KR20070052496A

KR20070052496A - Ｒａｎｉ의 세포사멸 조절제로서의 신규한 용도

Info

Publication number: KR20070052496A
Application number: KR1020050110192A
Authority: KR
Inventors: 신득용; 채태생; 진동훈; 홍승우
Original assignee: (주)젠크로스
Priority date: 2005-11-17
Filing date: 2005-11-17
Publication date: 2007-05-22
Anticipated expiration: 2025-11-17
Also published as: KR101274256B1

Abstract

본 발명은 Rani의 세포사멸 조절제로서의 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, Rani는 세포사멸에 필수적인 단백질 분해효소 카스파제 (Caspase)의 활성을 저해하여 세포사멸을 억제할 수 있다. 본 발명의 Rani 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질, 또는 이의 활성을 조절하는 물질, 예를 들면 항체, siRNA, 화학물질 등은 세포사멸과 관련된 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Rani, 세포사멸, siRNA

Description

ＲＡＮＩ의 세포사멸 조절제로서의 신규한 용도 {A NOVEL USE OF Rani AS AN APOPTOSIS REGULATOR}

도 1은 p53에 의해 유도된 세포사멸에 대하여 저항성을 나타내는 세포주의 분리과정 및 이로부터 세포사멸 억제 유전자의 클로닝 방법을 도식적으로 보여준다.

도 2는 Rani 단백질 C 말단부위와 다양한 단백질 유래의 HECT 영역과의 단백질 수준에서의 상동성을 보여준다. 도 2a는 HECT 영역을 포함하는 단백질을 Rani와 아미노산 서열수준에서 비교한 것이며, 도 2b는 HECT 영역에서의 상동성의 백분율로 나타낸다. *는 티오에스테르 결합형성에 있어 중요한 시스테인 잔기를 나타낸다.

도 3은 Rani 단백질의 E3 유비퀴틴라이게이즈로서의 활성을 보여준다.

도 4는 Rani 단백질의 p53, TNFα 및 STS (strausporine)의해 유도된 세포사멸에 대한 억제작용을 보여준다.

도 5는 Rani 단백질이 세포사멸 케스케이드에서 단백질 분해효소 카스파제 9 (도 5A)및 이에 의하여 활성화되는 단백질 분해효소인 카스파제 3 (도 5B)의 활성을 억제함을 보여준다.

도 6은 다양한 기관유래의 암 및 정상 조직에서의 Rani 발현 양상을 보여준 다.

도 7은 Rani 유전자의 발현을 억제하는 siRNA (small interfering RNA)에 의하여 암 세포의 세포사멸이 촉진된다는 것을 보여준다.

도 8은 Rani 유전자의 발현을 억제하는 siRNA (small interfering RNA)에 의하여 항암제에 대한 암 세포의 감수성이 증가한다는 것을 보여준다.

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본 발명은 세포사멸을 억제할 수 있는 Rani의 신규한 용도에 관한 것이다.

세포사멸(apoptosis)은 진핵세포에서 나타나는 세포의 파괴 또는 자살을 의미하는 것으로 (Kerr et al., 1972) 동물의 정상적인 발생조절, 및 불필요하거나, 비정상적인 세포의 제거 등을 포함하는 개체의 항상성 유지를 위한 기본적 세포내 과정이다. 세포사멸은 다양한 외부 및 내부 자극에 반응하여 일어나게 되는데, 세포사멸의 진행과 함께, 세포에서는 세포질의 파괴, 세포막의 기포형성(blebbing), 세포골격의 변화, 세포 수축, 염색체의 응축 및 DNA 분절화 등과 같은 특징적인 변화가 일어난다 (Kerr et al., 1972).

이러한 세포사멸은 생리적으로 매우 중요한 현상으로, 생체내의 복잡한 기전에 의해 정교하게 조절되고 있으며, 비정상적인 조절로 인한, 부적절한 세포사멸의 유도, 즉 세포사멸의 억제 또는 촉진은 많은 질환과 연관되어있다.

구체적으로, 과도한 세포사멸은 특정 세포의 파괴 및 이에 의해 매개되는 생체내 기능상실을 유발할 수 있어, 중추신경계 질환, 예를 들면, 다수의 급성 및 만성 퇴 행성 질환 (예컨대, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌허혈증/뇌졸증)(Mochizuki et al., 1996; Smale et al.,1995; Thomas et al., 1995; Robertson, et al., 2000), 심혈관계 질환 (Yue et al., 1999), 및 그레이브스 병 및 제2형 당뇨병 등과 같은 자가면역 질환 (O'Reilly et al., 1999; Magge, 1998)과 관련되어 있다.

반면, 세포사멸의 비정상적인 억제와 관련된 대표적 질환은 암으로, 세포사멸의 과소 활성으로 인해 적절하게 제거되지 못한 종양 세포의 축적이 암의 발생 밀접하게 관련되어 있는 것으로 알려져 있다 (Vogelstein et al., 2000; Vousden et al., 2002).

따라서, 세포사멸을 조절하는 인자 및 조절기전의 규명은 다양한 질환의 발생기전을 이해할 수 있게 하여 상기 언급한 세포사멸과 관련된 질환의 치료/진단제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

이와 관련하여 지금까지 세포사멸에 이르는 각 단계에서 작용하는 다수의 세포사멸 조절인자가 공지되었다.

세포사멸에 이르는 경로는 크게 세포사멸 수용체를 경유하는 것과 그렇지 않은 것으로 분류될 수 있다. 전자는 세포내 특정 리간드가 이의 수용체 결합하여 유도되는 세포사멸로서, 이에 관여하는 수용체에는 Fas, TNFR (tumor necrosis factor receptor 1), TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) 등이 있다. 후자는 스트레스에 의해 유발되는 세포사멸로서, 세포사멸을 유발할 수 있는 스트레스로는 자외선, 열쇼크, 감마선조사, 저산소상태 등이 있다. 이러한 자극에 의해 유발된 세포사멸은 하류 단계에서 작용하는 인자들을 경유하여 완결되며, 대표 적인 것이 카스파제 단백질분해효소이다. 이들은 세포사멸에 이르는 신호전달 경로에서 순차적으로 작용하는 단백질 군으로서 특정아미노산 (아스파테이트) 부위를 절단하여 일련의 단백질을 활성화시킴으로서 세포사멸에 관여한다.

따라서, 상기 일련의 단계에서 작용하는 다양한 인자들이 세포사멸의 조절을 위한 표적이 될 수 있으며, 예를 들면, Walczak 등 (Walczak et al., 1999)은 세포수용체를 경유하여 유도된 세포사멸 촉진 인자로서 TRAIL 단백질의 암치료제로서의 용도를 개시한다.

Fulda 등 (Fulda et al., 2000)은 세포수용체-유도된 세포사멸 조절의 표적으로서 Fas-L의 용도를 제시한다.

WO03/076647은 세포사멸의 하류단계에서 세포사멸 및 세포주기 조절제로서 기능하는 JADE 유전자, 단백질 및 이를 이용한 세포사멸 조절 물질의 스크리닝 방법을 개시한다.

한국 특허출원공개 2001-113088은 카스파제에 의해 활성화되는 특정 DNase와 상호작용하여 세포사멸을 조절하는 CIA 단백질, 유전자 및 이의 용도를 개시한다.

한국 특허출원공개 2002-40521은 세포사멸을 이용한 마이크로락톤을 포함하는 항암제를 개시한다.

나아가, 세포사멸 유도와 관련된 대표적 단백질로는 p53을 들 수 있으며, Myc과 같은 발암유전자에 의한 비정상적 세포성장을 나타내는 세포에서 p53이 세포사멸의 매개자로서 이러한 세포의 제거에 관여한다는 것이 밝혀졌다 (Vogelstein et al., 2000; Vousden et al., 2002). p53은 손상된 DNA의 수리, 세포주기 조절 에 관여하는 대표적인 종양 억제 단백질로, 특정 유전자의 프로모터 내 표적 서열에 대한 높은 친화성을 가진 전사조절인자로 작용하여 표적 유전자의 발현을 전사수준에서 조절하여 세포의 분열을 억제하거나 또는 손상된 DNA를 갖거나 비정상적인 분열을 하는 비정상적인 세포를 선택적으로 파괴하여 이들 세포의 암으로의 진행을 막는데 중요한 역할을 한다 (Oda et al., 2000).

