KR20180137465A - 형광 분석 효율이 증가된 유세포 분석용 가지형 핵산 나노구조체 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유세포 분석기를 이용한 형광 분석 시 분석 효율을 증가시키기 위한 가지형 핵산 나노구조체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 다종 시료의 동시 분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동일한 형광을 가지는 형광체가 표지된 경우 형광체 수의 변화를 주는 조합을 제외한 조합으로 표지된 가지형 핵산 나노구조체를 제공함으로써, 이를 이용하여 유세포 분석기의 분석능을 극대화시킬 수 있는 경제적인 방법을 제공하는 기술에 관한 것이다.
Description
본 발명은 유세포 분석기를 이용한 형광 분석 시 분석 효율을 증가시키기 위한 가지형 핵산 나노구조체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 다종 시료의 동시 분석 방법에 관한 것이다.
유세포 분석 기기는 생명공학 분야에서 가장 많이 사용되는 기기 중 하나로 유세포 분석기를 이용하면 세포를 세거나 분류하고 다양한 생체 지표를 검출할 수 있다. 유세포 분석기 사용 시 대상 세포 및 물질 분석을 위해서는 타겟 물질에 대한 표지가 수반되어야 하며, 이를 위해 특이적인 흡광/발광 파장을 갖는 형광물질(형광체)들이 이용되고 있다.
이때, 각각의 형광표지 인자를 검출하기 위해서는 형광물질을 발광시킬 수 있는 레이저와 형광표지 인자에서 발생하는 파장을 분석할 수 있는 분광분석기를 사용해야하므로, 동시에 다종의 세포 및 물질을 분석하기 위하여 다수의 레이저 및 분광분석기와 그에 해당하는 형광물질의 다양성이 수반되어야 한다. 특히, 면역학 및 줄기세포학과 같은 다종의 세포 분석이 필요한 분야에 대한 연구가 활발해짐에 따라 동시에 다종의 세포 및 물질을 분리/분석할 수 있는 기술적 요구가 증대되고 있는 실정이다.
이러한 요구를 만족시키기 위하여 유세포 분석기에 다수의 레이저 및 분광 분석기를 탑재하려는 노력이 지속되고 있으나, 아직까지는 최대 10개의 레이저와 18개의 분광 분석기를 탑재한 유세포 분석기가 상업적 기기로서의 기록을 가지고 있는 등 기술적 한계가 있으며, 이를 사용하기 위한 비용 부담이 큰 경제적인 문제점이 있다.
또한, 현재 첨단 생물학 분야에서는 생체 대사에서 주요한 기능을 수행하는 다양한 생체 그룹들을 동시 다발적으로 분석할 수 있어야 하므로, 유세포 분석기 이용범위를 확장하기 위하여 여러 흡광/발광 파장의 형광표지 인자들을 분석할 수 있는 레이저, 분광필터 및 감지기를 고도로 발전시키는 방향으로도 개발이 진행되고 있으며, 일례로 형광표지 인자의 다양성을 증대시키기 위해 최종적인 흡광/발광 파장을 바꿔줄 수 있는 ‘텐덤 형광인자(Tandem Dye)’를 디자인함으로써 동시에 다양한 물질 분석을 가능하게 하려는 노력이 계속되고 있으나 형광인자의 다양성을 충족시키기에는 상당한 어려움이 있고, 형광인자들의 양 및 비율 조절을 통해 하나의 형광인자를 다양하게 분석하려는 노력들도 있으나 유세포 분석기에 적용하기에는 실질적인 한계점이 극명한 문제점이 있다. 특히 형광인자의 양을 달리하는 기존 발명들의 경우, 유세포 분석기의 기본적인 기능 중 하나인 시료 내 대상 물질의 정량분석법에 크게 문제를 일으킬 수 있으며, 그로인한 사용한계가 분명하다.
종합적으로 보았을 때, 종래 유세포 분석기를 이용하여 물질 분석을 하는 방식에서는 형광표지 인자 하나를 탐지/분석하기 위하여 해당하는 레이저 및 분광분석기의 조합이 필요하므로, 동시에 다종의 세포 및 물질 분석을 위해서는 다수의 레이저와 분광분석기의 탑재가 필수적이다. 그러나 아직까지 첨단 생물공학에서 요구하는 수준을 만족시키지 못하고 있는 실정이며, 특이적인 흡광/발광 파장을 가지는 형광인자를 제작하기 위한 노력도 이루어지고 있지만, 그 수가 매우 제한적일 뿐 아니라, 형광 강도의 조절을 통한 유세포 분석 시도도 있으나, 유세포 분석에 적용이 안되는 한계점이 있다.
