KR20070107879A

KR20070107879A - 저온 및 저압 하에서 초임계유체를 이용한 나노수준의활성물질 입자 제조방법

Info

Publication number: KR20070107879A
Application number: KR1020060040416A
Authority: KR
Inventors: 김갑식; 조영태
Original assignee: 김갑식; (주)바이오시네틱스
Priority date: 2006-05-04
Filing date: 2006-05-04
Publication date: 2007-11-08
Also published as: KR101342121B1

Abstract

본 발명은 저온 및 저압 하에서 아임계유체 또는 초임계유체를 이용한 나노수준의 활성물질 입자 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 실온에서 고체상인 용매에 활성물질을 녹인 후, 저온 및 저압 하에서 아임계유체 또는 초임계유체를 이용하여 고체상 용매를 제거함으로써, 의약품, 화장품, 기능성 식품 등에 유용하게 사용되는 활성물질들을 나노수준의 입자로 제조하는 방법에 관한 것이다.

활성물질, 고체상 용매, 나노수준, 입자, 아임계유체, 초임계유체, 저온, 저압

Description

저온 및 저압 하에서 초임계유체를 이용한 나노수준의 활성물질 입자 제조방법{METHOD FOR PREPARING NANO-SCALE PARTICLE OF ACTIVE MATERIAL USING SUPERCRITICAL FLUID UNDER LOW PRESSURE AT LOW TEMPERATURE}

본 발명은 저온 및 저압 하에서 아임계유체 또는 초임계유체를 이용한 나노수준의 활성물질 입자 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 실온에서 고체상인 용매에 활성물질을 녹인 후, 저온 및 저압 하에서 초임계유체를 이용하여 고체상 용매를 제거함으로써, 의약품, 화장품, 기능성 식품 등에 유용하게 사용되는 활성물질들을 나노수준의 또는 비결정질 입자로 제조하는 방법에 관한 것이다.

매우 작고 일정한 크기를 유지하는 입자를 빠르고 효과적으로 제조하는 기술은 여러 산업 분야에서 요구되고 있다. 일정한 크기를 유지하는 작은 입자들은 많은 장점들을 지니고 있으며, 그 중에서도 특히, 흐름성이 좋고 입자간 상호작용에 있어서 편차가 거의 없다는 점은 산업적으로 매우 유용한 장점이 된다. 예를 들면, 의약산업에 있어서 치료제 입자의 크기는 분해속도, 생물학적 능력, 제형(formulation) 등에 있어서 매우 중요한 요소가 되는 바, 치료제 입자간 상호작 용에 있어서 편차가 적어질수록 치료제의 전체적인 안정성은 좋아지게 된다.

의약품에 있어서, 치료제 입자의 크기를 나노입자로 하면 다음과 같은 장점들이 있다. 먼저, 경구투여시 장내에서의 흡수율이 작은 약물에 있어서, 입자의 크기가 큰 경우보다 더 많이 흡수될 수 있어, 결과적으로 치료제의 생물학적 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 경구투여만이 가능했던 약물을 흡입형으로 환자에게 투여할 수 있게 되는 것과 같이, 치료제 제형의 형태를 다양하게 할 수 있다. 또한, 치료제의 방출속도는 서방형 치료제의 제형에 있어서 매우 중요한 요소인 바, 치료제 입자의 크기를 나노입자로 하면, 그 크기가 상대적으로 균일해짐에 따라 치료제의 방출속도가 예측가능 해져서, 보다 효과적인 치료제를 제조할 수 있게 된다.

상기한 바와 같이, 균일한 나노입자는 여러가지 장점들을 가지기 때문에, 활성물질을 나노입자로 제조하기 위한 다양한 시도들이 지금까지 이어져 왔다. 전통적으로는, 비교적 큰 입자를 상대적으로 작게 하기 위한 압착(crushing), 빻기(grinding), 제분(milling) 등의 기계적인 방법들이 이용되어 왔다. 근래 제약산업에서는, 에어-젯 분쇄기(air-jet mill)를 이용하여 대량의 치료약을 의약학적 이용에 적당한 크기의 범위로 분쇄하는 방법이 일반적으로 사용되고 있다. 그러나 이러한 기계적 방법에 의할 경우, 오염의 우려가 있으며, 입자의 크기를 작게 하는 데에는 수십 마이크로미터 정도로 한계가 있었다.

미합중국특허 제5,145,684호에는 계면활성제의 존재 하에서 습식제분(wet milling)을 이용하여 난용성 약물을 분쇄하여 수백 나노미터 크기의 입자를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 이 기술을 사용하기 위해서는, 약물을 전통적인 분쇄방 법을 이용하여 100 마이크로미터 이하의 크기를 갖는 입자로 제조한 후 사용하여야 한다. 이 경우에 있어서, 입자의 크기를 목표로 하는 범위로 제조하기 위해서 소요되는 시간은 사용되는 기계적 장치에 따라 달라지는데, 볼 밀(ball mill)을 사용하면 5일 또는 그 이상의 시간이 소요되나, 고전단 매질 밀(high shear media mill)을 사용하면 1일 이내에 제조할 수 있다. 그러나, 고전단 매질 밀(high shear media mill)을 사용할 경우, 분쇄 매질(grinding media) 및 분쇄용기(grinding vessel)의 부식이 상당히 높아 오염이 우려된다. 또한, 이 방법에서 얻어진 나노입자는 액상이므로, 분말로 제조하기 위해서는 스프레이 드라이(spray dry) 또는 동결건조의 공정을 거쳐야 한다. 그러나, 이들 공정을 거치는 동안 입자들간의 상호 응집이 발생하기 때문에, 얻어진 분말을 다시 액체 내에 분산하였을 때 실질적인 나노미터 크기의 입자로 분산되기가 어렵다. 이러한 문제를 해결하기 위해서, 미합중국특허 제5,302,401호에서는 동결건조시의 응집방지제에 대하여 기술하고 있다. 또한 미합중국특허 제 6,592,903호 B2에서는 안정제, 계면활성제 그리고 스프레이 드라이 시의 응집방지제에 대하여 기술하고 있다. 그리고 미합중국특허 2003/0185869호 A1에서는 계면안정제로서 리소자임(lysozyme)을 사용하여 여러 난용성 약물에 대하여 습식제분(wet milling)법을 적용한 예를 기술하고 있다. 그러나 이 경우, 계면안정제가 단백질이므로, 건조에 많은 제약이 있으며, 따라서 액상형태의 제조에 대하여만 기술하고 있다.

