KR20070085274A - 클로스트리디움계 독소 활성을 결정하기 위한 란타나이드계기질 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) 란타나이드 도너 복합체; (b) 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 (c) 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다.
Description
본 발명은 개괄적으로 프로테아제 에세이에 관한 것으로, 특히, 란타나이드를 포함하는 기질을 사용하여 보툴리눔 독소 및 파상풍 독소와 같은 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 결정하기 위한 방법에 관한 것이다.
파상풍의 신경마비 증후군 및 드물지만 잠재적으로 치명적인 질환인 보툴리즘은 클로스트리디움 속 세균에 의해 생성된 신경독에 의한 것이다. 클로스트리디움계 신경독은 매우 강력하며, 신경세포에 특이적인 독으로, 보툴리눔 독소의 사람 치사량은 나노그램 수준이다. 따라서, 식료품에 단지 미소한 정도의 보툴리눔 독소만 존재해도, 공중의 건강에 위험을 초래하므로 엄격한 테스트를 통해 막아야만 한다.
그러나, 잠재적으로 해로운 효과에도 불구하고, 낮은 제어된 투여량의 보툴리눔 신경독은 몇가지 미용 목적을 위한 치료제로서 성공적으로 사용된다. 특히, 보툴리눔 독소는 콜린성 신경 말단 활성의 가역적인 억제가 필요한 다양한 안면 및 부분 디스토니아, 사시 및 다른 질환의 치료적 관리에 사용되어 왔다. 사람에 대 한 보툴리눔 독소 신경독의 확립된 치료학적 용도는 안검경련, 반측안면 경련, 인후부 디스토니아, 안면 다한증, 타액분비과다, 근긴장성 디스토니아(oromasibylar dystonia), 경부 디스토니아, 사경, 사시, 사지 티스토니아, 직업상 경련(occupational cramp) 및 근육잔떨림을 포함하나 이에 제한되지는 않는다(Rossetto 등 , Toxicon 39: 27-41 (2001)). 예를 들어, 경련 조직에 적은 양의 보툴리눔 신경독 A를 근육내 주사하여 뇌 손상, 척수 손상, 졸중, 다발성 경화증 및 대뇌 마비로 인한 경련을 효과적으로 처치하였다. 클로스트리디움 신경독의 추가적으로 가능한 임상 용도가 조사되고 있다.
식품 중 소량의 보툴리눔 독소와 관련된 잠재적인 위험이 있고, 정확한 약제학적 조성을 준비할 필요가 있으므로, 식품 및 약제 산업에서는 보툴리눔 신경독에 대한 에세이를 사용한다. 식품 산업은 새로운 식품 포장 방법을 허가하고, 식품 안정성을 확인하기 위해서 보툴리눔 독소에 대한 에세이가 필요하다. 보툴리눔 독소의 증대되는 임상적 용도로 인해 제품 조성뿐아니라 질적 컨트롤을 위해 보툴리눔 신경독 활성에 대한 정확한 에세이가 필요하다. 두가지 산업 모두에서, 마우스 치사 테스트가 현재 보툴리눔 신경독 활성에 대해 유일한 허용가능한 에세이이다.
불행히도, 마우스 치사 에세이는 몇가지 문제점이 있다: 많은 수의 실험동물이 필요하므로 비용이 많이 들고; 특이성이 부족하며; 많은 동물 그룹을 사용하지 않는 경우 부정확할 가능성이 있고; 동물을 희생시켜야만 한다. 따라서, 마우스 치사 에세이를 보완할 수 있고 필요성을 감소시킬 수 있는 간편한 합성 기질에 기초한 새로운 방법이 요구된다. 본 발명은 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활 성을 결정하기 위한 신규한 에세이를 제공함으로써 이러한 요구를 충족시키면서, 관련된 장점을 또한 제공한다.
본 발명은 (a)란타나이드 도너 복합체; (b) 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 (c) 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 시료로 (i) 란타나이드 도너 복합체; (ii) 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 (iii) 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 처리하고; (b) 란타나이드 도너 복합체의 안테나를 여기(exciting)시키고; (c) 처리된 기질의 공명 에너지 전이를 대조구 기질과 비교하여 결정하고, 대조구 기질과 비교한 처리된 기질의 공명 에너지 전이의 차이로서 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 표시함으로써, 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 결정하는 방법을 제공한다.
또한, (a)란타나이드 이온을 가진, 란타나이드 도너 복합체; (b) 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; (c) 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는, 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다.
본 발명은 신규한 기질 및 모든 세로타입의 보툴리눔 독소 뿐아니라 파상풍 독소를 포함하는 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 결정하기 위한 방법에 관한 것이다. 테르븀과 같은 란타나이드 이온을 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질에 의존적인 본 발명의 신규한 방법은 동물 독성 연구의 필요성을 감소시키며, 고순도의 이중사슬 또는 단일 사슬 독소 또는 조성된 독소 제품뿐아니라 조시료(crude sample) 및 벌크 시료를 분석하는 데 사용할 수 있다. 신규한 본 발명의 란타나이드계 방법은 균질한 용액-상 에세이(homogeneous solition-phase assays)로서 실시될 수 있으며, 자동화된 하이 스루풋 포맷으로 수정이 가능한다. 게다가, 본 발명의 방법은 비-특이적인 백그라운드 형광을 포함하는 시료를 분석하는 데 특히 유용한 시간-분해 에세이(time-resolved assaya)로서 실시될 수 있다.
실시예 I에 설명한 바와 같이, 재조합 융합 단백질은 SNAP-25의 일부분에 융합된 녹색 형광 단백질을 포함하여 제조되며, 카르복시-말단 시스테인을 포함하도록 가공되었다. 말레이미드 화학을 루미포어 CS124-DTPA-EMCH-Tb로 GFP-SNAP25(134-206)-His6-C의 카르복시-말단 시스테인을 유도체화시키는 데 사용하였다. GFP-SNAP25(134-206)-His6-C로 표지된 CS124-DTPA-EMCH-Tb의 흡수 및 방출 스펙트럼을 도 9A 및 9B에 각각 나타내었다. 도 9B에서 알 수 있듯이, 330nm에서 감작 그룹(sensitizing group) 카보스티릴 124(CS124)의 방출로 인해 일련의 4개의 주요한 뾰족한 밴드가 490nm, 546nm, 586nm 및 622nm에서 얻어지는 장시간의 테르븀 방출 특성이 나타난다.
또한 실시예 II에 설명한 바와 같이, 클로스트리디움계 독소 기질은 벌크 BoNT/A 독소의 활성을 민감하게 분석하는 데 유용하다. 특히, 란타나이드 도너 복합체 및 GFP 사이의 너지 전이가 586nm에서 테르븀 방출을 모니터링하여 관찰되었다. 도 10A에 나타낸 바와 같이, 감소된 벌크 BoNT-A 독소를 가한 다음 586nm에서 루미네선스 강도가 현저히 증가하였으며, 이는 란타나이드 도너 복합체와 GFP 사이의 퀀칭(quenching)이 제거되었음을 표시한다. 더욱이, 도 10B에 나타낸 것과 같은 방출을 모니터하기 위해 게이티드 프로세스를 사용함으로써 방출 프로세스의 신호 대 잡음비가 크게 향상되었고, 실선은 기질의 턴오버 전 게이티드 테르븀 방출을 나타내고 점선은 턴오버 후 게이티드 테르븀 방출을 나타낸다.
총괄하면, 이러한 결과들은 란타나이드 도너 복합체와 GFP 사이의 퀀칭을 나타내는 클로스트리디움계 독소 기질을 생성하도록, CS124-DTPA-EMCH-Tb와 같이 상업적으로 입수가능한 란타나이드 도너 복합체를 사용하여 GFP-SNAP25(134-206)-His6-C를 유도체화할 수 있다는 것을 나타낸다. 클로스트리디움계 독소를 가했을 때 루미네선스 강도가 증가한 것에 의해 표시되는 퀀칭의 제거(relief of quenching)는 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 표시한다. 이러한 결과들은 또한 본 발명의 란타나이드-계 기질을 사용하여 클로스트리디움계 독소 활성을 에세이할 때 게이티드 방출을 사용하면 백그라운드를 감소시키는 데 유용할 수 있다는 것을 나타낸다.
이러한 점들에 기초하여, 본 발명은 (a)란타나이드 도너 복합체; (b) 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 (c) 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 형광 수명이 적어도 500μs인 란타나이드 도너 복합체를 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 형광 양자 수율(fluorescence quantum yield)이 적어도 0.05인 란타나이드 도너 복합체를 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 형광 양자 수율이 적어도 0.5인 란타나이드 도너 복합체를 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다.
란타나이드 도너 복합체에 유용한 란타나이드 이온은 테르븀 이온, 유로퓸 이온, 사마륨 이온 및 디스프로슘 이온을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 란타나이드 도너 복합체에 유용한 란타나이드-결합 부위는 예를 들어, 란타나이드 이온에 대한 친화도가 적어도 5μM인 것을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이는 EF 핸드 모티프의 배위 부위를 포함하거나 EF 핸드 모티프를 포함하는 것과 같은 펩티드 및 펩티도미메틱을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 란타나이드 도너 복합체에 유용한 란타나이드-결합 부위는 또한 티올-반응성 킬레이터; 디에틸렌트리아민펜트아세트산(DTPA); β-디케톤 킬레이트; 폴리아미노폴리카복실산 킬레이트; 칼릭사렌 킬레이트; 폴리페놀; DOTA; 피리딘 및 폴리피리딘을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 추가적으로, 본 발명에 유용한 란타나이드-결합 부위는 트리비피리딘(TBP) 클립테이트; 트리스비피리딘 테트라카복실레이트(TBP4COOH) 크립테이트; 트리스비피리딘 펜타카복실레이트(TBP5COOH) 크립테이트; 및 피리딘 비피리딘 테트라카복실레이트(PBP4COOH)를포함하나 이에 제한되지는 않는다.
란타나이드 도너 복합체는 도너 복합체의 란타나이드-결합 부위와는 구별되는 또는 그 안에 포함되는 안테나를 포함한다. 본 발명에 유용한 안테나는 카보스티릴124(CS124), 트립토판, 또는 2-히드록시이소프탈아미드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명은 안테나로서 카보스티릴124(CS124)를 포함하는 란타나이드 도너 복합체를 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 란타나이드 도너 복합체가 CS124-DTPA-EMCH-Tb인 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다.
알렉사 플루오르 염료와 같은 억셉터 플루오로포어 및 다른 비-단백질 억셉터를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 억셉터가 본 발명의 클로스트리디운 독소 기질에 유용하다. 본 발명에 유용한 억셉터 플루오로포어는 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(BFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 및 적색 형광 단백질(RFP)이 포함된다. 일 실시형태에서, 본 발명은 억셉터로서 녹색 형광 단백질을 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다. 헴 단백질(heme protein)을 포함하나 이에 제한되지 않는 비-형광 억셉터가 또한 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질에 유용하다.
다양한 인식 서열이 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질에 포함될 수 있다. 일 실시형태에서, 인식 서열은, SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하는 BoNT/A 인식 서열과 같은 BoNT/A 인식 서열이나, 이에 제한되지는 않으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Gln-Arg, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. BoNT/A 인식 서열은 예를 들어 SEQ ID NO:2의 잔기 134 내지 206을 포함할 수 있다. 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질에 포함되는 인식 서열은 또한 BoNT/B 인식 서열일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. BoNT/B 인식 서열은 예를 들어 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함할 수 있으며, 여기서 6개의 연속된 잔기들은 Gln-Phe 또는 이의 펩티도미메틱을 포함할 수 있다. 또다른 실시형태에서, 클로스트리디움계 독소 기질에 포함된 인식 서열은 또한 BoNT/C1 인식 서열일 수 있다. 이러한 BoNT/C1 인식 서열은 신택신의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Lys-Ala 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 본 발명에 유용한 BoNT/C1 인식 서열은 또한 SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함할 수 있으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Arg-Ala 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다.
또다른 실시형태에서, 클로스트리디움계 독소 기질에 포함되는 인식 서열은 BoNT/D 인식 서열이다. 이러한 BoNT/D 인식서열은 예를 들어, VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함할 수 있으며, 여기서 6개의 연속된 잔기들은 Lys-Leu 또는 이의 펩티도미메틱을 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 인식 서열은 또한 예를 들어 BoNT/E 인식 서열일 수 있다. 이러한 BoNT/E 인식 서열은 SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함할 수 있으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Arg-Ile 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 클로스트리디움계 독소 기질에 포함되는 인식 서열은 BoNT/F 인식 서열이다. 본 발명에 유용한 BoNT/F 인식 서열은 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Gln-Lys 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 클로스트리디움계 독소 기질에 포함되는 인식 서열은 BoNT/G 인식 서열일 수 있다. 이러한 BoNT/G 인식 서열은 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Ala-Ala 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질에 포함되는 인식 서열은 파상풍 독소(TeNT) 인식 서열이다. 이러한 TeNT 인식 서열은 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Gln-Phe 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다.
본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질은 다양한 길이의 펩티드 또는 펩티도미메틱을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질은 최고 300개의 잔기 또는 최고 150개의 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱이다. 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질은 일정 정도의 활성을 가지고 절단될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질은 적어도 1 나노몰/분/밀리그램 독소의 활성을 가지고 절단될 수 있다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질은 적어도 20 나노몰/분/밀리그램 독소의 활성을 가지고 절단될 수 있다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질은 적어도 100 나노몰/분/밀리그램 독소의 활성을 가지고 절단될 수 있다.
본 발명은 또한 (a)란타나이드 이온을 가진, 란타나이드 도너 복합체; (b) 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; (c) 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는, 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명이 핵산 분자는 다양한 길이의 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화할 수 있으며; 특정 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 최대 30개 잔기 길이 또는 최대 150개 잔기 길이의 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화한다.
란타나이드 도너 복합체는, 일부분, 란타나이드-결합 부위를 포함한다. 임의의 다양한 란타나이드-결합 부위가 본 발명에 유용하며, 예를 들어 EF 핸드 모티프의 배위 부위를 포함하는 것 및 EF 핸드모티프를 포함하는 것이 있으나 이에 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 란타나이드 도너 복합체는 안테나로서 작용하는 트립토판 잔기를 포함한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 억셉터가 억셉터 플루오로포어인 클로스트리디움계 독소 기질를 암호화한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 억셉터 플루오로포어가 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(BFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 도는 적색 형광 단백질(RFP)인 클로스트리디움계 독소 기질를 암호화한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 억셉터가 헴 단백질과 같은(이에 제한되지는 않음) 비-형광 억셉터인 클로스트리디움계 독소 기질를 암호화한다.
본 발명의 핵산 분자에 의해서 암호화된 클로스트리디움계 독소 기질은 임의의 다양한 인식 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자에서, 암호화된 인식 서열은 예를 들어, SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하는 BoNT/A 인식서열과 같은 BoNT/A 인식 서열일 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Gln-Arg, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 이러한 BoNT/A 인식 서열은 예를 들어 SEQ ID NO:2의 134 내지 206을 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자에 유용한 암호화된 인식 서열은 또한 BoNT/B 인식 서열일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 BoNT/B 인식 서열은 예를 들어 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함할 수 있으며, 여기서 6개의 연속된 잔기들은 Gln-Phe 또는 이의 펩티도미메틱을 포함할 수 있다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산은 BoNT/C1 인식 서열을 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화한다. 이러한 BoNT/C1 인식 서열은 신택신의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Lys-Ala 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 본 발명에 유용한 BoNT/C1 인식 서열은 또한 SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함할 수 있으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Arg-Ala 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 BoNT/D 인식 서열을 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화한다. 이러한 BoNT/D 인식서열은 예를 들어, VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함할 수 있으며, 여기서 6개의 연속된 잔기들은 Lys-Leu 또는 이의 펩티도미메틱을 포함할 수 있다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 BoNT/E 인식 서열을 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화한다. 이러한 BoNT/E 인식 서열은 SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함할 수 있으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Arg-Ile 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 BoNT/F 인식 서열을 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화한다. 본 발명에 유용한 BoNT/F 인식 서열은 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Gln-Lys 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 또한 BoNT/G 인식 서열을 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화한다. 이러한 BoNT/G 인식 서열은 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Ala-Ala 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 TeNT 인식 서열을 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화한다. 이러한 TeNT 인식 서열은 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Gln-Phe 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다.
본 발명의 기질 또는 방법을 사용하여 에세이할 수 있는 파상풍 및 보툴리눔 신경독은 Clostridia에 의해서 생성된다. 이러한 독소는 파상풍 및 보툴리즘의 신경마비 증후군을 야기하며, 파상풍 독소는 주로 중추 신경계에 작용하고, 보툴리눔 독소는 말초 신경계에 작용한다. 클로스트리디움계 독소는 신경전달 물질의 방출이 억제되는 세포 중독(cell intoxication)과 유사한 메카니즘을 공유한다. 두개의 디설파이드-결합된 폴리펩티드 사슬로 구성되는 이러한 독소에서, 더 큰 서브유닛은 신경특이적인 결합 및 더 작은 서브유닛의 세포질로의 전위(translocation)의 원인이 된다. 뉴런의 전위 및 환원 시에, 더 작은 사슬은 뉴로엑소사이토시스(neuroexocytosis)를 포함하는, 단백질 구성 요소에 특이적인 펩티다아제 활성을 나타낸다. 클로스트리디움계 독소의 "SNARE" 단백질 표적은 다양한 비-뉴런 타입에서의 엑소사이토시스와 공통되며; 이러한 세포에서는, 뉴런에서와 같이, 경쇄 펩티다아제 활성이 엑소사이토시스를 억제한다.
파상풍 신경독 및 보툴리눔 신경독 B,D,F 및 G는 특이적으로 VAMP(시냅토브레빈으로도 알려진), 시냅스 소포막의 내재성 단백질(integral protein)을 인식한다. VAMP는 신경독에 따라 별개의 결합을 절단한다. 보툴리눔 A 및 E 신경독은 SNAP-25, 시냅스전 막의 단백질을, 단백질 카르복시-말단 부분의 두가지 상이한 부위에서 특이적으로 인식 및 절단한다. 보툴리눔 신경독 C는 SNAP-25 외에도, 신택신, 신경 원형질막의 단백질을 절단한다. 절단 부위 및 독소 감수성은 반드시 보존되지는 않지만, 클로스트리디움계 신경독의 3가지 단백질 표적은 효모로부터 사람에 이르기까지 보존된다(하기 참조, Humeau et al. , Biochimie 82: 427-446 (2000); Niemann et al., Trends in Cell Biol . 4 : 179-185 (1994); 및 Pellizzari et al. , Phil . Trans . R. Soc . London 354: 259-268 (1999)도 참조) .
천연 파상풍 및 보툴리눔 신경독은 리더 서열이 없는 150kDa의 폴리펩티드 사슬로서 제공된다. 이러한 독소는 노출된 프로테아제-감응성 루프가 박테리아 또는 조직 프로테이나아제에 의해 절단되어 이중사슬 독소를 생성할 수 있다. 선택적인 단백분해 절단은 두개의 디설파이드-결합된 사슬: 50kDa의 L 사슬 및 HN 및 HC 라고 하는 두개의 도메인으로 구성된 100kDa의 H 사슬을 생성하여 독소를 활성화시킨다. 이중사슬 독소는 닉킹되지 않은 독소(unkicked toxin)보다 실질적으로 더욱 활성이 있다. 천연 클로스트리디움계 독소는 중쇄와 경쇄를 다리연결하는 단일 사슬간 디설파이드 결합을 포함한다; 세포 밖에서 가해진 독소의 신경독성에 있어서 이러한 다리연결은 중요하다(Montecucco and Schiavo, Quarterly Rev . Biophysics 28: 423-472 (1995)).
클로스트리디움계 독소는 루프에 의해서 연결되는 별개의 약 50kDa 도메인 3개로 접혀져 있는 것으로 나타나며, 각 도메인은 별도의 역할을 한다. 도 1에 도시한 바와 같이, 클로스트리디움계 독소의 세포 중독 메카니즘은 4가지 개별적인 단계로 구성된다:(1) 결합; (2) 내재화(internalization); (3) 막 전위; 및 (4) 효소적 표적 변형. 중쇄의 카복시-말단부(HC)는 신경특이적인 결합 시에 기능하는 반면에, H 사슬의 아미노-말단부(HN)는 엔도솜으로부터 세포질로 막 전위시에 기능한다. 세포 내의 디설파이드 결합의 환원 후에, L 사슬의 아연-엔도펩티다아제 활성이 살아난다.(Montecucco and Schiavo, supra, 1995).
8가지 사람 클로스트리디움계 신경독의 아미노산 서열을 해당 유전자로부터 유도하였다(Neimann, "Molecular Biology of Clostridial Neurotoxins"in Sourcebook of Bacterial Protein Toxins Alouf and Freer (Eds.) PP. 303-348 London: Academic Press 1991). L 사슬 및 H 사슬은 각각 대략 439 및 843개의 잔기로 구성된다. 유사성이 거의 없거나 전혀 없는 영역에서 상동 부분(homologous segment)을 절단한다. L 사슬의 가장 잘 보존된 영역은 아미노-말단부(100개의 잔기) 및 중앙 영역(TeNT의 잔기 216 내지 244에 해당)뿐아니라, 사슬간 디설파이드 결합을 형성하는 2개의 시스테인이다. 216 내지 244 잔기는 아연-엔도펩티다아제의 His-Glu-X-X-His 결합 모티프 특성을 포함한다.
클로스트리디움계 독소 중쇄는 경쇄보다 덜 보존되며, HC의 카복시-말단부(TeNT의 잔기 1140 내지 1315에 해당)가 가장 변하기 쉽다. HC 도메인이 신경 말단에 결합하는 것에 연관되고, 상이한 신경독이 상이한 수용체와 결합하는 것을 보인다는 사실과 일치한다.
클로스트리디움계 독소의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 비교하면, 공통된 조상 유전자로부터 유도된 것으로 나타난다. 클로스트리디움계 신경독 유전자가 이동가능한 유전자 요소에 위치하기 때문에, 이러한 유전자가 널리 퍼지는 것이 쉬워졌다. 하기에 더욱 설명한 바와 같이, 7가지 보툴리눔 독소의 서열 변형이 공지되어 있다. 예를 들어, Humeau et al. , supra, 2000를 참조한다.
상기한 바와 같이, 클로스트리디움계 신경독의 자연적인 표적은 VAMP, SNAP-25 및 신택신을 포함한다. VAMP는 시냅스 소포체 막에 결합하며, SNAP-25 및 신택신은 표적 막(도 2 참조)에 결합한다. BoNT/A 및 BoNT/E는 카복시-말단 영역에서 SNAP-25를 절단하여, 각각 9개 또는 26개의 아미노산 잔기를 떼어내고, BoNT/C1은 또한 카복시-말단 근처 SNAP-25를 절단한다. 보툴리눔 세로타입 BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F 및 BoNT/G 및 파상풍 독소는 VAMP의 보존된 중앙부에 작용하여, VAMP의 아미노-말단부를 시토졸로 방출한다. BoNT/C1은 시토졸 막 표면 근처의 단일 부위에서 신택신을 절단한다. 따라서, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G 또는 TeNT 단백분해는 VAMP 또는 신택신의 시토졸 도메인의 큰 부분을 떼어 내고, 반면에 SNAP-25의 작은 부분은 BoNT/A, BoNT/C1 또는 BoNT/E 절단에 의해 떼어 내어진다(Montecucco and Schiavo, supra, 1995).
막관통 세그멘트가 없는 약 206개 잔기의 단백질인 천연 SNAP-25은 신경 원형질막(nerve plasmalemma)의 시토졸 표면과 연관된다(도 2 참조, Hodel et al., INT. J. Biochemistry and Cell Biology 30: 1069-1073 (1998)도 참조). 또한, 초파리로부터 표유류에 이르기까지 고도로 보존된 상동체일 뿐아니라, SNAP-25-관련 단백질은 또한 효모로부터 클로닝되었다. SNAP-25는 발생 과정중 엑손 성장에 필요하며, 성숙 신경 시스템에서는 신경 말단 가소성을 위해 필요할 것이다. 사람에서는, 발생 과정중 두가지 이소폼(isoform)이 차별적으로 발현되며; 이소폼 a는 태아 발생 과정동안 구성성분으로 발현되고, 반면에 이소폼 b는 출생시 보여지며, 성인의 삶에서 우세하다. 또한, SNAP-23과 같은 SNAP-25 유사체가 신경계 밖, 예를 들어, 췌장 세포에서 발현된다.
천연 VAMP는 종 및 이소타입에 따라 정확한 길이를 가지는, 약 120개 잔기의 단백질이다. 도 2에 도시한 바와 같이, 대부분의 분자는 시토졸에 노출되는 반면, VAMP는 소포 내강 안쪽에 짧은 카복시-말단 세그먼트를 포함한다. 프롤린-풍부 아미노-말단의 30개 잔기는 종 및 이소폼에 따라 달라지며, 반면에 하전된 잔기 및 소수성 잔기가 풍부하고 공지의 절단 부위를 가지는, VAMP의 중앙부(잔기 30 내지 96)는 고도로 보존된다. VAMP는 시냅토피신(synaptophysin)과 함께 시냅스 소포 막에서 모인다.