그러나, 다양한 자극에 반응하여, 서로 상호작용하는 복잡한 단계에 의해 유도되는 세포사멸 기전의 정확한 이해 및 이를 기반으로 하는 특정 질환에 특이적이고 부작용이 적은 효과적인 치료/진단제의 개발을 위해 세포사멸의 조절에 관여하는 추가의 인자를 개발할 필요성이 있다.

이에, 본 발명자들은 세포 수용체 또는 외부의 다양한 스트레스에 의해 유발되는 세포사멸의 활성을 조절할 수 있는 신규한 인자를 규명하기 위해, p53이 결여된 세포를 이용하여 p53에 의해 유도되는 세포사멸에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 클로닝하고, 이의 세포사멸 억제제로서의 신규한 활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 Rani 단백질, 이를 코딩하는 유전자의 세포사멸 조절제로서의 새로운 용도, 구체적으로 Rani 유전자, 단백질 또는 이의 활성을 조절하는 물질을 유효성분으로 포함하는 세포사멸 조절제 및 세포사멸관련 질환치료제를 제공하는 것이다.

상기 목적 달성을 위해 본 발명은 Rani 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 유효성분으로 포함하는 세포사멸 조절제를 제공한다.

또한, 본 발명은 Rani 유전자 또는 단백질 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 치료보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 Rani 유전자 또는 단백질 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 세포사멸의 과소 활성과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 유용한 약학적 조성물을 제공한다. .

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 Saos-2 세포주를 사용하여, 마우스 유래의 cDNA 라이브러리를 스크리닝한 결과, p53에 의해 유도되는 세포사멸에 강한 저항성을 부여하는 약 2.2kb의 cDNA를 분리하고, 이를 Rani(Resistance to apoptosis induction의 약자) 로 칭하였다.

BLAST(Karlin et al., 1993)에 기초하여 개발된 BLASTN 이나 BLASTX라 불리는 프로그램 (Altschul et al 1990; http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)을 사용한 컴퓨터를 이용한 상동성 분석 결과, Rani은 GenBank AK077015 (마우스) 및 AB002315 (사람)의 일부를 구성하는 서열로 확인되었으나, 이의 기능은 현재까지 전혀 알려지진 바가 없다. 다만, 상기 프로그램을 사용한 상동성 분석의 결과, Rani의 C-말단부위가 HECT (Homology to E6-AP Carboxy Terminus) 영역과 아주 낮은 유사성을 갖 는 것으로 나타났다.

HECT (Homology to E6-AP Carboxy Terminus) 영역은, 약 350개의 아미노산 잔기로 구성되는 보존영역으로서, 주로, 단백질의 유비퀴틴화에 관여하는 E3 유비퀴틴 라이게이즈, 예컨대 E6-AP (Huibregtse et al., 1995), Nedd4 (Harvey and Kumar, 1999), SMURF2 (Lin et al., 2000), 및 PUP1 (Arendt and Hochstrasser, 1997) 등에서 발견된다 (Huibregtse et al., 1995). 포유동물에서는 현재가지 약 20여개의 HECT 영역을 포함하는 E3 유비퀴틴 라이게이즈가 발견되었으나, 이들은 유비퀴틴화가 관여하는 세포내 기능에 따라 그 역할이 매우 다양하다 (You and Pickart, 2001). 그러므로, HECT 영역을 포함하는 단백질이라고 하더라도 이의 세포내에서의 구체적인 기능을 밝히기까지는 당업자의 자명하지 않은 많은 실험을 요구하며, 특히, 본 발명의 Rani와 같이, 이미 알려진 E6-AP, hNedd4, hSMURF2, hPUP1 및 yRSP5의 HECT 영역과 상동성이 모두 35% 미만으로 매우 낮은 경우에는 더욱이 그러하다 (도 2).

이에, 본 발명자들은 연구를 거듭한 결과 Rani이 HECT 영역을 포함하는 E3 유비퀴틴 라이게이즈로서 세포사멸을 효과적으로 억제할 수 있음을 발견하였다.

구체적으로, 본 발명에서는 시험관내 실험을 통하여 Rani 단백질이 E3 유비퀴틴 라이게이즈 활성이 있다는 것을 발견하였으며(도 3), 생체내 실험을 통하여 Rani 유전자의 과발현이 p53, TNF-alpha 및 staurosporine (STS) 등에 의해 유발된 세포사멸을 현저하게 억제할 수 있음을 발견하였다 (약 50% 이상, 도 4). 나아가, 암 환자의 정상 및 암 조직에서 Rani의 발현을 조사한 결과 각종 암, 예를 들면, 위암, 대장암, 간암, 및 폐암의 각각 48%, 46%, 33%, 및 42%에서 Rani의 과발현이 관찰되었다(도 6). 또한, siRNA(Small Interfering RNA)에 의한 내인성 Rani 단백질 발현의 억제는 세포사멸의 유도는 물론 항암제에 대한 민감성을 유도하였다 (도 7 및 8). 이러한 결과는 본 발명의 Rani 유전자의 새로운 세포사멸 조절제로서의 새로운 용도를 증명하는 것이다.

본 발명은 Rani 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 유효성분으로 포함하는 세포사멸 조절제를 제공한다.

상기 Rani 단백질, 이를 코딩하는 유전자 서열은 다양한 포유동물 유래의 것이 사용될 수 있지만, 바람직하게는 인간 유래이며, 이들은 인간 및 비-인간 포유동물 종의 모든 세포 유형에 존재하는, 천연의 서열 공급원으로부터 정제되거나, 화학적으로 합성되거나, DNA 재조합 기술에 의해 생성되거나, 이들 및/또는 기타 방법의 조합에 의해 제조된 모든 것을 포함하는 것이다.

나아가, 본 발명의 Rani 단백질, 이를 코딩하는 유전자에는 그의 “기능적으로 동등한 변이체”가 포함된다. 본 발명의 목적상 기능적으로 동등한 변이체란 통상적으로 발견되는 천연 서열과 대등한 생물학적 활성을 나타내는 화합물을 가리킨다. 본 발명의 목적을 고려하면, 기능적으로 동등한 변이체는 세포사멸을 억제할 수 있는 것을 의미한다. 구체적으로, 기능적으로 동등한 변이체는 유전자의 경우, GenBank Accession 번호 AB002315(인간)(서열번호 1) 및 AK077015 (마우스)(서열번호 2), 및 단백질의 경우, BAA20775(마우스) 및 BAC36566 (인간) 서열로부터 유래한 것이다.

또한, 이러한 기능적으로 동등한 변이체는 세포사멸 억제의 활성을 갖는 한, 유전자서열을 구성하는 뉴클레오타이드, 또는 단백질 서열을 구성하는 아미노산 서열이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 서열변이체를 포함한다.

상기 단백질 서열 변이는 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어, 부위-유도성 돌연변이법(site-directed mutagenesis, Kramer, W.& Fritz, H-J. Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplux DNA. Methods in Enzymology, 154, 350-367, 1987) 등에 의해 제조될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 서열 변이는 자연적으로도 발생한다.

상기와 같은 서열의 변이는 단백질을 이루는 아미노산 서열 변이를 수반하거나 또는 수반하지 않을 수도 있다. 예를 들어, 단백질 서열 변이가 폴리펩타이드 중의 아미노산의 변이를 수반하지 않는, 축중변이가 있으며, 이러한 축중변이체(degeneracy mutants)도 본 발명의 유전자에 포함된다.

Rani 단백질과 기능적으로 동등한 변이체를 암호화하는 유전자는 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 혼성화 기술(Southern, E.M., Journal of Molecular Biology, 98, 503, 1975)이나 PCR 방법(Saiki et al., Science, 230: 1350-1354, 1985; Saiki et al., Science, 239: 487-491, 1988)을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 당업자라면 상기 언급한 Rani 단백질 서열로부터 Rani 유전자에 특이적으로 혼성화될 수 있는 프라이머를 고안하여 Rani 유전자와 높은 상동성을 가지는 유전자를 분리할 수 있을 것이다.

