KR20070119251A - 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출 방법 - Google Patents

카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법은 i) 금속박막 칩의 표면을 활성화시켜 주는 단계, ii) pH 3.5 내지 5.0의 pH 버퍼 용액으로 항체를 희석하여 항체 희석액을 준비하는 단계, iii)상기 항체 희석액을 상기 표면에 흘려주어 상기 금속박막 표면에 항체를 고정화시키는 단계 및 iv) 상기 표면에 아민계 화합물을 제공하여 상기 항체를 안정화시키는 단계를 포함하는 항체 고정화 단계; 검출 대상 시료를 상기 항체가 고정화된 금속박막 칩 상에 제공하는 단계; 상기 검출 대상 시료를 분석하는 시료 분석 단계; 및 상기 검출 대상 시료를 상기 금속박막 칩으로부터 해리시키는 해리 단계를 포함한다.

Description

카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출 방법{Detecting method for carbamate based and organic phosphate based agricultural chemicals}
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 검출방법을 개념적으로 도시한 개념도이다.
도 2는 pH 및 시간에 따른 RU값의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 금속박막 칩 상에 덱스트란이 도포된 모습을 보여주는 3차원 이미지이다.
도 4는 도 3의 도포된 덱스트란을 보여주는 1차원 이미지이다.
도 5는 도 3의 덱스트란이 도포된 금속박막 칩 상에 GST 항체가 고정화된 모습을 보여주는 3차원 이미지이다.
도 6은 도 5의 GST 항체가 고정화된 모습을 보여주는 1차원 이미지이다.
본 발명은 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 검출 감도가 우수하고 검출 시간을 단축시킬 수 있는 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법에 관한 것이다.
농약은 농약의 본래 이점에도 불구하고 농산물과 생태계에 잔류하여 환경오염과 사람의 건강을 위협하기 때문에 세계적으로 잔류농약에 대한 관심이 고조되어 있는 실정이다. 특히, 농산물에 존재하는 잔류농약은 국내외적인 큰 관심사항으로 각 국가마다 농산물 중 농약의 잔류량을 규제함으로써 농약의 안전사용기준 준수를 유도하여 농약 사용량을 억제함으로써 농산물의 안전성을 사전에 확보하고 있다.
관행적인 잔류농약 분석은 주로 가스크로마토그래피(gas chromatograhpy, GC)나 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC), GC/MS(gas chromatography/mass spectroscopy)에 의존하고 있는데, 분석을 위해 일정량의 시료를 마쇄하고 적당한 유기용매로 추출하고 정제한다. 이 방법들은 감도와 정확도가 높다는 장점을 갖는 반면 많은 경비와 시간, 노력, 고가의 장비 및 숙련된 기능을 필요로 한다.
농산물의 안전성 확보를 위한 검사는 유통특성상 신속한 검사기술이 요구된다. 따라서 잔류농약 성분을 정확하고, 신속하게 측정할 수 있으며, 조작이 간단하여 누구나 손쉽게 측정할 수 있는 소형, 경량의 경제성 있는 장비 혹은 바이오센서 개발 기술의 습득이 절실히 요구된다.
바이오센서는 “측정 대상물로부터 정보를 얻을 때 생물학적 요소를 이용하거나, 측정 대상물이 생물체이거나 또는 생물학적 요소를 모방하는 것을 사용하여 색, 형광, 전기적 신호 등과 같이 인식 가능한 유용한 신호로 변환시켜주는 시스템”으로 전처리가 간편하고 현장에서의 실시간 측정이 가능하기 때문에 보건, 의료 및 국방 분야를 중심으로 선진국에서는 개발에 대한 관심이 급증하고 있다.