또 다른 전통적인 방법으로는, 활성물질이 녹아 있는 용액의 환경을 변화시켜 용질을 침전 또는 결정화시키므로써 활성물질의 미세입자를 만드는 재결정 방법 이 있다. 이 재결정 방법에는 크게 두가지 방식이 있는데, 그 하나는 치료제를 적당한 용매에 녹인 다음, 온도를 낮추어 치료제의 용해도를 변화시켜 입자를 석출시키는 방식이고, 다른 하나는 치료제가 녹아 있는 용매에 반용매(antisolvent)를 첨가하여 용매의 용해력을 낮추므로써 입자를 석출시키는 방식이다. 그러나 이러한 재결정 방법은, 대부분 인체에 유해한 유기용매의 사용을 필요로 하게 되고, 또한, 석출된 입자를 여과한 후 젖은 상태에서 건조하는 동안 입자들끼리 서로 뭉쳐지는 현상이 자주 발생하여, 최종적으로 얻어진 입자의 크기가 일정하지 않을 수도 있다.

미합중국특허 제 2003/0104068 A1호에서는 고분자를 유기용매에 녹이고 여기에 단백질 약물을 녹이거나 분산시킨 후, 초 저온으로 급속냉각하여 고형화 시키고, 이를 동결건조하여 미세 분말을 제조하는 방법을 기술하고 있다. 그러나 이 경우 단백질 약물이 유기용매와의 접촉에 의해서 변성의 우려가 있으며, 또한 급속 냉각 및 동결건조의 공정을 거치므로써 공정의 경제성에도 많은 문제점이 있다.

또한, 유화를 이용하여 입자의 크기를 작게 하는 방법들이 있다. 이 방법은 화장품 분야에서 많이 사용되는 방법으로서, 난용성 물질을 열을 가하여 녹이거나 또는 유기용매를 이용하여 녹인 다음, 이를 계면활성제가 녹아있는 수용액에 첨가하면서 고속교반을 하거나, 초음파를 이용하여 분산함으로써 미세입자를 제조하는 방법이다. 그러나, 이 경우에, 미세 입자를 분말로 제조하기 위해서는 물을 제거하여야 하는데, 이 과정에서 다양한 제약이 따르게 된다. 또한, 유기용매를 사용하여 난용성 물질을 녹일 경우, 인체에 유해한 유기용매의 잔존에 대한 우려가 항상 존 재한다.

미합중국특허 제2004/0067251 A1호는 활성물질을 유기용매에 녹이고, 이를 계면활성제가 녹아 있는 수용액에 분사하므로써 미세입자를 제조하는 방법을 개시하고 있다. 이 방법에서는 유기용매를 사용할 뿐만 아니라, 제조된 입자는 수용액상에 존재하기 때문에, 분말로 제조하기 위해서는 용매로 사용된 수분을 건조하여야 하는데, 수분을 건조하는 동안에 입자들간의 응집이 발생하여 재분산시에 입자들이 나노수준 크기의 입자로 재분산되기 어렵다.

근래에 와서는, 초임계유체를 이용하여 비결정형질 또는 나노입자를 제조하고자 하는 시도들이 많이 있어 왔다. 초임계유체는 임계온도와 임계압력보다 높은 온도와 압력하에 존재하는 유체이며, 일반적으로는 이산화탄소가 많이 사용된다. 초임계유체를 이용하여 나노입자를 제조하고자 하는 방법 중의 하나로서 초임계 용액 급속팽창법(rapid expansion of supercritical solution, 이하 RESS)이 알려져 있다(Tom et al. (1991) Biotechnol . Prog . 7(5):403-411.; 미합중국특허 제6,316,030 B1호; 미합중국특허 제6,352,737 B1호, 미합중국특허 제6,368,620 B2호). 이 방법에 따르면, 대상 용질을 초임계유체에 먼저 녹인 후, 그 초임계유체 용액을 비교적 낮은 압력환경으로 노즐을 통하여 급격하게 분사하게 된다. 그러면 초임계유체의 밀도가 급격하게 낮아지게 되고, 그 결과 용질에 대한 초임계유체의 용해력이 급속하게 떨어져서, 용질들이 매우 작은 입자 또는 결정으로 생성되게 된다.

초임계유체를 이용하는 다른 방법으로는 기체-반용매 재결정법(gas- antisolvent recrystallization, 이하 GAS)이 있다(Debenedetti et al. (1993) J. Control. Release 24:27-44; WO 00/37169). 이 방법에 따르면, 전통적인 유기용매에 치료약을 녹인 용액을 만들고, 이 용액을 반용매 역할을 하는 초임계유체 속으로 노즐을 통하여 분사하게 된다. 그러면 용액과 초임계유체가 서로 접촉하게 되어 급속한 부피확장이 발생하고, 그 결과 용매의 밀도 및 용해력이 떨어져서 초 과포화상태가 발생하게 되어, 용질이 핵 또는 입자를 형성하게 된다.

