KR20080004480A - 티로신 키나제 억제제 조성물, 그의 제조 방법 및 이를이용한 질병 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 ErbB-기반 리간드 결합 분자, 그의 제조 방법 및 용도를 개시한다. 상기 결합 분자는 재조합 DNA 분자로부터 발현된 단백질이다. 상기 단백질은 활성화 리간드에 결합할 수 있는 ErbB 세포외 도메인을 포함한다. 이러한 결합 요소들은 순환하는 리간드에 결합하여 이를 격리하기 위한 트랩으로 작용함으로써, 순환하는 리간드가 세포성 ErbB 수용체에 결합하지 못하도록 한다.

암 치료제, 티로신 키나제, ErbB 수용체, ErbB1, ErbB3, ErbB4

Description

티로신 키나제 억제제 조성물, 그의 제조 방법 및 이를 이용한 질병 치료 방법{TYROSINE KINASE INHIBITOR COMPOSITIONS AND METHODS FOR MANUFACTURING AND USING THEM IN THE TREATMENT OF DISEASE}

본 발명은 일반적으로 수용체 티로신 키나제 및 이들의 활성화 리간드 분야, 가용성 ErbB 리간드 결합 분자를 생성하기 위한 유전 공학의 이용, 변형된 제작물을 재조합 DNA 벡터에 삽입하여 세포에 의해 가용성 형태로 분비되는 수용체의 변형된 형태를 제조하는 방법, 및 이러한 분자의 질병 치료에의 용도에 관한 것이다.

암은 많은 국가에서 사망 원인의 선두를 차지하고 있는 질병 군에 대한 일반명이다. 단순하게 말하자면, 암은 손상되어 조절불가능한 세포의 비정상적 증식에 기인한 질병이다. 비정상적 세포 성장은 정상적인 세포 성장, 발달 및 사망을 조절하는 몇몇 중요한 유전자 또는 유전자 군의 돌연변이 때문에 발생한다. 이러한 비정상적인 세포가 성장함에 따라, 종양이 형성된다. 최악의 경우에는, 종양이 신체에 많은 부작용을 일으킬 정도로 커지거나 신체 전체에 퍼져서 종국적으로 사망에 이르게 된다.

암의 일차적인 치료 방법은 종양을 제거하기 위한 시도로서의 수술이고, 이로써 건강한 조직에 종양의 침범을 중지시키는 것이다. 수술은 위험도가 높은 시 도일 수 있고, 모든 환자에게 적합하지는 않을 수 있다. 또한, 종양이 수술할 수 없는 뇌 영역에서 발견되는 경우나, 백혈병 같은 질환의 경우와 같이, 모든 종양을 퇴치하기 위해 수술을 이용할 수 있는 것도 아니다.

결과적으로, 수술이 보장되지 않거나 불가능한 종양을 치료하기 위하여 대안적인 치료법이 고안되어왔으며 고안되고 있다. 이러한 대안적인 방법 중 하나는 방사능이다. 종양에의 방사능 조사는 표적화된 종양 세포 및 암세포가 아닐 수 있는 인접 부분의 노출된 세포의 사멸 또는 손상을 야기한다. 허약화 부작용이 잘 알려져 있다.

화학요법은 환자에게 세포독성 화합물을 투여하여 체내의 종양 조직을 파괴하기 위한 다른 시도이다. 이러한 유형의 치료법은 암을 이겨내기 위한 독립적인 방법으로써 단독으로, 또는 수술 또는 방사능 치료 전후에 사용될 수 있다. 방사능에서와 마찬가지로 허약화 부작용이 잘 알려져 있으며, 그 부작용이 수술 또는 방사능보다 환자의 건강에 더 위험한 정도일 수 있다.

비-암성 조직에 발생하는 손상을 피하고 이러한 다양한 유형의 치료법의 부작용을 피하기 위한 시도로서, 암성 조직만을 제거하기 위한 치료법이 연구되어 왔다. 이러한 치료법 중 하나는 종양, 예컨대, 결장 종양에 특이적으로 작용하는 항체를 이용하여, 건강한 조직을 보존하려고 시도하는 것이다. 이러한 치료법의 성공률은 낮다.

유전자 기반 치료법도 연구되고 있다. 몇몇 유전자 돌연변이는 야생형 (또는 정상) 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 정상 형태보다, 약물에 상이하게 반응 하는 단백질 (또는 표적)을 생산한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 유형의 치료법의 예 중 하나는 만성 골수성 백혈병 ("CML")에 매우 효과적인 치료제인 약물 글리벡^® (Gleevec^®; 이마티니브(imatinib)의 등록상표)을 이용하여 실시하는 것인데, 이는 BCR-ABL 키나제로 알려진, CML 진행을 촉진하는 주로 종양발생성 유전자를 억제한다. 또한, 글리벡^®은 특정한 티로신 키나제 수용체, 특히, 많은 위장관 종양 ("GIST")에서 발견되는 c-kit 종양발생성 수용체의 돌연변이 형태의 억제제라는 것이 밝혀졌다.

