CN101611150A - 二价ErbB配体结合分子及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

公开了新的二价的基于ErbB的配体结合分子，连同其制备方法和用途。所述结合分子可以是由重组DNA分子表达的蛋白。该蛋白可以含有2个均可结合ErbB受体配体的ErbB受体胞外结构域。这些结合分子起诱捕分子的作用，以结合和隔离配体，从而使它们不能用于结合细胞ErbB受体。

Description

二价ErbB配体结合分子及其制备和使用方法

背景

受体酪氨酸激酶参与刺激许多癌症的生长。通常，受体酪氨酸激酶是由下述组分组成的糖蛋白：(1)一个能结合特异性配体的胞外结构域，(2)一个跨膜区域，(3)一个近膜结构域，受体在这里可以被例如蛋白磷酸化所调节，(4)一个酪氨酸激酶结构域，它是受体的酶组分，和(5)一个羧基末端尾。对于许多实体瘤，ErbB家族的I型受体酪氨酸激酶构成一个重要的受体类别，因为它们在介导细胞生长、分化和存活中的重要性。该受体家族的成员包括ErbB1(也称作HER1)，ErbB2(HER2/neu)，ErbB3(HER3)，和ErbB4(HER4)。这些受体酪氨酸激酶在许多组织中广泛表达，所述组织包括上皮、间质和神经元组织。已经将ErbB2或ErbB1的过表达与有些乳腺癌和多种其它恶性肿瘤中的较差临床结果相关联。

在它们的无活性状态，通常认为ErbB受体作为单体存在。在结合它们各自的配体后，可以在受体内发生构象变化，这可以导致受体同型-和异型二聚体(即激活的受体形式)的形成。配体结合和随后的同型-或异型二聚化可以通过自磷酸化和转磷酸作用来刺激受体的催化活性，也就是说，单个单体会在酪氨酸残基上彼此磷酸化。这可以导致对受体催化活性的进一步刺激。另外，有些磷酸化的酪氨酸残基会为下游信号传导分子提供停泊位点。

ErbB受体的激活可以导致多种不同效应中的任一种，所述效应例如增殖和细胞存活。这些不同的结果通过不同的信号传导途径发生，所述途径依赖于结合特定受体的特定配体。配体结合决定了最终形成的同型-或异型二聚体的群体。许多研究已经表明，结合的配体的类型和随后形成的同型-或异型二聚体的类型，会导致激活的ErbB受体上酪氨酸残基的差异磷酸化。作为一个实例，神经调节蛋白(″NRG″，也称作调蛋白)是一个可以结合ErbB受体并引发多种应答的配体家族，所述应答包括增殖、分化、存活和迁移。NRG1β和NRG2β可以结合ErbB3，并诱导ErbB2/ErbB3异型二聚体，但是，仅NRG1β会刺激培养的乳腺癌细胞的分化。原因是，与结合NRG2β时相比，当结合NRG1β时不同的下游信号传导分子向激活的ErbB2/ErbB3异型二聚体的募集。例如，尽管NRG1β和NRG2β会导致类似的ErbB2酪氨酸磷酸化总水平，仅NRG1β导致PI3K(p85)、SHP2、Grb2和Shc向受体的结合。

现有的基于受体酪氨酸激酶的治疗剂通常落入2类。小分子抑制剂，例如拉帕替尼(Lapatinib)，会结合细胞内酪氨酸激酶区域并阻止ATP结合和受体磷酸化。第二类治疗剂是基于单克隆抗体，例如赫赛汀(曲妥珠单抗)，其识别和结合特定受体的胞外配体结合域，从而触发受体降解。这2类疗法均已经表现出功效。但是，显然多种因素会影响每种疗法的相对功效。例如，已知高水平的IGF-1R会干扰赫赛汀^TM治疗，但是不会干扰拉帕替尼治疗。尽管它们的作用机理不同，赫赛汀^TM和拉帕替尼都靶向及结合受体。

激活性配体的过表达可以造成类似于失调受体的失控细胞增殖，这也变得清楚。在这样的情况下，干扰激活性配体与它的受体的结合，可以提供可能更有效或可强化单独的现有的基于受体的疗法或其它疗法的新治疗策略。

干扰配体与ErbB3的结合的治疗剂可能是特别有效的。ErbB3与其它EGFR家族中的受体的不同之处在于，它的酪氨酸激酶结构域是功能上无活性的；但是，ErbB2/ErbB3异型二聚体会发送ErbB家族的任何同型-或异型二聚体组合的最强效丝裂信号。因此，ErbB3是一种重要靶物，但也是不能通过靶向激酶区域的小分子抑制的靶物。因为在形成激活的异型二聚体之前，ErbB3需要激活性配体例如调蛋白(NDF)，可以干扰ErbB3受体配体的结合的分子可能被用于阻断或干扰ErbB二聚体和异型二聚体的形成。这样的分子的一个实例会是受体分子的胞外域的可溶部分，其保留紧密的配体结合亲和力，因而可以“捕获”配体，并有效地降低它们的浓度，使它们不能激活ErbB3受体。

存在几种试图利用该诱捕或″引诱″现象的治疗剂。例如，Enbrel^TM(依那西普-Amgen)是结合并捕获促炎症配体TNFα的可溶修饰形式的TNFR受体。另外，称作VEGF Trap的VEGFR1和VEGFR2受体的可溶融合蛋白，目前在临床试验中用于治疗黄斑变性和几种形式的癌症(Regeneron Pharmaceuticals)。ErbB3诱捕分子(trap)也已经表现出在经NDF处理的细胞中增强双重EGFR/ErbB2抑制剂的作用和逆转的GW2974(ErbB1和ErbB2的小分子抑制剂)抗性方面的体外效力。

所有目前批准的ErbB抑制剂都靶向EGFR或ErbB2或二者。但是，目前批准的疗法不会同时干扰配体与多个ErbB受体的结合。显然，需要可以用于隔离(sequester)受体配体(例如ErbB配体)并从而阻断配体与多个ErbB受体的结合和随后的受体激活的新的结合分子。能结合所有已知的ErbB配体的结合分子会是特别有用的。理想地，如果可以制备这样的分子，它将会是单个共价结合的分子，从而仅为单个分子。这样的分子会简化生产和给药方案，当用于隔离受体配体时，会在理论上提供最大益处。这样的分子会提供优异的治疗功效，尤其对于过表达如TGFα和NDF等ErbB配体的肿瘤。

简述

公开了新的二价的基于ErbB受体的配体结合分子，以及它们的制备方法和用途。所述结合分子是由重组DNA分子表达的蛋白。该蛋白可以含有2个结合ErbB激活性配体的ErbB胞外结构域。这些结合域起诱捕分子的作用，以结合和隔离配体，从而使它们不能用于结合细胞的ErbB受体。已经令人惊奇地发现，ErbB受体的胞外域的多个部分可以在单个多肽中共价连接到一起，使得两个结合部分都保留对它们各自配体的实质亲和力，所以它们可以用于结合和捕获ErbB配体，如在多种结合测定中的任何测定中的结合所证实的，所述测定包括ELISA测定，在Biacore装置上进行的测定等。

所公开的蛋白可以包括几种ErbB受体的部分，优选地将结合多种或所有已知的ErbB配体。

也描述了用公开的分子治疗疾病或状况的方法。通过该公开的方法，可以治疗通过去除或抑制ErbB配体可好转、改善或抑制的任何疾病。所述方法通常包括，通过将ErbB配体捕获在公开的结合分子中，阻止它们与受体的结合。在一种方法中，这可以通过给需要治疗的受试者施用本文公开的二价结合分子来实现。

本文描述了其它的特征和优点，并将从下面的详述和附图中明白。

附图简述

图1：例示了ErbB单诱捕分子作用机理和下一代的ErbB双诱捕分子。

图2：例示了当与ErbB单诱捕分子治疗一起使用时，GW2974细胞毒性的增强。

图3：提供了从表达下述构建体的293T细胞制备的裂解物的蛋白印迹的照片：1.pEF-ECD3-IRES-P(含有ErbB3受体的胞外域的一部分的单诱捕分子)，2.pEF-IRES-P(阴性对照载体)，3.pEF-ECD13-IRES-P9(含有在多肽的氨基末端侧的ErbB1受体的胞外域的一部分和在多肽的羧基末端侧的ErbB3受体的胞外域的一部分的双诱捕分子)，4.pEF-ECD31-IRES-P(含有在多肽的氨基末端侧的ErbB3受体的胞外域的一部分和在多肽的羧基末端侧的ErbB1受体的胞外域的一部分的双诱捕分子)，5.pEF-ECD14-IRES-P(含有在多肽的氨基末端侧的ErbB1受体的胞外域的一部分和在多肽的羧基末端侧的ErbB4受体的胞外域的一部分的双诱捕分子)，6.pEF-ECD41-IRES-P(含有在多肽的氨基末端侧的ErbB4受体的胞外域的一部分和在多肽的羧基末端侧的ErbB1受体的胞外域的一部分的双诱捕分子)，和7.MDA-MB-468细胞(阳性抗体对照)。如实施例1所述制备构建体。用识别在ErbB1的胞外结构域中的表位的抗体，探测印迹。

图4：3天后，收集来自表达不同诱捕分子构建体的293T细胞的培养基。以1∶1000稀释培养基，使用来自R&P Systems的人EGF RDuoSet，一式两份地对每个样品进行ELISA。使用Bio-Tek EL312e，读出ELISA测定。构建体如下：VC-载体对照，Her3*-单ErbB3诱捕分子，ECD1-3.p6，ECD3-1.p6，ECD1-4.p5和ECD4-1.p5。如实施例1所述制备构建体。

图5：为了测试诱捕分子的功能，收集来自293T细胞的条件培养基，过滤，并用新鲜培养基1∶1稀释。该稀释的条件培养基然后用于培养BT474细胞。48小时后，固定细胞，用在50％甲醇中的1％亚甲蓝溶液染色。在来自下述诱捕分子构建体的培养基中培养BT474细胞：1.pEF-IRES-P(对照)，2.PEF-ECD13-IRES-P，3.pEF-ECD14-IRES-P，4.pEF-ECD3-IRES-P(单诱捕分子)，5.pEF-ECD31-IRES-P和6.pEF-ECD41-IRES-P，构建体缩写在上面图3中定义。

图6：热EGF与诱捕分子的交联。将二价和单价诱捕分子与热EGF一起温育，且有/没有过量的未标记的EGF或NDF，随后与交联分子BS3一起温育。显示的条带是与热EGF交联的二价或单价诱捕分子。如预期的，所有二价诱捕分子结合EGF，同时仅ErbB1单价诱捕分子结合EGF。如预期的，冷EGF的加入会竞争掉所有诱捕分子中热EGF的结合。令人感兴趣地，冷NDF的加入似乎会干扰ErbB1-ErbB3二价诱捕分子中EGF的结合，但是在ErbB3-ErbB1或ErbB4-ErbB1二价诱捕分子中则不会。如实施例1所述制备构建体。

图7：通过Biacore测得的诱捕分子与特定配体的结合亲和力。使用标准方法，使用Biacore测定二价和单价诱捕分子对几种不同配体的结合亲和力(Kd)。使诱捕分子结合到Biacore芯片，加入递增浓度的配体，以测定诱捕分子和配体之间的结合亲和力。所有二价诱捕分子都可以结合ErbB1和ErbB3/ErbB4特异性配体，而单价诱捕分子仅可结合它们各自的配体类别。已知全长胞外域具有约412-961nM的对TGFα的亲和力。

图8：在有诱捕分子存在下，标记的EGF(1.6ng/ml)与EGFR的结合。使EGFR结合到Biacore芯片，然后加入热EGF。在没有诱捕分子存在下热EGF与EGFR的结合设定为1。再将3种不同浓度的二价和单价诱捕分子加入热EGF库(pool)，随后暴露于EGFR结合的芯片。二价诱捕分子能减少可利用的热EGF库，而相同浓度的单价ErbB1诱捕分子不能。

