KR20070102177A - 세포표면 표지의 검출 및 계수 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 형광세기 차이를 이용한 세포표면 표지의 검출 및 계수 방법에 관한 것이다. 하나의 표지에 약한 형광세기를 가지는 형광물질을 붙이고, 다른 하나에 보다 더 강한 형광세기를 가지는 형광물질을 붙임으로써 형광세기의 축으로부터 두 가지의 표지를 분리하여 계수할 수 있다.
유세포분석기, 형광, HIV
Description
도 1은 본 발명의 CD4_PE 및 CD8_실리카나노입자의 형광세기 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 종래기술에 따른 형광세기 분석 예를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 CD45_PE 및 CD4_실리카나노입자의 형광세기 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 CD4_PE 및 CD8_실리카나노입자의 형광세기 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 PMT로부터 얻은 형광의 세기 결과를 나타낸다.
도 6은 PI 도핑된 실리카나노입자의 구조도를 나타낸다.
기술분야
본 발명은 세포표면 표지를 검출하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 형광세기 차이를 이용하여 샘플로부터 2개 이상의 세포표면의 표지물질 을 검출하는 방법 및 이를 이용한 세포 계수 방법에 관한 것이다.
종래기술
유세포분석 (flow cytometry) 방법은 유체 중 현탁된 미세입자를 분리 (sorting), 계수 (counting) 및 분석 (examining) 하는 것이다. 유세포분석기는 유액상태의 입자나 세포가 일정 감지 지역 (sensing point)을 통과할 때 각각의 입자나 세포를 신속하게 측정하여 한 세포가 갖는 여러 특징을 동시에 측정하고 경우에 따라 특정한 부분을 선택하여 분리 (sorting)할 수 있는 장비이다. 유세포분석 방법은 광학적/전자적 검출 수단을 통해 유체 중에 포함된 단일 세포 (single cell)의 물리적 및 화학적 특성을 동시에 분석하는 수단을 제공한다. 일반적으로, 유세포분석에 의한 샘플분석은 단일 파장의 레이저광을 유체에 가한 후, 유체를 통과한 빛을 분석하기 위한 수개의 검출기 예를 들어, 유체가 흐르는 방향과 동일한 방향에 위치하는 FSC (Forward Scatter) 및 유체 흐름 방향과 수직 방향에 놓이는 수개의 SSC (Side Scatter)를 이용하여 그 결과를 분석한다.
유세포분석을 이용하여, 세포 용적 및 세포 형태학적 정보 분석, DNA (세포 주기분석 등) 분석, RNA, 염색체 분석, 다양한 항원 분석 등을 수행할 수 있다. 또한, 유세포분석기는 실시간으로 수천개 입자를 분석하고 특정 성질을 갖는 입자를 분리할 수 있다. 일반적으로 유세포분석기는 5개의 주요 구성을 갖는다: 분석하고자 하는 세포 등을 포함한 유체, 광원, 검출 및 분석기, 증폭장치, 및 신호 분석 컴퓨터.
이와 같이 유세포분석기는 분자생물학, 병리학 및 면역학 등 다양한 분야에 서 이용되고 있다. 최근에 널리 이용되고 있는 유세포분석기는 수개의 레이저와 형광물질 검출기를 포함한다.
HIV에 감염되면 혈액중 CD4+ 세포의 수가 줄어드는 반면 CD3 및 CD8 세포의 수는 다소 증가하는 것으로 알려져 있다. 또한 CD4+ 세포와 CD8 세포의 합이 CD3 세포의 수와 일치 (허용오차 5~10%) 하여야 한다는 사실이 알려져 있다. 따라서 혈액 중 CD4+ T 세포의 수를 측정하여 HIV/AIDS의 진단에 이용하고자 하는 다양한 방법이 개발되고 있다. 예를 들어, 전체 백혈구 (CD45) 및 CD4+ 세포를 계수하고 이들의 상대적 비율을 측정하거나, [CD4 세포 수]/[CD8 세포 수]를 모니터링 함으로써 진단에 이용하고 있다. 그러나 이와 같은 종래 방법들은 파장이 다른 항체 (antibody) 및 검출기 (detector)가 각각 2개 이상 필요하다. 또한 샘플 제조과정이 복잡하여 세계보건기구(WHO)가 요구하는 제 3 세계용 진단기기 (소형의 저렴한 토스터)로 제작하는 것이 곤란하다.
