KR20070121700A - 포유동물에서 염증을 감소시키기 위한 유산균의 선별과용도 - Google Patents

포유동물에서 염증을 감소시키기 위한 유산균의 선별과용도 Download PDF

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Abstract

염증, 예를 들면, 염증성 장 질환을 감소시키는 능력에 대하여 선별된 유산균(lactic acid bacteria) 균주, 이들 균주를 선별하는 방법 및 이들 균주를 포함하는 산물.
유산균

Description

포유동물에서 염증을 감소시키기 위한 유산균의 선별과 용도{SELECTION AND USE OF LACTIC ACID BACTERIA FOR REDUCING INFLAMMATION IN MAMMALS}
본 발명은 비병원성 항-염증성 세균 균주를 선별하는 방법의 이용 및 특정 세균 또는 다른 염증-유발 병원균에 의해 유발된 원치 않는 염증의 치료와 예방에 이들 균주를 이용하는 산물과 방법에 관계한다.
단핵구는 골수를 나와 위장관의 점막/장막에 도달할 때까지 말초혈 혈관을 통하여 이동한다. 이들 추정 대식세포는 GI의 면역계를 조절하는데 필요한 신호의 상호작용과 전달에 핵심적이다.
위장관 내에서, 장 내강에 존재하고 장 점막에 부착된 세균에 대한, 점막 상피의 대식 세포에서 면역 반응의 수준은 일정하다. 정상 상태에서, 이러한 반응은 불필요한 염증 반응을 제한하고 억제하는 사이토킨 신호의 발생을 수반한다. 하지만, 이들 세포가 병원균 또는 독소에 노출되면, 이들은 제1방어선을 형성하고, 위협이 제거될 때까지 염증 반응을 전파하는 친염증성 사이토킨을 증가된 양으로 생산하는 역할을 한다. 공생(비-위협) 세균과의 상호작용에 관련된 사이토킨 및 병원균에 대한 완전 염증 반응에 관여하는 사이토킨의 생산은 유산균(lactic acid bacteria) 자체 또는 이들 유산균에 의해 생산되는 물질에 의한 개 입(intervention)에 종속되는데, 이러한 공생 균총(commensal flora)이 점막의 대식세포와 광범위하게 상호작용하여 장내 균총(gut flora)에 대한 균형 반응을 유지시킴으로써 최적 건강을 유지시킨다는 것은 명백하다(Rook GA, Adams V, Hunt J, Palmer R, Martinelli R, Brunet LR. Mycobacteria and other environmental organisms as immunomodulators for immunoregulatory disorders. Springer Semin Immunopathol 2004; 25:237-255).
예로써, 위장관 내에서 다양한 병원균이 염증을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. 예로써, 위와 위장관 내에서 이런 염증은 항원성 자극, 예를 들면, 병원균에 의해 유발된 항원성 자극에 반응하여 상피 내에서 대식세포와 수상돌기 세포에 의해 생산되는 사이토킨(cytokine)이라고 하는 세포내 신호 단백질에 의해 매개된다. 상피 및 병원균의 항원 또는 이러한 병원균에 의해 생산되는 내독소(endotoxin), 예를 들면, LPS 사이에 접촉이후, 상피 내에서 항원 제시 세포(antigen presenting cell)(수상돌기 세포 포함)는 고유 대식세포로 신호를 전파하고, 이후 대식세포는 소위, Th-1형 반응을 유도하는데, 여기서 TNFα, IL-1, IL-6, IL-12를 비롯한 친염증성 사이토킨이 이들 대식세포에 의해 생산된다. 이들 사이토킨은 자연 킬러 세포, T-세포 및 다른 세포를 자극하여 염증의 핵심 매개인자인 인터페론 γ(IFNγ)를 생산한다. IFNγ는 염증 반응의 단계적 확대 및 세포독성을 결과하는 상기한 반응을 유발한다. 고유 대식세포는 Th-2 형 반응으로 항원에 반응할 수도 있다. 이러한 반응은 IFNγ에 의해 억제된다. 이들 Th-2 형 세포는 항-염증성 사이토킨, 예를 들면, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10을 생산한다.
IL-10은 IFNγ의 생산을 저해하고, 따라서 상기 면역 반응을 저해하는 것으로 알려져 있다. Th-1과 Th-2 형 세포 및 이들의 개별 사이토킨 생산의 균형은 일정한 항원에 대한 염증 반응의 정도를 결정한다. Th-2 형 세포는 면역계를 통하여 면역글로불린의 생산을 자극할 수도 있다. TNFα 수준이 감소된 위장관 내에서 항-염증 활성은 강화된 상피 세포(장내 벽 내막 완전성(gut wall lining integrity)) 및 결과적으로, 위장 병원균과 독소에 의해 유발되는 부정적 효과의 감소와 상관한다.
다수의 연구 결과는 DNA가 장내 상피 세포 상에서 항-염증 작용을 발휘하거나, 또는 면역계를 자극할 수 있음을 암시한다(Madsen et al. and Rachmilewitz et al, presentations at Digestive Disease Week, May 19-22, 2002, The Moscone Center, San Francisco).