또한 초임계유체를 이용하여 활성물질이 녹아 있는 용액을 미세입자로 분무(nebulization)하고, 건조 가스를 이용하여 이를 건조하므로써 미세분말을 얻는 방법을 미합중국특허 제 6,630,121호에서 기술하고 있다. 이 방법은 활성물질의 초임계유체에 대한 용해도와는 무관하게 사용할 수 있는 기술이다. 한편 WO 02/38127 A2호에서는 SEDS(Solution Enhanced Dispersion by Supercritical fluids)방법을 이용하여 활성물질을 미세물질로 만들면서, 생성된 미세물질을 고분자와 같은 첨가물로 코팅하는 방법에 대하여 기술하고 있다. 또 미합중국특허 제 6,596,206 B2호에서는 유기용매에 활성물질을 녹이고, 이 용액에 초음파를 가하여 용액이 미세입자의 형태로 초임계유체에 분무되게 하므로써 활성물질이 미세입자로 제조되게 하는 기술에 대하여 기술하고 있다.

이러한 종래기술들은 매우 작은 입자를 비교적 일정한 크기로 생산할 수 있는 방법들을 제시하고 있지만, 여기에도 여러 가지 문제점들이 있다.

첫번째 문제점은 용액을 전달하는 관과 노즐에 존재한다. 일반적으로 초임계유체를 이용한 미세입자 제조방법에서는 노즐 직경의 크기에 따라 생성되는 입자의 크기가 결정되기 때문에, 노즐의 직경이 매우 작고 또한 정밀하여야 한다. 그러나 노즐의 사용횟수가 증가함에 따라 그 직경이 변하게 되므로써, 생성되는 입자의 크기가 시간 경과에 따라 균일하지 않게 된다. 또한, 미세입자의 제조를 위해 직경이 극히 미세한 노즐을 사용해야 하므로, 노즐의 막힘 현상이 자주 발생하며, 노즐이 막혀 이를 뚫는 동안에, 관내에 머물러 있는 입자가 서로 뭉치는 현상이 빈번하게 발생한다.

두번째 문제점은 적용가능한 용질 및 사용가능한 용매의 종류가 극히 제한되어 있다는 점이다. RESS 방법은 적용가능한 용질들이 초임계유체에 잘 녹아야만 활용할 수 있는 방법이다. 물론 용질에 따라 공용매를 사용하여 용해도를 증가시킬 수 있겠지만, 공용매의 양이 많아지면 입자생성 이후에 잔존하는 용매로 인하여 결정성장이 발생할 수 있으며, 이로 인하여 균일한 크기의 입자를 제조하는 것이 어렵게 된다. 또한, GAS 방법에 있어서는 용매를 신중하게 선택해야만 한다. 용질을 녹인 용매가 초임계유체와 접촉할 때, 신속하게 초임계유체 속으로 확산되어야만 미세입자를 생성할 수 있으며, 또한 여과 중에 입자에 잔존하는 용매가 최소화되어야만 입자의 성장을 막을 수가 있다. 또한, GAS 방법에서는 생성된 미세입자를 용매로부터 여과하기 위한 특수여과장치가 필요하다.

세번째 문제점은, 종래의 방법들에 의해 초임계유체를 이용하여 나노크기의 입자를 제조할 경우, 상업적인 규모로 이를 제조하기에는 많은 제약이 따른다는 점이다. RESS 방법을 상업적으로 이용하기 위해서는 용질들이 초임계유체에 매우 잘 녹아야 하는데, 이러한 물질은 극히 소수에 불과하다. 또한 단일 물질을 나노크기 의 미세물질로 만들면 입자들끼리의 뭉침현상이 발생하기 때문에, 유화제, 셀룰로스 또는 지질과 같은 응집방지 물질을 함께 녹여서 그 혼합물을 나노크기의 미세입자로 제조하여야 하나, 이들 응집방지 물질의 대부분은 주된 초임계유체인 이산화탄소에는 잘 녹지 않는다. 또한, GAS 방법을 이용하여 나노크기의 미세입자를 제조할 경우에는, 용질들이 녹아있는 용액을 초임계유체가 존재하는 반응기 내로 밀어 넣어야 하는데, 이때 그 주입속도가 매우 느려서 균일한 크기의 입자를 제조하기가 어렵고, 주입속도를 높일 경우 입자의 크기가 고르지 않고 여과에 문제가 발생할 여지가 많다. 또한 용매에 대한 용질의 용해도와 입자의 뭉침을 방지하기 위해 함께 첨가한 응집방지제의 용해도가 다르기 때문에, 본래 제조하고자 했던 조성비와 다른 조성비의 입자가 생성될 수도 있다.

한편, 상기한 바와 같은 종래 기술들의 문제점을 해결하고자 본 출원인은, 탄소수 10~22의 포화 지방산 및 그 에스테르 화합물 및 그 알코올 화합물과 같이 30℃ 이하의 온도에서 고체로 존재하는 지질을 용매로서 사용하고, 20~40℃의 온도 및 70~200기압의 압력 하에서 초임계유체를 이용하여 활성물질의 나노분말을 제조하는 방법을 한국특허출원 제2004-90832호로서 출원한 바 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술들의 문제점을 해결하고자 하는 것으로서, 본 발명의 목적은, 낮은 온도 및 낮은 압력 조건 하에서 아임계유체 또는 초임계유체를 이용하여 나노입자 수준의 미세입자를 우수한 효율로 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, (1) 활성물질 및 고체상 용매를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; (2) 10~25℃의 온도에서 상기 혼합물이 들어 있는 반응기 내에 초임계유체 가스를 넣어 40~90기압의 압력으로 가압하는 단계; 및 (3) 반응기 내를 10~25℃의 온도 및 40~90기압의 압력으로 유지하면서 초임계유체 가스와 함께 상기 고체상 용매를 반응기 바깥으로 배출함으로써, 상기 혼합물로부터 상기 고체상 용매를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노수준의 활성물질 입자 제조방법이 제공된다.

본 명세서에 있어서, 용어 "초임계유체 가스"란, 이산화탄소 기체 또는 질소 기체와 같이, 반응성이 없는 불활성 기체이면서, 초임계유체(supercritical fluid)가 될 수 있는 기체를 말한다.

또한, 본 명세서에 있어서, 용어 "초임계온도" 및 "초임계압력"이란, 초임계유체 가스가 초임계유체로 될 수 있는 온도 및 압력조건을 의미한다.