이와 같이, 2 이상의 파장이 다른 항체 및 검출기를 사용하여야 하는 문제점을 해결하기 위해 동일한 파장대에서 형광 강도차이를 이용하여 분석하고자 하는 방법이 제안된 바 있다 (미국 특허 제5627037호 "One step method for detection and enumeration of absolute counts of one more cell populations in a sample"). 이 방법에 따르면, 비교적 낮은 신호의 세포 표면 마커의 형광 세기와 임의로 제조한 밝은 비드 (bead)의 형광 세기와의 차이를 이용하여 동일 파장대에서 1회 검출로 세포와 비드의 개수를 측정할 수 있다. 그러나 두 개 이상의 마커가 있는 경우, 동일 파장대에서 두 개의 마커를 효과적으로 분리하여 해석할 수 있 는 방법은 본 발명의 출원일 이전에 제시된 바 없다. 즉, 측정하고자 하는 세포의 종류가 2개 이상인 경우 파장이 다른 여러 가지의 형광물질을 사용하는 것이 일반적이다 (도 2 참조).
본 발명은 이러한 종래기술과는 달리 두 개 이상의 마커 (marker)를 하나의 검출기 (detector)만으로 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 동일 파장대에서 두 개 이상의 마커를 효과적으로 검출할 수 있는 유세포분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 동일 파장대에서 두 개 이상의 마커를 효과적으로 검출하여 질병을 진단하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 CD4+ 및 CD45 세포의 절대 계수 (absolute counting)를 동일 파장대에서 수행하는 유세포분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 CD4+ 및 CD45 세포의 절대 계수를 동일 파장대에서 수행하여 HIV 감염을 진단하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.
본 발명은 하나의 세포 표면에 있는 두 가지 이상의 마커 (marker)를 해석하기 위해 동일한 파장대로서 형광 강도 (intensity)가 다른 2종의 형광 물질을 이용하여 2종의 마커를 분석하고 계수하였다.
본 발명에 사용되는 PI (Propidium Iodide) 도핑된 실리카 나노 입자는 선행문헌을 참조하여 본 발명자들이 직접 합성하여 사용하였다 (참고문헌: Adv.Mater. 2004, 16, 173-176; Anal. Chem. 2001, 73, 4988-4993; Chem. Commun. 2004, 10, 2810-2811; J. Biomed. Mater. Res. - Part A 2003, 66, 870-879) (도 6 참조).
일 구체예에서, PE(phycoerythrins)와 접합한 CD4+ T세포 (CD4_PE)와 PI(Propidium Iodide) 도핑된 실리카 나노 입자에 접합한 CD8+ T세포 (CD_Silica-nano particle)에 녹색광을 각각 조사하고 방출되는 파장을 관찰하였다. PE와 PI는 동일한 녹색 레이저에 의해 여기 (excitation)되어 파장을 방출 (emission)하는 물질로서 유사한 형광 세기를 갖는 것으로 알려졌다. 방출된 파장을 관찰한 결과 CD4+ T세포 보다 CD8+ T세포가 10~100배 밝게 나타났으며, 이에 따라 형광세기를 나타내는 도메인 (intensity domain)에서 두 개의 히스토그램 피크 (histogram peak)가 유의한 수준의 차이를 나타냈다 (도 1 및 도 4 참조). 이는 실리카 나노 입자 속에 PI를 100~200개 정도 넣고 마커를 붙였기 때문으로 이해된다.