염증은 피부, 눈 등에 외부적으로 및 예로써, 다양한 점막 상에서 내부적으로 포유동물에서 여러 질환에 관련된다; 입, GI 관, 질 등에서 뿐만 아니라 근육, 관절, 뇌-조직 내에서. GI-관 내에서 염증에 관련된 여러 질환, 예를 들면, 위염, 궤양, 염증성 장 질환(IBD)이 나타난다. IBD는 염증이 발생하고 팽창된 소화관이나 장벽을 유발하는 만성 질환이다. 소화관이 IBD로 인하여 염증이 발생하거나 팽창하는 경우에, 종기(궤양)가 형성되고 출혈이 발생한다. 이는 복통, 수양성 설사(watery diarrhea), 혈변, 피로, 감소된 식욕, 체중 감소, 또는 열병을 유발한다. 따라서, IBD에서 염증은 환자에서 궤양과 같은 조직 손상 및 악화된 질환을 유발한다.
가장 일반적인 2가지 IBD 형태는 궤양성 대장염(UC)과 크론병(CD)이다. 크론병은 점막에서 장막까지 전체 장벽의 재발성 염증성 병소로 특성화되는 만성 질환이고, 장내 여러 부위에서 발생할 수 있다. 상기 질환은 장내 미세균총에서 불균형 및 정상적인 장내 균총 성분에 대한 과도한 염증 반응에 연관되고, 이러한 반응은 현재, 일련의 상이한 약제로 치료되고 있긴 하지만 그 결과가 불량한데, 이들 약제 중에서 하나는 위장 점막 내에서 TNFα의 수준을 감소시키도록 설계된 항-TNFα 치료제에 기초한다. 따라서, 이런 질환을 앓는 개체는 이상적인 연구 군 및 면역-조절성 염증 약화 락토바실러스(lactobacillus)의 이용을 위한 진정한 표적 군을 형성한다.
만성 대장염은 생쥐에서 자발적으로 발생하지만, 무균 동물(germ-free animal)에서는 발생하지 않는다. 생쥐 대장염은 위장관의 만성적인 심각한 염증 질환인 인간 크론병과 유사하다. 크론병은 일반적으로 장내에서 발생하지만, 위장관 내에 어디에라도 발생할 수 있다. 이들 질환은 장내 세균(enteric bacteria)의 존재를 요하고, 양쪽 모두 대장염의 Th1-매개된-IL-12-의존성 형태이다. 원인과 증상의 유사성으로 인하여, 대장염의 생쥐 모형 및 다른 생쥐 모형은 염증 반응의 구성요소를 직접적으로 조사하는데 빈번하게 이용되고, 동일한 기전이 인간에도 적용될 것으로 추측되기 때문에 인간 위장 질환에 대한 치료제를 개발하기 위한 모형으로서 인정되고 있다. 하지만, 인간에 대한 동물 유래된 모형의 적절성에 관하여 일부 문제점이 제기되고 있기 때문에, 인간 기전을 조사하고 더욱 인간 기초된 시스템에서 다른 모형으로부터 결과를 확증하기 위한 대안적 방법이 요구된다. 본 발명의 목적은 항-염증성을 나타내는 유산균(lactic acid bacteria)을 선별하고, 이후 이런 선별된 유산균을 다양한 염증 질환의 예방과 치료에 이용하는, 인간 세포에 기초한 방법을 제시하는 것이다.
락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)는 동물의 위장관 내에서 자연적으로 발생하는 생식균(inhabitant) 중의 하나이고, 건강한 동물의 장 내에서 일상적으로 관찰되고, 낮은 pH에도 불구하고 인간 위 내에서 때때로 관찰된다. 이는 항균 활성을 갖는 것으로 알려져 있다(참조: U.S. Patent No. 5,439,678, 5,458,875, 5,534,253, 5,837,238, 5,849,289). 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 세포를 글리세롤의 존재에서 혐기성 조건하에 배양하는 경우에, 이들은 루테린(reuterin)(β-하이드록시-프로피온알데히드)으로 알려져 있는 항생 물질을 생산한다. 또한, 락토바실러스 루테리(L. reuteri)를 비롯한 락토바실러스(Lactobacillus)의 특정 균주는 항-염증성을 갖는 것으로 알려져 있다(U.S. patent application 20040208863과 20040067573). 다른 면역조절 활성 역시 다양한 다른 락토바실러스(Lactobacillus)와 연관하였다.
인간 임상 시험과 동물 연구에서, 락토바실러스(Lactobacillus)는 만성 대장염에서 염증을 예방하거나 개선할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 락토바실러스(Lactobacillus)는 장내 세균에 의해 유도된 친염증성 사이토킨 반응을 하향-조절할 수 있는 것으로 생각된다. J. Pefla et al (2003)에서는 락토바실러스(Lactobacillus)가 뮤린 대식세포주에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNFα)의 생산을 감소시키는 지를 조사하였다. 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG 및 리포폴리사카라이드와 함께 배양된 뮤린 대식세포에 의한 TNF-α 생산이 대조와 비교하여 현저하게 저해되는 것으로 밝혀졌다.
동일한 연구자 그룹에서 락토바실러스(Lactobacillus) spp.가 생체내에서 헬리코박터(Helicobacter)-유도된 염증을 완화시키는데 효과적인 지를 조사하였다. 이를 위하여, 헬리코박터 헤파티쿠스(H. hepaticus) 생쥐 대장염 모형에서 락토바실러스 루테리(L. reuteri)와 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei)로 공동-접종 실험을 수행하였다. 헬리코박터 헤파티쿠스(H. hepaticus) 단독이 접종된 동물에 비하여, 헬리코박터 헤파티쿠스(H. hepaticus)와 락토바실러스(Lactobacillus) spp.가 모두 접종된 암컷 생쥐에서 병리 스코어의 현저한 감소가 관찰되었다. 이러한 모형에서 락토바실러스(Lactobacillus) spp.의 생균제 효과(probiotic effect)는 헬리코박터 헤파티쿠스(H. hepaticus) 균의 배제와 무관하고 TNF-α 발현의 전사후 조절에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 이들 데이터는 락토바실러스(Lactobacillus) spp.가 대식세포에서 헬리코박터(Helicobacter) 유도된 친염증성 사이토킨 생산을 하향-조절할 수 있는 신규한 기전의 존재를 암시한다.