이에 본 발명자들은 종래 형광표지 인자의 한계를 극복하고, 실제 유세포 분석기를 이용한 분석에 적용 가능한 새로운 형광체 조합으로 표지된 핵산 나노구조체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 말단에 다종의 형광체가 부착된 핵산 단일가닥들을 정교한 나노구조체로 형성시킨 가지형 핵산 나노구조체를 제공하는 것이다. 이때, 상기 핵산 나노구조체의 말단을 한 종류의 형광체로 표지하면 표지하는 숫자를 달리하여도 구분이 어려움을 규명한 바, 말단을 한 종류의 형광체로만 표지할 경우 1개만 표지하는 것을 특징으로 하는 가지형 핵산 나노구조체를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 핵산 단일가닥에 부착된 형광체를 다양하게 조절함으로써 각기 다른 조합의 형광체로 표지된 핵산 나노구조체를 얻을 수 있으며, 이러한 핵산 나노구조체의 경우 유세포 분석기에 포함된 두 개 이상의 레이저 및 분광필터를 이용하여 각기 다른 형광인자로 분리/분석될 수 있음을 규명하였으므로, 단일 흡광/발광 파장을 갖는 형광체들을 정밀하게 조합하여 표지한 가지형 핵산 나노구조체들을, 다종의 레이저 및 분광분석기와 조합하여 사용함으로써 동시에 다종의 물질을 쉽고 빠르게 분석할 수 있는 다종 시료의 동시 분석 방법을 제공하고자 한다. 유세포 분석기가 2개 이상의 레이저 및 분광분석기를 탑재하고 있을 경우, 정밀하게 조합된 형광체가 각각의 흡광/발광 파장을 나타낼 수 있고, 각 형광체의 형광비를 기준으로 대상 물질을 탐지/분석해 낼 수 있음을 규명한 바, 2개의 형광체만으로 조합을 통해 최소 7가지 이상의 물질(시료) 검출이 가능하다.
이에 더하여, 본 발명은 구조적 안정성 및 정밀성에 탁월한 다양한 가지형 핵산 나노구조체(Y-형, T형, Z형 또는 나뭇가지형 등)를 유세포 분석기 이용 용도로 최적화하는 가지형 핵산 나노구조체의 제조방법을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 형광 분석 효율이 증가된 유세포 분석용 가지형(branched) 핵산 나노구조체를 제공하며, 상기 핵산 나노구조체는 가지 말단에 형광체가 표지되고, 동일 형광을 가지는 형광체로만 구성되는 경우 1개의 형광체만 표지하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 유세포분석 시 형광 분석의 효율 증가를 위한 가지형(branched) 핵산 나노구조체의 제조방법을 제공하며, 상기 제조방법은 핵산 나노구조체의 하나 이상의 가지 말단에 형광체를 표지하되, 동일 형광을 가지는 형광체로 표지하는 경우 1개의 말단에만 표지하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
이에 더하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 유세포 분석기를 이용한 다종 시료의 동시 분석 방법을 제공한다:
a) 서로 다른 형광체 조합으로 표지된 가지형 핵산 나노구조체들을 다종의 시료와 혼합하는 단계; 및
b) 유세포분석기 분석을 통해 형광비를 측정하는 단계를 포함하되,
상기 a) 단계의 서로 다른 형광체 조합은 동일 형광체를 개수만 다르게 한 경우로 이루어지는 조합은 제외한다.
본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 핵산 나노구조체는 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 단일가닥이 Y자 가지 형태로 결합한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 핵산 나노구조체는 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 단일가닥으로 결합된 Y자 가지형태 핵산구조체의 점착성 말단에 또 다른 Y자 가지형태 핵산구조체가 나뭇가지 형태로 결합한 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 형광체는 플루오레신(fluorescein), 텍사스레드(TexasRed), 로다민(rhodamine), 알렉사(alexa), 시아닌(cyanine), 보디피(BODIPY), 아세톡시메틸 에스터(Acetoxymethyl ester), 및 쿠마린(coumarin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 계열일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 제조방법은 서냉복원법(annealing)으로 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 단일가닥을 Y자 가지 형태로 결합시켜 핵산 나노구조체를 형성시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 제조방법은 서냉복원법(annealing)으로 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 단일가닥을 나뭇가지 형태로 결합시켜 핵산 나노구조체를 형성시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 형광 분석은 시험관내(in vitro)에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 시료는 세포일 수 있다.