다른 유사한 치료제인 게피티니브(gefitinib) (이레사(Iressa)^®, 아스트라제네카(AstraZeneca)의 등록상표)는 상피세포 성장 인자 수용체 ("EGFR")의 티로신 키나제 활성을 표적으로 하는 소분자 억제제이다. 이레사^®는 백금계 및 도세탁셀 화학요법에 반응하지 않는 종양을 가진 환자의 비-소세포 폐암의 치료에 대하여 FDA의 승인을 받았다. 약 10%의 환자만이 이레사^®에 반응하지만, 이러한 소집단은 이 약물에 대하여 양호한 임상적 반응을 나타낸다.

다른 접근법은 종양에서의 새로운 혈관 형성, 또는 혈관 생성을 조절하는 수용체를 공격하고 억제하는 것이다. 성장하는 종양에 영양을 공급하는 혈관의 공급은 그의 성장에 매우 중요한 것으로 생각된다. 혈관 내피세포 성장 인자 ("VEGF")는 이러한 과정에 매우 중요한 것으로 알려져 있다. VEGF 경로는 VEGF가 내피 세 포 상의 그의 수용체에 결합할 때 시작된다. 이들 수용체 VEGFR1 및 VEGFR2는 이들의 세포외 도메인에서 VEGF에 결합하는 막통과성 티로신 키나제이며, 내재적 티로신 키나제 활성을 활성화하고, 세포내 신호전달을 개시한다. 이러한 경로의 봉쇄는 트랩(trap)으로 작용하여 VEGF가 그의 수용체에 결합하는 것을 막는 봉쇄성 가용성 수용체인 항-VEGF 항체 또는 항-VEGFR 항체, 및 VEGFR의 티로신 키나제 활성의 소분자 억제제를 이용하는 것으로 보고되었다. 홀래쉬(Holash) 등은 인간 면역글로불린 G1의 Fc 부분에 융합된 VEGFR1 및 VEGFR2의 세포외 도메인으로 이루어지고, VEGF에 대한 트랩으로 작용함으로써 경쟁적 억제제로 여겨지는 가용성 수용체를 사용하여 VEGF 캐스캐이드를 파괴하고 종양에 새로운 혈관 형성을 억제하는 것을 보고하였다 (Holash, et al., 2002, PNAS, vol. 98, no. 17, pp 11393-1398.).

염증성 질병, 특히 류마티스 관절염에서의 가용성 수용체의 다른 용도에서, 종양 괴사 인자-알파 ("TNF-α") 활성화는 염증을 일으키기 위해 필요하다. TNF-α-매개된 사건의 개시는 TNF-α 동종삼량체(homotrimer)가 세포 표면 수용체의 세포외 도메인에 결합하는 것을 필요로 한다. 이러한 세포 표면 수용체는 그후 다량체를 형성하고, 수용체 세포내 도메인을 통해 후속적인 신호 전달이 일어난다. TNF-α 수용체의 천연 가용성 형태가 천연적으로 존재하고, TNF-α가 세포 표면 수용체에 결합하는 것에 대한 경쟁적 억제제로 작용할 수 있다는 것이 증명되었지만, 이들은 대부분의 염증성 질병에서 나타나는 수준의 활성을 봉쇄하기에는 충분하지 않다. 엔브렐(Enbrel)^® (미국 캘리포니아주 사우전드 옥스의 암젠, 인크(Amgen, Inc.)의 등록상표)로 알려진 항-관절염 약물 인타너셉트(etanercept)는 인간 IgG1의 Fc 부분에 연결된 인간 TNF-α 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인으로 이루어진 완전 인간 삼량체 융합 단백질이다. 이는 세포 표면 TNF 수용체에 대한 TNF-α의 결합의 경쟁적 억제제로 작용하여, 류마티스 관절염 환자의 관절에서 TNF-α-유도 염증 활성을 억제한다. 인타너셉트는 사이토킨 캐리어 및 TNF-α 길항제로 작용하여, TNF-α가 생물학적으로 불활성이 되도록 한다 (Goffe, et al. 2003, J. Am. Acad. Dermatol, vol. 49, no. 2, pp. S105-S111; Goldenburg, M., 1999, Clinical Therapeutics, vol. 21, no. 1, pp. 75-87).