사람, 래트, 소, 토르피도, 초파리, 효모, 오징어 및 아프리시아 상동체를 포함하는 VAMP의 다양한 종 상동체(specise homologs)가 공지되어 있다. 또한, 다중 이소폼의 VAMP는 VAMP-1, VAMP-2 및 셀루브레빈을 포함하여 동정되었고, 반응하지 않는 형태는 비-뉴런성 세포로 동정되었다. VAMP-1 및 VAMP-2의 분포는 세포 형태에 따라 다르지만, VAMP는 모든 척추동물 조직에 존재하는 것으로 보인다. 닭 및 래트 VAMP-1는 TeNT 또는 BoNT/B에 의해 절단되지 않는다. 이러한 VAMP-1 상동체는 TeNT 또는 BoNT/B 절단 부위에서, 사람 및 마우스 VAMP-1에 존재하는 글루타민 대신에 발린을 가진다. 이러한 치환은 유사한 비율로 VAMP-1 및 VAMP-2 모두를 절단하는 BoNT/D, /F 또는 /G에는 나타나지 않는다.
신택신은 신경 원형질막의 시토졸 표면에 위치하며, 대부분의 단백질 부분은 시토졸에 노출된 채로, 카르복시-말단 세그먼트가 막에 박혀서 고정된다(membrane-anchored). 신택신은 칼슘 채널가 함께 시냅스전 막의 활성 지대에 모이며(colocalize), 여기서 신경전달물질 방출이 일어난다. 또한, 신택신은 시냅토타그민(synaptotagmin), 및 SSV 막의 단백질과 상호작용하여, 원형질막과 소포 사이에 기능성 다리를 형성한다. 다양한 신택신 이소폼을 확인하였다. 다른 조직에서 발현된 이소폼 2, 3, 4 및 5와 함께, 신경 세포에서 길이가 약간 다른 두가지 이소폼(285개 및 288개 잔기)을 확인하였다(이소폼 1A 및 1B). 상이한 이소폼은 BoNT/C1에 대한 감수성이 다르며, 1A, 1B, 2 및 3 신택신 이소폼은 이 독소에 의해 분리된다.
란타나이드, 또는 "희토류" 원소는 3가 양이온이 한정된 파장에서 빛을 방출하고 긴 붕괴시간을 가지는 원소들의 그룹이다. 란타나이드는 원소번호 57 내지 71의 원소들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 란탄(La): 세륨(Ce); 프라세오디뮴(Pr); 네오디뮴(Nd); 프로메튬(Pm); 사마륨(Sm); 유로퓸(뗘); 가돌리늄(Gd); 테르븀(Tb); 디스프로슘(Dy); 홀뮴(Ho); 에르븀(Er); 툴륨(Tm); 이테르븀(Yb); 및 루테튬(Lu). 란타나이드는 또한 이트륨(Y; 원소번호 39) 및 스칸듐(Sc; 원소번호 21)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
란타나이드 이온은 광학적으로 활성인 전자를 부분적으로 차폐하는 이들의 특이한 전자 구조에 기초한 고유한 광물리 및 스펙트럼 속성을 가진다. 보통 란타나이드 이온의 방출 수명은 길다; 그러나, 이들의 광 수집 효율은 매우 낮다. 이러한 속성으로 인해, 란타나이드 이온은 예를 들어, 피리딜, 페닐 또는 인돌 그룹과 같이 강하게 흡수하는 방향족 크로모포어일 수 있는 광-수확 장치("안테나")와 결합될 때 특히 유용하다. 안테나에 의해서 수집된 에너지는 분자내 비-방사성 프로세스에 의해서 모이어티(moiety)의 싱글렛으로부터 트리플렛으로 이동한 다음, 트리플렛으로부터 란타나이드 이온의 방출 레벨로 이동된 후, 특징적인 긴-수명의 루미네선스를 방출한다. 따라서, 안테나와 결합된 란타나이드 이온은 예를 들어, 매우 민감한 시간-분해 에세이에서 루미네선트 프로브로서 유용하며, 많은 생물학적 시료에 존재하는 짧은 수명의 백그라운드 형광과 쉽게 구별할 수 있는 긴 수명의 형광 신호를 발생시킨다.
란타나이드는 일반적으로 3가 양이온으로서 존재하며, 이 경우에 이들의 전자 구성은 (Xe)4fn으로, n은 1(Ce3 +)에서 14(Lu3 +)까지 다양하다. 다음 설명에 제한하고자 하는 것은 아니지만, f-전자들의 전이는 긴 수명의 루미네선스 및 뾰족한 흡수 및 방출 선과 같은 란타나이드 이온의 특별한 광물리 성질의 원인이 된다. 특히, f-전자들은 채워진 5s 및 5p 오비탈에 의해서 외부의 혼란으로부터 차폐될 수 있어, 특징적인 선 형태의 스펙트럼을 나타낼 수 있다. 마이크로초 내지 밀리초 범위인 긴 여기 상태 수명을 야기하는 f-f 전자 전이는 금지된다.
앞서 논의한 바와 같이, 많은 경우에, 에너지는 "안테나" 또는 "감광기(sensitizer)"로 알려진 근처의 유기 크로모포어로부터 란타나이드 이온으로 이동할 수 있다. 따라서, 본 발명에 유용한 란타나이드 도너 복합체는 란타나이드 이온, 란타나이드-결합 부위 및 안테나를 포함하며, 일반적으로 물 또는 다른 용매의 퀀칭 효과로부터 란타나이드 이온을 차폐하는 구조이다. 란타나이드-결합 부위는 란타나이드 이온을 유지시키는 기능을 하고, 선택적으로 안테나 및 클로스트리디움계 독소 기질의 나머지 부분에 란타나이드 도너 복합체를 커플링하는 데 적합한 반응성 그룹의 부착을 위한 스캐폴드(scaffold)로서 작용할 수 있다. 일 실시형태에서, 안테나는 란타나이드-결합 부위 안에 병합된다. 또다른 실시형태에서, 란타나이드-결합 부위로부터 떨어져 있는 안테나가 란타나이드 도너 복합체에 포함된다.
본 발명에 유용한 란타나이드 이온은 가시 스펙트럼에서 방출하는 란타나이드인 테르븀(Tb), 유로퓸(eu), 디스프로슘(Dy) 및 사마륨(Sm) 이온을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 란타나이드 이온은 높은 방출 양자 수율을 가지며 Dy 또는 Sm 이온보다 더 강한 세기로 방출하는 Tb 또는 Eu 이온이다. Tb 또는 Eu를 위한 안테나의 여기(excitation)는 자외선 영역이며, 예를 들어, 337nm 질소 레이저 또는 플래쉬 램프를 사용하여 달성될 수 있다. 테르븀 방출은 녹색 스펙트럼인 반면, 유로퓸 방출은 적색 스펙트럼이고, 두가지 모두 여기 광(excitation light)과는 뚜렷이 대비된다.
본 명세서에서 사용할 때, "안테나"라는 용어는 "감광기"와 동의어이며, 여기광을 흡수하며 광 에너지를 란타나이드 이온으로 이동시키는 유기 크로모포어와 같은 분자를 의미한다. 란타나이드는 그 자체로는 본래 약한 흡수를 나타내기 때문에 안테나가 필수적이다. 일 실시형태에서, 안테나는 337nm의 여기광을 흡수하는 카보스티릴124(CS124)이다. 또다른 실시형태에서, 안테나는 트립토판 잔기이다. 또다른 실시형태에서, 안테나는 란타나이드-결합 부위로서도 작용(하기 참조)하는 2-히드록시이소프탈아미드이다. 안테나는 란타나이드 결합 부위와 구별되거나 그 일부를 구성할 수 있을 것으로 이해된다. 제한적이지 않은 실시예에서, 란타나이드 이온을 결합하는 안테나는 2-히드록시이소프탈아미드, 피리딘 또는 다른 크립테이트; LANCE 착물(Wallac; Perkin-Elmer); 또는 터피리딘 착물이다.
본 명세서에 사용할 때, "란타나이드-결합 부위"라는 용어는 란타나이드 이온을 구속하는 모이어티를 의미한다. 다양한 란타나이드-결합 부위가 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질에 유용하다. 란타나이드-결합 부위의 예로는 DTPA 킬레이트, BPTA 킬레이트, β-디케톤 킬레이트, 피리딘, 폴리피리딘 및 칼릭사렌 킬레이트와 같은 폴리아미노폴리카보실산 킬레이트가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. Li and Selvin, Bioconi. Chem. 8:127-132 (1997); Chen and Selvin, Bioconi. Chem. 10: 311-315 (1999); Selvin, Nature Struc. Biol. 7:730-734 (2000); Selvin, Methods Enzyrn. 246:300-334 (1995); Selvin et al., J. Am. Chem. Soc. 116:6029-6030 (1994); and Yuan et al., Anal. Chem. 73:1869-1876 (2001)에서와 같이, 이들 및 다른 란타나이드 킬레이트가 해당 분야에 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 본 발명에 유용한 란타나이드-결합 부위는 디에틸렌트리아민펜트아세트산(DTPA) 또는 트리에틸렌테트라아민헥사아세트산(TTHA)과 같은 폴리아미노카복실레이트이다. DTPA 또는 TTHA와 같은 폴리아미노카복실레이트 란타나이드-결합 부위와 관련된 유용한 안테나는 카보스티릴142(CS124)일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
란타나이드 도너 복합체에 란타나이드-결합 부위는 펩티드 및 펩티도미메틱인 것들을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 유용한 란타나이드-결합 부위는 두개의 나선이 Ca2 +, Tb3 + 및 이온 반지름이 유사한 다른 이온에 대한 친화도가 높은 결합 루프를 포함하는 고도로 보존된 도메인인 EF 핸드 모티프의 배위 부위를 포함한다. 천연에서는, 칼모둘린, 트로포닌 C, 파르발부민 및 칼빈딘을 포함하는 200개 이상의 단백질이 하나 또는 몇 부의 EF 핸드를 함유한다.
천연에서, EF 핸드 모티프의 두 개의 α-나선은 모티프의 금속 배위 부위를 포함하는 약 12개 잔기의 루브에 의해서 연결된다. 리간드로서 제공되는 잔기들은 루프와 두번째 나선의 처음을 연결하는 12개의 잔기의 인접한 서열 안에서 고도로 보존된다. 특히, 루프 영역의 위치 1, 3, 5, 7, 9 및 12의 잔기들 및 아마도 배위 물 분자는 란타나이드 이온에 7개의 배위 산소를 제공한다. 산성 아미노산은 종종위치 7의 Trp를 제외한 배위 위치 대부분 또는 모두에 존재하며, 주 사슬에 의해서 배위 산소가 제공된다(Vasquez-lbar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:3487-3492 (2002)). 위치 1, 3, 5 및 12의 루프 잔기들은 측쇄 산소를 통해 모노덴테이트(위치 1, 3 및 5) 또는 바이덴테이트(위치 12) 리간드를; 백본 카보닐 산소를 통해 잔기 7(트립토판) 리간드를 내어준다. 불변 글리신 잔기가 위치 6에 존재하여 잔기 5의 산소 및 잔기 7의 카보닐을 통해 란타나이드를 연결하는 데 필수적인 뾰족한 구부러짐을 가능하게 한다. 또한, 잔기 9는 측쇄의 산소를 통해 직접적으로 또는 물 분자를 경유하여 간접적으로 리간드를 제공한다. 잔기 12는 불변 글루탐산(Glu)인 반면, 잔기 1은 전형적으로 아스파레이트(Asp)이다. Lewit-Bentley, Curr. Qpin. Struct. Biol. 10:637-643 (2000); and Myers (Ed.), Molecular Biology and Biotechnology VCH publishers New York, NY (1995) 참조.
본 명세서에서 사용할 때, "EF 핸드 모티프의 배위 부위"라는 용어는 위치 6이 글리신; 위치 12가 글루탐산이고, 서열의 위치 1, 3, 5, 7, 9 및 12의 리간드 그룹 또는 배위 물분자가 금속 결합 부위를 제공하는 약 12개 잔기의 서열을 의미한다. 위치 7에 선택적으로 트립토판 잔기가 존재할 수 있다. EF 핸드 모티프의 배위 부위를 포함하는 란타나이드-결합 부위는 12개 잔기 배위 부위 밖의 EF 핸드 모티프의 α-나선과 상동을 가지거나 가지지 않을 수 있는 것으로 이해된다.
EF 핸드 모티프의 배위 부위를 포함하는 서열은 예를 들어, MacManus et al., Biosci. Rep. 3:1071 -1075 (1983), and Strynadka and James, Annu. Rev. Biochem. 58: 951-998 (1989)에 기재된 것과 같은 14-머 펩티드 GDKNADGWIEFEEL (SEQ ID NO: 97)이다. 14-머 SEQ ID NO: 97는 트립토판 잔기를 포함하고 있기 때문에 란타나이드-결합 부위 및 안테나로서 모두 작용한다. EF 핸드 모티프의 배위 부위는 또한 펩티드 GDKNADGFI C FEEL (SEQ ID NO: 98)(여기서, 표시한 시스테인 잔기는 요오도아세트아미도살리실산 또는 안테나로 공유적으로 표지될 수 있음)(Clark et al., FEBS 333: 96-98 (1993)), 펩티드 DKNADG C IEFEE (SEQ ID NO: 99)(여기서, 표시한 시스테인 잔기는 안테나의 간편한 공유적 부착을 가능하게 함)(Clark et al., Anal. Biochem. 210:1 -6 (1993)). 제한되지 않은 실시예에서, 예를 들어, Eu3 +를 위한 안테나로서 7-디에틸아미노-3-((4'-요오도아세틸아미노)페닐)-4-메틸쿠마린이 SEQ ID NO: 99의 시스테인에 공유적으로 부착될 수 있으며, 예를 들어, Tb3 +를 위한 안테나로서 4-요오도아세트아미도살리실산이 SEQ ID NO: 99의 시스테인에 공유적으로 부착될 수 있다.
EF 핸드 모티프의 배위 부위를 포함하는 란타나이드-결합 부위는 또한 Nitz et al., Anoew. Chem. Int. Ed. 43:3682-3685 (2004)에 기재된 것과 같은 란타나이드-결합 태그(LBT)일 수 있다. 이러한 란타나이드-결합 부위는 안테나 트립토판을 포함하는 17-머 YID 1 TN 3 ND 5 GW 7 YE 9 GDE 12 LLA (SEQ ID NO: 100)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 란타나이드-결합 부위는 8개의 리간드, 특히, Asp1, Asn3 및 Asp5의 모노덴테이트 산소 리간드, Glu9 및 Glu12로부터의 바이덴테이트 리간드, 및 Trp 7의 백본 카보닐를 통해 예를 들어 테르븀 또는 다른 란타나이드 이온을 배위할 수 있다. 더욱이, Nitz et al., supra, 2004에 기재된 것과 같은 란타나이드-결합 부위는 테르븀 또는 다른 란타나이드 이온을 나노몰 단위의 친화도로 결합시킬 수 있다. 제한되지 않은 실시예에서, 란타나이드-결합 부위 SEQ ID NO: 100은 62 +/- 4nM의 겉보기 해리 상수 Kd를 가지고 Eu3 +와; 84 +/- 6nM의 겉보기 해리 상수 Kd를 가지고 Gd3 +와; 57 +/- 3nM의 겉보기 해리 상수 Kd를 가지고 Tb3 +와; 71 +/- 5nM의 겉보기 해리 상수 Kd를 가지고 Dy3 +와; 78 +/- 6nM의 겉보기 해리 상수 Kd를 가지고 Er3 +와 결합한다.
란타나이드 도너 복합체에 유용한 란타나이드-결합 부위는 또한 란타나이드 이온 배위 스피어의 물 분자들을 제외한 펩티드-계 리간드를 통하지 않고 란타나이드 이온과 결합하는 것들을 포함한다. 이러한 란타나이드-결합 부위는 예를 들어 17-머 서열 YIDTNN DGWYEGDELLA (SEQ ID NO: 100; Nitz et al., supra, 2004)을 포함한다.
란타나이드 도너 복합체에 유용한 란타나이드-결합 부위는 또한 EF 핸드 모티프일 수 있다. 본 명세서에서 사용할 때, "EF 핸드 모티프"라는 용어는 EF 핸드 모티프의 배위 부위 측면에 위치하는 2개의 α-나선을 의미한다. 본 발명에 유용한 EF 핸드 모티프는 하나의 하기 서브패밀리로부터의 EF 핸드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 칼모둘린(CAM); 트로포닌 C(TNC); 미오신의 필수 또는 조절 경쇄; 트로포닌, 무척추동물(TPNV); Cal1, C. elegans(CAL); 스퀴둘린, Loligo(SQUD), CDC31 및 칼트락틴(caltractin)(CDC); 칼슘-의존성 단백질 키나아제(CDPK); LAV1, Physarum (LAV); EHF5; 칼시네우린 B (CLNB); p24 티로이드 단백질, Canis (TPP); 칼빈딘 28 kDa (CLBN); 파르알부민 (PARV); 내장 칼슘 결합 단백질 및 S100; 디아실글리세롤 키나아제 (DGK); α-액티닌 (ACTN); 단백질 포스페타아제, Drosophila (PTTS); Strongylocentrotus 칼슘-결합 단백질 (SPEC); Lytechinus purpuratus SPEC 유사 단백질 (LPS); 에쿼린 및 루시페린 결합 단배질 (AEQ); 칼슘 벡터 단백질, Branchiostoma (CVP); 1 F8 및 TB17 (1 F8); 칼파인 및 소르신 (CALP); 표면 단백질, Plasmodium (PFS); 근형질 칼슘-결합 단백질 (SARC); 비시닌 및 레코베린 (VIS); 칼슘-결합 단백질, Saccharopolyspora (CMSE); Tetrahymena 칼슘-결합 단백질 (TCBP); CAM 관련 유전자 생성물, Homo (CRGP); 또는 단백질 키나아제, Plasmodium (PFPK). 본 발명에 유용한 EF 핸드 모티프는 또한 도 6에 나타낸 것과 같은 정규 EF 핸드 모티프 또는 예를 들어 상기한 서브패밀리 중 하나와 같이 천연 EF 핸드와 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 아미노산이 일치하는, 천연 EF 핸드와 상당한 아미노산 상동성을 가지는 펩티드를 포함할 수 있다. 다양한 천연 EF 핸드가 해당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, Kawasaki and Kretsinger, Protein Profile 1 :343-517 (1994), 및 Nakayama and Kretsinger, Annu. Rev. Biophvs. Biomol. Struct. 23:473-507 (1994)에 기재되어 있다. 더욱이, EF 핸드 모티프 또는 EF 핸드 모티프의 배위 부위를 유전학적으로 가공하는 방법이 또한 해당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Vazquez-lbar et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 99:3487-3492 (2002) 참조.
란타나이드 도너 복합체에 유용한 란타나이드-결합 부위는 또한 란타나이드 결합 부위를 포함하도록 재설계된 나선-턴-나선 DNA 결합 모티프인 키메라 나선-턴-나선/EF 핸드 펩티드를 포함한다. 이러한 란타나이드-결합 부위는 Welch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3725-3730 (2003)에 기재된 것과 같은 펩티드 "P3W"(TERRQQLDKDGDGTIDEREIKIWFQNKRAKIK; SEQ ID NO: 101)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
추가적인 펩티드 란타나이드-결합 부위가 해당 분야에 공지되어 있으며, 란타나이드-결합 부위가 우연히 나타난 것 또는 내재성 칼슘-결합 부위를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 제한되지 않는 실시예에서, 란타나이드 이온은 Bacillus subtilus PyrR (Tomchick et al., Structure 6:337-350 (1998)) 및 카드헤린 NCD1 (Moore et al., J. Am. Chenri. Soc. 120:7105-7106 (1998))애 강하게 결합한다. 또한, Pidcock and Moore, J. Biol. Inorq. Chem. 6:479-489 (2001) 참조. 펩티드 란타나이드-결합 부위는 또한 예를 들어 테르븀 루미네선스에 기초한 스크리닝 프로토콜(Franz et al., Chem. BioChem. 4:265 (2003); and Nitz et al., Chem. BioChem. 4:272 (2003))을 사용하여 확인된 것들 및 유사한 스크리닝 에세이를 사용하여 확인된 것들을 포함한다.
란타나이드 도너 복합체에 유용한 란타나이드-결합 부위는 또한 란타나이드 이온을 가두어서 용매로부터 보호하는 케이지(cage)로서 작용하는 마크로폴리시클릭 화합물인 크립테이트일 수 있다. 크립테이트 케이지 자체는 특히 여기광을 흡수하고 에너지를 이온으로 이동시키고 물의 퀀칭으로부터 보호함으로써 갖힌 란타나이드 이온에 대한 안테나로서 작용한다. 트리스비피리딘(TBP) 란타나이드 크립테이트 및 이의 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 란타나이드 크립테이트가 본 발명에 유용하다. 이온과 단단히 결합하는 이러한 크립테이트는 생물학적 매질에서 매우 안정하다. 본 발명에 유용한 란타나이드 크립테이트는 트리스비피리딘 유로퓸 크립테이트; 트리스비피리딘 테트라카복실레이트(TBP4COOH) 유로퓸 크립테이트; 트리스비피리딘 펜타카복실레이트 유로퓸 크립테이트 및 피리딘 비피리딘 테트라카복실레이트(PBP4COOH) 유로퓸 크립테이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 해당 분야의 당업자는 TBP4COOH 또는 PBP4COOH와 같이 다중 카복실기를 포함하는 크립테이트 유도체가 그들의 부모 크립테이트보다 훨씬 더 발광할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이들 및 다른 란타나이드 크립테이트가 해당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 Selvin et al., Ann. Rev. Biornol. Struct. 31 :275-302 (2002); Mathis, Clin. Chem. 41 :1391- 1397 (1995); 및 Mathis. J. Clin. Liαand Assay 20:141 -147 (1997)에 기재되어 있다.
란타나이드 도너 복합체에 유용한 란타나이드-결합 부위는 또한 Sm3 +, Eu3 +, Tb3+ 및 Dy3 +와 같은 란타나이드와 함께 발광성의 안정성이 높은 복합체를 형성하는 분자인 2-히드록시이소프탈아미드를 포함한다 (Petoud et al., J.. Am. Chem. Soc. 125:13324-13325 (2003). 2-히드록시이소프탈아미드 그룹은 란타나이드 이온에 대한 매우 우수한 리간드이며, 예를 들어, 특히 효과적인 리간드-투-란타나이드 에너지 이동 프로세스를 통하여 Tb3 +의 탁월한 감작(sensitization)을 제공한다. 2-히드록시이소프탈아미드 란타나이드 킬레이트의 양자 수율은 상당히 높을 수 있으며(Φ>0.5), 2-히드록시이소프탈아미드로 형성된 복합체는 일반적으로 생리학적 pH에서 물에 대한 높은 용해도 및 안정성을 가진다(Petoud et al., supra, 2003).
란타나이드 도너 복합체에 유용한 란타나이드-결합 부위는 또한 이에 제한되지는 않지만 Eu3 +-β-디케토네이트(2-나프토일트리플루오로아세토네이트)-트리옥틸포스핀 옥사이드 터너리 플루오레센트 복합체와 같은 β-디케토네이트일 수 있다. 이러한 란타나이드-결합 부위는 예를 들어 Diamandis, Clin. Biochem. 21 :139-150 (1988)에 기재된 것과 같이 해당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 DELFIA® 시스템(Perkin-Elmer)의 일부로서 상업적으로 입수 가능하다.
해당 분야의 당업자는 이들 및 다른 란타나이드-결합 부뉘가 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질 및 방법의 란타나이드 도너 복합체의 일부로서 유용하 f수있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 란타나이드-결합 부위는 4,7-비스(클로로술포디페닐)-1,10-페난트롤린-2,9-디카복실산을 함유하는 것들("FlAgen" 시스템; Diamandis et al., Anal. Chem. 62:1149A- 1157A (1990)) 및 5-플루오로살리실레이트-Tb3+-EDTA를 함유하는 것들("효소-증폭 시간-분해 플루오로면역에세이"시스템; Chrisopoulos and Diamandis, Anal. Chem. 64:342-346 (1992))을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, Cooper and Sammes, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 28:1675-1700; Jones et al., J. Fluoresc. 11 :13-21 (2001); 및 KoIb et al. in Devlin (Ed.), High Throughput Screening: The Discovery of Bioactive Substances pages 345-360 New York: Marcel Dekker (1997) 참조. 해당 분야의 당업자는 이들 및 다른 펩티드, 펩티도미메틱 및 작은 분자 란타나이드-결합 부위가 본 발명의 기질의 란타나이드 도너 복합체에 병합될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
란타나이드 도너 복합체에 유용한 란타나이드-결합 부위는 또한 란타나이드 이온에 대한 친화도가 나노몰 내지 피코몰 범위인 것들을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 유용한 란타나이드-결합 부위는 란타나이드 이온에 대해 10μM 이하, 5μM 이하, 1μM 이하, 500nM 이하, 250nM 이하, 100nM 이하, 50nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하 또는 0.1nM 이하의 Kd를 가진다. 또다른 실시형태에서, 본 발명에 유용한 란타나이드-결합 부위는 란타나이드 이온에 대해 100nM 이하, 90nM 이하, 80nM 이하, 70nM 이하, 60nM 이하, 50nM 이하, 40nM 이하, 30nM 이하, 20nM 이하, 또는 10nM 이하의 Kd를 가진다. 또다른 실시형태에서, 본 발명에 유용한 란타나이드-결합 부위는 란타나이드 이온에 대해 1 X 10-9M 이하, 1 X 10-10M 이하, 1 X 10-11M 이하, 1 X 10-12M 이하, 1 X 10-13M 이하, 1 X 10-14M 이하, 1 X 10-15M 이하, 1 X 10-16M 이하, 1 X 10-17M 이하, 1 X 10-18M 이하, 1 X 10-19M 이하 또는 1 X 10-20M 이하의 Kd를 가진다.