본 발명은 유세포분석기의 분석능을 극대화할 수 있는 형광체 조합으로 구성되는 핵산 나노구조체를 제공함으로써, 예를 들어 두개의 각기 다른 흡광/발광 파장을 갖는 형광체들을 표지하고 유세포 분석을 수행하였을 때, 종래의 경우 각 형광체의 흡광/발광 파장에 해당하는 두 가지 물질의 분리만 가능했던 반면, 동일한 유세포 분석기를 사용하여 최소 7가지 이상의 물질 분리가 가능한 장점이 있다.
또한, 본 발명은 핵산 나노구조체의 결합 특성을 이용하여 유세포 분석시 분석 효율이 증가되도록 제조하였기 때문에 단위 분자당 포함되는 형광체의 개수비가 일정하며, 이로 인해 두 가지 이상의 레이저를 처리하였을 때, 분광분석기로 측정되는 형광값의 비율이 일정한 값을 보이므로, 이를 이용하여 서로 다른 형광비율을 갖는 형광체 조합들의 개별적인 분리가 가능하다. 따라서 유세포 분석기 이용시 추가적인 레이저 및 분광분석기 등의 필요없이 다종 세포 또는 물질의 동시다발적인 분석이 가능하며, 현재 시판되고 있는 형광체의 단순 조합만으로 새로운 종류의 형광체를 만드는 효과도 가지는 특징이 있다.
이에, 본 발명은 면역학, 유전학 및 줄기세포학을 비롯한 다양한 첨단 생물공학 분야에서 필요로 하는 강력한 유세포 분석능을 제공함으로써 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 핵산 나노구조체의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 조합형 형광표지 인자의 모형(a), 전기영동을 통해 확인한 핵산 나노구조체(b) 및 형광 조합(c)을 나타낸 것이다.
도 3은 동일한 형광인자가 표지된 조합형 핵산 나노구조체의 유세포분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 유세포 분석 기기를 이용한 조합형 핵산 나노구조체의 기능 평가 결과를 나타낸 것이다(G: FAM, R: Cy5).
도 2는 조합형 형광표지 인자의 모형(a), 전기영동을 통해 확인한 핵산 나노구조체(b) 및 형광 조합(c)을 나타낸 것이다.
도 3은 동일한 형광인자가 표지된 조합형 핵산 나노구조체의 유세포분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 유세포 분석 기기를 이용한 조합형 핵산 나노구조체의 기능 평가 결과를 나타낸 것이다(G: FAM, R: Cy5).
본 발명은 유세포분석기를 이용한 분석/분리시 효율을 증가시킬 수 있도록 형광체들을 효과적으로 조합한 핵산 나노구조체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 다종 시료의 분석 방법을 제공하는 것을 그 특징으로 한다.
본 발명에서는 유세포분석기의 분석 효율 증가를 위해 형광체들의 세밀한 조립이 가능하고 단위체 조합에서 특이성과 안정성에 탁월한 핵산 나노구조체를 이용하였다. 보다 자세하게, 서냉복원법(annealing)을 통해 형광체가 부착된 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 단일가닥 간의 상보적 결합으로 얻을 수 있는 가지형 핵산 나노구조체(Y형 핵산 나노구조체 또는 나뭇가지형 핵산 나노구조체 등)를 형성시킴으로써 흡광/발광 파장이 서로 다른 여러 형광체들이 일정 비율로 정교하게 합성되도록 하였다. 이때, 나머지 핵산 나노구조체의 말단에 타겟팅 분자(targeting molecule) 또는 화학적 기능기(functional group) 등을 부착하여 추가적인 기능을 부여함으로써, 종래 형광체들이 가지는 기능성을 유지/보완/대체 할 수 있으며, 형광체의 다변화 및 추가 조정이 가능하다.