TNF-α 수용체를 표적으로 하는 다른 약물은 인플릭시마브(infliximab)이다. 이는 일어나야만 하는 결합을 억제하기 위한 TNF-α에 대한 모노클로날 키메라 항체이지만, 막-결합성 및 가용성 TNF-α 양자 모두에 결합하여, 몇몇 원치않는 부작용을 일으킬 수 있다.

수용체 티로신 키나제는 몇몇 유방암의 성장에 대한 열쇠이다. 일반적으로, 수용체 티로신 키나제는 (1) 특이적 리간드와 결합할 수 있는 세포외 도메인, (2) 막통과성 영역, (3) 수용체가 예를 들어, 단백질 인산화에 의해 조절될 수 있는 막-인접 도메인, (4) 수용체의 효소적 성분인 티로신 키나제 도메인, 및 (5) 카르복시말단 꼬리로 이루어진 당단백질이다 (Davis, et al., US 6,441,137, Aug. 27, 2002). 유방암에 대해서는 I형 수용체 티로신 키나제인 ErbB 일족이 현재까지 가 장 중요하다. 이들은 ErbB1 (HER1로도 알려짐), ErbB2 (HER2/neu), ErbB3 (HER3) 및 ErbB4 (HER4)를 포함한다. 이들 수용체 티로신 키나제는 상피, 중간엽 및 신경 조직에서 광범위하게 발현된다. ErbB2 또는 ErbB1의 과발현은 몇몇 유방암 및 다른 다양한 악성 종양에서의 좋지 않은 임상적 결과와 연관되어 있다.

불활성화 상태에서 ErbB 수용체는 단량체로 존재한다. 가용성 리간드와 결합하면, 수용체 동종- 및 이종이량체, 즉, 활성화된 수용체 형태의 형성을 일으키는 입체형태적 변화가 수용체 내에 일어난다. 리간드 결합 및 후속적인 동종- 및 이종이량체화는 자가인산화를 통한 수용체의 촉매적 활성을 촉진하는데, 즉, 개별적인 단량체가 티로신 잔기에 서로 인산화시킨다. 이로써 수용체 촉매적 활성의 추가적 촉진이 일어난다. 또한, 인산화된 몇몇 티로신 잔기는 하류 신호전달 분자를 위한 도킹(docking) 부위를 제공한다.

ErbB 수용체의 활성화는 하류의 상이한 사건, 예컨대, 증식 및 세포 생존을 일으킨다. 이러한 상이한 결과는 특정 수용체에 결합하는 특정 리간드에 따라 달라지는 상이한 신호전달 경로를 통해 발생한다. 그후 리간드 결합은 그 결과 형성되는 동종- 또는 이종이량체의 조성을 지시한다. 현재, 수많은 연구에서 결합된 리간드의 종류 및 형성된 동종- 또는 이종이량체의 후속적인 종류가 활성화된 ErbB 수용체 상의 티로신 잔기의 차별적인 인산화를 일으키는 것이 입증되었다. 예로써, 뉴레귤린 (neuregulin; "NRG", 헤레귤린(heregulin)으로도 알려짐)은 ErbB 수용체에 결합하여, 증식, 분화, 생존 및 이동을 포함하는 상이한 반응을 일으키는 리간드 일족이다. NRG1β 및 NRG2β는 ErbB3에 결합하고 ErbB2/ErbB3 이종이량체 를 유도할 수 있으나, NRG1β만이 배양에서 유방암 세포의 분화를 촉진한다. 그 이유는 NRG2β가 결합했을 때와 비교하여 NRG1β가 결합했을 때, 활성화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체에 상이한 하류 신호전달 분자가 동원되기 때문이다. 예를 들어, NRG1β 및 NRG2β는 유사한 전체 수준의 ErbB2 티로신 인산화를 일으키지만, NRG1β만이 PI3K (p85), SHP2, Grb2 및 She와 수용체의 결합을 일으킨다.

가용성 펩티드 리간드의 다른 일족은 ErbB 수용체 신호전달을 조절하고, 수용체 ErbB1에 각각 결합하는 상피세포 성장 인자 ("EGF") 및 전환 성장 인자 α ("TGF-α")를 포함한다. 몇몇 암 환자에서 리간드 EGF 또는 TGF-α의 발현 증가는 불량한 예후 표시자로 보고되었고, 종양 미세환경에서의 EGF 또는 다른 리간드의 국소적 농도 증가는 수용체 과발현의 부재 하에서도 활성화된 상태의 이종이량체를 유지할 수 있는 것으로 보고되었다.