본 명세서에서 사용할 때, "억셉터"란 용어는 란타나이드 도너 복합체가 여기할 때, 그로부터 에너지를 흡수하는 분자를 의미한다. 클로스트리디움계 독소 기질에 유용한 억셉터는, 기질에 포함된 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가진다. 본 발명에 유용한 억셉터는 일반적으로 란타나이드 도너 복합체에 포함된 안테나의 여기(excitation)에 적합한 파장에서는 오히려 흡수를 적게 한다.
상기한 바와 같이, 억셉터는 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가진다. 본 명세서에서 사용할 때, "겹치는"이란 용어는, 억셉터의 흡수 스펙트럼과 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼을 참고하여, 흡수 스펙트럼 및 방출 스펙트럼이 일부 또는 전부 공유되는 것을 의미한다. 따라서, 이러한 겹치는 스펙트럼들에서, 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼 범위의 상단은 억셉터의 흡수 스펙트럼 범위의 하단보다 높다.
본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 "사이에 있는" 절단 부위를 포함한다. 따라서, 절단 부위는 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 위치하여, 절단 부위가 단백분해되면 란타나이드 도너 복합체를 포함하는 제 1 절단 생성물과, 억셉터를 포함하는 제 2 절단 생성물을 얻게 된다. 클로스트리디움계 독소 인식 서열의 모든 또는 임의의 부분이 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 있을 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 절단 부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함한다. 정의된 바와 같이, 이러한 클로스트리디움계 독소 기질은, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서, 적어도 하나의 클로스트리디움계 독소에 의한 절단에 민감하다.
본 명세서에서 사용될 때, "클로스트리디움계 독소 인식 서열"이란 용어는 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서, 클로스트리디움계 독소에 의해서 절단된 결합에서, 단백분해를 검출하기에 충분한 인접 또는 비-인접 인식 요소와 함께 절단할 수 있는 결합을 의미한다. 여러가지 유용한 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 하기에 논의한다.
특정 실시예에 있어서, 본 발명에 유용한 클로스트리디움 독소 기질은 한정된 길이의 펩티드 또는 펩티도미메틱이다. 클로스트리디움 독소 기질은 예를 들어, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 350개 또는 적어도500개 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 또다른 실시형태에서, 클로스트리디움 독소 기질은 예를 들어, 최대 20개의 잔기, 최대 30개의 잔기, 최대 40개의 잔기, 최대 50개의 잔기, 최대 100개의 잔기, 최대 150개의 잔기, 최대 200개의 잔기, 최대 250개의 잔기, 최대 300개의 잔기, 최대 350개 잔기 또는 최대 400개의 잔기를 가진다.
본 발명에 유용한 클로스트리디움 독소 기질은 선택적으로 하나 이상의 추가적인 구성요소를 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 제한되지 않은 실시예에서, GGGGS(SEQ ID NO: 21)와 같은 구부러질 수 있는 스페이서 서열이 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질에 포함될 수 있다. 유용한 클로스트리디움계 독소 서열은 또한 하기의 것을 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: HIS6와 같은 친화도 태그, 바이오틴 또는 바이오티닐레이션 서열; FLAG와 같은 에피토프, 헤마글루티닌(HA), c-myc, 또는 AU1; 면역글로불린 힌지 영역; N-히드록시숙신이미드 링커; 펩티드 또는 펩티도미메틱 헤어핀 턴; 또는 정제를 용이하게 하거나 클로스트리디움계 독소 기질의 용해성 또는 안정성을 향상시키는 친수성 서열 또는 다른 구성요소 또는 서열.
본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질은 란타나이드 도너 복합체 및 억셉터를 포함하며, 클로스트리디움계 독소 절단 부위는 란타나이드 도너 복합체와 억셉터의 사이에 위치한다. 일 실시형태에서, 억셉터는 절단 부위의 카복시-말단에 위치하며, 란타나이드 도너 복합체는 절단 부위의 아미노-말단에 위치한다. 또다른 실시형태에서, 억셉터는 절단 부위의 아미노-말단에 위치하며, 란타나이드 도너 복합체는 절단 부위의 카복시-말단에 위치한다.
본 발명에 유용한 기질은 재조합적인 방법을 사용하거나 합성 화학법을 사용하거나 두가지를 조합사용하여 제조할 수 있다. 실시예 I에 기재한 바와 같이, 재조합적인 방법으로 BoNT/A 클로스트리디움계 독소 인식 서열에 융합된 GFP를 포함하는 융합 단백질 및 카복시-말단 시스테인을 제조하였다. 카복시-말단 시스테인을 란타나이드 도너 복합체의 부착을 위해 사용하여, 완전한 클로스트리디움계 독소 기질을 생성하였다. 융합 단백질인 클로스트리디움계 독소 기질의 제조를 위한 재조합적인 방법은 예를 들어, Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, Inc., New York 2000.에 기재된 바와 같이, 해당 분야에 공지되어 있다.
란타나이드 도너 복합체 또는 억셉터 또는 두가지 모두를 포함하도록 단백질, 펩티드 및 펩티도미메틱을 변형하는 데 적합한 일상적인 화학적 방법이 공지되어 있다(Fairclough and Cantor, Methods Enzymol. 48: 347-379 (1978) ; Glaser et al., Chemical Modification of Proteins Elsevier Biochemical Press, Amsterdam (1975) ; Haugland, EXCITED STATES OF BIOPOLYMERS (STEINER ED.) PP. 29-58, PLENUM Press, New York (1983); Means and Feeney, BIOCONJUGATE CHEM. 1: 2-12 (1990); MATTHEWS et al., METHODS ENZYMOL. 208: 468-496 (1991); LUNDBLAD, Chemical Reagents for Protein Modification 2nd Ed., CRC Press, Boca Ratan, Florida (1991); Haugland, supra, 1996). 제한적이지 않은 실시예에서, 란타나이드 도너 복합체는 이소티오시아네이트와 같은 아미노-반응성 그룹(Li and Selvin, Bioconi. Chem. 8:127-132 (1997)) 또는 말레이미드, 브로모아세트아미드 도는 피리딜 디티오와 같은 티올 반응성 그룹(Chen and Selvin, Bioconiug. Chem. 10:311 -315 (1999))을 포함할 수 있다. 티올-반응성 란타나이드 도너 복합체는 예를 들어, 기질의 시스테인 잔기에 편리하게 부착된다. 클로스트리디움계 독소 기질의 일부분을 재조합 기술로 제조하는 경우, 란타나이드 도너 복합체의 부착을 위해 기질의 적합한 위치에서 시스테인 잔기가 가공될 수 있다(실시예 I 참조). 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질을 제조하는데 있어서, 란타나이드 도너 복합체 또는 억셉터를 커플링하기 위하여 할로아세틸 표지된 시약을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, Wu and Brand, supra, 1994 참조.
가교제 모이어티가 또한 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질을 제조하는 데 유용할 수 있다. 가교제는 해당 분야에 공지되어 있으며, BMH 및 SPDP와 같은 호모- 및 헤테로-2 기능성 가교제(cross-linker)를 포함한다. 란타나이드-결합 부위 또는 억셉터가 단백질인 경우, 단백질의 아미노- 또는 카복시-말단에 분자를 특이적으로 연결하기 위해 공지의 화학적 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, "Chemical Approaches to PROTEIN ENGINEERING" in Protein Engineering : A Practical Rees et al. (Eds) Oxford University Press, 1992를 참조한다.
란타나이드 원자 및 DTPA 및 TTHA 킬레이트는 Invitrogen 및 Sigma를 포함한다양한 상업적인 공급원으로부터 입수가능하다. 더욱이, DTPA-CS124 및 TTHA-CS124의 합성 및 정제는 예를 들어, Li and Seivin, J. Am. Chem. Soc. 117:8132 (1995)에 기재된 대로 일상적으로 실시될 수 있다. 트리스비피리딘(TBP) 및 테트라카복실레이트(TBP4COOH) 유로퓸 크립테이트는 예를 들어, CIS Bio International(Bedford, MA)로부터 상업적으로 입수가능하며, 또는 일상적인 방법으로 제조할 수 있다. 해당 분야의 당업자는 이들 및 다른 일상적인 재조합 및 합성 화학적 방법이 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질을 제조하는 데 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명은 (a) 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 시료로 (i) 란타나이드 도너 복합체; (ii) 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 (iii) 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 처리하고; (b) 상기 란타나이드 도너 복합체의 안테나를 여기(exciting)시키고; (c) 처리된 기질의 공명 에너지 전이를 대조구 기질과 비교하여 결정하고, 대조구 기질과 비교한 처리된 기질의 공명 에너지 전이의 차이로서 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 표시함으로써, 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 결정하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 형광 수명이 적어도 500μs인 란타나이드 도너 복합체를 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하여 실시된다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 형광 양자 수율이 적어도 0.05인 란타나이드 도너 복합체를 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하여 실시된다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 형광 양자 수율이 적어도 0.5인 란타나이드 도너 복합체를 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하여 실시된다.
란타나이드 도너 복합체는 테르븀 이온, 유로퓸 이온, 사마륨 이온 또는 디스프로슘 이온을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 란타나이드 도너 복합체에 유용한 란타나이드-결합 부위는 예를 들어, 란타나이드 이온에 대한 친화도가 적어도 5μM인 것을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이는 EF 핸드 모티프의 배위 부위를 포함하거나 EF 핸드 모티프를 포함하는 것과 같은 펩티드 및 펩티도미메틱을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 란타나이드 도너 복합체에 유용한 란타나이드-결합 부위는 또한 티올-반응성 킬레이터; 디에틸렌트리아민펜트아세트산(DTPA); β-디케톤 킬레이트; 폴리아미노폴리카복실산 킬레이트; 칼릭사렌 킬레이트; 폴리페놀; DOTA; 피리딘 및 폴리피리딘; 트리비피리딘(TBP) 클립테이트; 트리스비피리딘 테트라카복실레이트(TBP4COOH) 크립테이트; 트리스비피리딘 펜타카복실레이트(TBP5COOH) 크립테이트; 또는 피리딘 비피리딘 테트라카복실레이트(PBP4COOH)를포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법에서, 란타나이드 도너 복합체는 란타나이드-결합 부위와는 구별되는 또는 그 안에 포함되는 안테나를 포함한다. 본 발명의 방법은 예를 들어 카보스티릴124(CS124), 트립토판, 또는 2-히드록시이소프탈아미드와 같은 안테나를 사용하여 실시될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 란타나이드 도너 복합체가 안테나로서 카보스티릴124(CS124)를 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하여 실시된다. 다른 실시형태에서, 본 발명 방법은 란타나이드 도너 복합체가 CS124-DTPA-EMCH-Tb인 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하여 실시된다.
본 발명의 방법은 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(BFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 및 적색 형광 단백질(RFP)과 같은 억셉터 플루오로포어를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 억셉터를 병합한 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하여 실시된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 억셉터로서 녹색 형광 단백질을 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하여 실시된다. 헴 단백질(heme protein)과 같은 비-형광 억셉터가 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
임의의 다양한 인식 서열을 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하여 본 발명의 방법을 실시할 수 있을 것으로 이해된다. 일 실시형태에서, 인식 서열은, SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하는 BoNT/A 인식 서열과 같은 BoNT/A 인식 서열이나, 이에 제한되지는 않으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Gln-Arg, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 이러한 BoNT/A 인식 서열은 예를 들어 SEQ ID NO:2의 잔기 134 내지 206을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 인식 서열은 또한 BoNT/B 인식 서열일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. BoNT/B 인식 서열은 예를 들어 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함할 수 있으며, 여기서 6개의 연속된 잔기들은 Gln-Phe 또는 이의 펩티도미메틱을 포함할 수 있다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 BoNT/C1 인식 서열을 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하여 실시할 수 있다. 이러한 BoNT/C1 인식 서열은 신택신의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Lys-Ala 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 본 발명에 유용한 BoNT/C1 인식 서열은 또한 SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함할 수 있으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Arg-Ala 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 BoNT/D 인식 서열을 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하여 실시된다. 이러한 BoNT/D 인식서열은 예를 들어, VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함할 수 있으며, 여기서 6개의 연속된 잔기들은 Lys-Leu 또는 이의 펩티도미메틱을 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 인식 서열은 또한 예를 들어 BoNT/E 인식 서열일 수 있다. 이러한 BoNT/E 인식 서열은 SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함할 수 있으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Arg-Ile 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 BoNT/F 인식 서열을 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하여 실시된다. 본 발명에 유용한 BoNT/F 인식 서열은 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Gln-Lys 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 본 발명의 방법은 BoNT/G 인식 서열을 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하여 실시할 수 있다. 이러한 BoNT/G 인식 서열은 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Ala-Ala 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명에 유용한 인식 서열은 파상풍 독소(TeNT) 인식 서열이다. 이러한 TeNT 인식 서열은 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서, 6개의 연속된 잔기들은 Gln-Phe 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 란타나이드 이온이 테르븀 이온인 란타나이드 도너 복합체를 포함하는 것 또는 또는 란타나이드-결합 부위가 최대 300 개 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱인 EF 핸드 모티브의 배위 부위를 포함하는 것과 같은 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하여 실시된다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 최대 150개 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱인 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하여 실시된다. 본 발명의 방법에서, 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질은 일정 범위의 활성을 가지고 절단될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 클로스트리디움계 독소 기질이 적어도 1 나노몰/분/밀리그램 독소의 활성을 가지고 절단되는 조건하에서 실시될 수 있다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 클로스트리디움계 독소 기질이 적어도 20 나노몰/분/밀리그램 독소의 활성을 가지고 절단되는 조건하에서 실시될 수 있다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질이 적어도 100 나노몰/분/밀리그램 독소의 활성을 가지고 절단되는 조건하에서 실시될 수 있다. 본 발명의 방법은 조세포 용해물; 분리된 클로스트리디움계 독소 경쇄와 같은 분리된 클로스트리디움계 독소; 및 조성된 BoNT/A, BoNT/B 및 BoNT/E 독소 생성물을 포함하나 이에 제한되지 않는 조성된 클로스트리디움계 독소 생성물을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 시료에서 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 결정하는 데 유용할 수 있다.
하기에 논의한 바와 같이, 본 발명의 방법은 고순도 이중사슬 및 단일 사슬 독소 뿐아니라 조시료에 적용할 수 있는 것으로 이해된다. 제한되지 않은 실시예에서, 본 발명의 방법은 음식 또는 음료 시료 중 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 결정하는 데; 예를 들어, 클로스트리디움계 독소에 노출된 또는 클로스트리디움계 독소의 하나 이상의 증상을 가진 사람 또는 동물로부터의 시료를 에세이 하는 데; 클로스트리디움계 독소의 생성 및 정제 중 활성을 따르는 데; 또는 약품 또는 화장품과 같은 조성된 클로스트리디움계 독소 생성물을 에세이하는 데 유용할 수 있다.
다양한 시료가 본 발명의 방법에 유용하다. 본 명세서에서 사용될 때, "시료(sample)"라는 용어는 활성 클로스트리디움계 독소를 함유하거나, 잠재적으로 함유하는 생물학적 물질을 의미한다. 그러므로, 시료라는 용어는 정제된 또는 부분적으로 정제된 클로스트리디움계 독소; 천연 또는 비-천연 서열을 가지는 재조합 단일 사슬 또는 이중사슬 독소; 변형 프로테아제 특이성을 가지는 재조합 클로스트리디움계 독소; 변경된 세포 특이성을 가지는 재조합 클로스트리디움계 독소; 다중 클로스트리디움계 독소 종 또는 서브타입으로부터의 구조 요소를 포함하는 키메라 독소; 벌크 독소; 조성된 독소 제품; 세포 또는 조(crude) 세포 용해물, 분류하거나 부분적으로 정제한 세포 용해물, 예를 들어, 클로스트리디움계 독소을 암호화하는 재조합 핵산을 포함하도록 가공된 것; 박테리아, 바큘로바이러스 및 효모 용해물; 날것이거나, 조리되거나, 일부 조리되거나 가공된 음식; 음료; 동물 먹이; 토양 시료; 물 시료; 연못 침전물; 로션; 화장품; 및 임상적 조성물(formulation)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 시료라는 용어는 포유류 조직 시료, 양, 소 및 돼지 조직 시료와 같은 가축 조직 시료; 영장류 조직 시료; 및 사람 조직 시료를 포함하나 이에 제한되지 않는, 조직 시료를 포함하는 것으로 또한 이해된다. 이러한 시료는 유아 장관 시료와 같은 장관 시료, 및 상처로부터 얻은 조직 시료를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한 하기에 논의한 바와 같이, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 다양한 조건들이 본 발명의 방법에 유용한다. 예를 들어, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건은 적어도 10%의 기질이 절단되도록 제공될 수 있다. 유사하게, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건은 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 클로스트리디움계 독소 기질이 절단되도록 또는 100%의 클로스트리디움계 독소 기질이 절단되도록 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건은 에세이가 선형이 되도록 제공된다. 또다른 실시형태에서, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건은 적어도 90%의 기질이 절단되도록 제공된다. 또다른 실시형태에서, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건은 최대 25%의 기질이 절단되도록 제공된다. 또다른 실시형태에서, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건은 최대 5%, 10%, 15% 또는 20%의 기질이 절단되도록 제공된다.
본 발명의 방법에서, 클로스트리디움계 독소 기질은 용액상 시료로 처리될 수 있다. 클로스트리디움계 독소 기질과 관련하여 본 명세서에서 사용할 때, "용매상("in solution phase")이라는 용어는 기질이 용해가능함을 의미하며, 단백분해동안 비드, 컬럼 또는 접시와 같은 고체 지지체 상에 구속 또는 고정되지 않는다.
본 발명의 방법에서, 시료는 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하여 처리된다. 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건의 예는 해당 분야에 공지되어 있으며, 일상적인 방법들에 의해서도 결정될 수 있다. 예를 들어, Hallis et al., J. Clin. Microbiol. 34:1934-1938 (1996); Ekong et al., Microbiol. 143:3337-3347 (1997); Shone et al., WO 95/33850; Schmidt and Bostian, supra, 1995; Schmidt and Bostian, supra, 1997; Schmidt et al., supra, 1998; 및 Schmidt and Bostian, U.S. Patent No. 5,965,699 참조. 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건은 부분적으로 에세이될 특이적인 클로스트리디움계 독소 타입 또는 서브타입 및 독소 제제의 순도에 의존적일 수 있는 것으로 이해된다. 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건은 일반적으로 전형적으로 pH 5.5 내지 9.5 범위이고, 예를 들어, pH 6.0 내지 9.0, pH 6.5 내지 8.5 또는 pH 7.0 내지 8.0 범위인, HEPES, Tris 또는 소디움 포스페이트와 같은 완충제를 포함한다. 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건은 또한, 예를 들어, 이중사슬을 에세이하는 경우, 필요하면, 디티오트레이톨(dithiothreitol), β-머캅토에탄올 또는 다른 환원제를 포함할 수 있다(Ekong et al., supra, 1997). 일 실시형태에서, 조건은 0.01mM 내지 50mM 범위의 DTT를 포함하며, 다른 실시형태에서, 조건은 0.1mM 내지 20mM, 1 내지 20mM 또는 5 내지 10mM 범위의 DTT를 포함한다. 원한다면, 클로스트리디움계 독소 기질을 가하기 전에, 분리된 클로스트리디움계 독소 또는 시료를 환원제와 함께 예를 들어 10mM 디키오트레이톨(DTT)과 함께 약 30분간 미리 배양할 수 있다.
클로스트리디움계 독소는 아연 메탈로프로테아제이며, 원한다면 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건의 일부로서 전형적으로 1 내지 500μM의 범위 예를 들어 5 내지 10μM의 범위의 아연 클로라이드 또는 아연 아세테이트와 같은 아연 공급원이 포함될 수 있다. 해당 분야의 당업자는 EDTA와 같은 아연 킬레트화제는 일반적으로 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 결정하기 위한 완충제에서 배제된다는 것을 이해할 것이다.
클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건은 선택적으로 예를 들어, 소 혈청 알부민을 대체하여 사용될 수 있는 TWEEN-20과 같은 세제를 포함할 수 있다. TWEEN-20은 예를 들어, 0.001% 내지 10%(v/v)의 범위로, 또는 0.01% 내지 1.0%(v/v)의 범위로 제공될 수 있다. 제한되지 않은 실시예에서, TWEEN-20은 0.1%(v/v)의 농도로 함유될 수 있다.
클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건은 또한, 원한다면, 소 혈청 알부민(BSA) 또는 단백질 안정화제, 용해제 또는 표면 손실 차단제로서 작용하는 다른 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 포함되는 경우, BSA는 전형적으로 0.1mg/ml 내지 10mg/ml의 범위로 제공된다. 일 실시형태에서, BSA는 1mg/ml의 농도로 포함된다. 예를 들어, Schmidt and Bostian, supra, 1997 참조. 일 실시형태에서, BSA는 0.1%(w/v)의 농도로 포함된다.
본 발명의 방법에서 클로스트리디움계 독소 기질의 양은 다양할 수 있다. 클로스트리디움계 독소는 1μM 내지 500μM, 1μM 내지 50μM, 1μM 내지 30μM, 5μM 내지 20μM, 50μM 내지 3.0mM, 0.5mM 내지 3.0mM, 0.5mM 내지 2.0mM 또는 0.5mM 내지 1.0mM의 농도로 제공될 수 있다. 당업자는 원한다면 에세이가 선형(linear)이 되도록 클로스트리디움계 독소 기질의 농도 또는 시료의 양을 제한할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 100μM 이하의 클로스트리디움계 독소 기질 농도에 의존적이다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 50μM 이하 또는 25μM 이하의 클로스트리디움계 독소 기질 농도에 의존적이다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 10μM 이하 또는 20μM 이하의 클로스트리디움계 독소 기질 농도에 의존적이다. 원한다면, 선형 에세이는 또한 클로스트리디움계 독소 기질을 상응하는, 기능성 란타나이드 도너 복합체가 결여된 "비표지" 기질과 혼합하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 상응하는 비표지 기질 중에 클로스트리디움계 독소 기질을 계열 희석함으로써 적합한 희석 정도를 결정할 수 있다.
본 발명의 방법에서 에세이되는 정제된 또는 부분 정제된 클로스트리디움계 독소의 농도는 일반적으로 약 0.0001 ng/ml 내지 500㎍/ml 독소, 예를 들어 약 0.0001 ng/ml 내지 50㎍ 독소, 0.001 ng/ml 내지 500㎍/ml 독소, 0.001 ng/ml내지 50㎍/ml 독소, 0.0001 내지 5000ng/ml 독소, 0.001 ng/ml 내지 5000ng/ml 독소, 0.01 ng/ml 내지 5000ng/ml 독소, 0.1 ng/ml 내지 5000ng/ml 독소, 1 ng/ml 내지 5000ng/ml 독소, 10 ng/ml 내지 5000ng/ml 독소, 50 ng/ml 내지 5000ng/ml 독소, 50 ng/ml 내지 5000ng/ml 독소 또는 100 ng/ml 내지 5000ng/ml 독소 범위이며, 예를 들어, 정제된 재조합 이중사슬 또는 단일사슬 독소 또는 사람 혈청 알부민 및 부형제를 포함하는 조성된 클로스트리디움계 독소 제품일 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법에서 에세이되는 정제된 독소의 양은 0.1pg 내지 100㎍의 범위이며, 예를 들어, 0.1pg 내지 50㎍ 또는 0.1pg 내지 10㎍이다.
