KR20070100832A

KR20070100832A - 항혈관신생 ｐｈｓｃｎ 펩티드를 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR20070100832A
Application number: KR1020077019974A
Authority: KR
Inventors: 앤드류 피. 마자르; 하셈 헤이아티; 제이 쉬리어; 밍 리; 스코트 해리스
Original assignee: 아테뉴온, 엘엘씨
Priority date: 2005-02-01
Filing date: 2006-02-01
Publication date: 2007-10-11
Also published as: AU2006210895A1; WO2006083906A3; CA2596255A1; EP1843779A2; WO2006083906A2; JP2008528630A

Abstract

본 발명은 펩티드 또는 유사체를 자발적 직렬식 이량체화 또는 더 높은 올리고머화에 대해 안정화시키는 1 개 이상의 추가 화합물을 포함하는 Cys 함유 항혈관신생 펩티드 Pro-His-Ser-Cys-Asn(바람직하게는 Ac-PHSCN-NH₂로서 캡핑된 형태) 또는 그의 산 부가 염 또는 그의 유사체의 조성물/제제에 관한 것이다. 바람직한 제제는 시트레이트와 같은 산성 완충제, 부형제 및 부피형성제로서의 글리신을 포함한다. 이 제제의 임의의 추가 성분은 환원제, 비-티올 생체적합성 항산화제, 동결건조 보호제(전형적으로, 1 개 이상의 당, 1 개 이상의 아미노산, 1 개 이상의 메틸아민, 1 개 이상의 유방향성 염, 및/또는 1 개 이상의 폴리올임)이다. 또한, 용액 또는 동결건조된 형태의 제제를 포함하는 제조 물품 또는 키트가 제공된다. 상기 제제 중의 펩티드를 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 대상자의 혈관신생 억제 방법도 또한 게재되어 있다.

이상 혈관화, 혈관신생

Description

항혈관신생 ＰＨＳＣＮ 펩티드를 함유하는 조성물{COMPOSITIONS CONTAINING THE ANTI-ANGIOGENIC PHSCN PEPTIDE}

본 출원은 2005년 2월 1일자로 출원된 미국 가출원 60/648,391을 우선권 주장의 기초로 하는 출원이다.

본 발명은 펩티드의 열화 및 자발적 산화성 이량체화 또는 올리고머화를 방지하는 Cys 함유 항혈관신생 펩티드 Pro-His-Ser-Cys-Asn의 개선된 제제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

대부분의 암 형태는 고체 종양으로서 나타나거나 또는 그로부터 유래한다(쇼클레이(Shockley) 등, Ann. N. Y. Acad. Sci. 1991, 617:367-382). 이러한 유형의 종양은 임상에서 단일클론 항체 및 면역독소와 같은 생물학적 치료에 대해 내성이 있는 것으로 일반적으로 증명되었다. 암 치료를 위한 항혈관신생 요법은 고체 종양이 지속적인 성장을 하기 위해서는 혈관신생(즉, 새로운 혈관 생성)을 필요로 한다는 인식에서부터 개발되었다(포크만(Folkman), Ann. Surg.1972,175:409-416; 포크만, Mol. Med. 1995,1:120-122; 포크만, Breast Cancer Res. Treat. 1995,36:109-118; 하나한(Hanahan) 등, Cell 1996,86:353-364). 동물 모델에서 항혈관신생 요법의 효능이 예를 들어 다음과 같은 많은 연구에서 입증되었다: 밀라우 어(Millauer) 등, Cancer Res. 1996,56:1615-1620: 보그스트롬(Borgstrom) 등, Prostrate 1998,35:1-10; 벤자민(Benjamin) 등, J. Clin. Invest.1999,103:159-165; 브루어 쥐제이(Brewer GJ) 등, Integr Cancer Ther. 2002,1:327-337; 밴 골렌 케이엘(van Golen KL) 등, Neoplasia 2002, 4:373-379; 콕스 씨(Cox C) 등, Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 2003, 129:781-785. 혈관신생이 일어나지 않을 때, 고체 종양의 내부 세포 층에 대한 영양 공급이 불충분하게 이루어진다. 게다가, 이제 혈관신생(즉, 이상 혈관화)은 비고체 혈액학적 종양의 성장에 필요한 것으로 밝혀졌고, 눈 신생혈관 질환, 황반 변성, 류마티스성 관절염 등을 포함하여 많은 다른 질환과 관련이 있다.

대조적으로, 정상 조직은 상처 수복, 생리 주기 동안 자궁 내막 증식 등과 같은 특수 상황을 제외하고는 혈관신생을 필요로 하지 않는다. 따라서, 혈관신생 요구는 종양/암 조직과 정상 조직 간의 유의한 차이이다. 중요한 것은, 정상 세포와 비교할 때 혈관신생에 대한 종양 세포의 의존도는 정상 조직과 종양 조직 간의 세포 복제 및 세포 죽음의 차이보다 정량적으로 더 크다. 후자의 차이는 전형적으로 암 치료법에 이용된다.

종양 혈관신생은 저산소 조건 하에서 국부 혈관의 내피 세포("EC") 상의 특이적 수용체와 결합하는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및/또는 섬유아세포 성장 인자(FGF)와 같은 사이토킨에 의해 억제될 수 있다. 활성화된 EC는 연관된 조직 기질을 리모델링하고 인테그린과 같은 부착 분자의 발현을 조정하는 효소를 분비한다. 기질 열화 후, EC는 증식해서 종양 쪽으로 이동하고, 이 때문에 새로운 혈관 이 발생하고 성숙한다.

관심을 끄는 것은, 기질 단백질의 열화로 혈관신생을 억제하는 엔도스타틴, 크링글 5 및 PEX와 같은 단백질 단편이 생성된다(오레일리(O'Reilly) 등, Cell 1997,88,277-85; 오레일리 등, Cell,1994,79:315-28; 브룩스(Brooks) 등, Cell 1998,92:391-400). 따라서, 이들 단백질 단편은 신혈관신생을 억제할 수 있고, 따라서 종양 성장 및 전이를 방지한다. 그러나, 단백질 단편은 그의 사용과 연관된 중요한 결점을 가지고 있다. 그것은 다량 생산이 어렵고 비용이 많이 들며, 불량한 약물학적 성질을 나타내고, 열화에 민감하다는 것 등이다. 한 가지 접근법은 이러한 큰 단백질의 또는 더 긴 단편 또는 서브유닛의 짧은 펩티드 단편을 확인하는 것이고, 짧은 펩티드는 모 단백질의 항혈관신생 활성의 중요한 부분을 보유한다.

혈관신생을 억제하는 펩티드에 대한 연구는 새로운 혈관의 성장을 방지함에 있어서 유의한 효과성을 갖는 화합물을 제공하였지만, 우수한 활성 프로필을 갖는 분자가 여전히 필요하다. 따라서, 혈관신생을 방지하고 이상 혈관화를 검출함에 있어서 펩티드의 잠재력을 충분히 탐색하는 신규 펩티드가 필요하다. 신규 펩티드는 당업계에 기재된 펩티드에 비해서 더 긴 혈장 반감기를 가질 수 있고, 열화에 대해 더 큰 내성이 있을 수 있고, 증가된 생체이용가능성, 더 높은 친화성, 더 큰 선택성 등을 가질 수 있다(리반트(Livant) 등, 미국 특허 6,001,965 및 6,472,369). 이러한 신규 펩티드는 세포 이동, 침입 및 증식의 억제 및 원하지 않은 혈관신생 및 이상 혈관화와 연관된 다양한 질환의 치료 또는 예방에 효과가 있 을 수 있다. 이러한 펩티드의 예, 주로 캡핑된 펜타펩티드 Ac-PHSCN-NH₂(또한, ATN-161이라고도 부름)의 유도체는 공동 양도된 미국 특허 출원 10/723,144(출원일: 2003년 11월 25일; 앨런(Allan) 등의 US20040162239A1으로 공개됨) 및 미국 특허 출원 10/722,843(출원일: 2003년 11월 25일; 터난스키(Ternansky) 등의 US20050020810A1으로 공개됨)에 기재되어 있고, 이들 문헌은 전체를 본원에 참고로 혼입한다.

당업계에서 용액상 및 고체상 조건 하에서 Ac-PHSCN-NH₂의 열화를 방지하는 방법이 필요하다. 항혈관신생 펩티드의 활성 프로필을 개선하는 한가지 접근은 저장 수명을 연장하고 열화에 대한 내성을 증진하기 위한 수단으로서 그의 제제화 방법을 이용하는 것이다. Cys를 포함하는 펩티드의 경우, 디술파이드 결합 형성을 통해 자발적 산화성 이량체화 또는 더 높은 올리고머화 또는 중합을 방지하는 것도 중요하다. 본 발명은 항혈관신생 펩티드 Ac-PHSCN-NH₂ 및 그의 항혈관신생 유도체를 위한 이러한 개선된 제제에 관한 것이다.

<발명의 요약>

본 발명자들 및 동료들은 특히 원하지 않은 이량체화를 일으키는 디술파이드 결합 형성을 억제함으로써 이 펩티드의 생물학적/생화학적 효력을 보존하는 Cys 함유 펩티드 및 그의 염을 위한 개선된 제제를 포함하는 조성물을 개발하였다.

본 발명의 제제에 유용한 Ac-PHSCN-NH₂의 산 부가 염은 공동 계류 중인 터난 스키 등의 출원(발명의 명칭은 둘 모두 "Ac-PHSCN-NH₂의 산 부가 염"임. 미국 가출원 60/649,308(2005년 2월 1일자로 출원됨) 및 2006년 2월 1일자로 출원된 국제 출원(대리인 문서 번호 : 9715-022-228))에 기재되어 있고, 이들은 각각 전체를 본원에 참고로 혼입한다. 상기 출원은 Ac-PHSCN-NH₂의 산 부가 염, Ac-PHSCN-NH₂의 산 부가 염 제조 방법, Ac-PHSCN-NH₂의 산 부가 염의 제약 조성물, Ac-PHSCN-NH₂의 산 부가 염 및 그의 제약 조성물을 혈관신생 및 이상 혈관화와 연관된 질환의 치료에 이용하는 방법 및 염 형성에 의한 Ac-PHSCN-NH₂의 열화 방지 방법을 게재한다. 따라서, 본원의 신규 제제는 터난스키 등의 상기 문헌에 기재된 신규 염들을 이용하는 것을 포함한다.

따라서, 본 발명은 펩티드 Pro-His-Ser-Cys-Asn(PHSCN), 그의 유사체 또는 그 펩티드 또는 유사체의 염, 및 그 펩티드 또는 유사체를 자발적 직렬식(tandem) 이량체화 또는 더 높은 올리고머화에 대해서 안정화시키는 1 개 이상의 추가 화합물을 포함하는 제제에 관한 것이다. 바람직하게는, 펩티드는 양쪽 말단이 캡핑되는데, N-말단은 아세틸기로, C-말단은 아미드기로 캡핑된다. 추가 화합물은 Cys 잔기의 술프히드릴기 사이에 디술파이드 결합 형성을 억제, 방지 또는 역전한다.

또한, 추가 화합물이 pK 약 5의 생체적합성 산 완충제인 상기 제제가 제공된다.

바람직하게는, 완충제 존재시, 용액의 pH는 약 3.0 초과 약 7.5 미만 또는 7.5이다. 바람직한 산 완충제는 시트레이트, 아세테이트 또는 2-(N-모르폴리노)에 탄술폰산(MES)이다.

상기 제제에서, 산 완충제는 바람직하게는 약 25 mM 농도의 시트레이트이다. 완충제는 부형제 및 부피형성제(bulking agent)인 글리신으로 바람직하게는 약 50 mg/ml의 농도로 보충될 수 있다. 완충제는 시트레이트 및 아세테이트를 포함할 수 있고, 또한 트리스를 포함할 수 있다.

바람직한 한 실시태양에서, 상기 제제는 (1) 상기 펩티드, 캡핑된 펩티드 또는 유사체, (ii) 시트레이트 약 50 mM, 및 (iii) 글리신 약 50 mg/ml을 포함한다.

제제의 바람직한 실시태양은 2 mL의 pH 5.0 용액으로부터 동결 건조된, 상기 펩티드, 캡핑된 펩티드, 염 또는 유사체 100 mg, 시트레이트 50 mM, 글리신 50 mg/ml을 갖는 동결 건조된 형태로 용기 또는 바이알 안에 넣어진다.

상기 제제는 1 개 이상의 환원제를 더 포함할 수 있고, 바람직한 환원제는 디티오트레이톨 β-메르캅토에탄올, 또는 글루타티온이다. 바람직하게는, 환원제 또는 환원제들의 농도는 약 10 mM을 넘지 않는다.

상기 제제는 비-티올 생체적합성 항산화제를 포함할 수 있다.