详述

公开了能结合多种受体(例如ErbB受体)的配体的共价连接的二价结合分子。优选的二价结合分子能结合至少2种不同受体的配体。为了本说明书的目的，这样的结合分子称作″双诱捕分子″。在一个实施方案中，所述分子具有对所有ErbB配体的实质亲和力。在图1中图解了结合分子的示例性的实施方案。图1也例示了认为的这样的双重结合分子的工作机理。

在一个实施方案中，本发明涉及对结合不同受体的配体具有实质的结合亲和力的二价结合分子。所述二价结合分子可以包括受体的胞外域的部分，且优选地共价连接在单个多肽序列中。在由2种受体结合的配体谱重叠的情况下，由这些受体的部分制备的二价结合分子的每个结合部分可以结合类似的或相同的配体。优选地，二价结合分子在水性溶液中可溶。

在一个实施方案中，二价结合分子的每个结合部分可以是含有受体的胞外结构域的可溶部分。任何合适的受体都可以用于结合分子中。合适的受体通常含有细胞外或细胞内结构域，其含有配体结合必需的且足够的所有决定簇。在一个实施方案中，ErbB受体家族的多个成员可以用于创建二价结合分子。因而，二价结合分子可以是ErbB受体的胞外配体结合域的组合，例如ErbB1和ErbB3，ErbB1和ErbB4或其它组合。结合域可以以任何次序存在于多肽链上，只要维持对受体配体的合适结合亲和力即可。

为了本申请的目的，合适的结合亲和力是高得足以捕获在生理基质中的ErbB配体的亲和力。优选地，解离常数将不高于天然受体的解离常数约100倍至约1000倍。更优选地，在纳摩尔范围或更低的解离常数是优选的。尽管如此，足以结合和捕获ErbB配体、从而阻止或干扰它们与ErbB受体结合的任何亲和力，适用于公开的组合物中，且可以用于公开的方法中。

已知ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4的完整核苷酸序列，且可以在Genbank中找到，分别是登录号NM_005228(ErbB1)，登录号NM_004448(ErbB2)，登录号M29366或NM_001982(ErbB3)和登录号NM_005235(ErbB4)。为了本说明书的目的，全长EGFR胞外域是指由ErbB1的氨基酸残基1-621或EGF受体家族的其它成员的等同残基组成的胞外域。也已知ErbB受体家族的全长胞外域的氨基酸序列，下面包括了这些序列的部分：ErbB1氨基酸残基1-532的SEQ ID NO.2，ErbB1氨基酸残基1-500的SEQ ID NO.22，ErbB3氨基酸残基1-531的SEQ ID NO 6，ErbB3氨基酸残基1-499的SEQ ID NO.24，ErbB4氨基酸残基1-528的SEQ ID NO 8，和ErbB4氨基酸1-496的SEQ ID NO.26。在每个序列中，位置编号″1″是在信号肽之后的第一个氨基酸。编码这些氨基酸的对应的核苷酸序列分别可见SEQ ID NO.2，6和8。ErbB受体的全长胞外域含有4个亚结构域，称作L1，CR1，L2和CR2，其中L和CR分别是“大”和“富含cys”的首字母简略缩写。已经测定了ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4的胞外域的氨基酸序列比对。参见美国专利公开号2006/0234343，图1A和1B。

认为ErbB受体的CR2亚结构域连接配体结合域(L1，CR1和L2)和跨膜区，由7个额外模块组成，所述模块由2或3个氨基酸残基的接头连接到一起，并以半胱氨酸残基为界。对于ErbB1，这些模块分别从氨基酸位置482-499，502-511，515-531，534-555，558-567，571-593，和596-612(对于模块1-7)延伸。对于ErbB2，这些模块分别从490-507，510-519，523-539，542-563，566-575，579-602和605-621(对于模块1-7)延伸。对于ErbB3，这些模块分别从481-498，501-510，514-530，533-554，557-566，570-591，和594-610(对于模块1-7)延伸。对于ErbB4，这些模块分别从478-495，498-507，511-527，530-552，555-564，568-589，和592-608(对于模块1-7)延伸。

通过任何合适的重组DNA技术，可以制备ErbB胞外域的合适部分，如本领域已知的，并在本文的实施例中描述。例如，现在可以定制编码希望的胞外域或胞外域部分的核苷酸序列，连接到一起，并克隆进表达载体。然后可将表达载体用于转化表达蛋白的细胞，然后可以从细胞或细胞上清液纯化结合分子。胞外域可以包括每个受体的全长胞外域。或者，胞外域可以在氨基或羧基末端截短。在氨基末端，胞外域可以始于例如位置1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更高的位置，只要不实质性减弱所得到的结合部分的结合活性。在羧基末端，胞外域可以终止在第7个模块、第6个模块、第5个模块、第4个模块、第3个模块、第2个模块、第1个模块之后或之内、甚至在第1个模块之前，例如参考ErbB1，在氨基酸序号500，512，532，556，568，594，613，对于ErbB3和ErbB4在对应位置。因而，对于ErbB1，可以使用例如氨基酸1-532[SEQ ID NO 2]或1-500[SEQ ID NO 22]。对于ErbB3，可以使用氨基酸1-499[SEQ ID NO.24]或1-531[SEQ IDNO 6]，以及其它序列。对于ErbB4，可以使用氨基酸1-496[SEQ ID NO26]或1-528[SEQ ID NO 8]，以及其它序列。

在一个实施方案中，可以修饰结合部分之一或二者的氨基酸序列，条件是，该修饰不会不利地影响结合部分对它的配体的结合亲和力。例如，通过制备残基或序列的不同置换或删除结合活性不需要的末端或内部残基或序列，可以构建经修饰的结合部分。一般而言，置换应当保守地进行；例如，最优选的置换氨基酸是具有与要替换的残基类似的生理化学特征的那些。类似地，当采用删除或插入策略时，应当考虑删除或插入对生物活性的潜在影响。为了保持结合部分的生物活性，删除和置换优选地产生同源的或保守置换的序列，这意味着给定残基被替换为生物学类似的残基。保守置换的实例包括将一个脂族残基置换为另一个，例如将Ile，Val，Leu，Met或Ala彼此置换，或将一个极性残基置换为另一个，例如在Lys和Arg；Glu和Asp；或Gln和Asn之间，众所周知其它这样的保守置换，例如，具有类似的疏水性特征的整个区域的置换。此外，在人、鼠或其它哺乳动物EGFR之间的特定氨基酸差异，提示可以在ErbB结合部分中产生、而不改变结合部分的基本生物特征的其它保守置换。

在一个实施方案中，二价结合分子可以以下述基序排列：B-L-B-F；B-L-rB-F和B-F-B。B代表结合部分，其可以源自受体。结合部分可以相同或不同。rB代表结合部分，其中氨基酸序列反转，使得氨基末端氨基酸变成羧基末端残基。ErbB1的一个示例性的序列是SEQ ID NO3，它是编码SEQ ID NO.1的一个这样的反转序列的核苷酸序列，以提供SEQ ID NO.4的氨基酸序列，它是SEQ.ID NO.2的序列的反转序列。根据需要，可以为ErbB3和ErbB4构建类似的反转。这样的反转序列可以定位作为羧基末端结合部分，以模仿受体如在膜中发现的那样的结构。

在优选的实施方案中，2个结合部分是不同的。合适的排列包括，例如，B1-L-B2-F，B2-L-B1-F，B1-F-B2，B2-F-B1。在具体实施方案中，B1和B2是不同的，是ErbB1，ErbB3和ErbB4的胞外域的部分。在一个特别优选的实施方案中，B1和B2分别是ErbB1和ErbB4。更具体地，对于ErbB1，氨基酸1-500和1-532可以用于形成有活性的结合分子，对于ErbB4，可以使用氨基酸1-496和1-528，以便当将ErbB1和ErbB4连接在单个多肽中时，它们形成对ErbB1和ErbB4配体都具有实质亲和力的二价结合分子，无论ErbB1是位于ErbB4的氨基还是羧基末端侧。当然，B1或B2可以是任何的其它受体或配体结合蛋白，且不一定从氨基酸序号1开始。

″L″是一个可选存在的连接部分，其可以用于连接结合部分。许多合适的接头分子是已知的，且可以使用。优选地，接头是非免疫原性的。关于接头和鉴别希望的接头的方法，参见，例如，George等人(2003)Protein Engineering 15：871-879，其通过参考特别地并入本文中。接头序列可以包括一个或多个天然连接到结合部分上的氨基酸，且可以添加，以提供特别希望的目标部位，允许组分结构域形成最佳的三级结构和/或增强组分与它的靶分子的相互作用。一个简单的接头是(Gly₄Ser)x，其中″X″可以是1到约10或更高的任何数字，在某些实施方案中，已经使用其中″X″是3的接头[SEQ ID NO：29]。但是，接头也可以是酰胺键。

″F″是一个可选存在的融合伴侣，可以是增强二价结合分子的功能的任何组分。合适的融合伴侣可以增强二价结合分子的生物活性，辅助它的产生和/或回收，或通过例如增强它的血清半衰期、组织渗透性、免疫原性的缺乏或稳定性，增强融合多肽的药理学性质或药代动力学谱。

当融合伴侣是血清蛋白或其片段时，它可以是α-1-微球蛋白，AGP-1，血清类粘蛋白，α-1-酸性糖蛋白，维生素D结合蛋白(DBP)，血液结合素，人血清白蛋白(hSA)，转铁蛋白，铁蛋白，afamin，触珠蛋白，甲胎蛋白，甲状腺球蛋白，α-2-HS-糖蛋白，β-2-糖蛋白，透明质烷-结合蛋白，突触融合蛋白，ClR，Clq a链，半乳凝素3-Mac2结合蛋白，纤维蛋白原，多聚Ig受体(PIGR)，α-2-巨球蛋白，尿素转运蛋白，触珠蛋白，IGFBP，巨噬细胞清除剂受体，纤连蛋白，巨蛋白，Fc(尤其包括IgG Fc结构域)，α-1-抗糜蛋白，α-1-抗胰蛋白酶，抗凝血酶III，载脂蛋白A-I，载脂蛋白B，β-2-微球蛋白，血浆铜蓝蛋白，补体成分C3或C4，CI酯酶抑制剂，C反应蛋白，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，和蛋白C。在需要时，包含融合伴侣组分，可以延长本发明的融合多肽的血清半衰期。

对于ErbB受体，在下面的表1中显示了已知的配体和受体结合特异性。因而，ErbB1和ErbB3结合部分的组合可以用于创建具有对EGF、TGFα、HB-EGF、β动物纤维素(Betacellulin)、双调蛋白、表皮调节素(Epiregulin)、Epigen、神经调节蛋白1α、神经调节蛋白1β、神经调节蛋白2α和神经调节蛋白2β的特异性的二价结合分子。ErbB1和ErbB4的结合域的组合具有对EGF、TGFα、HB-EGF、β动物纤维素、双调蛋白、表皮调节素、Epigen、神经调节蛋白1α、神经调节蛋白1β、神经调节蛋白2α、神经调节蛋白2β、神经调节蛋白3和神经调节蛋白4的结合亲和力，这包括所有已知的ErbB配体。

表1

配体受体特异性ErbB1●EGF

●TGFα●HB-EGF●β动物纤维素●双调蛋白●表皮调节素●EpigenErbB3●神经调节蛋白1α●神经调节蛋白1β●神经调节蛋白2α●神经调节蛋白2βErbB4●β动物纤维素●HB-EGF●表皮调节素●神经调节蛋白1α●神经调节蛋白1β●神经调节蛋白2α●神经调节蛋白2β●神经调节蛋白3●神经调节蛋白4

