KR20070068135A - 간 질환 예방 및 치료와 간 보호 효과를 갖는 만형자추출물 및 그의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간 보호 활성을 갖는 만형자(Viticis Fructus)의 메탄올 추출물 중 클로로포름 추출 분획법과 분획물에 관한 것으로서, 이 추출 분획물은 사염화탄소에 의한 간 독성을 효과적으로 치료함으로써, 간염, 간경화와 같은 간질환의 치료제나 간 보호제등으로 사용될 수 있다.

만형자, 간보호제, AST, ALT, 간조직

Description

간 질환 예방 및 치료와 간 보호 효과를 갖는 만형자 추출물 및 그의 제조 방법{Extracts of Viticis fructus for the prevention or treatment of hepatic diseases and/or method for the production and use thereof}

도 1은 만형자 추출물을 랫트에 7회 투여하고 나서, 사염화탄소로 간독성을 유발한 후, 간 조직의 모습이다.

도 2는 만형자 추출물 대신에 10% 라브라졸을 투여하고 나서, 사염화탄소로 간독성을 유발한 후, 간 조직의 모습이다.

도 3은 정상 흰쥐의 간 조직의 모습이다.

간은 인체의 화학 공장으로 우리 몸이 필요한 각종 단백질과 영양소를 만들고 저장하며, 몸에 해로운 여러 가지 물질을 해독하는 기능을 한다.

간은 소화기계와 전신순환계 사이에 위치하여 소화기계로 들어온 외부 물질로부터 인체를 방어하는 기능을 담당하고 있다. 따라서, 간은 영양소 외에도 많은 독성물질에 노출될 위험이 다른 장기보다 커 그만큼 손상을 입을 확률도 다른 장기에 비해 높다.

간질환은 병이 생기는 원인에 따라 바이러스성 간질환, 알코올성 간질환, 약물 독성간질환, 지방간, 자가 면역성 간질환, 대사성 간질환 및 기타 간질환으로 구분된다. 간 질환은 초기에 자각증상이 없어 상당히 진행되어서야 발견되기 때문에, 우리 나라뿐만 아니라 세계적으로도 사망원인의 수위를 차지하고 있으나, 효과적인 치료제 및 진단방법이 없는 실정이다.

한국에서 간질환은 국민 전체 사망 원인 중 5위를 차지하며, 40대에는 1위를 차지할 정도로 간질환을 앓고 있는 사람들이 많아 간 질환 치료제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 임상에서 간 섬유화 억제효과를 나타내는 약물은 없는 실정으로 경제적이고 안전한 치료제의 개발이 필요하다.

그간 간 질환의 예방 및 치료를 위하여 천연물을 소재로 한 많은 연구가 진행되어 왔다. 대표적인 것으로는 마리아 엉겅퀴(Silybum marianum)의 열매에서 분리한 실리마린(silymarin), 오미자에서 분리한 고미신(gomisin),감초에서 분리한 글리시리진(glycrhizin) 등이 있다.

만형자(蔓荊子)는 마편초과(Verbenaceae)의 관목인 순비기나무(Vitex rotundifolia L)의 건조한 열매로서 검붉은 빛깔을 띠고 있다. 순비기나무는 한국, 일본, 중국, 오스트레일리아 등지에 널리 분포하며, 한국에서는 제주도와 울릉도 그리고 남부지방, 중부지방의 해발 100~700m 지역, 남쪽 섬지방이나 해변 모래땅에서 자생하여 9~10월에 익는데, 이것을 말린 것이 만형자가 된다.

한방에서 만형자의 약성은 맵고 약간 찬 것으로 분류되어 있으며, 진정, 해열 작용이 있고, 두통,안질 및 귓병 치료에 이용된다. 동의보감에도 풍두통과 뇌명에 사용한다고 기술되어 있다. 사용시는 그대로 술에 불려 찌거나 볶아서 하루 6~9g을 달여서, 혹은 알약이나 가루약 형태로 먹는다. 만형자가 들어가는 처방전으로는 강활유풍탕, 세간명목탕등이 있다.