본 발명의 방법에서 에세이되는 정제된 또는 부분 정제된 클로스트리디움계 독소의 농도는 예를 들어 0.1pM 내지 100μM, 0.1pM 내지 10μM, 0.1pM 내지 1μM, 0.1pM 내지 500nM, 0.1pM 내지 100nM, 예를 들어, 1pM 내지 2000pM, 1pM 내지 200pM, 1pM 내지 50pM, 1nM 내지 1μM, 1nm 내지 500nM, 1nm 내지 200nM, 1nm 내지 100nM, 또는 3nm 내지 100nM의 범위일 수 있으며, 예를 들어, 정제된 천연 또는 재조합 경쇄 또는 이중사슬 독소 또는 사람 혈청 알부민 및 부형제를 포함하는 조성된 클로스트리디움계 독소 제품일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 정제된 또는 부분 정제된 재조합 BoNT/A, BoNT/B 또는 BoNT/E 경쇄 또는 이중사슬 또는 조성된 제품의 농도는 1pM 내지 2000pM, 10pM 내지 2000pM, 20pM 내지 2000pM, 40pM 내지 2000pM 또는 1pM 내지 200pM의 범위이다. 또다른 실시형태에서, 정제된 또는 부분 정제된 재조합 BoNT/C 경쇄 또는 이중사슬 또는 조성된 제품의 농도는 1pM 내지 200pM, 4nM 내지 100nM, 10nM 내지100nM 또는 4nM 내지 60nM의 범위이다. 해당분야의 당업자는 정제된 또는 부분 정제된 클로스트리디움계 독소의 농도가 에세이되는 독소의 세로타입뿐아니라 독소의 순도 또는 재조합 서열, 억제 성분의 존재, 및 에세이 조건에도 의존적이라는 것을 이해할 것이다. 정제된 또는 부분정제된 시료 또는 조시료가 표준곡선에 대하여 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성을 에세이하기에 편리한 범위 내에서 희석될 수 있다는 것을 또한 이해할 것이다. 유사하게, 원한다면 에세이가 선형이 되도록 시료를 희석할 수 있는 것으로 이해된다.
클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건은 또한 일반적으로 약 20℃ 내지 약 45℃ 범위, 예를 들어 25℃ 내지 40℃ 범위 또는 25℃ 내지 39℃ 범위의 온도를 예를 들어 포함한다. 나노리터 반응 부피가 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있지만, 에세이 부피는 종종 약 5㎕ 내지 약 200㎕의 범위, 예를 들어, 약 10㎕ 내지 100㎕의 범위 또는 약 0.5㎕ 내지 100㎕의 범위이다. 에세이 부피는 또한 예를 들어, 100㎕ 내지 2.0ml 범위 또는 0.5ml 내지1.0ml 범위일 수 있다.
에세이 시간은 당업자에게 적절하게 다양할 수 있으며, 일반적으로 클로스트리디움계 독소의 농도, 순도 및 활성에 일부 의존적일다. 에세이 시간은 일반적으로 약 15분 내지 약 5시간의 범위 내에서 다양하나 이에 제한되지는 않는다. 제한되지 않은 실시예에서, 에세이 시간은 예를 들어 37℃에서의 30분, 45분, 60분, 75분 또는 90분 동안의 배양을 포함한다. 특정 실시형태에서, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%의 클로스트리디움계 독소 기질이 절단된다. 또다른 실시형태에서, 프로테아제 반응은 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 50% 이상의 클로스트리디움계 독소 기질이 절단되기 전에 중단된다. 프로테아제 반응은 일반적으로 란타나이드 도너 복합체 및 기질의 다른 성분들에 의존적인 적합한 제제로 종결시킬 수 있는 것으로 이해된다. 제한되지 않은 실시예에서, 형광 억셉터로서 GFP를 포함하는 기질에 기초한 프로테아제 반응은 예를 들어 최종 농도 1 내지 2M로 쿠아니디늄 클로라이드(quanidinium chloride)를 가하여 종결할 수 있다. 프로테아제 반응은 또한 H2SO4; 약 0.5 내지 1.0 소디움 보레이트, pH 9.0 내지 9.5; 도는 아연 킬레이트화제를 가하여 종결시킬 수 있다. 해당분야의 당업자는 원한다면 안테나를 여기시키기 전에 프로테아제 반응을 종결시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
제한되지 않은 실시예에서, BoNT/A 프로테아제 활성과 같은 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건은 10-16 μM 기질과 함께 50mM HEPES를 함유하는 완충제(pH7.2), 10μM ZnCl2, 10mM DTT, 및 0.1%(v/v) TWEEN-20 중에서 37℃로 90분간 배양하는 것일 수 있다. 원한다면, 기질을 가하기 전에 BoNT/A를 포함하는 시료, 특히 이중사슬 BoNT/A를 디티오트레이톨과 함께 예를 들어 20 또는 30분간 미리 배양할 수 있다. 제한되지 않는 실시예에서, BoNT/A 프로테아제 활성에 적합한 조건은 5mM 디티오트레이톨과 같은 환원제를 포함하는 30mM HEPES(pH7.3)과 같은 완충제; 및 25μM 아연 클로라이드(약 7nM; Schmidt and Bostian, supra, 1997)와 같은 아연 공급원 중에서 37℃로 배양하는 것일 수 있다. 시료를 클로스트리디움계 독소 기질로 처리할 때 0.1mg/ml 내지 10mg/ml 범위의 BSA, 예를 들어, 1mg/ml BSA를 또한 포함시킬 수 있다(Schmidt and Bostian, supra, 1997). 또다른 제한되지 않은 실시예에서, BoNT/B 프로테아제 활성과 같은 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건은 50mM HEPES, pH 7.4, 10μM 아연 클로라이드, 1% 소 태아 혈청 및 10mM 디티오트레이톨 중에서 37℃로 90분간 배양하는 것일 수 있으며 (Shone and Roberts. Eur. J. Biochem. 225:263-270 (1994); Hallis et al., supra, 1996); 또는 예를 들어, 선택적으로 0.2%(v/v) 트리톤 X-100을 포함하는 40mM 소디움 포스페이트, pH 7.4, 10mM 디티오트레이톨 중에서 37℃로 2시간 동안 배양하는 것일 수 있다 (Shone et al., supra, 1993). 파상풍 독소 프로테아제 활성 또는 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건은 예를 들어, 25μM 펩티드 기질과 함께 20mM HEPES, pH 7.2, 및 100mM NaCl 중에서 37℃로 2시간 동안 배양하는 것일 수 있다(Comille et al., supra, 1994).
본 발명은 Tb3 + 또는 Eu3 +와 같은 란타나이드 이온이 분자내 원거리 다이폴-다이폴 커플링(long-range dipole-dipole coupling)을 통해 플루오로포어일 수 있는 유기 억셉터로 에너지를 비-방사적으로 전이시키는 루미네선스 공명 에너지 전이(LRET)에 부분적으로 의존적이다. FRET는 란타나이드 도너 복합체 및 억셉터의 분자내 분리(separation)의 인버스 제 6의 힘(inverse sixth power)에 의존하고, 효과적인 전이를 위하여, 란타나이드 도너 복합체 및 엑셉터는 예를 들어, 약 10Å 내지 약 100Å으로 가깝게 인접하여 분리된다. 효과적인 에너지 전이는 란타나이드 도너 복합체 및 억셉터의 스펙트럼의 특성뿐아니라, 상대적인 배향(orientation)에 의존한다(Clegg, Current Opinion in Biotech. 6: 103-110 (1995); 및 Selvin, Nature Structural Biol. 7: 730-734 (2000)참조).
본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질에서, 란타나이드 도너 복합체 및 억셉터는, 란타나이드 도너 복합체의 안테나가 여기할 때, 란타나이드 도너 복합체 및 억셉터가 공명 에너지 전이를 나타내도록 선택된다. 해당 분야에 공지된 바와 같이, 공명 에너지 전이 효율은, 란타나이드 이온의 형광 양자 수율 및 억셉터와의 강력한 오버랩 뿐아니라 Foerster 방정식으로 설명되는 것처럼, 란타나이드 이온 또는 다른 란타나이드 도너 복합체 성분과 억셉터가 떨어져 있는 거리에 의존한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 최적의 조건하에서, 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이의 LRET의 효율이 적어도 10%인 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 최적의 조건 하에서, 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이의 LRET의 효율이 적어도 20%인 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 최적의 조건 하에서, 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이의 LRET의 효율이 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%인 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다.
본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질은 긴, 밀리초 내지 서브밀리초의 수명, 가시 스펙트럼에서의 좁은 다중 방출 밴드 및 비편광 방출을 특징으로 하는 란타나이드의 두드러진 루미네선스 성질을 이용한다. 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질에 사용하기에 유용한 란타나이드 도너 복합체/억셉터 쌍은 CS124-DTPA-EMCH-Tb 또는 억셉터로서 녹색 형광 단백질 또는 청색 형광 단백질과 조합된 다른 테르븀 이온 복합체(실시예 I 및 II 참조)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 유용한 란타나이드 도너 복합체/억셉터 쌍은 또한 105 kDa 피코빌리프로테인 억셉터 플루오로포어, 알로피코시아닌와 조합된 란타나이드 도너 복합체 Eu-트리스비피리딘 크립테이트(TBP-Eu3+, λEx 337nm)일 수 있다(Sittampalam et al., Curr. Qpin. Chem. Biol. 1 :384-391 (1997)). Eu-트리스비피리딘 크립테이트는 빛을 수확하여 케이지된 Eu3 +로 보내는 두개의 비피리딜 그룹을 가지며, Eu3 +는 억셉터와 가깝게 근접할 때 비방사적으로 에너지를 알로피코시아닌으로 전이시키고, 9.5nm의 란타나이드 이온-억셉터 거리에서 50% 이상이 전이 효율을 나타낸다. 더욱이, TBP-Eu3+과 알로피코시아닌 모두와 이들의 분광학적 특성은 생물학적 매질에서 매우 안정하며, 알로피코시아닌은 란타나이드 이온의 긴 수명을 가지고 방출하므로(λEx 665nm), 시간-분해 검출이 가능하다(Kolb et al., J. Biomol. Screening 1 :203- 210 (1996)). 이러한 란타나이드 도너 복합체-억셉터 쌍을 포함하는 기질을 제조하는 방법은 예를 들어, Kolb et al., supra, 1996, 및 Sittampalam et al., supra, 1997 에 기재된 바와 같이 공지되어 있다.
본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질은, 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 위치하는 클로스트리디움계 독소 절단 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 란타나이드 도너 복합체는 절단부위의 카복시-말단에 위치하는 반면, 억셉터는 절단부위의 아미노-말단에 위치한다. 또다른 실시형태에서, 란타나이드 도너 복합체는 절단부위의 아미노-말단에 위치하는 반면, 억셉터는 절단부위의 카복시-말단에 위치한다.
당업자라면 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질에서 란타나이드 도너 복합체 및 억셉터를 선택 및 위치시키는 데 몇가지를 고려해야 한다는 것을 이해할 것이다. 란타나이드 도너 복합체 및 억셉터는 일반적으로 기질이 클로스트리디움계 독소에 결합하거나 독소에 의해 단백분해되는 것을 방해하는 것을 최소화하도록 위치한다. 따라서, 예를 들어, 결합에 중요한, 결합 및 비-결합 상호작용의 분열을 최소화하고, 입체장애를 최소화하도록, 란타나이드 도너 복합체 및 억셉터를 선택 및 위치시킬 수 있다. 또한, 억셉터와 란타나이드 도너 복합체 사이의 공간적 거리는 일반적으로, 란타나이드 도너 복합체로부터 억셉터로 효과적인 에너지 전이를 달성하도록 제한된다.
상기한 바와 같이, 란타나이드 도너 복합체로부터 억셉터로의 에너지 전이 효율은, 일부, 란타나이드 도너 복합체와 억셉터의 공간적 분리에 의존적이다. 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이의 거리가 증가할 수록, 억셉터로의 에너지 전이가 감소하며, 따라서, 절단 이전이라도 란타나이드 도너 복합체 신호가 증가한다. 기질의 절단시, 란타나이드 도너 복합체의 형광 수율의 전체 증가는, 기질내 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이의 떨어진 거리, 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이의 스펙트럼 오버랩, 및 에세이에 사용된 기질 농도를 포함하는 많은 인자들에 의존한다. 당업자라면 단백분해 절단 이후라도 기질의 농도가 증가함에 따라, 도너의 분자간 퀀칭이 영향을 미치는 인자가 될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 현상을 "내부 필터 효과(inner filter effect)"라 한다.
50% 에너지 전이를 위한 도너 플루오로포어와 억셉터 사이의 간격인 푀르스터 거리는, 도너 플루오로포어와 우수한 민감성을 제공하는 억셉터의 공간적 분리를 나타낸다. 펩티드 기질에 있어서, 인접 잔기는 최대로 연장된 구조에서 약 3.6Å의 거리로 떨어져 있다. 그러나, 용액 중의 펩티드 및 펩티도미메틱은 완전히 연장된 구조는 거의 갖지 않기 때문에, 란타나이드 도너 복합체 및 억셉터는, 잔기당 3.6Å으로 계산하여 예상한 것보다 더욱 멀리 분리될 수 있으며, 여전히 푀르스터 거리 이내이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 란타나이드 이온 또는 란타나이드 도너 복합체의 다른 성분이 억셉터와 최대 100Å 거리로 공간적으로 떨어져 있는 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 란타나이드 이온 또는 란타나이드 도너 복합체의 다른 성분이 억셉터와 최대 90Å, 80Å, 70Å, 60Å, 50Å, 40Å, 30Å 또는 20Å 거리로 공간적으로 떨어져 있는 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 란타나이드 이온 또는 란타나이드 도너 복합체의 다른 성분이 억셉터와 10Å 내지 100Å, 10Å 내지 80Å, 10Å 내지 60Å, 10Å 내지 40Å, 10Å 내지 20Å, 20Å 내지 100Å, 20Å 내지 80Å, 20Å 내지 60Å, 20Å 내지 40Å, 40Å 내지 100Å, 40Å 내지 80Å 또는 40Å 내지 60Å 거리로 공간적으로 떨어져 있는 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다.
해당 분야 당업자는 부분적으로 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질이 공명 에너지 전이의 효율을 최적화시키도록 디자인될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 해당 분야 당업자는 본 발명에 유용한 란타나이드 이온이 일반적으로 높은 양자 수율을 가지며, 필요시, 푀르스터 거리를 최대화하도록 높은 흡광 계수를 가지는 억셉터를 선택할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 또한, 억셉터의 직접 여기로부터 나온 형광을 공명 에너지 전이로부터 얻어지는 형광과 구별하기 어려울 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 억셉터의 직접 여기를 일으키지 않는 파장에서 란타나이드 도너 복합체의 안테나가 여기될 수 있도록, 여기 스펙트럼의 오버랩이 비교적 작은 란타나이드 도너 복합체 및 억셉터를 선택할 수 있다는 것을 알 수 있다. 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질은, 두가지 방출이 쉽게 구별되도록 란타나이드 도너 복합체와 억셉터의 방출 스펙트럼이 비교적 적게 겹쳐질 수 있게 디자인될 수 있다는 것을 또한 알 수 있다. 필요시, 높은 형광 양자 수율을 가지는 억셉터를 선택할 수 있다
클로스트리디움계 독소 기질의 단백분해 및 그에 따른 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성은, 예를 들어, 란타나이드 도너 복합체의 적어도 하나의 방출 피크로부터 증가된 루미네선스를 검출하거나; 감소된 억셉터 형광 세기를 검출하거나; 란타나이드 도너 복합체 방출 최대치 근처 형광 진폭에 대한 억셉터 방출 최대치 근처의 형광 진폭의 감소된 비율을 검출하는 다양한 방법으로 검출할 수 있다. 상대적인 루미네선스 세기는 적절하게 선택된 파장 또는 파장 범위에서 검출되는 것으로 이해된다. 클로스트리디움계 독소 기질의 단백분해, 및 그에 따른 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성은 예를 들어 억셉터 방출 최대치 근처로부터 란타나이드 이온의 방출 최대치 근처로의 방출 최대치의 이동에 의해서 또는 란타나이드 이온의 증가된 여기상태 수명에 의해서 검출될 수 있다.
일 실시형태에서, 란타나이드 도너 복합체의 적어도 하나의 방출 피크의 루미네선스 세기가 검출되며, 증가된 루미네선스 세기는 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 나타낸다. 이러한 증가된 세기는 시료와 접촉하지 않은 동일한 클로스트리디움계 독소의 동일 파장에서의 루미네선스 세기와 비교할 때, 예를 들어, 적어도 2배, 3배, 5배, 10배, 20배 또는 그 이상일 수 있다. 이러한 증가된 세기는 또한 시료와 접촉하지 않은 동일한 클로스트리디움계 독소의 동일 파장에서의 루미네선스 세기와 비교할 때, 예를 들어 적어도 0.1-배, 0.2-배, 0.3-배, 0.4-배, 0.5-배, 0.6-배, 0.7-배, 0.8-배, 0.9-배, 1.0-배 또는 1.5-배의 증가일 수 있다.
란타나이드 도너 복합체의 루미네선스 세기의 검출을 위하여, 여기(excitaition)는 안테나 흡수 파장으로 설정되며, 란타나이드 도너 복합체의 적어도 하나의 피크의 방출을 모니터링한다. 란타나이드 도너 복합체의 방출 파장은 일반적으로 억셉터 형광으로부터의 기여가 거의 또는 전혀 관찰되지 않도록 선택된다. 실시예 II에 설명한 바와 같이 억셉터의 존재는 란타나이드 도너 복합체로부터의 루미네선스를 퀀칭한다. 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 결정하기 위한 본 발명의 방법은 대조구 기질과 비교하여, 시료와 접촉된 클로스트리디움계 독소 기질의 공명 에너지 전이를 결정하는 것을 포함하며, "고정-시간(fixed-time)" 에세이로서 또는 연속 시간 에세이로서 실시될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 클로스트리디움계 독소 기질의 루미네선스 공명 에너지 전이는 대조구 기질과 비교하여 결정된다. 이러한 대조구 기질은 어떠한 시료로도 처치되지 않은 또는 하나 이상의 클로스트리디움계 독소를 포함하는 것으로 알려진 한정 시료로 처치된 또는 활성 클로스트리디움계 독소가 결여된 것으로 알려진 한정시료로 처치된 동일한 클로스트리디움계 독소 기질일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기로부터 다양한 대조구 기질이 본 발명의 방법에 유용하며 대조구 기질이 양성 대조구 기질 또는 음성 대조구 기질일 수 있다는 것이 분명하다. 대조구 기질은, 예를 들어, 활성 클로스트리디움계 독소를 포함하지 않거나, 어떤 시료와도 접촉되지 않거나, 클로스트리디움계 독소에 의한 절단에 민감하지 않은 유사한 시료와 접촉된 유사한 또는 일치하는 기질과 같은 음성 대조구 기질일 수 있다. 대조구 기질은 또한 클로스트리디움계 독소 기질의 클로스트리디움계 독소 단백분해로부터 얻어진 절단 생성물과 같은 양성 대조구 기질일 수 있다. 이러한 대조구 기질은 란타나이드 도너 복합체-함유 절단 생성물, 억셉터-함유 절단 생성물 또는 이 두 가지의 조합일 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 자동화될 수 있으며, 96-웰, 384-웰 또는 1536 웰 플레이트를 사용하여, 이에 제한되지는 않지만, 고-처리량 또는 초고-처리량 포맷으로 구성될 수 있는 것으로 이해된다. 일례로서, 형광 방출은 96-웰 플레이트 에세이를 위해 디자인된, Molecular Devices FLIPR® 계장 시스템(Molecular Devices; Sunnyvale, CA)을 사용하여 검출할 수 있다(Schroeder et al., J. Biomol. Screenina 1: 75-80 (1996)). FLIPR은 전체 플레이트를 조사하고 이미징하기 위하여, 수냉 488nm 아르곤 이온 레이저(5와트) 또는 크세논 아크 램프, 및 전하결합소자(CCD) 카메라를 가지는 반초점공유 최적 시스템(semiconfocal optimal system)을 이용한다. FPM-2 96-웰 플래이드 리더(Folley Consulting and Research; Round Lake, Illinois)가 또한 본 발명의 방법에서 형광 방출을 검출하는 데 유용하다. 당업자는 ECLIPSE 쿠벳 리더(Varian-Cary; Walnut Creek, CA), SPECTRAMAX GEMINI XS (Molecular Devices) 및 예를 들어, Perkin Elmer로부터의 다른 시스템과 같은 적합한 분광학 호환성을 가지는, 이러한, 그리고 다른 자동화 시스템이 본 발명에 유용할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
생물학적 시료에 존재하는 많은 화합물 및 단백질이 천연적으로 형광성이다; 따라서, 종래의 플루오로포어를 사용하는 것은 민감도에 있어서 상당한 제한을 가지게 된다. 그러나, 비-특이적인 백그라운드 형광은 수명이 짧고, 전형적으로 단지 약 10 나노초의 붕괴 시간을 가지므로 시료 형광보다 훨씬 빨리 소멸된다. 따라서, 희토류 란타나이드의 수명이 긴 형광에 기초한 신속하고 편리한 에세이인 시간-분해 형광(TRF)를 사용하여 대부분의 백그라운드 신호가 쉽게 구별될 수 있다. 시간-분해 형광에서, 대부분의 백그라운드 형광을 포함하는 형광의 초기 폭발은 측정하지 않도록 검출기는 짧은 시간 동안 게이트(gated)된다. 게이팅 기간 후에, 시료에서 더 오래 지속되는 형광을 측정하여 실질적으로 민감도를 향상시킨다. 제한되지 않은 실시예에서, 란타나이드 도너 복합체의 안테나를 여기시키기 위한 펄스된 여기 공급원은 질소 레이저(337nm)을 사용하여 발생시킬 수 있다. 전형적으로, 20 내지 50-Hz 반복률로 약 5 나노초의 펄스-너비가 사용된다. 수명 측정에서, 적합한 컬러 필터를 가진 광전자증배관 튜브 및 카운팅 전자장치가 사용될 수 있다. 시간-지연 스펙트럼에 대해서, 일반적으로 회절 격자를 사용하는 분광계 및 전자적으로 게이트되거나 기계적 초퍼(chapper)를 가진, 시간-게이티드 광전자증배관 튜브 또는 CCD가 사용된다. 이러한 장비들은 상업적으로 입수가능하며, 예를 들어 KoIb et al., supra, 1996, and Sittampalam et al., supra, 1997에 기재된 바와 같이 해당 분야에 공지되어 있다.
상이한 클로스트리디움계 독소에 대한 특이적이고 구별되는 절단 부위가 해당 분야에 공지되어 있다. BoNT/A는 Gln-Arg 결합을 절단하고, BoNT/B 및 TeNT는 Gln-Phe 결합을 절단하고; BoNT/C1은 Lys-Ala 결합 또는 Arg-Ala 결합을 절단하고; BoNT/D는 Lys-Leu 결합을 절단하고; BoNT/E는 Arg-Ile 결합을 절단하고; BoNT/F는 Gln-Lys 결합을 절단하고; BoNT/G는 Ala-Ala 결합을 절단한다(표 A 참조). 표준 명명법에서, 클로스트리디움계 독소 절단 부위를 둘러싼 서열은 분리가능 결합을 나타내는 P1-P1'을 가지는, P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'로 나타낸다. P1 또는 P1' 부위, 또는 두가지 모두가, 천연 잔기 대신에 다른 아미노산 또는 아미노산미메틱으로 치환될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, BoNT/A 기질은 P1 위치(Gln)가 알라닌, 2-아미노부티르산 또는 아스파라긴 잔기로 변형되어 제조될 수 있다; 이러한 기질은 BoNT/A에 의해서 P1-Arg 결합에서 가수분해된다(Schmidt and Bostian, J. Protein Chem. 16: 19- 26 (1997)). 분리가능 결합의 P1 위치, 예를 들어, BoNT/A 분리가능 결합이 치환될 수 있는 반면에, P1' 잔기는 보존하는 것이 유리할 수 있다는 것을 알 수 있다(Vaidyanathan et al., J. Neurochem.72: 327-337 (1999)). 따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명은, 클로스트리디움계 독소에 의해 절단되는 표적 단백질의 천연 잔기와 비교하여 P1' 잔기가 변형이나 치환되지 않은 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 가지는 클로스트리디움계 독소 기질에 의존하는 방법을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은, 클로스트리디움계 독소에 의해 절단되는 표적 단백질의 천연 잔기와 비교하여 P1 잔기가 변형이나 치환된 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 가지는 클로스트리디움계 독소 기질에 의존하는 방법을 제공한다; 이러한 클로스트리디움계 독소 기질은 P1과 P1' 잔기 사이의 펩티드 결합 절단에 대한 민감성을 유지한다.
SNAP-25, VAMP 및 신택신은 
-나선형 구조를 취할 것으로 예상되는 영역 내에 위치하는 짧은 모티프를 공유한다. 이러한 모티프는 신경독에 민감한 동물에서 발현되는 SNAP-25, VAMP 및 신택신 이소폼에 존재한다. 이와 대조적으로, 이러한 신경독에 내성이 있는 초파리 및 효모 상동체 및 엑소사이토시스에 관여하지 않는 신택신 이소폼은 이러한 VAMP 및 신택신 단백질의 
-나선형 모티프 영역에 서열 변화를 포함한다.