상기 제제는 동결건조 보호량으로 존재하는, 예를 들어 약 50 - 600 몰 동결건조 보호제 : 1 몰 펩티드의 비로 존재하는 동결건조 보호제를 포함할 수 있다. 동결건조보호제는 1 개 이상의 당, 1 개 이상의 아미노산, 1 개 이상의 메틸아민, 1 개 이상의 유방향성(lyotropic) 염, 및/또는 1 개 이상의 폴리올이다. 상기 바람직한 제제에서, (a) 당은 수크로스 또는 트레할로스이고, (b) 아미노산은 모노소 듐 글루타메이트 또는 히스티딘이고, (c) 메틸아민은 베타인이고, (d) 유방향성 염은 황산마그네슘이고, (e) 폴리올은 3 가 이상의 당 알콜이다.

상기 제제는 글리세린, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨, 만니톨, 프로필렌 글리콜 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 개 이상의 폴리올을 포함할 수 있다. 한 제제에서, 동결건조보호제는 비환원 당, 바람직하게는 트레할로스 또는 수크로스이다.

상기한 모든 제제에서, 펩티드는 바람직하게는 그의 N- 및 C-말단이 캡핑되고, 가장 바람직하게는 N-말단 캡은 아실기이고, C-말단 캡은 아미드기이어서, 펩티드가 CO-NH₂로 종결한다.

상기 제제는 바람직하게는 멸균성이고, 생체내 투여용으로 제제화된다.

본 발명은

(a) 상기 제제를 용액으로 또는 동결건조된 형태로 함유하는 용기;

(b) 임의로, 동결건조된 제제를 위한 희석제 또는 재구성 용액을 함유하는 제 2 용기;

(c) 임의로, (i) 용액 사용 또는 (ii) 동결건조된 제제의 재구성 및/또는 사용에 관한 설명서

를 포함하는 제조 물품 또는 키트를 포함한다.

이 물품 또는 키트는 (i) 다른 완충제, (ii) 희석제, (iii) 필터, (iv) 니들, 또는 (v) 시린지 중 1 개 이상을 더 포함할 수 있다. 용기는 바람직하게는 병, 바이알, 시린지 또는 시험관이고; 그것은 다회용 용기일 수 있다. 제제는 바람직하게는 동결건조된다.

본 발명은 펩티드, 유사체 또는 염이 항혈관신생 유효량으로 투여되도록 상기 제제를 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 혈관신생 억제 방법에 관한 것이다. 이러한 혈관신생 억제는 암 및 크론병의 치료 방법에 이용된다. 본 발명은 암 또는 크론병 치료와 같이 원하지 않은 혈관신생을 억제하기 위해 대상자에게 투여하기 위한 의약에서의 상기 조성물의 용도를 제공한다. 또한, 원하지 않은 혈관신생을 억제하고 따라서 암 및 크론병을 치료하기 위해 대상자에게 투여하기 위한 의약 제조에 있어서의 상기 조성물의 용도도 포함된다.

바람직한 실시태양에 대한 설명

본 발명자들은 Cys 함유 펩티드 PHSCN, 가장 바람직하게는 말단이 캡핑된 펜타펩티드 아세틸-PHSCN-NH₂ 및 그의 다양한 염, 및/또는 캡핑된 또는 캡핑되지 않은 PHSCN의 유사체 및 유도체 및 유사체의 염의 개선된 제제를 고안했다. 다양한 다른 캡핑 관능기는 아래에서 논의한다. PHSCN의 "유사체"는 구조적으로 및/또는 기능적으로 PHSCN과 실질적으로 유사한 천연 또는 비천연 분자를 의미한다. 예로는 보존적 아미노산 치환 변이체, 약 20 개 이하의 잔기의 첨가 변이체(천연 폴리펩티드 또는 그의 구조적 도메인을 제외함), 및 화학적으로 변형된 펩티드를 포함한다. 다른 유사체는 펩티드 모방체 및 앱타머(aptamer)이다.

제제화될 펩티드는 바람직하게는 순수하거나, 또는 본질적으로 순수하고, 바람직하게는 본질적으로 균질하다(즉, 오염 펩티드 또는 단백질 등이 없음). "본질적으로 순수한"은 펩티드가 조제물 총 중량을 기준으로 하여 90 중량％ 이상, 바람직하게는 95 중량％ 이상인 펩티드 조제물을 의미한다. "본질적으로 균질한" 조제물은 조제물 중의 펩티드 총 중량을 기준으로 하여 99 중량％ 이상의 펩티드를 포함하는 펩티드 조제물을 의미한다.

캡핑기

상기한 바와 같이, PHSCN 펩티드는 바람직하게는 그의 N 및 C 말단이 각각 아실("Ac"로 약기함) 및 아미도("Am"으로 약기함)기로, 예를 들어 N 말단은 아세틸(CH₃CO-), C 말단은 아미도(CO-NH₂)로 캡핑된다.

N-말단 캡핑기

넓은 범위의 N-말단 캡핑 관능기, 바람직하게는 말단 아미노기와의 연결부에서의 넓은 범위의 N-말단 캡핑 관능기가 고려되고, 예를 들어

포르밀;

C₁ _-10 알카노일, 예를 들어 아세틸, 프로피오닐, 부티릴;

C₁ _-10 알케노일, 예를 들어 헥스-3-에노일;

1 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 C₁ _-10 알키노일, 예를 들어 헥스-5-이노일;

아로일, 예를 들어 벤조일 또는 1-나프토일;

헤테로아로일, 예를 들어 3-피롤릴 또는 4-퀴놀로일

알킬술포닐, 예를 들어 메탄술포닐;

아릴술포닐, 예를 들어 벤젠술포닐 또는 술파닐릴;

헤테로아릴술포닐, 예를 들어 피리딘-4-술포닐;

C₁ _-10 치환 알카노일, 예를 들어 4-아미노부티릴;

C₁ _-10 치환 알케노일, 예를 들어 6-히드록시-헥스-3-에노일;

C₁ _-10 치환 알키노일, 예를 들어 3-히드록시-헥스-5-이노일;

치환 아로일, 예를 들어 4-클로로벤조일 또는 8-히드록시-나프트-2-오일;

치환 헤테로아로일, 예를 들어 2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로-3-메틸-퀴나졸린-6-오일;

치환 알킬술포닐, 예를 들어 2-아미노에탄술포닐;

치환 아릴술포닐, 예를 들어 5-디메틸아미노-1-나프탈렌술포닐;

치환 헤테로아릴술포닐, 예를 들어 1-메톡시-6-이소퀴놀린술포닐;

카르바모일 또는 티오카르바모일;

치환 카르바모일(R'-NH-CO) 또는 치환 티오카르바모일(R'-NH-CS)(여기서, R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 치환 알킬, 치환 알케닐, 치환 알키닐, 치환 아릴, 또는 치환 헤테로아릴임);

치환 카르바모일(R'-NH-CO) 및 치환 티오카르바모일(R'-NH-CS)(여기서, R'은 알카노일, 알케노일, 알키노일, 아로일, 헤테로아로일, 치환 알카노일, 치환 알케노일, 치환 알키노일, 치환 아로일, 또는 치환 헤테로아로일이고, 모두 위에서 정의됨).

C-말단 캡핑기

C-말단 캡핑 관능기는 말단 카르복실과 아미드 또는 에스테르 결합일 수 있다. 아미드 결합을 제공하는 캡핑 관능기는 NR¹R² 로 나타내고, 여기서, R¹ 및 R²는 독립적으로 다음 기로부터 택한다:

수소;

C₁ _-10 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, 이소프로필;

C₁ _-10 알케닐, 예를 들어 프로프-2-에닐;

C₁ _-10 알키닐, 예를 들어 프로프-2-이닐;

C₁ _-10 치환 알킬, 예를 들어 히드록시알킬, 알콕시알킬, 메르캅토알킬, 알킬티오알킬, 할로게노알킬, 시아노알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 디알킬아미노알킬, 알카노일알킬, 카르복시알킬, 카르바모일알킬;

C₁ _-10 치환 알케닐, 예를 들어 히드록시알케닐, 알콕시알케닐, 메르캅토알케닐, 알킬티오알케닐, 할로게노알케닐, 시아노알케닐, 아미노알케닐, 알킬아미노알케닐, 디알킬아미노알케닐, 알카노일알케닐, 카르복시알케닐, 카르바모일알케닐;

C₁ _-10 치환 알키닐, 예를 들어 히드록시알키닐, 알콕시알키닐, 메르캅토알키닐, 알킬티오알키닐, 할로게노알키닐, 시아노알키닐, 아미노알키닐, 알킬아미노알키닐, 디알킬아미노알키닐, 알카노일알키닐, 카르복시알키닐, 카르바모일알키닐;

C₁ _-10 아로일알킬, 예를 들어 펜아실 또는 2-벤조일에틸;

아릴, 예를 들어 펜틸 또는 1-나프틸;

헤테로아릴, 예를 들어 4-퀴놀릴;

C₁ _-10 알카노일, 예를 들어 아세틸 또는 부티릴;

아로일, 예를 들어 벤조일;

헤테로아로일, 예를 들어 3-퀴놀로일;

OR' 또는 NR'R" (여기서, R' 및 R"은 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아실, 아로일, 술포닐, 술피닐, 또는 SO₂-R'" 또는 SO-R'"(여기서, R'"은 치환 또는 비치환 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알케닐 또는 알키닐임).

에스테르 결합을 제공하는 캡핑 관능기는 OR(여기서, R은 알콕시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 아랄킬옥시, 헤테로아랄킬옥시, 치환 알콕시, 치환 아릴옥시, 치환 헤테로아릴옥시, 치환 아랄킬옥시, 또는 치환 헤테로아랄킬옥시일 수 있음)로 나타낸다.

N-말단 또는 C-말단 캡핑 관능기 또는 양자 모두는 캡핑된 분자가 활성 약물을 방출하기 위해 체내에서 자발적 또는 효소적 형질전환을 겪고 모 약물 분자에 비해 개선된 전달 성질을 갖는 전구약물(모 약물 분자의 약물할적 불활성 유도체)로서 기능하는 구조일 수 있다(번드가드 에이취.(Bundgaard H) 편집: Design of Prodrugs, Elsevier, 암스테르담,1985).

캡핑기의 판단이 적절한 선택은 펩티드에 다른 활성의 첨가를 허용한다. 예를 들어, N- 또는 C-말단 캡에 연결된 술프히드릴기의 존재는 유도체화된 펩티드가 다른 분자와 컨쥬게이션할 수 있게 한다.

"동결건조 보호제"는 관심 단백질 또는 펩티드와 조합될 때 동결건조 및 후속 보관시 단백질 또는 펩티드의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 유의하게 방지 또는 감소하는 분자이다. 예시적인 동결건조 보호제는 수크로스 또는 트레할로스와 같은 당; 모노소듐 글루타메이트 또는 히스티딘과 같은 아미노산; 베타인과 같은 메틸아민; 황산마그네슘과 같은 유방향성 염; 3가 이상의 당 알콜, 예를 들어 글리세린, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨과 같은 폴리올; 프로필렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉스(pluronics); 및 이들의 조합을 포함한다. 바람직한 동결건조 보호제는 비환원 당, 예를 들어 트레할로스 또는 수크로스이다. 동결건조 보호제는 동결건조 보호량으로 사전 동결건조된 제제에 첨가되고, 이것은 펩티드의 동결건조 후 동결건조 보호량의 동결건조 보호제 존재 하에서 펩티드가 동결건조 및 보관시 그의 물리적 및 화학적 안정성 및 완전성을 완전히 보유하는 것을 의미한다.

관심 "희석제"는 제약학적으로 허용되고(사람에게 투여하기 위해 안전하고 비독성이고) 재구성된 제제의 조제에 유용한 것이다. 예시적인 희석제는 멸균수, 주사용 정균수(BWFI), pH 완충 용액(예: 인산염 완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.

"방부제"는 재구성된 제제에서 세균 작용을 본질적으로 감소시키기 위해 희석제에 첨가할 수 있는 화합물이고, 따라서 예를 들어 다회용의 재구성된 제제의 제조를 촉진한다. 잠재적 방부제의 예는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤잘코늄 클로라이드(알킬기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물) 및 벤즈에토늄 클로라이드를 포함한다. 다른 유형의 방부제는 방향족 알콜, 예를 들어 페놀, 부틸 및 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올, 및 m-크레졸을 포함한다. 본원에서 가장 바람직한 방부제는 벤질 알콜이다.

"부피형성제"는 동결건조된 혼합물에 질량을 첨가하여 동결건조된 케이크의 물리적 구조에 기여하는(예: 열린 기공 구조를 유지하는 본질적으로 균일한 동결건조된 케이크의 제조를 촉진함) 화합물이다. 예시적인 부피형성제는 만니톨, 글리신, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비톨을 포함한다.