이와 같은 필요에 의해 국내에서 바이오센서를 이용한 잔류농약에 관한 연구는 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase)를 흡착시킨 디스크 형식의 검출 키트, 흡광도를 이용하여 이성분 동시 측정용 광바이오 센서 연구, 분광광도계를 이용하여 EBDC계 살균제 잔류량 검출 연구 등이 수행되었다. 국외에서는 압전효과를 이용한 방법, 표면플라즈몬공명을 이용한 방법, 광열바이오센서 방법에 의한 잔류농약 검출 연구가 수행되었다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 필요를 감안한 것으로서, 검출 감도가 우수하고 검출 시간을 단축시켜 검출 효율을 획기적으로 개선할 수 있는 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 특징에 따른 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법은 항체 고정화 단계, 검출 대상 시료를 상기 항체가 고정화된 금속박막 칩 상에 제공하는 단계, 상기 검출 대상 시료를 분석하는 시료 분석 단계, 및 상기 검출 대상 시료를 상기 금속박막 칩으로부터 해리시키는 해리 단계를 포함한다. 상기 항체 고정화 단계는 i) 금속박막 칩의 표면을 활성화 시켜주는 단계, ii) pH 3.5 내지 5.0의 pH 버퍼 용액으로 항체를 희석하여 항체 희석액을 준비하는 단계, iii)상기 항체 희석액을 상기 표면에 흘려주어 상기 금속박막 표면에 항체를 고정화시키는 단계 및 iv) 상기 표면에 아민계 화합물을 제공하여 상기 항체를 안정화시키는 단계를 포함한다.
상기 금속박막은 금, 은 등의 금속으로 이루어질 수 있다. 또한 상기 금속박막 칩의 표면에는 표면에는 덱스트란(dextran)이 도포되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 활성화 단계에서는 상기 금속박막 칩의 표면에 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide), N-에틸-N'(디메틸아미노프로필) 카보디미드[N-ethyl-N'(dimethylaminopropyl)carbodimide]를 흘려준다.
본 발명에 따른 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출을 위한 항체로서는 글루타티온 s-트랜스퍼라제(GST), 아세틸콜린스테라제(AChE) 등이 바람직하다.
상기 아민계 화합물로서는 에탄올 아민 등을 사용할 수 있다.
상기 시료분석 단계에서는 상기 금속박막 표면에 표면플라즈몬공명(SPR)을 발생시키고 단색 편광인 광을 입사시켜 SPR각 변화를 분석한다.
상기 해리 단계에서는 염화나트륨(NaCl) 및 수산화나트륨(NaOH)의 PBS(Phosphate Buffered Saline)버퍼 희색액을 상기 금속박막 표면에 흘려주어 항원만을 선택적으로 해리한다.
상기 모든 단계들은 15분 이내의 시간 내에 수행될 수 있다.
상기 검출 방법에 따르면, 채소류 등에 잔류하는 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분을 효율적으로 검출할 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세하게 설명하도록 한다.
본 발명에 따른 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법은 효소면역 분석법 및 표면플라즈몬공명(SPR)을 모두 채용한다.
상기 검출방법은 항체 고정화 단계, 검출 대상 시료 제공 단계, 검출 단계 및 상기 검출 대상 시료의 해리 단계를 포함한다.
상기 검출 대상 시료는 카바메이트계 또는 유기인계 농약 성분으로서, 예를 들면 카바메이트계 농약 성분인 카보후란을 들 수 있다. 상기 검출 대상 시료는 효소면역분석법 하에서 항원으로서 기능하게 된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 검출방법을 개념적으로 도시한 개념도이다.
도 1을 참조하면, 상기 농약 성분의 검출을 위해서는 우선, 모 기판(10)에 금속박막(20)이 형성된 금속박막 칩(100)이 준비된다. 상기 금속박막은 금, 은 등의 금속물질이 도포 또는 증착되어 형성된다(A).
상기 금속박막(20)의 표면에는 덱스트란(dextran)이 도포된다(B). 상기 금속박막 칩으로서는, 예를 들면, CM5 칩(상품명, 스웨덴 바이오코어사 제조)이 사용될 수 있다. 상기 CM5 칩은 약 760nm의 파장을 갖는 광에 의하여 표면플라즈몬공명(SPR)을 일으키게 된다.
상기 덱스트란이 도포된 금속박막 칩(100) 상에는 항체가 잘 결합될 수 있도록 활성화 물질이 제공된다(C). 상기 활성화 물질로서는, N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; EDC) 및 N-에틸-N'(디메틸아미노프로필) 카보디미드[N-ethyl-N'(dimethylaminopropyl)carbodimide; NHS]가 사용될 수 있다. 상기 EDC 및 NHS를 상기 금속박막 칩(100) 상에 흘려줌으로써, 상기 금속박막 칩(100)은 활성화 될 수 있다.