다중 반복의 
-나선형 모티프가 클로스트리디움계 독소에 의해 절단되기 쉬운 단백질에 존재한다: 4 카피가 천연 SNAP-25에 존재하고; 2카피가 천연 VAMP에 존재하고; 2 카피가 천연 신택신에 존재한다. 또한, 
-나선형 모티프의 특이 서열에 상응하는 펩티드는 in vitro 및 in vivo에서 신경독 활성을 억제할 수 있고, 이러한 펩티드는 상이한 신경독을 교차-억제할 수 있다. 또한, 이러한 펩티드에 대하여 생성된 항체는 3가지 표적 단백질 중에서 교차-반응할 수 있으며, 이는 이러한 
-나선형 모티프가 단백질 표면에 노출되어, 세가지 표적 단백질 각각에서 유사한 구조를 취하는 것을 나타낸다. 이러한 점과 일관되게, SANP-25-특이적, VAMP-특이적 및 신택신-특이적인 신경독은, 표적을 비-특이적으로 절단하지는 않지만, 동일한 결합 부위에 대하여 경쟁하여, 서로 교차-억제한다. 이러한 결과는 클로스트리디움계 독소 인식 서열이 필요시 적어도 하나의 
-나선형 모티프를 포함할 수 있다는 것을 나타낸다. 공지된 BoNT/A에 대한 16-머 및 17-머 기질에 의해 증명된 바와 같이, 
-나선형 모티프가 클로스트리디움계 독소에 의한 절단에 필요하지 않다는 것을 알 수 있다.
다중 
-나선형 모티프는 천연 SANP-25, VAMP 및 신택신 표적 단백질에서 발견되지만, 클로스트리디움계 독소 기질에 유용한 클로스트리디움계 독소 인식 서열은 단일 
-나선형 모티프를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 둘 이상의 
-나선형 모티프를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열에 의존한다. BoNT/A 또는 BoNT/E 인식 서열은 예를 들어, S4 
-나선형 모티프를 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 
-나선형 모티프와 조합하여 포함할 수 있다; BoNT/B, BoNT/G 또는 TeNT 인식 서열은 예를 들어, V2 
-나선형 모티프를 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 
-나선형 모티프와 조합하여 포함할 수 있다; BoNT/C1 인식 서열은 예를 들어, S4 -나선형 모티프를 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 
-나선형 모티프와 조합하여 포함하거나, X2 
-나선형 모티프를 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 
-나선형 모티프와 조합하여 포함할 수 있다; 그리고, BoNT/D 또는 BoNT/F 인식 서열은 예를 들어, V1 
-나선형 모티프를 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 
-나선형 모티프와 조합하여 포함할 수 있다.
BoNT/A 인식 서열
본 명세서에서 사용시, "보툴리눔 독소 세로타입 A 인식 서열"이란 용어는 "BoNT/A 인식 서열"과 동의어이며, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 BoNT/A에 의해 분리 가능한 결합에서 단백분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소 또는 두가지 모두와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. BoNT/A에 의해 분리되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Gln-Arg이다.
다양한 BoNT/A 인식 서열이 해당 분야에 공지되어 있으며, 본 발명에 유용하다. BoNT/A 인식 서열은 예를 들어, 사람 SNAP-25의 잔기 134 내지 206 또는 잔기 137 내지 206을 가질 수 있다(Ekong et al., supra, 1997 ; U. S. Patent No. 5,962, 637). BoNT/A 인식 서열은 또한 사람 SNAP-25의 잔기 190 내지 202에 해당하는 서열 Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO : 30) 또는 이의 펩티도미메틱; 사람 SNAP-25의 잔기 187 내지 201에 해당하는 서열 Ser-Asn-Lys-Thr- Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (SEQ ID NO : 31) 또는 이의 펩티도미메틱; 사람 SNAP-25의 잔기 187 내지 202에 해당하는 서열 Ser-Asn-Lys-Thr- Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 32) 또는 이의 펩티도미메틱; 사람 SNAP-25의 잔기 187 내지 203에 해당하는 서열 Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (SEQ ID NO : 33) 또는 이의 펩티도미메틱; 사람 SNAP-25의 잔기 186 내지 202에 해당하는 서열 Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 34)또는 이의 펩티도미메틱; 사람 SNAP-25의 잔기 186 내지 203에 해당하는 서열 Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (SEQ ID NO: 35) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, Schmidt and Bostian, J. Protein Chem. 14: 703-708 (1995); Schmidt and Bostian, supra, 1997; Schmidt et al., FEBS Letters 435: 61-64 (1998); and Schmidt and Bostian, U.S. Patent No. 5,965,699)를 참조한다. 필요시, 유사한 BoNT/A 인식 서열은 다른 BoNT/A-민감성 SNAP-25 이소폼의 상응하는 (상동체) 단편 또는 예를 들어, 쥐, 래트, 금붕어 또는 제브라피쉬 SNAP-25와 같은 상동체로부터 제조하거나, 본 명세서에 기재하거나 예를 들어, 미국 특허 5,965,699에 공지된 임의의 펩티드일 수 있다.
본 발명에 유용한 BoNT/A 인식 서열은, 보툴리눔 독소 세포타입 A에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 BoNT/A-민감성 단백질의 단편과 실질적으로 유사할 수 있다. 표 B에 나타낸 바와 같이, BoNT/A에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 마우스 및 래트 SNAP-25; 및 금붕어 SNAP-25A 및 SANP-25B를 포함한다. 따라서, 본 발명에 유용한 BoNT/A 인식서열은 예를 들어, 사람 SNAP-25, 마우스 SNAP-25, 래트 SNAP-25, 금붕어 SNAP-25A 또는 SNAP-25B, 또는 BoNT/A에 의해서 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질에 상응할 수 있다. 또한, BoNT/A에 의해 절단되는 본래의 SNAP-25 아미노산 서열과 비교할 때, 이러한 서열은 완전하게 보존되지는 않으며(표 B 및 도 3 참조), 천연 BoNT/A-민감성 SNAP-25 서열에 대한 다양한 아미노산 치환 및 변형이 본 발명에 유용한 BoNT/A 인식 서열에서 허용될 수 있음을 나타낸다.
BoNT/A 인식 서열을 포함하는 기질과 같은 클로스트리디움계 독소 기질은, 상응하는 클로스트리디움계 독소에 의해 절단되는 천연 서열과 비교할 때, 하나 또는 다중의 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, 사람 SNAP-25의 잔기 187 내지 203에 상응하는 17-머와 비교할때, BoNT/A 기질에서 Asp193이 Asn으로 치환되면 상대적 단백분해 비율이 0.23이 되며; Glu194가 Gln으로 치환되면 상대적 비율이 2.08이 되고; Ala195가 2-아미노부티르산으로 치환되면 상대적 비율이 0.38이 되고; Gln197이 Asn, 2-아미노부티르산 또는 Ala으로 치환되면 상대적 비율이 각각 0.66, 0.25 또는 0.19가 된다(표 C 참조). 또한, Ala199를 2-아미노부티르산으로 치환하면 상대적 비율이 0.79가 되고; Thr200을 Ser 또는 2-아미노부티르산으로 치환하면 상대적 비율이 각각 0.26 또는 1.20이 되고; Lys201을 Ala으로 치환하면 상대적 비율이 0.12가 되고; Met202을 Ala 또는 노르류신으로 치환하면 상대적 비율이 각각 0.38 또는 1.20이 된다. Schmidt and Bostian, supra, 1997 참조. 이러한 결과는 천연 독소-민감성 서열과 비교하여 클로스트리디움계 독소 기질에서 다양한 잔기가 치환될 수 있음을 나타낸다. BoNT/A의 경우, 이러한 결과는, Glu194, Ala195, Gln197, Ala199, Thr200 및 Met202, Leu203, Gly204, Ser205 및 Gly206을 포함하나 이에 제한되지 않는 잔기뿐아니라 Gln-Arg 분리가능 결합으로부터 더 끝쪽에 있는 잔기도 치환되거나, 본 발명에 유용한 BoNT/A 기질의 플루오로포어, 벌크그룹, 도너 플루오로포어 또는 억셉터에 컨쥬게이트될 수 있음을 나타낸다. 이러한 BoNT/A 기질은, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서, BoNT/A에 의해 분리가능한 결합에서 검출가능하게 단백분해된다. 따라서, BoNT/A 기질은 필요시, 천연 SNAP-25 서열과 비교하여, 하나 또는 몇 개의 아미노산의 치환, 추가 또는 삭제를 포함할 수 있다.
BoNT/B 인식 서열
본 명세서에서 사용시, "보툴리눔 독소 세로타입 B 인식 서열"이란 용어는 "BoNT/B 인식 서열"과 동의어이며, 적합한 조건하에서 BoNT/B에 의해 분리 가능한 결합에서 단백분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소 및 두가지 모두와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. BoNT/B에 의해 분리되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Gln-Phe이다.
다양한 BoNT/B 인식 서열이 공지되어 있으며, 통상의 방법으로 정의될 수 있다. 이러한 BoNT/B 인식 서열은, 예를 들어, 사람 VAMP-1 또는 사람 VAMP-2와 같은 VAMP 단백질의 친수성 코어 전체 또는 일부에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. BoNT/B 인식 서열은 사람 VAMP-2(SEQ ID NO : 6)의 잔기 33 내지 94, 잔기 45 내지 94, 잔기 55 내지 94, 잔기 60 내지 94, 잔기 64 내지 94, 잔기 60 내지 88, 또는 사람 VAMP-1(SEQ ID NO : 7)의 잔기 60 내지 94를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. Shone et al., Eur . J. Biochem . 217: 965-971 (1993) 및 U. S. Patent No. 5,962, 637를 참조한다. 유사한 BoNT/B 인식 서열을 필요시, 또다른 BoNT/B-민감성 VAMP 이소폼의 상응하는 (상동체) 단편 또는 사람 VAMP-1 또는 래트 또는 닭 VAMP-2와 같은 상동체로부터 제조할 수 있다.
따라서, BoNT/B 인식 서열은, 보툴리눔 독소 세포타입 B에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 이러한 BoNT/B-민감성 단백질의 단편과 실질적으로 유사할 수 있다. 표 D에 나타낸 바와 같이, BoNT/B에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 마우스 및 소 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 VAMP-2; 래트 셀루브레빈; 닭 VAMP-2; 토르페도 VAMP-1; 성게 VAMP; 군소 VAMP; 오징어 VAMP; 예쁜꼬마선충 VAMP; 초파리 n-syb; 및 거머리 VAMP를 포함한다. 따라서, BoNT/B 기질에 포함되는 BoNT/B 인식 서열은 예를 들어, 사람 VAMP-1 또는 VAMP-2, 마우스 VAMP-1 또는 VAMP-2, 소 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 VAMP-2, 래트 셀루브레빈, 닭 VAMP-2, 토르페도 VAMP-1, 성게 VAMP, 군소 VAMP, 오징어 VAMP, 예쁜꼬마선충 VAMP, 초파리 n-syb, 거머리 VAMP 또는 BoNT/B에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 또한, 표 D에 나타낸 바와 같이, BoNT/B에 의해 절단되는 본래의 VAMP 아미노산 서열과 비교할 때, 이러한 서열은 완전하게 보존되지는 않으며(도 4 참조), 천연 VAMP 서열과 비교하여 다양한 아미노산 치환 및 변형이 본 발명의 BoNT/B 기질에서 허용될 수 있음을 나타낸다.
BoNT/C1 인식 서열
본 명세서에서 사용시, "보툴리눔 독소 세로타입 C1 인식 서열"이란 용어는 "BoNT/C1 인식 서열"과 동의어이며, 적합한 조건하에서 BoNT/C1에 의해 분리 가능한 결합에서 단백분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소 또는 두가지 모두와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. BoNT/C1에 의해 분리되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Lys-Ala 또는 Arg-Ala이다.
BoNT/C1 인식 서열은, 보툴리눔 독소 세포타입 C1에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 BoNT/C1-민감성 단백질의 단편과 실질적으로 유사할 수 있는 것으로 이해된다. 표 E에 나타낸 바와 같이, BoNT/C1에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 래트, 마우스 및 소 신택신 1A 및 1B; 래트 신택신 2 및 3; 성게 신택신; 군소 신택신 1; 오징어 신택신; 초파리 Dsynt1; 및 거머리 신택신 1이 포함된다. 따라서, BoNT/C1 기질에 유용한 BoNT/C1 인식 서열은 예를 들어, 사람, 래트, 마우스 또는 소 신택신 1A 또는 1B; 래트 신택신 2, 래트 신택신 3, 성게 신택신, 군소 신택신 1, 오징어 신택신, 초파리 Dsynt1, 거머리 신택신 1 또는 BoNT/C1에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 또한, BoNT/C1에 의해 절단되는 본래의 신택신 아미노산 서열과 비교할때, 이러한 서열은 완전하게 보존되지는 않으며(표 E 및 도 5 참조), 천연 BoNT/C1-민감성 신택신 서열에 대한 다양한 아미노산 치환 및 변형이, 예를 들어, 본 발명에 유용한 BoNT/C1 기질에서 허용될 수 있음을 나타낸다.
다양한 천연 SNAP-25 단백질이 또한 BoNT/C1에 의해 절단되기 쉬우며, 사람, 마우스 및 래트 SNAP-25; 금붕어 SNAP-25A 및 SNAP-25B; 및 초파리 및 거머리 SNAP-25를 포함한다. 따라서, BoNT/C1 기질에 유용한 BoNT/C1 인식 서열은 예를 들어, 사람, 마우스 또는 래트 SNAP-25, 금붕어 SNAP-25A 또는 SNAP-25B, 초파리 SNAP-25, 거머리 SNAP-25 또는 BoNT/C1에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 다양한 천연 신택신 서열에 대하여 상기한 바와 같이, BoNT/C1에 의해 절단되는 본래의 SNAP-25 아미노산 서열과 비교할때, 상당한 서열 변화가 나타나며(도 3 및 표 B 참조), 천연 BoNT/C1-민감성 SNAP-25 서열에 대한 다양한 아미노산 치환 및 변형이 본 발명에 유용한 BoNT/C1 기질에서 허용될 수 있는 것으로 나타났다.
BoNT/D 인식 서열
본 명세서에서 사용시, "보툴리눔 독소 세로타입 D 인식 서열"이란 용어는 "BoNT/D 인식 서열"과 동의어이며, 적합한 조건하에서 BoNT/D에 의해 분리 가능한 결합에서 단백분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소 또는 두가지 모두와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. BoNT/D에 의해 분리되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Lys-Leu이다.
다양한 BoNT/D 인식 서열이 공지되어 있으며, 통상의 방법으로 정의될 수 있다. 이러한 BoNT/D 인식 서열은, 예를 들어, 쥐 VAMP-2의 잔기 27 내지 116; 잔기 37 내지 116; 잔기 1 내지 86; 잔기 1 내지 76; 또는 잔기 1 내지 69를 포함할 수 있다(SEQ ID NO : 90 ; Yamasaki et al., J. Biol . Chem . 269 : 12764-12772 (1994)). 따라서, BoNT/D 인식 서열은 예를 들어, 쥐 VAMP-2의 잔기 27 내지 69 또는 잔기 37 내지 69를 포함할 수 있다.(SEQ ID NO : 90). 필요시, 유사한 BoNT/D 인식 서열을 또다른 BoNT/D-민감성 VAMP 이소폼의 상응하는 (상동체) 단편 또는 사람 VAMP-1 또는 사람 VAMP-2와 같은 상동체로부터 제조할 수 있다.
BoNT/D 인식 서열은, 보툴리눔 독소 세포타입 D에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 BoNT/D-민감성 단백질의 단편과 실질적으로 유사할 수 있다. 표 D에 나타낸 바와 같이, BoNT/D에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 마우스 및 소 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 셀루브레빈; 닭 VAMP-1 및 VAMP-2; 토르페도 VAMP-1; 군소 VAMP; 오징어 VAMP; 초파리 syb 및 n-syb; 및 거머리 VAMP를 포함한다. 따라서, BoNT/D 인식 서열은 예를 들어, 사람 VAMP-1 또는 VAMP-2, 마우스 VAMP-1 또는 VAMP-2, 소 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 셀루브레빈, 닭 VAMP-1 또는 VAMP-2, 토르페도 VAMP-1, 군소 VAMP, 오징어 VAMP, 초파리 syb 또는 n-syb, 거머리 VAMP 또는 BoNT/D에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 또한, 상기 표 D에 나타낸 바와 같이, BoNT/D에 의해 절단되는 본래의 VAMP 아미노산 서열과 비교할때, 상당한 서열변화가 나타났으며(도 4 참조), 천연 BoNT/D-민감성 VAMP 서열과 비교하여 다양한 아미노산 치환 및 변형이 본 발명에 유용한 BoNT/D 기질에서 허용될 수 있음을 나타낸다.
BoNT/E 인식 서열
본 명세서에서 사용시, "보툴리눔 독소 세로타입 E 인식 서열"이란 용어는 "BoNT/E 인식 서열"과 동의어이며, 적절한 조건하에서 BoNT/E에 의해 분리 가능한 결합에서 단백분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소 또는 두가지 모두와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. BoNT/E에 의해 절단되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Arg-Ile이다.
BoNT/E 인식 서열은, 보툴리눔 독소 세포타입 E에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 BoNT/E-민감성 단백질의 단편과 실질적으로 유사할 수 있다는 것이 당업자에게는 명백하다. 일 실시형태에서, BoNT/E 인식 서열은 SEQ ID NO:2의 잔기 134 내지 206을 포함한다. BoNT/E에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 마우스 및 래트 SNAP-25; 마우스 SNAP-23; 닭 SNAP-25; 금붕어 SNAP-25A 및 SNAP-25B; 제브라피쉬 SNAP-25; 예쁜꼬마선충 SNAP-25 및 거머리 SNAP-25를 포함한다(표 B 참조). 따라서, BoNT/E 인식 서열은 예를 들어, 사람 SNAP-25, 마우스 SNAP-25, 래트 SNAP-25; 마우스 SNAP-23; 닭 SNAP-25; 금붕어 SNAP-25A 또는 SNAP-25B; 예쁜꼬마선충 SNAP-25, 거머리 SNAP-25 또는 BoNT/E에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 또한, 표 B 및 도 3에 나타낸 바와 같이, BoNT/E에 의해 절단되는 본래의 SNAP-23 및 SNAP-25 아미노산 서열과 비교할때, 이러한 서열은 완전하게 보존되지는 않으며, 천연 BoNT/E-민감성 SNAP-23 또는 SNAP-25 서열과 비교하여 다양한 아미노산 치환 및 변형이, 예를 들어, 본 발명에 유용한 BoNT/E 기질에서 허용될 수 있음을 나타낸다.
BoNT/F 인식 서열
본 명세서에서 사용시, "보툴리눔 독소 세로타입 F 인식 서열"이란 용어는 "BoNT/F 인식 서열"과 동의어이며, 적절한 조건하에서 BoNT/F에 의해 분리 가능한 결합에서 단백분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소 또는 두가지 모두와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. BoNT/F에 의해 절단되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Gln-Lys이다.
다양한 BoNT/F 인식 서열이 공지되어 있으며, 통상의 방법으로 정의될 수 있다. 이러한 BoNT/F 인식 서열은, 예를 들어, 쥐 VAMP-2의 잔기 27 내지 116; 잔기 37 내지 116; 잔기 1 내지 86; 잔기 1 내지 76; 또는 잔기 1 내지 69를 포함할 수 있다(SEQ ID NO : 90 ; Yamasaki et al., supra, 1994). BoNT/F 인식 서열은 또한 예를 들어, 쥐 VAMP-2의 잔기 27 내지 69 또는 잔기 37 내지 69를 포함할 수 있다(SEQ ID NO : 90). 유사한 BoNT/F 인식 서열을 필요시, 또다른 BoNT/F-민감성 VAMP 이소폼의 상응하는 (상동체) 단편 또는 사람 VAMP-1 또는 사람 VAMP-2와 같은 상동체로부터 제조할 수 있는 것으로 이해된다.
BoNT/F 인식 서열은, 보툴리눔 독소 세포타입 F에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 BoNT/F-민감성 단백질의 단편과 실질적으로 유사할 수 있다. BoNT/F에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 마우스 및 소 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 셀루브레빈; 닭 VAMP-1 및 VAMP-2; 토르페도 VAMP-1; 군소 VAMP; 초파리 syb; 및 거머리 VAMP를 포함한다(표 D 참조). 따라서, BoNT/F 인식 서열은 예를 들어, 사람 VAMP-1 또는 VAMP-2, 마우스 VAMP-1 또는 VAMP-2, 소 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 셀루브레빈, 닭 VAMP-1 또는 VAMP-2, 토르페도 VAMP-1, 군소 VAMP, 초파리 syb, 거머리 VAMP 또는 BoNT/F에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 또한, 상기 표 D에 나타낸 바와 같이, BoNT/F에 의해 절단되는 본래의 VAMP 아미노산 서열과 비교할 때, 이러한 서열은 완전하게 보존되지는 않으며(도 4 참조), 천연 BoNT/F-민감성 VAMP 서열과 비교하여 다양한 아미노산 치환 및 변형이, 예를 들어, 본 발명에 유용한 BoNT/F 기질에서 허용될 수 있음을 나타낸다.
BoNT/G 인식 서열
본 명세서에서 사용시, "보툴리눔 독소 세로타입 G 인식 서열"이란 용어는 "BoNT/G 인식 서열"과 동의어이며, 적절한 조건하에서 BoNT/G에 의해 분리 가능한 결합에서 단백분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소 또는 두가지 모두와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. BoNT/G에 의해 절단되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Ala-Ala이다.
BoNT/G 인식 서열은, 보툴리눔 독소 세포타입 G에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 이러한 BoNT/G-민감성 단편과 실질적으로 유사할 수 있다. 표 D에 나타낸 바와 같이, BoNT/G에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 마우스 및 소 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 셀루브레빈; 닭 VAMP-1 및 VAMP-2; 및 토르페도 VAMP-1를 포함한다. 따라서, BoNT/G 인식 서열은 예를 들어, 사람 VAMP-1 또는 VAMP-2, 마우스 VAMP-1 또는 VAMP-2, 소 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 셀루브레빈, 닭 VAMP-1 또는 VAMP-2, 토르페도 VAMP-1 또는 BoNT/G에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 또한, 상기 표 D에 나타낸 바와 같이, BoNT/G에 의해 절단되는 본래의 VAMP 아미노산 서열과 비교할 때, 이러한 서열은 완전하게 보존되지는 않으며(도 4 참조), 천연 BoNT/G-민감성 VAMP 서열과 비교하여 다양한 아미노산 치환 및 변형이 본 발명에 유용한 BoNT/G 기질에서 허용될 수 있음을 나타낸다.
TeNT 인식 서열
본 명세서에서 사용시, "파상풍 독소 인식 서열"이란 용어는, 적절한 조건하에서 파상풍 독소에 의해 분리 가능한 결합에서 단백분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소 또는 두가지 모두와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. TeNT에 의해 절단되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Gln-Phe이다.
다양한 TeNT 인식 서열이 공지되어 있으며, 통상의 방법으로 정의될 수 있고, 사람 VAMP-1 또는 사람 VAMP-2와 같은 VAMP 단백질의 친수성 코어 전체 또는 일부에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. TeNT 인식 서열은 사람 VAMP-2(SEQ ID NO : 8; Cornille et al. , Eur. J. Biochem. 222: 173-181 (1994); Foran et al. , Biochem. 33: 15365-15374 (1994))의 잔기 25 내지 93 또는 잔기 33 내지 94; 래트 VAMP-2(SEQ ID NO : 90; Yamasaki et al. , supra, 1994)의 잔기 51 내지 93 또는 잔기 1 내지 86; 또는 사람 VAMP-1(SEQ ID NO : 7)의 잔기 33 내지 94를 포함할 수 있다. TeNT 인식 서열은 또한 예를 들어, 사람 VAMP-2(SEQ ID NO : 8) 또는 래트 VAMP-2(SEQ ID NO : 90)의 잔기 25 내지 86, 잔기 33 내지 86 또는 잔기 51 내지 86을 포함할 수 있다. 유사한 TeNT 인식 서열을 필요시, 또다른 TeNT-민감성 VAMP 이소폼의 상응하는 (상동체) 단편 또는 사람 VAMP-1 또는 성게 또는 군소 VAMP와 같은 종 상동체로부터 제조할 수 있다고 이해된다.