본 발명에서 상기 형광체는 바람직하게 플루오레신(fluorescein), 텍사스레드(TexasRed), 로다민(rhodamine), 알렉사(alexa), 시아닌(cyanine), 보디피(BODIPY), 아세톡시메틸 에스터(Acetoxymethyl ester), 또는 쿠마린(coumarin) 등의 계열일 수 있으며, 보다 바람직하게 하기 표 1의 형광체들을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 핵산 단일가닥 부착이 가능한 공지의 형광체라면 모두 사용 가능하다.
| 형광표지 인자 | 흡광 (nm) | 발광 (nm) | 형광표지 인자 | 흡광 (nm) | 발광 (nm) | 형광표지 인자 | 흡광 (nm) | 발광 (nm) |
| 6-FAM(NHS Ester) | 496 | 516 | ROX (NHS Ester) | 588 | 608 | Alexa Fluor® 660 (NHS Ester) | 661 | 691 |
| 6-FAM (Fluorescein) | 495 | 520 | TYE™ 563 | 549 | 563 | Alexa Fluor® 750 (NHS Ester) | 753 | 775 |
| Fluorescein dT | 495 | 520 | HEX | 538 | 555 | GreenTM-X (NHS Ester) | 504 | 531 |
| Cy3TM | 550 | 564 | TEX 615 | 596 | 613 | Rhodamine RedTM-X (NHS Ester) | 574 | 594 |
| TAMRATM | 559 | 583 | TYE™ 665 | 645 | 665 | 5-TAMRA TM (Azide) | 546 | 579 |
| JOE (NHS Ester) | 529 | 555 | TYE 705 | 686 | 704 | WellRED D4 Dye | 650 | 670 |
| Cy5TM | 648 | 668 | Alexa Fluor® 488 (NHS Ester) | 492 | 517 | WellRED D3 Dye | 683 | 701 |
| TAMRA (NHS Ester) | 559 | 583 | Alexa Fluor® 532 (NHS Ester) | 527 | 553 | WellRED D2 Dye | 763 | 778 |
| MAX (NHS Ester) | 524 | 557 | Alexa Fluor® 546 (NHS Ester) | 555 | 571 | AM (Azide) | 496 | 516 |
| TETTM | 522 | 539 | Alexa Fluor® 594 (NHS Ester) | 584 | 616 | Texas Red®-X (NHS Ester) | 598 | 617 |
| Cy5.5TM | 685 | 706 | Alexa Fluor® 647 (NHS Ester) | 650 | 670 | Lightcycler® 640 (NHS Ester) | 620 | 635 |
| Dy 750(NHS Ester) | 747 | 776 |
본 발명의 형광체 조합은 핵산 나노구조체의 말단 수에 따라 얼마든지 축소 또는 증가시킬 수 있으며, 예를 들어, Y형 핵산 나노구조체일 경우 3개의 말단을 가지고 있으므로 2개의 말단에 형광체를 부착하고, 나머지 하나의 말단에는 기능성 타겟팅 분자를 부착할 수 있다. 그러므로 2가지 형광체(A, B로 명명)를 이용하였을 때, A, AB, AA, BB의 총 4가지 조합을 만들 수 있으나, A와 AA 또는 B와 BB의 조합은 형광 세기의 차이는 있겠으나, 실제 유세포 분석기에서 형광세기의 비교 분석은 어려움을 확인한 바, (A, AA), (B, BB), (AB) 세가지 조합이 실제 사용가능하다. 또한, Y형 핵산 나노구조체를 결합시켜 얻을 수 있는 나뭇가지형 핵산 나노구조체의 경우 총 5개의 말단을 가지고 있고, 이 중 4개의 말단에 2 종류의 형광체를 표지할 수 있으므로, 상기와 같은 방식으로 총 7가지의 조합을 얻을 수 있다. 