KR20070085689A - 면역글로불린 분획물 - Google Patents

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실비아 미셔
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Abstract

본 발명은 사람 면역글로불린 제제의 분획물을 포함하는 신규 약제학적 조성물, 당해 조성물의 신규 적용 및 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
면역글로불린 분획물

Description

면역글로불린 분획물{Immunoglobulin fractions}
본 발명은 사람 면역글로불린 제제의 분획물을 포함하는 신규 약제학적 조성물, 이들 조성물의 신규 응용 및 당해 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
정맥내 면역글로불린(IVIG) 제제는 수천명의 건강한 공여자로부터 채취된 혈장(현재 채취물 규모는 1000명 내지 60,000명 범위이다)으로부터 유래하고, 공여자 집단이 항원에 누적된 노출을 경험하였음을 반영하는 면역 항체 및 천연 항체(NAb) 둘다를 포함한다. 따라서, IVIG는 자기/자가항원과 반응하는 NAb 뿐만 아니라, 병원체 및 외래 항원에 대해 특정된 소위 다양한 범위의 특이적인 "면역 항체"를 포함한다. NAb는 외래 항원에 대한 노출과는 상관없이 의도적 면역화 부재하에 발생되는 것으로서 정의된다(문헌참조번호 1). 실질적으로, 자기 항원에 대한 다양한 항체가 검출되었고 특히 친화성 크로마토그래피에 의해 IVIG 제제로부터 정제되었다. 이들 NAb는 흔히 다중반응성이고 병원체에 결합하여 순환계로부터 노화되거나 변화된 분자 및 세포를 추적하고 이를 제거함에 의해 면역항상성을 유지하는데 중요하다(문헌참조번호 2). 추가로, 이들 NAb는 자기 내성을 유지하는데 필수적인 면역학적 호문클루스(homunculus)로서 언급되는 보존된 면역우성 항원을 인지하는 것으로 제한되었다(문헌참조번호 3). 그러나, 이들 항체, 성질 및 IVIG의 서브-분 획물중에 이들의 잠재적인 존재 여부에 대한 정확한 특징 분석은 부분적으로 관련 표적 항원 및 항체에 대한 지식의 부족으로 규명되지 못했다.
현재 IVIG의 치료학적 응용은 2개의 주요 카테고리를 포함한다: i) 1차 및 2차 항체 결핍에서 항체 대용(문헌참조번호 4) 및 ii) 전신 염증 및 자가면역 질환을 갖는 환자에서 면역조절(문헌참조번호 2 및 5). IVIG는 항체 결핍 및 몇몇 자가 면역 및 염증 질환[예를 들어, 면역 혈소판 감소 자반증(ITP), 귈레인 바레 증후군(GBS), 가와사키 질환, 만성 염증 탈수초 다발신경병증(CIDP)]에서 임상적 효능을 보여주었고, 흔히 통계학적으로 중요한 조절 시험의 부재로 인해 기타 자가면역 및 전신 염증 증상에서 미확인/모호한 임상적 이득에 대한 많은 예가 있다.
IVIG의 작용 모드는 많은 상이한 세포 유형에서 Fc 수용체의 발현 및 기능의 복잡하게 연루된 조절, 보체 활성화 및 사이토킨 네트워크에 대한 간섭, 활성, 분화 및 효능인자 기능의 조절이다. 유전자형 네트워크는 면역 항상성에 관여하는 필수 네트워크로서 제안되었고 이의 불균형은 궁극적으로 명백한 자가면역 질환을 유발한다. IVIG에 대해 현재 많은 치료학적 징후는 병리학적 자가면역 항체를 균형화하거나, 중화시키거나 차단함에 따라서 건강한 유전자형 네트워크를 회복시키는 것을 기반으로 한다[문헌참조번호 6 및 7]. 최근 보고는 또한 단핵구, 수지상 세포, 내피 세포 및 T 및 B 림프구에 대한 직접적인 효과를 나타내었다. 이러한 복잡성은 건강한 개인에서 항상성을 유지하기 위한 순환하는 항체의 필수 기능을 반영하는 것이다[문헌참조번호 2 및 8].
노화에 따라 면역 반응성이 감소하여 소위 면역노화라고 불리우는 면역 감소 를 입증하는 많은 문헌의 보고가 있었다[문헌참조번호 9]. 그러나, 연령 증가와 함께 외래 항원에 대한 IgG 항체 레퍼토리의 연령에 따른 다양화와 비교하여 자기 항원에 반응하는 천연 IgG 항체는 장기간 안정성인 것으로 나타난다[문헌참조번호 10].
IVIG는 IgG 이소형 분포가 정상적인 사람 혈청의 분포와 상응하는 온전한 IgG 분자와 미량의 IgA로 이루어진다. 제형화에 따라, IVIG 제제는 다양한 양의 단량체 및 이량체 IgG를 함유한다. 단량체는 단량체 IgG(분자량 150,000)인 반면 이량체는 이전의 데이타로부터 전형적인 유전자형 항-유전자형 쌍으로서 배향될 수 있는 2개의 IgG 분자를 나타낸다[문헌참조번호 11].
EP-A-1394183은 예를 들어, 고형 지지체에 결합된 면역글로불린 이외의 사람 혈청에 존재하는 단백질의 혼합물인 리간드에 대한 친화성 크로마토그래피를 사용하여, IVIG 제제로부터 자가항체를 정제하는 방법을 기재하고 있다.
미국 특허 제6,231,856호는 자가면역 질환에 대한 항체 기반 치료를 위한 실질적으로 정제되고 농축된 항-유전자형 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 사람 항체 조성물을 기재하고 있다.