이렇게 분리된 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 아미노산 수준에 있어서, 천연 Rani 단백질과 높은 상동성을 갖는다. 높은 상동성이란 아미노산 서열 전체에서, 50% 이상, 특히 70% 이상, 보다 특히 90% 이상(예를 들어, 95% 이상)의 서열의 동일성을 가리킨다.

아미노산 서열이나 염기서열의 상동성은 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993)에 기초하여 개발된 BLASTN 이나 BLASTX라 불리는 프로그램(Altschul et al, J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990)을 사용하여 분석될 수 있으며 구체적인 방법은 다음의 웹사이트에 공지되어 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).

또한, Rani 단백질, 이를 코딩하는 유전자는 이의 천연서열과 대등한 생물학적 활성을 갖는 단편을 또한 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 “단편”은 유전자 또는 단백질의 일부에 해당하는 서열로서, 유전자의 경우, 물리적, 엔도뉴클리에이즈 또는 화학적으로 절단한 것을 포함하며, 단백질의 경우, 프로테이즈로 절단한 것이나, 화학적으로 절단한 것을 모두 포함한다. 나아가 단백질의 경우, Rani 단백질의 안전성, 저장성, 용해도 등의 변경을 위한 변이체, 또는 상호작용하는 다른 단백질과의 상호작용의 변경을 위한 변이체도 상기 기능적으로 동등한 변이체에 포함된다.

본 발명의 Rani 유전자 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체는 본 발명의 목적 달성을 위해, 그 자체로 또는 벡터에 포함되어 사용될 수 있으며, 벡터로의 DNA 도입방법은 당업계에 공지되어 있다 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.,Sambrook and Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; Current Protocols in Molecular Biology Ausubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith and Stuhl eds, Greene Publ.Assoc., Wiley-Interscience,1992). 본 발명의 한 구현예에서는 진핵세포에서의 발현을 위해 pCEV29 (Michieli et al., 1996; Yamanaka et al., 2001) 벡터로 도입되어 사용되었다.

세포에서의 발현 및/또는 증폭, 및 다른 면에서는 염색체내로 도입 또는 염색체와 독립적으로 세포에 존재할 수 있는 다양한 벡터가 공지되어 있으며, 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 형태의 벡터, 또는 그 외 목적달성에 적합한 임의의 벡터를 포함한다. 나아가, 이러한 벡터는 세포표면에 수용체에 대한 리간드 또는 핵산결합 모이어티 (예를 들면 폴리리신 결합 부위) 등을 포함하는 (예를 들면, WO 93/04701에 기술된 것) 화학적 컨쥬게이트 벡터, 바이러스 벡터 (예를 들면, DNA 또는 RNA 바이러스), 도입된 단백질과 융합되어 발현되는 융합단백질 모이어티(예를 들면, 세포의 항원을 인식하는 항체 모이어티, 분리 및 검출의 용이성을 위한 Glutathione S-transferase 또는 형광단백질 모이어티)를 포함하는 융합단백질발현 벡터를 포함하며, 목적에 적절한 벡터의 선택은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 Rani 유전자는 유전자치료 시스템 등에 사용되는 발현벡터, 예를 들면 아데노바이러스벡터에 도입되어 공지된 방법에 따라 전달체로서 바이러스입자에 포함되어 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 Rani 폴리뉴클레오티드 및 상기 기재된 모든 변이체는 폴리펩타이드 합성에 대한 공지의 유기화학적 방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 또한 목적하는 완전한 길이의 서열을 얻기 위하여 단편으로 합성된 서열들을 서로 결합할 수 있다(The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1-9, Gross, Udenfriend and Meienhofer Ed. 1979-1987, Academic Press Inc.). 특히, 본 발명에 따른 Rani 폴리뉴클레오티드, 이의 단편, 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체는 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이 바람직하다. 천연 Rani 폴리뉴클레오티드를 적당한 숙주세포에서 발현시킨 후 세포의 융해물을 만들거나, 또는 Rani mRNA를 시험관내에서 번역한 후, 당업계의 공지된 단백질 분리방법에 의해 정제할 수 있으며, 일반적인 유전자 재조합 기술 및 단백질 정제방법은 예를 들면 문헌 (Sambrook et al., Molecular Clonning: A Laboratory Mannual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al Ed., Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience 1991)을 참조하면 된다. 이러한 본 발명의 Rani 폴리펩타이드는 예를 들면 정제된 단백질, 수용성 단백질, 또는 표적 세포로의 전달 또는 투여를 위해 담체에 결합된 형태의 단백질 또는 아미노산 잔기와 융합된 형태의 것을 포함하는 것이다.

본 발명의 Rani의 세포내 발현은 p53, TNF-a 및 STS 등에 의해 유발된 세포사멸을 현저하게 억제하였다 (약 50% 이상, 도 4). 나아가, Rani에 특이적인 siRNA를 사용한 내인성 Rani 단백질 발현의 억제는 세포사멸을 유도하였다. 이러한 결과는 본 발명의 Rani 유전자가 새로운 세포사멸 억제기능을 가짐을 증명하는 것으로서, 세포사멸 억제 기능을 하는 본 발명의 Rani 단백질은 비정상적으로 유도된 세포사멸의 억제에 사용될 수 있어, 비정상적 세포사멸에 의해 유발되는 질환의 치료제로서 유용할 수 있음을 나타내는 것이다.

따라서, 본 발명의 세포사멸 조절제는 세포사멸의 과다 활성과 관련된 질병의 치료 또는 예방용인 것을 특징으로 한다. 이러한 세포사멸의 과다활성과 관련된 질환은 이로 한정하는 것은 아니지만, 중추신경계 질환, 예를 들면, 다수의 급성 및 만성 퇴행성 질환 (예컨대, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌허혈증/뇌졸증)(Mochizuki et al., 1996; Smale et al., 1995; Thomas et al., 1995; Robertson et al., 2000), 심혈관계 질환 (Yue et al., 1999), 및 그레이브스 병 및 제2형 당뇨병 등과 같은 자가면역 질환 (O'Reilly et al.,1999; Magge et al., 1998)을 포함한다.

본 발명은 또한 상기 Rani 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체가 특히 Rani 단백질의 HECT 영역과 관련된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 한 구현예에서는 Rani의 C-말단 부위의 HECT 영역만으로도 충분히 세포사멸을 억제할 수 있음을 증명하였다.

본 발명은 Rani의 세포사멸 억제제로서의 유용성 및 Rani이 세포사멸의 과소활성과 관련된 질환 예를 들면 암세포에서 과발현된다는 발견에 기초한 것으로서(도 6 참조), 이러한 관점에서 본 발명은, Rani 유전자 또는 단백질 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 세포사멸의 과소 활성과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 유용한 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 세포사멸의 과소 활성에 의한 질병으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 특히 p53의 불활성화에 의한 암을 포함한다 (Vogelstein et al., 2000; Vousden et al., 2002). 본 발명의 한 구현예서는 위암, 간암, 대장암, 및 폐암에서 Rani의 과발현을 확인하였으며, 이는 상기 암조직을 구성하는 암세포에서의 세포사멸의 억제를 의미하는 것으로 Rani의 기능상실에 의한 세포사멸의 유도가 암의 치료에 효과적일 수 있음을 시사하는 것이다.

본 명세서에 사용된 용어 "억제제"는 Rani 유전자의 발현, Rani 단백질의 발현, 및/또는 발현된 단백질의 활성을 억제할 수 물질이면, 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의해 얻어진 물질, 천연 유래의 물질 또는 그의 유도체인 물질로서, 예컨대, 항체, 안티센스뉴클레오타이드 등을 포함한다. 본 발명의 한 구현예에서는 억제제로서 siRNA를 사용하여 효과적으로 Rani의 세포사멸억제제로서의 기능을 억제할 수 있었다.