유방암에서, ErbB1 및 ErbB2는 이량체화되어 생존 및 증식 경로를 활성화한다. ErbB1, ErbB2 및 ErbB4 모두 기능성 촉매적 도메인을 가지며, 이는 이들 경로를 활성화하는 주요 특성이다. ErbB1 및 ErbB2의 작용을 억제하는 것을 목표로 하는 몇몇 치료적 전략이 알려져 있다. 그 중 하나는 이들 수용체의 세포외 도메인에 결합하고 수용체 분해를 일으키는 항체의 사용이고, 다른 하나는 이들 수용체의 세포내 도메인 상의 활성 키나제 도메인에 결합하는 소분자 억제제의 사용이다. 불행하게도, 이러한 치료법 중 어느 것도 유방암의 성장을 완전히 근절할 수는 없었다.

그 이유는 모든 ErbB 수용체가 소분자에 의해 억제될 수 있는 기능성 촉매적 도메인을 가지는 것은 아니기 때문일 수 있다. ErbB3 수용체 티로신 키나제는 그의 촉매적 도메인에 결함이 있다는 점에서 수용체 키나제 중에서 특이하다. 다른 키나제 결함성 수용체, 즉, CCK-4m VIK/RYK, Klg 및 Ror1가 알려져 있지만, 이들은 알려진 리간드가 없는 외토리 수용체이다. ErbB3은 헤레귤린 (HRG 또는 뉴레귤린 (NDF)으로 알려짐)과 같은 리간드에 결합할 수 있다는 점에서 이러한 다른 수용체와 상이하다. ErbB3은 촉매적 활성이 결여되긴 했지만, ErbB2 및 ErbB4와 이량체화하여 ErbB2/ErbB3 및 ErbB3/ErbB4 이종이량체를 형성하고, 이로써 유방암에서 신호전달 활성을 자극한다는 점에서 중요하다 (Lee, et al., 2001, Cancer Research 61, pp 4467-4473).

ErbB3 수용체의 세포외 도메인만으로 이루어진, 천연적으로 발생하는 말단절단형(truncated) ErbB3 수용체가 동정되었다. 이러한 천연 가용성 수용체는 리간드에 결합함으로써 세포성 ErbB3 수용체의 경쟁적 억제제로 작용한다는 것이 밝혀졌다. 이들 천연 발생적 가용성 수용체는 유방암에 걸린 환자에게 치료적 효과를 나타낼 정도의 많은 양으로 존재하지 않는다. 특히, 이 (Lee) 등은 p85-가용성 ErbB3 수용체의 발견 및 그의 ErbB3 리간드의 경쟁적 억제제로서의 활성에 대하여 논의하였다. HRG가 세포 표면 수용체와 결합하는 것을 막음으로써, 시험관 내에서 이 수용체가 천연적으로 발생하는 ErbB3 억제제임을 발견하였다. 이는 많은 세포외 음성 조절자 중 하나로 여겨질 수 있다 (Lee, et al., 2001, Cancer Research, 61: 4467-4473).

본 발명의 목적은 ErbB3 리간드에 경쟁적으로 결합함으로써 이러한 리간드의 세포성 ErbB3 수용체와의 결합을 위한 이용가능성을 감소 또는 제거하는 ErbB3 리간드 길항제를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 바람직하게는, ErbB3 리간드 길항제를 단독 제제로, 또는 다른 암 치료제와 함께 투여하는 것에 의한 암 치료 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 신규한 ErbB-기반 리간드 결합 분자, 그의 제조 방법 및 용도를 개시한다. 상기 결합 분자는 재조합 DNA 분자로부터 발현된 단백질이다. 상기 단백질은 활성화 리간드에 결합할 수 있는 ErbB 세포외 도메인을 포함한다. 이러한 결합 요소들은 순환하는 리간드에 결합하여 이를 격리하기 위한 트랩으로 작용함으로써, 순환하는 리간드가 세포성 ErbB 수용체에 결합하지 못하도록 한다.

바람직하게는, 상기 단백질은 ErbB 수용체의 일부를 포함할 수 있고, ErbB 리간드에 결합할 것이다.

추가적인 특징 및 장점은 본 명세서에 기술될 것이고, 하기 발명의 상세한 설명 및 도면으로부터 명백할 것이다.

도 1은 ErbB 싱글 트랩의 작용 기작의 모식도이다.

도 2는 ErbB3 싱글 트랩 및 ErbB 더블 트랩 폴리펩티드의 웨스턴 블랏이다.