특허 WO2004/031368A1에서는 TNF-α 활성에 대한 생쥐 대식세포 측정검사를 이용하여, 포유동물 내에서 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 감염과 연관된 위장 염증을 감소시키는 능력에 대하여 선별된 락토바실러스(Lactobacillus) 균주를 기술한다.
특허 출원 US20040057943A1은 모유(breast milk) 및/또는 양수(amniotic fluid) 내에서 생존할 수 있는 락토바실러스 코리니포르미스(L. coryniformis), 락 토바실러스 살리바리우스(L. salivarius), 락토바실러스 아시도필러스(L. acidofilus), 락토바실러스 가서리(L. gasseri), 락토바실러스 페르멘툼(L. fermentum)의 새로운 생균 균주의 선별 공정에 관계한다.
S. Menard et al. (2003)에서는 유산균(lactic acid bacteria)이 장 전달이후 항-염증성을 보존하는 대사물질을 분비하는 지를 조사하였다. 세균 조절된 배지(CM)의 존재에서 THP-1 프로-단핵구에 LPS 결합을 분석하여 LPS가 LPS 결합 단백질(LBP)에 결합한 이후에 LPS-LBP가 CD14 수용체를 인식할 수 있는 지를 관찰하였다. 이러한 결합은 유세포분석법(flow cytometry)으로 측정하였다. 비피도박테리아(Bifidobacterium) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermofilus) CM은 장 장벽을 통과할 수 있고 항-TNF-α 효과를 나타내는 대사물질을 방출함으로써 THP-1 세포에 대한 LDB 의존성 LPS 결합을 완전히 저해하는 것으로 밝혀졌다.
위장 염증을 비롯한 염증을 감소시키는 여러 락토바실러스(Lactobacillus) 균주의 능력에서 차이가 공지되어 있긴 하지만, 인간 세포에 기초한 모형을 이용함으로써 이들 차이가 더욱 효과적으로 예측되고 이러한 모형이 인간에서 잠재적 효과에 대하여 이들 균주를 선별하는데 선호된다는 것은 기존에 알려진 바가 없다.
이런 이유로, 본 발명의 목적은 인간 세포주를 이용하여, 예로써, IBD에 기인한 염증을 감소시키는 능력에 대하여 선별된 유산균(lactic acid bacteria)의 균주를 제시하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 이들 균주; 인간과 다른 포유동물에 투여용으로 예로써, IBD와 연관된 염증의 치료 또는 예방을 위한 작용제; 이들 균주가 성장하는 조절된 배지(conditioned media) 및 이의 단백질-함유 추출물을 포 함하는 산물을 제시하는 것이다. 따라서, 본 발명은 환자에서 궤양과 같은 조직 손상 및 악화된 질환을 유발하는 IBD에서 염증을 치료하는데 이용된다.
다른 목적과 이점은 아래의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백할 것이다.
본 발명의 요약
본 발명은 염증, 예를 들면, 대장성 장 질환을 감소시키는 능력에 대하여 선별된 유산균(lactic acid bacteria)의 신규한 균주; 이들 균주를 선별하는 방법 및 이들 균주를 포함하는 산물을 제시한다.
도 1은 LPS-활성화된 단핵구에 의한 TNF-α 생산에 대한 락토바실러스(Lactobacillus)-조절된 배지의 효과를 보여주는 막대그래프이다. 3가지 균주 및 대조는 24 시간 동안 배양되었다.
도 2는 LPS-활성화된 단핵구에 의한 TNF-α 생산에 대한 락토바실러스(Lactobacillus)-조절된 배지의 효과를 보여주는 막대그래프이다. 3가지 균주 및 대조는 9 시간 동안 배양되었다.
도 3은 LPS-활성화된 일차 단핵구에 의한 TNF-α 생산에 대한 락토바실러스(Lactobacillus)-조절된 배지의 저해 효과를 보여주는 막대그래프이다. CD-rem(재발)과 CD-act(활성) 환자로부터 일차 단핵구가 이용되었다. 이들 균주 및 대조는 24 시간 동안 배양되었다.
도 4는 LPS-활성화된 일차 단핵구에 의한 TNF-α 생산에 대한 락토바실러 스(Lactobacillus)-조절된 배지의 효과를 보여주는 막대그래프이다. CD-act 환자로부터 일차 단핵구가 이용되었다. 이들 균주 및 대조는 24 시간 동안 배양되었다.
본 발명은 IBD와 같은 염증을 감소시키는 능력에 대하여 선별된 유산균(lactic acid bacteria) 균주를 포함한다. 이들 균주에는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) MM4-1A, ATCC PTA-6475가 포함된다. 이들 균주로부터 유래된 전체 세포 또는 성분을 포함하는 식품, 영양 첨가제와 제제, 조제약 또는 의료 장치와 같은 산물은 당분야에 공지된 바와 같이 조제될 수 있고, 일반적으로, 공지된 섭취가능 지지체(ingestible support) 및 락토바실러스(Lactobacillus) 또는 이로부터 유래된 성분을 포함한다. 우수한 TNFα 감소 활성을 갖는 것으로 새로이 확인된 기존의 공지된 균주, 예를 들면, 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) GG ATCC 53103, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) MM2-3, ATCC PTA-4659 역시 이들 제제에 이용될 수 있다.