상기 siRNA는 표적 mRNA에 결합하여 이의 번역을 방해하는 이중가닥의 RNA 분자를 의미하는 것으로 센스가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 상기 센스가닥은 Rani 유전자서열, 예를 들면, 서열번호 1 또는 2로부터 선택되는 표적서열에 상응하는 라이보뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 상기 센스가닥에 상보적인 라이보뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

siRNA는 생체의 발달과정, 또는 바이러스에 대항하는 생체의 방어기작 등의 과정에서 발현되는 것으로, 표적 mRNA에 결합시, 이를 인지하는 세포내 효소복합체의 결합을 유도하여, 상응하는 mRNA를 분해시키는 기능을 한다 (Fire,1998; Montgomery et al., 1998; Sharp P.A., ,1999).

포유동물의 경우 siRNA는 통상적으로 20 또는 21mer의 이중가닥 RNA로서, 19 개의 상보서열 및 3‘-말단의 비상보적인 티미딘 또는 유리딘의 다이머(dimer)로 구성된다. 이러한 이중가닥 RNA는 세포내 도입 시 상응하는 유전자의 발현을 특이적으로 억제하는 것으로 나타났다 (Elbashir et al., 2001).

본 발명에 따른 siRNA는 두 개의 상보적인 뉴클레오타이드 분자를 포함할 수 있거나, 예를 들면, 헤어핀 모양과 같이, 센스 및 안티센스 서열을 하나의 분자(전사체)에 포함할 수 있다. 상기 siRNA의 길이는 약 10 뉴클레오티드 이상으로, 가장 길게는 천연적으로 나타나는 Rani 전사체의 길이일 수 있다. 특히, 상기 siRNA의 길이는 약 100 뉴클레오티드 이하, 가장 특히는 15 내지 약 25 뉴클레오티드이다. 본 발명의 한 바람직한 구현예에서는 상기 이중가닥 분자를 구성하는 센스가닥 및 안티센스가닥으로서 각각 서열번호 3 또는 4로 표시되는 서열을 사용하여 Rani의 기능을 효과적으로 억제하였다.

상보적 폴리뉴클레오타이드 서열은 적절한 조건하에서 혼성화하여 수 개의 미스매치(mismatch) 또는 미스매치가 없는 이중가닥 분자 또는 헤어핀 구조의 이중가닥 분자를 형성할 수 있다. 본 발명의 목적을 고려하면, 5개 이하의 미스매치를 포함하는 두 개의 서열을 상보적인 것으로 고려할 수 있다.

이러한 siRNA를 세포로 도입하는 방법은 공지되어 있으며, 본 발명의 한 구현예에서는 siRNA로의 전사가 가능한 이의 DNA 주형을 포함하는 벡터를 세포에 트렌스펙션하여 siRNA를 발현하였다.

본 발명의 한 구현예에서는 인간 Rani 유전자에 상응하는 부위로부터 siRNA를 고안하고, 이를 사용하여, Rani이 고발현되는 293 세포주에 도입하여 Rani의 발 현을 특이적으로 억제하였다. 그 결과, 293 세포에서의 세포사멸 증가를 관찰하였으며, 아울러, 세포사멸 촉진인자 중의 하나인 TNF-알파에 대한 감수성 증가 및 공지의 항암제에 대한 감수성을 증가를 확인하였다 (실시예 7, 도 7 및 8 ). 특히, 상기 Rani의 억제에 의한, 공지의 항암제에 대한 감수성 증가 현상은 임상적 유용성이 대단히 큰 것으로서, 예를 들면, Rani에 대한 siRNA와 같은 Rani 억제제를 공지의 항암제와 함께, 이의 감수성을 증가시키는 보조제로서 사용할 경우, 부작용이 많은 공지의 항암제의 사용량을 상당히 줄일 수 있어, 환자의 복지향상 및 경제적 측면에서 매우 큰 의미가 있다.

이러한 관점에서, 본 발명의 Rani 유전자 또는 단백질 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 세포사멸의 과소 활성과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 유용한 약학적 조성물은 암의 치료에 사용될 경우, 추가로 항암제를 포함할 수 있다.

또 다른 관점에서 본 발명은 본 발명의 Rani 유전자 또는 단백질 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 치료보조제를 제공한다.

또 다른 관점에서 본 발명은 본 발명의 Rani 유전자 또는 단백질 발현 억제제 및 항암제를 조합으로 사용하는 것을 특징으로 하는 항암제를 제공한다. 상기 억제제는 암세포의 항암제에 대한 민감성을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

상기 항암제는 본 발명의 Rani 유전자 또는 단백질 발현 억제제와 조합으로 사용되어 상기 효과를 달성하는 한, 당업계에 공지된 것이 사용될 수 있으며, 이로 제한하는 것은 아니나, 시스플라틴, 독소루비신 및 에토포시드를 포함한다.

본 발명은 또한 Rani 유전자 또는 Rani 단백질의 발현, 또는 Rani 유전자의 변이 검출 수단을 포함하는 세포사멸관련 질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 Rani 유전자 또는 단백질이 세포사멸이 유도된 세포에서의 세포사멸을 억제할 수 있을 뿐만이 아니라, 세포사멸이 과소활성화된 암에서 과발현됨을 발견하였다. 따라서, 환자의 생검시료를 이용하여 Rani 유전자 및/또는 단백질의 발현량을 측정함으로써, 세포사멸과 관련된 질환의 진단 및/또는 진행정도를 알 수 있으며, 본 발명의 진단키트가 사용될 수 있는 세포사멸관련 질환은 상기 언급한 바와 같다.

상기 발현량의 측정은 당업계의 공지된 검출 수단을 사용하여 수행될 수 있으며, 이로 제한하는 것은 아니나, 예를 들면, 유전자 발현의 경우, 생검시료에서 RNA를 분리 후에, 역전사방법을 통하여 cDNA를 합성한 후, Rani을 특정적으로 증폭할 수 있는 적절한 프라이머를 사용하여 PCR(Polymerase Chanin Reaction)을 수행하는 RT-PCR 방법 또는 상기 방법을 기본으로 하는 실시간 정량 PCR, cDNA array법, 노던블롯 등으로 수행할 수 있다. 단백질 발현의 경우, Rani에 대한 항체를 이용한 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), RIA(radioimmunoassay), HPLC(high performance liquid chromatography), 웨스턴블롯 또는 질량분석에 의한 정량법을 사용할 수 있다.

또한, Rani 유전자가 세포사멸과 밀접한 관련이 있다는 것이 밝혀졌으므로, Rani 코딩서열 또는 그 조절영역 예를 들면, 프로모터 및 인핸서 등에 특정 변이, 예를 들면, 특정 핵산 서열의 치환, 결실 부가 등이 존재하여 Rani의 기능이 저하 되거나, 유전자 또는 단백질이 발현이 감소될 수 있다. 따라서, Rani 코딩서열, 그 조절영역을 포함하는 유전자의 변이를 검사하여, 그 차이점을 정상 유전자와 비교함으로써, 세포사멸관련 질환에 걸릴 위험성을 미리 판단할 수 있다. 유전자 서열의 변이 및 정상 서열과의 차이는 당업계의 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있으며, 이로 제한하는 것은 아니나, 예를 들면, cDNA 염기서열분석, PCR-SSCP (single strand confimration polymorphism), PCR-SSO (sequence-specific oligonucleotide) 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 세포사멸관련 질환치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명은 Rani 유전자의 발현 조절물질, Rani 단백질의 발현조절물질, Rani 단백질의 기능조절물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 물질은 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의해 얻어진 물질, 천연 유래의 물질 또는 그들의 유도체인 물질인 것이 바람직하다.