본 발명에 따라, 사람 면역글로불린 제제의 크기 분획화는 상이한 특성을 갖는, 이량체 항체와 단량체 항체를 분획시키는 것으로 밝혀졌다. 이량체 분획물은 항원, 예를 들어, 자기항원 및/또는 외부 항원에 대한 반응성을 증가시킨다. 추가로, 이량체 분획물은 표적 항원에 대한 친화성이 보다 높은 항체를 함유하여 보다 높은 생물학적 활성, 예를 들어, 항세균, 항독소 또는 항바이러스 활성의 경우에 중화 활성을 가질 수 있다. 이와 대조적으로, 단량체 분획물은 보다 낮은 친화성 항체, 예를 들어, 천연 항체, 즉 고친화성의 항체가 개발되는 기본 레퍼토리를 함유할 수 있다.
제1 측면에서, 본 발명은, 이종성 사람 공여자 집단으로부터의 사람 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 이량체 사람 항체 기원 분획물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은, 이종성 사람 공여자 집단으로부터의 사람 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 단량체 사람 항체 기원의 분획물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
당해 분획물은 다수 공여자의 폴리클로날 사람 항체 제제를 포함하는 임의의 제제로부터 수득될 수 있다. 바람직하게, 당해 분획물은 IVIG 제제로부터 수득된다.
본 단락에서, IVIG 제제는 다수의, 예를 들어, 1,000 내지 100,000명의 혈액 공여자의 수집된 혈장으로부터 기원할 수 있는 사람 면역글로불린 제제이다. 항체의 항원 결합 단편은 공지된 방법, 예를 들어, 단백질분해에 의해 수득될 수 있다. 바람직한 항체 단편은 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편이다.
단량체 또는 이량체 분획물은 사람 항체 제제의 크기 분획화에 의해 수득될 수 있다. 크기 분획화는 크기 배척 분리, 겔 여과, 한외여과, 저분자 여과 및/또는 기타 겔 또는 막 분리 방법을 포함할 수 있다. 단량체 분획물은 겉보기 분자량이 약 150kDa인 항체 단량체를 회수함에 의해 수득될 수 있고 이량체 분획물은 겉 보기 분자량이 약 300kDa인 항체 이량체를 회수함에 의해 수득될 수 있다.
바람직하게, 크기 분획화는 예를 들어, 슈퍼로스 6 또는 세파크릴 S-300 칼럼상에 크기 배척 크로마토그래피를 포함한다.
크기 분획화에 의해 수득되는 단량체 및 이량체 분획물의 순도는 분석용 HPLC, 예를 들어, TSK G 3000 SWXL 칼럼상의 크기 배척 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
이량체 항체 분획물의 순도는 크기 분획화 후 바로 수행되는 분석용 HPLC에 의해 측정되는 바와 같이 통상적으로 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상 및 보다 바람직하게는 85% 이상이다.
단량체 항체 분획물의 순도는 통상적으로 크기 분획화 후 바로 수행되는 분석용 HPLC에 의해 측정되는 바와 같이 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 및 보다 바람직하게는 95% 이상이다.
이량체 항체 분획물은 바람직하게 파상풍 독소 및/또는 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 및/또는 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 독소 A와 같은 외부항원 및/또는 적혈 세포 고스트 및/또는 Hep-2 상피 세포와 같은 자가항원에 대한 반응성이 증가된 특성을 갖는다. 보다 특히, 이량체 분획물은 파상풍 독소 및/또는 호흡기 합포체 바이러스에 대해, 실시예에 측정된 바와 같이, 비분획화된 IVIG 제제와 비교하여 2배 이상 증가된 특이적 활성을 가질 수 있다. 추가로, 이량체 분획물은 에스. 피오게네스(S. pyogenes)의 M 바이러스 독성 단백질 및/또는 Hep-2 상피 세포에 대해, 특히 세포내 항원에 대해, 실시예에서 측정된 바와 같이, 비분획화된 IVIG 제제와 비교하여 2배 이상 증가된 반응성을 가질 수 있다.
이량체 항체 분획물의 약제학적 조성물은 이량체 형태 또는 해리되거나 재단량체화된 형태로 항체를 포함할 수 있다. 바람직하게, 항체는 해리되거나 재단량체화된 형태이고 여기서, 이량체의 함량은 10% 이하, 보다 바람직하게는 5% 이하이다. 단량체화는 산성 pH, 예를 들어, pH 약 3 내지 약 5, 바람직하게는 약 3.5 내지 약 4.5, 보다 바람직하게는 pH 약 4.0으로 조정하여 수행될 수 있다. pH는 임의의 약제학적으로 허용되는 산성 완충제, 예를 들어, 아세트산에 의해 조정될 수 있다. 이량체 항체의 단량체화된 제제는 바람직하게 동역학적으로 안정하여 실질적으로 실시예 부분에서 측정된 바와 같은 상기 저장 조건 및 사용하에 이량체로 재변환되지 않는다.
이량체 분획물은 단량체 분획물 보다 특이적 활성이 높은 항체를 함유한다. 따라서, 상기 분획물은 바람직하게 병원체, 예를 들어, 바이러스, 세균, 진균류, 원생동물 및/또는 기생충 감염에 대한 약물 제조를 위해 사용된다. 특히, 급성 감염의 치료를 위해서는 이량체 분획물의 사용이 바람직하다.
추가로, 이량체 분획물은 바람직하게 자가면역 장애에 대한 약물의 제조 및/또는 자가면역 항상성 유지에 적용된다. 이량체 분획물은 내부 평형을 유지하는데 중요한 유전자형 및 항유전자형 항체를 함유한다. 이량체는 자가 반응성 클론이 자가면역 질환을 유발하도록 클론 확장되는 것을 피하기 위해 상응하는 항유전자형 항체에 의해 조절하에 있는 생리학적 자가 반응성을 보여준다. 예를 들어, 비분획화된 IVIG 또는 단량체 분획물과 비교하여 단량체화된 이량체 분획물은 실시예에서 측정된 바와 같이 쇼그렌 증후군의 표적 항원중 하나인 무스카린 3 수용체(M3R)의 루프 2에 대해 증가된 활성을 보여준다. 당해 활성은 이량체 분획물에서 유전자형 및 항유전자형 항체가 단량체화되는 경우에만 나타난다.
