KR101217705B1

KR101217705B1 - 신규한 세포사멸 및 노화 조절제로서의 ｋｉａａ1764 용도

Info

Publication number: KR101217705B1
Application number: KR1020100046332A
Authority: KR
Inventors: 신득용
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-05-18
Filing date: 2010-05-18
Publication date: 2013-01-09
Also published as: KR20110126851A

Abstract

본 발명은 신규한 세포사멸 또는 세포노화 조절용 유전자인 KIAA1764, 상기 유전자 또는 그의 단백질을 포함하는 세포사멸 과소 활성과 관련있는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 KIAA1764를 이용한 세포사멸 촉진제 또는 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 세포사멸 및 노화 조절제로서의 ＫＩＡＡ1764 용도{A NOVEL USE OF KIAA1764 AS A REGULATOR OF, APOTOPSIS AND SENESCENSE}

본 발명은 신규한 세포사멸 및 노화 조절제로서의 KIAA1764 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 신규한 세포사멸 또는 세포노화 조절용 유전자인 KIAA1764, 상기 유전자 또는 그의 단백질을 포함하는 세포사멸 과소 활성과 관련있는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 유전자의 전사 제어 영역 및 상기 유전자 또는 리포터(report) 유전자를 포함하는 형질전환 세포 또는 시험관내 발현 시스템을 이용한 세포사멸 촉진제 또는 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

세포사멸(apoptosis)은 진핵세포에서 나타나는 세포의 파괴 또는 자살을 의미하는 것으로, 동물의 정상적인 발생을 조절하거나, 불필요하거나, 비정상적인 세포를 제거하는 등을 포함하는 개체의 항상성 유지를 위한 기본적인 세포내 과정이다. 세포사멸은 다양한 외부 및 내부 자극에 반응하여 발생하게 되는데, 세포사멸의 진행과 함께, 세포질의 파괴, 세포막의 기포 형성(blebbing), 세포 골격의 변화, 세포 수축, 염색체의 응축 및 DNA 분절화 등과 같은 특징적인 변화가 일어난다⁸.

이러한 세포사멸은 생리적으로 매우 중요한 현상으로, 생체내 복잡한 기전에 의해 정교하게 조절되고 있으며, 비정상적인 조절로 인한 부적절한 세포사멸의 유도, 즉 세포사멸의 억제 또는 촉진은 많은 질환과 연관되어있다.

구체적으로, 과도한 세포사멸은 특정 세포의 파괴와 이로 의해 매개되는 생체내 기능 상실을 유발할 수 있으며, 중추신경계 질환, 예를 들면, 다수의 급성 및 만성 퇴행성 질환(예컨대, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌허혈증/뇌졸증)^{13, 20, 21, 18}, 심혈관계 질환²⁷, 및 그레이브스 병 및 제2형 당뇨병 등과 같은 자가면역 질환^16,12과 관련되어 있다.

한편, 세포사멸의 비정상적인 억제와 관련있는 대표적인 질환으로는 암이 있다. 즉, 세포사멸의 과소 활성으로 인해 적절하게 제거되지 못한 종양 세포의 축적이 암 발생과 밀접하게 관련있는 것으로 알려져 있다²².

따라서, 세포사멸을 조절하는 인자 및 조절 기전의 규명을 통해 다양한 질환의 발생 기전을 이해할 수 있어, 이러한 세포사멸과 관련된 질환의 치료/진단제 개발에 유용하게 사용할 수 있다. 이와 관련하여 지금까지 세포사멸에 이르는 각 단계에서 작용하는 다수의 세포사멸 조절 인자들이 공지되어 있다.

세포사멸에 이르는 경로는 크게 세포사멸 수용체를 경유하는 경로와 그렇지 않은 경로로 분류할 수 있다. 전자는 세포내 특정 리간드가 이의 수용체 결합하여 유도되는 세포사멸로서, 이에 관여하는 수용체로는 Fas, TNFR(tumor necrosis factor receptor 1), TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand) 등이 있다. 후자는 스트레스에 의해 유발되는 세포사멸로서, 세포사멸을 유발할 수 있는 스트레스로는 자외선, 열 쇼크, 감마선 조사, 저산소 상태 등이 있다. 이러한 자극에 의해 유발된 세포사멸은 하류 단계에서 작용하는 인자들을 경유하여 완결되며, 대표적인 것이 카스파제 단백질분해효소이다. 이들은 세포사멸에 이르는 신호전달 경로에서 순차적으로 작용하는 단백질 군으로서, 특정 아미노산(아스파테이트) 부위를 절단하여 일련의 단백질을 활성화시킴으로서 세포사멸에 관여한다.