본 발명의 제제의 한가지 중요한 목적은 이들 펩티드 또는 유사체를 자발적 이량체화에 대해서 안정화시키는 것이다. 이것은 바람직하게는 2 개의 Cys 잔기 사이에 디술파이드 결합 형성을 방지하는 낮은 pH에서 펩티드를 제제화함으로써 달성된다. 이러한 산 완충제는 바람직하게는 생체적합성이다. 예로는 시트레이트, 아세테이트, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES), 또는 완충제 존재 하에서 용액의 pH가 ≤ 7.5, 하지만 바람직하게는 약 3.0 이상인 pK 약 5의 어떠한 유사한 완충제라도 포함한다. 바람직한 산성 제제는 시트레이트, 바람직하게는 약 25 mM의 시트레이트를 포함한다. 완충제는 바람직하게는 부형제 및 부피형성제인 글리신(Gly)으로 보충된다. 바람직한 농도는 약 50 mg/ml Gly이다. Gly의 다른 이점은 그것이 사람에게 정맥내 주입 또는 주사를 위해 승인된 부형제라는 것이다.

다른 아미노산 또는 화합물을 Gly 대신에 사용할 수 있다. 바람직한 산 또는 조합의 예는 시트레이트 + 아세테이트, 아세테이트 및 트리스, 및 기타 등등이다. 목표는 펩티드가 동결건조된 형태로 있을 때 pH를 낮게 유지시키는 것이다. 이렇게 함으로써, 동결건조된 분말은 물과 함께 재구성된다.

본 발명은 동결건조된 조성물 이외에, 치료 활성 화합물로서의 효과성이 액체 제제로 보관하는 동안 이량체화 및 더 높은 차수의 올리고머화, 응집 등의 결과로 보통 손상되는 본원에 게재된 바람직하게는 캡핑된 펩티드를 포함하는 안정화된 액체 제약 조성물을 포함한다. 안정화된 액체 제약 조성물은 보관하는 동안 응집체 생성을 감소시키기에 충분한 양의 아미노산 염기를 포함하고, 여기서 아미노산 염기는 아미노산 또는 아미노산의 조합이고, 주어진 아미노산이 어느 것이든 그것은 유리 염기 형태로 또는 그의 염 형태로 존재한다. 이 조성물은 액체 조성물의 pH를 펩티드의 안정성을 위해 허용되는 범위 내로 유지시키는 완충제를 포함하는 것으로 이해되고, 여기서 완충제는 염 형태가 실질적으로 없는 산, 그의 염 형태의 산, 또는 산 및 그의 염 형태의 혼합물이다. 아미노산 염기는 액체 제약 조성물을 보관하는 동안 응집체 형성에 대해 펩티드를 안정화시키는 기능을 하고 한편 산 완충제(그의 형태 중 어느 하나)의 사용으로 거의 등장성인 삼투 농도를 갖는 액체 조성물이 얻어진다. 액체 제약 조성물은 펩티드의 안정성을 더 증가시키기 위해 추가로 다른 안정화제, 더 특히 메티오닌, 비이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트 80, 및 EDTA를 혼입할 수 있다. 이러한 액체 제약 조성물은 염 형태가 실질적으로 없는 산, 염 형태의 산, 또는 산 및 그의 염 형태의 혼합물과 조합한 아미노산 염기의 첨가가 이들 두 성분의 조합의 부재 하에서 제제화된 액체 조성물에 비해 보관 안정성을 증가시키기 때문에 안정화된 것이라고 말한다. 액체 제약 조성물 중의 펩티드의 안정성을 증가시키는(그리고 이러한 조성물의 보관 안정성을 증가시키는) 방법은 보관하는 동안 폴리펩티드의 응집체 생성을 감소시키기에 충분한 양의 아미노산 염기, 및 염 형태가 실질적으로 없는 산, 염 형태의 산, 또는 산 및 염 형태의 혼합물인 완충제를 액체 조성물에 혼입하는 것을 포함한다.

Ac-PHSCN-NH₂의 산 부가 염(상기 터난스키 등의 문헌 참조)은 유기산 및 무기산으로부터 생성될 수 있다. 예시적인 유기산은 일반적으로 카르복실산 및 술폰산, 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 시클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 글리콜산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 1,2-에탄-디술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 벤젠술폰산, 푸마르산, 옥살산, 락트산, 4-클로로벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 4-톨루엔술폰산, 캄포르술폰산, 4-메틸바이시클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, t-부틸아세트산, 라우릴황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산 및 무콘산을 포함한다. 다른 유기산도 당업계 숙련자에게는 알려져 있다. 몇몇 실시태양에서, Ac-PHSCN-NH₂의 산 부가 염은 메탄술폰산, 아세트산, 글리콜산, (+)-캄포르술폰산, 만델산, 살리시클산, 숙신산 또는 이들의 조합으로부터 생성된다.

예시적인 무기산은 불화수소산, 과염소산, 염산, 브롬화수소산, 질산, 인산, 아인산, 요오드화수소산, 염소산, 티오시안산, 차인산, 아질산, 시안산, 크롬산, 아황산, 아인산 또는 히드라조산을 포함한다. 다른 무기산은 당업계 숙련자에게 알려져 있다. 몇몇 실시태양에서, Ac-PHSCN-NH₂의 산 부가 염은 브롬화수소산, 질산, 염산, 인산 또는 이들의 조합으로부터 생성된다. 다른 실시태양에서, Ac-PHSCN-NH₂의 산 부가 염은 염산으로부터 생성된다.

일반적으로, Ac-PHSCN-NH₂의 산 부가 염은 당업계 숙련자에게 알려진 어떠한 통상의 방법으로도 제조할 수 있다. 이들 방법은 Ac-PHSCN-NH₂의 용액을 기체 산으로 포화하거나, 산의 용액을 Ac-PHSCN-NH₂의 용액에 첨가하거나, 또는 기타 등등을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, Ac-PHSCN-NH₂의 산 부가 염은 증류수에 용해된 Ac-PHSCN-NH₂의 용액에 1 당량을 약간 초과하는 양(예: 1.05 당량)의 산을 첨가함으로써 제조한다. 산 부가 염은 전형적으로 수성 혼합물로부터 고체로서 단리된다.

일반적으로, Ac-PHSCN-NH₂의 산 부가 염은 고체상 및 용액상 둘 모두에서 유리 염기보다 상당히 더 안정할 수 있다. 산 부가 염은 시스테인에 의해 중개되는 Ac-PHSCN-NH₂의 산화성 이량체화를 방지하는 것으로 믿어진다. Ac-PHSCN-NH₂의 열화를 방지하는 산 부가 염은 예를 들어 메탄술폰산, 아세트산, 글리콜산, 황산, (+)-캄포르술폰산, 만델산, 살리시클산, 숙신산, 브롬화수소산, 염산, 질산 및 인산으로부터 생성된다.

본 발명의 제제는 바람직하게는 낮은 농도, 바람직하게는 약 10 mM을 초과하지 않는 농도의 디티오트레이톨(DTT), β-메르캅토에탄올, 글루타티온(GSH) 또는 다른 Cys 함유 환원제와 같은 1 개 이상의 환원제를 포함한다. 생체적합성이 있는 금속 결합 화합물(EDTA, EGTA)과 같은 항산화제를 함유하는 다른 비-티올도 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 한 실시태양은 비경구 주사 후 펩티드의 반감기를 증가시키는 제제에 관한 것이다. 이들의 예는 시클로덱스트린, 크레마포르 또는 리포좀 제제를 갖는 Ac-PHSCN-NH₂의 제제를 포함한다.

"시클로덱스트린"은 아밀로스에서처럼 α-연결에 의해 1,4 위치에서 연결된 6 개 이상의 α-D-글루코피라노스 단위를 함유하는 시클릭 분자를 의미한다. β-시클로덱스트린 또는 시클로헵타아밀로스는 7 개의 α-D-글루코피라노스 단위를 함유한다. 본 명세서에서 사용되는 "시클로덱스트린"이라는 용어는 또한 히드록시프로필 및 술포부틸 에테르 시클로덱스트린과 같은 시클로덱스트린 유도체를 포함한다. 이러한 유도체는 예를 들어 미국 특허 4,727,064 및 5,376,645에 기재되어 있다. 바람직한 한 시클로덱스트린은 푸리에르 변환 적외선 분광법에 의해 측정되는 치환 정도가 약 4.1 - 5.1인 히드록시프로필 β-시클로덱스트린(HβCD)이다. 이러한 시클로덱스트린은 세레스타(Cerestar)(미국 인디애나주 함몬드)로부터 캐비트론 82003(등록상표)(Cavitron 82003™)이라는 상표명으로 입수가능하다.

한 바람직한 실시태양에서, Ac-PHSCN-NH₂ 또는 유도체는 시클로덱스트린을 함유하는 수용액에서 제제화된다. 다른 한 실시태양에서, 본 발명의 펩티드는 시클로덱스트린을 함유하는 동결건조된 분말로서 또는 시클로덱스트린을 함유하는 멸균 분말로서 제제화된다. 바람직하게는, 시클로덱스트린은 (HβCD) 또는 술포부틸 에테르 β-시클로덱스트린이고, 더 바람직하게는 시클로덱스트린은 히드록시프로필-β-시클로덱스트린이다. 전형적으로, 주사용액에서, 시클로덱스트린은 제제의 약 1 - 25 중량％, 바람직하게는 약 2 - 10 중량％, 더 바람직하게는 약 4 - 6 중량％를 포함할 것이다. 추가로, 시클로덱스트린 대 펩티드의 중량비는 바람직하게는 약 1:1 내지 약 10:1일 것이다.

본 발명의 다른 한 실시태양에서 Ac-PHSCN-NH₂ 또는 그의 유도체는 펩티드가 경구 또는 비내 생체이용성을 갖도록 제제화된다.

본 발명의 제제 중의 다른 유용한 성분은 안정화제로서 작용할 수 있고 벌크 분말이 케이크를 생성하는 것을 추가로 돕는 만니톨과 같은 폴리올을 포함한다. 바람직하게는, 폴리올은 3 개 이상의 히드록실기를 가지고, 2 개 이상의 폴리올의 혼합물의 형태일 수 있다.

생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균성이어야 한다. 이것은 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 별법으로, 전체 혼합물의 멸균은 예를 들어 펩티드 첨가 전에 성분들을 약 120 ℃에서 약 30분 동안 오토클레이브함으로써 달성할 수 있다.

펩티드, 동결건조 보호제 및 다른 임의 성분을 함께 혼합한 후, 제제를 동결건조한다. 이 목적으로는 Hull50(등록상표)(Hull50™)(Hull, 미국) 또는 GT20(등록상표)(GT20™)(레이볼드-헤라에우스(Leybold-Heraeus), 독일) 냉동 건조기와 같은 많은 상이한 냉동 드라이버를 이용할 수 있다. 냉동 건조는 제제를 냉동하고 이어서 1차 건조에 적당한 온도에서 냉동된 내용물로부터 얼음을 승화시킴으로써 달성된다. 이 조건 하에서 생성물 온도는 제제의 공융점 또는 붕괴 온도보다 낮다. 전형적으로, 1차 건조의 저장온도는 전형적으로 약 50 내지 250 mTorr 범위의 적당한 압력에서 약 -30 내지 25 ℃의 범위일 것이다(다만, 생성물은 1 차 건조 동안 냉동된 채로 있음). 제제, 크기 및 샘플을 담는 용기의 유형 (예: 유리 바이알) 및 액체 부피가 주로 건조에 요구되는 시간을 지시할 것이고, 이것은 수 시간 내지 수 일의 범위일 수 있다(예: 40 - 60 시간). 2차 건조 스테이지는 용기의 유형 및 크기 및 펩티드의 성질에 주로 의존해서 약 0 - 40 ℃에서 수행할 수 있다. 예를 들어, 동결건조의 전체 물 제거기 전반에 걸쳐서 저장온도는 약 15 - 30 ℃(예: 약 20 ℃)일 수 있다. 2 차 건조에 요구되는 시간 및 압력은 예를 들어 온도 및 다른 변수에 의존해서 적당한 동결건조된 케이크를 생성하는 것일 것이다. 2차 건조 시간은 생성물 중의 원하는 잔류 수분 수준에 의해 지시되고, 전형적으로 약 5 시간 이상이 걸린다(예: 10 -15 시간). 압력은 1차 건조 단계 동안에 사용된 압력과 동일할 수 있다. 냉동 건조 조건은 제제 및 바이알 크기에 의존해서 달라질 수 있다.

몇몇 경우, 이송 단계를 피하기 위해 펩티드의 재구성이 수행될 용기에서 펩티드 제제를 동결건조하는 것이 바람직할 수 있다. 이 경우, 용기는 예를 들어 3, 5, 10, 20, 50 또는 100 cc 바이알일 수 있다.

일반적으로 진술하면, 동결건조를 하면 수분 함량이 약 5％ 미만, 바람직하게는 약 3％ 미만인 동결건조된 제제가 얻어질 것이다.