염증을 감소 또는 증가시키는 인자를 결정하기 위하여, 적당한 사이토킨을 이용한 모형 시스템이 이용된다. 본 발명에는 인간 세포에 기초한 측정검사법이 이용된다.
THP-1 세포는 백혈병 환자로부터 유래되는 인간 단구성 세포주인데, 이들 세포는 the American Type Culture Collection에서 보존되고 있다. 인간 호스트로부터 기원으로 인하여, 이들 세포는 인간 위장 면역계의 인간 공생 세균과의 상호작용을 연구하는데 특히 적합하다.
본 발명에서 데이터는 특이적인 균주, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 4659와 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 6475에 의한 TNFα 생산의 강력한 저해를 암시하고, 이러한 저해가 후기 대수/정체 생장기 동안 이들 2가지 특이적인 균주에 의해 배양 배지 내로 방출된 물질에 의해 매개된다는 것을 입증한다. 대조적으로, 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 2가지 다른 균주는 대장균(E. coli) 독소에 대한 세포의 염증 반응을 저해할 수 없었을 뿐만 아니라 자체의 염증 반응을 유발하였다. 이러한 놀라운 조사 결과는 기존에 예측될 수 없었던, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 4659와 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 6475 균주의 잠재적인 항-염증성을 지시한다.
이들 조사 결과의 가능한 임상적 적절성을 확증하기 위하여, 염증성 장 질환, 구체적으로, 크론병(CD) 환자의 혈액으로부터 유래된 세포에서 추가적인 연구를 수행하였다.
유산균(lactic acid bacteria)과 점막 면역 세포 사이에 상호작용을 조사하기 위하여, 분화된 대식세포가 미분화된 단핵구보다 더욱 효과적인 모형인 것으로 간주하였다. 분화된 대식세포는 유산균(lactic acid bacteria)에 반응하고 선천성 숙주 면역계의 조절성이나 염증성 변화를 유도하는, 위장관의 생체내 대식세포 개체군과 유사할 가능성이 높다. 가령, 내독소에 대한 반응으로 THP-1 세포에 의한 친염증성 인터루킨-8의 생산은 분화의 도입이후 현저하게 증가하고(Baqui et al., 1999), 게다가, 이들 세포에 의한 TNFα 생산이 분화이후 현저하게 증가한다(Klegeris et al., 1997).
본 발명의 이들 특징은 아래의 실시예를 참조하면 더욱 명확하게 이해되지만, 이들 실시예는 본 발명을 한정하지 않는다.
실시예 1. 항-염증성 균주의 선별.
THP-1 세포는 대조 배지, 또는 선별된 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주: 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 4659, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 6475, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC 55730, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주 CF48-3A의 성장으로부터 조절된 배지(L-CM)와 함께 배양하였다. 이들 조절된 배지(L-CM)는 각 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 배양액의 9-시간 또는 24-시간 배양액으로부터 세포-없는 상층액이다. THP-1 세포는 3.5 시간 배양 동안 대조 배지 또는 대장균(E. coli)-유래된 LPS(이는 정상적인 염증 반응에서 TNFα의 생산을 유도한다)로 자극하고, 이후, 이들 세포는 제거하고, 상층액은 ELISA 기술을 이용하여 TNFα 수준을 분석하였다.
재료:
THP-1 백혈병성 단구성 세포주(ATCC, cat number TIB202)
RPMI 1640 배지(Gibco-Invitrogen)
태아 소 혈청(Gibco-Invitrogen)
페니실린-스트렙토마이신 용액(Sigma)
대장균(E. coli) 혈청형 O127:B8 리포폴리사카라이드(Sigma, cat number L3137)
TNF-알파/TNF-SFII 인간 DuoSet ELISA Development 키트(R&D Systems, cat number D Y210)
방법:
THP-1 단구성 세포주를 이용한다. 5%(v/v)의 MRS 배지와 5%(v/v)의 락토바실러스(Lactobacillus) 조절된 배지(conditioned medium)를 적당한 웰 내로 추가한다. 락토바실러스(Lactobacillus) 조절된 배지(conditioned medium)는 MRS 배지에 담긴 락토바실러스(Lactobacillus) 종의 24-시간 배양액으로부터 상층액이다. 이후, 조절된 배지(conditioned medium)는 동결 원심분리 건조(speed-vacuum drying)로 pH-조정하고, 펠릿(pellet)은 동등 부피의 배양 배지에 재현탁시킨다. 48 시간의 배양이후 액체 증발을 최소화하기 위하여 가습된 챔버가 고안되긴 하지만, 24-웰 평판 내에서 세포 현탁액 부피는 대략 475 ㎕로 감소한다.
100 ng/㎖의 대장균(E. coli) 혈청형 O127:B8 리포폴리사카라이드를 적당한 웰 내로 추가한다. 37℃, 가습된, 5% CO2 챔버 내에서 배양한다. 3.5 시간 배양이후, 배양액을 1.5 ㎖ 원심분리 튜브 내로 수집한다. 1500 RCF에서 5분간 4℃에서 원심분리한다. 상층액을 수집한다.
ELISA(Quantikine TNF-알파/TNF-SFII 인간 DuoSet)로 사이토킨 발현을 검사한다.