상기 물질을 스크리닝하는 방법은 상기 물질을 (1) Rani 유전자의 전사 제어 영역 및 Rani 유전자 또는 리포터(reporter) 유전자를 포함하는 형질전환 세포 또는 시험관 내 발현시스템과 접촉시켜 Rani 유전자 또는 리포터 유전자의 발현량을 검출하는 단계, 또는 (2) Rani 단백질의 존재 중에서, 표적 분자와 접촉시켜 Rani 단백질의 세포사멸 억제기능을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 단계 (1)에서 리포터 유전자로는, 예를 들면, 클로르암페니콜 아세틸 전이효소(CAT), β-갈락토시다아제(β-Gal), 루시퍼라제(luciferase) 등을 이용할 수 있다. Rani 유전자의 발현조절 물질은, 예를 들면, Rani 유전자의 전사조절 영역(프로모터, 인핸서)을 리포터 유전자의 번역 영역의 상류 또는 하류에 연결한 발현 벡터를 구축하여 적당한 배양세포 등에 도입하고, 그 배양세포에 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의해 얻어진 화합물 또는 천연 유래의 화합물 및 그들

의 유도체를 첨가하고, 일정 시간 후에 리포터 유전자의 발현량 또는 리포터 단백질의 양을 측정함으로써 스크리닝할 수 있다. Rani 유전자의 조절영역은 시판되는 게놈 라이브러리로부터, 공지의 방법에 의해 Rani cDNA의 단편을 프로브로 하여 플라크 잡종화(plaque hybridization)를 수행하여 얻을 수 있다. 리포터 단백질의 양은 효소 활성으로서 측정할 수도 있고, 단백질의 발현량으로서 항체 등을 이용

하여 측정할 수도 있다.

상기 단계 (2)의 방법은 재조합 등의 방법으로 세포내에서 과발현된 후 정제한 Rani 또는 Rani를 포함하는 세포 추출물(분획물)을 시험관내에서 유비퀴틴과 결합시켜, 예를 들면 실시예 2에 기재된 방법과 같이 유비퀴틴화의 활성을 측정함으로써 Rani 발현조절 물질을 스크리닝할 수 있다.

본 발명에 따른 세포사멸 유도제, 및 세포사멸관련 질환 치료용 약학적 조성물은 당업계의 공지된 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 적절한 제형으로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 조직에 도달할 수 있는 한 일반적 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 특히 비경구 투여가 바람직하며, 더욱 특히는 정맥내 주사로 투여할 수 있으며, 제형은 선택한 투여방법에 따라 달라진다.

약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

부가하여, 다른 약학적 전달 시스템 예컨대 당업계의 주지된 리포좀 및 에멀젼을 채용할 수 있다. 특정 유기용매 예컨대 디메틸설폭시드를 또한 채용할 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 것이다. 예를 들면, 치료적 으로 유효한 투여량은, 초기에는 세포배양을 통한 시험관내 분석을 사용하여 결정할 수 있으며, 동물모델에서 실험을 수행하여 혈중 Rani의 농도 범위가 세포배양에서 결정된 IC50 (시험관내 분석, 약물 처리 시, 배양 세포의 50%에 대한 치사량의 테스트 화합물의 농도)을 통하여 결정할 수 있다. 당업자라면, 과도한 실험을 거치지 않고도 치료에 유효한 양을 결정할 수 있을 것이며, 이러한 정보를 이용하여 인간에서 유용한 투여량을 더욱 정확하게 결정할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 암의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 항암제와 같은 약물과 조합으로 제공될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포사멸을 억제하는 유전자의 클로닝

1-1 세포 배양 및 트렌스펙션

본 실시예에서 사용된 세포는 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, Hyclone), 고글루코스, 페니실린(100unit/ml) 및 스트렙토마이신(100㎍/ml)을 포함하는 배지, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)(Hycolon) 중에서, 37℃ 5%의 CO₂ 환경에서 배양하였다. 트렌스펙션은 기본적으로 Lipoectamine(Invitrogen, USA)을 제조자의 권고대로 사용하여 수행하였다. 그 외, 세포배양에 필요한 시약 및 기구는 Invitrogen사로부터 구입하였다.

1-2 세포사멸을 억제하는 유전자의 클로닝

p53에 의하여 세포사멸이 유도되는 인간 뼈육종 유래의 Saos-2 세포 (American Type Culture Collection, ATCC; Cat. No. HTB-85)에 마우스 고환 cDNA 라이브러리를 도입하였다. 상기 cDNA 라이브러리는 마우스 고환으로부터 Trizol(Invitrogen)을 제조자의 권고대로 사용하여 mRNA를 추출, 정제하고 이를 주형으로 하여 Superscipt II (Invitrogen)을 역시 제조자의 권고대로 사용하여 cDNA를 합성하고 이를 pCEV29 발현벡터 (Michieli et al., 1996;Yamanaka et al., 2001)의 Sfi I 제한효소 부위에 클로닝하여 제작하였다. pCEV29 발현벡터는 MuMLV-LTR (Moloney murine leukemia virus long terminal repeat)프로모터를 통하여 클로닝된 cDNA를 발현하며 G418에 대한 내성을 나타내게 하는 Neomycin-저항성 유전자를 발현한다.

1x10⁶의 Saos-2세포를 직경 100mm의 플레이트에 넣고 10ml의 배양액 (DMEM+10% FBS)에서 2일간 배양한 후 상기 제조한 2 ㎍의 cDNA 라이브러리를 CaPO4법으로 세포에 도입한 후 500㎍/ml의 G418을 배양액에 첨가하여 배양하였다. 약 2주일 후 cDNA-비도입주가 제거되고 나면 G418 첨가를 중단하였으며, 이때 세포는 대략 100-2,000개의 세포를 포함하는 G418 내성의 콜로니를 형성하고 있었다. 그 후 각 콜로니가 직경 약 1mm로 자라면, 이들을 분리하여 각 콜로니를 두 개의 24웰 플레이트의 두 개의 웰에 분리해서 넣고 배양하였다.

상기 세포가 약 50% 정도 무성하게 되면 p53을 발현하는 아데노바이러스 (Jung et al., 2004)를 상기 두 개의 웰 중 한 웰의 세포에 감염시키고 약 3시간 후 배양액을 갈아주었다. 3일 후 p53 발현에 의하여 세포사멸을 관찰할 수 있었다. 일주일 후 세포를 고정하고 김사(Giemsa, Sigma USA) 용액으로 염색한 후 p53 바이러스-감염 웰과 비감염 웰에서의 세포성장을 비교하였다.

p53 발현에 의하여 세포사멸이 적극적으로 일어나지 않은 웰의 콜로니를 분리하여 직경 60mm 플레이트에 옮기고 성장시켰다. 이렇게 분리한 세포에 대하여 다시 p53 바이러스를 감염시켜 상기와 같은 방법으로 p53에 의해 유도된 세포사멸에 대한 저항성을 재확인 한 후, 세포사멸이 확인된 세포로부터 이에 도입된 cDNA를 다음과 같이 분리하였다.

우선, p53-저항성 세포로부터 공지된 방법에 따라 염색체 DNA를 추출하였다. 염색체내로 도입된 pCEV29 발현벡터를 분리해내기 위해 벡터내에 하나만 존재하는 제한효소 XhoI 또는 NotI으로 상기 염색체 DNA (50 μg)를 절단한 뒤 공지된 페놀추출법으로 DNA를 정제하였다. 정제 후, 1.2μg 정도의 DNA를 T4 라이게이즈 (T4 ligase) 로 16℃에서 24 시간 결합시킨 다음, 다시 한번 페놀추출법으로 정제하였다. 아가로스젤 전기영동으로 결합된 DNA 농도를 확인하고, E. coli DH10B 세포주(Gibco-BRL, USA)에 제조자의 권고에 따라 전기충격방법(Gibco-BRL, USA)으로 상기 DNA를 세포내로 도입하였다. pCEV29 발현 벡터는 암피실린(ampicillin, Sigma, USA) 내성 유전자를 포함하므로, 암피실린 포함 배지에서 저항성 콜로니를 선별하였다. 전체 300개 내지 500개의 콜로니를, LB 배지(Luria-Bertani medium, Difco) 로 플레이트 전체를 씻어서 모은 후, 여기에 암피실린을 넣고(100μg/ml) 37℃에서 밤새 배양시킨 후, 그 다음날 세포를 모아서 플라스미드 DNA를 공지의 알칼린-라이시스법으로 분리하였다.