고특이적 활성으로 인해, 이량체 분획물은 보다 높은 양립성 및 보다 적은 부작용을 유도하는 저투여량으로 투여될 수 있다. 바람직하게, 이러한 본 발명의 양태에서, 당해 제제는 바람직하지 못한 부작용을 유발하지 않고 치료학적 효과를 거두기에 충분한 양으로 투여된다.
한편, 단량체 분획물은 면역 항체 및 천연 항체를 둘다 포함하지만 항유전자형 항체는 부재이고 특히, 병약한 면역계를 유지하고 부스트하는 것이 이로울 것이다. 바람직한 적용은 어린이, 나이든 사람 또는 면역손상된 사람, 예를 들어, 면역계가 손상되는 장애를 앓는 사람 또는 면역계를 손상시키는 치료를 받고 있는 사람에게 투여하는 것이다. 특히, 노화 예방 및/또는 회춘 치료를 위해 투여되는 것이 바람직하다. 또한 놀랍게도, 단량체 분획물은 미생물의 폴리사카라이드, 특히, 슈도모나스 아에루기노사의 상이한 혈청형의 폴리사카라이드에 대해 증가된 반응성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 우선적으로 슈도모나스 아에루기노사에 의한 감염 치료를 위해, 감염성 미생물에 대한 약물의 제조에 단량체 분획물을 사용하는 것이다.
단량체 제제의 이량체 함량은 바람직하게, 치료군에 대한 역반응을 회피하기 위해 7%, 바람직하게는 2.5% 및 보다 바람직하게는 1%의 최대량으로 제한된다.
본 발명의 추가의 측면은,
(a) 이종성 공여자 집단 기원의 사람 항체 제제를 크기별 분획시키는 단계,
(b) 이량체 항체 분획물을 회수하고 임의로 이량체 항체를 단량체화시키는 단계 및
(c) 단량체 항체 분획물을 회수하는 단계를 포함하는,
이종성 사람 공여자 집단 기원의 사람 항체 또는 항원 결합 단편의 분획물을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하기 위한 방법이다.
단량체 분획물의 특징은 크기 분획 과정에서 분자량이 약 150kDa라는 것이다. 이량체 분획물의 특징은 크기 분획 과정에서 분자량이 약 300kD라는 것이다.
추가로, 본 발명은 하기의 실시예에서 보다 상세하게 설명될 것이다.
도 1
크로마토그래피의 최적화 및 IVIG 제제의 분획화
상이한 유속(FR), 상이한 완충 시스템을 사용하고 12% 산도글로불린(SAGL) 제제에 대한 로딩 능력을 다양화하여 상기된 바와 같이 다양한 칼럼을 시험하였다. 분획물을 수거하고 단량체, 이량체 및 응집물의 함량에 대해 분석 HPLC로 분석하였다.
도 2
IVIG 제제의 제조용 분획화
세파크릴 S-300 칼럼(치수 26/60)을 PBS/0.92% 아지드로 평형화시킴에 이어서 500ml의 12% 산도글로불린(SAGL) 제제를 적용하였다. 1.2ml/분의 유속으로 칼럼을 전개하고 상기된 바와 같이 분획물 1 내지 4를 수거하고 단량체, 이량체 및 응집물의 함량에 대해 분석 HPLC로 분석하였다. 당해 칼럼은 실험실 규모에서 단량체 및 이량체 분획물을 제조하기 위해 스케일 업하였다.
도 3
분석 HPLC상에서의 IVIG, 분리된 단량체 및 이량체 분획물의 프로필
분석 HPLC를 사용하여 상이한 분획물중의 % 이량체, 단량체 및 응집체를 분석하였다: SAGL 12% 제제로부터 새롭게 용해된 IVIG; 세파크릴 S-300 칼럼상에서 분리된 단량체 및 이량체 분획물. 점선은 이량체 및 단량체가 비분리된 SAGL에서 발견됨을 보여준다.
도 4
분리된 이량체 분획물의 역학
분리된 이량체 분획물을 실온에 유지시키고 최대 48시간동안의 간격(이의 범위는 0 내지 24시간)으로 분석하여 단량체로 해리되는 것에 대한 이량체 분획물의 안정성을 관찰한다. 직선은 이량체 분획물중의 이량체%를 나타내고 점선은 이량체 분획물중에 단량체%를 나타낸다.
도 5
IVIG중에 단량체 및 이량체의 크기 배척 분리에 대한 흐름도
도 6
단량체화된 이량체 분획물의 제조를 위한 최적의 pH 조건
이량체 및 단량체 분획물을 수거하고 pH 2.6 내지 7의 시트레이트 포스페이트 완충액 또는 pH 4의 10mM의 아세트산 완충액을 사용하여 4 내지 7 범위의 pH에서 4℃에서 24시간동안 투석한다. 분자량 컷오프(MWCO)가 12,000 내지 14,000인 Spectra/Por 4 투석막(제조원: Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, California) 또는 MWCO가 8,000인 소형 투석 키트(제조원: Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)를 사용하여 투석을 수행하였다. 분석 HPLC는 투석 후 바로 수행하였다. 판넬 A, B, C: 투석된 이량체 분획물의 HPLC 프로필을 나타낸다: 이량체 pH 4(A), 이량체 pH 5(B) 및 이량체 pH 7(F). : 판넬 D, E, F: 투석된 단량체 분획물의 HPLC 프로필: 단량체 pH 4(D), 단량체 pH 5(E) 및 단량체 pH 7(F).