이용된 배양 배지는 RPMI 1640에 담긴 10% FBS, 2% 페니실린-스트렙토마이신이었다.
결과 - 실시예 1
LPS의 부재에서 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 4659와 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 6475 균주로부터 24-시간 L-CM과 함께 THP-1 세포의 배양은 배양 배지 내에서 TNFα의 생산을 유도하지 않았다(도 1). 놀랍게도, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC 55730과 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주 CF48-3A로부터 L-CM은 LPS 단독에서 관찰되는 수준과 유사한 수준으로 THP-1 세포에 의한 TNFα의 생산을 자극하였다. 따라서, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주는 THP-1 단핵구를 안정시킴으로써 친염증성 TNFα 생산을 자극하는 능력에서 서로 상이하다.
L-CM의 부재에서 THP-1 세포에 LPS의 추가는 3.5 시간 배양 기간 동안 138 pg/㎖ TNFα의 생산을 유도하였다. 이는 상기 독소에 대한 THP-1 세포의 예상된 염증 반응이다. L-CM 추가에 대한 대조로서 기능하는 성장 배지(MRS)의 추가는 132 pg/㎖ TNFα의 생산을 유도하고, 따라서 MRS는 LPS에 대한 반응에 개입하지 않았다. 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 4659 또는 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 6475로부터 24-시간 L-CM의 추가는 LPS 자극된 TNFα의 수준을 각각, 14와 10 pg/㎖까지 현저하게 감소시켰다. 이는 LPS-자극된 TNFα 생산의 각각, 89%와 92% 저해를 나타낸다. 대조적으로, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC 55730과 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주 CF48-3A로부터 24-시간 L-CM의 존재에서, LPS는 LPS의 부재에서 수준과 비교하여 TNFα의 현저한 상승을 유도하였다. LPS-자극된 TNFα 생산은 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC 55730과 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주 CF48-3A로부터 L-CM의 존재에도 불구하고 각각, 50%와 38% 증가하였다.
락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 4659 또는 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 6475로부터 9-시간 L-CM으로 수행된 유사한 실험은 LPS-자극된 TNFα에 대한 저해 효과가 상당히 줄어들긴 하지만(각각, 52%와 16%; 도 2) 여전히 나타난다는 것을 입증하였다. 따라서, 후기 대수/정체 성장기에서 L-CM의 수확과 함께, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주의 더욱 긴 배양은 TNFα 생산을 저해하는데 있어 개선된 효능을 유도한다.
실시예 2. 단핵구 세포에 대한 음성 선별 prep
단핵구 분리 키트 II(Miltenyi Biotec, Inc. 12740 Earhart Avenue, Auburn, CA 95602 (800) 367-6227; http://www.miltenyibiotec.com/index.php?, order number 130-091-153)는 인간 말초혈 단핵구 세포(PBMC)로부터 본래 상태의 단핵구를 분리하기 위한 간접적인 자석 표지 시스템이다. 비-단구성 세포, 다시 말하면, T 세포, B 세포, NK 세포, 수상돌기 세포, 호염기구는 CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123, 글리코포린(Glycophorin) A에 대한 비오틴-공액된 항체의 칵테일 및 항-비오틴 마이크로비드(MicroBead)를 이용하여 간접적으로 자석 표지된다. 이들 두 표지 단계 사이에서, 세척 단계는 필요하지 않다. 자석-표지된 비-단핵구는 이들을 MACS 분리의 자기장(magnetic field) 내에서 MACS칼럼 상에 유지시킴으로서 고갈되는 반면, 결합되지 않은 단핵구는 칼럼을 통과한다. 상대적으로 농축된 결합되지 않은 단핵구의 분리는 자석 표지된 세포의 고갈에 의해 달성된다. 농 축(enrichment) 수준은 유세포분석법으로 평가하거나 확증할 수 있다.
키트 정보: 단핵구 분리 키트 II(order number 130-091-153). 키트 내용물: FcR 차단 시약(1 ㎖); 비오틴-항체 칵테일(1 ㎖); 항-비오틴 마이크로비드(2 ㎖); 키트 내에 공급되지 않는 재료와 장치: 15 ㎖ Corning 원심분리 튜브; 냉각된 원심분리; 피펫과 피펫 팁; 혈청학적 피펫터와 피펫 팁; 타이머; Miltenyi Biotec MACSMS 칼럼; Miltenyi Biotec MACS자석; Miltenyi Biotec MACS칼럼 스탠드; Hausser Scientific Bright-Line 혈구계산기(hemocytometer); 작업 완충액(WB): 무균 1X 인산염 완충된 염수(PBS, pH 7.4, Gibco catalog number 10010023) + 0.5% 소 혈청 알부민(BSA, Panvera catalog number P2489) + 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, Gibco catalog number 15553-035).