二价结合分子还将通常包括在它们的氨基末端处的信号序列。可以使用任何合适的信号序列，其中的许多是已知的。例如，在二价结合分子的第一个位置中的ErbB胞外域可以含有它自己的天然信号肽。或者，可以修饰该信号肽，以符合共有Kozak序列(GCCGCCACCATGG)，其中ATG是ErbB胞外域的起始密码子，在+4的位置改变成G，以符合共有Kozak序列。在下面的表2中可以发现合适的序列。

表2

信号肽序列 合适的ErbB1信号肽： 正常核苷酸序列ATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGGCAGCGCTCCTGGCGCTGCTGGCTGCGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGCT[SEQ ID NO.9]正常氨基酸序列M R P S G T A G A A L L A L L A A L C P A S R A[SEQ ID NO.10]修饰的核苷酸序列ATGGGACCCTCCGGGACGGCCGGGGCAGCGCTCCTGGCGCTGCTGGCTGCGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGCT[SEQ ID NO.11]修饰的氨基酸序列M G P S G T A G A A L L A L L A A L C P A S R A[SEQ ID NO 12]合适的ErbB3信号肽： 正常核苷酸序列ATGAGGGCGAACGACGCTCTGCAGGTGCTGGGCTTGCTTTTCAGCCTGGCCCGGGGC[SEQ ID NO 13]正常氨基酸序列M R A N D A L Q V L G L L F S L A R G[SEQ ID NO 14]修饰的核苷酸序列ATGGGGGCGAACGACGCTCTGCAGGTGCTGGGCTTGCTTTTCAGCCTGGCCCGGGGC[SEQ ID NO 15]修饰的氨基酸序列M G A N D A L Q V L G L L F S L A R G[SEQ ID NO 16]合适的ErbB4信号肽 正常核苷酸序列

ATGAAGCCGGCGACAGGACTTTGGGTCTGGGTGAGCCTTCTCGTGGCGGCGGGGACCGTCCAGCCCAGCGATTCT[SEQ ID NO 17]正常氨基酸序列M K P A T G L W V W V S L L V A A G T V Q P S D S[SEQ ID NO 18]修饰的核苷酸序列ATGGGGCCGGCGACAGGACTTTGGGTCTGGGTGAGCCTTCTCGTGGCGGCGGGGACCGTCCAGCCCAGCGATTCT[SEQ ID NO 19]修饰的氨基酸序列M G P A T G L W V W V S L L V A A G T V Q P S D S[SEQ ID NO 20]

公开的二价结合分子将包括从重组DNA分子表达的氨基酸序列。如上面指出的，重组DNA分子可以包括编码第一受体蛋白的一部分的第一核苷酸序列和编码第二受体蛋白的一部分的第二核苷酸序列。受体蛋白可以相同或不同，但是通常优选地包括不同的受体蛋白，使得二价结合分子会结合更广谱的结合分子。在这样的情况下，第一和第二受体蛋白通常从不同的基因编码。

可以将编码二价结合部分、可选存在的接头和可选存在的融合伴侣的核苷酸序列与转录和翻译序列一起克隆进重组DNA构建体，其排列使得二价结合分子可以作为单个多肽链在合适的宿主中表达。本领域技术人员已知的将DNA片段插入载体中的任何方法，可以用于构建在转录/翻译控制信号控制下的编码本发明的融合多肽的表达载体。选择可以用于在合适宿主中表达基因的转录和翻译序列，是在本领域技术人员的技能范围内。可以使用从它们的重组基因产生公开的分子的任何宿主细胞。合适的宿主细胞包括、但不限于，细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。在许多情况下，将受体糖基化，糖基化可以影响配体结合。因而，宿主的选择可依赖于宿主细胞产生的糖基化模式。可以使用可生成具有合适的结合亲和力的配体结合分子的任何宿主细胞。在含有ErbB的结合分子的情况下，可以使用例如哺乳动物宿主细胞，例如更具体的CHO细胞。

许多合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。可以用于控制嵌合多肽分子的表达的启动子包括、但不限于，长末端重复序列；SV40早期启动子区域，CMV，M-MuLV，胸苷激酶启动子，金属硫蛋白基因的调节序列；原核表达载体例如β-内酰胺酶启动子或tac启动子；来自酵母或其它真菌的启动子元件例如Gal 4启动子，ADH，PGK，碱性磷酸酶，和源自诸如弹性蛋白酶I的基因的组织特异性的转录控制区。

通过允许所产生的双诱捕分子的稳定二价结合的任何技术，可以纯化所公开的二价结合分子。例如，二价结合分子可以作为可溶蛋白或作为包涵体从细胞回收，通过8M盐酸胍和透析可以从包涵体中将它们定量提取，如已知的。或者，可以使用二价结合分子、常规的离子交换色谱、疏水相互作用色谱、反相色谱或凝胶过滤。也可以使用利用固定化的配体或配体模仿物的亲和技术。

使用生物传感器技术或通过本领域众所周知的经典结合测定例如ELISA，可以测量二价结合分子中候选截短胞外域的结合亲和力和抑制剂效力。

二价结合分子可以用作单一疗法或用于联合疗法中。在许多实施方案中，二价结合分子可以与一种或多种其它化合物或疗法联合施用，包括化疗剂、手术、导管装置和辐照。联合疗法包括施用含有二价结合分子和一种或多种其它试剂的单一药物给药制剂；以及将二价结合分子和一种或多种其它试剂在其各自分开的药物给药制剂中给药。例如，二价结合分子和细胞毒性剂、化疗剂或生长抑制剂可以在单一给药组合物(例如联合制剂)中一起施用给患者，或每种试剂可以在分开的给药制剂中施用。更具体地，二价结合分子可以在联合疗法中与治疗剂(例如拉帕替尼，赫赛汀^TM，艾比特思(Erbitux)等)一起使用。在使用分开的给药制剂的情况下，本发明的融合多肽和一种或多种其它试剂可以同时或在分别错开的时间(即，序贯)施用。

图2证实了当用乳腺癌细胞培养物测试时，几种二价结合分子的体外功效。在图2的上排，在对照培养基(上排)或先前用ErbB3配体结合分子″单诱捕分子″或单价结合分子进行条件作用的培养基(下排)中培养乳腺癌细胞。然后将细胞不作处理、用1μM GW2974(普通的GW572016)或用GW2974+NDF(调蛋白)处理。可以观察到，ErbB3单诱捕分子增强了双重抑制剂毒性，并逆转了NDF依赖性的对双重抑制剂的抗性。

本发明也提供了药物组合物，其包含本发明的二价结合分子。这样的组合物包含治疗有效量的二价结合分子和药学可接受的载体。术语″药学可接受的″是指被联邦或者州政府的管理机构批准，或列在美国药典或其它公认的用于动物更特别是人的药典中。术语″载体″是指与治疗剂一起施用的稀释剂、辅剂、赋形剂或介质。这样的药用载体可以是无菌的液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，例如花生油，大豆油，矿物油，芝麻油等。合适的药物赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，稻米，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油酯，滑石，氯化钠，脱脂奶粉，甘油，丙烯，乙二醇，水，乙醇等。如果需要，组合物也可以含有小量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、持续释放制剂等的形式。药学可接受的载体包括在制剂中使用的其它成分，例如DPPC，DOPE，DSPC和DOPC。可以使用天然的或合成的表面活性剂。可以使用PEG(甚至除了它衍生蛋白或类似物的用途之外)。可以使用葡聚糖，例如环葡聚糖(环糊精)。可以使用胆汁盐和其它有关的增强剂。可以使用纤维素和纤维素衍生物。可以使用氨基酸，例如用于缓冲制剂中。药学可接受的稀释剂包括，具有不同内容物(例如，Tris-HCl，醋酸盐，磷酸盐)、pH和离子强度的缓冲剂；添加剂例如去污剂和增溶剂(例如，TWEED^TM80，聚山梨酯80)，抗氧化剂(例如，抗坏血酸，偏亚硫酸氢钠)，防腐剂(例如，硫柳汞，苯甲醇)和填充物(例如，乳糖，甘露醇)；所述材料掺入诸如聚乳酸、聚乙醇酸等聚合化合物的颗粒制剂中，或掺入脂质体中。也可以使用玻璃酸，这可以具有促进在循环中的持续时间的作用。这样的组合物可以影响本发明的蛋白和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，18th Ed.(1990，Mack PuBlishing Co.，Easton，PA 18042)第1435-1712页，其通过参考并入本文中。组合物可以制成液体形式，或可以是干燥的粉末，例如低压冻干形式。也考虑到可植入的持续释放制剂，例如透皮制剂。也考虑到脂质体、微囊或微球、包合复合物或其它类型的载体。

基于本发明的描述，通过标准的临床技术，可以确定对于它的目的治疗用途有效的活性二价结合分子的量。另外，体外测定可以任选地用于辅助确定最佳剂量范围。通常，日给药方案应当在0.1-1000微克活性物/kg体重的范围内，优选0.1-150微克/kg。有效剂量可以从衍生自体外或动物模型实验系统的剂量响应曲线推知。可以单个地调节给药量和间隔时间，以提供足以维持治疗效果的化合物血浆水平。在局部给药或选择性摄入的情况下，化合物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。主治医师考虑会改变药物作用的不同因素，例如患者的年龄、状况、体重、性别和饮食，疾病的严重性，给药时间和其它临床因素，可以确定在治疗方法中涉及的给药方案。

施用的化合物的量当然依赖于所治疗的受试者、受试者的体重、疾患的严重性、给药方式和处方医师的判断。在症状可检测到，或甚至检测不到时，可以间歇地重复治疗。可以单独地或与其它药物组合地提供治疗。

公开了用于治疗需要治疗的患者的方法，其包括，得到可结合ErbB配体的结合分子，和从血清去除该配体的一部分。本文公开的结合分子可以通过标准方法固定化到固体支持物上，例如apheresis(血液成分部分清除)或biocore支持物。当将结合分子固定化在固体支持物上时，可以使患者的血清或血液接触在apheresis柱中的所述固体支持物，以从血液中去除所述ErbB配体的一部分。

在一种方法中，公开的二价结合分子可以用于检测ErbB配体的过表达的诊断方法中。特征在于ErbB受体的过度激活的癌症，可以由超过相同组织类型的非癌性细胞中的过度激活造成。这样的过度激活可以由ErbB受体的过表达和/或超过正常水平的ErbB配体造成。

在一个实施方案中，可以对癌症进行诊断或预后测定，以确定ErbB受体的过度激活是否由ErbB配体的过表达造成。可以用任何检测标记来标记二价结合分子，例如放射性或对比标记。然后可以使所述分子接触癌细胞，并使用本领域已知的标准方法来显现观察。例如，该方法可以如下进行：施用二价结合分子，它会结合待检测分子且用检测标记(例如放射性同位素)予以标记，和在外部扫描患者以定位标记。

实施例1

本实施例证实了具有2个ErbB受体胞外结构域的二价结合分子的代表性组合物的构建。

通过结合ErbB1和ErbB3或ErbB1和ErbB4的胞外结构域，将ErbB二价结合分子设计成结合ErbB家族的所有配体。为每对设计2个不同的方向。从而制备了下述组合：ErbB1-ErbB3，ErbB3-ErbB1，ErbB1-ErbB4和ErbB4-ErbB1。

pcDNA3.1(+)载体用作克隆载体，以促进构建体的构建，这是因为它的广泛的多克隆位点。首先，将烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶识别序列(ETVRFQG/S)[SEQ ID NO：27]的寡核苷酸、随后为6x组氨酸标记和终止密码子克隆进pcDNA3.1(+)的XbaI和ApaI位点，以产生pcDNA3.1(+)-TH。所述寡核苷酸包括在ApaI位点上游的NotI位点，所以该构建体最终会从pcDNA3.1(+)释放出来。使用具有嵌入ApaI位点上游的XbaI位点和NotI位点的TEV-6xHis-STOP有义寡核苷酸：5′CTA GAG AAA ACC TGT ACT TCC AGT CCC ATC ATC ATC ATC ATC ATT GAGCGG CCG CGG GCC[SEQ ID NO 28]，以及具有嵌入ApaI位点上游的XbaI位点和NotI位点的TEV-6xHis-STOP反义寡核苷酸：5′CGC GGCCGC TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG GGA CTG GAA GTA CAG GTT TTC T[SEQ ID NO 30]。