동결건조된 제제의 재구성

원하는 스테이지에서, 전형적으로는 펩티드를 환자에게 투여할 시점일 때, 동결건조된 제제는 재구성된 제제 중의 펩티드 농도가 10 mg/mL 이상, 예를 들어 약 10 mg/mL 내지 약 1000 mg/mL, 더 바람직하게는 약 50 mg/mL 내지 약 500 mg/mL, 가장 바람직하게는 약 100 mg/mL 내지 약 500 mg/mL가 되도록 희석제로 재구성될 수 있다. 재구성된 제제 중의 이러한 높은 펩티드 농도는 재구성된 제제의 피하 전달이 의도되는 경우 특히 유용한 것으로 여겨진다. 그러나, 정맥내(i.v.) 투여와 같은 다른 투여 경로의 경우, 재구성된 제제 중의 펩티드의 농도가 더 낮을 것이 요망될 수 있다(예를 들어, 재구성된 제제 중의 약 1 - 100 mg/mL, 또는 약 5 - 50 mg/mL 펩티드). 몇몇 실시태양에서, 재구성된 제제의 펩티드 농도는 사전 동결건조된 제제의 펩티드 농도보다 유의하게 더 높다. 예를 들어, 재구성된 제제 중의 펩티드 농도는 사전 동결건조된 제제의 펩티드 농도의 약 2 - 40 배, 바람직하게는 3 - 10 배, 가장 바람직하게는 3 - 6 배(예: 3 배 이상 또는 4 배 이상)일 수 있다.

재구성은 완전 수화를 보장하기 위해 일반적으로 약 25 ℃의 온도에서 일어나지만, 원한다면 다른 온도도 이용할 수 있다. 재구성에 필요한 시간은 예를 들어 희석제의 유형, 부형제(들)의 양 및 펩티드에 의존할 것이다. 예시적인 희석제는 멸균수, 주사용 정균수(BWFI), pH 완충액(예: 인산염 완충 염수, PBS), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 희석제는 임의로 방부제를 함유한다. 예시적인 방부제는 상기한 바와 같고, 벤질 또는 페놀 알콜과 같은 방향족 알콜이 바람직한 방부제이다. 사용되는 방부제의 양은 펩티드와의 상용성 및 방부제 효능 시험을 위해 상이한 방부제 농도를 사정함으로써 결정한다. 예를 들어, 방부제가 방향족 알콜(예: 벤질 알콜)이면, 약 0.1 - 2.0 ％, 바람직하게는 약 0.5 - 1.5％, 하지만 가장 바람직하게는 약 1.0 - 1.2％의 양으로 존재할 수 있다.

바람직하게는, 재구성된 제제는 바이알 당 6000개 미만의 ≥10 ㎛의 크기를 갖는 입자를 갖는다.

제조 물품

본 발명의 다른 한 실시태양에서는, 본 발명의 동결건조된 제제를 함유하고 재구성 및/또는 사용을 위한 설명서를 제공하는 제조 물품이 제공된다. 이 제조 물품은 용기를 포함한다. 적당한 용기는 예를 들어 병, 바이알(예: 이중 챔버 바이알), 시린지(예: 이중 챔버 시린지) 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 동결건조된 제제를 담고, 용기 상의 또는 용기와 연관된 라벨은 재구성 및/또는 사용에 관한 지시를 표시할 수 있다. 예를 들어, 라벨은 동결건조된 제제를 상기한 펩티드 농도로 재구성한다는 것을 표시할 수 있다. 라벨은 제제가 피하 투여에 유용하다거나 또는 피하 투여를 위한 것으로 의도된 것이라는 것을 추가로 표시할 수 있다. 제제를 담는 용기는 재구성된 제제의 반복 투여(예: 2 - 6 회 투여)를 허용하는 다회용 바이알일 수 있다. 제조 물품은 적당한 희석제(예: BWFI)를 포함하는 제 2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 희석제 및 동결건조된 제제의 혼합시, 재구성된 제제 중의 최종 단백질 농도는 일반적으로 50 mg/mL 이상일 것이다. 제조 물품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 니들, 시린지, 및 사용에 관한 설명이 있는 패키지 인서트를 포함하는 상업적 및 사용자 관점에서 요망되는 다른 물질을 더 포함할 수 있다.

치료 키트는 Ac-PHSCN-NH₂ 제약 조성물의 제제를 다른 성분들(예: 다른 화합물 또는 이들 다른 화합물의 제약 조성물)과 함께 또는 다른 성분들 없이 함유하는 단일 용기를 가질 수 있거나, 또는 각 성분에 대해 다른 용기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 치료 키트는 제 2 화합물(예를 들어, 화학치료제, 천연 생성물, 호르몬 또는 길항제, 항혈관신생 작용제 또는 억제제, 세포사멸 유발제 또는 킬레이트제) 또는 그의 제약 조성물의 동시 투여와 함께 사용하기 위해 패키징된 본원에 게재된 Ac-PHSCN-NH₂ 또는 그의 산 부가 염의 제제를 포함한다. 키트의 성분은 사전 복합될 수 있거나, 또는 각 성분을 환자에게 투여하기 전에 별도의 상이한 용기에 있을 수 있다. 키트의 성분은 1 개 이상의 액체 용액, 바람직하게는 수용액, 더 바람직하게는 멸균 수용액으로 제공될 수 있다. 키트의 성분은 또한 바람직하게는 다른 별개의 용기에 제공되고 적당한 용매의 첨가에 의해 액체로 전환될 수 있는 고체로서 제공될 수 있다.

치료 키트의 용기는 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 시린지, 또는 고체 또는 액체를 봉입하는 다른 어떠한 수단이라도 될 수 있다. 보통, 1 개 초과의 화합물이 있을 때, 키트는 별도의 투여를 허용하는 제 2 바이알 또는 다른 용기를 함유할 것이다. 키트는 또한 제약학적으로 허용되는 액체를 위한 다른 한 용기를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 치료 키트는 본 발명의 키트의 성분들인 본 발명의 작용제의 투여를 가능하게 하는 장치(예: 1 개 이상의 니들, 시린지, 아이드로퍼, 피펫 등)를 함유할 것이다.

본 발명의 제제는 경구(장내), 피하, 근육내, 정맥내, 경피와 같은 허용되는 어떠한 경로로도 펩티드를 투여하기에 적당한 것이다. 투여는 주입 펌프에 의한 것일 수 있다. 터난스키 등의 상기 문헌에 기재된 모든 투여 방식 및 투여 경로는 본 발명의 제제에 유용한 것으로 이해되고, 이 문헌은 여기에 충분히 기재된 것처럼 전체를 본원에 참고로 혼압한다.

또한, 본 발명은 흡입 투여에 적당한 펩티드 제제에 관한 것이다. 현재 흡입에 의해 투여되는 많은 약물은 주로 호흡가능한 크기의 액체 또는 고체 에어로줄 입자로 주어진다. 생의학적 약물의 경우, 이들 의약 중 많은 의약이 장기간 동안 수성 환경에서 불안정하고, 건조 분말로 제공될 때 고전단 그라인딩 또는 다른 분쇄 방법에 의해 미세화되면 신속하게 변성되기 때문에 이것은 문제를 제기할 수 있다. 추가로, 이들 의약 중 많은 의약은 그들이 흡입 에어로졸로서 투여된 후 폐 환경으로부터 빨리 추출되기 때문에 폐에서 충분히 오랫동안 남아있지 못한다. 장치 및 용기 표면과 의약의 반응성의 결과로 또는 특히 고전단 에너지 집약적 분무 시스템(머멘테일러, 엠.(Mumenthaler, M) 등, Pharm. Res., 11:12-20(1994))에서 에어로졸화 동안 비활성화에 의해 유의한 약물 손실이 일어날 수 있다. 이러한 불안정성 문제를 극복하기 위해, 폴리(락티드-코-글리코리드)와 같은 생분해성 담체를 함유하는 많은 약물 및 부형제 시스템이 생의학적 단백질 및 펩티드를 위해 개발되어 왔다(류, 알.(Liu, R.) 등, Biotechnol. Bioeng.,37:177-184(1991)). 대부분의 치료용 펩티드는 침투 증진제와 함께 제제화될 때조차도 생물학적 막을 통한 흡수가 잘 일어나지 않는다. 많은 치료에서, 효능을 위해 요구되는 최소 전신 농도를 달성하기 위해 약물 용량이 10배 증가한다. 다른 경우, 약물 생성물은 흡수 배리어를 가로지르는 침투성을 개선하기 위해 외래 흡수 촉진제와 함께 제제화되고, 이것은 종종 독성 결과를 초래한다. 신체에 약물을 투여하는 방식은 또한 경구 및 비경구에서 경피, 직장 및 폐 투여 경로로, 즉 코 및 폐로 점차 확장되어 왔다. 이러한 약물 전달 접근의 성공은 어려운 질환, 예를 들어 감염, 악성 종양, 심혈관계, 내분비, 신경학적 질환 및 다양한 면역학적 손상 질환을 치료하는 데 이용될 수 있어야 하는 더 새롭고 복잡한 분자를 인정하지 않기 때문에 들쑥날쑥 혼잡하였다.

따라서, 본 발명은 안정하고, 속도 제한 담체에 의해 보호되고, 쉽게 제조되고, 유체 분산 입자로서 환자의 폐에 투여될 때 치료적으로 효과있는 펩티드(약물)를 포함하는 유체 추진 제제화 시스템의 존재를 이용한다. 상기한 바와 같이, 본 발명은 경구 또는 코 흡입용 펩티드 제제를 포함한다. 전체를 본원에 참고로 혼입하는 미국 특허 6,551,578에 게재된 바와 같이, 이러한 제제는 선택된 의약, 여기서는 펩티드와 연관되고 그것을 갖는 컨스트럭트의 일부를 형성할 수 있거나 또는 그것을 포획하고 느린 방출을 제공하는 폴리사카라이드 소낭을 포함하는 방출 조절 에어로졸 입자 및 호흡성 에어로졸 입자 의약을 포함하고, 하지만 이것에 제한되는 것은 아니다. 이 접근에서, 펩티드는 그것이 경구 및 코 흡입에 의한 투여에 적합하도록 제제화된다. 유체, 예를 들어 공기, 탄화수소 기체, 클로로플루오로카본(CFC) 추진제 EH는 비-CFC 추진제, 예를 들어 테트라플루오로에탄(HFA-134a) 및 헵타플루오로프로판(HFA-227) 중의 펩티드의 안정한 콜로이드성 분산물이 의도된다.

폐 내로의 흡입을 위해 의도된 본 발명의 제제의 목적상, 펩티드는 결합될 자연 발생 폴리사카라이드 중합체와 연관된다. 이 문맥에서 "연관" 또는 "연관된"이라는 용어는 펩티드가 폴리사카라이드 중합체와 함께 기질로서 또는 중합체 구조물의 일부로서 존재하거나 또는 폴리사카라이드 중합체 또는 폴리사카라이드 중합체 컨스트럭트 입자 중의 미소구체로서 캡슐화되거나 또는 이러한 입자의 표면 상에 있고, 이 경우 펩티드의 치료적 유효량 또는 분율(예: 95％ 이상)이 미립자이다. 전형적으로, 컨스트럭트 입자는 입자가 치료받는 환자의 호흡기도 및/또는 폐에 흡입될 수 있도록 하기 위해 약 10 ㎛ 미만, 바람직하게는 약 5 ㎛ 미만의 직경을 갖는다.

적당한 중합체 컨스트럭트는 선택된 펩티드를 안에 혼입하거나 또는 캡슐화하고 그로부터 환자 신체의 작용 또는 적용 부위로, 예를 들어 폐로부터 대상자의 국부 주변 환경으로의 의약의 조절된 또는 조정된 방출을 제공하는 것이다.

적당한 폴리사카라이드는 양이온이 예를 들어 Li⁺, Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, NH³ ⁺, NH⁴ ⁺ 등인 알기네이트염, 예를 들어 소듐 알기네이트, 칼슘 알기네이트, 소듐-칼슘 알기네이트, 암모늄 알기네이트, 소듐-암모늄 알기네이트, 또는 칼슘-암모늄 알기네이트의 군으로부터 선택되는 중합체이다. 바람직한 알기네이트 조정 방출제는 암모늄 칼슘 알기네이트이다. 이들 물질은 전형적으로 조절된 방출을 위한 주사가능 이식물 및 미소구체 조제물에 이용된다. 암모늄 칼슘 알기네이트의 상업적 형태는 인터내셔날 스페셜티 프로덕츠(International Specialty Products; 미국 뉴저지주 웨인)에 의해 제조 및 분배되는 켈토스(등록상표)(Keltose™)이다. 본원에서 사용되는 "알기네이트"는 알긴산 또는 그의 염; 또는 다른 자연 발생 폴리사카라이드 또는 탄수화물 기반 중합체, 예를 들어 아라비아검, 펙틴, 갈락투론산, 카라야검; 벤자민 검, 플란타고 오바타 검; 아가; 카라기난; 셀룰로오스; 젤라틴; 또는 상기 중합체의 혼합물을 의미한다. 알기네이트는 다양한 잘 문서화된 제약 시스템의 제조에 이용되는(미국 특허 6,166084, 6,166,043, 6,166,042, 6,166,004; 및 6,165,615) 안전하다고 일반적으로 여겨지는 제약 부형제이다. 알기네이트는 폴리사카라이드 사슬을 포함하는 자연 발생 중합체이다. 이들 중합체는 물을 흡수해서 팽윤되어 용액 중에서 겔 유사 구조가 되는 성향을 갖는다. 얻은 코어 제제를 치료받는 환자가 흡입할 때, 겔은 이 환자의 체내에서 용해됨으로써 용해 조절 방식으로 그의 약물 페이로드(payload)를 방출한다. 이러한 중합체 시스템은 선택된 의약 또는 의약들과 현장에서 생성될 때 컨스트럭트 또는 기질을 생성하고, 이렇게 함으로써 이 의약 또는 의약들은 기질의 일부를 형성하거나 또는 기질 내에 캡슐화된다. 이러한 제제화 또는 캡슐화시, 의약은 체내의 작용 부위, 예를 들어 폐, 호흡기도, 귀 등으로부터 대상자 신체의 주변 환경 또는 조직으로 경시 방출되거나, 또는 조정된다. 폴리사카라이드 중합체, 예를 들어 알기네이트염은 전형적으로 얻은 제어 방출 제제에 제제의 총 중량의 약 0.000001 중량％ 내지 약 10 중량％의 범위의 양으로 존재한다.