분리한 DNA를 다시 E. coli DH10B 세포에 도입시킨 후, 한 플레이트당 50-100개의 콜로니가 자랄 수 있도록, 4-5 개의 플레이트를 준비하였다. 상기 플레이트로부터 다시 단일 콜로니를 취하여 LB배지에 접종한 후, 단일 플라스미드 DNA를 공지의 알칼린-라이시스법으로 분리하였다. pCEV29 발현벡터에 삽입된 cDNA를 확인하기 위하여, 상기 벡터의 삽입 유전자의 5‘ 및 3’ 부근 각각에 존재하는 염기서열로 구성된 프라이머 (forward:5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'; reverse:5'-CATCAAAAATAGCCAAAAGG-3')를 사용하고, 상기 분리한 각각의 p53 유도 세포사멸 저항성 Saos-2 세포주에서 추출한 pCEV29 발현벡터를 주형으로 사용하여 94℃ 1min, 48℃ 1min, 72℃ 10min을 1주기로 하는 30 주기의 PCR 반응을 수행하였다.

이 방법을 통하여 8개의 p53 유도된 세포사멸 저항성 Saos-2 클론으로부터, 2.2 kb 크기의 유전자를 분리하여, 염기서열 분석키트 (Applied Biosystmes, USA)를 제조자의 권고대로 사용하여 염기서열 분석 후 BLASTN 프로그램(Altschul et al, 1990; http://www,ncbi.nlm.nih.gov)을 사용한 컴퓨터를 이용한 상동성 분석 결과, GenBank AK077015 (마우스) 및 AB002315 (사람)의 일부를 구성하는 서열로서, 추정적인 HECT 영역을 포함하는 것을 확인하였으나, 이는 E3-유비퀴틴 라이게이즈로서의 구체적 기능은 알려진 바가 없다.

상기 유전자를 Rani(Resistance to apoptosis induction)으로 명명하였다.

실시예 2. Rani 유비퀴틴화 활성 측정

Rani 단백질이 기능을 확인하기 위해, Rani이 유비퀴틴-활성 효소 E1 및 E2의 존재 중에서 유비퀴틴과 티오에스테르 복합체의 형성여부를 하기와 같은 실험을 수행하여 관찰하였다.

이를 위해 인간 유래 Rani의 HECT 영역 (Rani-H) 또는 HECT 영역의 720번째 시스테인 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 HECT (Rani-Hc/a) 영역을 코딩하는 서열을 pGEX5X-3(Pharmacia, USA)에 제조자의 권고대로 클로닝하여, 각각 GST(Glutathione S trnasferase)와 융합된 GST-Rani-H 및 GST-Rani-Hc/a 벡터를 제작하여 E. coli (BL21)에서 발현하고 정제하였다. 동 단백질을 E1(Calbiocem, USA) 및 E2(Calbiocem, USA)의 존재 중에서 유비퀴틴 및 ATP와 25℃에서 90분간 반응시켰다. 반응 후, 상기 혼합물을 완충액으로 세척하여 여분의 유비퀴틴을 제거한 후, 공지의 방법대로, 12%의 SDS(Sodium Dodecy Sulfate)-폴리아크릴아미드젤 전기영동(PAGE)을 하여, 나일론 막에 전달한 후, 1차 항체로서, 항-유비퀴틴(Santa Cruze Biotechnology USA) 및 항-GST 항체(Pharmingen, USA), 및 2차 항체로서 항-염소-호스레디쉬 과산화효소-융합 항체 및 Chemiluminescence Detect Kit (Amersham, UK)을 공지의 방법 및 제조자의 권고대로 사용하여 웨스턴블롯을 수행하였다.

도 3에 나타난 바와 같이 유비퀴틴과 결합한 Ran1 단백질은 높은 분자량으로 인하여, 결합하지 않은 것과 전기영동시 이동거리의 차이로 분리할 수 있다. 본 발명의 Rani 단백질은 E1 및 E2의 존재하에서, 유비퀴틴과 복합체를 형성하였으며, 이러한 복합체의 형성은 유비퀴틴과의 티오에스테르 결합을 방해하는 환원제(DTT) 및 시스테인 잔기의 알리닌으로의 돌연변이(Rani-Hc/a)에 의해 손실되었다. 세포내에서의 표적단백질의 유비퀴틴화에 관여하는 E3-유비퀴틴라이게이즈는 통상적으로 E1 및 E2의 존재하에서 유비퀴틴과 티오에스테르 결합을 형성하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 결과는 본 발명의 Rani 단백질, 특히 HECT 영역이 E3-유비퀴틴라이게이즈로서 기능한다는 것을 증명하는 것이다.

실시예 3. Rani 의 세포사멸 억제기능

Rani의 세포사멸 억제기능을 분석하기 위하여 실시예 1에서 클로닝된 전장 본 발명의 Rani cDNA (9-51), 인간 유래의 Rani cDNA, Rani-HECT 영역, 및 상기 각각의 HECT 영역의 720번째 시스테인 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 Rani-HECT 영역을 포함하는 발현 벡터 pCDNA6-v5를 Saos-2 세포에 도입시켜 실시예 1에 기재된 방법대로, Rani 단백질 또는 이의 HECT 영역을 안정적으로 발현하는 세포주를 제작하였다. 상기 각 세포를 24웰 플레이트에 4x10⁴ 씩 넣고 세포배양액 1ml을 첨가하였다. 1일 후 상기 각각의 웰에 p53을 발현하는 아데노바이러스 (Jung et al., 2004)(250 MOI(multiplicity of infection); 50㎍/ml의 시클로헥사미드를 포함하는 TNF-alpha (0.1ng/ml); 및 스토로스포린 (25nM)를 각 웰에 첨가한 후, 아데노바이러스의 경우는 2시간 후 배양액을 갈아주고, 나머지는 24시간이 경과한 시점에 각 웰에 있는 모든 세포들을 각각의 용기에 모으고 나서, 0.4% 트립판 블루(Sigma)로 염색하여 현미경하에서 사멸된 세포의 수를 측정하여 세포사멸을 정량하였다. 음성대조군으로서는 비처리된 Saos-2와 양성대조군으로서는 종전에 세포사멸을 억제하는 것으로 알려진 bclXL을 사용하였다(Jung et al., 2004)).

도 4에 나타난 바와 같이, Rani 단백질은 세포사멸 유도제로 알려진, 다양한 신호 즉, p53, TNF-alpha 및 스토로스포린에 의해 유도된 모든 양성대조군으로서 사용된 종전에 세포사멸억제제로 알려진 bclXL과 거의 동일한 수준으로 세포사멸을 억제함을 알 수 있다. 이러한 세포사멸 억제 효과는 HECT 영역의 720번째 시스테인 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 Rani(Rani ca, Rani-Hca)에서는 상실되며, 이는 HECT 영역 및 상기 아미노산 잔기가 세포사멸의 억제에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.

실시예 4 Rani 에 의한 단백질 분해효소 카스파제 -9 및 카 스파제 -3의 활성 억제

실시예 3에서 사용한 정상 및 변이 Rani 유전자 혹은 이미 세포사멸을 억제한다고 알려진 Bcl-xL 유전자를 발현하는 세포에 TNF-alpha (0.1ng/ml)를 첨가하고 24시간 후에, 카스파제 활성을 측정하였다.

카스파제 활성은 7-아미노-4-트리플루오르메틸 쿠마린(AFC) 에 컨쥬케이트된 DEVD(D:Aspartic acid, E: Glutamic acid, V:Valine에 해당), 및 LEHD(L:Leucine, H:Histidine에 해당)-AFC를 각각 카스파제 3 및 9에 대한 기질로 하여, 형광분석키트(R&D Systems, USA)를 사용하여 제조자의 권고대로 분석하였다. 형광신호는 400 nm의 여기파장 및 505nm의 방출파장에서 마이크로플레이트 형광판독기를 사용하여 측정하였다.

도 5에 보는 바와 같이, TNF-alpha 에 의해, 세포사멸의 증거로서 카스파제 9 및 3의 활성이 증가되지만, Rani를 발현하는 세포에서는 TNF-alpha의 처리에도 불구하고, 상기 카스파제의 활성이 억제되는 것을 볼 수 있다. 이러한 활성의 억제는 HECT 영역의 특정 아미노산이 치환된 Ranic/a의 경우에는 나타나지 않는 것으로 보아, 상기 카스파제 억제 활성이 Rani에 의한 것임을 알 수 있다.