이렇게 얻은 7가지 조합은 유세포 분석 기기를 이용하여 모두 구분 가능한 특징이 있으며, 종래 유세포 분석기의 기술적인 한계를 극복함으로써 추가적인 비용 없이 2가지 형광체만으로 총 7가지의 시료 분석을 동시에 할 수 있다.본 발명의 핵산 나노구조체는 Y형 핵산 나노구조체의 점진적인 조합을 통해 더욱 세밀하고 다양한 조합의 형광체 표지가 가능하도록 가지형태를 만들어 갈 수 있을 뿐 아니라, 형광체를 표지한 핵산 단일가닥을 이용하여 고차원적인 핵산 나노구조체의 형태로 구현될 수 있으므로, 어느 하나의 형태에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에서는 핵산 나노구조체로 Y형 핵산 나노구조체 및 나뭇가지형 핵산 나노구조체를 제조하였으며, 각 말단에 특이적으로 부착될 수 있는 형광체들을 다변화하여 각기 다른 형광체 조합을 가지는 핵산 나노구조체를 얻었다. 녹색 형광체(G; Green)와 적색 형광체(R; Red)를 이용하여 얻을 수 있는 이론적 조합의 경우 R, RR, G, GG, RG(Y형 핵산 나노구조체 사용 시) 및 R, RR, RRR, RRRR, RG, RGG, RGGG, RRG, RRGG, RRRG, GGGG, GGG, GG, G(나뭇가지형 핵산 나노구조체 사용 시)가 가능하나, 실험 결과 R, RR, RRR, 및 RRRR과 같이 동일한 비율의 형광체가 표지된 경우 구분이 어렵다는 것을 확인하였다. 이는 형광 강도를 조절하여 유세포분석기에 활용하는 기술로는 분석이 어렵다는 것을 증명한 것으로, Y형 핵산 나노구조체의 경우 실제로 3가지, 나뭇가지형 핵산 나노구조체의 경우 실제로 7가지의 조합으로 형광체를 표지하였을 때 유세포 분석기에 효과적으로 적용 가능함을 알 수 있다.
따라서 본 발명은 가지 말단에 형광체가 표지되며, 동일 형광을 가지는 형광체로만 구성되는 경우 1개의 형광체만 표지하는 것을 특징으로 하는, 형광 분석 효율이 증가된 유세포분석용 가지형(branched) 핵산 나노구조체를 제공할 수 있으며, 가지형 핵산 나노구조체의 하나 이상의 가지 말단에 형광체를 표지하되 동일 형광을 가지는 형광체로 이루어지는 경우 1개의 말단에만 형광체를 표지하는 단계를 포함하는 형광 분석 효율 증가를 위한 가지형 핵산 나노구조체의 제조방법을 제공할 수 있다. 이에 더하여, 서로 다른 형광체 조합으로 표지된 가지형 핵산 나노구조체들을 다종의 시료와 혼합하는 단계 및 유세포 분석기 분석을 통해 형광비를 측정하는 단계를 포함하되, 상기 ‘서로 다른 형광체 조합’은 동일 형광체를 개수만 다르게 한 경우로 이루어지는 조합은 제외하는 것을 특징으로 하는, 유세포 분석기를 이용한 다종 시료의 동시 분석 방법을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
조합형 형광표지 인자의 제작
형광 표지된 핵산 단일가닥을 서냉복원법(annealing) 과정을 통해 핵산 나노구조체로 합성하였다. 도 1에 나타낸 핵산 나노구조체 모형과 같이, Y형 핵산 나노구조체는 세 가지 핵산 단일가닥의 서냉복원법을 통해 제작할 수 있으며, 세 말단을 가진다. 나뭇가지형 핵산 나노구조체의 경우 세 개의 Y형 핵산 나노구조체의 말단 라이게이션(ligation)을 통해 합성할 수 있으며, 총 5개의 말단을 가진다.
보다 상세하게는, 3차 증류수에 녹아있는 핵산 단일가닥들을 동일한 몰비로 처리하고, 50 mM의 염화나트륨(NaCl)을 첨가하였으며, 이 용액을 95℃에서 4℃까지 천천히 내려주는 방식으로 Y형 핵산 나노구조체를 합성하였다. 사용한 핵산 단일가닥의 염기 서열은 아래 표 2에 나타내었으며, 표 2의 Y1, Y2, 및 Y3는 말단의 염기서열이 다른 Y형 핵산 나노구조체를 의미하는 것으로, T4 DNA ligase를 이용하여 상기 제작된 3종류의 Y형 핵산 나노구조체(Y1, Y2, 및 Y3)의 말단 라이게이션을 통해 나뭇가지형 핵산 나노구조체를 형성시켰다.