또한, 본 명세서에 있어서, 용어 "아임계온도" 및 "아임계압력"이란, 초임계유체 가스가 초임계유체 부근의 온도 및 압력조건을 의미하며, 예컨대 초임계유체 가스가 이산화탄소인 경우에는 32℃ 이하의 온도조건 및 70기압 이하의 압력조건을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 나노수준의 또는 비결정질 입자(이하, "나노입자"라고 한다)의 제 조방법에 있어서, 상기 활성물질은 예를 들면 의약품, 기능성 식품, 화장품 등에 있어서 생리활성을 나타내는 물질로서, 바람직하게는 생리활성을 나타내는 유기화합물, 유기금속 화합물, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이며, 고체상 또는 액체상 등의 상온에서의 성상 및 중성 또는 이온성 등의 전기적 형태에 대한 특별한 제한은 없다.

본 명세서에 있어서, 용어 "나노입자"란, 그 90% 이상이 5㎛ 이하, 바람직하게는 2㎛ 이하, 보다 바람직하게는 1㎛ 이하, 더욱 더 바람직하게는 0.5㎛ 이하의 크기를 가지는 입자를 의미한다.

본 발명의 나노입자 제조방법에 있어서, 고체상 용매란 실온, 즉, 30℃ 이하의 온도에서 고체상을 유지하고, 녹는점이 40~150℃, 바람직하게는 40~90℃로 비교적 낮으며, 초임계유체에 대한 용해도가 큰 화합물을 의미하는 것으로서, 예컨대 한국특허출원 제2004-90832호에서 사용되는 고체상 지질이 사용될 수 있다. 구체적으로는, 탄소수 10~22의 포화 지방산 및 그 에스테르 화합물 및 그 알코올 화합물, 탄소수 10~22의 포화지방산기를 갖는 모노- 또는 디-글리세라이드 화합물, 탄소수 16 이상의 탄화수소, 탄소수 10~22의 트리글리세라이드 화합물의 지방산 환원 화합물, 탄소수 6~22의 선형 또는 분지형 디올 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 사용될 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 (1)단계의 활성물질 및 고체상 용매를 포함하는 혼합물은 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 상기 계면활성제로는, 합성 계면활성제, 천연 계면활성제, 지질 및 고분자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 (1)단계의 활성물질 및 고체상 용매를 포함하는 혼합물은 계면활성제 이외의 응집방지제를 더 포함할 수 있다. 상기 계면활성제 이외의 응집방지제로는, 단당류, 다당류, 식이섬유, 검류 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 나노입자 제조방법에서는, 상기 활성물질을 단일 성분으로 하여 나노크기의 입자로 제조할 수도 있으며, 경우에 따라서는 제조된 나노크기의 입자들이 응집되는 것을 방지하기 위하여 응집방지제를 더 사용할 수도 있다. 이러한 응집방지제는 크게 계면활성제와 계면활성제 이외의 응집방지제로 나눌 수 있다. 계면활성제로는, 예를 들면, 다양한 합성 및 천연 계면활성제, 지질, 고분자 등을 사용할 수 있으며, 계면활성제 이외의 응집방지제로는, 단당류, 다당류, 식이섬유, 검류 그리고 단백질 등을 사용할 수 있다. 레시틴, 라이소 레시틴, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에틸아민 등과 같은 인지질은 일반적으로 지질로 분류할 수도 있으나, 본 발명에서는 계면활성제로 분류한다. 일반적으로 계면활성제는 물에 대한 친화도에 따라 크게 친수성과 친유성으로 나뉘며, HLB(hydrophilic-lipophilic balance)값으로 구분한다. 또한 작용기의 형태에 따라 양이온성, 음이온성, 중성 및 양성으로 나뉠 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 계면활성제 또는 계면활성제 이외의 응집방지제는, 상기 활성물질의 응집을 방지하고, 고체상 용매에 잘 용해되며, 초임계유체에 의해 용이하게 제거되지 않는다면, 그 종류에 있어서 특별한 제한은 없다.

또한, 본 발명의 나노입자 제조방법에서는, 고체상 용매만으로는 활성물질과 계면활성제를 충분히 녹일 수 없을 경우, 공용매로서 알코올, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 사용할 수도 있다. 상기 공용매로서의 알코올로는 탄소수 2~6의 저급 알코올이 바람직하며, 에탄올이 가장 바람직하다. 또한 공용매로서 알코올과 물의 혼합 용액을 사용하는 경우에는, 알코올 70~80 중량%와 물 20~30 중량%의 혼합 용액을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 나노입자 제조방법에 있어서, 상기 (2) 단계에서는, 10~25℃, 바람직하게는 10~22℃, 더 바람직하게는 10~20℃의 온도에서 (1)단계에서 얻어진 혼합물이 들어 있는 반응기 내에 초임계유체 가스를 넣어 40~90기압, 바람직하게는 50~80기압, 더 바람직하게는 50~70기압의 압력으로 가압한다.

본 발명의 나노입자 제조방법에 있어서, 상기 (3) 단계에서는, 반응기 내를 10~25℃, 바람직하게는 10~22℃, 더 바람직하게는 10~20℃의 온도 및 40~90기압, 바람직하게는 50~80기압, 더 바람직하게는 50~70기압의 압력으로 유지하면서 초임계유체 가스와 함께 고체상 용매를 반응기 바깥으로 배출함으로써, 상기 혼합물로부터 고체상 용매를 제거한다.

본 발명의 상기 (2) 단계 및 (3) 단계에서, 온도 및 압력 조건이 10℃ 미만이거나 상기 압력 조건이 40기압 미만이면 고체상 용매의 제거가 원활하지 않아 전체 공정의 생산성이 나빠지는 문제점이 있고, 25℃를 초과하거나 90기압을 초과하면 활성물질의 손실이 발생하는 문제점이 있을 수 있다.