실시예 5. 암조직에서의 Rani 의 과발현

Rani의 과발현은 세포사멸의 억제와 관련이 되어 있기 때문에, 세포사멸의 억제가 관찰되는 대표적 질환인 암에서 Rani의 발현양상을 조사하였다. 이를 위해, 위, 대장 및 간의 정상 및 암조직 유래의 시료를 포함하는 조직 마이크로어레이(US Biomax, Inc, USA) 상에서 면역화화법 및 신호증폭제로서 Tyramide Signal Amplification Kit (NEN Life Science)을 제조자의 권고대로 사용하여 분석을 수행하였다. 본 실험에서는 위암, 대장암, 간암 및 폐암 및 이들 각각의 정상조직에 대하여 각각 61, 124, 57, 및 184개의 시료를 사용하였다.

요약하면, 우선, pH 6.0의 시트르산 완충액 중에서 전자렌지로 가열하여 조직에 포함된 Rani를 노출시켰다. Rani에 대한 항체로는 Rani 단백질 서열의 특정 부위를 포괄하는 펩타이드를 에피토프로 하여 제작한 항체(Zymed, USA)를 사용하였다. 상기 항체를 조직시료에 결합시킨 후, 디아미노벤지딘(Sigma, USA)로 발색하 고, 헤마톡실린 A로 대조염색을 하였다. 음성대조군으로서는 면역되지 않은 래빗 혈청을 사용하였다. 결과는 3인의 병리학자가 독립적으로 판독하여, Rani 항체에 대한 반응 정도를 다음과 같이 4단계로 분류하였다: (1) 음성, 0-5%; (2) 낮음, 5-30%; (3) 중간, 30-50%; (4) 높음, 50% 이상. 정상조직에서는 Rani 발현이 음성 또는 낮음으로 판독되었기 때문에, 본 실험결과에서 중간 및 높은 반응성을 보인 것을 과발현하는 것으로 간주하였다.

도 6에서 보는 바와 같이, 정상 조직과 비교하여, 암조직에서의 Rani의 과발현을 관찰할 수 있었으며, 검사된 위, 대장 및 간 조직시료 중, 각각 48%, 46%, 33%의 조직에서 Rani의 과발현을 관찰할 수 있었다.

상기 결과는 암조직에서의 Rani의 불활성화가 암의 치료에 효과적일 수 있음을 시사하는 것이다.

실시예 6. Rani siRNA 의 암세포 사멸효과

실시예 6-1 siRNA 제작

siRNA 핵산서열은 Ambion website (www. ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)을 사용하여 디자인하였다. 요약하면, Rani cDNA의 AUG 서열에서 시작하여, 3‘ 방향으로 스캔하여 AA 서열이 나오면, 이 서열 및 이후 19개의 핵산서열을 잠재적 siRNA 표적 부위로 선정하였으며, 5' 및 3’ 비번역부위 및 번역개시부위(75 base 내)의 서열을 표적에서 제외하였다. 이렇게 선정된 서열을 공지의 데이터베이스의 서열과 비교하여, 다른 유전자 의 코딩서열과 상동성이 높은 것은 제외하였다. 본 실시예에서 사용한 Rani의 표적서열은 5'-AATTGGTCCCTGAGAACCTTT-3'이며, siRNA를 형성 서열은 다음과 같다: sense, 5'-UUGGUCCCUGAGAACCUUUTT-3' (서열번호 3); antisense, 5'-AAAGGUUCUCAGGGACCAATT-3‘(서열번호 4). Rani 유전자 발현에 영향을 주지 않는 대조군 siRNA로서 Scrambled siRNA를 PROLIGO 사에서 구입하였다. 상기 센스 및 안티센스 서열로 구성되는 헤어핀 구조를 갖는 siRNA의 세포내 발현을 위해서는 Knockout RNAi System (BD-Clontech, USA)BD을 제조자의 권고대로 사용하였다. 요약하면, 상기 sense 및 antisense 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제조자의 권고대로 합성하여 이를 pSIREN-Retro Q(BD-Clontech, USA)에 제조자클로닝하여 Rani를 표적으로 하는 siRNA를 발현하는 벡터(RNAi-Ready)를 제조하여, 세포의 트렌스펙션에 사용하였다.

실시예 6-2 RNA interference 분석

293 세포를 24-웰 플레이트의 각 웰에 3 x 10⁴세포의 농도로 파종하여 하루 밤 배양 한 후, 세포에 제조자의 권고대로 Lipofectamine 2000 (Invitrogene)를 사용하여, 상기 RANi-Ready를 웰당 40 pmole 농도로 24시간 동안 처리하였다. 처리 후, 세포를 0.4% 트립판 블루(Sigma)로 염색하여 현미경하에서 사멸된 세포의 수를 측정하여 세포사멸을 정량하였다.

도 7에서 보는 바와 같이, siRNA의 도입에 의해 세포사멸이 처리하지 않은 세포에 비하여 현저하게 증가하는 것을 알 수 있다. 이는 도 8의 결과와 함께, Rani 발현을 억제함으로서 세포, 특히 암세포에서의 사멸에 효과적으로 사용될 수 있음을 제시하는 것이다.

실시예 7 Rani siRNA 의 세포사멸 유도 및 항암제에 대한 감수성 증가

실시예 6-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 siRNA 처리된 세포(대장암 세포주 H1299)에 공지의 항암제인 시스플라틴(Bristol-Myers Squibb Company, USA), 독소루비신(ALZA Pharmaceuticals, USA), 및 에토포시드(Bristol-Myers Squibb Company, USA)를 각각 73μM, 2μM, 및 5μM 의 농도로 처리하여, 세포사멸 효과를 조사하였다.

도 8에서 보는 바와 같이, siRNA 단독 또는 항암제 단독으로 처리한 경우와 비교하여, 아들을 조합하여 처리한 경우, 그 효과가 최대 약 4배까지 향상됨을 알 수 있다.

이러한 결과는 Rani siRNA 뿐만 아니라, 이를 공지의 항암제와 조합으로 사용시 항암 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 제시하는 것이다.

본 발명의 Rani 단백질은 세포사멸을 실행하는 단백질 분해효소 카스파제의 활성을 억제하여 세포사멸을 효과적으로 억제하며, 나아가 Rani 억제제는 세포사멸이 억제된 암세포에서의 세포사멸을 효과적으로 유도할 수 있기 때문에, Rani은 비정상적 세포사멸과 관련된 질환, 예를 들면 퇴행성 뇌신경질환, 자가면역 질환 및 암 등의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