민간에서는 한방 외 염료로도 사용하였는데 만형자를 물에 넣고 30분간 끓이면 옅은 황색의 색소가 추출된다. 염재를 걸러내고 미리 명반 용액으로 매염한 목면을 넣어 30분간 3회 염색하면 옅은 황색으로 염색된다.

만형자에는 정유가 0.16% 존재하는데 그 주성분은 camphene이고, 지방유6.1%, flavonoid, labdane계 diterpene 및 vanillic acid등이 보고되어 있으나 아직까지 약리적 유효 성분은 규명되지 않았다 (장수정 et al, J Korean Soc. Agric. Chem. Biotechnol., 45, 101-107, 2002), 강삼식 et al, Kor. J. Pharmacogn., 25, 214~220, 1994). 또한, 만형자 단독으로서 간 질환 예방 및 치료와 간 보호에 유효 한 성분을 함유한다는 것은 아직까지 보고된 바 없다.

본 발명의 목적은 간질환 예방 및 치료 혹은 간 보호 효과를 갖는 만형자의 추출분획물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 추출 분획물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 건조, 분말화한 만형자 (Viticis fructus)를 메탄올 혹은 에탄올, 아세톤의 수용성 유기 용매로 냉침하여 얻어진 조 추출물 중 클로로포름 혹은 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 톨루엔의 비수용성 유기 용매의 가용 성분을 수집하여 추출물 분획물을 얻을 수 있다.

본 발명의 만형자는 한국산뿐만이 아니라 중국산등의 모든 만형자를 포함한다.

본 발명의 만형자 추출 분획물을 제조하는 방법은 다음과 같다.

음지에서 건조한 만형자를 세절하여 분말화한다. 여기에 만형자 부피 5배의 수용성 유기 용매, 바람직하게는 메탄올을 가하고 실온에서 일주일 간 침적한 후, 여과하 여 맑은 추출액 얻는다. 이것을 감압 농축하여 고형 농축물을 얻은 다음, 1L의 정제수를 가하고 잘 교반하여 현탁액으로 한다. 여기에 2배 내지 4배의 비수용성 유기 용매, 바람직하게는 클로로포름을 넣고 진탕 후, 그의 가용층을 수집, 감압 농축하여 만형자 추출물을 얻는다.

본 발명의 만형자 추출 분획물은 기타 천연물 등에서 간 질환 치료 및 간 보호 등에 유효한 성분을 함유한 것을 확인하기 위한 일련의 실험 중 디피피에이치 소거능 시험과 사염화 탄소로 유발한 급성 간 독성 모델에서 유의성 있는 활성을 나타내므로, 각종 간질환뿐만 아니라, 간 독성 등의 예방 및 치료에 유용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

다음의 실시 예, 실험 예들은 본 발명의 내용을 설명하나 본 발명의 내용이 여기에 한정되는 것은 아니다.

실시 예 1. 만형자 추출물의 제조

만형자를 음지에서 건조한 다음 분말화하고, 분말화된 만형자 가루 1kg을 메탄올 5L에 넣고 상온에서 7일간 추출한 후, Advantec 여과지로 여과하여 맑은 메탄올 추출액을 수거하였다. 이 추출물을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치로 50℃에서 감압 농축하고 건조하여 메탄올 추출물을 얻었다.

이 만형자 메탄올 조 추출물에 정제수 1L를 넣어 잘 교반하여 진탕 후 현탁액으로 만들고, 이 현탁액에 4L의 클로로포름을 가하여 잘 섞이게 한 후, 약 10분간 정치하여 클로로포름 불용층(물층,상)과 클로로포름 가용층(하)이 분리되도록 한 후, 클로로포름 가용층만을 수집하였다. 상기한 방법과 동일한 방법으로 4회 반복하여 클로로포름 가용층을 수집하고, 여기에 무수 황산나트륨을 넣어 물 가용성분을 최대한 제거하였다. 최종적으로 얻어진 클로로포름 가용층액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 50℃로 감압 농축하고 건조하여, 만형자 추출물 8.8g을 수득하였다.