따라서, TeNT 인식 서열은, 파상풍 독소에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 이러한 TeNT-민감성 단편과 실질적으로 유사할 수 있다. 표 D에 나타낸 바와 같이, TeNT에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 마우스 및 소 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 VAMP-2; 래트 셀루브레빈; 닭 VAMP-2; 토르페도 VAMP-1; 성게 VAMP; 군소 VAMP; 오징어 VAMP; 예쁜꼬마선충 VAMP; 초파리 n-syb; 및 거머리 VAMP를 포함한다. 따라서, TeNT 인식 서열은 예를 들어, 사람 VAMP-1 또는 VAMP-2, 마우스 VAMP-1 또는 VAMP-2, 소 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 VAMP-2, 래트 셀루브레빈, 닭 VAMP-2, 토르페도 VAMP-1, 성게 VAMP, 군소 VAMP, 오징어 VAMP, 예쁜꼬마선충 VAMP, 초파리 n-syb, 거머리 VAMP 또는 TeNT에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 또한, TeNT에 의해 절단되는 본래의 VAMP 아미노산 서열과 비교할 때, 이러한 서열은 완전하게 보존되지는 않으며(표 D 및 도 4 참조), 천연 TeNT-민감성 VAMP 서열과 비교하여 다양한 아미노산 치환 및 변형이 본 발명에 유용한 TeNT 기질에서 허용될 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질은 펩티드 및 펩티도미메틱뿐아니라 이들의 유도체들을 포함한다. 본 명세서에서 사용할 때, "펩티도미메틱(peptidomimetic)"이란 용어는 구조에 기초하여, 펩티드 기질과 동일한 클로스트리디움계 독소에 의해 절단되는 펩티드-유사 분자를 의미하는 넓은 의미로 사용된다. 이러한 펩티도미메틱은 화학적으로 변형된 펩티드, 비-천연 아미노산을 포함하는 펩티드-유사 분자, 및 N-치환된 글리신의 올리고머 어셈블리로부터 얻은 펩티드-유사 분자인 펩토이드를 포함하며, 펩티도미메틱이 유도된 펩티드 기질과 동일한 클로스트리디움계 독소에 의해서 절단된다(예를 들어, Goodman and Ro, Peptidomimetics for Drug Design , in "Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery" Vol. 1 (ed. M. E. Wolff; John Wiley & Sons 1995), pages 803-861 참조).
예를 들어, 속박된(constrained) 아미노산을 포함하는 펩티드-유사 분자, 펩티드 2차 구조 또는 아미드 결합 등입체성계(isostere)를 모방한 비-펩티드 구성요소를 포함하는, 다양한 펩티도미메틱이 공지되어 있다. 속박된, 비-천연 아미노산을 포함할 수 있는 펩티도미메틱은 예를 들어, α-메틸화된 아미노산; α,α-디알킬-글리신 또는 α-아미노시클로알칸 카복실산; Nα-Cα 고리화된 아미노산; Nα-메틸화된 아미노산; β- 또는 γ-아미노 시클로알칸 카복실산; α,β-불포화 아미노산; β,β-디메틸 또는 β-메틸 아미노산;αβ-포화된-2,3-메타노 아미노산; NCδ 또는 Cδ-Cδ 고리화된 아미노산; 또는 포화된 프롤린 또는 다른 아미노산 모방체(mimetic)를 포함할 수 있다. 또한, 펩티드 2차 구조를 모방한 펩티도미메틱은예를 들어, 비펩티드성 β-턴 모방; γ-턴 모방; β-시트 구조의 모방; 또는 나선형 구조의 모방을 포함할 수 있으며, 각각은 해당 분야에 공지되어 있다. 펩티도미메틱은 또한 예를 들어, 레트로-인베르소 변형과 같은 아미드 결합 등입체성계; 감소된 아미드 결합; 메틸렌티오에테르 또는 메틸렌술폭사이드 결합; 메틸렌 에테르 결합; 에틸렌 결합; 티오아미드 결합; 트랜스-올레핀 또는 플루오로올레핀 결합; 1,5-이치환된 테트라졸 링; 케토메틸렌 또는 플루오로케토메틸렌 결합 또는 다른 아미드 등입체성계를 포함하는 펩티드-유사 분자일 수 있다. 당업자는 이러한, 그리고, 다른 펩티도미메틱이 본 명세서에 사용된 "펩티도미메틱"라는 용어의 의미에 포함된다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 방법에 있어서, 클로스트리디움계 독소 기질은 동일한 또는 상이한 클로스트리디움계 독소에 대한, 하나 또는 다중 클로스트리디움계 독소 절단 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 단일 클로스트리디움계 독소 절단 부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질에 의존하는 방법을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 동일한 클로스트리디움계 독소에 대한 다중 절단 부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질에 의존하는 방법을 제공한다. 이러한 절단 부위는 일치하거나 상이한 클로스트리디움계 독소 인식 서열 내에 병합된다. 제한되지 않은 실시예에서, 클로스트리디움계 독소 기질은 동일한 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 있는 동일한 클로스트리디움계 독소에 대한 다중 절단 부위를 가질 수 있다. 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 동일한 클로스트리디움계 독소에 대하여 예를 들어, 2 이상, 3 이상, 5 이상 또는 10 이상의 일치하거나 일치하지 않는 인식 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 또한 동일한 클로스트리디움계 독소에 대하여 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10개의 인식 서열을 가질 수 있다; 다중 인식 서열은 동일하거나 상이한 란타나이드 도너 복합체-억셉터 쌍 사이에 있을 수 있다.
본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 또한 상이한 클로스트리디움계 독소에 대한 절단 부위를 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 본 발명은 모두 동일한 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 있는 상이한 클로스트리디움계 독소에 대한 다중 절단 부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질에 의존하는 방법을 제공한다. 클로스트리디움계 독소 기질은, 모두 동일한 란타나이드 도너 복합체와 억셉터 사이에 있는, 예를 들어, 2 이상, 3 이상 또는 5 이상의 상이한 클로스트리디움계 독소에 대한 절단부위를 포함할 수 있다. 클로스트리디움계 독소 기질은 또한 적어도 2개의 란타나이드 도너 복합체-억셉터 쌍 사이에 있는, 예를 들어, 2 이상, 3 이상 또는 5 이상의 상이한 클로스트리디움계 독소에 대한 절단부위를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 상이한 클로스트리디움계 독소에 대한 절단부위를 가지는 클로스트리디움계 독소 기질을 제공하며, 절단 부위는 동일하거나 상이한 란타나이드 도너 복합체-억셉터 쌍 사이에 있다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 예를 들어, 하기 클로스트리디움계 독소의 임의의 조합에 대한 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 절단부위의 임의의 조합을 가지는 클로스트리디움계 독소 기질을 제공한다: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G 및 TeNT.
본 발명의 방법은 다중 기질을 사용하여 실시될 수 있다. 이러한 방법에서, 제 1 클로스트리디움계 독소 기질을 시료로 처치하고, 제 1 기질은 제 1 란타나이드 도너 복합체를 포함하며, 제 1 억셉터는 제 1 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지며, 제 1 클로스트리디움계 독소 인식 서열은 절단 부위를 포함하고, 절단 부위는 제 1 란타나이드 도너 복합체와 제 1 억셉터 사이에 있고, 알맞은 조건 하에서 제 1 란타나이드 도너 복합체와 제 1 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타난다. 원한다면, 동일한 에세이에 제 2 클로스트리디움계 독소 기질이 포함될 수 있으며; 제 2 기질은 제 2 란타나이드 도너 복합체 및 제 2 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 제 2 억셉터, 제 1 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 절단하는 독소와는 상이한 클로스트리디움계 독소에 의해서 절단되는 제 2 클로스트리디움계 독소 인식서열을 포함한다. 제 2 기질의 란타나이드 도너 복합체-억셉터 쌍은 제 1 기질의 란타나이드 도너 복합체-억셉터 쌍과 동일하거나 상이할 수 있다. 이런 식으로, 하나 이상의 클로스트리디움계 독소의 존재에 대하여 단일 시료를 동시에 에세이할 수 있다.
클로스트리디움계 독소들의 임의 조합, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상의 클로스트리디움계 독소들에 대하여 검정하는 데 본 발명의 방법을 사용할 수 있을 것으로 이해된다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 BONT/A, BONT/B, BONT/C1, BONT/D, BONT/E, BONT/F, BONT/G 및 TeNT의 임의의 조합을 검정할 수 있다. 예를 들어, 에세이는 7개의 기질을 사용하여 실시될 수 있으며, 이들 각각은 GFP 및 각각 BONT/A, BONT/B, C1, BONT/D, BONT/E, BONT/F 또는 BONT/G 인식 서열 및 절단 부위 측면에 있는 CS124-DTPA-EMCH-Tb를 포함한다. 이러한 기질들은 330nm에서 카보스티릴 124를 여기시키고 586nm에서 테르븀 방출을 모니터링하기 전에 보툴리눔 독소 활성에 적합한 조건 하에서 시료로 처리될 수 있다. 586nm에서 루미네선스 세기의 증가(퀀칭의 제거)는 적어도 하나의 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 나타낸다. 이러한 에세이는 예를 들어, 보툴리눔 또는 다른 클로스트리디움계 독소의 존재에 대하여, 음식 시료 또는 조직 시료를 에세이하는 데 유용할 수 있으며, 필요시, 개별적인 클로스트리디움계 독소 또는 특정 조합의 클로스트리디움계 독소들에 대한 하나 이상의 이어지는 에세이와 조합하여 사용할 수 있다.
둘 이상의 상이한 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하고, 각각의 기질은 상이한 란타나이드 도너 복합체-억셉터 쌍을 포함하도록 하여, 둘 이상의 상이한 클로스트리디움계 독소에 대하여 단일 시료를 에세이할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어 미국 특허 6,180,340에 기재된 바와 같이, 다중 기질의 사용은 에세이의 다이내믹한 범위를 넓히는데 유용할 수 있다. 당업자는 제 2 란타나이드 도너 복합체의 제 2 안테나가 여기하기 전 또는 후에, 제 1 란타나이드 도너 복합체의 제 1 안테나가 여기할 수 있고, 제 1 기질의 공명 에너지 전이의 변화를 제 2 기질의 공명 에너지 전이를 결정하기 전에, 동시에 또는 후에 결정할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
도 1은 중추 뉴런 및 말초 뉴런에서 파상풍 독소 및 보툴리눔 독소 활성에 필요한 4 단계의 개략도를 나타낸다
도 2는 세포 이하의 배치 및 SNAP-25, VAMP 및 신택신의 절단부위를 나타낸 다. SNAP-25 및 신택신은 표적 원형질막에 결합하는 반면, VAMP는 스냅스 소포 막에 결합된다. BoNT/A 및 /E는 카복시-테타니에 가까운 SNAP-25을 절단하여, 각각 9개 또는 26개 잔기를 떼어 놓는다. BoNT/B, /D, /F, /G 및 TeNT는 VAMP의 보존된 중앙 부분(점선표시)에 작용하여, VAMP의 아미노-말단 부분을 시토졸로 방출한다. BoNT/C1은 카복시-말단에 가까운 SNAP-25를 절단할 뿐아니라, 시토졸 막 표면에 가까운 단일 부위에서 신택신을 절단한다. BoNT/B, /C1, /D, /F, /G 및 TeNT이 작용하면, VAMP 또는 신택신의 시토졸 도메인의 큰 부분을 떼어 놓는 반면, SNPA-25의 작은 부분은 BoNT/A, /C1 또는 /E의 선택적인 단백분해에 의해서만 떼어진다.
도 3은 다양한 SNAP-25 단백질의 배열을 나타낸다. 사람 SNAP-25(SEQ ID NO: 1; GenBank accession g4507099; 또한 관련된 사람 SNAP-25 서열 g2135800 참조) ; 마우스 SNAP-25(SEQ ID NO:2; GenBank accession G6755588) ; 초파리 SNAP-25(SEQ ID NO:3; GenBank accession g548941); 금붕어 SNAP-25(SEQ ID NO:4; GenBank accession G2133923); 성게 SNAP-25(SEQ ID NO:5 ; GenBank accession g2707818) 및 닭 SNAP-25 (SEQ ID NO:6; GenBank accession g481202)을 도시하였다.
도 4는 다양한 VAMP 단백질의 배열을 나타낸다. 사람 VAMP-1(SEQ ID NO:7; GenBank accession g135093) ; 사람 VAMP-2 (SEQ ID NO:8; GenBank accession gl35094) ; 마우스 VAMP-2 (SEQ ID NO:9; GenBank accession g2501081); 소 VAMP (SEQ ID NO:10; GenBank accession g89782); 개구리 VAMP (SEQ ID NO:11; GenBank accession g6094391); 및 성게 VAMP(SEQ ID NO: 12; GenBank accession g5031415) 을 나타낸다.
도 5는 다양한 신택신 단백질의 배열을 나타낸다. 사람 신택신 1A (SEQ ID NO:13; GenBank accession g15079184), 사람 신택신 1B2 (SEQ ID NO:14; GenBank accession g15072437), 마우스 신택신 1A (SEQ ID NO:15; GenBank accession g15011853), 초파리 신택신 1A (SEQ ID NO:16; GenBank accession g2501095); 예쁜꼬마선충 신택신 A (SEQ ID NO:17; GenBank accession g7511662) 및 성게 신택신 (SEQ ID NO:18; GenBank accession gl3310402)을 나타낸다.
도 6은 α-나선(E, 잔기 1-11), 란타나이드-결합 루프, 및 제 2 α-나선(F, 잔기 19-29)을 포함하는 정규 EF-핸드를 나타낸다. n으로 나타낸 α-탄소(잔기 2,5,6,9,17,22,25,26 및 (29))는 보통 소수성 측쇄들을 가진다. 이들은 안쪽을 가리키며, 국부적인 2-폴드 축에 의해서 첫번째와 연관되는, 제 2 EF-핸드 도메인의 상응하는 잔기들과 상호작용하여 소수성 코어를 형성한다. 잔기 17에서 Ile, Leu 또는 Val은 루프를 소수성 코어에 부착시킨다. 위치 15에서 Gly은 란타나이드-결합 루프에서 뾰족한 구부러짐을 가능하게 해준다. 특별히 표시된 잔기들은 강한 일치를 반영하지만 불변하는 것은 아니다. 란타나이드 이온은 잔기 10(X), 12(Y), 14(Z), 및 18(-X)의 측쇄의 산소 원자 또는 가교 물 분자에 의해서 배위된다. 꼭지점 -Y에서 리간드는 잔기 16의 카보닐 산소이다. 전형적으로 잔기 21(-Z)는 Glu이고, 란타나이드 이온을 배위하는 6번째 잔기이다. Nakayama and Kretsinαer. Annu. Rev . Biophvs . Biomol . Struct. 23:473-507 (1994) 참조.
도 7은 (A) 플라스미드 pQBI GFP-SNAP25(134-206)-6XHIS-C의 개략도 및 (B) pQBI GFP-SNAP25(134-206)-6XHIS-C의 핵산 및 아미노산 서열(SEQ ID NO: 19 및 20)을 나타낸다.
도 8은 GFP-SNAP25(134-206)-His6C의 (A) 흡수 스펙트럼 및 (B) 여기(점선) 및 방출(굵은선) 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 GFP-SNAP25(134-206)-His6-C-CS124-DTPA-EMCH-Tb의 300nm 펄스 게이티드 여기(pulse gated exitation)를 사용한, (A) UV-VIS 흡수 스펙트럼 및 (B) 방출 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 란타나이드계 기질 GFP-SNAP25(134-206)-His6-C-CS124-DTPA-EMCH-Tb를 사용하는 클로스트리디움계 독소 활성의 형광 공명 에너지 전이(LRET) 에세이를 나타낸다. (A)37℃에서 묽은 벌크 BoNT/A를 131 ng/ml 큐벳 농도로 가할 때 LRET에 의해서 나타나는 퀀칭 제거(Quench relief). 독소를 가했을 때 586nm 테르븀 방출이 증가한다. (B) 턴오번 전후에 330 nm 펄스 게이티드 제논 여기를 사용한 GFP-SNAP25(134-206)-His6-C-CS124-DTPA-EMCH-Tb의 방출 스펙트럼. 점선은 턴오버 전의 게이티드 테르븀 방출을 나타내고, 실선은 턴오버 후의 게이티드 테르븀방출을 나타낸다.
하기 실시예는 설명을 위한 것이며 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 I: 란타나이드-계 기질의 제조
본 실시예는 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 에세이하기에 적합한 테르븀 또는 다른 란타나이드 이온을 포함하는 기질의 구성을 설명한다.
A. GFP-SNAP25(134-206)-His6-C의 구성
기질을 녹색 형광 단백질(GFP), 쥐 SNAP-25 잔기 134-206, 폴리히스티딘 친화성 태그(6xHis) 및 카복시-말단 시스테인을 포함하며, 몇가지 성분들은 펩티드 링커에 의해서 구분된 융합 단백질로서 제조하였다. 하기한 바와 같이, GFP와 말단 시스테인이 SNAP-25(134-206)의 반대쪽 끝에 존재하도록 기질을 디자인하였다.
SANP-25 서열은 Professor Dolly (O'Sullivan et al., J. Biol. Chem. 274:36897-36904 (1999))에 의해서 제공되는, 글루타티온-S-트랜스페라아제(GST) 유전자의 3' 말단을 가지는 프레임에 삽입된 전체 길이의 마우스 SNAP-25 유전자를 포함하는 플라스미드, pT25FL로부터 얻었다(GST-SNAP25(1-206)). pT25FL로부터의 SNAP-25 서열을, 바이오티닐레이션(biotinylation)을 위한 BirAsp 신호 서열 및 SNAP-25의 잔기 134 내지 206의 아미노-말단에 융합된 폴리히스티딘 친화성 태그를 가지도록 디자인된 제 2 발현 벡터에 병합시켰다(BirAsp-polyHis-SNAP25(134-206), "BA-SNAP"로 표시). SNAP25(134-206)를 암호화하는 DNA 서열은 PCR 프라이머 5'-GCT AGA TCT CGA GTT AAC CAC TTC CCA GCA TCT TTG-3' (SEQ ID NO: 91;안티센스) 및 5-ATC CGG AGG GTA ACA AAC GAT GCC-3' (SEQ ID NO: 92; 센스)를 가지는 적절한 영역 의 pT25FL 플라스미드를 PCR 증폭에 의해 생성시켜서 Bgl II 제한 부위를 포함하는 SNAP25(134-206) PCR 생성물을 생성하였다(PCR 생성물 A).
20 bp 상보 영역(complementary region)을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드 SEQ ID NO: 93 및 94를 사용하여 SNAP25(134-206) 서열을 가진 프레임에 위쪽방향으로 융합하기 위해서, 바이오티닐레이션을 위한 천연 기질일 뿐아니라 폴리히스티딘 친화성 태그인 BirAsp 서열을 가공하였다. 이러한 올리고뉴클레오티드, 5'-CGA ATT CCG CGG GCC ACC ATG GGA GGA GGA CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCT CAA AAG ATC-3' (SEQ ID NO: 93; 센스; Sac II 부위는 밑줄) 및 5'-TCG TTT GTTACC CTC CGG ATA TGA TGA TGA TGA TGA TGA TGA TGG GAT CCA TGC CAC TCG ATC TTT TGA GCC TCG AAG A-3' (SEQ ID NO: 94; 안티센스)를 어닐링하고, PCR 증폭으로 단일 가닥 오버행을 채워서 PCR 생성물 B를 얻었다.
PCR 생성물 A로 표시한 SNAP25(134-206) 및 PCR 생성물 B로 표시한 BirAsp 및 폴리히스티딘에 대한 코딩 서열을 포함하는 두 개의 이중 가닥 PCR 생성물을 변성시키고 어닐링하였다. 두 개의 유전자 단편의 20 bp 상보 서열을 PCT 프라이머 SEQ ID NO: 92 및 SEQ ID NO: 94에 이탤릭체로 표시하였다. PCR로 오버행(overhang)을 채운 후, 생성물을 프라이머 SEQ ID NO: 93 및 SEQ ID NO: 91로 증폭하였다. BirAsp-polyHis-SNAP25(134-206)를 암호화한, 얻어진 PCR 생성물("BA-SNAP"으로 표시)을 SacII 및 BglII로 소화시키고, 분리된 유전자 인서트를 SacII 및 BamHI로 소화된 pQBI25fA2 벡터에 연결하여 플라스미드 pNTP12 (BA-SNAPmf 포함하 는 pQBI25fA2)를 얻었다.
E. coli로부터의 발현 및 정제를 위하여, BA-SNAP 유전자를 pTrc99A 플라스미드(Amersham Pharmacia Biotech)로 이동시켰다. Ncol 및 Xhol로 소화시킨 후 겔 정제하여 BA-SNAP 유전자를 pNTP12로부터 분리하였다. 별도로, pTrc99A 플라스미드를 Ncol 및 SacII로 소화시키고 분리된 벡터를 BA-SANP에 연결시켜서 플라스미드 pNTP14(BA-SNAP를 포함하는 pTrc99A)를 얻었다.
BA-SNAP 유전자를 플라스미드 pQE-50으로 클로닝하기 위하여, BA-SNAP 단편을 pNTP14로부터 프라미어 SEQ ID NO: 91 및 프라이머 SEQ ID NO: 95 (5'-CGA AGA TCT GGA GGA CTG AAC GAC ATC TTC-3' (센스; BglII 부위는 밑줄))을 PCR 증폭하였다. BglII 및 Xhol로 소화시킨 후, 증폭된 PCR 생성물을 BamHI 및 SacII로 소화된 벡터 pQE-50에 연결하였다. BA-SNAP을 함유하는 pQE50을 나타내는 얻어진 플라스미드를 pNTP26으로 표시한다.
하기와 같은 세단계로 벡터 pQBI T-7-GFP(Quantum Biotechnologies; Carlsbad, CA)를 변형시켜 녹색 형광 단백질(GFP) 융합 단백질 기질을 암호화하는 플라스미드를 제조하였다. 첫째로, 벡터 pQBI T7-GFP를 PCR-변형시켜 GFP-코딩 서열의 3' 말단에서 종결 코돈을 제거하고, SNAP-25 단편으로부터 GFP를 떨어뜨려 놓는 펩티드 링커의 부분에 대한 코딩 서열을 삽입하였다. 둘째로, SNAP-25(134-206) 유전자의 5'에 융합된 펩티드 링커의 나머지 부분 및 유전자의 3'에 융합된 6xHis 친화성 태그에 대한 코딩서열을 병합하도록 디자인된 PCR 프라이머를 사용하여 pNTP26으로부터 SNAP-25(134-206)에 대한 DNA 단편 코딩을 PCR 증폭하였다. 얻어진 PCR 생성물을 상술한 변형 pQBI 벡터로 클로닝하여 pQBI GFP-SNAP25(134-206)를 얻었다.
그리고 나서, 프라이머 SEQ ID NO: 96 (5'-GATGGTGATGGTGATGACAGCCGCCACCGCCACC-3' (안티센스 프라이머, 추가된 뉴클레오티드는 밑줄) 및 역상보(reverse complement)(센스 프라이머)를 사용하여 플라스미드 pQBI GFP-SNAP25(134-206)를 부위-지정 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)에 의해서 변형시켜 시스테인 코돈을 카복시 말단에 추가하였다. pQBI GFP-SNAP25 (Cys-Stop)로 표시하는, 얻어진 플라스미드를 도 7A에 나타내었고, GFP-SNAP25(134-206)-6xHis-Cys의 발현에 사용하였다. GFP-SNAP25(134-206)-6xHis-Cys 구조물에 대한 핵산 및 예상 염기서열을 도 7B에 나타내었다.
B. GFP-SNAP25(134-206)-His6-C의 발현 및 특성
pQBI GFP-SNAP25 (Cys-Stop) 발현 벡터를 E. Coli BL21(DE3) 세포(Novagen; Madison, Wl; or Invitrogen; Carlsbad, CA)로, 또는 T7 RNA 폴리머라아제 유전자를 포함하는 E. coli BL21 -CodonPlus®(DE3)-RIL 세포(Stratagene)로 형질변환(transform)하였다. 형질변형된 세포를 37℃에서 밤새 LB-암피실린 플레이트 상에서 선별하였다. 단일 콜로니를 1-3ml 스타터 배양물을 배양하는 데 사용하고, 차례로 0.5 내지 1.0L 배양물을 배양하는 데 사용하였다. 큰 배양물을 A595가 0.5-0.6에 도달할 때까지 흔들면서 37℃에서 성장시키고 배양기에서 꺼내어 잠시 냉각시켰다. 1mM IPTG을 사용하여 단백질 발현을 유도한 후, GFP 플루오로포어의 형성을 용이하게 하기 위하여 16℃에서 밤새 흔들면서 GFP-SNAP25(134-206)-His6-C 기질을 pQBI GFP-SNAP25 (Cys-Stop) 플라스미드로부터 발현시켰다. 원심분리(30분, 6,000 ㅌ g, 4℃)하여 발현 배양물의 250ml 분취액으로부터 세포를 수집하고 필요할 때까지 -80℃에 저장하였다.