본 명세서는 수용체, 예컨대 ErbB 수용체에 대한 리간드에 결합할 수 있는 결합 분자를 기술한다. 상기 결합 분자는 본원 개시 내용의 목적을 위하여 "싱글 트랩"이라는 용어로 지칭한다. 한 실시태양에서, 상기 분자는 모든 ErbB 리간드의 하위부류에 대하여 실질적인 친화성을 가진다. 상기 분자는 ErbB 수용체 및 리간드 양자 모두가 과발현되거나 변형된 종양에서 단일 치료법 또는 조합 치료법, 예를 들어, EGFR 및 ErbB2 억제제와의 조합 치료법으로 사용될 수 있다.

한 실시태양에서, 본 발명은 특정 ErbB 수용체에 결합하는 리간드에 대한 실질적인 결합 친화성을 가지는 일가(monovalent) 결합 분자에 관한 것이다. 일반적으로, 리간드는 상이한 수용체에 결합하는 상이한 리간드일 것이다. 결합 분자가 수용액에 가용성인 것이 바람직하다. 대안적으로, 결합 분자는 리포좀 제제와 같이 기능적으로 가용성이거나 수친화성이 되도록 하는 제제 형태일 수 있다.

한 실시태양에서, 결합 분자는 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분일 수 있다. 결합 분자에서 임의의 적절한 수용체를 사용할 수 있다. 적절한 수용체는 일반적으로 리간드 결합에 필요하고 리간드 결합에 충분한 모든 결정요소들을 포함하는 세포외 도메인을 포함할 것이다. 이들 결정요소들은 상응하는 mRNA, 또는 게놈으로부터 직접 단리되거나 그의 천연 숙주 세포로부터 유래된 cDNA로부터 단리될 수 있는 유전자 구조 상에 위치할 수 있다. 특정 실시태양에서, 결합 분자를 생성하기 위하여 ErbB 수용체 일족을 사용할 수 있다. 이를 위하여, 결합 분자는 ErbB 수용체, 예를 들어, ErbB1, ErbB3 또는 ErbB4의 세포외 리간드 결합 도메인을 포함할 수 있다. 결합 도메인은 수용체 리간드에 대한 적절한 결합 활성이 유지되는 한, 폴리펩티드 사슬 상에 다른 요소와 함께 존재할 수 있다.

결합 분자는 재조합 DNA 분자로부터 발현되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 재조합 DNA 분자는 수용체 단백질의 일부를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. IgG1의 Fc 부분과 같은 다른 요소가 결합 분자에 포함될 수 있다. 인간 IgG1의 Fc 부분을 사용하는 것은 치료제 분야의 당업자에게 널리 알려진 설계이고, 두 가지 목적을 수행하는 것으로 알려져 있다. 첫째는 단량체 가용성 수용체가 고차 구조, 예컨대, 이량체 또는 삼량체로 올리고머화되도록 하기 위한 것이다. 두번째 목적은 IgG1 분자의 Fc 부분을 포함하지 않는 분자보다 생체 내에서 더 긴 반감기를 나타내는, 보다 안정한 분자를 생성하기 위한 것이다. 다른 요소는 리간드 결합 요소를 IgG1-Fc 요소와 작동가능하게 연결시키는 링커일 수 있다. 한 예는 글리신-세린 (Gly4Ser)3 링커일 수 있다. 다른 요소는 원하는 경우 IgG1-Fc요소가 분자로부터 제거되도록 허용하는 프로테아제 인식 서열일 수 있다. 예시적인 서열은 Xa 인자 또는 TEV 프로테아제 인식 서열을 포함한다.

특정 실시태양에서, 재조합 DNA 분자는 ErbB1에 대한 서열을 포함한다. 특정 실시태양에서, 재조합 DNA 분자는 ErbB3으로부터 유래된 서열을 포함한다. 특정 실시태양에서, 재조합 DNA 분자는 ErbB4로부터 유래된 서열을 포함한다. 이들 중 어느 경우에나, 선택된 서열은 그들의 대응하는 ErbB 리간드에 결합하는 실질적인 능력을 가질 것이다.

특정 실시태양에서, 수용체 서열은 결합 분자가 적절한 숙주 내에서 발현될 수 있도록, 전사 및 번역 서열과의 배열로 재조합 DNA 제작물 내에 클로닝된다. 적절한 숙주 내에서 사용될 수 있는 전사 및 번역 서열을 선택하는 것은 당업자의 기술 범위 내에 속한다. 많은 경우에, 수용체는 글리코실화되고, 글리코실화는 리간드 결합에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 숙주의 선택은 숙주 세포에 의해 생성되는 글리코실화 패턴에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, ErbB-포함 결합 분자의 경우, 포유동물 숙주 세포가 사용될 수 있다.