도 7
분리된 단량체 및 이량체 분획물의 2D PAGE 분석
2차원 폴리아크릴아미드 전기영동은 이전에 문헌[참조: 2D-Electrophoresis, Principles and Methods(Amersham Biosciences)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, IVIG, 단량체 및 이량체 면역글로불린(Ig) 분획물의 총 4㎍을 8M 우레아, 2% CHAPS, 0.002% 브롬페놀 블루, DTT(0.65mM)를 함유하는 재수화 완충액 및 각각 0.5%의 IPG 완충액 125㎕중에 희석시켰다. 7cm IPG 스트립(pH 3 내지 10)(Amersham Biosciences)을 밤새 재수화시키고 스트립 세부지침(단계 1: 정전압 300V/60분, 단계 2: 1000V/30분으로의 구배, 단계 3: 5000V/90분으로의 구배, 단계 4: 정전압 5000V/15분)에 따라 IPGphor 유니트(Amersham Biosciences)상에 포커싱 하였다. 포커스된 스트립은 50mM 트리스 HCl, pH 8.8, 6M 우레아, 30%(v/v) 글리세롤, 2%(v/v) SDS, 0.002%(v/v) 브로모페놀 블루 및 1mg/ml DTT(제1 평형화 시점) 또는 25mg/ml의 요오도아세트아미드(제2 평형화 시점)을 함유하는 평형화 완충액중에서 15분의 2단계로 평형화시켰다. 분자량 분리를 위해, 스트립을, 2.5mM 트리스(하이드록시메틸)-아미노에탄(Merck), 25mM 글라이신(Merck), 0.01% SDS(w/v)(Fluka)를 함유하는, 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 수행 완충액중에서 세정하고 12% 폴리아크릴아미드 겔상에 위치시켰다. 이어서, 스트립을 4% 폴리아크릴아미드 스택킹 겔로 덮고 약 90분동안 정전압 100V에서 MiniProtean 전기영동 챔버(BioRad)의 2차원을 수행하였다. 은 염색은 PlusOne 은 염색 키트(Amersham Biosciences)를 사용하여 수행하였다.
도 8
IVIG 분획물에서 에스. 피오게네스의 M5 단백질에 대한 반응성
ELISA: 항원(재조합 사람 M 단백질: M1, M3, M5, M6, M19)을 10㎍/ml로 피복시킴. 2시간 37℃에서 차단 PBS/카세인. 10, 100 및 1000㎍/ml에서 제1 항체(IVIG T0/IVIG pH 4.0/이량체/단량체): 37℃에서 4시간. 제2 항체: AP004(결합 부위) 양 항-사람 IgG 퍼옥시다제, 1/1000(2시간, 37℃). 결과는 모든 다른 M 단백질을 대표하는 M5에 대한 것이다.
도 9
외부 항원에 대한 이량체 분획물의 차등 활성. 이량체 분획물의 증가된 활성은 결합 친화성의 증가와 관련된다.
파상풍 독소 및 M1 단백질에 대한 친화성 측정. 상이한 IVIG 제제의 친화성은 IAsys 큐벳 시스템을 사용하는 온라인 모니터링에 의해 평가하였다. 당해 큐벳에 스트렙토코커스 피오게네스(에스. 피오게네스) 또는 파상풍 독소를 고정화시켰다. 당해 결합을 측정하기 위해, IVIG 제제를 PBS/0.05% 트윈 20에서 상이한 농도로 희석시키고 50㎕의 샘플중에서 큐벳으로 첨가하였다. 당해 큐벳을 항체의 해리를 모니터링하기 위해 3 x 50㎕의 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하였다. 재생을 위해, 당해 큐벳을 2분동안 40㎕의 20mM HCl 및 45㎕의 PBS/0.05% 트윈 20을 사용하여 3회 연속으로 세척하였다. KD는 FAST플롯 및 Grafit 프로그램을 사용하여, IVIG, 단량체 또는 이량체 각 농도에 대해 수득된 Kon 값을 플롯팅함에 의해 KD를 계산하였다.
ELISA: IVIG, 단량체 및 이량체 분획물은 파상풍 독소, 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 및 에이취. 인플루엔자 B에 대해 시판되는 키트를 사용하여 분석하고 당해 결과는 표준 곡선으로부터 계산된 유니트/g 면역글로불린(Ig)으로 나타내었다. M1 단백질에 대한 활성은 도 7에 기재된 바와 같이 적정하였다.
도 10
이량체는 HEp-2 세포를 사용한 기능적 중화 분석에서 RSV에 대해 증가된 중화 활성을 보여준다
중화작용 하는 상이한 IVIG 제제(pH 7 및 pH 4에서 IVIG전체, pH 4에서 단량체 및 pH 4에서 이량체)를 1.5mg/ml로 예비 희석하고 96웰 플레이트(Becton Dickinson, Meylan Cedex, FR)상에서 연속으로 2회 희석시켰다. 50㎕의 RSV 롱 분획물(1/2 105TCID50/ml)을 각각의 웰에 첨가한 후, 항체-바이러스 혼합물을 실온에서 1시간동안 항온처리하였다(진탕기상에서, 파라필름으로 밀봉됨). 완전히 보충된 DMEM에서 모든 희석을 수행하였다. 분석을 위해 요구되는 바이러스의 양은 이전에 3일 후 세포를 100%로 사멸시키는 RSV 입자의 양(500TCID50/ml)으로서 정의된다. HEp-2 세포(ATCC CCL23)는 96 웰-플레이트(Becton Dickinson, Meylan Cedex, FR)에서 배양하고 웰당 20,000개의 세포로 증식시킨다. 이어서, 배지를 제거하고 이전에 항온처리된 항체-바이러스 혼합물을 HEp-2 세포에 전달하고 습한 대기에서 37℃에서 약 72시간동안 항온처리하였다.
세포 배양 배지를 HEp-2 세포로부터 세거하고 세포를 pH 7.4의 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 4℃에서 10분동안 메탄올-아세톤(1:1의 비율, 4℃로 예비 냉각시킴)으로 고정화하였다. 세포를 다시 pH 7.4의 PBS로 세척하였다. 이들에 웰당 50㎕의 모노클로날 마우스 항-RSV FITC 표지된 항체(Chemicon Europe LTD., Southampton, UK)를 첨가하였다. 표지된 항체는 암실에서 37℃에서 1시간동안 항온처리하였다. 과량의 항체를 pH 7.4의 PBS로 2회 세척하고 증류된 H2O로 1회 세척하였다. 염색 후, 형광 탑재 유체의 1적가물(Chemicon Europe LTD., Southampton, UK)을 첨가하고 감염은 형광 현미경(Nikon, Eclipse TE300, Egg/ZH, CH) 하에 20x 배율에서 가시화하였다. 이미지는 이미지 분석 소프트웨어(ACT-1, Nikon, Egg/ZH, CH)를 사용하여 디지탈 카메라(Nikon, Digital Camera DXM1200, Egg/ZH, CH)로 포 착하였다.