따라서, 상기 일련의 단계에서 작용하는 다양한 인자들이 세포사멸을 조절하는데 표적이 될 수 있으며, 예를 들면, Walczak 등²⁴은 세포 수용체를 경유하여 유도된 세포사멸 촉진 인자로서 TRAIL 단백질의 암치료제로서의 용도를 개시하였다. 또한, Fulda 등⁴은 세포 수용체-유도된 세포사멸 조절의 표적으로서 Fas-L의 용도를 제안하였다.

나아가, 세포사멸 유도와 관련된 대표적인 단백질로는 p53을 들 수 있으며, Myc와 같은 발암 유전자에 의해 비정상적인 세포 성장을 보이는 세포에서 p53이 세포사멸의 매개자로서 이러한 세포의 제거에 관여한다는 것이 밝혀졌다^{22, 23}. p53은 손상된 DNA의 수리와 세포주기 조절에 관여하는 대표적인 종양 억제 단백질로서, 특정 유전자의 프로모터내 표적 서열에 대한 높은 친화성을 가진 전사 조절 인자로 작용하여 표적 유전자의 발현을 전사수준에서 조절함으로써, 세포의 분열을 억제하거나 또는 손상된 DNA를 갖거나 비정상적인 분열을 하는 비정상적인 세포를 선택적으로 파괴하여 이들 세포의 암으로의 진행을 막는데 중요한 역할을 한다¹⁵.

WO 03/076647에는 세포사멸의 하류단계에서 세포사멸 및 세포주기 조절제로서 기능하는 JADE 유전자, 단백질 및 이를 이용한 세포사멸 조절 물질의 스크리닝 방법이 개시되어 있다.

한국 특허출원공개 2001-113088에는 카스파제에 의해 활성화되는 특정 DNase와 상호작용하여 세포사멸을 조절하는 CIA 단백질, 유전자 및 이의 용도가 개시되어 있다.

한국 특허출원공개 2002-40521에는 세포사멸을 이용한 마이크로락톤을 포함하는 항암제가 개시되어 있다.

그러나, 다양한 자극에 반응하여, 서로 상호작용하는 복잡한 단계에 의해 유도되는 세포사멸 기전에 대한 정확한 이해와, 이를 기반으로 특정 질환에 특이적이고 부작용이 적은 효과적인 치료/진단제를 개발하기 위한 세포사멸의 조절에 관여하는 추가적인 인자의 개발이 필요한 실정이다.

국제특허공개 WO 03/076647 한국 특허출원공개 2001-113088 한국 특허출원공개 2002-40521

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본 발명의 목적은 신규한 세포성장, 세포사멸 또는 세포노화 조절용 유전자 또는 단백질을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 세포성장, 세포사멸 또는 세포노화 조절용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 세포사멸 촉진제 또는 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

이에, 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 세포성장, 세포사멸 또는 세포노화 조절용 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 코딩하는, 세포사멸 또는 세포노화 조절용 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 세포사멸 조절용 유전자를 발현가능하게 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 세포사멸 또는 세포노화 조절용 단백질, 상기의 세포사멸 또는 세포노화 조절용 유전자, 또는 상기의 재조합 벡터를 포함하는, 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 유전자의 전사 제어 영역 및 상기 유전자 또는 리포터(report) 유전자를 포함하는 형질전환 세포 또는 시험관내 발현 시스템에, 후보 물질을 접촉시키는 단계; 상기 유전자 또는 리포터 유전자의 발현량을 검출하는 단계; 및 상기 발현량이 증가된 경우 상기 후보 물질을 세포사멸 과소 활성과 관련있는 질환의 치료 또는 예방용 물질로 선정하고, 상기 발현량이 감소된 경우 상기 후보 물질을 세포사멸 과다 활성과 관련있는 질환의 치료 또는 예방용 물질로 선정하는 것을 특징으로 하는, 세포사멸 촉진제 또는 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 KIAA1764 유전자는 세포의 성장, 사멸 및/또는 세포노화를 촉진시켜, 이와 관련된 질환의 치료 및 예방에 유용하다. 또한, KIAA1764의 발현에 관여하는 물질을 스크리닝함으로써, 세포사멸 및/또는 세포노화와 관련있는 질환의 치료제를 개발할 수 있다.