상기 활성화된 금속박막 칩(100) 상에는 항체가 결합된다(D). 본 발명에 따른 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출을 위한 항체로서는, 글루타티온 s-트랜스퍼라제(GST), 아세틸콜린스테라제(AChE) 등이 사용될 수 있다. 보다 자세하게는, 상기 GST는 카바메이트계 농약 성분의 검출에 상대적으로 유리하고, 상기 AChE는 유기인계 농약 성분의 검출에 상대적으로 유리하다.
상기 항체가 직접 상기 금속박막 칩(100) 표면에 제공되는 것은 아니다. 상기 항체는 pH 버퍼 용액에 희석된 희석액 상태로 상기 금속박막 칩(100) 표면에 흘려진다.
상기 pH 버퍼 용액의 pH는 안정된 항체의 고정을 위하여 상기 항체가 상기 금속박막 칩(100) 상에 고정되기 전에 농도 테스트 등을 거쳐 최적화된다.
상기 GST 및 AChE의 안정된 고정을 위한 pH범위는 3.5 내지 5.0이다. 상기 pH가 3.5 미만이거나 5.0를 초과할 경우, 항체의 안정된 고정이 힘들뿐만 아니라 해리 단계에서 항원의 완전히 해리되지 않는 문제점이 있다. 상기 pH 범위는 바람직하게는 4.3 내지 4.7이다.
상기 pH 버퍼로서는, 소듐 아세테이트(sodium acetate)가 사용될 수 있다.
상기 금속박막 칩(100)의 항체에는 검출 대상 시료가 제공된다(E). 검출 대상 시료 내의 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분은 항원으로서 상기 항체와 반응하게 된다. 상기 농약 성분의 검출은 표면플라즈몬공명을 이용하고 컴퓨터 처리작업을 통하여 수치화할 수 있다.
표면플라즈몬공명은 금속박막 표면에서 일어나는 전자들의 집단적 진동이며 이에 의해 발생한 표면플라즈몬파는 금속과 이에 인접한 유전물질의 경계면을 따라 진행하는 표면전자기파이다. 표면플라즈몬의 여기(excitation)는 외부에서 서로 다른 유전함수를 갖는 두 개의 매질의 경계면 즉, 금속과 유전체의 경계면에 전기장을 인가하면 경계면에서의 전기장의 수직성분의 불연속성 때문에 표면전하가 유도되고 이 표면 전하의 진동이 표면플라즈마파로 나타난다. 이 표면플라즈마파는 자유공간에서의 전자기파와는 달리 입사면에 평행하게 진동하는 파로서 p-편광(p-polarization) 성분을 가진다. 따라서 편광된 전자기파에 의해서만 표면플라즈몬을 여기 시킬 수 있다.
두 매질 사이가 매우 얇은 금속으로 코팅이 되어 있고, 입사광이 편광이며 단색 광일 경우, 특정한 입사각도에서 반사되는 광은 그 광 밀도가 현저히 줄어드는 SPR 현상이 발생한다. 이때 입사각을 SPR각 이라 부른다. SPR각은 전자기파가 파고드는 용액의 굴절률에 따라 달라진다. 굴절률은 버퍼가 바뀜에 따라 변하지만, 센서칩 표면의 질량 변화에 따라서도 달라진다. 따라서 센서칩 표면에 고정화된 물질(ligand. 항체)과 분석물질(analyte, 항원)이 결합하면 질량의 변화를 가져오고 따라서 SPR각이 처음과 달라 지게 된다. 이러한 SPR각의 변화를 연속적으로 기록한 데이터를 센소그램(sensorgram)이라 부른다. 실제의 센소그램에서는 SPR각을 RU(resonance unit)로 전환하여 표시하여 준다. 이때 1,000RU는 1ng/㎟, SPR각 변화는 0.1°에 해당된다.
상기와 같이, 본 발명에 따른 검출대상인 농약 성분은 SPR입사각을 분석함으 로써, 검출될 수 있다. 상기 검출 시스템은 항원, 항체의 종류 그 밖의 작업자의 의도 등에 따라 다양하게 변화될 수 있다.
상기 검출단계가 완료되면, 상기 항체와 반응한 항원은 상기 항체로부터 해리될 수 있도록 해리 단계를 거친다(F). 상기 해리 단계에서는 항원만이 선택적으로 해리됨으로써, 항원이 해리된 금속박막 칩(100)은 후속 검출 작업에서 반복적으로 재사용될 수 있다.