치료 펩티드는 본 발명의 중합체 컨스트럭트에 치료적 유효량, 즉 펩티드가 경구 또는 코 흡입에 의해 분산 에어로졸과 같은 에어로졸 제제에 혼입될 수 있고 바람직하게는 1 회 용량으로, 또는 수 회 용량으로 원하는 치료 효과를 일으킬 수 있는 양으로 존재한다.

다중층 또는 단일층 리포좀의 사용을 포함하는 연장된 투여를 위한 다른 제제도 또한 고려되고, 그의 제조는 당업계 숙련자에게 잘 알려져 있다. 리포좀은 인지질 또는 비인지질 기반일 수 있다.

평가

당업계 숙련자는 본 명세서에 기재된 Ac-PHSCN-NH₂ 및 그의 염의 본 발명의 제제의 활성을 측정하는 데 유용한 시험관내 및 생체내 평가가 포괄적인 것이 아니라 예시적인 것이라는 점을 알 것이다. 이들은 예를 들어 상기 터난스키 등의 문헌 및 공동 양도된 공동 계류 중인 출원 USSN 10/074,225 및 10/661,784에서 찾을 수 있고, 이들 모두 전체를 본원에 참고로 혼입한다. 바람직한 평가의 예를 아래에 기재한다.

내피세포 이동에 대한 평가

EC 이동의 경우, 트랜스웰 당 200 μL의 콜라겐 용액을 첨가한 후 37 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션함으로써 트랜스웰을 제 I 형 콜라겐(50 ㎍/mL)으로 코팅한다. 트랜스웰들을 24-웰 플레이트에 조립하고, 화학유인제(예: FGF-2)를 저부 챔버에 총 부피 0.8 mL 배지에 첨가한다. 트립신을 이용해서 단층 배양물로부터 떼낸 사람 제대정맥혈관 내피세포(HUVEC)와 같은 EC를 무혈청 배지로 약 10 세포/mL의 최종 농도가 되도록 희석하고, 0.2 mL의 이 세포 현탁액을 각 트랜스웰의 상부 챔버에 첨가한다. Ac-PHSCN-NH₂의 염은 상부 및 하부 챔버 둘 모두에 첨가할 수 있고, 37 ℃에서 습한 분위기에서 5 시간 동안 이동이 진행하도록 둔다. 디프퀵(등록상표)(DIFFQUIK®)을 이용해서 염색된 플레이트로부터 트랜스웰을 제거한다. 상부 챔버를 면봉으로 긁어서 이동하지 않은 세포를 그로부터 제거하고, 막을 떼어내어 슬라이드 위에 올려 놓고, 고배율 시야(400X) 하에서 계수하여 이동한 세포 수를 결정한다.

항침입 활성에 대한 생물학적 평가

마트리겔(등록상표)(MATRIGEL®) 침입 평가 시스템으로 알려진 평가에서 EC 또는 종양 세포(예: PC-3 사람 전립선암종) 세포와 같은 세포가 재구성된 기저막(마트리겔(등록상표)(MATRIGEL®))을 통해 침입할 수 있는 능력은 당업계에 상세히 기재되어 있다(클레인만(Kleinman) 등, Biochemistry 1986,25:312-318; 패리쉬(Parish) 등, 1992, Int.J. Cancer 52:378-383). 마트리겔(등록상표)은 제 IV 형 콜라겐, 라미닌, bFGF와 결합해서 그것을 국지화하는 헤파란 술페이트 프로테오글리칸, 예를 들어 퍼레칸, 비트로넥틴 뿐만 아니라 형질전환 성장 인자-β(TGFβ), 유로키나제형 플라스미노겐 활성인자(uPA), 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA) 및 제 1 형 플라스미노겐 활성인자 억제제(PAI-1)이라고 알려진 세르핀을 함유하는 재구성된 기저막이다(챔버스(Chambers) 등, Canc. Res. 1995, 55:1578-1585). 당업계에서는 세포외 수용체 또는 효소를 겨냥하는 화합물들에 대해서 이 평가에서 얻은 결과가 생체내에서 이들 화합물의 효능을 예언하는 것임을 인정한다(래바니(Rabbani) 등, Int.J. Cancer 1995,63:840-845).

이러한 평가는 트랜스웰 조직 배양 인서트를 이용한다. 침입 세포는 폴리카르보네이트 막의 마트리겔(등록상표) 및 상부를 통해 횡단해서 막의 저부에 부착할 수 있는 세포로 정의된다. 폴리카르보네이트 막(8.0 ㎛ 기공 크기)을 함유하는 트랜스웰(코스타(COASTAR))을 멸균 PBS 중에 75 ㎍/mL의 최종 농도로 희석된 마트리겔(등록상표)(콜래보러티브 리서치(Collaborative Research))로 코팅하고(인서트 당 60 μL의 희석된 마트리겔(등록상표)), 24-웰 플레이트의 웰에 놓는다. 막을 생물학적 안전 캐비넷에서 하룻밤 동안 건조한 후 진탕 테이블 상에서 1 시간 동안 항생제를 함유하는 DMEM 100 μL를 첨가함으로써 재수화시킨다. 흡인에 의해 각 인서트로부터 DMEM을 제거하고, 0.8 mL의 DMEM/10％ FBS/항생제를 24-웰 플레이트의 각 웰에 그것이 트랜스웰의 외부("저부 챔버")를 둘러싸도록 첨가한다. 신선한 DMEM/항생제 100 μL, 사람 Glu-플라스미노겐 5 ㎍/mL 및 시험할 억제제를 트랜스웰의 꼭대기 내부("상부 챔버")에 첨가한다. 시험할 세포를 트립신 처리하고, DMEM/항생제에 재현탁한 후, 800,000 세포/mL의 최종 농도로 트랜스웰의 꼭대기 챔버에 첨가한다. 상부 챔버의 최종 부피를 200 μL로 조정한다. 이어서, 조립된 플레이트를 습한 5％ CO₂ 분위기에서 72 시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 세포를 고정하고, 디프퀵(등록상표)(기엠사 스테인(Giemsa stain))을 사용해서 염색한 후, 상부 챔버를 면봉을 사용해서 긁어서 마트리겔(등록상표) 및 막을 통해 침입하지 못한 세포를 제거한다. X-액토(등록상표)(X-ACTO®) 블레이드를 사용해서 트랜스웰로부터 막을 떼어내고, 퍼마운트(등록상표)(PERMOUNT^®) 및 커버 슬립을 사용해서 슬라이드 위에 마운팅한 후, 고배율 시야(400X) 하에서 계수한다. 침입된 세포의 평균은 계수된 5 - 10 개 시야로부터 결정하고, 펩티드 농도의 함수로 플롯팅한다.

항혈관신생 활성에 대한 관 형성 평가

내피 세포, 예를 들어 제조할 수 있거나 또는 상업적으로 입수할 수 있는 사람 제대정맥혈관 내피 세포 (HUVEC) 또는 사람 미세혈관 내피 세포 (HMVEC)를 2 X 10⁵세포/mL의 농도로 피브리노겐 (5 mg/mL, 인산염 완충 염수(PBS) 중에 1:1 (v/v)비)과 혼합한다. 트롬빈을 첨가하고(5 유닛/mL 최종 농도), 혼합물을 즉시 24-웰 플레이트에 옮긴다(0.5 mL/웰). 피브린 겔이 형성되도록 두고, 이어서 VEGF 및 bFGF를 시험 화합물과 함께 웰에 첨가한다(각각 5 ng/mL 최종 농도). 세포를 37 ℃에서 5％ CO₂에서 4일 동안 인큐베이션하고, 이 때 각 웰의 세포를 계수하고, 둥근 것, 분지가 없고 기다란 것, 1 개의 분지가 있고 기다란 것, 또는 2 개 이상의 분지가 있고 기다란 것으로 분류한다. 결과는 화합물의 각 농도에 대해 5 개의 상이한 웰의 평균으로 표현한다. 전형적으로, 혈관신생 억제제 존재 하에서 세포는 둥근 상태로 있거나 또는 미분화 관(예: 0 또는 1 개의 분지)을 형성한다. 당업계에서는 이 평가가 생체내에서의 혈관신생(또는 항혈관신생) 효능을 예언하는 것으로 인식되어 있다(민(Min) 등, Cancer Res. 1996, 56:2428-2433).

다른 평가에서는, 내피 세포가 마트리겔(등록상표) 상에서 배양될 때의 내피 세포 관 형성을 관찰한다(쉬냅퍼(Schnaper) 등, J. Cell. Physiol. 1995,165:107-118). 내피 세포(1 x 10⁴세포/웰)를 마트리겔(등록상표)로 코팅된 24-웰 플레이트 상으로 옮기고, 48 시간 후 관 형성을 정량화한다. 억제제를 그것을 내피 세포와 동시에 첨가하거나 또는 그 후에 다양한 시점에서 첨가함으로써 억제제를 시험한다. 또한, 관 형성은 (a) bFGF 또는 VEGF와 같은 혈관신생 성장 인자, (b) 분화 자극제(예: PMA) 또는 (c) 이들의 조합을 첨가함으로써 자극할 수 있다.

이론에 얽매이게 하고 싶지는 않지만, 이 평가는 내피 세포에 특별한 유형의 기저막, 즉 이동 및 분화하는 내피 세포가 처음 마주칠 것이라고 예상되는 기질의 층을 제공함으로써 혈관신생을 모방한다. 결합된 성장 인자 이외에, 마트리겔(등록상표)(및 기저막 현장에서) 발견되는 기질 성분 또는 그의 단백질 분해 생성물도 내피 세포 관 형성에 대해 자극을 줄 수 있고, 이로 인해 이 모델은 이전에 기재한 피브린 겔 혈관신생 모델에 대해 상보적인 것이 된다(블러드(Blood) 등, Biochim. Biophys. Acta 1990,1032:89-118; 오데드라트(Odedrat) 등, Pharmac. Ther.1991.49:111-124).

증식 억제에 대한 평가

본 발명의 화합물이 EC 증식을 억제하는 능력을 96-웰 포맷으로 결정할 수 있다. 제 I 형 콜라겐(젤라틴)을 사용해서 플레이트의 웰을 코팅한다(PBS 중의 0.1-1 mg/mL, 0.1 mL/웰, 실온에서 30 분 동안). 플레이트를 세척한 후(3 x w/PBS), 웰 당 3-6,000 세포를 플레이팅하고, 내피 성장 배지(EGM; 클론틱스(Clonetics)) 또는 0.1 - 2％ FBS를 함유하는 M199 배지에서 4 시간 동안(37℃/5％ CO₂) 부착하도록 둔다. 4 시간이 지났을 때 배지 및 부착되지 않은 세포를 제거하고, bFGF(1 - 10 ng/mL) 또는 VEGF (1 - 10 ng/mL)를 함유하는 신선한 배지를 각 웰에 첨가한다. 마지막으로 시험 화합물을 첨가하고, 플레이트를 24 - 48 시간 동안 인큐베이션(37 ℃/5％ CO₂)하도록 둔다. MTS (프로메가(Promega))를 각 웰에 첨가하고, 1 - 4 시간 동안 인큐베이션하도록 둔다. 이어서, 세포 수에 비례하는 490 nm에서의 흡광도를 측정해서 대조 웰과 시험 화합물 함유 웰 간의 증식의 차이를 결정한다.

배양된 부착성 종양 세포로 유사한 평가 시스템을 설정할 수 있다. 그러나, 이 포맷에서는 콜라겐이 생략될 수 있다. 종양 세포(예: 3,000 - 10,000/웰)를 플레이팅하고, 하룻밤 동안 부착하도록 둔다. 이어서, 웰에 무혈청 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 동기화한다. 이어서, 10％ FBS 함유 배지를 각 웰에 첨가하여 증식을 자극한다. 일부 웰에 시험 화합물을 포함시킨다. 24 시간 후, MTS를 플레이트에 첨가하고, 평가를 전개하고 상기한 바와 같이 판독한다.