다음과 같이, IMAC 정제 및 그 후의 NcCl과 이미다졸을 제거하기 위한 탈염 단계를 포함한 2-단계 방법으로 4℃에서 기질을 정제하였으며, 전형적으로 150mg/L 이상의 정제된 기질을 수득한다. 250ml 배양물들로부터의 세포 펠렛을 각각 7-12ml 컬럼 바인딩 완충제(25mM HEPES, pH 8.0; 500mM NaCl; 1mM β-머캅토에탄올; 10mM 이미다졸) 중에 재현탁하고, 초음파로 용해(lyse)하고(38% 진폭 10-초 펄스에서 1분 40초), 원심분리(16000rpm, 4℃, 1시간)로 분리하였다. 유리 또는 일회용 컬럼 서포트(Bio-Rad) 안의 친화성 수지(3-5 mL Talon SuperFlow Co2+per cell pellet)를 4 컬럼 부피의 멸균 ddH2O 및 4 컬럼 부피의 컬럼 바인딩 완충제로 씻어내려서 평형을 이루게 하였다. 분리된 용해물을 다음 두가지 중 한가지 방법으로 컬럼에 넣었다; (1) 용해물을 수지에 가하고 1시간 동안 가볍게 흔들면서 수평 배양하여 배치 바인딩(batch binding)하였다. (2) 용해물을 수직 컬럼에 가하고 중력에 의해서 컬럼 안으로 천천히 들어가게 하였다. 단지 배치 바인딩만 한 후에 는, 컬럼을 똑바로 세워서 용액을 빼내어 모아서 다시 수지를 통과하게 하였다. 두가지 경우 모두에서, 용해물을 가한 후에, 컬럼을 4-5 컬럼 부피의 컬럼 바인딩 완충제로 세척하였다. 일부 경우에는, 컬럼을 1-2 컬럼 부피의 컬럼 세척 완충제 (25 mM HEPES, pH 8.0; 500 mM NaCl; 1 mM β-머캅토에탄올; 20 mM 이미다졸) 더욱 세척하였다. 1.5 내지 2.0 컬럼 부피의 컬럼 용리 완충제(25 mM HEPES, pH 8.0; 500 mM NaCl; 1 mM β-머캅토에탄올; 250 mM 이미다졸)를 사용하여 단백질을 용리하고, ~1.4ml의 분액으로 수집하였다. 녹색 분액(fraction)을 수집하고 원심분리 필터(10,000 또는 30,000 분자량 컷-오프)로 농축하고, HiPrep 26/10 사이즈 배제 컬럼(Pharmacia) 및 10ml/분 유속의 차가운 융합 단백질 탈염 완충제(50 mM HEPES, pH 7.4, 4℃)의 일정 조성 이동상(isocratic mobile phase)을 가진 FPLC(BioRad Biologic DuoLogic, QuadTec UV-Vis 검출기)로 탈염하였다. 탈염된 단백질을 하나로 수집하고, BioRad 단백질 에세이를 사용하여 농도를 결정하였다. SDS-PAGE로 GFP-SNAP25(134-206)-His6-C 기질을 분석하였다. 단백질 용액을 일련의 50㎕ 분취량들로 나누고, 액체 질소로 급속냉동시켜 -80℃에서 저장하였다. 일단 해동하고 나면, 사용하는 분취량은 4℃에 보관하며 빛을 차단한다.
C. 루미포어 CS124-DTPA-EMCH-Tb로 표지
GFP에 화학적 변형이 불가능한 묻혀있는 시스테인 잔기가 3개 있지만, GFP-SNAP25(134-206)-His6-C 구조물은 용매 노출되는 단 하나의 시스테인 잔기를 포함한다(Selvin, supra, 2000; Heyduk, Curr. Qpin. Biotech. 13:292-296 (2002)). 따 라서, 중성 pH에서 플루오로포어-말레이미드를 사용하여 카복시-말단 시스테인 잔기를 선택적으로 표지할 수 있다. 도 8A 및 8B에 각각 GFP-SNAP25(134-206)-His6-C 단백질의 흡수 및 방출/여기 스펙트럼을 나타내었다. 구조물의 일차 서열로부터 계산된 20250M-1cm-1의 이론적 몰 감광 계수에 기초하여 단백질 용액의 농도를 2.74mg/ml로 결정하였다. Matrix Assisted Laser Desorption Time of Flight mass spectrometry (MALDI-TOF)를 사용하여 정제된 GFP-SNAP25(134-206)-His6-C 단백질의 분자량을 약 37,000으로 확인하였다.
Invitrogen Lifetechnologies (Carlsbad, CA)로부터 루미포어 CS124-DTPA-EMCH-Tb를 입수하고, HEPES 완충제 중의 pH 6.9에서 말레이미드 화학을 사용하여 GFP-SNAP25(134-206)-His6-C의 카복시 말단 시스테인을 유도체함으로써 GFP-SNAP25(134-206)-His6-C-CS124-DTPA-EMCH-Tb를 생성하였다. 20 mM HEPES 완충제 pH 6.9 중에서 25kDa 막을 사용한 광범위 투석(extensive dialysis)을 하여, 반응하지 않은 프로브를 제거하였다. 얻어진 CS124-DTPA-EMCH-Tb 표지된 GFP-SNAP25(134-206)-His6-C의 흡수 및 방출 스펙트럼을 도 9A 및 도 9B에 각각 나타내었다.
실시예 II: 란타나이드-계 기질을 사용한 클로스트리디움계 독소 에세이
본 실시예는 란타나이드-계 기질을 사용하여 BoNT/A 활성을 에세이하는 것을 설명한다.
330nm에서 민감성 그룹 카보스티릴 124(CS124)이 여기할 때, 테르븀은 490nm, 546nm, 586nm 및 622nm의 일련의 4개의 뾰족한 주요 피크에서 긴 수명의 방출을 생성한다(도 9B 참조). GFP는 최대로 474nm에서 흡수하며, 507nm에서 방출 최대치를 갖는다. 586nm에서 Tb 방출을 모니터링하여 에너지 전이를 관찰하였다. 도 10A에 나타낸 바와 같이, 감소된 벌크 BoNT-A 독소를 가하는 동안 루미네선스 세기에 있어 현저한 증가가 있었으며, 이는 란타나이드 도너 복합체와 GFP 사이의 퀀칭의 제거를 나타낸다. 더욱이, 방출을 모니터하는 게이티드 프로세스를 사용하여 방출 프로세스에 대한 신호 대 잡음비가 향상되었다. 200μs 후 방출광에 대한 방출 게이트가 열리므로, 란타나이드 프로브의 101-102μs 수명보다 훨씬 짧은 수명을 가지는 가짜 형광 오염물로 인한 모든 방출이 배제된다. 점선은 턴오버 전의 게이티드 테르븀 방출을 나타내고, 실선은 턴오버 후의 게이티드 테르 븀방출을 나타내는 도 10에 나타낸 바와 같이, 얻어진 게이티드 신호는 매우 깨끗하고, 우수한 레벨의 민감도에 기여한다.
이러한 결과는 CS124-DTPA-EMCH-Tb와 같은 상업적으로 입수가능한 란타나이드 도너 복합체를 사용하여 GFP-SNAP25(134-206)-His6-C를 유도체화함으로써 란타나이드 도너 복합체와 GFP와 같은 억셉터 사이에서 루미네선스 공명 에너지 전이를 나타내는 클로스트리디움계 독소 기질을 생성할 수 있다는 것을 나타낸다. BoNT/A 감소된 독소를 가할 때 퀀칭의 제거는 BoNT/A의 활성을 나타낸다.
괄호로 덧붙여 제공되거나, 그렇지 않은, 상기에 제공된, 모든 저널 기사, 참조문헌 및 특허 인용참증이, 앞서 기재되거나 그렇지 않던 간에, 본 명세서에 완 전히 참조로 병합되어 있다.
본 발명을 상기에 제공된 실시예를 참조하여 설명하였으나, 본 발명의 정신을 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 있을 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 하기 청구의 범위에 의해서만 제한된다.
<110> Williams, Dudley J.
Gilmore, Marcella
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Aoki, Kei Roger
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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 206
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg
1 5 10 15
Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met
20 25 30
Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val
35 40 45
Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met
50 55 60
Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Thr Asp
65 70 75 80
Leu Gly Lys Phe Cys Gly Leu Cys Val Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys
85 90 95
Ser Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ala Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val
100 105 110
Val Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala
115 120 125
Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn
130 135 140
Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu
145 150 155 160
Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg
165 170 175
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile
180 185 190
Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly
195 200 205
<210> 2
<211> 206
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg
1 5 10 15
Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met
20 25 30
Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val
35 40 45
Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met
50 55 60
Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Thr Asp
65 70 75 80
Leu Gly Lys Phe Cys Gly Leu Cys Val Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys
85 90 95
Ser Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ala Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val
100 105 110
Val Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala
115 120 125
Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn
130 135 140
Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu
145 150 155 160
Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg
165 170 175
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile
180 185 190
Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly
195 200 205
<210> 3
<211> 212
<212> PRT
<213> Drosophila sp.
<400> 3
Met Pro Ala Asp Pro Ser Glu Glu Val Ala Pro Gln Val Pro Lys Thr
1 5 10 15
Glu Leu Glu Glu Leu Gln Ile Asn Ala Gln Gly Val Ala Asp Glu Ser
20 25 30
Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met Leu Ala Leu Cys Glu Glu Ser Lys Glu
35 40 45
Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val Ala Leu Asp Asp Gln Gly Glu Gln Leu
50 55 60
Asp Arg Ile Glu Glu Gly Met Asp Gln Ile Asn Ala Asp Met Arg Glu
65 70 75 80
Ala Glu Lys Asn Leu Ser Gly Met Glu Lys Cys Cys Gly Ile Cys Val
85 90 95
Leu Pro Cys Asn Lys Ser Gln Ser Phe Lys Glu Asp Asp Gly Thr Trp
100 105 110
Lys Gly Asn Asp Asp Gly Lys Val Val Asn Asn Gln Pro Gln Arg Val
115 120 125
Met Asp Asp Arg Asn Gly Met Met Ala Gln Ala Gly Tyr Ile Gly Arg
130 135 140
Ile Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asp Glu Met Glu Glu Asn Met Gly Gln
145 150 155 160
Val Asn Thr Met Ile Gly Asn Leu Arg Asn Met Ala Leu Asp Met Gly
165 170 175
Ser Glu Leu Glu Asn Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Asn Arg Lys
180 185 190
Gly Glu Ser Asn Glu Ala Arg Ile Ala Val Ala Asn Gln Arg Ala His
195 200 205
Gln Leu Leu Lys
210
<210> 4
<211> 203
<212> PRT
<213> Carassius auratus
<400> 4
Met Ala Asp Glu Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Thr Asp Met Gln Ala
1 5 10 15
Arg Ala Asp Gln Leu Gly Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met
20 25 30
Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val
35 40 45
Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met
50 55 60
Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Thr Asp
65 70 75 80
Leu Gly Asn Leu Cys Gly Leu Cys Pro Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys
85 90 95
Gly Gly Gly Gln Ser Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val Val Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala Ile Ser Gly
115 120 125
Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn Glu Met Asp
130 135 140
Glu Asn Leu Glu Gln Val Gly Ser Ile Ile Gly Asn Leu Arg His Met
145 150 155 160
Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp
165 170 175
Arg Ile Met Asp Met Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala
180 185 190
Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly
195 200
<210> 5
<211> 212
<212> PRT
<213> Strongylcentrotas purpuratus
<400> 5
Met Glu Asp Gln Asn Asp Met Asn Met Arg Ser Glu Leu Glu Glu Ile
1 5 10 15
Gln Met Gln Ser Asn Met Gln Thr Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg
20 25 30
Arg Met Leu Gln Met Ala Glu Glu Ser Gln Asp Met Gly Ile Lys Thr
35 40 45
Leu Val Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Asp Arg Ile Glu Glu
50 55 60
Gly Met Asp Gln Ile Asn Thr Asp Met Arg Glu Ala Glu Lys Asn Leu
65 70 75 80
Thr Gly Leu Glu Lys Cys Cys Gly Ile Cys Val Cys Pro Trp Lys Lys
85 90 95
Leu Gly Asn Phe Glu Lys Gly Asp Asp Tyr Lys Lys Thr Trp Lys Gly
100 105 110
Asn Asp Asp Gly Lys Val Asn Ser His Gln Pro Met Arg Met Glu Asp
115 120 125
Asp Arg Asp Gly Cys Gly Gly Asn Ala Ser Met Ile Thr Arg Ile Thr
130 135 140
Asn Asp Ala Arg Glu Asp Glu Met Asp Glu Asn Leu Thr Gln Val Ser
145 150 155 160
Ser Ile Val Gly Asn Leu Arg His Met Ala Ile Asp Met Gln Ser Glu
165 170 175
Ile Gly Ala Gln Asn Ser Gln Val Gly Arg Ile Thr Ser Lys Ala Glu
180 185 190
Ser Asn Glu Gly Arg Ile Asn Ser Ala Asp Lys Arg Ala Lys Asn Ile
195 200 205
Leu Arg Asn Lys
210
<210> 6
<211> 249
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 6
Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg
1 5 10 15
Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met
20 25 30
Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val
35 40 45
Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Asp Arg Val Glu Glu Gly Met
50 55 60
Asn His Ile Asn Gln Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Lys Asp
65 70 75 80
Leu Gly Lys Cys Cys Gly Leu Phe Ile Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys
85 90 95
Ser Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ala Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val
100 105 110
Val Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala
115 120 125
Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn
130 135 140
Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu
145 150 155 160
Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg
165 170 175
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Leu Ile Pro Ile Lys Pro Gly Leu
180 185 190
Met Lys Pro Thr Ser Val Gln Gln Arg Cys Ser Ala Val Val Lys Cys
195 200 205
Ser Lys Val His Phe Leu Leu Met Leu Ser Gln Arg Ala Val Pro Ser
210 215 220
Cys Phe Tyr His Gly Ile Tyr Leu Leu Gly Leu His Thr Cys Thr Tyr
225 230 235 240
Gln Pro His Cys Lys Cys Cys Pro Val
245
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Ser Ala Pro Ala Gln Pro Pro Ala Glu Gly Thr Glu Gly Thr Ala
1 5 10 15
Pro Gly Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Pro Asn Met Thr Ser Asn Arg
20 25 30
Arg Leu Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Glu Glu Val Val Asp Ile Ile
35 40 45
Arg Val Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu
50 55 60
Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu
65 70 75 80
Ser Ser Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Cys Lys
85 90 95
Met Met Ile Met Leu Gly Ala Ile Cys Ala Ile Ile Val Val Val Ile
100 105 110
Val Ile Tyr Phe Phe Thr
115
<210> 8
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Ser Ala Thr Ala Ala Thr Ala Pro Pro Ala Ala Pro Ala Gly Glu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu
20 25 30
Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val
35 40 45
Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp
50 55 60
Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
65 70 75 80
Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met
85 90 95
Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val
100 105 110
Tyr Phe Ser Ser
115
<210> 9
<211> 116
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 9
Met Ser Ala Thr Ala Ala Thr Val Pro Pro Ala Ala Pro Ala Gly Glu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu
20 25 30
Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val
35 40 45
Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp
50 55 60
Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
65 70 75 80
Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met
85 90 95
Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val
100 105 110
Tyr Phe Ser Thr
115
<210> 10
<211> 116
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 10
Met Ser Ala Thr Ala Ala Thr Ala Pro Pro Ala Ala Pro Ala Gly Glu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu
20 25 30
Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val
35 40 45
Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp
50 55 60
Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
65 70 75 80
Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met
85 90 95
Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val
100 105 110
Tyr Phe Ser Ser
115
<210> 11
<211> 114
<212> PRT
<213> Xenopus laevis
<400> 11
Met Ser Ala Pro Ala Ala Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly Asp Gly
1 5 10 15
Ala Pro Gln Gly Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu Gln Gln
20 25 30
Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val Asn Val
35 40 45
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Thr Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
50 55 60
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala
65 70 75 80
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Met Lys Met Met Ile Ile
85 90 95
Met Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val Tyr Phe
100 105 110
Ser Thr
<210> 12
<211> 104
<212> PRT
<213> Strongylocentrotus purpuratus
<400> 12
Met Ala Ala Pro Pro Pro Pro Gln Pro Ala Pro Ser Asn Lys Arg Leu
1 5 10 15
Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val
20 25 30
Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Ala Leu Ser Val Leu Asp
35 40 45
Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Asn
50 55 60
Ala Gly Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Cys Lys Met Met
65 70 75 80
Ile Ile Leu Ala Ile Ile Ile Ile Val Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val
85 90 95
Ala Ile Val Gln Ser Gln Lys Lys
100
<210> 13
<211> 288
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Thr Ala Lys Asp Ser Asp Asp
1 5 10 15
Asp Asp Asp Val Ala Val Thr Val Asp Arg Asp Arg Phe Met Asp Glu
20 25 30
Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Phe Ile Asp Lys Ile Ala
35 40 45
Glu Asn Val Glu Glu Val Lys Arg Lys His Ser Ala Ile Leu Ala Ser
50 55 60
Pro Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser
65 70 75 80
Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ser Ile
85 90 95
Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp
100 105 110
Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val
115 120 125
Glu Val Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg
130 135 140
Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr
145 150 155 160
Thr Ser Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile
165 170 175
Phe Ala Ser Gly Ile Ile Met Asp Ser Ser Ile Ser Lys Gln Ala Leu
180 185 190
Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Asn Ser
195 200 205
Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu
210 215 220
Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala
225 230 235 240
Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys
245 250 255
Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys
260 265 270
Val Ile Leu Gly Ile Val Ile Ala Ser Thr Val Gly Gly Ile Phe Ala
275 280 285
<210> 14
<211> 288
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Ser Ala Lys Asp Ser Asp Asp
1 5 10 15
Glu Glu Glu Val Val His Val Asp Arg Asp His Phe Met Asp Glu Phe
20 25 30
Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Cys Ile Glu Lys Leu Ser Glu
35 40 45
Asp Val Glu Gln Val Lys Lys Gln His Ser Ala Ile Leu Ala Ala Pro
50 55 60
Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Gln Glu Leu Glu Asp Leu Thr Ala Asp
65 70 75 80
Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ala Ile Glu
85 90 95
Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp Leu
100 105 110
Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val Glu
115 120 125
Val Met Thr Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Lys Tyr Arg Asp Arg Cys
130 135 140
Lys Asp Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr Thr
145 150 155 160
Asn Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Lys Leu Ala Ile Phe
165 170 175
Thr Asp Asp Ile Lys Met Asp Ser Gln Met Thr Lys Gln Ala Leu Asn
180 185 190
Glu Ile Glu Thr Arg His Asn Glu Ile Ile Lys Leu Glu Thr Ser Ile
195 200 205
Arg Glu Leu His Asp Met Phe Val Asp Met Ala Met Leu Val Glu Ser
210 215 220
Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ser Val
225 230 235 240
Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr
245 250 255
Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys Val
260 265 270
Val Leu Gly Val Val Leu Ala Ser Ser Ile Gly Gly Thr Leu Gly Leu
275 280 285
<210> 15
<211> 288
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 15
Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Thr Ala Lys Asp Ser Asp Asp
1 5 10 15
Asp Asp Asp Val Thr Val Thr Val Asp Arg Asp Arg Phe Met Asp Glu
20 25 30
Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Phe Ile Asp Lys Ile Ala
35 40 45
Glu Asn Val Glu Glu Val Lys Arg Lys His Ser Ala Ile Leu Ala Ser
50 55 60
Pro Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser
65 70 75 80
Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ser Ile
85 90 95
Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp
100 105 110
Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val
115 120 125
Glu Val Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg
130 135 140
Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr
145 150 155 160
Thr Ser Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile
165 170 175
Phe Ala Ser Gly Ile Ile Met Asp Ser Ser Ile Ser Lys Gln Ala Leu
180 185 190
Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Thr Ser
195 200 205
Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu
210 215 220
Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala
225 230 235 240
Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys
245 250 255
Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys
260 265 270
Val Ile Leu Gly Ile Ile Ile Ala Ser Thr Ile Gly Gly Ile Phe Gly
275 280 285
<210> 16
<211> 291
<212> PRT
<213> Drosophila sp.
<400> 16
Met Thr Lys Asp Arg Leu Ala Ala Leu His Ala Ala Gln Ser Asp Asp
1 5 10 15
Glu Glu Glu Thr Glu Val Ala Val Asn Val Asp Gly His Asp Ser Tyr
20 25 30
Met Asp Asp Phe Phe Ala Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Met Ile Asp
35 40 45
Lys Val Gln Asp Asn Val Glu Glu Val Lys Lys Lys His Ser Ala Ile
50 55 60
Leu Ser Ala Pro Gln Thr Asp Glu Lys Thr Lys Gln Glu Leu Glu Asp
65 70 75 80
Leu Met Ala Asp Ile Lys Lys Asn Ala Asn Arg Val Arg Gly Lys Leu
85 90 95
Lys Gly Ile Glu Gln Asn Ile Glu Gln Glu Glu Gln Gln Asn Lys Ser
100 105 110
Ser Ala Asp Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg
115 120 125
Lys Phe Val Glu Val Met Thr Glu Tyr Asn Arg Thr Gln Thr Asp Tyr
130 135 140
Arg Glu Arg Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly
145 150 155 160
Arg Pro Thr Asn Asp Asp Glu Leu Glu Lys Met Leu Glu Glu Gly Asn
165 170 175
Ser Ser Val Phe Thr Gln Gly Ile Ile Met Glu Thr Gln Gln Ala Lys
180 185 190
Gln Thr Leu Ala Asp Ile Glu Ala Arg His Gln Asp Ile Met Lys Leu
195 200 205
Glu Thr Ser Ile Lys Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met
210 215 220
Leu Val Glu Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr His Val
225 230 235 240
Glu His Ala Met Asp Tyr Val Gln Thr Ala Thr Gln Asp Thr Lys Lys
245 250 255
Ala Leu Lys Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Leu
260 265 270
Ile Cys Leu Thr Val Leu Gly Ile Leu Ala Ala Ser Tyr Val Ser Ser
275 280 285
Tyr Phe Met
290
<210> 17
<211> 291
<212> PRT
<213> C. elegans
<400> 17
Met Thr Lys Asp Arg Leu Ser Ala Leu Lys Ala Ala Gln Ser Glu Asp
1 5 10 15
Glu Gln Asp Asp Asp Met His Met Asp Thr Gly Asn Ala Gln Tyr Met
20 25 30
Glu Glu Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Ser Val Asp Ile
35 40 45
Ile Ala Asn Asn Val Glu Glu Val Lys Lys Lys His Ser Ala Ile Leu
50 55 60
Ser Asn Pro Val Asn Asp Gln Lys Thr Lys Glu Glu Leu Asp Glu Leu
65 70 75 80
Met Ala Val Ile Lys Arg Ala Ala Asn Lys Val Arg Gly Lys Leu Lys
85 90 95
Leu Ile Glu Asn Ala Ile Asp His Asp Glu Gln Gly Ala Gly Asn Ala
100 105 110
Asp Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Arg Phe
115 120 125
Val Glu Val Met Thr Asp Tyr Asn Lys Thr Gln Thr Asp Tyr Arg Glu
130 135 140
Arg Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Asp Ile Ala Gly Lys Gln
145 150 155 160
Val Gly Asp Glu Asp Leu Glu Glu Met Ile Glu Ser Gly Asn Pro Gly
165 170 175
Val Phe Thr Gln Gly Ile Ile Thr Asp Thr Gln Gln Ala Lys Gln Thr
180 185 190
Leu Ala Asp Ile Glu Ala Arg His Asn Asp Ile Met Lys Leu Glu Ser
195 200 205
Ser Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val
210 215 220
Glu Ser Gln Gly Glu Met Val Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His
225 230 235 240
Ala Lys Glu Phe Val Asp Arg Ala Val Ala Asp Thr Lys Lys Ala Val
245 250 255
Gln Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Cys Ile Leu Val Thr
260 265 270
Gly Val Ile Leu Ile Thr Gly Leu Ile Ile Phe Ile Leu Phe Tyr Ala
275 280 285
Lys Val Leu
290
<210> 18
<211> 288
<212> PRT
<213> Strongylocentrotus purpuratus
<400> 18
Met Arg Asp Arg Leu Gly Ser Leu Lys Arg Asn Glu Glu Asp Asp Val
1 5 10 15
Gly Pro Glu Val Ala Val Asn Val Glu Ser Glu Lys Phe Met Glu Glu
20 25 30
Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Val Arg Asn Asn Ile Asp Lys Ile Ser
35 40 45
Lys Asn Val Asp Glu Val Lys Lys Lys His Ser Asp Ile Leu Ser Ala
50 55 60
Pro Gln Ala Asp Glu Lys Val Lys Asp Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser
65 70 75 80
Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ala Lys Leu Lys Met Met
85 90 95
Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Ser Ala Lys Met Asn Ser Ala Asp
100 105 110
Val Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val
115 120 125
Glu Val Met Thr Asp Tyr Asn Ser Thr Gln Thr Asp Tyr Arg Glu Arg
130 135 140
Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Lys Ser Thr
145 150 155 160
Thr Asp Ala Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile
165 170 175
Phe Thr Ser Gly Ile Ile Met Asp Thr Gln Gln Ala Lys Gln Thr Leu
180 185 190
Arg Asp Ile Glu Ala Arg His Asn Asp Ile Ile Lys Leu Glu Ser Ser
195 200 205
Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu
210 215 220
Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu Gln Ser
225 230 235 240
Val Asp Tyr Val Glu Thr Ala Lys Met Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys
245 250 255
Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Phe Tyr Ile Ala Ile Cys Cys
260 265 270
Gly Val Ala Leu Gly Ile Leu Val Leu Val Leu Ile Ile Val Leu Ala
275 280 285
<210> 19
<211> 1005
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid pQPIGFP-SNAP25
<221> CDS
<222> (1)...(1005)
<400> 19
atg gct agc aaa gga gaa gaa ctc ttc act gga gtt gtc cca att ctt 48
Met Ala Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
gtt gaa tta gat ggt gat gtt aac ggc cac aag ttc tct gtc agt gga 96
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
gag ggt gaa ggt gat gca aca tac gga aaa ctt acc ctg aag ttc atc 144
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
tgc act act ggc aaa ctg cct gtt cca tgg cca aca cta gtc act act 192
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
ctg tgc tat ggt gtt caa tgc ttt tca aga tac ccg gat cat atg aaa 240
Leu Cys Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
cgg cat gac ttt ttc aag agt gcc atg ccc gaa ggt tat gta cag gaa 288
Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
agg acc atc ttc ttc aaa gat gac ggc aac tac aag aca cgt gct gaa 336
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
gtc aag ttt gaa ggt gat acc ctt gtt aat aga atc gag tta aaa ggt 384
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
att gac ttc aag gaa gat ggc aac att ctg gga cac aaa ttg gaa tac 432
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
aac tat aac tca cac aat gta tac atc atg gca gac aaa caa aag aat 480
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
gga atc aaa gtg aac ttc aag acc cgc cac aac att gaa gat gga agc 528
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Thr Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
gtt caa cta gca gac cat tat caa caa aat act cca att ggc gat ggc 576
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
cct gtc ctt tta cca gac aac cat tac ctg tcc aca caa tct gcc ctt 624
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
tcg aaa gat ccc aac gaa aag aga gac cac atg gtc ctt ctt gag ttt 672
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
gta aca gct gct ggg att aca cat ggc atg gat gaa ctg tac aac ggc 720
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Asn Gly
225 230 235 240
ggt gca gga tcc ggt gcg ggt ggc ggt ggc atc cgg agg gta aca aac 768
Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ile Arg Arg Val Thr Asn
245 250 255
gat gcc cgg gaa aat gag atg gat gag aac ctg gag cag gtg agc ggc 816
Asp Ala Arg Glu Asn Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly
260 265 270
atc atc gga aac ctc cgc cat atg gct cta gac atg ggc aat gag att 864
Ile Ile Gly Asn Leu Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile
275 280 285
gac acc cag aat cgc cag atc gac agg atc atg gag aag gct gat tcc 912
Asp Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser
290 295 300
aac aaa acc aga att gat gaa gcc aac caa cgt gca aca aag atg ctg 960
Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu
305 310 315 320
gga agt ggt ggc ggt ggc ggc cat cac cat cac cat cac tgc taa 1005
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly His His His His His His Cys *
325 330
<210> 20
<211> 334
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid pQBI GFP-SNAP25
<400> 20
Met Ala Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Cys Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Thr Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Asn Gly
225 230 235 240
Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ile Arg Arg Val Thr Asn
245 250 255
Asp Ala Arg Glu Asn Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly
260 265 270
Ile Ile Gly Asn Leu Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile
275 280 285
Asp Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser
290 295 300
Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu
305 310 315 320
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly His His His His His His Cys
325 330
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> Clostridium sp.