도 1은 사람의 KIAA1764 유래의 유전자인 KIAA1764-1(EAW87120), KIAA1764-2(NP_208325.3), 마우스의 KIAA1764 상동체(AK004646), 마우스의 잘린(truncated) cDNA인 11-61 등 세 개의 cDNA의 일차 구조를 도식적으로 표시한 것이다.
도 2는 사람 KIAA1764 유래의 두 종류의 cDNA 및 마우스의 KIAA1764 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 3은 KIAA1764 유래의 두 종류의 cDNA가 코딩하는 단백질 서열 차이를 염색체 상의 엑손 및 인트론 구조를 기반으로 표시한 것이다. 두 종류의 cDNA는 KIAA1764-1은 1번 엑손의 ATG에서 시작되고, KIAA1764-2는 2번의 a엑손의 ATG에서 시작되는 것으로 보인다.
도 4는 인간 유래의 섬유모세포주, WI38 및 인간 암 유래의 세포주, 사람 육정암 세포주(SaOs-2) 및 대장암 세포주(HCT116)의 mRNA를 RT-PCR법으로 KIAA1764-1 및 -2의 mRNA의 존재 여부를 확인한 것이다. 이 결과에 따르면 정상 및 암세포에 두 종류의 mRNA가 모두 존재하는 것으로 보인다.
도 5는 11-61로 명명한 절단형 cDNA를 발현하는 사람 육종암 세포주인 SaOs-2 세포와 대조군의 SaOs-2 세포에 0, 50, 150 MOI의 p53 아데노바이러스를 감염시킨 후, 6일 후에 세포의 노화를 측정하는 노화-관련 베타-갈락토시다제(SA-beta-Gal)의 활성을 측정한 것이다. 11-61 cDNA를 발현하는 세포에서 p53유전자의 발현에 의해 노화 마커인 SA-갈락토시다제 활성이 증가됨을 보여준다.
도 6은 두 종류의 KIAA1674 유래의 cDNA, KIAA1764-1와 KIAA1764-2를 각각 발현하는 사람 육종암 세포주인 SaOs-2 세포와 대조군의 SaOs-2 세포를 p53 아데노바이러스를 감염시킨 후, 일정 시간이 지난 후에 세포의 노화를 측정하는 SA-beta-Gal 활성을 측정한 것이다. KIAA1764-1, -2를 발현하는 세포에서 p53유전자의 발현에 의해 노화 마커인 SA-갈락토시다제 활성이 증가됨을 보여준다.
도 7은 두 종류의 KIAA1674 유래의 cDNA, KIAA1764-1와 KIAA1764-2를 각각 발현하는 사람 육종암 세포주인 SaOs-2 세포와 대조군의 SaOs-2 세포를 p53 아데노바이러스를 감염시킨 후, 일정 시간이 지난 후에 세포사멸을 측정한 것이다. KIAA1764 유래의 cDNA를 발현하는 세포에서 p53 유전자의 발현에 의한 세포사멸이 증가됨을 보여준다.
도 8은 KIAA1764-1 유전자를 발현하는 HCT116 대장암 세포와 대조군 HCT116 세포에 DNA 손상을 유발하는 항암제 독소루비신을 24시간 처리한 후 세포성장을 측정한 것이다. KIAA1764-1을 발현하는 암 세포주는 대조군에 비해 세포의 성장이 현저하게 감소하였다.
도 9는 인간 유래의 KIAA1764-1을 발현하는 골육종 세포 Saos2와 대장암 세포주 HCT116 및 대조군 세포주에 DNA 손상을 유발하는 항암제 독소루비신을 24시간 처리한 후, 6일 후에 노화를 측정하는 SA-갈락토시다제 활성을 측정한 것이다. KIAA1764를 발현하는 세포에서 DNA 손상에 의해 노화 마커인 SA-갈락토시다제 활성이 증가됨을 보여준다.
도 10은 KIAA1764 유전자를 발현하는 대장암 세포주 HCT116과 대조군 HCT116세포를 누드 마우스에 주입하여 종양 형성을 비교한 결과, KIAA1764를 발현하는 암 세포의 종양 형성 능력이 대조군에 비하여 현격하게 감소함을 나타낸 것이다.
도 11은 KIAA1764 유전자를 발현하는 대장암 세포주 HCT116과 대조군 HCT116 세포를 누드마우스에 이식하여 100일간 성장시킨 후, 독소루비신을 처리하면 KIAA1764 유전자를 발현하는 HCT116 세포주가 대조군 HCT116 세포에 비하여 동일 항암제에 대한 감수성이 현격하게 증가됨을 나타낸 것이다.