도 11
이량체는 쇼그렌 증후군의 표적 항원인 무스카린 3 수용체의 루프 2 펩타이드에 대해 증가된 활성을 보여준다
IVIG 제제(pH 7 및 pH 4에서 IVIG전체) pH 4에서 단량체 및 pH 4에서 이량체는 M3R 루프 2를 제공하는 합성 펩타이드를 사용하는 ELISA(이전에 실시예 8에서 기술된 바와 같이)로 비교하였다.
도 12
이량체는 세포외 자기 항원에 대한 것과 비교하여 우선적으로 세포내 항원에 대해 증가된 활성을 나타낸다
pH 4에서 100㎍/ml의 농도로 사용되는 단량체 및 이량체는 10㎍/ml로 피복된 항원 제공 세포내 및 세포외 단백질을 사용하여 ELISA(이전에 실시예 8에서 기재한 바와 같음)로 비교하였다.
도 13
단량체는 슈도모나스 아에루기노사의 다양한 리포폴리사카라이드 혈청형(IATS)에 우선적인 반응을 보이는 반면 독소 A에 대해서는 그 반대이다.
슈도모나스 아에루기노사 LPS 혈청형(국제 항원 분류 시스템) 및 독소 A는 표준 ELISA로 분석하였다. 각각의 플레이트는 표준 항체 제제(혈장은 8가의 슈도모나스 아에루기노사 O-폴리사카라이드 독소 A 접합체 백신으로 면역화된 9명의 개인으로부터 채취됨), 대조군 혈장 및 시험 샘플(단량체 및 이량체)의 연속 희석물 을 함유하였다. 표준 항체는 대조군 혈장 및 시험 샘플에서 항-LPS 또는 항-독소 A IgG 항체 농도의 양을 정량하기 위한 기준으로서 사용하였다.
도 14
이량체는 세포 골격 단백질에 대해 증가된 활성을 보여준다
HEp-2 세포에 대한 면역형광
면역조직학을 위해, 50㎕의 IVIG, 단량체 및 이량체 Ig 분획물을 진단 ANA(HEp-2 액틴) 슬라이드(INOVA Diagnostics, Inc., San Diego, US)상에서 30분동안 200㎍/ml에서 항온처리함에 이어서 PBS중에서 5분의 세척 단계를 수행한다. 이어서, FITC 표지된 항-사람 IgG 접합체(INOVA Diagnostics, Inc., San Diego, US)를 20분동안 항온처리함에 이어서 PBS중에서 5분동안 세척한다. ACT-1 소프트웨어(Nikon)를 사용하여, 형광 현미경(Nikon E600, Eclipse)상에서 400 x 배율에서 이미지를 수득하였다.
도 15
이량체는 HepG2 세포에 대해 증가된 자가 반응성을 보여준다
HepG2(간암) 세포를 10% FCS가 보충된 DMEM 배양 배지에서 컨플루언스할때까지 성장시켰다. 당해 세포를 트립신 처리하고 용해시키기 전에 PBS에서 2회 세척했다. 세포 단백질을 트리클로르아세트산으로 침전시켜 이전에 도 7에서 기재된 바와 동일한 과정을 사용하여 후속 2D-PAGE를 준비한다. 수득한 2차원 겔(은 염색, 도 1a 참조)을 니트로셀룰로스에 전달하고 0.15% 카세인 함유 PBS로 차단시키고 10㎍/ml의 단량체(도 1b) 또는 이량체(도 1c) IgG 분획물과 함께 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 1:1000의 PBS-카세인(0.15%)중에서 알칼린 포스파타제 접합된 염소-항-사람 IgG 항체 및 알칼린 포스파타제 전개 키트(BioRad Inc.)를 사용하여 전개하였다.
도 16
이량체는 상이한 동물 종 기원의 상피 세포의 세포내 단백질에 대해 증가된 활성을 보여준다
원숭이 기원의 상피 세포(COS-7), 사람 기원의 상피 세포(HEP-G2, HEp-2) 및 햄스터 기원의 상피 세포(CHO)의 FACS 분석. 랫트 호염기성 백혈병 세포 야생형(RBL wt)는 대조군 비-상피 세포(FACS 프로필은 나타내지 않음)로서 사용하였다.
유동 세포측정을 위해, 모든 접착된 세포주를 PBS-EDTA 0.03%를 사용하여 탈착시키고 PBS-카세인 0.15%(w/v)중의 1%(v/v) 파라포름알데하이드(Sigma, Buchs, Switzerland)를 사용하여 고정화시키고 PBS-카세인 0.15%(w/v)중의 0.3% 사포닌(Sigma, Buchs, Switzerland)(w/v)를 투과시켰다. 2회 다단계 과정으로 간접적인 염색을 수행하였다: (1) 비투과된 세포 또는 투과된 세포를 각각 20분동안 PBS-카세인 0.15%(w/v) 또는 PBS-카세인 0.15%/사포닌 0.3%(둘다 w/v)중의 IVIG, 단량체 또는 이량체 Ig 분획물 50㎍을 사용한 항온처리, (2) 이소타입 특이적 FITC-표지된 양 항사람 IgG-FC(PFO04, 결합 부위, 버밍햄)를 사용하여 20분동안 항온처리. 당해 2개의 항온처리 이후 PBS중에서 2회 5분간의 세척 단계를 수행한다. 유동 세포 측정 데이타는 세포 추적 프로 소프트웨어(Becton-Dickinson)를 사용하는 FACS 칼리버(FACSCalibur) 장비로 수득하고 후속 데이타 분석을 위해 WinMDI 소프트웨어(ⓒJoseph Trotter)를 사용하였다.