| 명칭 | 서열 (5'->3') | 서열번호 |
| Y1_Oligo1 | GAGTAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCA | 1 |
| Y1_Oligo2 | TGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAG | 2 |
| Y1_Oligo3 | GAGTCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCT | 3 |
| Y2_Oligo1 | AGTCAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCA | 4 |
| Y2_Oligo2 | TGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAG | 2 |
| Y2_Oligo3 | CTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCT | 5 |
| Y3_Oligo1 | ACTCAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCA | 6 |
| Y3_Oligo2 | TGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAG | 2 |
| Y3_Oligo3 | CTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCT | 5 |
Y형 핵산 나노구조체는 3개의 말단을 가지고 있고, 이 중 2개의 말단에 형광표지 인자를 부착하고, 나머지 하나의 말단에 일반적으로 기능성 타겟팅 분자를 부착하므로, 3종류의 Y형 핵산 나노구조체를 이용하여 제작한 나뭇가지형 핵산 나노구조체의 경우, 총 5개의 말단을 가지게 되므로, 이 중 4개의 말단에 2종류의 형광표지 인자를 부착하도록 설계할 수 있다. 나뭇가지형 핵산 나노구조체의 형광표지 인자 조합은 도 2(a)에 모식도를 나타내었으며, 전기영동법을 이용하여 도 2(b)에 나타낸 바와 같이 나노구조체의 형성을 확인하였다. Y형 핵산 나노구조체(도 2(b)의 3번 lane)는 단일가닥(도 2(b)의 1번 lane)이나 이중가닥(도 2(b)의 2번 lane)보다 높은 위치에 밴드가 나타났고, 3개의 Y형 핵산 나노구조체의 말단 결합으로 얻어지는 나뭇가지형 핵산 나노구조체(도 2(b)의 6번 lane)의 경우 Y형 핵산 나노구조체(도 2(b)의 3번 lane) 또는 2개의 Y형 핵산 나노구조체의 결합체(도 2(b)의 4,5번 lane)보다 높은 위치에 밴드가 나타났다.상기 결과는 단일가닥들이 서로 결합하여 전기영동 상의 밴드 위치가 점차 높아지는 것을 나타내는 것으로서, 나노구조체가 형성되었음을 알 수 있다.
형광표지 인자 조합의 기능 평가
핵산 나노구조체의 형광표지 인자 조합들의 기능을 평가하기 위해, FAM(형광/흡광; 496/516) 및 Cy5(형광/흡광; 648/668) 형광인자를 사용하여 핵산 나노구조체의 말단을 표지하고 전기영동 및 유세포분석기기로 기능을 분석하였다.
*Y형 핵산 나노구조체는 3가지 조합의 형광표지가 가능하고, 나뭇가지형 핵산 나노구조체의 경우 7가지의 형광 조합이 가능하다. 이에, 도 2(c)에 나타낸 바와 같이, 각각 FAM/Cy5, Cy5/Cy5, 및 FAM/FAM 조합을 갖는 Y형 핵산 나노구조체(도 2(c)의 1 내지 3 lane 밴드)와 다양한 조합으로 형광인자를 표지한 나뭇가지형 핵산 나노구조체(도 2(c)의 4 내지 10번 lane)를 준비하고 전기영동 분석을 수행한 결과, 다른 비율로 제작된 형광표지 인자의 경우 형광인자들에 의한 발광 파장의 조합으로 인해 붉은색(Cy5에서 기인)에서 녹색(FAM에서 기인)까지 다양한 빛을 내며, 이러한 빛 변화는 강한 자외선 파장 아래에서 확인 가능함을 알 수 있었다.
또한, 유세포분석기기를 이용한 유세포 분석 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 동일한 형광을 갖는 다양한 강도의 형광표지 인자(G, GG, GGG 및 GGGG; 또는 R, RR, RRR 및 RRRR)의 경우, 유세포 분석을 실시하였을 때 각 형광인자들이 명확하게 구분되지 않는 것으로 나타나, 그 분해능이 매우 떨어지는 것을 알 수 있었다.
이는 단순 결과 분석 이외에도 물질 분리에 있어서 큰 문제가 될 수 있는 부분으로, 형광 강도 조절을 통한 유세포 분석기법의 문제점을 극명하게 나타내는 것이다.