실시 예 2. 만형자 추출물의 제조

수용성 유기용매로서 아세톤을 사용하여 실시 예 1과 같은 방법으로 만형자의 아세톤 조 추출물을 추출한 후, 여기에 정제수 1L를 넣어 잘 교반하여 진탕 후 현탁액을 만들고, 이 현탁액에 2L의 에틸아세테이트를 가하여 잘 섞이게 한 후, 에틸아세테이트 가용층만을 수집하였다. 상기 방법과 동일한 방법으로 4회 반복하여 에틸아세테이트 가용층을 수집하고 실시 예1과 같은 방법으로 농축, 건조하여 만형자 추출물 9.7g을 수득하였다.

실시 예 3. 만형자 추출물 제조방법

수용성 유기용매로서 에탄올을 사용하여 실시 예 1과 같은 방법으로 만형자의 에탄올 조 추출물을 추출한 후, 여기에 정제수 1L를 넣어 잘 교반하여 진탕 후 현탁액을 만들고, 이 현탁액에 3L의 톨루엔을 가하여 잘 섞이게 한 후, 톨루엔 가용층만을 수집하였다. 상기 방법과 동일한 방법으로 4회 반복하여 톨루엔 가용층을 수집 하고 실시 예1과 같은 방법으로 농축, 건조하여 만형자 추출물 8.1g을 수득하였다.

실험 예 1. 만형자 추출물의 디피피에이치에 대한 자유 라디칼 소거능 측정

디피피에이치(DPPH, 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)는 천연물의 항산화 작용을 측정할 때 흔히 사용되는 방법이다. 디피피에이치는 보라색을 띤 안정한 자유 라디칼이며, 시료에 의해 디피피에이치가 소거됨에 따라 보라색이 노란색으로 변화하는데, 이때 보라색이 감소하는 정도를 측정하여 시료의 항산화 효과를 판단하는 것이다.

디피피에이치를 에탄올에 녹여 1mM로 한 후, 이 용액 150㎕와 디메칠설폭시드에 녹인 각 농도별 만형자 추출물(실시예1의 만형자 추출물) 10㎕를 섞어 상온에서 45분 반응하게 하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군은 실시 예의 추출물 대신 디메칠설폭시드를 사용하였고, 음성 대조군에는 실시 예의 디피피에이치 대신 에탄올를 넣었다. 추출물의 자유 라디칼 소거효과는 다음의 공식을 이용하여 라디칼을 50% 소거하는 농도를 구하여 ED50으로 표시하였다(표 1).

A0: 양성 대조군의 흡광도

As: 만형자 추출물의 흡광도

Ab: 음성 대조군의 흡광도

만형자 추출물의 디피피에이치 소거능

	ED50
만형자 추출물	0.3mg/ml

실험 예 2. 사염화탄소 유도 간독성에 대한 만형자 추출물의 간보호 효과

2-1. 시료의 조제 및 사염화탄소를 이용한 급성 간 독성 유발

체중 190∼200 g 내외의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐(오리엔트 바이오)를 1주일간 순화시킨 후 군 분리하여, 시험에 사용하였다. 동물실 온도는 22-25 ℃로 12시간의 명암 주기를 지켜 사육하였고, 사료 및 물은 자유로이 섭취하도록 하였다.

만형자 추출물은 10% 라브라졸에 현탁하여 마리당 150mg씩, 1일 2회 총 7회를 경구 투여하고, 마지막 투여 6시간 후, 사염화탄소 2ml/kg(사염화탄소:올리브 유=1:1)을 복강 내로 투여하여 급성 간 독성을 유발하였다.

2-2. 혈청의 분리 간 조직 표본 제작

상기 실험 예 2-1에서 사염화탄소를 복강 투여 한 흰쥐를 18시간 동안 절식시키고, 에테르 마취 하에 복부를 절개한 후 복부 대동맥에서 채혈하였다. 또한, 간의 병리 조직학적 이상 유무를 판단하기 위해 간 조직 표본을 제작하고자 하였는데, 이를 위하여 간을 적출하고 간 표면에 묻어있는 혈액을 생리 식염수로 세척한 후, 10% 포르말린 용액에서 고정하였다.