将ErbB1或ErbB4的胞外结构域的前3个亚结构域(LI，SI，LII，如已知的)和第4个亚结构域(SII，如已知的)的第1个模块与接头序列一起克隆进pcDNA3.1(+)-TH的NheI和KpnI位点。具体地，所述接头序列编码以下组成的15个氨基酸的(Gly₄Ser)₃肽：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser[SEQ ID NO：29]。将正向PCR引物设计成扩增信号肽加上ErbB1和ErbB4的LI，SI，LII以及SII亚结构域的第1个模块。如已知的，将共有的″Kozak″序列掺入引物中信号肽起始密码子的立即上游。将反向PCR引物设计成包括多至(且包含)ErbB1的V500氨基酸和ErbB4的L496氨基酸(在ErbB1的信号肽后面的亮氨酸定义为L1氨基酸，在ErbB4的信号肽后面的谷氨酰胺定义为Q1氨基酸)，其后是AgeI位点、(Gly₄Ser)₃接头序列[SEQ ID NO 29]和KpnI位点。具有NheI位点和共有的″Kozak″序列的ErbB1正向引物序列如下：5′AGC TGCTAG CGC CAC CAT GCG ACC CTC CGG GAC GGC CG[SEQ ID NO 31]。具有NheI位点和共有的″Kozak″序列的ErbB4正向引物序列如下：5′AGC TGC TAG CGC CAC CAT GAA GCC GGC GAC AGG ACT TT[SEQ ID NO32]。具有AgeI位点、(Gly₄Ser)₃接头序列和KpnI位点的ErbB1反向引物序列是5′TCT GGT ACC CGA TCC GCC ACC GCC AGA GCC ACC TCCGCC TGA ACC GCC TCC ACC ACC GGT GAC GCA GTC CCT GGG CTC CGG GCCC[SEQ ID NO 33]。具有AgeI位点、(Gly₄Ser)₃[SEQ TD NO：29]接头序列和KpnI位点的ErbB1反向引物序列是5′TCT GGT ACC CGA TCCGCC ACC GCC AGA GCC ACC TCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC ACC GGT CAGACA TTG GTC TGG CCC AGG TCC C[SEQ ID NO 34]。

从ErbB1或ErbB4的全长cDNA扩增胞外结构域。这产生质粒pcDNA3.1(+)-ECD1-GS-TH和pcDNA3.1(+)-ECD4-GS-TH。

为了构建ErbB3构建体，通过PCR从全长cDNA扩增ErbB3的胞外结构域的前3个亚结构域(L1，SI和LII)和第4个亚结构域(SII)的第1个模块，并克隆进pcDNA3.1(+)-ECD4-GS-TH的NheI和AgeI位点。如前所述设计正向PCR引物，以将NheI位点和共有的″Kozak″序列掺入ErbB3的信号肽起始密码子的立即上游。具有NheI位点和共有的″Kozak″序列的ErbB3正向引物序列是5′AGC GCT AGC GCC ACC ATGAGG GCG AAC GAC GCT CTG CAG G[SEQ ID NO 35]，具有AgeI位点的ErbB3反向引物序列是5′AGC ACC GGT CAA GCA CTG ACC AGG GCCTGG GCC C[SEQ ID NO 36]。

从ErbB3的全长cDNA扩增胞外结构域，并用于产生质粒pcDNA3.1(+)-ECD3-GS-TH。

将第2个ErbB胞外结构域克隆进每个构建体。这通过扩增ErbB1、ErbB3或ErbB4的胞外结构域的前3个亚结构域(LI，SI和LII)和SII亚结构域的第1个模块来实现。与第一个位置相比，置于构建体的第二个位置中的胞外结构域之间的唯一差别是，没有包含信号肽。设计具有KpnI位点的正向PCR引物，以扩增ErbB1、ErbB3或ErbB4的前3个亚结构域和第4个亚结构域的第1个模块。还设计具有XbaI位点的反向PCR引物，以扩增ErbB1、ErbB3或ErbB4。每个胞外结构域的最后一个氨基酸是V500(ErbB1)，L499(ErbB3)和L496(ErbB4)。具有KpnI位点的ErbB1第二位置正向引物是5′CGG GGT ACC CTG GAGGAA AAG AAA GTT TGC C[SEQ ID NO 37]。具有KpnI位点的ErbB3第二位置正向引物是5′CGG GGT ACC TCC GAG GTG GGC AAC TCT CAGGCA G[SEQ ID NO.：38]。具有KpnI位点的ErbB4第二位置正向引物是5′CGG GGT ACC CAG TCA GTG TGT GCA GGA ACG G[SEQ ID NO.：39]。具有XbaI位点的ErbB1第二位置反向引物是5′TGC TCT AGA GACGCA GTC CCT GGG CTC CGG G[SEQ ID NO.：40]。具有XbaI位点的ErbB3第二位置反向引物是5′TGC TCT AGA CAA GCA CTG ACC AGG GCCTGG GCC C[SEQ ID NO.：41]。具有XbaI位点的ErbB4第二位置反向引物是5′TGC TCT AGA CAG ACA TTG GTC TGG CCC AGG T[SEQ IDNO.：42]。

将ErbB1的胞外结构域克隆进pcDNA3.1(+)-ECD3-GS-TH和pcDNA3.1(+)-ECD4-GS-TH的第二位置，以产生质粒pcDNA3.1(+)-ECD3-GS-ECD1-TH和pcDNA3.1(+)-ECD4-GS-ECD1-TH。将ErbB3的胞外结构域克隆进pcDNA3.1(+)-ECD1-GS-TH的第二位置，以产生质粒pcDNA3.1(+)-ECD1-GS-ECD3-TH。将ErbB4的胞外结构域克隆进pcDNA3.1(+)-ECD1-GS-TH的第二位置，以产生质粒pcDNA3.1(+)-ECD1-GS-ECD4-TH。

通过直接测序，验证所有构建体。将双顺反子质粒pEF-IRES-P用于表达，其含有延伸因子1α(EF1α)启动子和由IRES序列表达的嘌呤霉素抗性基因(在多克隆位点后)。通过用NheI和NotI进行限制内切核酸酶消化，从pcDNA3.1(+)释放所有4个双诱捕分子构建体，并克隆进pEF-IRES-P中的相同位点。这产生质粒pEF-ECD13-IRES-P，pEF-ECD31-IRES-P，pEF-ECD14-IRES-P和pEF-ECD41-IRES-P，它们分别用于表达ErbB1-ErbB3，ErbB3-ErbB1，ErbB1-ErbB4，和ErbB4-ErbB1蛋白，第一结合部分位于靠近蛋白的氨基末端。

实施例2

本实施例证实了在哺乳动物宿主细胞中由重组DNA分子表达双诱捕分子及其活性形式的纯化。用PvuI消化来自实施例1的所有4个构建体，以产生线性重组DNA分子，其更适合于稳定地整合进细胞基因组DNA。通过标准方法，将4种线性化的双诱捕分子转染进293T细胞，然后在逐渐升高浓度的嘌呤霉素中选择，以产生稳定整合了构建体的细胞群体。可以通过不同方式评判构建体的表达，例如蛋白印迹，以检测在分泌之前细胞中诱捕分子的水平，如图3所示，或ELISA，如图4所示，以测定细胞培养基中结合分子的浓度。ELISA测定用于筛选大量单个细胞，以建立克隆衍生的表达最高水平诱捕分子的细胞系。结合分子含有组氨酸标记，这允许通过简单的亲和纯化方法纯化所述分子。

为了测试结合分子的功能，收集来自293T细胞的条件培养基，过滤，并用于培养BT474细胞。在用来自表达pEF-ECD14-IRES-P构建体的293T细胞的培养基培养的BT474细胞中，在48小时后观察到细胞数的显著减少。参见图5。

序列表

<110>TARGETED MOLECULAR DIAGNOSTICS，LLC

     YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO.LTD.

     BACUS，Sarah

     HILL，Jason

     YARDEN，Yosef

     KOCHUPURAKKAL，Bose S.