방법(단핵구 분리 키트 II):
혈구계산기에서 계산함으로써 세포 밀도(cell density)를 결정한다. 세포 현탁액을 15 ㎖ Corning 원추형 튜브 내로 이전한다. 300 RCF에서 10분간 4℃에서 세포를 펠릿으로 만든다. 10 ㎖ 혈청학적 피펫을 이용하여 상층액을 제거한다. 107개의 전체 세포당 30 ㎕의 WB에 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 107개의 전체 세포당 10 ㎕의 FcR 차단 시약을 추가한다. 107개의 전체 세포당 10 ㎕의 비오틴-항체 칵테일을 추가한다. 충분히 혼합하고 4℃ - 8℃에서 10분간 배양한다. 107개의 전체 세포당 30 ㎕의 WB를 추가한다. 107개의 전체 세포당 20 ㎕의 항-비오틴 마이크로비드를 추가한다. 충분히 혼합하고 4℃ - 8℃에서 15분간 추가로 배양한다. 10 - 20X 표지 부피(labeling volume)의 WB를 추가함으로써 세포를 세척한다. 300 RCF에서 10분간 4℃에서 원심분리한다. 2 ㎖ 혈청학적 피펫을 이용하여 상층액을 제거한다. 108개 세포당 500 ㎕의 WB에 세포 펠릿을 재현탁시킨다. MACS MS 칼럼을 자석 상에 위치시킨다.
500 ㎕의 WB로 칼럼을 세척한다. 세포 현탁액을 칼럼 상에 적하한다. 수집 튜브(~ 4 min/㎖) 내로 배출한다. 3 x 500 ㎕의 WB로 칼럼을 세척하고 동일한 수집 튜브 내로 배출한다.
칼럼을 다른 튜브 내로 위치시킴으로써, 포획된 세포를 다른 수집 튜브 내로 용리하고, 1 ㎖의 WB를 칼럼 내로 피펫팅하고, 상기 칼럼과 함께 제공된 플런저(plunger)로 양압(positive pressure)을 이용하여 세포를 밀어낸다. 2 초/inch의 속도로 진행된다.
상기 프로토콜에서는 신속하게 작업하고 차가운 용액만을 이용하는 것이 중요하다. 얼음 위에서 작업은 MACS 마이크로비드에 대한 증가된 배양 시간을 요한다. 냉장 장치 내에서 4℃ - 8℃에서 배양한다. 완충액 또는 배지는 Ca2 + 또는 Mg+를 포함하지 않아야 한다. BSA는 젤라틴, 인간 혈청 알부민 또는 소 태아 혈청으로 대체될 수 있다. 이용된 항-응고제의 유형은 프로토콜에 영향을 주지 않는다. 더욱 높은 온도와 더욱 긴 배양 시간은 비-특이적인 세포 표지를 유발한다.
실시예 3. 일차 단핵구 생물검사
일차 인간 단핵구는 활성 염증 단계(CD-act)에 있는, 또는 염증이 진정되었다가 재발 단계(CD-rem)에 있는 CD 환자의 혈액으로부터 분리하였다. 혈액은 CD 환자로부터 채취하고 말초혈 단핵구 세포를 분리하였다. 말초혈 단핵구는 실시예 2에 기술된 방법을 이용하여 농축하였다. 이들의 현탁액은 37℃, 가습된, 5% CO2 챔버 내에서 분화시켰다. 이러한 절차이후, 이들 세포는 대식세포로 발달하였다. 말초혈 단핵구 또는 분화된 대식세포는 성장 배지(대조) 또는 L-CM을 추가하고, 대조 배지 또는 대장균(E. coli)-유래된 LPS로 자극하고, 3.5 시간 동안 배양하였다. 이들 배양액으로부터 상층액에서 TNFα 생산을 분석하였다.
이용된 재료는 아래와 같다: 일차 말초혈 단핵구; RPMI 1640 배지(Gibco-Invitrogen); 태아 소 혈청(Gibco-Invitrogen); 페니실린-스트렙토마이신 용액(Sigma); 대장균(E. coli) 혈청형 O127:B8 리포폴리사카라이드(Sigma, cat number L3137); 트랜스 레티노산(CalBioChem, cat number 554720); TNF-알파/TNF-SFII 인간 DuoSet ELISA Development 키트(R&D Systems, cat number D Y210).
말초혈 단핵구는 상기 프로토콜: 말초혈 단핵구 세포 분리 프로토콜(실시예 2) 및 단핵구 음성 선별 프로토콜(실시예 2)에서 기술된 바와 같이 분리된다. 세포 현탁액 배지(PBS)는 세포 배양 배지(RPMI 1640에 담긴 10% FBS, 2% 페니실린-스트렙토마이신)로 교체한다.
세포를 1.0 x 105개 세포/㎖로 희석한다. 500 ㎕ 세포 현탁액을 24-웰 마이크로역가 평판의 각 웰 내로 도말한다. 세포를 37℃, 가습된, 5% CO2 챔버 내에서 48 시간 동안 분화시킨다. 생물검사를 시작한다. 5%(v/v)의 MRS 배지 및 5%(v/v)의 락토바실러스(Lactobacillus) 조절된 배지를 적당한 웰 내로 추가한다. 락토바실러스(Lactobacillus) 조절된 배지는 MRS 배지 내에서, 락토바실러스(Lactobacillus) 종의 24-시간 배양액으로부터 상층액이다. 이후, 상기 조절된 배지는 동결 원심분리 건조(speed-vacuum drying)로 pH-조정하고, 펠릿(pellet)은 동등 부피의 배양 배지에 재현탁시킨다. 48 시간의 배양이후 액체 증발을 최소화하기 위하여 가습된 챔버가 고안되긴 하지만, 24-웰 평판 내에서 세포 현탁액 부피는 대략 475-485 ㎕로 감소한다.
100 ng/㎖의 대장균(E. coli) 혈청형 O127:B8 리포폴리사카라이드를 적당한 웰 내로 추가한다. 37℃, 가습된, 5% CO2 챔버 내에서 배양한다. 3.5 시간 배양이후, 배양액을 1.5 ㎖ 원심분리 튜브 내로 수집한다. 1500 RCF에서 5분간 4℃에서 원심분리한다. 상층액을 수집한다. ELISA(Quantikine TNF-알파/TNF-SFII 인간 DuoSet)로 사이토킨 발현을 검사한다.