유세포분석기기 이용시 분석 정확성을 높이기 위한 형광표지 인자 조합의 확 인
유세포분석기기를 이용한 핵산 나노구조체의 형광 분석 시 형광표지 인자 조합에 따른 분석능 평가를 위해, 다양한 형광표지 인자가 부착된 핵산 나노구조체의 나머지 한 쪽 말단에 바이오틴(biotin)을 부착하고, 스트렙타아비딘(streptavidin)이 코팅된 5.2 μm 크기의 비드에 반응시킴으로써 세포 분석시와 동일한 환경을 만들었다. 그리고 7가지의 형광표지 인자 조합으로 각각 제작된 나뭇가지형 핵산 나노구조체를 유세포분석기기로 분석한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 각 형광표지 인자 조합을 개별적으로 유세포분석(도 4의 (a) 내지 (g))하거나 혼합하여 유세포분석(도 4의 (h))하였을 때, 형광표지 인자 조합에 따라 FAM과 Cy5의 형광 비율의 기울기가 달라지는 것으로 나타나, 개별적으로 모두 구분가능함을 알 수 있으며, 이 때 얻어지는 회귀함수의 기울기(R2값: 0.9576)는 형광표지의 비율과 일치함을 확인(도 4의 (i))하였다.
상기로부터 형광표지 인자의 비율에 따라 기울기가 변화함을 확인하였으므로, 동일한 형광을 갖는 다양한 강도의 형광표지 인자 조합이 아닌 형광표지 인자의 비율 변화를 통해 유세포분석기기 이용 분석시 분석능을 증대시킬 수 있음을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY
<120> BRANCHED NUCLEIC ACID NANOSTRUCTURE HAVING IMPROVED EFFICIENCY OF
FLUORESCENCE ANALYSIS FOR FLOW CYTOMETRY, AND MANUFACTURING
METHOD THEREOF
<130> PN1812-525
<150> KR 10-2017-0093261
<151> 2015-06-08
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y1_Oligo1
<400> 1
gagtaggctg attcggttca tgcggatcca 30
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y1_Oligo2 or Y2_Oligo2 or Y3_Oligo2
<400> 2
tggatccgca tgacattcgc cgtaag 26
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y1_Oligo3
<400> 3
gagtcttacg gcgaatgacc gaatcagcct 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y2_Oligo1
<400> 4
agtcaggctg attcggttca tgcggatcca 30
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y2_Oligo3 or Y3_Oligo3
<400> 5
cttacggcga atgaccgaat cagcct 26
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y3_Oligo1
<400> 6
actcaggctg attcggttca tgcggatcca 30
Claims (2)
1) 가지형(branched) 핵산 나노구조체의 5개 말단 중 하나 이상의 말단에 제 1 형광체만을 표지한 핵산 나노 구조체;
2) 가지형 핵산 나노구조체의 5개 말단 중 하나 이상의 말단에 상기 제 1 형 형광체와 다른 색의 형광을 갖는 제 2 형광체만을 표지한 핵산 나노 구조체;
3)가지형 핵산 나노구조체의 5개 말단 중 하나의 말단에 제 1 형광체가 표지되고 다른 4개의 말단 중 3개의 말단에 제 2 형광체가 표지된 핵산 나노 구조체;
4) 가지형 핵산 나노구조체의 5개 말단 중 하나의 말단에 제 2 형광체가 표지되고 다른 4개의 말단 중 3개의 말단에 제 1 형광체가 표지된 핵산 나노 구조체;
5) 가지형 핵산 나노구조체의 5개 말단 중 하나의 말단에 제 1 형광체가 표지되고 다른 4개의 말단 중 2개의 말단에 제 2 형광체가 표지된 핵산 나노 구조체;
6) 가지형 핵산 나노구조체의 5개 말단 중 하나의 말단에 제 2 형광체가 표지되고 다른 4개의 말단 중 2개의 말단에 제 1 형광체가 표지된 핵산 나노 구조체; 및
7) 가지형 핵산 나노구조체의 5개의 말단 중 두개의 말단에 제 1 형광체가 표지되고, 다른 3개의 말단 중 2개의 말단에 제 2 형광체가 표지된 핵산 나노 구조체 또는 가지형 핵산 나노구조체의 5개의 말단 중 하나의 말단에 제 1 형광체가 표지되고, 4 개의 말단 중 하나의 말단에 제 2 형광체가 표지된 핵산 나노 구조체;
를 포함하는 형광 분석 효율이 증가된 유세포 분석용 키트로서,
상기 핵산 나노구조체는 서열번호 1, 2 및 3의 염기서열로 이루어진 Y형 핵산 나노구조체; 서열번호 4, 2 및 5의 염기서열로 이루어진 Y형 핵산 나노구조체; 및 서열번호 6, 2 및 5의 염기서열로 이루어진 Y형 핵산 나노구조체;로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 Y형 핵산 나노구조체의 점착성 말단에 또 다른 상기 Y형 핵산 나노구조체가 나뭇가지 형태로 결합한 나뭇가지형 핵산구조체인, 키트.