<120>二价ErbB配体结合分子及其制备和使用方法

<130>115881-18

<150>US 60/771,237

<151>2006-02-08

<150>US 60/828,343

<151>2006-10-05

<160>42

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1596

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

ctggaggaaa agaaagtttg ccaaggcacg agtaacaagc tcacgcagtt gggcactttt    60

gaagatcatt ttctcagcct ccagaggatg ttcaataact gtgaggtggt ccttgggaat    120

ttggaaatta cctatgtgca gaggaattat gatctttcct tcttaaagac catccaggag    180

gtggctggtt atgtcctcat tgccctcaac acagtggagc gaattccttt ggaaaacctg    240

cagatcatca gaggaaatat gtactacgaa aattcctatg ccttagcagt cttatctaac    300

tatgatgcaa ataaaaccgg actgaaggag ctgcccatga gaaatttaca ggaaatcctg    360

catggcgccg tgcggttcag caacaaccct gccctgtgca acgtggagag catccagtgg    420

cgggacatag tcagcagtga ctttctcagc aacatgtcga tggacttcca gaaccacctg    480

ggcagctgcc aaaagtgtga tccaagctgt cccaatggga gctgctgggg tgcaggagag    540

gagaactgcc agaaactgac caaaatcatc tgtgcccagc agtgctccgg gcgctgccgt    600

ggcaagtccc ccagtgactg ctgccacaac cagtgtgctg caggctgcac aggcccccgg    660

gagagcgact gcctggtctg ccgcaaattc cgagacgaag ccacgtgcaa ggacacctgc    720

cccccactca tgctctacaa ccccaccacg taccagatgg atgtgaaccc cgagggcaaa    780

tacagctttg gtgccacctg cgtgaagaag tgtccccgta attatgtggt gacagatcac    840

ggctcgtgcg tccgagcctg tggggccgac agctatgaga tggaggaaga cggcgtccgc    900

aagtgtaaga agtgcgaagg gccttgccgc aaagtgtgta acggaatagg tattggtgaa    960

tttaaagact cactctccat aaatgctacg aatattaaac acttcaaaaa ctgcacctcc    1020

atcagtggcg atctccacat cctgccggtg gcatttaggg gtgactcctt cacacatact  1080

cctcctctgg atccacagga actggatatt ctgaaaaccg taaaggaaat cacagggttt  1140

ttgctgattc aggcttggcc tgaaaacagg acggacctcc atgcctttga gaacctagaa  1200

atcatacgcg gcaggaccaa gcaacatggt cagttttctc ttgcagtcgt cagcctgaac  1260

ataacatcct tgggattacg ctccctcaag gagataagtg atggagatgt gataatttca  1320

ggaaacaaaa atttgtgcta tgcaaataca ataaactgga aaaaactgtt tgggacctcc  1380

ggtcagaaaa ccaaaattat aagcaacaga ggtgaaaaca gctgcaaggc cacaggccag  1440

gtctgccatg ccttgtgctc ccccgagggc tgctggggcc cggagcccag ggactgcgtc  1500

tcttgccgga atgtcagccg aggcagggaa tgcgtggaca agtgcaacct tctggagggt  1560

gagccaaggg agtttgtgga gaactctgag tgcata                            1596

<210>2

<211>532

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln

1               5                   10                  15

Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn

            20                  25                  30

Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg

        35                  40                  45

Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr

    50                  55                  60

Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala

                85                  90                  95

Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro

            100                 105                 110

Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn

        115                 120                 125

Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val

    130                 135                 140

Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu

145                 150                 155                 160

Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp

                165                 170                 175

Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala

            180                 185                 190

Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys

        195                 200                 205

His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys

    210                 215                 220

Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys

225                 230                 235                 240

Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn

                245                 250                 255

Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro

            260                 265                 270

Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly

        275                 280                 285

Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys

    290                 295                 300

Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu

305                 310                 315                 320

Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys

                325                 330                 335

Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe

            340                 345                 350

Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu

        355                 360                 365

Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln

    370                 375                 380

Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu

385                 390                 395                 400

Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val

                405                 410                 415

Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile

            420                 425                 430

Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala

        435                 440                 445

Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr

    450                 455                 460

Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln

465                 470                 475                 480

Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro

                485                 490                 495

Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val

            500                 505                 510

Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn

        515                 520                 525

Ser Glu Cys Ile

    530

<210>3

<211>1596

<212>DNA

<213>智人

<400>3

atatgcgagt ctaacgaggt gtttgagagg ccagagggtg agctgcttaa ctgcaaggac    60

gtgtgcgaaa ggggccgaag cgtcaatcgg tgctctgtct gcgacaggcc cgagccgggc    120

tggtgcggcg agccctcctg cttggcccat tgcgtccagg gcacagccaa gtgcagcaac    180

gaaggtagaa acagcataat taaaaccaaa cagggttcca ccgggtttct gaaaaaatgg    240

aacataacaa atgcatattg cttgaataaa aacggatcaa ttatagtgga tggagatagt    300

atagagaagc tctcccgctt aggattgtcc acaataaacc tgagcgtcgt cgcactttct    360

tttcagggtc atcaaaagac caggggccgc ataatcgaac taaacgagtt tgcccatctc    420

gacacgagga acgaaccttg ggctcagatt ctgttgtttg ggacaatcga aaaggtaacc    480

aaactgattg atctggaaca gccagatctg cctcctactc atacattctc cgacggtagg    540

tttgcagtgc cgctgatcca cctcgatggc agtatctcca cctgcaacaa attccacaaa    600

attaatacgg ctaatatatc cctctcagac aaatttgaag gtattggtat aggaaactgt    660

gtgaaacgct gccctgggga atgcaagaag tgtaagcgcg tcggcgacga agagatggag    720

tatagcgacg ccgggtgtgc ccgagtctgc tcgggccacg atacagtggt gtataatcgt    780

ccctgtaaga aggtgtgcac cgccggtttt agctacaaag gcgagcccaa cgtggatatg    840

cagtacacga cccccaacta cctcatgctc ccaccctgca ccgacaagtg cacggccgaa    900

gaccgattca aacgctgcgt cctgtgcgac agcgagcggc ccggcacatg cggcgcagct    960

tgtcagaacc actgctgcga cagtccctcc aagggccgtt gccgcgggtc ctgccagcag    1020

gcctgtatca tcaaaaccct gaaacagtgc aacgaggagg gagcaggttg gtgcagcggg    1080

aatccctgta gcccagattg taagcaatgc agcggcctgc acaaccagtt cgacatgtcg    1140

atgaacagcc tctttgacag tagcgtcata gaccggtggc agatcagcga ggtgaactgc    1200

ctggccccta acaacagctt ccgggtggcc ggccatctga tcgaacagtt aaatagaatg    1260

cccctggaga agctgggaac caaaaatgca gattataact ctttagtcgc attagcctat    1320

tccaatgaat actacatgaa tggaagaatc atccagctga acgaattgcc tattcgagag    1380

gtgacaaacc tcgccattct cgtctatggt gctgtggagc agatcaccaa gttattctcc    1440

cttgattata ataggcaggt gtataccatt gaattgaatg ggcttgtcgt ggagtgtaac    1500

aatttcatga ggcagctcag cctctttcat gatgaattta ctggcttgca gacgctcaag    1560

aacagtacgg gccaatgcgt taaaaaggaa gagctg                              1596

<210>4

<211>532

<212>PRT

<213>智人

<400>4

Ile Cys Glu Ser Asn Glu Val Phe Glu Arg Pro Glu Gly Glu Leu Leu

1               5                   10                  15

Asn Cys Lys Asp Val Cys Glu Arg Gly Arg Ser Val Asn Arg Cys Ser

            20                  25                  30

Val Cys Asp Arg Pro Glu Pro Gly Trp Cys Gly Glu Pro Ser Cys Leu

        35                  40                  45

Ala His Cys Val Gln Gly Thr Ala Lys Cys Ser Asn Glu Gly Arg Asn

    50                  55                  60

Ser Ile Ile Lys Thr Lys Gln Gly Ser Thr Gly Phe Leu Lys Lys Trp

65                  70                  75                  80

Asn Ile Thr Asn Ala Tyr Cys Leu Asn Lys Asn Gly Ser Ile Ile Val

                85                  90                  95

Asp Gly Asp Ser Ile Glu Lys Leu Ser Arg Leu Gly Leu Ser Thr Ile

            100                 105                 110

Asn Leu Ser Val Val Ala Leu Ser Phe Gln Gly His Gln Lys Thr Arg

        115                 120                 125

Gly Arg Ile Ile Glu Leu Asn Glu Phe Ala His Leu Asp Thr Arg Asn

    130                 135                 140

Glu Pro Trp Ala Gln Ile Leu Leu Phe Gly Thr Ile Glu Lys Val Thr

145                 150                 155                 160

Lys Leu Ile Asp Leu Glu Gln Pro Asp Leu Pro Pro Thr His Thr Phe

                165                 170                 175

Ser Asp Gly Arg Phe Ala Val Pro Leu Ile His Leu Asp Gly Ser Ile

            180                 185                 190

Ser Thr Cys Asn Lys Phe His Lys Ile Asn Thr Ala Asn Ile Ser Leu

        195                 200                 205

Ser Asp Lys Phe Glu Gly Ile Gly Ile Gly Asn Cys Val Lys Arg Cys

    210                 215                 220

Pro Gly Glu Cys Lys Lys Cys Lys Arg Val Gly Asp Glu Glu Met Glu

225                 230                 235                 240

Tyr Ser Asp Ala Gly Cys Ala Arg Val Cys Ser Gly His Asp Thr Val

                245                 250                 255

Val Tyr Asn Arg Pro Cys Lys Lys Val Cys Thr Ala Gly Phe Ser Tyr

            260                 265                 270

Lys Gly Glu Pro Asn Val Asp Met Gln Tyr Thr Thr Pro Asn Tyr Leu

        275                 280                 285

Met Leu Pro Pro Cys Thr Asp Lys Cys Thr Ala Glu Asp Arg Phe Lys

    290                 295                 300

Arg Cys Val Leu Cys Asp Ser Glu Arg Pro Gly Thr Cys Gly Ala Ala

305                 310                 315                 320

Cys Gln Asn His Cys Cys Asp Ser Pro Ser Lys Gly Arg Cys Arg Gly

                325                 330                 335

Ser Cys Gln Gln Ala Cys Ile Ile Lys Thr Leu Lys Gln Cys Asn Glu

            340                 345                 350

Glu Gly Ala Gly Trp Cys Ser Gly Asn Pro Cys Ser Pro Asp Cys Lys

        355                 360                 365

Gln Cys Ser Gly Leu His Asn Gln Phe Asp Met Ser Met Asn Ser Leu

    370                 375                 380

Phe Asp Ser Ser Val Ile Asp Arg Trp Gln Ile Ser Glu Val Asn Cys

385                 390                 395                 400

Leu Ala Pro Asn Asn Ser Phe Arg Val Ala Gly His Leu Ile Glu Gln

                405                 410                 415

Leu Asn Arg Met Pro Leu Glu Lys Leu Gly Thr Lys Asn Ala Asp Tyr

            420                 425                 430

Asn Ser Leu Val Ala Leu Ala Tyr Ser Asn Glu Tyr Tyr Met Asn Gly

        435                 440                 445

Arg Ile Ile Gln Leu Asn Glu Leu Pro Ile Arg Glu Val Thr Asn Leu

    450                 455                 460

Ala Ile Leu Val Tyr Gly Ala Val Glu Gln Ile Thr Lys Leu Phe Ser

465                 470                 475                 480

Leu Asp Tyr Asn Arg Gln Val Tyr Thr Ile Glu Leu Asn Gly Leu Val

                485                 490                 495

Val Glu Cys Asn Asn Phe Met Arg Gln Leu Ser Leu Phe His Asp Glu

            500                 505                 510

Phe Thr Gly Leu Gln Thr Leu Lys Asn Ser Thr Gly Gln Cys Val Lys

        515                 520                 525

Lys Glu Glu Leu

    530

<210>5

<211>1593

<212>DNA

<213>智人

<400>5

tccgaggtgg gcaactctca ggcagtgtgt cctgggactc tgaatggcct gagtgtgacc    60

ggcgatgctg agaaccaata ccagacactg tacaagctct acgagaggtg tgaggtggtg    120

atggggaacc ttgagattgt gctcacggga cacaatgccg acctctcctt cctgcagtgg    180

attcgagaag tgacaggcta tgtcctcgtg gccatgaatg aattctctac tctaccattg    240

cccaacctcc gcgtggtgcg agggacccag gtctacgatg ggaagtttgc catcttcgtc    300

atgttgaact ataacaccaa ctccagccac gctctgcgcc agctccgctt gactcagctc    360

accgagattc tgtcaggggg tgtttatatt gagaagaacg ataagctttg tcacatggac    420

acaattgact ggagggacat cgtgagggac cgagatgctg agatagtggt gaaggacaat    480

ggcagaagct gtcccccctg tcatgaggtt tgcaaggggc gatgctgggg tcctggatca    540

gaagactgcc agacattgac caagaccatc tgtgctcctc agtgtaatgg tcactgcttt    600

gggcccaacc ccaaccagtg ctgccatgat gagtgtgccg ggggctgctc aggccctcag    660

gacacagact gctttgcctg ccggcacttc aatgacagtg gagcctgtgt acctcgctgt    720

ccacagcctc ttgtctacaa caagctaact ttccagctgg aacccaatcc ccacaccaag    780

tatcagtatg gaggagtttg tgtagccagc tgtccccata actttgtggt ggatcaaaca    840

tcctgtgtca gggcctgtcc tcctgacaag atggaagtag ataaaaatgg gctcaagatg    900

tgtgagcctt gtgggggact atgtcccaaa gcctgtgagg gaacaggctc tgggagccgc    960

ttccagactg tggactcgag caacattgat ggatttgtga actgcaccaa gatcctgggc    1020

aacctggact ttctgatcac cggcctcaat ggagacccct ggcacaagat ccctgccctg    1080

gacccagaga agctcaatgt cttccggaca gtacgggaga tcacaggtta cctgaacatc    1140

cagtcctggc cgccccacat gcacaacttc agtgtttttt ccaatttgac aaccattgga    1200

ggcagaagcc tctacaaccg gggcttctca ttgttgatca tgaagaactt gaatgtcaca    1260

tctctgggct tccgatccct gaaggaaatt agtgctgggc gtatctatat aagtgccaat    1320

aggcagctct gctaccacca ctctttgaac tggaccaagg tgcttcgggg gcctacggaa    1380

gagcgactag acatcaagca taatcggccg cgcagagact gcgtggcaga gggcaaagtg    1440

tgtgacccac tgtgctcctc tgggggatgc tggggcccag gccctggtca gtgcttgtcc    1500

tgtcgaaatt atagccgagg aggtgtctgt gtgacccact gcaactttct gaatggggag    1560

cctcgagaat ttgcccatga ggccgaatgc ttc                                 1593

<210>6

<211>531

<212>PRT

<213>智人

<400>6

Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr Leu Asn Gly

1               5                   10                  15

Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr Leu Tyr Lys

            20                  25                  30

Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu

        35                  40                  45

Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val

    50                  55                  60

Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu

65                  70                  75                  80

Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe

                85                  90                  95

Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu

            100                 105                 110

Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val

        115                 120                 125

Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr Ile Asp Trp

    130                 135                 140

Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val Lys Asp Asn

145                 150                 155                 160

Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly Arg Cys Trp

                165                 170                 175

Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala

            180                 185                 190

Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys

        195                 200                 205

His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys

    210                 215                 220

Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val Pro Arg Cys

225                 230                 235                 240

Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn

                245                 250                 255

Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala Ser Cys Pro

            260                 265                 270

His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Pro

        275                 280                 285

Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys Glu Pro Cys

    290                 295                 300

Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser Gly Ser Arg

305                 310                 315                 320

Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val Asn Cys Thr

                325                 330                 335

Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu Asn Gly Asp

            340                 345                 350

Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe

        355                 360                 365

Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro

    370                 375                 380

Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr Thr Ile Gly

385                 390                 395                 400

Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile Met Lys Asn

                405                 410                 415

Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala

            420                 425                 430

Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser

        435                 440                 445

Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu Arg Leu Asp

    450                 455                 460

Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu Gly Lys Val

465                 470                 475                 480

Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Gly

                485                 490                 495

Gln Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr Ser Arg Gly Gly Val Cys Val Thr