결합 분자의 예시적 실시태양을 도 1에 도시하였다. ErbB 리간드 결합 도메인의 탐지는 웨스턴 블랏에 의한, ErbB 수용체에 대한 세포외 도메인 특이적 항체를 이용한 인식으로 나타내었다 (도 2).

본 발명의 화합물의 제약 조성물을 이용한 방법도 제공된다. 이러한 제약 조성물은 주사 또는 경구, 폐, 코, 경피적 투여를 위한 형태 또는 다른 투여 형태일 수 있다. 일반적으로, 본 발명은 본 발명의 결합 분자의 유효량 및 제약학적으로 허용가능한 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체를 포함하는 제약 조성물을 포괄한다. 이러한 조성물은 다양한 완충제 성분 (예를 들어, 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도의 희석제; 첨가제, 예컨대, 세제 및 가용화제 (예를 들어, 트위드(Tweed)™80, 폴리소르베이트 80), 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산, 중아황산나트륨), 방부제 (예를 들어, 티메르솔, 벤질 알콜) 및 증량 물질 (bulking substance) (예를 들어, 락토스, 만니톨); 중합체 화합물, 예컨대, 폴리락트산, 폴리글리콜산 등의 미립자 제제 또는 리포좀 내로의 물질의 혼입을 포함한다. 히알루론산도 사용될 수 있고, 이는 순환계에서 연장된 지속을 촉진하는 효과를 가질 수 있다. 이러한 조성물은 신체적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도, 및 본 발명의 단백질 및 유도체의 생체내 제거(clearance) 속도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참조로 인용되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712]을 참조할 수 있다. 조성물은 액체 형태일 수 있거나, 또는 건조 분말, 예컨대, 동결 건조 형태일 수 있다. 경피용 제제와 같은 이식가능한 서방형 제제도 고려할 수 있다.

제약학적으로 허용가능한 담체는 탄수화물, 예컨대, 트레할로스, 만니톨, 자일리톨, 수크로스, 락토스 및 소르비톨을 포함한다. 제제에서 사용되는 다른 성분은 DPPC, DOPE, DSPC 및 DOPC을 포함할 수 있다. 천연 또는 합성 계면활성제가 사용될 수 있다. PEG가 (단백질 또는 유사체를 유도화하는 그의 용도를 벗어나서도)사용될 수 있다. 덱스트란, 예컨대, 시클로덱스트란이 사용될 수 있다. 담즙산염 및 다른 관련된 강화제(enhancer)가 사용될 수 있다. 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체가 사용될 수 있다. 완충 제제에 사용되는 것과 같이 아미노산이 사용될 수 있다.

또한, 리포좀, 미세캡슐 또는 미세구, 봉입 복합체, 또는 다른 유형의 담체의 사용도 고려할 수 있다.

치료 방법에 관련된 투여량 계획은 약물의 작용을 변형하는 다양한 요소, 예를 들어, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식습관, 질병의 경중도, 투여 기간 및 다른 임상적 요소를 고려하여 주치의에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 일일 계획은 체중 1 kg 당 본 발명의 화합물 0.1-1000 mg, 바람직하게는 체중 1 kg 당 0.1-150 mg의 범위 내여야 한다.

실시예 1

본 실시예는 ErbB 수용체 세포외 도메인, 즉, ErbB3 세포외 도메인을 가지는 싱글 트랩 분자의 한 대표적 조성물의 단일 재조합 유전적 제작물로의 제작을 예시한다.

ErbB 싱글 트랩은 ErbB1, ErbB3 또는 ErbB4의 세포외 도메인을 혼입시킴으로써, ErbB 일족의 상이한 리간드에 결합하도록 설계될 수 있다.

이스라엘, 레호봇의 웨이즈만 연구소(Weizmann Institute in Rehovot, Israel)의 요세프 야든 박사(Dr. Yosef Yarden)가 ErbB3의 말단절단형을 pEF-IRES-P 플라스미드에 클로닝하였다. 이 제작물은 LI (도메인 I), SI (도메인 II), LII (도메인 III)라고 불리는 ErbB3의 첫 세 개의 세포외 도메인, 및 SII (도메인 IV)의 일부로 이루어진다. 이 단편의 3' 말단에 융합된 다른 단백질 도메인은 PKA 인산화 부위, Xa 인자 절단 부위, 및 3' 말단에 부착된 인간 IgG1의 Fc 단편을 포함한다. 그후, 이러한 전체 단편을 pEF-IRES-P 플라스미드의 NheI - NotI 부위 내로 클로닝하여 pEF-ECD3IgG-IRES-P 플라스미드를 수득하였다.