결과 - 실시예 3
CD-rem 환자로부터 일차 단핵구에서, LPS는 TNFα에서 예상된 상승을 유도하였고, 이러한 상승은 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 6475로부터 L-CM 의 존재에서 43% 저해될 수 있었다. CD-act 환자로부터 일차 단핵구에서, LPS-자극된 TNFα 생산의 수준은 다소간 높았고, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 6475로부터 L-CM에 의해 동일한 정도로 저해되었다(도 3).
배지 대조와 비교하여, CD-act 환자의 일차 단핵구로부터 유래된 분화된 대식세포 내에서 LPS에 대한 반응으로 TNFα의 생산은 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 4659 균주로부터 L-CM에 의해 50% 및 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 6475로부터 L-CM에 의해 60%까지 저해되었다(도 4). 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC 55730과 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주 CF48-3A로부터 유래된 L-CM은 TNFα의 생산을 저해하지 못하였고, 오히려 관련된 대조와 비교하여 TNFα의 생산을 각각, 22%와 30% 증가시켰는데, 이는 THP-1 세포로부터 데이터를 확증한다(도 4).
이들 데이터는 락토바실러스 루테리(L. reuteri)의 상이한 균주가 단핵구와 분화된 대식세포에 의한 TNFα 생산에 대해 다양한 효과를 나타내고, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 4659와 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA 6475 균주가 염증성 장 질환을 앓는 인간의 위장관에 이용하기 특히 적합하다는 놀라운 발견을 뒷받침한다.
실시예 4. 조절된 배지(conditioned medium)의 이용
실시예 1에 기술된 방법을 이용하여, TNFα를 효과적으로 감소시키는 한 균주로부터 조절된 배지(conditioned medium), 본 실험의 경우에, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA-4659로부터 배지를 선택하였다. 이러한 배지는 상기 균주를 de Man, Rogosa, Sharpe(MRS)(Difco, Sparks, MD) 내에서 성장시킴으로써 대량으로 생산하였다. 락토바실러스(Lactobacillus)의 하룻밤 배양액은 1.0의 OD60O(대 략 109개 세포/㎖)까지 희석하고, 추가로 1:10 희석하고, 24 시간 동안 더욱 성장시켰다. 세균 세포-없는 조절된 배지(conditioned medium)는 8500 rpm에서 10분간 4℃에서 원심분리로 수집하였다. 조절된 배지(conditioned medium)는 세포 펠릿으로부터 분리하고, 이후 0.22 ㎛ 다공 필터 단위(Millipore, Bedford, Mass.)를 통하여 여과하였다. 그 다음, 조절된 배지(conditioned medium)는 표준 방법을 이용하여 냉동 건조시키고 조제하여 정제를 만들었다. 이러한 정제는 IBD에 의해 유발된 궤양을 효과적으로 치료하기 위하여 인간에 의해 약제로서 이용되었다.
실시예 5. 선별된 항-염증성 락토바실러스 루테리 ( Lactobacillus reuteri ) 균주의 이용
실시예 1에 기술된 방법을 이용하여, TNFα를 효과적으로 감소시키는 한 균주로부터 조절된 배지(conditioned medium), 본 실험의 경우에, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA-4659로부터 배지를 선택하였다. 이후, 상기 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주는 표준 방법을 이용하여 냉동 건조시키고 조제하여 캡슐을 만들었다. 이러한 캡슐은 IBD에 의해 유발된, IBD 환자에서 점막 염증을 효과적으로 감소시키기 위하여 인간에 의해 약제로서 이용되었다.
실시예 6. 효과적인 락토바실러스 ( Lactobacillus ) 균주에 의해 생산된 단백질의 특성화
락토바실러스 루테리(L. reuteri) 균주 ATCC PTA 4659와 락토바실러스 루테리(L. reuteri) ATCC PTA-6475 조절된 배지(conditioned medium)를 비롯한 상이한 효과적인 락토바실러스(Lactobacillus) 조절된 배지는 이들 세균으로부터 유래되는 추정 면역모듈린(immunomodulin)의 본성을 결정하기 위하여 다양한 변성 화합물로 처리하였다. 따라서, 조절된 배지는 반복적인 냉동-해동, 열처리, DNA 절단 효소로 절단, 프로테아제 및 불활성화된 프로테아제에 노출시켰다. 상기 추정 면역모듈린은 이러한 방식으로, 자연에서 하나이상의 단백질 또는 펩티드인 것으로 확인되었다. 추정 단백질 면역모듈린의 크기를 결정하기 위하여, 조절된 배지(conditioned medium)는 여과로 분별하고, 여과액은 효능을 검사하였다. 이러한 방식으로, 효과적인 락토바실러스(Lactobacillus) 균주로부터 조절된 배지의 활성 성분은 대략 5 kDa 이하의 크기를 갖는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 특정 구체예에 관하여 기술되긴 했지만, 본 발명의 기술적 사상 또는 범위를 벗어나지 않은 다양한 개변이 가능하고, 이런 개변은 본 발명의 범위 내에 속한다.

Claims (7)

  1. 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) ATCC PTA-6475의 생물학적으로 순수한 배양액.