한국특허출원 제2004-90832호에서와 같이 초임계유체를 이용하여 고체상 지 질을 제거할 때의 조건이 본 발명에서 보다 고온 및/또는 고압인 경우, 일부 활성물질이 초임계유체 가스에, 또는 초임계유체 가스에 녹아 있는 고체상 용매에 녹아서 함께 배출되는 경우가 있으며, 이 경우에는 생성된 입자의 분포가 넓어져서 전체적인 입자의 평균 입경도 매우 커진다. 따라서 본 발명에서는 초임계유체 가스를 이용한 고체상 용매의 제거시 활성물질의 손실을 최대한 막는 동시에 입자의 크기를 작고 균일하게 유지하기 위하여, 초임계유체 가스로 고체상 용매를 제거할 때의 조건을 10~20℃의 온도 및 40~70기압의 압력으로 특정한 것이다. 또한, 본 발명에서는 종래의 온도 조건에 비하여 낮은 온도 하에서 고체상 용매가 제거되기 때문에, 활성물질이 열에 민감한 경우, 나노입자 제조과정에서 열에 의한 활성의 손실을 감소시킬 수 있으며, 또한 종래의 압력 조건에 비하여 낮은 압력 하에서 고체상 용매가 제거되기 때문에, 고내압 설비가 필요치 않게 되어 설비 비용 및 운전 비용을 줄일 수 있다.

이하에서는 본 발명의 나노입자 제조방법을 각 단계별로 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 나노입자 제조방법에 있어서, 상기 (1)단계에서는, 활성물질 및 고체상 용매를 포함하는 혼합물을 제조한다. 이를 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 (1)단계는, 활성물질, 고체상 용매 및 선택적으로 계면활성제를 반응기에 투입하고, 이를 균일하게 용융 혼합하는 단계이 다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 (1)단계는, 활성물질, 고체상 용매 및 선택적으로 계면활성제를 반응기에 투입하고, 이를 균일하게 용융 혼합하고; 이를 급속히 냉각하여 고형화하고; 고형화된 혼합물을 분말화하고; 얻어진 분말에 계면활성제 및/또는 계면활성제 이외의 응집방지제 또는 이의 수용액을 첨가하여 균일하게 혼합하고; 이를 상온에서 건조하는 단계이다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 (1)단계는, 계면활성제 및 고체상 용매를 반응기에 투입하고, 이를 균일하게 용융 혼합하고; 이를 급속히 냉각하여 고형화하고; 고형화된 혼합물을 분말화하고; 얻어진 분말에, 활성물질과 함께 계면활성제 및/또는 계면활성제 이외의 응집방지제 또는 이의 수용액을 첨가하여 균일하게 혼합하고; 이를 상온에서 건조하는 단계이다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 (1)단계는, 활성물질, 고체상 용매 및 선택적으로 계면활성제를 반응기에 투입하고, 초임계유체 가스를 더 투입하고, 그 다음에 가열하여 혼합물을 용융하며 혼합하는 단계이다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 (1)단계는, 활성물질, 고체상 용매 및 선택적으로 계면활성제를 반응기에 투입하고, 여기에 초임계유체 가스를 넣어 가압하여 용융한 다음, 상기 용융된 혼합물을 대기압으로 분사하는 단계이다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 (1)단계는, 활성물질, 고체상 용매 및 선택적으로 계면활성제를 반응기에 투입하고, 여기에 초임계유체 가스를 넣어 가압하여 용융한 다음, 상기 용융된 혼합물을 대기압으로 분사하여 분말화하고; 이 분말화된 혼합물에 계면활성제 및/또는 계면활성제 이외의 응집방지제 또는 이의 수용액을 첨가하여 균일하게 혼합하고; 이를 상온에서 건조하는 단계이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 활성물질 및 활성물질 1중량부당 고체상 용매 0.1~1000중량부를 함께 반응기에 투입한다. 이 때, 필요에 따라 선택적으로, 활성물질 1중량부에 대하여, 계면활성제 0.001~10중량부 또는 공용매로서 저급 알코올 또는 알코올 70~80 중량%와 물 20~30 중량%의 혼합 용액 0.001~10중량부, 또는 계면활성제 0.001~10중량부 및 공용매로서 저급 알코올 또는 알코올 70~80 중량%와 물 20~30 중량%의 혼합 용액 0.001~10중량부의 혼합물을 반응기에 투입할 수 있다.

상기에서, 선택적으로 투입되는 계면활성제는, 고체상 용매에 대한 용해도가 비교적 커서, 활성물질과 함께 고체상 용매에, 또는 후술하는 저급 알코올을 포함하는 고체상 용매에 녹았을 경우, 균일한 용액을 형성할 수 있어야 한다. 또한, 상기 계면활성제는, 활성물질의 성질과 제조되는 나노입자의 용도나 사용목적에 따라 다르게 선택될 수 있다. 제조되는 나노입자가 수중분산되어 사용되는 것을 목적으로 할 경우, HLB값이 높은 계면활성제가 선택되는 것이 바람직하고, 체내흡수율을 증가시키는 것을 목적으로 할 경우, HLB값이 비교적 낮은 계면활성제가 선택되는 것이 바람직하다.

상기한 바와 같이, 활성물질과 고체상 용매를 반응기에 투입하고, 필요에 따라 계면활성제, 저급 알코올, 또는 계면활성제 및 저급 알코올 공용매로서 저급 알코올 또는 알코올 70~80 중량%와 물 20~30 중량%의 혼합 용액의 혼합물을 반응기에 더 투입한 다음, 서서히 열을 가하여 녹인다. 경우에 따라서는 계면활성제 및 공용 매는 활성물질과 고체상 용매가 완전히 녹은 후에 투입할 수도 있다.