pEF-ECD3IgG-IRES-P 플라스미드를 변형하여 pEF-ECD3-IRES-P 플라스미드를 생성한다. ECD3IgG를 ErbB3의 LI, SI, LII, 및 SII 도메인의 일부만 발현되도록 말단절단시켰다. 이를 달성하기 위한 편리한 절단 효소가 없기 때문에, ErbB3 세포외 도메인의 일부를 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 설계하였다. 이들 프라이머는 순방향 프라이머 상에 XhoI 부위를 포함시켰는데, 이는 도메인 SII의 3' 말단에 가장 가까운 고유한 절단 효소 부위였기 때문이다. 역방향 프라이머에는 NotI 부 위 (제작물의 3' 말단 상의 고유한 클로닝 부위였기 때문), 내부의(nested) NheI 부위, 및 NheI 부위와 겹치는 중지 코돈을 포함시켰다. NheI 부위는 빈(empty) pEF-IRES-P 대조군 플라스미드의 제작이 가능하도록 역방향 프라이머 상의 NotI 부위 내에 혼입되었는데, 이는 ErbB3 싱글 트랩의 제작 후 전체 ErbB3 세포외 도메인 단편이 절제되는 것을 허용하는 다중 클로닝 부위 ("MCS")의 5' 말단에 NheI 부위가 존재했기 때문이다.

pEF-ECD3IgG-IRES-P를 다음과 같은 PCR 반응의 주형으로 사용하였다: pEF-ECD3IgG-IRES-P 플라스미드 25 ng, NEB 10x 벤트(Vent) 폴리머라제 완충액 2.5 ㎕, dNTP (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각의 10 mM 용액) 0.5 ㎕, 순방향 및 역방향 프라이머 0.5 ㎕ 및 벤트 폴리머라제 0.5 ㎕ (5000 유닛/mL). 프라이머의 서열은 다음과 같다: s-ErbB3-XhoI, 5' AGC TCT CGA GCA ACA TTG ATG GAT TTG TGA ACT GC (서열 번호 1) 및 s-ErbB3-NheI-NotI, 5' AGC TGC GGC CGC TAG CTC AAC CAG GGC CTG GGC CCC AGC ATC (서열 번호 2). PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 2분, 그후 95℃에서 45초, 55℃에서 45초 및 72℃에서 2분의 22 주기, 그후 72℃에서 5분간 최종 연장.

증폭된 PCR 단편을 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하고, 퀴아젠(Qiagen) 겔 추출 키트를 이용하여 정제하였다. PCR 생성물 및 pEF-ECD3IgG-IRES-P 플라스미드를 XhoI 및 NotI로 밤새 절단하고, 1% 아가로스 겔 상에서 분리하고, 퀴아젠 겔 추출 키트를 이용하여 정제하였다. XhoI - NotI PCR 단편을 XhoI - NotI 절단된 pEF-ECD3IgG-IRES-P 플라스미드 내로 라이게이션하고, DH5α 적격 세포 내로 형질 도입시켰다. XhoI 및 NotI로 절단함으로써, 클론을 재조합에 대하여 선별하였다. 이러한 새로운 제작물 pEF-ECD3-IRES-P 플라스미드를 그후 NheI로 절단하였다. 단편을 1% 아가로스 겔 상에서 분리하고, 퀴아젠 겔 추출 키트를 이용하여 정제하고, pIRES 뼈대 플라스미드를 다시 자가 라이게이션시켰다. 이로써 ErbB3 또는 IgG1-Fc 서열 중 어느 것도 포함하지 않는 pEF-IRES-P 대조군 플라스미드가 생성되었다.

실시예 2

본 실시예는 포유동물 숙주 세포에서 재조합 DNA 분자로부터의 더블 트랩 분자의 발현 및 그의 활성형의 정제를 예시한다. pEF-ECD3IgG-IRES-P 플라스미드, pEF-ECD3-IRES-P 플라스미드 및 pEF-IRES-P 대조군 플라스미드를 별도로 293T 세포에 형질감염시킨 뒤, 플라스미드가 안정적으로 통합된 세포 집단을 생성시키기 위하여 퓨로마이신 상에서 선별하였다. 이들 형질도입된 세포들은 ECD3IgG 및 ECD3 싱글 트랩 폴리펩티드를 배양 배지로 분비하였다.