Figure 112007040450217-PCT00001
면역도트 블롯a 및 ELISAb로 부터의 결과 요약
면역도트(Immunodot): 10, 100 및 500ng 항원을 사용한 공기 건조된 도트: 차단: 탑 블록, 1,5시간, 실온(RT). 10, 100 및 500㎍/ml의 제1 항체(이량체/단량체): 4℃에서 밤샘 항온처리. 제2 항체: AP004(결합 부위) 양 항사람 IgG 퍼옥시다제(2시간, RT).
반응성:
+ 10ng 항원 도트에 대한 100㎍/ml의 면역글로불린 제제의 강한 반응성
+/- 500ng 항원 도트에 대한 500㎍/ml의 면역글로불린 제제의 약한 반응성
- 500ng 항원 도트에 대한 500㎍/ml의 면역글로불린 제제의 무반응
ELISA: 10, 1㎍/ml로 피복된 항원. 차단 PBS/카세인 2시간 37℃. 제1 항체(이량체/단량체) 10, 100 및 1000㎍/ml: 37℃에서 4시간. 제2 항체: AP004(결합 부위) 양 항사람 IgG 퍼옥시다제, 1/1000(2시간, 37℃).
반응성: 10㎍/ml 항원에서의 반응성과 100㎍/ml 면역글로불린 분획물의 반응성과의 비교. ++ 단량체 보다 로그 배수 이상의 적정된 이량체 시그날, + 기준선 이상의 명백한 시그날, +/- 약한 시그날이지만 여전히 기준선 이상, - 시그날 부재.
본 발명자는 IVIG 제제중에서 발견된 단량체 및 이량체 분획물의 차등 반응성을 연구하였다. 본 발명자는 생체내 임상용 지침에 따라 가용화시킨 동결건조된 제제를 사용하였다. 또한 SAGL(산도글로불린에 대한 약어)로 호칭되는 당해 IVIG를 이어서 분별하고 추가의 실험을 위해 20℃에서 저장하였다. 당해 IVIG는 모든 추가 분석에서 표준으로서 사용하여 단량체 및 이량체 분획물의 분리 조건을 설정한다. 본 결과는 자가/자기 및 외부 항원 둘다에 대한 당해 분획물의 차등 반응성 패턴을 나타냈고 이는 다양한 기술을 사용하여 확인되었다.
1) IVIG의 단량체 및 이량체 분획물의 분리
분획화를 최적화하기 위해, 본 발명자는 여러 다양한 칼럼 유형(세파크릴, 슈퍼로스, 레프로실) 및 상이한 조건(완충액, 유속, 칼럼 크기)을 시험하였다. 세파크릴 S-300, 반-정제용 HPLC 시스템, 조합된 우수한 피크 분리, 고순도의 분획물, 단기 시험 시간 및 분획물중 고농도의 단백질, 도 1 및 2를 참조한다. 분리된 분획물은 도 3에 나타낸 바와 같이 HPLC로 즉시 분석하였다. 이전의 보고와 일치하여 본 발명자는 이량체가 완충액, pH, 온도, 단백질 농도 및 저장 시간에 의해 영향받아 역학적 불안정성(즉, 단량체 형태로 재전환되는 경향)을 나타냄을 관찰하였다. 도 4는 실온에서 저장될때 분리된 이량체 분획물의 쇠퇴에 대한 역학을 보여준다. 이량체 IgG는 수시간내에 보다 안정한 이량체 집단으로 감소하고 이의 범위는 본래의 이량체의 20 내지 30% 범위가 된다. 일반적으로, 이량체의 형성은 느린 반면 이의 쇠퇴는 보다 신속하다. 대조적으로, 단량체 분획물은 몇주 이상 안정하고 이량체를 재형성하지 않는다.
2) 해리된 이량체 제제의 제조:
동력학적으로 안정하고 일단 주사된 이량체의 생체내 해리를 묘사하는 이량체 분획물을 제조하기 위해, 단량체 성분들로 효과적으로 전환되는 해리된 이량체 분획물을 사용하였다. 최적의 pH 조건은 pH가 4 내지 7인 완충액에 대해 이량체 및 단량체 둘다를 투석(대조군용)함에 의해 시험하였다. 투석 후 즉시 투석된 분획물을 HPLC 분석하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 이량체 해리를 위한 최적의 pH는 pH 4(잔류 이량체 함량이 10% 미만으로 감소함)인 반면 pH 5 및 7에서의 투석으로 잔류하는 이량체 함량은 각각 39.41% 및 55.19%이다. 단량체 분획물은 시험된 모든 pH 조건하에서 매우 안정하다. 이것은 이량체 분획물이 크기 배척에 의해 분리됨에 이어서 이량체 IgG를 단량체로 전환시키는 처리(예를 들어, 본 발명자는 pH 4.0에서 아세트산으로의 투석을 사용하였다)에 적용됨을 의미한다. 이것은 10mM 아세트산 pH 4.0으로의 최소 24시간 투석을 요구한다. 이후, 당해 해리된 이량체 제제는 5% 미만의 이량체를 함유하였고 동력학적으로 안정한 상태로 남아있으며 특정 저장 및 사용 조건하에서 이량체로 재전환되지 않는다. 추가로, PBS 완충액중에서 pH 7.4로의 해리된 이량체의 중화는 실온에서도 24시간 저장시까지 이후 이량체 %에는 어떠한 효과를 미치지 않는다. 따라서, 반응성을 평가하는데 사용되는 분석 조건 동안에 해리된 이량체는 해리된 상태로 남는다. 단량체와 이량체의 동등한 비교를 위해, 또한 단량체를 동일한 처리에 적용하고 동일한 완충 시스템에서 비교하였다. 사용되는 다양한 분획물의 분리 및 제조를 위해 최적화된 흐름도의 예는 도 5에 나타낸다.