본 발명은 KIAA1764 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 포함하는 세포사멸 및/또는 세포노화 조절제를 제공한다. 상기 세포사멸 또는 세포노화 조절제는 세포사멸 촉진 또는 세포노화 촉진 조절제이다.

상기 KIAA1764 단백질, 이를 코딩하는 유전자 서열은 다양한 포유동물 유래의 것이 사용될 수 있지만, 바람직하게는 인간 유래이며, 이들은 인간 및 비-인간 포유동물 종의 모든 세포 유형에 존재하는, 천연의 서열 공급원으로부터 정제되거나, 화학적으로 합성되거나, DNA 재조합 기술에 의해 생성되거나, 이들 및/또는 기타 방법의 조합에 의해 제조된 모든 것을 포함하는 것이다. 바람직하게는, 상기 KIAA1764 단백질은 서열번호 2 및 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되며, 상기 KIAA1764 유전자는 서열번호 2 및 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 코딩하는 핵산 서열로 구성되며, 더 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열로 구성된다.

나아가, 본 발명의 KIAA1764 단백질, 이를 코딩하는 유전자에는 그의 기능적으로 동등한 변이체가 포함된다. 본 발명의 목적상 기능적으로 동등한 변이체란 통상적으로 발견되는 천연 서열과 대등한 생물학적 활성을 나타내는 화합물을 가리킨다. 본 발명의 목적을 고려하면, 기능적으로 동등한 변이체는 세포사멸을 억제할 수 있는 것을 의미한다. 구체적으로, 기능적으로 동등한 변이체는 유전자의 경우, 서열번호 1 또는 3으로부터 유래한 것이다.

또한, 이러한 기능적으로 동등한 변이체는 세포사멸 억제의 활성을 갖는 한, 유전자서열을 구성하는 뉴클레오타이드, 또는 단백질 서열을 구성하는 아미노산 서열이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 서열변이체를 포함한다.

상기 단백질 서열 변이는 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어, 부위-유도성 돌연변이법(site-directed mutagenesis, Kramer, W.& Fritz, H-J. Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplux DNA. Methods in Enzymology, 154, 350-367, 1987) 등에 의해 제조될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 서열 변이는 자연적으로도 발생한다.

상기와 같은 서열의 변이는 단백질을 이루는 아미노산 서열 변이를 수반하거나 또는 수반하지 않을 수도 있다. 예를 들어, 단백질 서열 변이가 폴리펩타이드 중의 아미노산의 변이를 수반하지 않는, 축중변이가 있으며, 이러한 축중변이체(degeneracy mutants)도 본 발명의 유전자에 포함된다.

KIAA1764 단백질과 기능적으로 동등한 변이체를 암호화하는 유전자는 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 혼성화 기술(Southern, E.M., Journal of Molecular Biology, 98, 503, 1975)이나 PCR 방법(Saiki et al., Science, 230: 1350-1354, 1985; Saiki et al., Science, 239: 487-491, 1988)을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 당업자라면 상기 언급한 KIAA1764 단백질 서열로부터 KIAA1764 유전자에 특이적으로 혼성화될 수 있는 프라이머를 고안하여 KIAA1764 유전자와 높은 상동성을 가지는 유전자를 분리할 수 있을 것이다.

이렇게 분리된 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 아미노산 수준에 있어서, 천연 KIAA1764 단백질과 높은 상동성을 갖는다. 높은 상동성이란 아미노산 서열 전체에서, 50% 이상, 특히 70% 이상, 보다 특히 90% 이상(예를 들어, 95% 이상)의 서열의 동일성을 가리킨다.