형질감염된 293T 세포로부터의 웨스턴 블랏 결과 (도 2)는 ECD3 싱글 트랩은 ErbB3 특이적 항체에 의해 인식되지 않지만 (래인 1), 동일한 폴리펩티드로부터 가용성 ErbB3 및 가용성 ErbB1을 발현하는 폴리펩티드는 항체에 의해 탐지된다 (래인 3 및 4)는 것을 예증한다. 이들 폴리펩티드는 2종의 상이한 ErbB 세포외 리간드 결합 도메인의 세포외 리간드 결합 부분을 포함하기 때문에 ErbB 더블 트랩이라고 불린다. 싱글 트랩 및 더블 트랩에 사용되는 ErbB3 세포외 리간드 결합 부분 간의 차이점은 단지 더블 트랩에서 ErbB3 세포외 리간드 결합 부분의 카르복시 말단에 아미노산 3개가 첨가되었다는 것이다. 따라서, ErbB3 싱글 트랩은 더블 트랩 폴리 펩티드에는 포함되어 있으나 ErbB3 싱글 트랩의 현재 형태에는 존재하지 않는 TEV 프로테아제 인식 서열 및 히스티딘 태그와 더불어 이러한 3개의 추가적 아미노산을 포함하도록 변형될 것이다. 이들 요소는 PCR과 같은 공지된 방법에 의하여 ErbB3 싱글 트랩 폴리펩티드에 첨가될 수 있다.

실시예 3

ErbB3 싱글 트랩의 기능성을 시험하기 위하여, 293T 세포로부터 조절된 배지를 수집하고, 여과하고, BT474 유방암 세포를 배양하는데 사용하였다. 48시간 후, pEF-IRES-P 대조군 벡터를 발현하는 293T 세포로부터의 조절된 배지를 이용하여 배양한 세포와 비교하여, pEF-ECD3-IRES-P 플라스미드를 발현하는 293T 세포로부터의 배지를 이용하여 배양한 BT474 세포에서 세포수의 현저한 감소가 관찰되었다.

<110> TARGETED MOLECULAR DIAGNOSTICS, LLC <120> TYROSINE KINASE INHIBITOR COMPOSITIONS AND METHODS FOR MANUFACTURING AND USING THEM IN THE TREATMENT OF DISEASE <150> US 60/659,236 <151> 2005-03-07 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 agctctcgag caacattgat ggatttgtga actgc 35 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 agctgcggcc gctagctcaa ccagggcctg ggccccagca tc 42

Claims (22)

1. ErbB 리간드에 대한 결합 친화성을 가지며, 분자 전체가 ErbB 수용체의 세포외 영역 또는 그의 일부인 결합 분자.
2. 제1항에 있어서, 수용액에 실질적으로 가용성인 결합 분자.
3. 제1항에 있어서, ErbB 수용체의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 결합 분자.
4. 제1항에 있어서, ErbB1의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 결합 분자.
5. 제1항에 있어서, ErbB3의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 결합 분자.
6. 제1항에 있어서, ErbB4의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 결합 분자.
7. ErbB 수용체 단백질의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 진핵 세포.
8. 제7항에 있어서, ErbB 리간드 또는 리간드들에 대한 결합 친화성을 가지는 결합 분자를 생산하는 진핵 세포.
9. 제7항에 있어서, ErbB 리간드에 대한 결합 친화성을 가지며 수용액에 가용성인 결합 분자를 생산하는 진핵 세포.
10. 제7항에 있어서, 상기 결합 분자가 세포 외부 및 주위 매질 내로 운반되는 것인 진핵 세포.
11. 제7항에 있어서, 상기 결합 분자가 ErbB 수용체의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 것인 진핵 세포.
12. 제7항에 있어서, ErbB1의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 진핵 세포.
13. 제7항에 있어서, ErbB3의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 진핵 세포.
14. 제7항에 있어서, ErbB4의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 진핵 세포.
15. 제7항에 있어서, 상기 재조합 DNA 분자가 Xa 인자 절단 부위 및 인간 면역글로불린 G1의 Fc 부분의 서열을 포함하는 것인 진핵 세포.
16. 제15항에 있어서, ErbB 리간드 또는 리간드들에 대한 결합 친화성을 가지는 결합 분자를 생산하는 진핵 세포.
17. 제15항에 있어서, ErbB 리간드에 대한 결합 친화성을 가지며 수용액에 가용성인 결합 분자를 생산하는 진핵 세포.
18. 제15항에 있어서, 상기 결합 분자가 세포 외부 및 주위 매질 내로 운반되는 것인 진핵 세포.
19. 제15항에 있어서, 상기 결합 분자가 ErbB 수용체의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 것인 진핵 세포.
20. 제15항에 있어서, ErbB1의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 진핵 세포.
21. 제15항에 있어서, ErbB3의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 진핵 세포.
22. 제15항에 있어서, ErbB4의 세포외 도메인을 추가로 포함하는 진핵 세포.

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