3) 단량체 제제 및 해리된 이량체 제제의 특징 분석
분획물 둘다는 2D 겔 전기영동상에서 중쇄 및 경쇄에 대해 예상된 전체 패턴을 나타낸다. 이량체 분획물은 도7에서와 같이 등전점 분포가 보다 광범위하게 산성 영역으로 연장되는 경향을 보여주었다. 비교 이소타입 분석은 이량체 분획물에서 IgG 1, 2, 4 및 약간 증가된 IgG3이 동일한 분포를 나타냄을 보여주었다.
4) 단량체 제제 및 해리된 이량체 제제의 차등 반응성
상이한 분석 범위에서 외부- 및 자가/자기 항원 둘다에 대한 반응성을 수행하였다. 요약하여, 이량체 분획물은 자가-항원 및 외부항원 둘다의 특정 항원에 대해 증가된 반응성을 보여준다. 몇몇 경우에, 본 발명자는 또한 이량체에서 명백 하게 증가된 반응의 친화성을 측정하였다. 본 발명자는 반응성이 단량체 또는 이량체중 하나에서만 나타나는 항원 특이성을 밝히지 못했다. 단량체 또는 이량체에서 어떠한 검출가능한 항체 반응성이 검출되지 않는 항원이 있다.
도 8은 스트렙토코커스 피오게네스의 사람 재조합 M5 단백질(바이러스 독성 인자)를 사용한 ELISA의 결과를 도시한다. 당해 이량체는 T0(시간 제로에서 제조되고 동결된 IVIG)로서 정의된 단량체 또는 IVIG 제제 또는 pH 4.0으로서 정의된 IVIG와 비교하여 명백하게 증진된 반응을 보여준다(IVIG는 이량체와 동일한 완충액으로 투석됨).
도 9는 외부항원, 파상풍 독소, 에스. 피오게네스의 M1, RSV 및 에이취. 인플루엔자 B에 대한 결과를 보여준다. 이량체는 명백하게 증진된 반응을 보여주고 이것은 분획물 둘다에서 동일한 반응성을 나타내는 에이취. 인플루엔자 B를 제외하고는 친화성 측정에 의해 확인되었다.
도 10은 단량체와 비교하여 이량체에서 증가된 항-RSV 활성을 보여준다. pH 7 및 pH 4에서 비분리된 IVIG, pH 4에서 단량체 및 pH 4에서 이량체의 중화 작용을 평가하였다. 이들 4개의 IVIG 분획물을 적정하여 90% 초과의 HEp-2 세포가 감염으로부터 보호되는 IgG 농도를 측정하였다. HEp-2 세포의 RSV 감염 검출은 면역 형광 염색(도 10)에 의해 나타났다. 시험된 IVIG 분획물에 따라 다양한, 명백한 용량 의존성이 나타났다. 중화 활성에서 가장 명백한 차이는 pH 4에서 단량체 및 이량체를 비교하는 경우 나타난다. 동일양의 RSV 입자를 100% 중화시키는데 이량체(46.8㎍/ml) 보다 단량체(187㎍/ml)가 훨씬 많이 요구되었다.
도 11은 쇼그렌 증후군의 표적 항원중 하나인 M3R 펩타이드에 대해 단량체에서 보다 이량체에서 증가된 활성을 보여준다. M3R에 대한 자가항체는 보다 특히 해리된 이량체에서 IVIG 제제중에 존재하고 이는 정상적인 생리학적 조건하에서 당해 자기항체의 항-유전자형 대조군이 존재함을 시사한다.
도 12는 세포외 자가 항원과 비교하여 세포내 기관에 위치한 자가 항원에 대한 이량체의 우선적 반응성을 보여준다.
도 13은 슈도모나스 아에루기노사의 다양한 리포폴리사카라이드 혈청형(IATS에 의해 분류됨)에 대해 명백히 증가된 단량체의 활성을 보여준다. 비교에서, 이량체는 단백질인 독소 A에 대해 증가된 활성을 보여주었다.
도 14는 면역조직학적 분석을 위해 HEp-2 세포를 사용한 결과를 보여준다. 이들 세포는 통상적으로 다양한 자가면역 질환에서 핵, 리보솜 및 미토콘드리아 항원과 반응하는 것으로 밝혀진 자가항체를 검출하기 위한 진단 실험에서 사용된다. 반응성에 대해 어떠한 병리학적 패턴이 나타나지 않는다. 대신에, 보다 높은 배율에서 세포의 세포골격 성분처럼 보이는 이량체 분획물의 활성이 명백하였다.
도 15는 이전에 HEp-2(상피) 세포에 대한 면역형광에 의해 관찰되는 결과를 확인시켜준다. 당해 도면은 HepG2 세포의 프로테옴의 2D 분석에 이어서 단량체 또는 이량체 분획물중 하나를 사용한 웨스턴 블롯을 보여준다. 단량체 분획물과 비교하여 이량체에서 자가반응성의 증가가 나타난다. 당해 반응성의 증가는 스팟 픽킹 및 질량 분광기에 의한 분석에 의해 측정되는 바와 같이 면역우성 서브세트의 자가항원이 제한되고 명백하기 때문이다.
도 16은 상이한 유형의 상피 세포에 대한 FACS 분석 결과를 보여준다. 세포는 처리되지 않거나, 투과성이 되도록 처리되어 막 염색과 세포내 염색이 명백한 차이가 있도록 한다. 이량체는 시험된 모든 상피 세포에 대해 증가된 세포내 반응성을 보여준다. 기준선 이상의 상당한 염색이 비투과성 세포에서는 관찰되지 않았고 이는 시험된 모든 분획물에 대한 막 단백질의 반응성이 결여되어 있음을 시사한다. 대조적으로, 대조군 비상피 세포주(프로필은 나타내지 않음)로서 사용되는 비처리된 RBL 세포는 Fc-감마 수용체와 상호작용할 것으로 추측되는 모든 분획물에서 동일한 염색을 보여주었다.