아미노산 서열이나 염기서열의 상동성은 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993)에 기초하여 개발된 BLASTN 이나 BLASTX라 불리는 프로그램²을 사용하여 분석될 수 있으며 구체적인 방법은 다음의 웹사이트에 공지되어 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).

또한, KIAA1764 단백질, 이를 코딩하는 유전자는 이의 천연서열과 대등한 생물학적 활성을 갖는 단편을 또한 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 단편은 유전자 또는 단백질의 일부에 해당하는 서열로서, 유전자의 경우, 물리적, 엔도뉴클리에이즈 또는 화학적으로 절단한 것을 포함하며, 단백질의 경우, 프로테이즈로 절단한 것이나, 화학적으로 절단한 것을 모두 포함한다. 나아가 단백질의 경우, KIAA1764 단백질의 안전성, 저장성, 용해도 등의 변경을 위한 변이체, 또는 상호작용하는 다른 단백질과의 상호작용의 변경을 위한 변이체도 상기 기능적으로 동등한 변이체에 포함된다.

또한, 본 발명은 KIAA1764 유전자를 발현가능하게 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 KIAA1764 유전자 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체는 본 발명의 목적 달성을 위해, 그 자체로 또는 벡터에 포함되어 사용될 수 있으며, 벡터로의 DNA 도입방법은 당업계에 공지되어 있다 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.,Sambrook and Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; Current Protocols in Molecular Biology Ausubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith and Stuhl eds, Greene Publ.Assoc., Wiley-Interscience,1992). 본 발명의 한 구현예에서는 진핵세포에서의 발현을 위해 pCEV29 (Michieli et al., 1996; Yamanaka et al., 2001) 벡터로 도입되어 사용되었다.

세포에서의 발현 및/또는 증폭, 및 다른 면에서는 염색체내로 도입 또는 염색체와 독립적으로 세포에 존재할 수 있는 다양한 벡터가 공지되어 있으며, 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 형태의 벡터, 또는 그 외 목적달성에 적합한 임의의 벡터를 포함한다. 나아가, 이러한 벡터는 세포표면에 수용체에 대한 리간드 또는 핵산결합 모이어티 (예를 들면 폴리리신 결합 부위) 등을 포함하는 (예를 들면, WO 93/04701에 기술된 것) 화학적 컨쥬게이트 벡터, 바이러스 벡터 (예를 들면, DNA 또는 RNA 바이러스), 도입된 단백질과 융합되어 발현되는 융합단백질 모이어티(예를 들면, 세포의 항원을 인식하는 항체 모이어티, 분리 및 검출의 용이성을 위한 Glutathione S-transferase 또는 형광단백질 모이어티)를 포함하는 융합단백질발현 벡터를 포함하며, 목적에 적절한 벡터의 선택은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 KIAA1764 유전자는 유전자치료 시스템 등에 사용되는 발현벡터, 예를 들면 아데노바이러스벡터에 도입되어 공지된 방법에 따라 전달체로서 바이러스입자에 포함되어 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 KIAA1764 폴리뉴클레오티드 및 상기 기재된 모든 변이체는 폴리펩타이드 합성에 대한 공지의 유기화학적 방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 또한 목적하는 완전한 길이의 서열을 얻기 위하여 단편으로 합성된 서열들을 서로 결합할 수 있다(The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1-9, Gross, Udenfriend and Meienhofer Ed. 1979-1987, Academic Press Inc.). 특히, 본 발명에 따른 KIAA1764 폴리뉴클레오티드, 이의 단편, 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체는 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이 바람직하다. 천연 KIAA1764 폴리뉴클레오티드를 적당한 숙주세포에서 발현시킨 후 세포의 융해물을 만들거나, 또는 KIAA1764 mRNA를 시험관내에서 번역한 후, 당업계의 공지된 단백질 분리방법에 의해 정제할 수 있으며, 일반적인 유전자 재조합 기술 및 단백질 정제방법은 예를 들면 문헌 (Sambrook et al., Molecular Clonning: A Laboratory Mannual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al Ed., Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience 1991)을 참조하면 된다. 이러한 본 발명의 KIAA1764 폴리펩타이드는 예를 들면 정제된 단백질, 수용성 단백질, 또는 표적 세포로의 전달 또는 투여를 위해 담체에 결합된 형태의 단백질 또는 아미노산 잔기와 융합된 형태의 것을 포함하는 것이다.