캐스파제 -3 활성

본 발명의 화합물이 EC의 세포사멸을 촉진하는 능력은 캐스파제-3의 활성화를 측정함으로써 결정할 수 있다. 제 I 형 콜라겐(젤라틴)을 사용해서 P100 플레이트를 코팅하고, 5 x 10⁵ EC를 10％ FBS 함유 EGM에 시딩한다. 24 시간 후(37℃, 5％ CO₂), 배지를 2％ FBS, 10 ng/ml bFGF 및 원하는 시험 화합물을 함유하는 EGM으로 대체한다. 6 시간 후 세포를 수거하고, 1％ 트리톤에서 세포 용해물을 제조하고, 제조자 설명서에 따라서 엔즈첵(등록상표)(EnzChek®) 캐스파제-3 평가 키트 #1(몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes))를 사용하여 평가한다.

각막 혈관신생 모델

사용되는 프로토콜은 볼퍼트(Volpert) 등의 문헌(J. Clin. Invest. 1996, 98:671-679)에 기재된 것과 본질적으로 동일하다. 간략하게 말하면, 암컷 피셔 쥐(120 - 140 gm)를 마취하고, 히드론(등록상표)(Hydron®), bFGF 150 nM 및 시험 화합물로 이루어진 펠렛 (5 ㎕)를 각막에 윤부로부터 1.0 - 1.5 mm인 작은 절개부 안에 이식한다. 이식 후 5 일 및 7 일째에 신혈관화를 사정한다. 7 일째에, 동물들을 마취하고, 콜로이드성 카본과 같은 염료를 주입하여 혈관을 염색한다. 이어서, 동물을 안락사시키고, 각막을 포르말린으로 고정하고, 각막을 편평하게 해서 사진을 찍어서 신혈관화 정도를 사정한다. 총 혈관 면적 또는 길이를 이미지화하거나 또는 단순히 혈관을 계수하여 신혈관을 정량화한다.

마트리겔 (등록상표) 플러그 평가

이 평가는 본질적으로 파사니티(Passaniti) 등의 문헌(Lab 15 Invest. 67:519-528(1992))에 기재된 바와 같이 수행한다. 얼음으로 냉각된 마트리겔(등록상표) (예: 500 μL)(콜래보러티브 바이오메디칼 프로덕츠, 인크.(Collaborative Biomedical Products, Inc.), 미국 매사추세츠주 베드포드)를 헤파린(예: 50 ㎍/ml), FGF-2(예: 400 ng/ml) 및 시험 화합물과 혼합한다. 몇몇 평가에서, bFGF를 혈관신생 자극으로서 종양 세포로 대체할 수 있다. 마트리겔(등록상표) 혼합물을 생후 4 - 8 주 된 비흉선 누드 마우스에게 복부 중간선 부근 부위에 피하 주사하고, 바람직하게는 마우스 당 3 회 주사한다. 주사한 마트리겔(등록상표)은 만져서 알 수 있는 고체 겔을 형성한다. 주사 부위는 각 동물의 양성 대조 플러그(예: FGF-2 + 헤파린), 음성 대조 플러그(예: 완충제 + 헤파린) 및 혈관신생에 대한 효과에 대해 시험되는 화합물을 포함하는 플러그(예: FGF-2 + 헤파린 + 화합물)를 받도록 선택한다. 모든 처리는 바람직하게는 3개 1조로 수행한다. 주사 후 약 7 일째에 또는 혈관신생 관찰에 최적일 수 있는 다른 시점에서 경추 탈골로 동물을 희생시킨다. 복부 중간선을 따라서 마우스 피부를 떼어내고, 마트리겔(등록상표) 플러그를 회수하고, 즉시 고분해능으로 스캔한다. 이어서, 플러그를 물 중에 분산해서 37 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다. 제조자 설명서에 따라 드랩킨(Drabkin) 용액(예: 시그마(Sigma)로부터 얻음)을 이용해서 헤모글로빈(Hb) 수준을 결정한다. 플러그 중의 Hb의 양은 샘플 중의 혈액의 양을 반영하기 때문에 혈관신생의 간접 측정이다. 추가로, 또는 별법으로, 동물을 희생시키기 전에 형광체가 컨쥬게이트된 고분자량 덱스트란을 함유하는 완충제(바람직하게는 PBS) 0.1 ml를 주사할 수 있다. 형광 분석에 의해 결정된 분산된 플러그 중의 형광체의 양은 또한 플러그 중의 혈관신생에 대한 측정으로 이용된다. mAb 항-CD31(CD31은 "혈소판 내피 세포 부착 분자 또는 PECAM"임) 염색도 플러그 중의 신혈관 형성 및 미소혈관 밀도를 확인하는 데 이용할 수 있다.

CAM(병아리 융모요막) 혈관신생 평가

이 평가는 본질적으로 엔구옌(Nguyen) 등의 문헌(Microvascular Res. 1994,47:31-40)에 기재된 바와 같이 수행한다. 혈관신생 인자 (bFGF) 또는 종양 세포를 억제제와 함께 함유하는 메쉬를 생후 8일 된 병아리 배아의 CAM 상에 놓고, 샘플 이식 후 3 - 9 일 동안 CAM을 관찰한다. 메쉬 중의 혈관 함유 정사각형의 백분율을 결정함으로써 혈관신생을 정량화한다.

종양 세포를 이용한 마트리겔 (등록상표) 플러그 평가를 이용한 혈관신생 억제 및 항종양 효과에 대한 생체내 평가

이 평가에서는 상기 B 부분에 기재된 프로토콜에 따라서 종양 세포, 예를 들어 3LL 루이스 폐 암종 또는 쥐 전립선 세포주 MatLyLu의 1 - 5 x 10⁶ 세포를 마트리겔(등록상표)과 혼합하고, 이어서 마우스의 옆구리 안에 주사한다. 약 5 내지 7일 후에 플러그에서 종양 세포의 질량 및 강력한 혈관신생 반응을 관찰할 수 있다. 실제 종양 환경에서 화합물의 항종양 및 항혈관신생 작용은 그것을 플러그 안에 포함시킴으로써 평가할 수 있다. 이어서, 종양 중량, Hb 수준 또는 형광 수준(희생시키기 전에 주사한 덱스트란-형광체 컨쥬게이트의 형광 수준)을 측정한다. Hb 또는 형광을 측정하기 위해, 먼저 플러그를 조직 균질화기로 균질화한다.

피하(s.c.) 종양 성장의 이종이식 모델

누드 마우스에게 오른쪽 옆구리에 MDA-MB-231 세포(사람 유방암종) 및 마트리겔(등록상표)(0.2 mL 중의 1 x 10⁶ 세포)를 피하 접종한다. 종양을 200 ㎣까지 다단화한 후, 시험 조성물을 이용한 처리를 개시한다(100 ㎍/동물/일, 매일 복강내 주사). 격일로 종양 부피를 얻고, 2 주간의 처리 후 동물을 희생시킨다. 종양을 절개하고, 중량을 측정하고, 파라핀 포매한다. 종양의 조직학적 절편을 H 및 E, 항-CD31, Ki-67, TUNEL, 및 CD68 염색으로 분석한다.

전이의 이종이식 모델

또한, 본 발명의 화합물을 실험적 전이 모델을 이용하여 후기 전이 억제에 대해 시험한다(크라울리(Crowley) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90:5021-5025). 후기 전이는 종양 세포의 부착 및 혈관외유출, 국부 침입, 시딩, 증식 및 혈관신생 단계를 포함한다. 리포터 유전자, 바람직하게는 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자로 형질감염된, 하지만 별법으로는 클로르암페니콜 아세틸-트랜스퍼라제(CAT), 루시퍼라제 또는 LacZ 효소를 코딩하는 유전자로 형질감염된 사람 전립선 암종 세포(PC-3)를 누드 마우스에게 접종한다. 이 접근법은 이들 마커 중 어느 하나를 이용해서(GFP의 형광 검출 또는 효소 활성의 조직화학적 비색 검출) 이들 세포의 운명을 추적할 수 있게 한다. 세포를 주사, 바람직하게는 정맥내 주사하고, 약 14일 후 특히 폐에서 뿐만 아니라 국소 임파절, 대퇴골 및 뇌에서도 전이가 확인된다. 이것은 사람 전립선암에서 자연 발생 전이의 기관 향성(organ tropism)을 모방한다. 예를 들어, GFP 발현 PC-3 세포(마우스 1 마리 당 1 x 10⁶ 세포)를 누드(nu/nu) 마우스의 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사한다. 동물들을 시험 조성물로 매일 복강내로 100 ㎍/동물/일 처리한다. 단일 전이 세포 및 초점을 시각화하고, 형광 현미경 또는 광학 현미경적 조직화학에 의해 또는 조직의 그라인딩 및 검출가능한 라벨에 대한 정량적 비색 평가에 의해 정량화한다.

PHSCN 및 기능적 유도체에 의한 생체내 자발적 전이의 억제

쥐 유전적 동계 유방암 시스템은 Mat BIII 쥐 유방암 세포(싱(Xing) 등, Int. J. Cancer 1996,67:423-429)를 이용한다. 종양 세포, 예를 들어 0.1 mL PBS에 현탁된 약 10⁶개 종양 세포를 암컷 피셔 쥐의 유방 지방체 내에 접종한다. 접종시, 시험 화합물을 디스펜싱하기 위해 14-일 알자(Alza) 삼투압 미니펌프를 복강내 이식한다. 이 화합물은 PBS (예: 200 mM 원액)에 용해하고, 멸균 여과하고, 미니펌프에 약 4 mg/kg/일의 방출 속도를 달성하도록 넣는다. 대조 동물들은 미니펌프로 비히클(PBS)만 또는 비히클 대조 펩티드를 받는다. 동물들을 약 14 일째에 희생시킨다. 본 발명의 화합물로 처리한 쥐에게서, 일차 종양의 크기 및 비장, 폐, 간, 신장 및 임파절에서의 전이의 수(분리된 초점으로 셈)가 유의하게 감소한 것을 관찰할 수 있다. 조직학적 및 면역조직화학적 분석에 의해, 처리된 동물의 종양에서 증가된 세포괴사 및 세포사멸 징후가 있음이 밝혀진다. 신혈관화가 결여된 종양 영역에서는 큰 세포괴사 영역이 보인다. ¹³¹I가 컨쥬게이트된(펩티드 분자 당 1 또는 2 개의 I 원자) 사람 또는 토끼 PHSCN 및 그의 유도체는 효과적인 방사선치료제이고, 컨쥬게이트되지 않은 폴리펩티드보다 2 배 이상 더 효력이 있는 것으로 밝혀져 있다. 반대로, 대조 펩티드로 처리한 것은 종양 크기 또는 전이에서 유의한 변화를 일으키지 못한다.

3 LL 루이스 폐 암종 : 일차 종양 성장

이 종양주는 C57BL/6 마우스에서 폐의 암종으로서 자발적으로 생긴다(말라브(Malave) 등, J. Nat'l, Canc. Inst. 1979,62:83-88). 그것을 피하(s.c.) 접종에 의해 C57BL/6 마우스에서 계대에 의해 전파시키고, 반동종이식 C57BL/6 x DBA/2 F₁ 마우스 또는 동종이식 C3H 마우스에게서 시험한다. 전형적으로, 피하(s.c.) 이식을 위해 그룹 당 6 마리의 동물 또는 근육내(i.m.) 이식을 위해 그룹 당 10 마리의 동물을 사용한다. 종양은 2 - 4 mm 단편으로서 피하 이식하거나 또는 약 0.5 - 2 x 10⁶세포의 현탁된 세포의 접종물로서 근육내 또는 피하 이식할 수 있다. 처리는 이식 후 24 시간되는 시점에서 시작하거나, 또는 명시된 크기(보통 약 400 mg)의 종양을 만져서 알 수 있을 때까지 지연시킨다. 시험 화합물을 11일 동안 매일 복강내 투여한다.

동물들의 체중을 측정하고, 촉진하고, 종양 크기를 측정한다. 근육내 접종 후 12일째에 비처리 대조 수여자의 전형적인 종양 중량은 500 - 2500 mg이다. 전형적인 중앙 생존 시간은 18 - 28 일이다. 양성 대조 화합물, 예를 들어 시클로포스프아미드를 1일 - 11 일째에 매일 20 mg/kg/주사씩 사용한다. 계산된 결과는 평균 동물 체중, 종양 크기, 종양 중량, 생존 시간을 포함한다. 확인된 치료 활성에 대해서, 시험 조성물은 두 번의 다회 용량 평가로 시험하여야 한다.