  2. 염증성 장 질환에서 염증을 치료하는 방법에 있어서, 청구항 1에 따른 배양액으로부터 조절된 배지(conditioned medium)를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  3. 염증성 장 질환에서 염증을 치료하는데 효과적인 세균 균주를 선별하는 방법에 있어서, 인간 공급원으로부터 유래된 THP-1 단구성 세포주를 이용하여 TNFα를 감소시키는데 효과적인 균주를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 선별 방법.
  4. 염증성 장 질환에서 염증을 치료하는 방법에 있어서, 청구항 3에 따라 선별된 세균 균주의 세포를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  5. 청구항 3에 따라 선별된 세균 균주의 배양액의 성장이후 락토바실러스(Lactobacillus) 조절된 배지(conditioned medium) 내에 존재하는 5kDa 단백질성 물질을 함유하는, 궤양을 치료하는데 효과적인 성분.
  6. 청구항 3에 따라 선별된 세균 균주의 배양액으로부터 조절된 배지(conditioned medium)를 포함하는, 염증성 장 질환 환자에 투여용 산물.
  7. 청구항 3에 따라 선별된 세균 균주의 배양액을 포함하는, 염증성 장 질환 환자에 투여용 산물.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180123737A (ko) * 2011-07-21 2018-11-19 바이오가이아 에이비 박테리아성 히스타민의 산물 및 이의 용도
KR20200044134A (ko) * 2012-06-04 2020-04-28 바이오가이아 에이비 포유류에서 골 소실을 예방하는 젖산균의 선별 및 이의 용도

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080254011A1 (en) * 2007-04-11 2008-10-16 Peter Rothschild Use of selected lactic acid bacteria for reducing atherosclerosis
US20110293710A1 (en) * 2010-02-02 2011-12-01 Delphine Saulnier Immunomodulatory properties of lactobacillus strains
US8785183B2 (en) * 2010-09-21 2014-07-22 Biogaia Ab Active plastic material in oil
ES2402014B1 (es) 2011-09-07 2014-02-27 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Peptido secretado por lactobacillus plantarum con función inmunomoduladora
JP6203816B2 (ja) 2012-03-29 2017-09-27 セラバイオーム，エルエルシー 回腸及び虫垂に対して活性の胃腸部位特異的経口ワクチン接種製剤
US9907755B2 (en) 2013-03-14 2018-03-06 Therabiome, Llc Targeted gastrointestinal tract delivery of probiotic organisms and/or therapeutic agents
RU2692671C2 (ru) * 2014-01-23 2019-06-26 Биогайа Аб Выбор агентов, модулирующих гастроинтестинальную боль
US20180104287A1 (en) * 2015-03-26 2018-04-19 Biogaia Ab Histamine-producing bacterial strains and their use in cancer
US10376563B1 (en) 2016-02-12 2019-08-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods for systemically delivering polypeptides and microorganisms therefor
SI3442547T1 (sl) 2016-04-15 2023-11-30 Baylor College Of Medicine Lactobacillus reuteri MM4-1A za uporabo pri zdravljenju ali preprečevanju motenj avtističnega spektra
KR102250597B1 (ko) 2017-11-20 2021-05-11 경희대학교 산학협력단 신규 유산균 및 이의 용도
CN110893195B (zh) * 2019-09-30 2023-03-14 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 一种具有缓解肠道炎症功能的副干酪乳杆菌et-22
WO2021091474A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 Biogaia Ab Serotonin producing bacteria
CN114196581B (zh) * 2020-12-16 2023-06-13 江南大学 缓解高尿酸血症的罗伊氏乳杆菌ccfm1132及应用
EP4175968B1 (en) 2021-07-30 2024-07-03 Helaina, Inc. Methods and compositions for protein synthesis and secretion
WO2023063314A1 (ja) 2021-10-11 2023-04-20 味の素株式会社 異種Ｔａｔ系タンパク質を発現するよう改変された細菌

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5413960A (en) * 1987-05-01 1995-05-09 Biogaia Ab Antibiotic reuterin
US5458875A (en) * 1990-06-15 1995-10-17 Biogaia Ab In ovo method for delivering Lactobacillus reuteri to the gastrointestinal tract of poultry
US5534253A (en) * 1995-06-07 1996-07-09 Biogaia Ab Method of treating enteropathogenic bacterial infections in poultry
US5837238A (en) * 1996-06-05 1998-11-17 Biogaia Biologics Ab Treatment of diarrhea
US20010049115A1 (en) * 2000-01-17 2001-12-06 Collins John Kevin Vitro model for gastrointestinal inflammation
AU5773600A (en) * 1999-06-30 2001-01-31 Board Of Regents Of The University Of Nebraska, The Method of isolation of regulated virulence determinants from bacterial pathogens
US6953574B2 (en) * 2002-06-21 2005-10-11 Technology Commercialization, Inc. Method for producing a fermented hydrolyzed medium containing microorganisms
US7105336B2 (en) 2002-10-07 2006-09-12 Biogaia Ab Selection and use of lactic acid bacteria for reducing inflammation caused by Helicobacter
US20040208863A1 (en) * 2003-01-30 2004-10-21 James Versalovic Anti-inflammatory activity from lactic acid bacteria

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180123737A (ko) * 2011-07-21 2018-11-19 바이오가이아 에이비 박테리아성 히스타민의 산물 및 이의 용도
KR20200044134A (ko) * 2012-06-04 2020-04-28 바이오가이아 에이비 포유류에서 골 소실을 예방하는 젖산균의 선별 및 이의 용도

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