본 발명의 KIAA1764의 세포내 발현은 p53 등에 세포노화 및 세포사멸을 현저하게 촉진하였다. 이러한 결과는 본 발명의 KIAA1764 유전자가 새로운 세포사멸 촉진 기능을 가짐을 증명하는 것으로서, 세포사멸을 촉진시키는 본 발명의 KIAA1764 단백질은 세포사멸 과소와 관련된 질환의 치료 및 예방제로서 유용할 수 있음을 나타내는 것이다.

따라서, 본 발명은 KIAA1764 세포사멸 또는 세포노화 조절용 단백질, KIAA1764 세포사멸 또는 세포노화 조절용 유전자, 또는 KIAA1764를 발현가능하게 포함하는 재조합 벡터를 포함하는, 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물은 세포사멸 과소 활성과 관련있는 질환의 예방 또는 치료용일 수 있다. 이러한 세포사멸의 과소 활성과 관련된 질환으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 특히 p53의 불활성화에 의한 암, 예컨대 암을 포함한다^{21, 22}.

또한, 본 발명의 KIAA1764는 항암제에 대한 세포 민감성을 증가시켜, 항암제의 효과를 배가시키는 효과를 보인다. 따라서, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 항암제를 추가로 포함하거나 또는 항암제와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 항암제는 본 발명의 KIAA1764 유전자 또는 단백질 발현 억제제와 조합으로 사용되어 상기 효과를 달성하는 한, 당업계에 공지된 것이 사용될 수 있으며, 이로 제한하는 것은 아니나, 시스플라틴, 독소루비신 및 에토포시드를 포함한다.

또한, KIAA1764 유전자가 세포사멸과 밀접한 관련이 있다는 것이 밝혀졌으므로, KIAA1764 코딩서열 또는 그 조절영역 예를 들면, 프로모터 및 인핸서 등에 특정 변이, 예를 들면, 특정 핵산 서열의 치환, 결실 부가 등이 존재하여 KIAA1764의 기능이 저하되거나, 유전자 또는 단백질이 발현이 감소될 수 있다. 따라서, KIAA1764 코딩서열, 그 조절영역을 포함하는 유전자의 변이를 검사하여, 그 차이점을 정상 유전자와 비교함으로써, 세포사멸관련 질환에 걸릴 위험성을 미리 판단할 수 있다. 유전자 서열의 변이 및 정상 서열과의 차이는 당업계의 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있으며, 이로 제한하는 것은 아니나, 예를 들면, cDNA 염기서열분석, PCR-SSCP (single strand confimration polymorphism), PCR-SSO (sequence-specific oligonucleotide) 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 세포사멸 및/또는 세포노화 촉진제 또는 억제제, 구체적으로는 세포사멸 관련 질환 치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 KIAA1764 유전자의 전사 제어 영역 및 상기 유전자 또는 리포터(report) 유전자를 포함하는 형질전환 세포 또는 시험관내 발현 시스템에, 후보 물질을 접촉시키는 단계; 상기 유전자 또는 리포터 유전자의 발현량을 검출하는 단계; 및 상기 발현량이 증가된 경우 상기 후보 물질을 세포사멸 과소 활성과 관련있는 질환의 치료 또는 예방용 물질로 선정하고, 상기 발현량이 감소된 경우 상기 후보 물질을 세포사멸 과다 활성과 관련있는 질환의 치료 또는 예방용 물질로 선정하는 것을 특징으로 하는, 세포사멸 촉진제 또는 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 물질은 천연, 합성, 반합성 화합물, 천연, 재조합, 합성한 생체 물질, 또는 그들의 유도체인 물질인 것이 바람직하다.