다른 일구체예에서, PE(phycoerythrins)와 접합한 CD45 (CD45_PE)와 PI(Propidium Iodide) 도핑된 실리카 나노 입자에 접합한 CD4 T세포 (CD4_Silica-nano particle)의 조합으로 CD45(전체 백혈구)와 CD4+ T세포의 절대 계수를 수행했다 (도 3 참조).
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 상세히 기술한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것을 뿐이며 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것이 아님은 물론이다.
실시예
실시예 1: CD4_PE와 CD8_실리카나노입자를 사용한 CD4+ T세포 및 CD8+ T세포 절대 계수
CD4+ T세포에 PE(phycoerythrins)를 접합하고, CD8+ T세포에 PI(Propidium Iodide) 도핑된 실리카 나노 입자 (약 100nm, 직접 합성해서 사용)를 접합했다. 이렇게 제조한 2종의 샘플을 1:1의 비율로 섞은 후 전혈(Whole blood)에 넣고 10분간 반응 시켰다. 다음, 유세포분석기인 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter) 또는 마이크로칩 기재 계수기 (Microchip based Cell counter)로 분석하였다. PE 및 PI(Propidium Iodide) 도핑된 실리카 나노 입자는 조사된 녹색레이저에 반응하여 적색 빛을 발광하였다. 발광된 적색 빛을 PMT(Photo Multiplied Tube)로 분석하여 발광된 빛의 세기를 확인하였다 (도 5). 분석 결과 CD4+ T세포 5,321개, CD4+ Monocyte 3,684개, CD8+ T세포 3,578개가 얻어 졌다. 정상인의 경우 이 세 가지의 결과가 약 1:0.6:0.6의 비율을 보이며, CD4+ T세포의 개수가 0.7이하의 비율로 떨어지는 경우 HIV의 감염을 의심할 수 있다.
실시예 2: CD45_PE 및 CD4_실리카나노입자를 사용한 CD45(전체 백혈구)와 CD4+ T세포의 계수
CD4_PE와 CD8_실리카나노입자 대신에 CD45_PE 및 CD4_실리카나노입자를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, CD4+ T세포와 CD45를 계수했다 (도 3 참조). 히스토그램 상에서 CD4+ T세포가 가장 밝은 영역에서 나타났다.
분석 결과 CD4+ T세포 5,122개, CD4+ Monocyte 2,978개, CD45 세포(전체 백혈구) 20,617개가 얻어 졌다. 정상인의 경우 이 세 가지의 결과가 약 2:1:10의 비 율을 보이며, CD4+ T세포의 개수가 0.2이하의 비율([CD4]/[CD45])로 떨어지는 경우 HIV의 감염을 의심할 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따르면 2개 이상의 마커를 동일한 파장대의 단일 광원을 사용하는 유세포분석기를 사용하여 분리 및 계수할 수 있으므로, 소형의 저렴한 진단기를 제조할 수 있다.
Claims (4)
- 유세포분석기 (flow cytometry)를 사용하여 2종 이상의 세포를 계수하는 방법에 있어서, 특정 형광표지물질을 검출 대상 세포와 접합하고 동일한 파장대의 다른 형광물질로서 실리카 나노입자에 도핑된 형광물질을 다른 세포와 결합하여 이용함을 특징으로 하는 세포 계수 방법.
- 제 1항에 있어서, 세포가 CD4+ T세포 및 CD8+ T 세포이고, CD4+ T세포와 PE(phycoerythrins)가 접합되고, CD8+ T 세포가 PI(Propidium Iodide) 도핑된 실리카 나노입자와 접합됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 세포가 CD45 세포 및 CD4+ T 세포이고, CD45 세포와 PE(phycoerythrins)가 접합되고, CD4+ T 세포가 PI(Propidium Iodide) 도핑된 실리카 나노입자와 접합됨을 특징으로 하는 방법.
- PE(phycoerythrins)와 접합된 CD4+ T세포, PI(Propidium Iodide) 도핑된 실리카 나노입자와 접합된 CD45 세포를 포함하는 유체, 녹색 광원, 검출기 및 분석기로 구성된 HIV 감염 진단용 유세포분석기 (flow cytometry).
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