3 LL 루이스 폐 암종 : 일차 성장 및 전이 모델

이 평가는 당업계에 잘 알려져 있다(고어릭(Gorelik) 등, J. Nat'l. Canc. Inst. 1980, 65:1257-1264; 고어릭 등, Rec. Results Canc. Res. 1980, 75:20-28; 이사코브(Isakov) 등, Invasion Metas. 2:12-32(1982); 탈마쥐(Talmadge) 등, J.Nat'l. Canc. Inst. 1982,69:975-980; 힐가드(Hilgard) 등, Br. J. Cancer 1977,35:78-86). 시험 마우스는 생후 2 - 3 개월 된 수컷 C57BL/6 마우스이다. 피하, 근육내 또는 발바닥내(intra-footpad) 이식 후, 이 종양은 전이를 우선적으로 폐에서 일으킨다. 종양의 몇몇 주의 경우, 일차 종양은 항전이 효과를 발휘하고, 전이상에 관한 연구에 앞서 먼저 절개해야 한다(참조: 미국 특허 5,639,725)

트립신 처리에 의해 고체 종양으로부터 제조된 단일 세포 현탁액을 세척하고, PBS에 현탁한다. 이렇게 제조된 3LL 세포의 생존률은 일반적으로 약 95 - 99％이다(트립판 블루 색소 배제법에 의함). 0.05 ml PBS 중에 현탁된 생존가능 종양 세포 (3 x 10⁴- 5 x 10⁶)를 C57BL/6 마우스의 등 영역에 또는 한쪽 뒷발바닥에 피하 주사한다. 10⁶ 세포를 등에 피하 주사한 후 3 - 4 일째에 눈에 보이는 종양이 출현한다. 종양 출현일 및 확립된 종양의 직경을 격일로 캘리퍼로 측정한다. 1 주일에 1 내지 5회 용량의 펩티드 또는 유도체로 처리한다. 다른 한 실시태양에서는 삼투압 미니펌프로 펩티드를 전달한다.

등 종양의 종양 절개를 포함하는 실험에서, 종양의 크기가 약 1500 ㎣에 도달할 때, 마우스를 무작위로 두 그룹으로 나눈다: (1) 일차 종양이 완전 절개됨; 또는 (2) 샴 수술을 수행하고 종양은 손상되지 않은 채로 있음. 500 - 3000 ㎣의 종양이 전이의 성장을 억제하지만, 1500 ㎣이 국부 성장이 일어나지 않고 높은 생존률로 안전하게 절제될 수 있는 최대 크기 일차 종양이다. 국부 종양 절개 후의 전이 성장의 가속화 현상은 반복적으로 관찰되어 왔다(참조: 예를 들어, 미국 특허 5,639,725). 이들 관찰은 암 수술을 받은 환자의 예후에 대한 결과를 갖는다. 21일 후, 모든 마우스를 희생시키고, 부검한다. 폐를 제거해서 중량을 측정하고, 보우인(Bouin) 용액에 고정하고, 눈에 보이는 전이의 수를 기록하고, 전이의 직경도 측정한다. 기록된 직경을 토대로 하여, 각 전이의 부피를 계산할 수 있다. 폐 당 전이의 총 부피를 결정하기 위해, 눈에 보이는 전이의 평균 수에 전이의 평균 부피를 곱한다.

폐 세포 내로의 ¹²⁵IdUrd의 혼입을 측정하는 것이 가능하다(쎄이커(Thakur) 등, J. Lab. Clin. Med. 1977,89:217-228). 종양 절단 후 10일째에, 25 ㎍의 플루오로데옥시우리딘을 종양을 갖는 마우스(및 사용된 경우이면, 종양이 절제된 마우스)에게 복강내 주사한다. 30분 후, 마우스에게 1 μCi의 ¹²⁵IdUrd(요오도데옥시우리딘)를 제공한다. 1일 후, 폐 및 비장을 제거해서 중량을 측정하고, 감마 계수기를 이용해서 ¹²⁵IdUrd 혼입 정도를 측정한다.

발바닥 종양이 있는 마우스에서, 종양의 직경이 약 8 - 10 mm에 도달할 때, 마우스를 무작위로 두 그룹으로 나눈다: (1) 무릎 관절 위를 결찰한 후 종양이 있는 다리를 절단함; 또는 (2) 마우스가 절단되지 않고 종양을 갖는 대조군으로서 손상되지 않은 채로 있음. (종양을 갖는 마우스에게서 종양이 없는 다리의 절단은 후속 전이에 대해 알려진 영향이 없고, 마취, 스트레스 또는 수술의 가능한 효과를 배제함). 절단 후 10 - 14 일째에 마우스를 죽인다. 상기한 바와 같이 전이를 평가한다.

통계: 종양을 갖는 마우스의 폐에서는 전이 발생 및 그들의 성장을 나타내는 값들이 정상적으로 분포되지 않는다. 따라서, 만-휘트니(Mann-Whitney) U-테스트와 같은 비모수 통계를 분석에 이용할 수 있다.

PHSCN 펩티드, 유사체 및 염의 치료 용도

Ac-PHSCN-NH₂ 염 또는 그의 제약 조성물은 일반적으로 의도된 목적을 달성하는 데 효과적인 양으로 사용될 것이다. 이상 혈관화 또는 이상 혈관신생을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 용도를 위해서는, 제악 조성물일 수 있는 Ac-PHSCN-NH₂ 염은 치료적 유효량으로 투여 또는 적용된다. 본원에 게재된 특별한 장애 또는 병태의 치료에 유효한 Ac-PHSCN-NH₂ 염의 양은 장애 또는 병태의 성질에 좌우될 것이고, 당업계에 알려진 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 최적 투여량 범위의 확인을 돕기 위해 임의로 시험관내 또는 생체내 평가를 이용할 수 있다. 투여되는 Ac-PHSCN-NH₂ 염의 양은 물론 다른 인자들 중에서도 치료받는 대상자, 대상자의 체중, 심도, 투여 방식 및 처방 의사의 판단에 좌우될 것이다. 예를 들어, 투여량은 단일 또는 다수 투여에 의해 또는 제어 방출에 의해 제약 조성물로 전달될 수 있다. 투여는 간헐적으로 반복될 수 있거나, 단독으로 또는 다른 약물과 함께 제공될 수 있고, 질환 또는 장애의 효과적 치료에 필요한만큼 오랫동안 계속할 수 있다. 경구 투여를 위한 적당한 투여량 범위는 약물의 효력에 의존하지만, 일반적으로 체중 1 Kg 당 0.001 mg 내지 200 mg, 바람직하게는 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 50 mg의 본 발명의 화합물이다. 투여량 범위는 통상의 기술을 가진 당업계 숙련자에게 알려진 방법에 의해 쉽게 결정할 수 있다. 정맥내 (i.v.) 투여를 위한 적당한 투여량 범위는 약 0.01 mg 내지 약 100 mg/kg(체중)이다. 비내 투여를 위한 적당한 투여량 범위는 일반적으로 0.01 mg/kg(체중) 내지 50 mg/kg(체중) 또는 0.10 mg/kg(체중) 내지 10 mg/kg(체중)이다. 좌약은 일반적으로 체중 1 kg 당 약 0.01 mg 내지 약 50 mg의 본 발명의 화합물을 함유하고, 약 0.5 중량％ 내지 약 10 중량％의 범위의 활성 성분을 포함한다. 피부내, 근육내, 복강내, 피하, 경막외, 설하 또는 뇌내 투여를 위한 권장된 투여량은 약 0.001 mg/kg(체중) 내지 약 200 mg/kg(체중)의 범위이다. 유효 투여량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 투여량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 이러한 동물 모델 및 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다.

특이한 한 실시태양에서는, 투여되는 투여량이 체중을 기준으로 하지 않고, 절대적 양, 예를 들어 1회 투여 당 1 mg 내지 1 g이다. 특이한 다른 한 실시태양에서, 투여량은 1회 투여 당 10 내지 750 mg, 예를 들어 20 mg, 100 mg 또는 600 mg이다. 특이한 한 실시태양에서, 투여량은 1 주일에 1 회 내지 수 회(예: 2, 3, 4 또는 7 회) 투여한다.

Ac-PHSCN-NH₂ 염은 바람직하게는 사람에게 사용하기 전에 원하는 치료 또는 예방 활성에 대해서 상기한 바와 같이 시험관내 및 생체내 평가한다. 예를 들어, Ac-PHSCN-NH₂ 염 또는 Ac-PHSCN-NH₂ 염들의 조합의 투여가 이상 혈관신생 또는 혈관화를 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 바람직한지의 여부를 결정하는 데 시험관내 평가를 이용할 수 있다. Ac-PHSCN-NH₂ 염의 안전성 및 효능은 동물 모델 시스템을 이용해서 입증될 수 있다. 바람직하게는, 본원에 기재된 Ac-PHSCN-NH₂ 염의 치료적 유효량은 실질적인 독성을 일으키지 않고 치료적 이익을 제공할 것이다. Ac-PHSCN-NH₂ 염의 독성은 표준 제약 절차를 이용해서 결정될 수 있고, 당업계 숙련자들에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 질환 또는 장애의 치료에서, Ac-PHSCN-NH₂ 염의 "치료 지수"(독성 투여량과 치료 투여량 사이의 비)는 바람직하게는 높을 것이다. 본원에 기재된 Ac-PHSCN-NH₂ 염의 바람직한 투여량은 독성이 거의 또는 전혀 없는 유효 투여량을 포함하는 순환 농도의 범위를 제공할 것이다.

이제까지 본 발명을 일반적으로 설명하였지만, 본 발명을 제한하려는 의도가 없고 예시하기 위해 제공된 다음 실시예를 참고함으로써 본 발명을 더 쉽게 이해하게 될 것이다

실시예 I

Ac- PHSCN - NH ₂ 염산염의 제조

실시예 II

Ac-Pro-His- Ser - Cys - Asn - NH ₂ TFA 염의 제조 및 정제

링크 아미드 AM 수지(노바바이오켐(Novabiochem))를 DMF(수지 100 mg 당 1 mL) 중의 20％ 피페리딘으로 3 분 동안 질소 교반과 함께 처리하고, 반응 혼합물을 여과하고, DMF로 1 회 세척하였다. 이 단계를 추가로 2 회 반복하였다. 수지를 DMF로 3회, 디클로로메탄으로 3회 세척하였다. Fmoc-Asn(trt)-OH 3 당량, HBTU 3 당량 및 HOBT 3 당량을 DMF (수지 100 mg 당 1 mL) 중에 용해하고, 상기 수지에 첨가한 후, N-메틸모르폴린 (NMM) 6 당량을 첨가하고, 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 수지를 DMF로 3회, 디클로로메탄으로 3회 세척하였다. 이 커플링 단계를 반복하였다. 상기한 Fmoc 탈보호 및 커플링 단계를 Fmoc-Cys(trt)-OH, Fmoc-Ser(trt)-OH 및 Fmoc-His(trt)-OH와 함께 연속 이용하여 수지에 결합된 Fmoc-His(trt)-Ser(trt)-Cys(trt)-Asn(trt)를 얻었다. 이 수지를 질소 교반과 함께 3 분 동안 DMF 중의 20％ 피페리딘(수지 100 mg 당 1 mL)으로 처리하고, 반응 혼합물을 여과하고, DMF로 1회 세척하였다. 이 단계를 추가로 2회 반복하였다. 수지를 DMF로 3회, 디클로로메탄으로 3회 세척하였다. Ac-Pro-OH 3 당량, HBTU 3 당량 및 HOBt 3 당량을 DMF(수지 100 mg 당 1 mL) 중에 용해하고, 상기 수지에 첨가한 후, N-메틸모르폴린(NMM) 6 당량을 첨가한 후, 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 수지를 DMF로 3회, 디클로로메탄으로 3회 세척하여 링크 아미드 AM 수지에 결합된 Ac-Pro-His(trt)-Ser(trt)-Cys(trt)-Asn(trt)을 얻었다. 수지를 TFA/TIS/물(95:2.5:2.5, 수지 100 mg 당 1 mL)로 처리하고, 2 시간 동안 질소와 함께 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 수지를 TFA/TIS/물로 1회, 디클로로메탄으로 3회 세척하였다. 용매를 진공에서 제거하고, 이렇게 하여 얻은 잔분을 에테르로 3 회 트리투레이션(trituration)하여 조 Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH₂ TFA염을 얻었다.

이 일반적인 절차를 이용해서 2 g의 링크 아미드 AM 수지(로딩: 0.63 mmol/g)로부터 708 mg의 조 Ac-PHSCN-NH₂, TFA염을 제조하였다.

정제

최소량의 메탄올 및 물에 용해한 조 펩티드를 페노메넥스 시너지(Phenomenex Synergi) 히드로-RP C18 칼럼(250 mm x 21.2 mm)을 갖는 예비 역상 HPLC(베크만(Beckman))로 정제하였다. 20 mL/분의 유속으로 30 분에 걸쳐서 3 - 100 ％ B의 구배를 이용하여 펩티드를 용출하였고, 여기서 용매 A는 0.1％ 트리플루오로아세트산을 함유하는 물이고, 용매 B는 0.1％ 트리플루오로아세트산을 함유하는 아세토니트릴이다. 220 nm에서 검출하였다. 분석용 HPLC 분석(3 - 100％ B의 구배를 이용하여 페노메넥스 히드로 RP (250 mm x 4.6 mm)로 행함)에 의해 >95％ 순도를 갖는 분획들을 합치고, 회전 증발에 의해 약 2 - 4 ml의 부피로 농축하고, 동결건조하였다. 샘플들을 물에 재용해하고, 용기 무게를 단 2 드램 바이알에 옮기고 다시 동결건조하였다.