2) 가지형 핵산 나노구조체의 5개 말단 중 하나 이상의 말단에 상기 제 1 형 형광체와 다른 색의 형광을 갖는 제 2 형광체만을 표지한 핵산 나노 구조체;
3)가지형 핵산 나노구조체의 5개 말단 중 하나의 말단에 제 1 형광체가 표지되고 다른 4개의 말단 중 3개의 말단에 제 2 형광체가 표지된 핵산 나노 구조체;
4) 가지형 핵산 나노구조체의 5개 말단 중 하나의 말단에 제 2 형광체가 표지되고 다른 4개의 말단 중 3개의 말단에 제 1 형광체가 표지된 핵산 나노 구조체;
5) 가지형 핵산 나노구조체의 5개 말단 중 하나의 말단에 제 1 형광체가 표지되고 다른 4개의 말단 중 2개의 말단에 제 2 형광체가 표지된 핵산 나노 구조체;
6) 가지형 핵산 나노구조체의 5개 말단 중 하나의 말단에 제 2 형광체가 표지되고 다른 4개의 말단 중 2개의 말단에 제 1 형광체가 표지된 핵산 나노 구조체; 및
7) 가지형 핵산 나노구조체의 5개의 말단 중 두개의 말단에 제 1 형광체가 표지되고, 다른 3개의 말단 중 2개의 말단에 제 2 형광체가 표지된 핵산 나노 구조체 또는 가지형 핵산 나노구조체의 5개의 말단 중 하나의 말단에 제 1 형광체가 표지되고, 4 개의 말단 중 하나의 말단에 제 2 형광체가 표지된 핵산 나노 구조체;
를 포함하는 형광 분석 효율이 증가된 유세포 분석용 키트로서,
상기 핵산 나노구조체는 서열번호 1, 2 및 3의 염기서열로 이루어진 Y형 핵산 나노구조체; 서열번호 4, 2 및 5의 염기서열로 이루어진 Y형 핵산 나노구조체; 및 서열번호 6, 2 및 5의 염기서열로 이루어진 Y형 핵산 나노구조체;로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 Y형 핵산 나노구조체의 점착성 말단에 또 다른 상기 Y형 핵산 나노구조체가 나뭇가지 형태로 결합한 나뭇가지형 핵산구조체인, 키트.
제1항에 있어서,
상기 형광체는 플루오레신(fluorescein), 텍사스레드(TexasRed), 로다민(rhodamine), 알렉사(alexa), 시아닌(cyanine), 보디피(BODIPY), 아세톡시메틸 에스터(Acetoxymethyl ester), 및 쿠마린(coumarin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 계열인 것을 특징으로 하는, 키트.
상기 형광체는 플루오레신(fluorescein), 텍사스레드(TexasRed), 로다민(rhodamine), 알렉사(alexa), 시아닌(cyanine), 보디피(BODIPY), 아세톡시메틸 에스터(Acetoxymethyl ester), 및 쿠마린(coumarin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 계열인 것을 특징으로 하는, 키트.
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070048759A1 (en) * | 2005-06-10 | 2007-03-01 | Dan Luo | Detection of target molecules with labeled nucleic acid detection molecules |
| KR20070102177A (ko) | 2006-04-14 | 2007-10-18 | 주식회사 디지탈바이오테크놀러지 | 세포표면 표지의 검출 및 계수 방법 |
-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070048759A1 (en) * | 2005-06-10 | 2007-03-01 | Dan Luo | Detection of target molecules with labeled nucleic acid detection molecules |
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