            500                 505                 510

His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu Pro Arg Glu Phe Ala His Glu Ala

        515                 520                 525

Glu Cys Phe

    530

<210>7

<211>1584

<212>DNA

<213>智人

<400>7

cagtcagtgt gtgcaggaac ggagaataaa ctgagctctc tctctgacct ggaacagcag    60

taccgagcct tgcgcaagta ctatgaaaac tgtgaggttg tcatgggcaa cctggagata    120

accagcattg agcacaaccg ggacctctcc ttcctgcggt ctgttcgaga agtcacaggc    180

tacgtgttag tggctcttaa tcagtttcgt tacctgcctc tggagaattt acgcattatt    240

cgtgggacaa aactttatga ggatcgatat gccttggcaa tatttttaaa ctacagaaaa    300

gatggaaact ttggacttca agaacttgga ttaaagaact tgacagaaat cctaaatggt    360

ggagtctatg tagaccagaa caaattcctt tgttatgcag acaccattca ttggcaagat    420

attgttcgga acccatggcc ttccaacttg actcttgtgt caacaaatgg tagttcagga    480

tgtggacgtt gccataagtc ctgtactggc cgttgctggg gacccacaga aaatcattgc    540

cagactttga caaggacggt gtgtgcagaa caatgtgacg gcagatgcta cggaccttac    600

gtcagtgact gctgccatcg agaatgtgct ggaggctgct caggacctaa ggacacagac    660

tgctttgcct gcatgaattt caatgacagt ggagcatgtg ttactcagtg tccccaaacc    720

tttgtctaca atccaaccac ctttcaactg gagcacaatt tcaatgcaaa gtacacatat    780

ggagcattct gtgtcaagaa atgtccacat aactttgtgg tagattccag ttcttgtgtg    840

cgtgcctgcc ctagttccaa gatggaagta gaagaaaatg ggattaaaat gtgtaaacct    900

tgcactgaca tttgcccaaa agcttgtgat ggcattggca caggatcatt gatgtcagct    960

cagactgtgg attccagtaa cattgacaaa ttcataaact gtaccaagat caatgggaat    1020

ttgatctttc tagtcactgg tattcatggg gacccttaca atgcaattga agccatagac    1080

ccagagaaac tgaacgtctt tcggacagtc agagagataa caggtttcct gaacatacag    1140

tcatggccac caaacatgac tgacttcagt gttttttcta acctggtgac cattggtgga    1200

agagtactct atagtggcct gtccttgctt atcctcaagc aacagggcat cacctctcta    1260

cagttccagt ccctgaagga aatcagcgca ggaaacatct atattactga caacagcaac    1320

ctgtgttatt atcataccat taactggaca acactcttca gcacaatcaa ccagagaata    1380

gtaatccggg acaacagaaa agctgaaaat tgtactgctg aaggaatggt gtgcaaccat    1440

ctgtgttcca gtgatggctg ttggggacct gggccagacc aatgtctgtc gtgtcgccgc    1500

ttcagtagag gaaggatctg catagagtct tgtaacctct atgatggtga atttcgggag    1560

tttgagaatg gctccatctg tgtg                                  1584

<210>8

<211>528

<212>PRT

<213>智人

<400>8

Gln Ser Val Cys Ala Gly Thr Glu Asn Lys Leu Ser Ser Leu Ser Asp

1               5                   10                  15

Leu Glu Gln Gln Tyr Arg Ala Leu Arg Lys Tyr Tyr Glu Asn Cys Glu

            20                  25                  30

Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Thr Ser Ile Glu His Asn Arg Asp

        35                  40                  45

Leu Ser Phe Leu Arg Ser Val Arg Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val

    50                  55                  60

Ala Leu Asn Gln Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Glu Asn Leu Arg Ile Ile

65                  70                  75                  80

Arg Gly Thr Lys Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr Ala Leu Ala Ile Phe Leu

                85                  90                  95

Asn Tyr Arg Lys Asp Gly Asn Phe Gly Leu Gln Glu Leu Gly Leu Lys

            100                 105                 110

Asn Leu Thr Glu Ile Leu Asn Gly Gly Val Tyr Val Asp Gln Asn Lys

        115                 120                 125

Phe Leu Cys Tyr Ala Asp Thr Ile His Trp Gln Asp Ile Val Arg Asn

    130                 135                 140

Pro Trp Pro Ser Asn Leu Thr Leu Val Ser Thr Asn Gly Ser Ser Gly

145                 150                 155                 160

Cys Gly Arg Cys His Lys Ser Cys Thr Gly Arg Cys Trp Gly Pro Thr

                165                 170                 175

Glu Asn His Cys Gln Thr Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Glu Gln Cys

            180                 185                 190

Asp Gly Arg Cys Tyr Gly Pro Tyr Val Ser Asp Cys Cys His Arg Glu

        195                 200                 205

Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Lys Asp Thr Asp Cys Phe Ala Cys

    210                 215                 220

Met Asn Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val Thr Gln Cys Pro Gln Thr

225                 230                 235                 240

Phe Val Tyr Asn Pro Thr Thr Phe Gln Leu Glu His Asn Phe Asn Ala

                245                 250                 255

Lys Tyr Thr Tyr Gly Ala Phe Cys Val Lys Lys Cys Pro His Asn Phe

            260                 265                 270

Val Val Asp Ser Ser Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Ser Ser Lys Met

        275                 280                 285

Glu Val Glu Glu Asn Gly Ile Lys Met Cys Lys Pro Cys Thr Asp Ile

    290                 295                 300

Cys Pro Lys Ala Cys Asp Gly Ile Gly Thr Gly Ser Leu Met Ser Ala

305                 310                 315                 320

Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Lys Phe Ile Asn Cys Thr Lys

                325                 330                 335

Ile Asn Gly Asn Leu Ile Phe Leu Val Thr Gly Ile His Gly Asp Pro

            340                 345                 350

Tyr Asn Ala Ile Glu Ala Ile Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe Arg

        355                 360                 365

Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Phe Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro Pro

    370                 375                 380

Asn Met Thr Asp Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Val Thr Ile Gly Gly

385                 390                 395                 400

Arg Val Leu Tyr Ser Gly Leu Ser Leu Leu Ile Leu Lys Gln Gln Gly

                405                 410                 415

Ile Thr Ser Leu Gln Phe Gln Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala Gly Asn

            420                 425                 430

Ile Tyr Ile Thr Asp Asn Ser Asn Leu Cys Tyr Tyr His Thr Ile Asn

        435                 440                 445

Trp Thr Thr Leu Phe Ser Thr Ile Asn Gln Arg Ile Val Ile Arg Asp

    450                 455                 460

Asn Arg Lys Ala Glu Asn Cys Thr Ala Glu Gly Met Val Cys Asn His

465                 470                 475                 480

Leu Cys Ser Ser Asp Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Asp Gln Cys Leu

                485                 490                 495

Ser Cys Arg Arg Phe Ser Arg Gly Arg Ile Cys Ile Glu Ser Cys Asn

            500                 505                 510

Leu Tyr Asp Gly Glu Phe Arg Glu Phe Glu Asn Gly Ser Ile Cys Val

        515                 520                 525

<210>9

<211>72

<212>DNA

<213>智人

<400>9

atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg    60

gcgagtcggg ct                                                        72

<210>10

<211>24

<212>PRT

<213>智人

<400>10

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1               5                   10                  15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala

            20

<210>11

<211>72

<212>DNA

<213>智人

<400>11

atgggaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg    60

gcgagtcggg ct                                                        72

<210>12

<211>24

<212>PRT

<213>智人

<400>12

Met Gly Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1               5                   10                  15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala

            20

<210>13

<211>57

<212>DNA

<213>智人

<400>13

atgagggcga acgacgctct gcaggtgctg ggcttgcttt tcagcctggc ccggggc    57

<210>14

<211>19

<212>PRT

<213>智人

<400>14

Met Arg Ala Asn Asp Ala Leu Gln Val Leu Gly Leu Leu Phe Ser Leu

1               5                   10                  15

Ala Arg Gly

<210>15

<211>57

<212>DNA

<213>智人

<400>15

atgggggcga acgacgctct gcaggtgctg ggcttgcttt tcagcctggc ccggggc    57

<210>16

<211>19

<212>PRT

<213>智人

<400>16

Met Gly Ala Asn Asp Ala Leu Gln Val Leu Gly Leu Leu Phe Ser Leu

1               5                   10                  15

Ala Arg Gly

<210>17

<211>75

<212>DNA

<213>智人

<400>17

atgaagccgg cgacaggact ttgggtctgg gtgagccttc tcgtggcggc ggggaccgtc    60

cagcccagcg attct                                                     75

<210>18

<211>25

<212>PRT

<213>智人

<400>18

Met Lys Pro Ala Thr Gly Leu Trp Val Trp Val Ser Leu Leu Val Ala

1               5                   10                  15

Ala Gly Thr Val Gln Pro Ser Asp Ser

            20                  25

<210>19

<211>75

<212>DNA

<213>智人

<400>19

atggggccgg cgacaggact ttgggtctgg gtgagccttc tcgtggcggc ggggaccgtc    60

cagcccagcg attct                                                     75

<210>20

<211>25

<212>PRT

<213>智人

<400>20

Met Gly Pro Ala Thr Gly Leu Trp Val Trp Val Ser Leu Leu Val Ala

1               5                   10                  15

Ala Gly Thr Val Gln Pro Ser Asp Ser

            20                  25

<210>21

<211>1500

<212>DNA

<213>智人

<400>21

ctggaggaaa agaaagtttg ccaaggcacg agtaacaagc tcacgcagtt gggcactttt    60

gaagatcatt ttctcagcct ccagaggatg ttcaataact gtgaggtggt ccttgggaat    120

ttggaaatta cctatgtgca gaggaattat gatctttcct tcttaaagac catccaggag    180

gtggctggtt atgtcctcat tgccctcaac acagtggagc gaattccttt ggaaaacctg    240

cagatcatca gaggaaatat gtactacgaa aattcctatg ccttagcagt cttatctaac    300

tatgatgcaa ataaaaccgg actgaaggag ctgcccatga gaaatttaca ggaaatcctg    360

catggcgccg tgcggttcag caacaaccct gccctgtgca acgtggagag catccagtgg    420

cgggacatag tcagcagtga ctttctcagc aacatgtcga tggacttcca gaaccacctg    480

ggcagctgcc aaaagtgtga tccaagctgt cccaatggga gctgctgggg tgcaggagag    540

gagaactgcc agaaactgac caaaatcatc tgtgcccagc agtgctccgg gcgctgccgt    600

ggcaagtccc ccagtgactg ctgccacaac cagtgtgctg caggctgcac aggcccccgg    660

gagagcgact gcctggtctg ccgcaaattc cgagacgaag ccacgtgcaa ggacacctgc    720

cccccactca tgctctacaa ccccaccacg taccagatgg atgtgaaccc cgagggcaaa    780

tacagctttg gtgccacctg cgtgaagaag tgtccccgta attatgtggt gacagatcac    840

ggctcgtgcg tccgagcctg tggggccgac agctatgaga tggaggaaga cggcgtccgc    900

aagtgtaaga agtgcgaagg gccttgccgc aaagtgtgta acggaatagg tattggtgaa    960

tttaaagact cactctccat aaatgctacg aatattaaac acttcaaaaa ctgcacctcc    1020

atcagtggcg atctccacat cctgccggtg gcatttaggg gtgactcctt cacacatact    1080

cctcctctgg atccacagga actggatatt ctgaaaaccg taaaggaaat cacagggttt    1140

ttgctgattc aggcttggcc tgaaaacagg acggacctcc atgcctttga gaacctagaa    1200

atcatacgcg gcaggaccaa gcaacatggt cagttttctc ttgcagtcgt cagcctgaac    1260

ataacatcct tgggattacg ctccctcaag gagataagtg atggagatgt gataatttca    1320

ggaaacaaaa atttgtgcta tgcaaataca ataaactgga aaaaactgtt tgggacctcc    1380

ggtcagaaaa ccaaaattat aagcaacaga ggtgaaaaca gctgcaaggc cacaggccag    1440

gtctgccatg ccttgtgctc ccccgagggc tgctggggcc cggagcccag ggactgcgtc    1500

<210>22

<211>500

<212>PRT

<213>智人

<400>22

Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln

1               5                   10                  15

Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn

            20                  25                  30

Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg

        35                  40                  45

Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr

    50                  55                  60

Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala

                85                  90                  95

Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro

            100                 105                 110

Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn

        115                 120                 125

Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val

    130                 135                 140

Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu

145                 150                 155                 160

Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp

                165                 170                 175

Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala

            180                 185                 190

Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys

        195                 200                 205

His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys

    210                 215                 220

Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys

225                 230                 235                 240

Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn

                245                 250                 255

Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro

            260                 265                 270

Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly

        275                 280                 285

Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys

    290                 295                 300

Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu

305                 310                 315                 320

Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys

                325                 330                 335

Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe

            340                 345                 350

Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu

        355                 360                 365

Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln

    370                 375                 380

Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu

385                 390                 395                 400

Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val

                405                 410                 415

Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile

            420                 425                 430

Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala

        435                 440                 445

Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr

    450                 455                 460

Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln

465                 470                 475                 480

Val cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro

                485                 490                 495

Arg Asp Cys Val

            500

<210>23

<211>1497

<212>DNA

<213>智人

<400>23

tccgaggtgg gcaactctca ggcagtgtgt cctgggactc tgaatggcct gagtgtgacc    60

ggcgatgctg agaaccaata ccagacactg tacaagctct acgagaggtg tgaggtggtg    120

atggggaacc ttgagattgt gctcacggga cacaatgccg acctctcctt cctgcagtgg    180

attcgagaag tgacaggcta tgtcctcgtg gccatgaatg aattctctac tctaccattg    240

cccaacctcc gcgtggtgcg agggacccag gtctacgatg ggaagtttgc catcttcgtc    300

atgttgaact ataacaccaa ctccagccac gctctgcgcc agctccgctt gactcagctc    360

accgagattc tgtcaggggg tgtttatatt gagaagaacg ataagctttg tcacatggac    420

acaattgact ggagggacat cgtgagggac cgagatgctg agatagtggt gaaggacaat    480

ggcagaagct gtcccccctg tcatgaggtt tgcaaggggc gatgctgggg tcctggatca    540

gaagactgcc agacattgac caagaccatc tgtgctcctc agtgtaatgg tcactgcttt    600

gggcccaacc ccaaccagtg ctgccatgat gagtgtgccg ggggctgctc aggccctcag    660

gacacagact gctttgcctg ccggcacttc aatgacagtg gagcctgtgt acctcgctgt    720

ccacagcctc ttgtctacaa caagctaact ttccagctgg aacccaatcc ccacaccaag    780

tatcagtatg gaggagtttg tgtagccagc tgtccccata actttgtggt ggatcaaaca    840

tcctgtgtca gggcctgtcc tcctgacaag atggaagtag ataaaaatgg gctcaagatg    900

tgtgagcctt gtgggggact atgtcccaaa gcctgtgagg gaacaggctc tgggagccgc    960

ttccagactg tggactcgag caacattgat ggatttgtga actgcaccaa gatcctgggc    1020

aacctggact ttctgatcac cggcctcaat ggagacccct ggcacaagat ccctgccctg    1080

gacccagaga agctcaatgt cttccggaca gtacgggaga tcacaggtta cctgaacatc    1140

cagtcctggc cgccccacat gcacaacttc agtgtttttt ccaatttgac aaccattgga    1200

ggcagaagcc tctacaaccg gggcttctca ttgttgatca tgaagaactt gaatgtcaca    1260

tctctgggct tccgatccct gaaggaaatt agtgctgggc gtatctatat aagtgccaat    1320

aggcagctct gctaccacca ctctttgaac tggaccaagg tgcttcgggg gcctacggaa    1380

gagcgactag acatcaagca taatcggccg cgcagagact gcgtggcaga gggcaaagtg    1440

tgtgacccac tgtgctcctc tgggggatgc tggggcccag gccctggtca gtgcttg       1497

<210>24

<211>499

<212>PRT

<213>智人

<400>24

Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr Leu Asn Gly

1               5                   10                  15

Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr Leu Tyr Lys

            20                  25                  30

Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu

        35                  40                  45

Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val

    50                  55                  60

Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu

65                  70                  75                  80

Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe

                85                  90                  95

Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu

            100                 105                 110

Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val

        115                 120                 125

Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr Ile Asp Trp

    130                 135                 140

Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val Lys Asp Asn

145                 150                 155                 160

Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly Arg Cys Trp

                165                 170                 175

Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala

            180                 185                 190

Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys

        195                 200                 205

His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys

    210                 215                 220

Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val Pro Arg Cys

225                 230                 235                 240

Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn

                245                 250                 255

Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala Ser Cys Pro

            260                 265                 270

His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Pro

        275                 280                 285

Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys Glu Pro Cys

    290                 295                 300

Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser Gly Ser Arg

305                 310                 315                 320

Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val Asn Cys Thr

                325                 330                 335

Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu Asn Gly Asp

            340                 345                 350

Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe

        355                 360                 365

Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro

    370                 375                 380

Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr Thr Ile Gly

385                 390                 395                 400

Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile Met Lys Asn

                405                 410                 415

Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala

            420                 425                 430

Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser

        435                 440                 445

Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu Arg Leu Asp

    450                 455                 460

Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu Gly Lys Val

465                 470                 475                 480

Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Gly

                485                 490                 495

Gln Cys Leu

<210>25

<211>1488

<212>DNA

<213>智人

<400>25

cagtcagtgt gtgcaggaac ggagaataaa ctgagctctc tctctgacct ggaacagcag    60

taccgagcct tgcgcaagta ctatgaaaac tgtgaggttg tcatgggcaa cctggagata    120

accagcattg agcacaaccg ggacctctcc ttcctgcggt ctgttcgaga agtcacaggc    180

tacgtgttag tggctcttaa tcagtttcgt tacctgcctc tggagaattt acgcattatt    240

cgtgggacaa aactttatga ggatcgatat gccttggcaa tatttttaaa ctacagaaaa  300

gatggaaact ttggacttca agaacttgga ttaaagaact tgacagaaat cctaaatggt  360

ggagtctatg tagaccagaa caaattcctt tgttatgcag acaccattca ttggcaagat  420

attgttcgga acccatggcc ttccaacttg actcttgtgt caacaaatgg tagttcagga  480

tgtggacgtt gccataagtc ctgtactggc cgttgctggg gacccacaga aaatcattgc  540

cagactttga caaggacggt gtgtgcagaa caatgtgacg gcagatgcta cggaccttac  600

gtcagtgact gctgccatcg agaatgtgct ggaggctgct caggacctaa ggacacagac  660

tgctttgcct gcatgaattt caatgacagt ggagcatgtg ttactcagtg tccccaaacc  720

tttgtctaca atccaaccac ctttcaactg gagcacaatt tcaatgcaaa gtacacatat  780

ggagcattct gtgtcaagaa atgtccacat aactttgtgg tagattccag ttcttgtgtg  840

cgtgcctgcc ctagttccaa gatggaagta gaagaaaatg ggattaaaat gtgtaaacct  900

tgcactgaca tttgcccaaa agcttgtgat ggcattggca caggatcatt gatgtcagct  960

cagactgtgg attccagtaa cattgacaaa ttcataaact gtaccaagat caatgggaat  1020

ttgatctttc tagtcactgg tattcatggg gacccttaca atgcaattga agccatagac  1080

ccagagaaac tgaacgtctt tcggacagtc agagagataa caggtttcct gaacatacag  1140

tcatggccac caaacatgac tgacttcagt gttttttcta acctggtgac cattggtgga  1200

agagtactct atagtggcct gtccttgctt atcctcaagc aacagggcat cacctctcta  1260

cagttccagt ccctgaagga aatcagcgca ggaaacatct atattactga caacagcaac  1320

ctgtgttatt atcataccat taactggaca acactcttca gcacaatcaa ccagagaata  1380

gtaatccggg acaacagaaa agctgaaaat tgtactgctg aaggaatggt gtgcaaccat  1440

ctgtgttcca gtgatggctg ttggggacct gggccagacc aatgtctg               1488

<210>26

<211>496

<212>PRT

<213>智人

<400>26

Gln Ser Val Cys Ala Gly Thr Glu Asn Lys Leu Ser Ser Leu Ser Asp

1               5                   10                  15

Leu Glu Gln Gln Tyr Arg Ala Leu Arg Lys Tyr Tyr Glu Asn Cys Glu

            20                  25                  30

Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Thr Ser Ile Glu His Asn Arg Asp

        35                  40                  45

Leu Ser Phe Leu Arg Ser Val Arg Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val

    50                  55                  60

Ala Leu Asn Gln Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Glu Asn Leu Arg Ile Ile

65                  70                  75                  80

Arg Gly Thr Lys Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr Ala Leu Ala Ile Phe Leu

                85                  90                  95

Asn Tyr Arg Lys Asp Gly Asn Phe Gly Leu Gln Glu Leu Gly Leu Lys

            100                 105                 110

Asn Leu Thr Glu Ile Leu Asn Gly Gly Val Tyr Val Asp Gln Asn Lys

        115                 120                 125

Phe Leu Cys Tyr Ala Asp Thr Ile His Trp Gln Asp Ile Val Arg Asn

    130                 135                 140

Pro Trp Pro Ser Asn Leu Thr Leu Val Ser Thr Asn Gly Ser Ser Gly

145                 150                 155                 160

Cys Gly Arg Cys His Lys Ser Cys Thr Gly Arg Cys Trp Gly Pro Thr

                165                 170                 175

Glu Asn His Cys Gln Thr Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Glu Gln Cys

            180                 185                 190

Asp Gly Arg Cys Tyr Gly Pro Tyr Val Ser Asp Cys Cys His Arg Glu

        195                 200                 205

Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Lys Asp Thr Asp Cys Phe Ala Cys

    210                 215                 220

Met Asn Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val Thr Gln Cys Pro Gln Thr