반응기 내의 온도가 올라감에 따라, 고체상 용매가 녹게 되고, 활성물질, 계면활성제 등이 이에 용해된다. 온도는 균일한 용액을 형성하는 온도까지 올린다. 이 때, 교반이 가능해지는 시점부터 교반을 행하는 것이, 혼합물 용액을 보다 균일하게 하고, 또한 작업시간을 단축하는 데에 있어서 바람직하다. 교반이 가능한 시점은 활성물질, 계면활성제 및 고체상 용매의 종류에 따라 달라지며, 이 분야에 종사하는 사람은 누구나 현장에서 그 시점을 선택할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 구체예에 있어서는, 상기한 바와 같이, 활성물질, 고체상 용매 및 선택적으로 계면활성제를 반응기에 투입하고 이를 균일하게 용융 혼합한 후에, 추가적으로 이를 급속히 냉각하여 고형화하고, 고형화된 혼합물을 분말화하고, 얻어진 분말에 계면활성제 및/또는 계면활성제 이외의 응집방지제 또는 이의 수용액을 첨가하고 균일하게 혼합하고, 이를 상온에서 건조하므로써, 활성물질 및 고체상 용매를 포함하는 혼합물을 제조한다. 상기에서 건조공정은 특별한 어떤 방법으로 한정되는 것은 아니지만, 사용된 고체상 용매의 녹는점 이하의 온도에서 수행되어야만 한다. 본 명세서에서, “고체상 용매의 녹는점”주위 온도의 상승에 따라 고체상 용매의 표면에서 녹는 현상이 관찰되기 시작하는 온도를 의미한다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 활성물질이 펩타이드, 단백질 또는 다당류와 같이 온도에 민감하거나 또는 수용성인 경우에는, 먼저 계면활성제 및 고체상 용매를 반응기에 투입하고 이를 균일하게 용융 혼합하고, 이를 급속히 냉각하여 고형화하고, 고형화된 혼합물을 분말화한 후에, 얻어진 분말에 활성물질과 함 께 계면활성제 및/또는 계면활성제 이외의 응집방지제 또는 이의 수용액을 첨가하여 매우 균일하게 혼합하고, 이를 상온에서 건조하므로써, 활성물질 및 디올 화합물을 포함하는 혼합물을 제조한다. 상기에서 건조공정은 특별한 어떤 방법으로 한정되는 것은 아니지만, 사용된 고체상 용매의 녹는점 이하의 온도에서 수행되어야만 한다.

급속 냉각에 의해서 고형화를 할 경우, 냉각이 천천히 행해진다면, 활성물질들 간에 결정성장이 일어날 수 있고, 이렇게 되면 활성물질의 나노입자를 달성하기가 어려울 수도 있으며, 또한 생성된 입자의 분포가 넓어질 수가 있으므로, 용융된 혼합물 용액을 10℃ 이하로 급속히 냉각하여 고형화하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다.

급속 냉각에 의해 얻어진 고형물은 전통적인 분쇄방법, 즉 건식 분쇄(dry milling)와 같은 방법으로 분쇄한다. 이때 분쇄된 입자의 크기가 미세할수록, 즉 입자의 표면적이 커질수록, 디올 화합물 제거 공정과 같은 이후의 공정에서 유리하다. 분쇄된 입자의 크기는 100 마이크로미터 이내인 것이 바람직하지만, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서는, 활성물질, 고체상 용매 및 선택적으로 계면활성제를 반응기에 투입하고, 여기에 초임계유체 가스(예를 들면, CO₂ 기체)를 더 투입하여 바람직하게는 아임계상태 또는 초임계상태로 만들고, 그 다음에 가열하여 혼합물을 녹이므로써 활성물질 및 고체상 용매를 포함하는 혼합물을 제조한 다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서는, 활성물질, 고체상 용매 및 선택적으로 계면활성제를 반응기에 투입하고, 여기에 초임계유체 가스를 넣어 바람직하게는 초임계압력 이상의 압력으로 가압하여 용융한 다음, 상기 용융된 혼합물을 대기압으로 분사하므로써 활성물질 및 고체상 용매를 포함하는 혼합물을 제조한다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서는, 활성물질, 고체상 용매 및 선택적으로 계면활성제를 반응기에 투입하고, 여기에 초임계유체 가스를 넣어 바람직하게는 초임계압력 이상의 압력으로 가압한 다음, 상기 용융된 혼합물을 대기압으로 분사하여 분말화한 이후에, 이 분말화된 혼합물에 계면활성제 및/또는 계면활성제 이외의 응집방지제 또는 이의 수용액을 첨가하여 균일하게 혼합하고, 이를 상온에서 건조하므로써 활성물질 및 고체상 용매를 포함하는 혼합물을 제조한다. 상기에서 건조공정은 특별한 어떤 방법으로 한정되는 것은 아니지만, 사용된 고체상 용매의 녹는점 이하의 온도에서 수행되어야만 한다.

본 발명의 (1) 단계에서, 초임계 유체를 이용하는 경우, 혼합물이 모두 녹고 균일하게 혼합되면, 초임계유체 가스(예를 들면, CO₂)를 서서히 반응기에 투입하여 바람직하게는 초임계유체가 되는 압력(초임계압력; CO₂의 경우, 70기압) 이상으로 가압한다. 이 때의 반응기 내의 압력은 반응기의 크기와 혼합물의 양에 따라서 결정되지만, 일반적으로 50~200기압인 것이 바람직하다. 이 때의 온도는, 교반이 원활하게 유지될 수 있도록 혼합물 용액이 충분한 유동성을 가질 수 있는 온도이면 된다.

반응기 내의 압력이 상승하여, 초임계유체 가스가 초임계유체로 되는 압력에 이르면, 그 상태에서 10분 이상 더 교반하여 초임계유체가 충분히 혼합물 용액에 스며들게 하는 것이 바람직하다.