이 방법을 이용해서, 140 mg의 순수한 Ac-PHSCN-NH₂ TFA염을 338 mg의 조 물질로부터 얻었다: ES MS m/z(M+H)⁺ 598.2; HPLC : 99％ 순도.

실시예 III

Ac-Pro-His- Ser - Cys - Asn - NH ₂ 의 제조

140 mg(0.197 mmol)의 Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH₂ TFA염을 2 mL의 증류수에 용해하고, 4.2 meq/g(273 mg, 5.8 당량)의 앰버리스트 A-26(OH) 수지를 첨가하 였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 수용액을 경사 분리하고, 수지를 증류수로 2회 세척하고, 합친 수성 층을 동결 건조하여 81 mg(69 ％)의 Ac-PHSCN-NH₂을 솜털 같은 백색 고체로 얻었다: ES MS m/z (M+H)⁺ 598.2; HPLC : 94％ 단량체, 6％ 이량체.

실시예 IV

Ac-Pro-His- Ser - Cys - Asn - NH ₂ 염산염의 제조

77 mg(0.13 mmol)의 Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH₂를 3 ml의 증류수에 실온에서 용해하고, 즉시 0.13 mL(0.13 mmol)의 1M 염산을 첨가하였다. 혼합물을 1회 와류시킨 후, 냉동하고, 동결건조하여 Ac-PHSCN-NH₂ 염산염을 솜털 같은 백색 고체로 얻었다.

실시예 V

제제화 및 시험을 위한 물질 및 방법

제제화

Ac-PHSCN-NH₂ 50 mg/ml를 50 mM 시트레이트 및 하기 표 1에 나타낸 성분들을 포함하는 용액에서 제제화하였다. 용액을 동결건조하고 1 mL 물에 재구성하기 위 한 바이알 내에 디스펜싱하였다.

안정성 시험

40 ℃에서 4일 동안 및 55 ℃에서 34일 동안 용액을 보관함으로써 가속화된 안정성을 시험하였다. 가속화된 안정성 실험은 강제로 분해가 일어나게 해서 특별한 제제의 상대 안정성을 빠르게 시험하기 위해 극단적 조건의 온도 및/또는 습도를 사용해서 수행하였다(전형적인 보관 조건은 대부분의 약물의 경우 22 ℃, 4℃ 또는 - 20 ℃임). 이렇게 함으로써, 이 데이터는 많은 시험 제제들로부터 가장 안정할 것 같은 제제를 선택할 수 있는 능력을 제공한다. 물로 재구성한 후, 각 제제를 물/메탄올 또는 물/아세토니트리릴과 같은 표준 이동상을 사용하여 역상 HPLC로 검사하였다. 이 방법은 Ac-PHSCN-NH₂ 또는 디술파이드 결합 이량체의 단편과 같은 Ac-PHSCN-NH₂ 분해 생성물로부터 Ac-PHSCN-NH₂를 분리할 수 있게 하였다.

효력 계산

효력은 HPLC 크로마토그램 대 표준 곡선에서 Ac-PHSCN-NH₂ 피크 아래의 면적으로 계산하였다.

순도 계산

순도는 전체 크로마토그램의 적분 면적에 대한 백분율로서 Ac-PHSCN-NH₂ 피크 아래의 면적으로 계산하였다.

％ 이량체 계산

Ac-PHSCN-NH₂ 이량체의 상대적인 양은 이량체 피크 아래의 면적을 전체 크로마토그램의 적분 면적에 대한 백분율로서 계산하였다.

실시예 VI

Ac- PHSCN - NH ₂ 의 다양한 제제의 안정성

펩티드 제제의 안정성은 세가지 방법으로 표현하였다: 효력(mg/mL), 순도(％ 단량체 및 ％ 이량체). 그 결과를 하기 표 2 및 3에 나타내었다. 표 3은 t=0에서의 용액의 효력에 대해 정규화된 효력을 나타내고, N으로 표시된 칸은 정규화된 값을 나타낸다.

실시예 VII

바람직한 제제(들)의 선택

다음은 펩티드 제제의 특성을 요약한다:

A. 용액 1-4 중의 제제는 다음과 같은 특징을 가졌다:

1. 케이크 모양이 일관성이 없음. 동결 건조기에서 대부분 붕괴됨.

2. 가속화된 안정성 시험 동안 케이크 부피가 손실됨.

3. 붕괴된 케이크의 재구성 시간이 불합리함.

B. 용액 6 중의 제제는 다음과 같은 특징을 가졌다.

가속화된 안정성 시험 동안 색이 갈색으로 변하였음. 이것은 글루코스와 글리신의 반응 때문일 것임.

C. 용액 5 중의 제제는 다음과 같은 특징을 가졌다.

1. 양호한 품질의 케이크. 백색. 신속한 재구성 및 낮은 수분 함량. 용액 5의 조성은 50 mg/mL의 펩티드, 50 mg/mL 글리신, 50 mM 시트레이트, pH 5.0, 동결건조됨(1 mL).

2. 동결 건조기에서 튼튼한 성능, 어느 샘플에서도 붕괴가 일어나지 않는 균일한 외관.

3. 가속화된 안정성 시험 동안 외관 및 재구성 능력이 유지됨.

4. 다른 제제와 동등하거나(±2％) 또는 더 나은 안정성이 유지됨.

실시예 VIII

실시간 안정성 데이터는 바람직한 정맥내 제제(100 mg Ac-PHSCN-NH₂ (=ATN-161), 50 mM 시트레이트, 50 mg/mL 글리신, pH 5.0, 50 mg/mL ATN-161의 2 mL 용액으로부터 동결건조됨)가 -20℃ 또는 2 - 8 ℃에서 보관할 때 3년 동안 규격 명세(즉, > 90％ ATN-161) 내에 있음을 알려주었다. 이 결과를 토대로, 동결건조 후 바이알 안에 충분한 부피형성제(약 50 mg/ml 글리신) 및 낮은 수분 함량을 갖는 낮은 pH의 제제가 ATN-161 약물 생성물에 대해 원하는 품질 및 안정성을 제공할 것이라고 결정하였다. 수분 함량은 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 동결건조 사이클을 최적화함으로써 변화시킬 수 있다. ATN-161 또는 그의 산 부가염 또는 유사체를 위한 추가의 제제를 개발하기 위해 유사한 파라미터를 따르게 될 것이다.

위에서 언급한 모든 참고 문헌은 혼입된다고 명시하든 하지 않든 전체를 본원에 참고로 혼입한다. 상기 문헌의 인용은 상기한 어느 것도 선행 기술에 속한다고 인정하는 것을 의도하지 않는다. 날짜에 관한 모든 언급 또는 이들 문헌의 내용에 관한 진술은 출원인이 입수할 수 있는 정보를 토대로 한 것이고, 이들 날짜 또는 이들 문헌의 내용의 정확성에 관한 승인을 전혀 구성하지 않는다.

본 발명을 충분히 기술하였지만, 당업계 숙련자는 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고 부당한 실험 없이 이것을 넓은 범위의 균등한 파라미터, 농도 및 조건 내에서 수행할 수 있음을 이해할 것이다.

Claims

(a) 펩티드 Pro-His-Ser-Cys-Asn, 그의 유사체, 또는 상기 펩티드 또는 그의 유사체의 염을 (b) 상기 펩티드, 유사체 또는 염을 자발적 직렬식(tandem) 이량체화 또는 더 높은 올리고머화에 대해 안정화시키는 1 개 이상의 추가 화합물과 함께 제제화하여 포함하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 펩티드가 그의 N- 및 C-말단이 각각 N-말단 캡 및 C-말단 캡으로 캡핑된 조성물.
제 2 항에 있어서, N-말단 캡이 아실기이고 C-말단 캡이 아미드기인 조성물.
제 3 항에 있어서, N-말단 캡이 아세틸기인 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 화합물이 Cys 잔기의 술프히드릴기들 사이의 디술파이드 결합 형성을 억제하거나, 방지하거나 또는 역전시키는 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 화합물이 pK 약 5의 생체적합성 산 완충제인 조성물.
제 3 항에 있어서, 완충제 존재 하에서 용액의 pH가 3.0 초과 7.5 이하인 조성물.
제 6 항에 있어서, 산 완충제가 시트레이트, 아세테이트 또는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES)인 조성물.
제 8 항에 있어서, 산 완충제가 약 25 mM 농도의 시트레이트인 조성물.
제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제가 부형제 및 부피형성제인 글리신으로 보충되는 조성물.
제 10 항에 있어서, 글리신의 농도가 약 50 mg/ml인 조성물.
제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제가 시트레이트 및 아세테이트를 포함하는 조성물.
제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제가 또한 트리스를 포함하는 조성물.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 상기 펩티드, 또는 상기 펩티드 또는 유사체의 염, (ii) 시트레이트 약 50 mM 및 (iii) 글리신 약 50 mg/ml을 포함하는 조성물.
제 14 항에 있어서, 용기 또는 바이알에 2 mL의 pH 5.0 용액으로부터 동결건조된, 상기 펩티드, 또는 펩티드 또는 유사체의 염 100 mg, 시트레이트 50 mM, 글리신 50 mg/ml을 갖는 동결건조된 형태로 있는 조성물.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 1 개 이상의 환원제를 더 포함하는 조성물.
제 16 항에 있어서, 상기 환원제가 디티오트레이톨, β-메르캅토에탄올 또는 글루타티온을 포함하는 조성물.
제 17 항에 있어서, 환원제 또는 환원제들의 농도가 약 10 mM를 초과하지 않는 조성물.
제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 비-티올 생체적합성 항산화제를 더 포함하는 조성물.
제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 보호량으로 존재하는 동결건조 보호제를 포함하는 조성물.
제 20 항에 있어서, 동결건조 보호제 : 펩티드의 몰 비가 약 50 - 600 몰 동결건조 보호제 : 1 몰 펩티드인 조성물.
제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 동결건조 보호제가 1 개 이상의 당, 1 개 이상의 아미노산, 1 개 이상의 메틸아민, 1 개 이상의 유방향성(lyotropic) 염 및/또는 1 개 이상의 폴리올인 조성물.
제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 보호제가 수크로스 또는 트레할로스; 모노소듐 글루타메이트 또는 히스티딘; 베타인; 황산마그네슘; 또는 3가 이상의 당 알콜인 조성물.
제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 글리세린, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 개 이상의 폴리올을 포함하는 조성물.
제 22 항에 있어서, 동결건조 보호제가 비환원 당인 조성물.
제 25 항에 있어서, 당이 트레할로스 또는 수크로스인 조성물.
제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균성이고 생체내 투여용으로 제제화된 조성물.
(a) 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 조성물을 용액으로 또는 동결건조된 형태로 함유하는 제 1 용기;

(b) 임의로, 동결건조된 조성물을 위한 희석제 또는 재구성 용액을 함유하는 제 2 용기;

(c) 임의로, (i) 용액 사용 또는 (ii) 동결건조된 조성물의 재구성 및/또는 사용에 관한 설명서

를 포함하는 제조 물품 또는 키트.
제 28 항에 있어서, (i) 다른 완충제, (ii) 희석제, (iii) 필터, (iv) 니들, 또는 (v) 시린지 중 1 개 이상을 더 포함하는 물품 또는 키트.
제 28 항에 있어서, 제 1 용기 및 임의의 제 2 용기가 병, 바이알, 시린지 또는 시험관인 물품 또는 키트.
제 28 항에 있어서, 제 1 용기 및 임의의 제 2 용기가 다회용 용기인 물품 또는 키트.
제 28 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 동결건조된 형태인 물품 또는 키트.
펩티드 또는 유사체가 항혈관신생 유효량으로 투여되도록 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 조성물을 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 대상자의 혈관신생 억제 방법.
펩티드 또는 유사체가 암 치료 유효량으로 투여되도록 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 조성물을 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생 억제에 의한 대상자의 암 치료 방법.
펩티드 또는 유사체가 크론병 치료 유효량으로 투여되도록 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 조성물을 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생 억제에 의한 대상자의 크론병 치료 방법.
원하지 않은 혈관신생을 억제하기 위해 대상자에게 투여하기 위한 의약에서의 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
제 36 항에 있어서, 암에 걸린 대상자에게 암 치료를 위해 투여하기 위한 용도.
제 36 항에 있어서, 크론병에 걸린 대상자에게 크론병 치료를 위해 투여하기 위한 용도.
제 36 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드, 유사체 또는 펩티드 또는 유사체의 염이 항혈관신생 유효량으로 투여되는 용도.
원하지 않은 혈관신생을 억제하기 위해 대상자에게 투여하기 위한 의약 제조를 위한 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
제 41 항에 있어서, 암에 걸린 대상자에게 암을 치료하기 위해 투여하기 위한 의약 제조를 위한 용도.
제 41 항에 있어서, 크론병에 걸린 대상자에게 크론병을 치료하기 위해 투여하기 위한 의약 제조를 위한 용도.
제 40 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드, 유사체 또는 펩티드 또는 유사체의 염이 항혈관신생 유효량으로 투여되는 용도.