<110> GENCROSS <120> A NOVEL USE OF Rani AS AN APOPTOSIS REGULATOR <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5402 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (463)..(2943) <223> Coding sequence 463 to 2943 <400> 1 gccggttccc aggccgggtg gagaccaact ctggggtctc ttggtgggag agtggggagc 60 ccgtcttctg ctgagtgctg ccgccccttc ccaggacagc ggaggtggaa cttcgtcgcg 120 ctgcaacccc cggctcggga tcctggggcg tcctttggca gttgattgca ccctgcacta 180 gagagaagtc caggaatgat atattcttgg gctgtatttc tctaccctgg agttcatcca 240 gttcatccca gaaacactga cctgattact gtgacaaagt ctgatggata gaccctttct 300 gttgaccttg tggcgttttt ctttcatgtg gaagttggaa gacaaggtga aaggggccaa 360 aagttacctg ctttggtgaa taggagtgct ctacttggtt ctcagaacat gggccctcgt 420 ttaaagctgc agctgtgatc ctcggctgtc tgttggcatt gacgggacct gatgttttac 480 gttattggtg gaatcacagt gtctgtggtt gcattcttct tcacaattaa gttcctcttt 540 gagcttgccg cacgtgtagt cagcttcctc cagaatgagg accgcgagcg ccgaggggac 600 cggactattt atgactacgt gcggggaaat tacctggatc cccggtcttg caaagtctcc 660 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gtgagcattt actttgaggc ttacctttac aatgctaaca 1080 actgtaccag cacaccatgg catcttcctc ccatgcacat gagctcttct caacgccggc 1140 cctccactgc tattgaggag gacgatgaag actcaccctc agagtgtcac acccctgaga 1200 aggtgaagaa accgaagaag gtgtactgct atgtgtcacc aaagcaattc tctgtgaagg 1260 aattctacct gaaaatcatc ccctggcgcc tctacacctt ccgagtgtgc ccaggaacaa 1320 agttttcata ccttggccct gaccctgttc acaagctcct cacgctggtg gtggatgacg 1380 gcattcagcc tccagtggag ctcagctgta aagaaaggaa tatcctagca gccactttca 1440 tccgttcctt gcacaagaac attggaggct ctgagacctt tcaagacaag gtgaactttt 1500 tccagagaga gcttcggcag gtacatatga agagacctca ttccaaagtc actctgaagg 1560 tcagcagaca cgccttgttg gagtcgtctt tgaaggccac tcggaacttt tccatctcag 1620 actggagcaa gaactttgaa gtagttttcc aggatgagga agctttggat tggggagggc 1680 ctcgccggga atggtttgag ctaatctgca aagcactgtt tgacaccacc agtcagctct 1740 tcgcccggtt cactgacagc aaccaagcac tagtgcatcc taaccctaac cgcccggctc 1800 acctgcgctt gaagatgtat gagtttgcag ggcggctggt gggcaagtgt ttgtatgaat 1860 cctctctagg gggagcctac aagcagttgg tccgtgcccg gttcactcgg tctttcctgg 1920 cccaaatcat aggactccgt atgcattaca agtactttga aacggatgac ccagaattct 1980 ataagtccaa ggtgtgcttt atcctcaaca atgacatgag tgagatggag ctggtctttg 2040 cagaagagaa atacaacaaa tcaggtcaac tggataagat tgtagaactc atgacaggcg 2100 gagctcaaac cccagtcacc aatgcaaata aaatcttcta tttaaacctg ctggctcagt 2160 atcggctggc cagtcaagtg aaagaggagg tggagcattt cctgaaaggc ttgaatgagc 2220 tggttcctga gaacctcctg gctatttttg atgagaatga gcttgagctg ctgatgtgtg 2280 ggactggaga catcaatgta tctgacttca aagcccatgc tgtagtggtt ggtggatcct 2340 ggcatttcag agaaaaggtc atgaggtggt tttgggctgt ggtttccagt ctgacccagg 2400 aggaactggc taggctgctt cagtttacaa caggctcttc tcagctccca cctggaggat 2460 ttgctgccct ctgtccctca tttcagatta ttgctgctcc aacccatagc acgcttccta 2520 ctgcacacac atgttttaac caactgtgcc tccctacata tgactcatat gaagaggtgc 2580 acaggatgct acagctggcc atcagtgagg gttgcgaggg ctttggcatg ctctgaccgc 2640 tcctctgtca cctgcttggc tcccaagctc tctagagcat ctggacacat gttaacaagc 2700 atagccactg accttaacca caaccattag ccagaagata ctgcatgctc ccttgtgtct 2760 ggagtattct gtcatctgca agccctgttc ttacctcacc tgtccacgtt caccacaggc 2820 cacttgagca cgtggcacct atctgagctc tactcagtca tgagaggagg accatgctgc 2880 tgtcacttcg ttggtccctt gaagatctct gtgaccggat ctgcctccgt ggctgggaga 2940 cattcataac acagaggact cagttctgtt ggaaagccag catgtgagac ccttccacca 3000 tgcctcattc cagccctcct tgagctcact acttgaccag actgggtaat gcatcacctc 3060 ttctcatcag tggtcaggag aagtgcagct agaaagtggc ccacacaagc cgtctgattt 3120 gtcctcccac ataatggcag gcacaggcca tggcactgga ttagttctca tggggactgg 3180 tagtacaaaa ggatgtcttt aaggtgacag aactggaaaa gatactccct gtgggcattt 3240 ttaaagatga tcattaatct ataaggaatt tgctaagctt tctcttgaat ttgagccagt 3300 gagaaaagca gtcagaagaa tgtgaaggat gtctgcgctg cagcctccag tgctgggtac 3360 gcttctctcg tggggaaggg ccgtgtccag gcatgtggat ggcttgaaga ctagctgatg 3420 ctttcctctg aattgttctt tgcactgaag gaggacttgg actgacctcc gacttacata 3480 gtttgttaag agctgtcttt agcattctgc tggaagaatt ttgggagcaa cagactggga 3540 cagagcctgc cagctgtggt ggtgatcttt ggcagtgcta aggcaaagga gcggtgaagc 3600 cactggggac agacaaggtg gagacccagc agcagtaaat acctagcaat tccaaggact 3660 tggtttcatc agttaccagg aagtggggga accatggagg gagaacgcta tattgggttc 3720 acagttacat ggtgatcaaa gagaacttct cagtctccag gaagatagca tcttttcatg 3780 agtgtttgaa tgaaaacaac acgaaggctc aatacc 3816 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand for Rnai siRNA, all the "T"s except last two "T"s are U in siRNA <400> 3 ttggtccctg agaacctttt t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand for RNAi siRNA, all the "T"s except last two "T"s are U in siRNA <400> 4 aaaggttctc agggaccaat t 21

Claims

Rani 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 유효성분으로 포함하는 세포사멸 조절제.
제 1 항에 있어서, Rani 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체는 Rani 단백질의 HECT 영역과 관련된 것을 특징으로 하는 세포사멸 조절제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 세포사멸의 과다 활성과 관련된 질병의 치료 또는 예방용인 것을 특징으로 하는 세포사멸 조절제.
제 3 항에 있어서, 세포사멸의 과다 활성과 관련된 질환은 퇴행성 뇌신경계 질환, 뇌졸중, 자가면역질환인 것을 특징으로 하는 세포사멸 조절제.
Rani 유전자 또는 단백질 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 치료보조제.
제 5 항에 있어서, 상기 억제제는 암세포의 항암제에 대한 민감성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 치료보조제.
제 5 항 또는 제 6 항에서, 상기 억제제는 센스가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중가닥 분자로서, 상기 센스가닥은 서열번호 1 또는 2로부터 선택되는 표적서열에 상응하는 라이보뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 상기 센스가닥에 상보적인 라이보뉴클레오타이드 서열이며, 상기 이중가닥 분자는 Rani 유전자 및 단백질의 발현을 방해하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 치료보조제.
제 7 항에 있어서, 이중가닥 분자는 서열번호 3 또는 4의 서열인 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 치료보조제.
Rani 유전자 또는 단백질 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 세포사멸의 과소 활성과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 유용한 약학적 조성물.
제 9 항에서, 억제제는 센스가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중가닥 분자로서, 상기 센스가닥은 서열번호 1 또는 2로부터 선택되는 표적서열에 상응하는 라이보뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 상기 센스가닥에 상보적인 라이보뉴클레오타이드 서열이며, 상기 이중가닥 분자는 Rani 유전자 및 단백질의 발현을 방해하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 서열번호 3이며, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 4의 서열인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 10 항에 있어서, 세포사멸의 과소 활성과 관련된 질환은 암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 12 항에 있어서, 유효성분으로서 항암제와 조합으로 사용되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
Rani 유전자 또는 Rani 단백질의 발현, 또는 Rani 유전자의 변이 검출 수단을 포함하는 세포사멸관련 질환 진단용 키트.
Rani 유전자의 발현 조절물질, Rani 단백질의 발현조절물질, Rani 단백질의 기능조절물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 스크리닝하는 방법에서, 상기 물질은 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의해 얻어진 물질, 천연 유래의 물질 또는 그들의 유도체인 물질로서, 상기 물질을 (1) Rani 유전자의 전사 제어 영역 및 Rani 유전자 또는 리포터(reporter) 유전자를 포함하는 형질전환 세포 또는 시험관 내 발현시스템과 접촉시켜 Rani 유전자 또는 리포터 유전자의 발현량을 검출하는 단계, 또는 (2) Rani 단백질의 존재 중에서, 표적 분자와 접촉시켜 Rani 단백질의 세포사멸 억제기능을 측정하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법.