추가 교반이 완료되면, 서서히 초임계유체 가스를 더 투입하면서 배출구를 최대한 열어, 대기압의 다른 반응기 내로 분사한다. 이 때, 초임계유체가 순간적으로 기화함에 따라 주위의 온도를 급격히 냉각시키고, 이로 인해 혼합물 용액이 순간적으로 고형화되게 된다. 이렇게 순간적으로 혼합물 용액이 고형화됨에 따라, 결정성장에 필요한 에너지 및 시간을 가질 수 없게 되어, 활성물질, 계면활성제 등의 용질과 고체상 용매가 매우 미세한 입자로 매우 균일하게 혼합된 상태의 고형물을 얻을 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 고형물 내에는, 입자의 크기가 나노수준의 크기로 매우 미세한 활성물질의 입자가 균일하게 분산되어 존재하게 된다. 게다가, 계면활성제 역시 매우 균일하게 활성물질과 혼합되어 있기 때문에, 최종 생산된 미세입자의 분산성 및 안정성이 월등하게 향상된다.

본 발명은, 상기 고형물 내에 존재하는 활성물질의 입자를 미세하게 하고 균일하게 하는 것에 그 특징이 있으므로, 이후의 작업성에 지장을 주지 않는 범위 내에서라면, 고형물 자체의 입자크기를 특별하게 조절할 필요가 없다. 따라서, 대기압으로 분사되어 생성되는 고형물 자체의 입자크기를 조절하기 위해 분사노즐의 직경을 작게 하거나 분사 속도를 조절할 필요가 없으므로, 분사노즐의 변형 또는 막힘을 염려할 필요가 없다.

대기압으로의 분사시에는, 분사되어 나오는 유체가 보다 미세한 분말 형태로 고형화되도록, 대기압 상태의 다른 반응기 내부에 원추형의 받침판을 분사출구에서 일정거리를 두고 설치하는 것이 바람직하다. 이는, 고형물이 보다 작은 분말로 생성될수록, 다음 단계에서 초임계유체로 고체상 용매를 보다 용이하게 제거할 수 있기 때문이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서는, 초임계유체를 이용하거나 또는 분쇄기를 이용하여 얻어진 혼합분말에, 필요에 따라 계면활성제 및/또는 계면활성제 이외의 응집방지제 또는 이의 수용액을, 또는 활성물질이 펩타이드, 단백질 또는 다당류와 같이 온도에 민감하거나 또는 수용성일 경우에는, 활성물질과 함께 계면활성제 및/또는 계면활성제 이외의 응집방지제 또는 이의 수용액을 첨가할 수 있고, 결과 혼합물은 일반적인 혼합기를 이용하여 매우 균일하게 혼합될 수 있다. 이 때, 계면활성제 이외의 응집방지제는, 필요에 따라, 활성물질 1중량부에 대하여 0.001~10중량부를 첨가한다. 수용액을 첨가하는 경우, 사용된 물의 양, 계면활성제 및 응집방지제의 종류에 따라 제조된 혼합물의 성상은 다양하게 되나, 일반적으로 첨가된 물의 양이 사용된 고체상 용매의 양의 30%(w/w) 이내이면, 쉽게 분말상이 형성된다. 첨가되는 물의 양은, 첨가할 수용성 원료물질들을 충분히 분산시킬 수 있는 양이 되면 족하므로, 특별히 한정되지는 않는다. 만약 물을 고체상 용매의 40%(w/w) 이상으로 사용한다면 혼합물은 죽상 반죽(dough or paste)의 상태가 되며, 이 때는 상온에서 다양한 전통적인 방법에 의해 쉽게 수분을 건조할 수 있다. 건조공정은 특별한 어떤 방법으로 한정하는 것은 아니지만, 사용된 고체상 용매의 녹는점 이하의 온도에서 수행되어야만 한다. 또한 사용된 분말의 입자가 미세할수록 전통적인 감압건조공정에 의해서 쉽게 수분을 제거할 수 있음은, 당 분야에 종사하는 사람이라면 쉽게 알 수 있다. 수분 제거 후 고체상 용매 대비 잔존수분의 양은 30% 미만인 것이 바람직하다.

본 발명의 나노입자 제조방법에 있어서, 상기 (2) 단계 및 (3) 단계에 대하여 상세하게 설명하면 다음과 같다.

상기 (1) 단계를 포함하는 이전 단계에서 얻어진 혼합물이 들어있는 반응기의 온도를 10~25℃, 바람직하게는 10~22℃, 더 바람직하게는 10~20℃의 온도로 유지하면서, 반응기에 초임계유체 가스를 투입하여 40~90기압, 바람직하게는 50~80기압, 더 바람직하게는 50~70기압으로 가압한 다음, 이산화탄소 투입밸브와 배출밸브를 조절하여 반응기의 압력을 이 온도 및 압력의 범위 내로 유지하면서 서서히 초임계유체 가스를 배출하면, 초임계유체 가스와 함께 고체상 용매가 배출되므로써 제거된다. 이 때, 상기 온도 및 압력 조건을 유지함으로써 활성물질이 초임계유체 및 고체상 용매에 녹아 이들과 함께 배출되는 것을 방지할 수 있을 뿐만 아니라 활성물질이 녹았다가 재결정이 일어남으로써 발생할 수 있는 입자의 성장도 억제할 수 있다.

고체상 용매를 초임계유체로 제거하는데 소요되는 시간은 사용된 고체상 용매의 종류 및 양에 크게 좌우되며, 보다 높은 순도의 활성물질 입자를 얻기 위해서는, 가능한 한 충분한 시간 동안 고체상 용매를 제거하여 그 잔존량을 최소화시키는 것이 바람직하다. 본 발명에서 그 잔존량을 특정범위로 한정할 필요는 없지만, 얻어지는 활성물질의 순도를 고려해 볼때, 전체 무게의 10중량% 미만이 잔존하도록 하는 것이 바람직하다.

상기와 같이 하여 제거된 고체상 용매는 별도의 반응기에 수거하여, 다음 생산공정에서 계속 사용할 수 있다.

이하 실시예들을 통하여 본 발명을 상세히 설명하나, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

고체상 용매로서 미리스틸 알코올 30 g을 250 ml 용량의 비이커에 투입하고, 서서히 가열하여 온도가 100℃에 이르렀을 때, 계면활성제로서 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone K 30) 1 g 및 활성물질로서 파클리탁셀(paclitaxel) 1 g을 넣고 완전히 녹인 후, 실온에서 서서히 굳혔다.