상기 단계에서 리포터 유전자로는, 예를 들면, 클로르암페니콜 아세틸 전이효소(CAT), 베타-갈락토시다아제(β-Gal), 루시퍼라제(luciferase) 등을 이용할 수 있다. KIAA1764 유전자의 발현조절 물질은, 예를 들면, KIAA1764 유전자의 전사조절 영역(프로모터, 인핸서)을 리포터 유전자의 번역 영역의 상류 또는 하류에 연결한 발현 벡터를 구축하여 적당한 배양세포 등에 도입하고, 그 배양세포에 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의해 얻어진 화합물 또는 천연 유래의 화합물 및 그들의 유도체를 첨가하고, 일정 시간 후에 리포터 유전자의 발현량 또는 리포터 단백질의 양을 측정함으로써 스크리닝할 수 있다. KIAA1764 유전자의 조절영역은 시판되는 게놈 라이브러리로부터, 공지의 방법에 의해 KIAA1764 cDNA의 단편을 프로브로 하여 플라크 잡종화(plaque hybridization)를 수행하여 얻을 수 있다. 리포터 단백질의 양은 효소 활성으로서 측정할 수도 있고, 단백질의 발현량으로서 항체 등을 이용하여 측정할 수도 있다.

상기 세포사멸 과소 활성과 관련있는 질환은 암일 수 있으며, 그 예로는 위암, 대장암, 간암, 유방암, 및 폐암을 들 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

상기 세포사멸 과다 활성과 관련있는 질환은 중추신경계 질환, 예를 들면, 다수의 급성 및 만성 퇴행성 질환 (예컨대, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌허혈증/뇌졸증), 심혈관계 질환 , 및 그레이브스 병 및 제2형 당뇨병 등과 같은 자가면역 질환을 들 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 세포사멸 유도제, 및 세포사멸 관련 질환 치료용 약학적 조성물은 당업계의 공지된 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 적절한 제형으로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 조직에 도달할 수 있는 한 일반적 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 특히 비경구 투여가 바람직하며, 더욱 특히는 정맥내 주사로 투여할 수 있으며, 제형은 선택한 투여방법에 따라 달라진다.

약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

부가하여, 다른 약학적 전달 시스템 예컨대 당업계의 주지된 리포좀 및 에멀젼을 채용할 수 있다. 특정 유기용매 예컨대 디메틸설폭시드를 또한 채용할 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 것이다. 예를 들면, 치료적으로 유효한 투여량은, 초기에는 세포배양을 통한 시험관내 분석을 사용하여 결정할 수 있으며, 동물모델에서 실험을 수행하여 혈중 KIAA1764의 농도 범위가 세포배양에서 결정된 IC₅₀ (시험관내 분석, 약물 처리 시, 배양 세포의 50%에 대한 치사량의 테스트 화합물의 농도)을 통하여 결정할 수 있다. 당업자라면, 과도한 실험을 거치지 않고도 치료에 유효한 양을 결정할 수 있을 것이며, 이러한 정보를 이용하여 인간에서 유용한 투여량을 더욱 정확하게 결정할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 암의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 항암제와 같은 약물과 조합으로 제공될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실험 방법 및 재료

본 발명의 분자유전학 및 유전공학의 일반적인 방법은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Sambrook et.al., Cold Spring Harbor); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller & Calos ed.); 및 Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et.al, ed., Wiley & Sons)의 현재 판에 기술되어 있다. 본원 발명의 명세서 중에 언급된 시약, 클로닝 벡터, 및 유전자조작용 키트는 시중의 업체, 예컨대 Gibco/BRL, Bio-Rad, Stratagene, Invitrogen, ClonTech 및 Sigma-Aldrich Co. 에서 구입할 수 있다. 세포 배양방법은 일반적으로 Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (R.I. Freshney ed, Wiley & Sons); General Techniques of Cell Culture (M.A. Harrison & I.F. Rae, Cambridge Univ. Press)의 현재 판에 기술되어 있다. 세포배양에 필요한 물건 및 시약은 시중의 업체 예컨대 Gibco/BRL, Nalgene-Nunc International, Sigma Chemical Co. 및 ICN Biochemicals에서 구입할 수 있다.

세포 배양

세포주 SaOs2, HCT116, HEK 293, H460, 및 A549은 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, Hyclone), 글루코스, 페니실린(100unit/ml) 및 스트렙토마이신(100㎍/ml)을 포함하는 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Hycolon) 중에서, 37℃, 5%의 CO₂ 환경에서 배양하였다. 세포는 Dulbecco's modified phosphate buffer saline (D-PBS, GIBCO BRL)으로 두번 세척하고 1 x 트립신으로 처리한 뒤 플레이트에서 3-4일 마다 배지를 교환하여 배양하였다.