상기 해리를 위해서는 해리액을 상기 금속박막 칩(100) 상에 흘려주어야 한다. 상기 해리액은 염화나트륨(NaCl) 및 수산화나트륨(NaOH)이 PBS(Phosphate Buffered Saline) 버퍼에 희석된 희석액이다.
상기 염화나트륨 및 수산화나트륨의 몰비 및 농도는 해리 대상에 따라 절적하게 조절될 수 있다.
검출작업이 모두 완료되고 항원이 해리된 금속박막 칩(100)은 재활용될 수 있다(G).
상기 검출 방법에 따른 적어도 0.001 ppm까지의 농약 성분의 검출이 가능하다. 또한, 상기 모든 단계는 아무리 길어도 15분 이내에 모두 완료될 수 있다.
이하에서는 구체적인 실시예들을 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나 하기 실시예들에 의하여 본 발명의 기술적 사상이 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
고정화 조건 실험
고정화할 GST가 센서칩 표면(nagative charged)에 쉽게 접근할 수 있도록 최적 pH 버퍼 선택을 위한 농도 테스트를 하였다. 이를 위해 10mM 소듐 아세테이트를 pH 7.0 ~ 3.5의 범위 안에서 각각 1,000㎕씩을 준비하였다. 각 pH별로 50 g/ml GST와 희석하여 최적의 pH 값을 찾기 위한 측정 실험을 실시하였다. 농도 테스트 후 50mM NaOH를 1분간 흘려주어 항체 고정화 준비를 하였다.
고정화 조건 실험 결과
GST가 센서칩 표면(nagative charged)에 쉽게 접근할 수 있는 pH 값을 찾기 위해 도 2에서와 같이 소듐 아세테이트 버퍼와 GST 혼합액을 pH 7.0에서 pH 3.5까지 pH를 달리하며 실험을 하였다. 실험결과 pH 4.5, 4.0, 3.5에서 높은 피크의 RU(resonance unit)값을 보였다. 이중 pH 4.5는 반응할 때와 해리될 때의 RU값이 뚜렷이 구분되었다. 반면 pH 4.0과 pH 3.5는 반응은 잘 되지만 해리구간에서 완전히 해리 되지 못하여 칩 표면에서 GST 잔류물에 의한 RU 값이 계속 측정 되어 과도한 네거티브 전하를 가지는 것을 알 수 있다. 이 같은 결과는 pH 4.5 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer)가 칩 표면에서 적당한 네거티브 전하를 가지면서 GST의 활성을 가장 좋게 해 준다는 것을 의미한다.
[실시예 2]
고정화
금속박막 칩 표면에 EDC와 NHS를 각각 50㎕씩 섞어 유속 5㎕/min로 흘려주어 약 30 ~ 40%의 카르복실 그룹(carboxyl group)을 활성화 하여 단백질의 아민(amine)기가 공유결합 될 수 있도록 하였다. 농도 테스트 에서 채택된 pH 버퍼에 리간드인 GST를 희석하여 흘려주었다. 실험에 사용된 GST의 농도는 50 g/ml이었으며 200㎕를 준비하였다. 끝으로 고정화된 GST를 안정화시키기 위해 1M의 에탄올아민(ethanolamine) 50㎕를 흘려주었다.
[실시예 3]
금속박막 칩의 표면 관찰
본 발명의 일 실시예에 의하여 제조된 금속 박막 칩 상에 덱스트란이 도포된 모습 및 GST가 고정화된 모습을 관찰하였다.
상기 관찰은 AFM(Atomic Force Microscope)라고 불리우는 원자힘현미경으로 관찰되었다. 상기 AFM은 극도로 미세한 나노크기의 형상을 측정하고 물리적 및 화학적 특성규명에 이용된다. 또한, 유전자, 단백질 및 살아있는 세포를 포함한 생물학적 활성을 측정하는데 많이 활용되고 있다. 특히, 비접촉 AFM은 시료를 손상시키지 않고 현미경의 캔틸레버를 고유진동수 부근에서 기계적으로 진동시켜 3 차원 이미지까지 높은 분해능으로 관찰할 수 있게 해준다. 본 실시예에서는, 상기 AFM을 이용하여 상기 금속 박막 칩으로서 골드칩 표면에 공유결합되어 있는 항체의 고정화 상태를 관찰하고 분석하였다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 금속박막 칩 상에 덱스트란이 도포된 모 습을 보여주는 3차원 이미지이다. 도 4는 도 3의 도포된 덱스트란을 보여주는 1차원 이미지이다.