225                 230                 235                 240

Phe Val Tyr Asn Pro Thr Thr Phe Gln Leu Glu His Asn Phe Asn Ala

                245                 250                 255

Lys Tyr Thr Tyr Gly Ala Phe Cys Val Lys Lys Cys Pro His Asn Phe

            260                 265                 270

Val Val Asp Ser Ser Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Ser Ser Lys Met

        275                 280                 285

Glu Val Glu Glu Asn Gly Ile Lys Met Cys Lys Pro Cys Thr Asp Ile

    290                 295                 300

Cys Pro Lys Ala Cys Asp Gly Ile Gly Thr Gly Ser Leu Met Ser Ala

305                 310                 315                 320

Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Lys Phe Ile Asn Cys Thr Lys

                325                 330                 335

Ile Asn Gly Asn Leu Ile Phe Leu Val Thr Gly Ile His Gly Asp Pro

            340                 345                 350

Tyr Asn Ala Ile Glu Ala Ile Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe Arg

        355                 360                 365

Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Phe Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro Pro

    370                 375                 380

Asn Met Thr Asp Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Val Thr Ile Gly Gly

385                 390                 395                 400

Arg Val Leu Tyr Ser Gly Leu Ser Leu Leu Ile Leu Lys Gln Gln Gly

                405                 410                 415

Ile Thr Ser Leu Gln Phe Gln Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala Gly Asn

            420                 425                 430

Ile Tyr Ile Thr Asp Asn Ser Asn Leu Cys Tyr Tyr His Thr Ile Asn

        435                 440                 445

Trp Thr Thr Leu Phe Ser Thr Ile Asn Gln Arg Ile Val Ile Arg Asp

    450                 455                 460

Asn Arg Lys Ala Glu Asn Cys Thr Ala Glu Gly Met Val Cys Asn His

465                 470                 475                 480

Leu Cys Ser Ser Asp Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Asp Gln Cys Leu

                485                 490                 495

<210>27

<211>7

<212>PRT

<213>烟草蚀纹病毒

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>Xaa可以是Gly或Ser

<400>27

Glu Thr Val Arg Phe Gln Xaa

1               5

<210>28

<211>60

<212>DNA

<213>烟草蚀纹病毒

<400>28

ctagagaaaa cctgtacttc cagtcccatc atcatcatca tcattgagcg gccgcgggcc    60

<210>29

<211>15

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>接头序列编码

<400>29

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1               5                   10                  15

<210>30

<211>52

<212>DNA

<213>烟草蚀纹病毒

<400>30

cgcggccgct caatgatgat gatgatgatg ggactggaag tacaggtttt ct            52

<210>31

<211>38

<212>DNA

<213>智人

<400>31

agctgctagc gccaccatgc gaccctccgg gacggccg                            38

<210>32

<211>38

<212>DNA

<213>智人

<400>32

agctgctagc gccaccatga agccggcgac aggacttt                            38

<210>33

<211>85

<212>DNA

<213>智人

<400>33

tctggtaccc gatccgccac cgccagagcc acctccgcct gaaccgcctc caccaccggt    60

gacgcagtcc ctgggctccg ggccc                                          85

<210>34

<211>85

<212>DNA

<213>智人

<400>34

tctggtaccc gatccgccac cgccagagcc acctccgcct gaaccgcctc caccaccggt    60

cagacattgg tctggcccag gtccc                                          85

<210>35

<211>40

<212>DNA

<213>智人

<400>35

agcgctagcg ccaccatgag ggcgaacgac gctctgcagg                          40

<210>36

<211>34

<212>DNA

<213>智人

<400>36

agcaccggtc aagcactgac cagggcctgg gccc                                34

<210>37

<211>31

<212>DNA

<213>智人

<400>37

cggggtaccc tggaggaaaa gaaagtttgc c                                   31

<210>38

<211>34

<212>DNA

<213>智人

<400>38

cggggtacct ccgaggtggg caactctcag gcag                                34

<210>39

<211>31

<212>DNA

<213>智人

<400>39

cggggtaccc agtcagtgtg tgcaggaacg g                                   31

<210>40

<211>31

<212>DNA

<213>智人

<400>40

tgctctagag acgcagtccc tgggctccgg g                                   31

<210>41

<211>34

<212>DNA

<213>智人

<400>41

tgctctagac aagcactgac cagggcctgg gccc                                34

<210>42

<211>31

<212>DNA

<213>智人

<400>42

tgctctagac agacattggt ctggcccagg t                                   31

Claims (60)

1.二价结合分子，其在单个共价结合的蛋白分子中的分开的结合位点具有对第一和第二ErbB配体的结合亲和力。

2.权利要求1的结合分子，其中所述结合分子可溶于水性溶液中。

3.权利要求1的结合分子，其中所述结合分子另外包含ErbB受体的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB受体的配体。

4.权利要求1的结合分子，其另外包含ErbB1的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB1的配体。

5.权利要求1的结合分子，其另外包含ErbB1的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB1的配体，其中所述部分包括ErbB受体的氨基酸1-500。

6.权利要求1的结合分子，其另外包含ErbB1的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB1的配体，其中所述部分包括ErbB1受体的氨基酸1-532。

7.权利要求1的结合分子，其另外包含ErbB1的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB1的配体，其中所述部分包括ErbB1受体的氨基酸1-621。

8.权利要求1的结合分子，其另外包含ErbB3的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB3的配体。

9.权利要求1的结合分子，其另外包含ErbB3的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB3的配体，其中所述部分包括ErbB3受体的氨基酸1-499。

10.权利要求1的结合分子，其另外包含ErbB3的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB3的配体，其中所述部分包括ErbB3受体的氨基酸1-531。

11.权利要求1的结合分子，其另外包含ErbB3的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB3的配体，其中所述部分包括ErbB3受体的氨基酸1-624。

12.权利要求1的结合分子，其另外包含ErbB4的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB4的配体。

13.权利要求1的结合分子，其另外包含ErbB4的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB4的配体，其中所述部分包括ErbB4受体的氨基酸1-496。

14.权利要求1的结合分子，其另外包含ErbB4的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB4的配体，其中所述部分包括ErbB4受体的氨基酸1-528。

15.权利要求1的结合分子，其另外包含ErbB4的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB4的配体，其中所述部分包括ErbB4受体的氨基酸1-626。

16.权利要求1的结合分子，其另外包含会结合ErbB1的配体的ErbB1的胞外结构域的一部分和会结合ErbB3的配体的ErbB3的胞外结构域的一部分。

17.权利要求1的结合分子，其另外包含会结合ErbB1的配体的ErbB1的胞外结构域的一部分和会结合ErbB4的配体的ErbB4的胞外结构域的一部分。

18.权利要求16和17中任一项的结合分子，其中所述羧基末端ErbB配体结合位点具有将氨基至羧基末端方向反转的氨基酸序列。

19.权利要求1-18中任一项的结合分子，另外包含在结合位点之间的接头。

20.权利要求1-18中任一项的结合分子，另外包含融合伴侣。

21.重组DNA分子，其编码在单个共价结合的蛋白分子中的分开的结合位点具有对第一和第二ErbB配体的结合亲和力的蛋白。

22.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码ErbB受体蛋白的一部分的核苷酸序列，所述部分会结合ErbB的配体。

23.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码会结合ErbB的配体的ErbB受体蛋白的一部分的核苷酸序列，和编码会结合ErbB的配体的ErbB受体蛋白的一部分的第二核苷酸序列。

24.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码ErbB1受体蛋白的一部分的核苷酸序列，该部分会结合ErbB1的配体。

25.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码ErbB1受体的氨基酸1-500的核苷酸序列。

26.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码ErbB1受体的氨基酸1-532的核苷酸序列。

27.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码ErbB1的胞外结构域的一部分的核苷酸序列，其中所述部分编码ErbB1受体的氨基酸1-621。

28.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码ErbB3的胞外结构域的一部分的核苷酸序列，该部分会结合ErbB3的配体。

29.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码ErbB3受体的氨基酸1-499的核苷酸序列。

30.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码ErbB3受体的氨基酸1-531的核苷酸序列。

31.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码ErbB3受体的氨基酸1-624的核苷酸序列。

32.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码ErbB4的胞外结构域的一部分的核苷酸序列，该部分会结合ErbB4的配体。

33.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码ErbB4受体的氨基酸1-496的核苷酸序列。

34.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码ErbB4受体的氨基酸1-528的核苷酸序列。

35.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码ErbB4受体的氨基酸1-626的核苷酸序列。

36.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码会结合ErbB1的配体的ErbB1的胞外结构域的一部分和会结合ErbB3的配体的ErbB3的胞外结构域的一部分的核苷酸序列。

37.权利要求21的重组DNA分子，另外包含编码会结合ErbB1的配体的ErbB1的胞外结构域的一部分和会结合ErbB4的配体的ErbB4的胞外结构域的一部分的核苷酸序列。

38.权利要求32和33中任一项的重组DNA分子，其中编码羧基末端ErbB配体结合位点的核苷酸序列编码将氨基至羧基末端方向反转的氨基酸序列。

39.权利要求21-38中任一项的重组DNA分子，其中所述核苷酸序列编码连接结合位点的接头。

40.权利要求21-38中任一项的重组DNA分子，其中所述核苷酸序列还编码融合伴侣。

41.宿主细胞，其包含重组DNA分子，所述重组DNA分子编码在单个共价结合的蛋白分子中的分开的结合位点具有对第一和第二ErbB配体的结合亲和力的蛋白。

42.权利要求41的宿主细胞，其中所述细胞产生在单个共价结合的蛋白分子中的分开的结合位点具有对第一和第二ErbB配体的结合亲和力的二价结合分子。

43.权利要求41的宿主细胞，其中所述细胞将结合分子的一部分转运到细胞外和周围培养基中。

44.权利要求41的宿主细胞，其中所述重组DNA分子编码ErbB受体的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB受体的配体。

45.权利要求41的宿主细胞，其中所述重组DNA分子编码ErbB1受体的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB1受体的配体。

46.权利要求41的宿主细胞，其中所述重组DNA分子编码ErbB3受体的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB3受体的配体。

47.权利要求41的宿主细胞，其中所述重组DNA分子编码ErbB4受体的胞外结构域的一部分，该部分会结合ErbB4受体的配体。

48.权利要求41的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。

49.权利要求41的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

50.权利要求41的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞。

51.权利要求41的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母细胞。

52.权利要求41的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。

53.治疗疾病的方法，其包括，给需要治疗的患者施用有效量的二价结合分子，所述二价结合分子在单个共价结合的蛋白分子中的分开的结合位点具有对第一和第二ErbB配体的结合亲和力。

54.权利要求53的治疗疾病的方法，其中所述结合分子另外包含ErbB受体的胞外结构域。

55.权利要求53的治疗疾病的方法，其中所述结合分子另外包含ErbB1的胞外结构域，它会结合ErbB1的配体。

56.权利要求53的治疗疾病的方法，其中所述结合分子另外包含ErbB3的胞外结构域，它会结合ErbB3的配体。

57.权利要求53的治疗疾病的方法，其中所述结合分子另外包含ErbB4的胞外结构域，它会结合ErbB4的配体。

58.诊断癌症的方法，其包括，使肿瘤细胞接触二价结合分子，所述二价结合分子在单个共价结合的蛋白分子中的分开的结合位点具有对第一和第二ErbB配体的结合亲和力。

59.结合分子，其包含对EGF、TGFα、HB-EGF、β动物纤维素、双调蛋白、表皮调节素、Epigen、神经调节蛋白1α、神经调节蛋白1β、神经调节蛋白2α、神经调节蛋白2β、神经调节蛋白3和神经调节蛋白4具有亲和力的单个分子。

60.治疗通过去除或抑制ErbB配体可好转、改善或抑制的疾病或状况的方法，其包括，给需要的受试者施用二价结合分子，所述二价结合分子在单个共价结合的蛋白分子中的分开的结合位点具有对第一和第二ErbB配体的结合亲和力。

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