표 1은 ELISA 및 면역도트 분석 둘다로부터의 누적 데이타를 나타내고 여기서, 각각의 항원은 고정화되고 특정 농도 범위의 단량체, 이량체 및 대조군으로서 IVIG 개시 제제와 반응하도록 방치하였다. 간편한 비교를 위해, 단량체와 이량체는 단순한 반응성 스케일(++ 내지 -)상에서 비교하였다. 차등 반응성이 단량체와 이량체간에 명백하게 관찰된다. 또한 몇몇 자가 항원, 즉, 미오신 및 포스포릴라제 B가 단량체와 반응하지만 이량체와 증가된 반응성을 나타내는 것 처럼 보인다.
요약
상기 결과를 기초로, 이량체 분획물은 보다 성숙한 항체 레퍼토리를 포함하고 세포내 자가항원에 대한 활성이 명백하게 나타난다. 면역 항체 및 천연 항체 둘다로 이루어진 단량체 분획물과는 대조적으로 몇몇 폴리사카라이드 항원과 우선적으로 반응할 수 있다.
이량체 분획물은 보다 높은 친화성 항체를 함유하고 따라서 당해 분획물은 또한 항세균, 항독소 또는 항바이러스성 항체의 경우에 중화 활성과 같은 생물학적 활성이 보다 높을 수 있다. 따라서, 이량체 분획물은 특정 항원에 대해 보다 높은 특이적 활성을 갖는 IVIG의 하위분획물이다. 이것은 또한, 면역계가 항상성을 유지하기 위한 네가티브 피드백 또는 하향 조절에 의해 생산되는 고친화성 항체에 응답해야만 하기 때문에 당해 분획물중에 항-유전형 항체가 존재함을 제시한다.
단량체 분획물은 천연 항체, 즉 고친화성 항체의 개발에 요구되는 기본 레퍼토리를 제공하는 저친화성 항체를 함유한다.
참조문헌
Figure 112007040450217-PCT00002
상기 참조문헌 모두는 본원에 참조로서 인용된다.

Claims (27)

  1. 이종성 사람 공여자 집단의 이량체 사람 항체로부터 기원하는 사람 항체 또는 이의 항원 결합 단편 분획물을 포함하는 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 사람 항체 분획물이 폴리클로날 사람 면역글로불린 제제로부터 기원하는 이량체 항체 분획물인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 사람 항체 분획물이 정맥내 폴리클로날 사람 면역글로불린 제제(IVIG)로부터 기원하는 이량체 항체 분획물인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체 항체의 순도가 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상 및 보다 바람직하게는 85% 이상인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 항체가 비분획화된 면역글로불린 제제 보다 2배 이상의 반응성을 갖는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 항체의 이량체 분획물이 이종성 공여자 집단 기원의 사람 항체 제제의 크기 분획화 및 겉보기 분자량이 약 300kDa인 항체 이량체 회수에 의해 수득될 수 있는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 크기 분획화가 크기 배척, 분리, 겔 여과, 한외여과 및/또는 기타 겔 또는 막 분리 방법을 포함하는 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체 항체 또는 항체 단편이 해리되거나 단량체화된 형태로 존재하는 조성물.
  9. 바이러스, 세균, 진균류, 원생동물 또는 기생충 감염과 같은 감염에 대한 억제 약물을 제조하기 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  10. 제9항에 있어서, 감염이 급성 감염인 용도.
  11. 자가면역 장애 억제 약물의 제조를 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  12. 쇼그렌 증후군 억제 약물을 제조하기 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 자가면역 장애 억제 약물이 자가면역 항상성 의 유지 및/또는 회복용 약물인 용도.
  14. 이종성 사람 공여자 집단의 단량체 사람 항체로부터 기원하는 사람 항체 또는 이의 항원 결합 단편 분획물을 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 사람 항체 분획물이 폴리클로날 사람 면역글로불린 제제 기원의 단량체 항체 분획물인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 사람 항체 분획물이 정맥내 폴리클로날 사람 면역글로불린 제제(IVIG) 기원의 단량체 항체 분획물인 조성물.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단량체 항체의 순도가 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상 및 보다 바람직하게는 93% 이상인 조성물.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 항체의 단량체 분획물이 이종성 공여자 집단 기원의 사람 항체 제제의 크기 분획화 및 겉보기 분자량이 약 150kDa인 항체 단량체 회수에 의해 수득될 수 있는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 크기 분획화가 크기 배척 분리, 겔 여과, 한외여과 및/또는 기타 겔 또는 막 분리 방법을 포함하는 조성물.
  20. 면역 항상성 유지를 위한 약물을 제조하기 위한 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  21. 제20항에 있어서, 면역 항상성 유지를 위한 약물이 어린이, 나이든 사람 또는 면역손상된 사람, 예를 들어, 면역계를 손상시키는 장애를 앓는 사람 또는 면역계를 손상시키는 치료를 받고 있는 사람 투여용 약물인 용도.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 면역 항상성 유지를 위한 약물이 노화 방지 또는 회춘 치료용 약물인 용도.
  23. 바이러스, 세균, 진균류, 원생동물 또는 기생충 감염과 같은 감염 억제 약물을 제조하기 위한 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  24. 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 혈청형에 의해 유발되는 감염 치료용 약물을 제조하기 위한, 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  25. (a) 이종성 공여자 집단 기원의 사람 항체 제제를 크기 분획화시키는 단계,
    (b) 이량체 항체 분획물을 회수하고 임의로 이량체 항체를 단량체화시키는 단계 및
    (c) 단량체 항체의 분획물을 회수하는 단계
    를 포함하는, 이종성 사람 공여자 집단 기원의 사람 항체 또는 항원 결합 단편의 분획물을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하기 위한 방법.
  26. 제25항에 있어서, 단량체 사람 항체의 분획물이 약 150kDa의 겉보기 분자량을 갖고 이량체 항체의 분획물이 약 300kDa의 겉보기 분자량을 갖고 있음을 특징으로 하는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 분획물 (b) 및 (c)가 상이한 약제학적 응용의 약물을 제조하기 위해 사용되는 방법.
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