도 3 및 도 4를 참조하면, 가로×세로가 각각 5 ㎛인 골드칩 표면에 덱스트란이 균일하게 도포되어 있는 모습이다. 상기 덱스트란은 균일하게 도포되어 있어 항체가 보다 효율적으로 상기 덱스트란과 결합될 수 있도록 유도할 수 있다.
도 5는 도 3의 덱스트란이 도포된 금속박막 칩 상에 GST 항체가 고정화된 모습을 보여주는 3차원 이미지이다. 도 6은 도 5의 GST 항체가 고정화된 모습을 보여주는 1차원 이미지이다.
상기 GST 항체는 아민커플링 고정화 방법에 의하여 고정화되었으며, 도 5 및 도 6을 참조하면, 상기 GST는 덱스트란 표면에 비교적 고르게 고정화된 것을 알 수 있었다. 상기 GST 항체의 평균 고정화 높이는 0.15 ㎛이었고, 체적은 2.85 ㎛3이었다.
본 발명에 따른 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법은 검출 감도가 매우 우수할 뿐만 아니라 검출 시간이 매우 단축될 수 있다. 향후 본 방법을 더욱 발전시켜 간편하면서도 정확한 바이오 센서를 개발할 수 있을 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 검출 방법은 0.001ppm 미만의 농약 성분을 정확하게 검출할 수 있으며, 검출 시간도 10 내지 15분 정도만 소요되어 매우 효율적이다.
또한, 반응에 참여한 항원으로서의 농약 성분이 완전히 항체와 해리됨으로써, 후속 검출 반응의 정확도를 증가시킬 수 있으며, 바이오 칩의 반 영구적인 사용이 가능하다.
이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

Claims (10)

  1. i) 금속박막 칩의 표면을 활성화 시켜주는 단계;
    ii) pH 3.5 내지 5.0의 pH 버퍼 용액으로 항체를 희석하여 항체 희석액을 준비하는 단계;
    iii)상기 항체 희석액을 상기 표면에 흘려주어 상기 금속박막 칩의 표면에 항체를 고정화시키는 단계; 및
    iv) 상기 표면에 아민계 화합물을 제공하여 상기 항체를 안정화시키는 단계를 포함하는 항체 고정화 단계;
    검출 대상 시료를 상기 항체가 고정화된 금속박막 칩 상에 제공하는 단계;
    상기 검출 대상 시료를 분석하는 시료 분석 단계; 및
    상기 검출 대상 시료를 상기 금속박막 칩으로부터 해리시키는 해리 단계를 포함하는 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 희석액을 준비하는 단계는 pH 4.3 내지 4.7의 pH 버퍼 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 금속박막 칩은 금(Au)으로 이루어진 것을 특징으로 하는 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 금속박막의 표면에는 덱스트란(dextran)이 도포되어 있는 것을 특징으로 하는 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 활성화 단계는 상기 금속박막 칩의 표면에 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide) 및 N-에틸-N'(디메틸아미노프로필) 카보디미드[N-ethyl-N'(dimethylaminopropyl)carbodimide]를 흘려주는 것을 특징으로 하는 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체는 글루타티온 s-트랜스퍼라제(GST) 및 아세틸콜린스테라제(AChE)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 아민계 화합물은 에탄올 아민인 것을 특징으로 하는 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 시료분석 단계는 상기 금속박막 표면에 표면플라즈몬공명(SPR)을 발생시키고 단색 편광인 광을 입사시켜 SPR각 변화를 분석하는 것을 특징으로 하는 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 해리 단계는 염화나트륨(NaCl) 및 수산화나트륨(NaOH)의 PBS(Phosphate Buffered Saline)버퍼 희색액을 상기 금속박막 표면에 흘려주어 항원만을 선택적으로 해리하는 것을 특징으로 하는 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 모든 단계들은 15분 이내의 시간 내에 수행되는 것을 특징으로 하는 카바메이트계 및 유기인계 농약 성분의 검출방법.
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