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 22
Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 23
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 24
Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Trp
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 25
Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 26
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 27
Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 28
Glu Thr Ser Ala Ala Lys Leu Lys
1 5
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 29
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
1 5
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
1 5 10 15
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
1 5 10 15
Met
<210> 35
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
1 5 10 15
Met Leu
<210> 36
<211> 33
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 36
Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser
20 25 30
Gly
<210> 37
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Gln Asn Pro Gln Ile Lys Arg Ile Thr Asp Lys Ala Asp Thr Asn Arg
1 5 10 15
Asp Arg Ile Asp Ile Ala Asn Ala Arg Ala Lys Lys Leu Ile Asp Ser
20 25 30
<210> 38
<211> 32
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 38
Gln Asn Gln Gln Ile Gln Lys Ile Thr Glu Lys Ala Asp Thr Asn Lys
1 5 10 15
Asn Arg Ile Asp Ile Ala Asn Thr Arg Ala Lys Lys Leu Ile Asp Ser
20 25 30
<210> 39
<211> 34
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 39
Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Leu Ile Pro Ile Lys
1 5 10 15
Pro Gly Leu Met Lys Pro Thr Ser Val Gln Gln Arg Cys Ser Ala Val
20 25 30
Val Lys
<210> 40
<211> 33
<212> PRT
<213> Carassius auratus
<400> 40
Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Asp Met Ala Asp Ser Asn Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser
20 25 30
Gly
<210> 41
<211> 33
<212> PRT
<213> Carassius auratus
<400> 41
Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser
20 25 30
Gly
<210> 42
<211> 30
<212> PRT
<213> Torpedo sp.
<400> 42
Gln Asn Ala Gln Val Asp Arg Ile Val Val Lys Gly Asp Met Asn Lys
1 5 10 15
Ala Arg Ile Asp Glu Ala Asn Lys His Ala Thr Lys Met Leu
20 25 30
<210> 43
<211> 33
<212> PRT
<213> Strongylocentrotus purpuratus
<400> 43
Gln Asn Ser Gln Val Gly Arg Ile Thr Ser Lys Ala Glu Ser Asn Glu
1 5 10 15
Gly Arg Ile Asn Ser Ala Asp Lys Arg Ala Lys Asn Ile Leu Arg Asn
20 25 30
Lys
<210> 44
<211> 31
<212> PRT
<213> C. elegans
<400> 44
Gln Asn Arg Gln Leu Asp Arg Ile His Asp Lys Gln Ser Asn Glu Val
1 5 10 15
Arg Val Glu Ser Ala Asn Lys Arg Ala Lys Asn Leu Ile Thr Lys
20 25 30
<210> 45
<211> 31
<212> PRT
<213> Drosophila sp.
<400> 45
Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Asn Arg Lys Gly Glu Ser Asn Glu
1 5 10 15
Ala Arg Ile Ala Val Ala Asn Gln Arg Ala His Gln Leu Leu Lys
20 25 30
<210> 46
<211> 32
<212> PRT
<213> Hirudinida sp.
<400> 46
Gln Asn Arg Gln Val Asp Arg Ile Asn Asn Lys Met Thr Ser Asn Gln
1 5 10 15
Leu Arg Ile Ser Asp Ala Asn Lys Arg Ala Ser Lys Leu Leu Lys Glu
20 25 30
<210> 47
<400> 47
000
<210> 48
<400> 48
000
<210> 49
<400> 49
000
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 50
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Ala
1 5 10 15
Leu
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Xaa=Nle
<400> 51
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Xaa
1 5 10 15
Leu
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 52
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Ala Met
1 5 10 15
Leu
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 53
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Ser Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<221> MOD_RES
<222> 14
<223> Xaa=Abu
<400> 54
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Xaa Lys Met
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Leu
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<221> MOD_RES
<222> 13
<223> Xaa=Abu
<400> 55
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1 5 10 15
Leu
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 56
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Ala Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<221> MOD_RES
<222> 11
<223> Xaa=Abu
<400> 57
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Xaa Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 58
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Asn Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 59
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Ala Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<221> MOD_RES
<222> 9
<223> Xaa=Abu
<400> 60
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Xaa Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 61
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Gln Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 62
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asn Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 63
<211> 40
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ser Ser Ala Ala
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 64
<211> 40
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 64
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 65
<211> 40
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 65
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Glu Ser Ser Ala Ala
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 66
<211> 40
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 66
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 67
<211> 40
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 67
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 68
<211> 40
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 68
Asp Leu Val Ala Gln Arg Gly Glu Arg Leu Glu Leu Leu Ile Asp Lys
1 5 10 15
Thr Glu Asn Leu Val Asp Ser Ser Val Thr Phe Lys Thr Thr Ser Arg
20 25 30
Asn Leu Ala Arg Ala Met Cys Met
35 40
<210> 69
<211> 32
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 69
Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala Leu
1 5 10 15
Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Glu Ser Ser Ala Ala Lys Leu Lys Arg
20 25 30
<210> 70
<211> 32
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 70
Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala Leu
1 5 10 15
Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala Lys Leu Lys Arg
20 25 30
<210> 71
<211> 40
<212> PRT
<213> Torpedo sp.
<400> 71
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ser Ser Ala Ala
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 72
<211> 40
<212> PRT
<213> Strongylocentrotus purpuratus
<400> 72
Asp Lys Val Leu Asp Arg Asp Gly Ala Leu Ser Val Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Asn Ala Gly
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 73
<211> 40
<212> PRT
<213> Aplysia sp.
<400> 73
Glu Lys Val Leu Asp Arg Asp Gln Lys Ile Ser Gln Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Glu Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ala Ser Ala Gly
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 74
<211> 40
<212> PRT
<213> Teuthoida sp.
<400> 74
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Ser Lys Ile Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ala Ser Ala Gly
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Phe Trp Trp
35 40
<210> 75
<211> 40
<212> PRT
<213> C. elegans
<400> 75
Asn Lys Val Met Glu Arg Asp Val Gln Leu Asn Ser Leu Asp His Arg
1 5 10 15
Ala Glu Val Leu Gln Asn Gly Ala Ser Gln Phe Gln Gln Ser Ser Arg
20 25 30
Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Trp Trp
35 40
<210> 76
<211> 40
<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 76
Glu Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Gly Glu Arg
1 5 10 15
Ala Asp Gln Leu Glu Gly Gly Ala Ser Gln Ser Glu Gln Gln Ala Gly
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Gln Trp Trp
35 40
<210> 77
<211> 40
<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 77
Glu Lys Val Leu Glu Arg Asp Ser Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gln Gln Ala Gly
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Phe Trp Leu
35 40
<210> 78
<211> 39
<212> PRT
<213> Hirudinida sp.
<400> 78
Asp Lys Val Leu Glu Lys Asp Gln Lys Leu Ala Glu Leu Asp Arg Ala
1 5 10 15
Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ala Ser Ala Gly Lys
20 25 30
Leu Lys Arg Lys Phe Trp Trp
35
<210> 79
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 80
<211> 18
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 80
Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 81
<211> 18
<212> PRT
<213> Rattus rattus
<400> 81
Glu His Ala Lys Glu Glu Thr Lys Lys Ala Ile Lys Tyr Gln Ser Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 82
<211> 18
<212> PRT
<213> Rattus rattus
<400> 82
Glu Lys Ala Arg Asp Glu Thr Arg Lys Ala Met Lys Tyr Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 83
<211> 18
<212> PRT
<213> Rattus rattus
<400> 83
Glu Arg Gly Gln Glu His Val Lys Ile Ala Leu Glu Asn Gln Lys Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 84
<211> 18
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 84
Val Pro Glu Val Phe Val Thr Lys Ser Ala Val Met Tyr Gln Cys Lys
1 5 10 15
Ser Arg
<210> 85
<211> 18
<212> PRT
<213> Strongylocentrotus purpuratus
<400> 85
Val Arg Arg Gln Asn Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 86
<211> 18
<212> PRT
<213> Aplysia sp.
<400> 86
Glu Thr Ala Lys Met Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 87
<211> 18
<212> PRT
<213> Teuthoida sp.
<400> 87
Glu Thr Ala Lys Val Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 88
<211> 18
<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 88
Gln Thr Ala Thr Gln Asp Thr Lys Lys Ala Leu Lys Tyr Gln Ser Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 89
<211> 18
<212> PRT
<213> Hirudinida sp.
<400> 89
Glu Thr Ala Ala Ala Asp Thr Lys Lys Ala Met Lys Tyr Gln Ser Ala
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 90
<211> 116
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 90
Met Ser Ala Thr Ala Ala Thr Val Pro Pro Ala Ala Pro Ala Gly Glu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu
20 25 30
Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val
35 40 45
Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp
50 55 60
Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
65 70 75 80
Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met
85 90 95
Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val
100 105 110
Tyr Phe Ser Thr
115
<210> 91
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 91
gctagatctc gagttaacca cttcccagca tctttg 36
<210> 92
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 92
atccggaggg taacaaacga tgcc 24
<210> 93
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 93
cgaattccgc gggccaccat gggaggagga ctgaacgaca tcttcgaggc tcaaaagatc 60
<210> 94
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 94
tcgtttgtta ccctccggat atgatgatga tgatgatgat gatgggatcc atgccactcg 60
atcttttgag cctcgaaga 79
<210> 95
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 95
cgaagatctg gaggactgaa cgacatcttc 30
<210> 96
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 96
gatggtgatg gtgatgacag ccgccaccgc cacc 34
<210> 97
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 97
Gly Asp Lys Asn Ala Asp Gly Trp Ile Glu Phe Glu Glu Leu
1 5 10
<210> 98
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 98
Gly Asp Lys Asn Ala Asp Gly Phe Ile Cys Phe Glu Glu Leu
1 5 10
<210> 99
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 99
Asp Lys Asn Ala Asp Gly Cys Ile Glu Phe Glu Glu
1 5 10
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 100
Tyr Ile Asp Thr Asn Asn Asp Gly Trp Tyr Glu Gly Asp Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 101
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 101
Thr Glu Arg Arg Gln Gln Leu Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Asp
1 5 10 15
Glu Arg Glu Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ala Lys Ile Lys
20 25 30
Claims (130)
- (a) 란타나이드 도너 복합체;(b) 상기 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터;(c) 상기 란타나이드 도너 복합체와 상기 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고,알맞은 조건 하에서 상기 란타나이드 도너 복합체와 상기 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 적어도 500μs의 형광 수명을 가지는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 적어도 0.05의 형광 양자 수율을 가지는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 적어도 0.5의 형광 양자 수율을 가지는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 테르븀 이온, 유로퓸 이 온, 사마륨 이온 및 디스프로슘 이온으로 구성된 그룹으로부터 선택된 란타나이드 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 5 항에 있어서, 상기 란타나이드 이온이 테르븀 이온인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 펩티드 또는 펩티도미메틱인 란타나이드-결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 7 항에 있어서, 상기 란타나이드-결합 부위가 EF 핸드 모티프의 배위 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 7 항에 있어서, 상기 란타나이드-결합 부위가 EF 핸드 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 7 항에 있어서, 상기 란타나이드-결합 부위가 티올-반응성 킬레이트화제를 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 디에틸렌트리아민펜트아세트산(DTPA)를 포함하는 란타나이드-결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 기 질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 β-디케톤 킬레이트, 폴리아미노폴리카복실산 킬레이트, 칼릭사렌 킬레이트, 폴리페놀, DOTA, 피리딘 및 폴리피리딘으로 구성된 그룹으로부터 선택된 란타나이드-결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 트리비피리딘(TBP) 클립테이트, 트리스비피리딘 테트라카복실레이트(TBP4COOH) 크립테이트, 트리스비피리딘 펜타카복실레이트(TBP5COOH) 크립테이트, 및 피리딘 비피리딘 테트라카복실레이트(PBP4COOH)로 구성된 그룹으로부터 선택된 란타나이드-결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 란타나이드 이온에 대해 적어도 5μM의 친화도를 가지는 란타나이드-결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1, 6 또는 8 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 트립토판 잔기인 안테나를 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 카보스티릴124(CS124), 트립토판 및 2-히드록시이소프탈아미드로 구성된 그룹에서 선택된 안테나를 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 16 항에 있어서, 상기 안테나가 카보스티릴124(CS124)인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 11 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 CS124-DTPA-EMCH-Tb인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 억셉터가 억셉터 플루오로포어인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 억셉터가 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(BFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청록색 형광 단백질(CFP) 및 적색 형광 단백질(RFP)로 구성된 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 기질.
- 제 20 항에 있어서, 상기 억셉터가 GFP인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 억셉터가 비-형광 억셉터인 것을 특징으로 하는 기 질.
- 제 22 항에 있어서, 상기 비-형광 억셉터가 헴 단백질인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항에 있어서, 보툴리눔 독소 인식 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 24 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/A 인식 서열인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 25 항에 있어서, 상기 BoNT/A 인식 서열이 SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Gln-Arg 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 24 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/B 인식 서열인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 27 항에 있어서, 상기 BoNT/B 인식 서열이 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Gln-Phe 또는 이의 펩티도미메틱 을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 24 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/C1 인식 서열인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 29 항에 있어서, 상기 BoNT/C1 인식 서열이 신택신의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Lys-Ala 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 29 항에 있어서, 상기 BoNT/C1 인식 서열이 SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Arg-Ala 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 24 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/D 인식 서열인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 32 항에 있어서, 상기 BoNT/D 인식 서열이 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Lys-Leu 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 24 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/E 인식 서열인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 34 항에 있어서, 상기 BoNT/E 인식 서열이 SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Arg-Ile 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 24 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/F 인식 서열인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 36 항에 있어서, 상기 BoNT/F 인식 서열이 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Gln-Lys 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 24 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/G 인식 서열인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 38 항에 있어서, 상기 BoNT/G 인식 서열이 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Ala-Ala 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 인식 서열이 TeNT 인식 서열인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 40 항에 있어서, 상기 TeNT 인식 서열이 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Gln-Phe 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1, 6 또는 7항에 있어서, 최대 300개의 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1, 6 또는 7항에 있어서, 최대 150개의 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 기질이 적어도 1 나노몰/분/밀리그램 독소의 활성을 가지고 절단될 수 있는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 기질이 적어도 20 나노몰/분/밀리그램 독소의 활성을 가지고 절단될 수 있는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 기질이 적어도 100 나노몰/분/밀리그램 독소의 활성을 가지고 절단될 수 있는 것을 특징으로 하는 기질.
- (a) 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 시료로(i) 란타나이드 도너 복합체;(ii) 상기 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및(iii) 상기 란타나이드 도너 복합체와 상기 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건 하에서 상기 란타나이드 도너 복합체와 상기 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 처리하고;(b) 상기 란타나이드 도너 복합체의 안테나를 여기(exciting)시키고;(c) 상기 처리된 기질의 공명 에너지 전이를 대조구 기질과 비교하여 결정하고, 상기 대조구 기질과 비교한 상기 처리된 기질의 공명 에너지 전이의 차이로서 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 표시함으로써, 클로스트리디움계 독소의 존재 또는 활성을 결정하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 적어도 500μs의 형광 수명을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 적어도 0.05의 형광 양자 수율을 가지는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 47 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 적어도 0.5의 형광 양자 수율을 가지는 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 47 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 테르븀 이온, 유로퓸 이온, 사마륨 이온 및 디스프로슘 이온으로 구성된 그룹으로부터 선택된 란타나이드 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 51 항에 있어서, 상기 란타나이드 이온이 테르븀 이온인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 펩티드 또는 펩티도미메틱인 란타나이드-결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 란타나이드-결합 부위가 EF 핸드 모티프의 배위 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 54 항에 있어서, 상기 란타나이드-결합 부위가 EF 핸드 모티프를 포함하 는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 란타나이드-결합 부위가 티올-반응성 킬레이트화제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 디에틸렌트리아민펜트아세트산(DTPA)를 포함하는 란타나이드-결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 β-디케톤 킬레이트, 폴리아미노폴리카복실산 킬레이트, 칼릭사렌 킬레이트, 폴리페놀, DOTA, 피리딘 및 폴리피리딘으로 구성된 그룹으로부터 선택된 란타나이드-결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 트리비피리딘(TBP) 클립테이트, 트리스비피리딘 테트라카복실레이트(TBP4COOH) 크립테이트, 트리스비피리딘 펜타카복실레이트(TBP5COOH) 크립테이트, 및 피리딘 비피리딘 테트라카복실레이트(PBP4COOH)로 구성된 그룹으로부터 선택된 란타나이드-결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 란타나이드 이온에 대해 적어도 5μM의 친화도를 가지는 란타나이드-결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47, 52 또는 54 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 트립토판 잔기인 안테나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 카보스티릴124(CS124), 트립토판 및 2-히드록시이소프탈아미드로 구성된 그룹에서 선택된 안테나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 62 항에 있어서, 상기 안테나가 카보스티릴124(CS124)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 57 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 CS124-DTPA-EMCH-Tb인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 억셉터가 억셉터 플루오로포어인 것을 특징으로 하는 기질.
- 제 65 항에 있어서, 상기 억셉터 플루오로포어가 형광 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항 또는 제 64 항에 있어서, 상기 억셉터가 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(BFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청록색 형광 단백질(CFP) 및 적색 형광 단백질(RFP)로 구성된 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 67 항에 있어서, 상기 억셉터가 GFP인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 비-형광 억셉터가 헴 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 69 항에 있어서, 상기 비-형광 억셉터가 헴 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 클로스트리디움계 독소가 보툴리눔 독소 인식 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 71 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/A 인식 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 72 항에 있어서, 상기 BoNT/A 인식 서열이 SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Gln-Arg 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 71 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/B 인식 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 74 항에 있어서, 상기 BoNT/B 인식 서열이 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Gln-Phe 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 71 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/C1 인식 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 76 항에 있어서, 상기 BoNT/C1 인식 서열이 신택신의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Lys-Ala 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 76 항에 있어서, 상기 BoNT/C1 인식 서열이 SNAP-25의 적어도 6개의 연속 된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Arg-Ala 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 71 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/D 인식 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 79 항에 있어서, 상기 BoNT/D 인식 서열이 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Lys-Leu 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 71 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/E 인식 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 81 항에 있어서, 상기 BoNT/E 인식 서열이 SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Arg-Ile 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 71 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/F 인식 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 83 항에 있어서, 상기 BoNT/F 인식 서열이 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Gln-Lys 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 71 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/G 인식 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 85 항에 있어서, 상기 BoNT/G 인식 서열이 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Ala-Ala 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 인식 서열이 TeNT 인식 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 87 항에 있어서, 상기 TeNT 인식 서열이 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Gln-Phe 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47, 52 또는 53 항에 있어서, 상기 기질이 최대 300개의 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47, 52 또는 53 항에 있어서, 상기 기질이 최대 150개의 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 기질이 적어도 1 나노몰/분/밀리그램 독소의 활성을 가지고 절단될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 기질이 적어도 20 나노몰/분/밀리그램 독소의 활성을 가지고 절단될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 기질이 적어도 100 나노몰/분/밀리그램 독소의 활성을 가지고 절단될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 시료가 조세포 용해물(crude cell lysate)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 시료가 분리된 클로스트리디움계 독소인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 95 항에 있어서, 상기 분리된 클로스트리디움계 독소가 분리된 클로스트 리디움계 독소 경쇄인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 시료가 조성된 클로스트리디움계 독소 제품인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 97 항에 있어서, 상기 조성된 클로스트리디움계 독소 제품이 BoNT/A, BoNT/B 또는 BoNT/E 제품인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 98 항에 있어서, 상기 조성된 제품이 조성된 BoNT/A 독소 제품인 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 란타나이드 이온을 가진, 란타나이드 도너 복합체;(b) 상기 란타나이드 도너 복합체의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터;(c) 상기 란타나이드 도너 복합체와 상기 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고,알맞은 조건 하에서 상기 란타나이드 도너 복합체와 상기 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 제 100 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 EF 핸드 모티프의 배위 부위를 포함하는 란타나이드-결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 101 항에 있어서, 상기 란타나이드-결합 부위가 EF 핸드 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 100 항 또는 제 101 항에 있어서, 상기 란타나이드 도너 복합체가 트립토판 잔기인 안테나를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 100 항 또는 제 101 항에 있어서, 상기 억셉터가 억셉터 플루오로포어인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 104 항에 있어서, 상기 억셉터 플루오로포어가 형광 단백질인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 104 항에 있어서, 상기 억셉터 플루오로포어가 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(BFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청록색 형광 단백질(CFP) 및 적색 형광 단백질(RFP)로 구성된 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 106 항에 있어서, 상기 억셉터 플루오로포어가 GFP인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 100 항에 있어서, 상기 억셉터가 비-형광 억셉터인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 109 항에 있어서, 상기 비-형광 억셉터가 헴 단백질인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 100 항에 있어서, 상기 인식 서열이 보툴리눔 독소 인식 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 110 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소 인식 서열이 BoNT/A 인식 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 111 항에 있어서, 상기 BoNT/A 인식 서열이 SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Gln-Arg을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 112 항에 있어서, 상기 BoNT/A 인식 서열이 SEQ ID NO:2의 잔기 134 내지 206을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 110 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/B 인식 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 114 항에 있어서, 상기 BoNT/B 인식 서열이 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Gln-Phe을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 110 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/C1 인식 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 116 항에 있어서, 상기 BoNT/C1 인식 서열이 신택신의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Lys-Ala을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 116 항에 있어서, 상기 BoNT/C1 인식 서열이 SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Arg-Ala을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 110 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/D 인식 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 119 항에 있어서, 상기 BoNT/D 인식 서열이 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Lys-Leu을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 110 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/E 인식 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 121 항에 있어서, 상기 BoNT/E 인식 서열이 SNAP-25의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Arg-Ile을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 110 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/F 인식 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 123 항에 있어서, 상기 BoNT/F 인식 서열이 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Gln-Lys을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 110 항에 있어서, 상기 인식 서열이 BoNT/G 인식 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 125 항에 있어서, 상기 BoNT/G 인식 서열이 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Ala-Ala을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 100 항에 있어서, 상기 인식 서열이 TeNT 인식 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 127 항에 있어서, 상기 TeNT 인식 서열이 VAMP의 적어도 6개의 연속된 잔기들을 포함하며, 상기 6개의 연속된 잔기들이 Gln-Phe을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 100 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 최대 300개의 잔기를 가지는 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제 100 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 최대 150개의 잔기를 가지는 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
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