이 고형물 5 g을 내압반응기에 투입한 후, 내압반응기의 온도를 15~20℃ 사이로 유지하면서 이산화탄소를 투입하여 압력을 60~90기압 사이로 가압하고, 이 온도 및 압력 조건을 유지하면서 이산화탄소를 8시간 동안 흘려보냄으로써 미리스틸 알코올을 제거하였다. 그 결과, 파클리 탁셀, 및 폴리비닐피롤리돈의 혼합분말 0.31 g을 얻었다.

얻어진 혼합분말을 증류수에 분산시킨 후, 입도분석기(Horiba LA910S)를 이용하여 입도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

실시예 2

실시예 1에서 얻어진 고형분말 10 g을 내압반응기에 투입한 후 내압반응기의 온도를 25~32℃ 사이로 유지하면서 이산화탄소를 투입하여 압력을 100기압 전 후로 가압하고, 이 온도 및 이 압력 조건을 유지하면서 이산화 탄소를 10시간 동안 흘려보냄으로써 미리스틸 알코올을 제거하였다. 그 결과 0.62 g의 파클리 탁셀 및 폴리비닐피롤리돈의 혼합분말을 얻었다.

[표 1] 실시예에서 제조된 최종 분말의 입도분포 (㎛)

	D50	D70	D90	평균
실시예 1	0.0930	0.1098	0.1602	0.1073
실시예 2	0.4954	10.1310	30.2567	8.7291

위의 실험결과로 온도와 압력이 높아지면 활성성분이 초임계유체에 녹아있는 지질에 일정 부분이 녹았다가 다시 결정이 형성됨으로 입도의 분포가 커짐을 알 수 있다.

실시예 3

고체상 용매로서 세틸 알코올 21 g을 250 ml 용량의 비이커에 투입하고, 서서히 가열하여 온도가 100℃에 이르렀을 때, 계면활성제로서 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone K 30) 0.56 g 및 활성물질로서 이트라코나졸(Itraconazole) 0.7 g을 넣고 완전히 녹인 후, 70 ℃로 냉각하고, 여기에 히드록 시프로필 메틸 셀룰로오스(hydroxypropyl methyl cellulose) 400 mg을 에탄올 80%와 물 20%의 혼합용매에 녹여 제조한 용액 3.85 ml을 첨가하고 5 분간 충분히 교반한 다음 실온에서 서서히 굳혔다. 이 고형물을 상온에서 24시간 감압건조하였다.

이 고형물 1.6 g을 내압반응기에 투입한 후, 내압반응기의 온도를 22~28℃ 사이로 유지하면서 이산화탄소를 투입하여 압력을 60~90기압 사이로 가압하고, 이 온도 및 압력 조건을 유지하면서 이산화탄소를 8시간 동안 흘려보냄으로써 세틸 알코올을 제거하였다. 그 결과, 이트라코나졸, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로즈 및 폴리비닐피롤리돈의 혼합분말 0.1 g을 얻었다.

얻어진 혼합분말을 증류수에 분산시킨 후, 입도분석기(Horiba LA910S)를 이용하여 입도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2] 실시예 3에서 제조된 최종 분말의 입도분포 (㎛)

	D50	D70	D90	평균
실시예 3	0.4640	0.5834	0.8938	0.8499

본 발명에 따르면, 활성물질의 손실 및 입자의 재성장을 최대한 막을 수 있어 보다 미세한 나노입자를 효율적으로 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 나노입자 제조과정에서 열에 의한 활성의 손실을 감소시킬 수 있으며, 고내압 설비가 필요치 않게 되어 설비 비용 및 운전 비용을 줄일 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 나노입자는 그 분산성, 흡수성, 생리적 활성 등이 매우 우수하여 의약품, 기능성 식품, 일반 식품, 화장품 등에 사용되기에 적합하다.

Claims

(1) 활성물질 및 고체상 용매를 포함하는 혼합물을 제조하는 단계;

(2) 10~25℃의 온도에서 상기 혼합물이 들어 있는 반응기 내에 초임계유체 가스를 넣어 40~90기압의 압력으로 가압하는 단계; 및

(3) 반응기 내를 10~25℃의 온도 및 40~90기압의 압력으로 유지하면서 초임계유체 가스와 함께 상기 고체상 용매를 반응기 바깥으로 배출함으로써, 상기 혼합물로부터 상기 고체상 용매를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노수준의 활성물질 입자 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 활성물질은 생리활성을 나타내는 유기화합물, 유기금속 화합물, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 고체상 용매는 탄소수 10~22의 포화 지방산 및 그 에스테르 화합물 및 그 알코올 화합물, 탄소수 10~22의 포화지방산기를 갖는 모노- 또는 디-글리세라이드 화합물, 탄소수 16 이상의 탄화수소, 탄소수 10~22의 트리글리세라이드 화합물의 지방산 환원 화합물, 탄소수 6~22의 선형 또는 분지형 디올 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (1)단계의 활성물질 및 고체상 용매를 포함하는 혼합물은 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 계면활성제는 합성 계면활성제, 천연 계면활성제, 지질 및 고분자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (1)단계의 활성물질 및 고체상 용매를 포함하는 혼합물은 계면활성제 이외의 응집방지제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 계면활성제 이외의 응집방지제는 단당류, 다당류, 식이섬유, 검류 및 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (1) 단계에서 공용매를 더 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 공용매는 알코올, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 공용매로서의 알코올은 탄소수 2~6의 알코올인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 공용매로서의 알코올과 물의 혼합물은 알코올 70~80 중량%와 물 20~30 중량%의 혼합 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (3) 단계에서 반응기 내의 온도는 10~22℃인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (3) 단계에서 반응기 내의 압력은 50~80기압인 것을 특징으로 하는 방법.