혈액은 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 얻어, AST, ALT를 측정할 때까지 -70℃에서 보관하였고, 10% 포르말린 용액에 고정한 간 조직은 통상적인 방법에 따라 조직 표본 슬라이드를 제작하였다.

실험 예 3. 혈청 중의 AST, ALT 활성도 측정

상기 실험 예 2-2에서 얻은 혈청에서 AST, ALT의 활성도는 바이오 크리니칼 시스템의 AUTO GOT, GPT Kit를 사용하여 측정하였다. 간에 손상을 입게 되면 혈청 중의 ALT와 AST 치가 상승하게 되는 데, 이것은 간세포가 괴사되고 간 조직이 파괴됨에 따라 세포 내의 트랜스아미나제(transaminase)가 혈중으로 방출되기 때문이다.

상기 실험의 AST, ALT 활성도에 대한 실험 결과는 표 2와 같다.

흰 쥐의 사염화탄소 유도 간 손상 모델에 있어서 만형자 추출물이 혈중 AST, ALT 수치에 미치는 영향

	AST(u/ml)	ALT(u/ml)
VF150 +사염화탄소	278 ± 69 *	84 ± 18 *
사염화탄소	489 ± 75	190 ± 40
정상군	164 ± 15	61 ± 2

VF150군은 만형자 추출물 1회에 150mg 투여한 군

사염화탄소군은 시료 대신 10% labrasol을 투여한 군

* T-검정시 사염화탄소 군에 비해 95% 유의성이 인정된 경우

실험 예 4. 간 조직에 나타난 병리 조직학적 변화 관찰

상기 실험 예 2-2에서 얻은 각 군 동물의 간 조직 표본 슬라이드는 헤마톡시린-에오신(Hematoxylin-Eosin) 염색을 통하여 현미경으로 검사하였다 (배율: X 100).

그 결과, 각 군별 동물의 간 조직에서 나타난 병리 조직학적 관찰소견은 도 1 내지 3에 나타내었다. 정상군의 경우 중심 정맥을 중심으로 관찰하였을 때 별다른 이상을 발견할 수 없었으나(도 3), 사염화탄소 단독 투여 군에서는 간 조직 전반에 걸쳐 염증 세포의 출현과 간 실질 세포의 공포변성 및 괴사가 관찰되었다.(도 2) 그러나, 만형자 추출물을 투여한 군에서는 중심 정맥 주변에서만 약간의 염증 세포와 간 세포의 공포변성이 나타났을 뿐, 그 정도와 출현 범위는 사염화탄소 단독 투여군에 비하여 놀랄만하게 감소하였다.(도 1)

상기에서 살펴본 바와 같이, 만형자 추출 분획물은 자유 라디칼 소거능을 지니며, 사염화탄소로 유도한 흰 쥐의 간 독성 모델에서, 혈청 중의 AST와 ALT의 수치를 낮출 뿐만 아니라, 간 조직에서 나타나는 염증 세포 침윤이나 간 세포의 공포 변성 등의 간 손상을 억제하는 것으로 나타났다. 따라서, 만형자에서 유기 용매 등으로 추출한 분획물, 특히 클로로포름 분획물은 간 보호 혹은 간 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

Claims (5)

1. 간 질환 예방, 치료 또는 간보호 효과를 갖는 만형자 추출물
2. 항산화 효과를 갖는 만형자 추출물
3. 항산화 효과, 간 질환예방, 치료 또는 간보호 효과를 갖는, 만형자의 메탄올, 에탄올 또는 아세톤중에서 선택되는 한가지 이상의 수용성 유기용매 추출물중 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 톨루엔중에서 선택되는 한가지 이상의 비수용성 유기용매의 가용성 추출물
4. 만형자를 메탄올, 에탄올 또는 아세톤중에서 선택되는 한가지 이상의 수용성 유기용매로 추출하고, 그 추출물중 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 톨루엔

   중에서 선택되는 한가지 이상의 비수용성 유기용매의 가용 성분을 수집하는 것을 특징으로 하는 만형자 추출물의 제조방법
5. 제 1항 내지 제 3항중에서 선택되는 어느 한항의 추출물을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물 또는 건강기능식품.

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