DNA 형질감염

안정한 세포주를 형성하기 위해, 트랜스펙션 24시간 전에 세포를 직경 100 mm의 플레이트에서 60%의 컨플루언스(confluence)로 배양하였다. 4 ㎍/㎕ 플라스미드, 캐리어 DNA, 16 ㎍/㎕ 연어 정자 DNA를 SaOs-2와 HCT116 세포에 CaPO₄법으로 도입하였다.

G418 500 ㎍/㎕을 포함하는 배양액(DMEM + 10% FBS)에 형질전환체(Transfectant)을 선별하여 3-4일마다 배지를 교체하면서 배양하였다. 안정적으로 도입된 형질감염체의 각각의 클론을 추가 분석을 위해 선별하였다. 세포 형질전환은 혈청에서 수행하였고, 리포펙타민 2000(Invitrogene)를 사용하였다.

웨스턴 블롯

배양된 세포는 리파 세포용해 완충액(50mM Tris-Cl/pH 7.5, 50mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mM EGTA, 50mM NaF, 10mM Na₄P₂O₇, 5mM Na₃VO₄, 1mM DTT, 어프로티닌, 루펩틴으로 구성된 프로테아제 저해제 칵테일, 페닐메틸설포닐 플루라이드(PMSF))를 처리한 뒤 얼음에서 30분 동안 보관한 다음, 4 ℃에서 20분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하였다.

단백질 정량은 단백질 어세이 키트(Bio-Rad)를 사용하여 수행하였다.

샘플 별로 동량의 단백질을 SDS-PAGE를 행한 다음 PVDF 막(Perkin Elmer life science)으로 이동시켰다. 5% 탈지유/0.1% 트윈 20/TBS로 PVDF를 블로킹하고, 각 항체를 4일 동안 반응시켰다. 이후 20분 동안 TBS-T로 3번 세척한 후 상온에서 호스라디시 페록시다제가 접합된 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody)로 1시간 동안 배양하였다.

ECL 화학발광법(Amersham)으로 신호를 검출하고, X-레이 필름에 노출시켰다. 사용한 항체는 다음과 같다: Flag (Sigma, M2), V5 (Invitrogen, R960-25), 액틴(Santa cruz biotech. SC-1616), 알파-튜불린 (Sigma,B-5-1-2), Stat3 (Santa Cruz Biotech., SC-482), p-Stat3 (Cell signal Tech., 9131), 사이클린 B1 (Santa Cruz Biotech. SC-594), p-cdc2 (Santa Cruz Biotech, 9111), 항-cdc25c (SC-254), 및 항-RNR R2 (SC-10846), cdc2 (sc-54; Santa Cruz Biotechnology), p53 (sc-126; Santa Cruz Biotechnology), 라민 B (Santa Cruz Biotech, SC-6216), Nup62 (COVANCE, Mab414).

플라스미드 구축

유전자를 pfu 중합효소(stratagene)를 이용한 PCR로 제조하였다. 이 유전자를 포유류 발현 벡터인 pcDNA 3.1 벡터에 클로닝하였다. 이 유전자의 서열을 분석하여, 정확한 방향과 서열을 확인하였다. PCR을 이용하여 3' 말단에 인-프래임 FLAG 에피토프를 부가한 Rani-2 및 hRani-2를 p3xFlag-CMV (pRani2-Flag 및 phRani2-Flag)의 C-말단에 클로닝하였다.

노던 블롯

트리졸 용액(Invitrogen, co.)을 이용하여 총 세포 RNA를 분리하였다. 샘플 당 총 RNA 20 ㎍을 변성시켜, 1.2% 아가로스-포름알데하이드 겔에 전개시킨 다음, 나일론막으로 이동시켜, 제조사의 설명(Expresshyb, clonethec Inc,)에 따라 혼성화하였다. 프로브를 랜덤 프라이머 DNA 표지 키트(Roche)를 이용하여 ³²P-표지하였다. 블롯을 X-레인 필름에 노출시킨 후, 세정한 다음 -70℃에 하룻밤 두었다.

노화 관련 베타-갈락토시다제(SA-β-Gal) 염색

SA-β-Gal 염색을 Dimiri et al (27)에 개시된 바에 따라 수행하였다. 지정된 기간 동안 배양한 세포를 DPBS로 세정하고, PBS 중의 0.25% 글루타르알데하이드에서 실온에서 15분 고정하였다. 37 ℃에서 6-12시간 동안 세정한 SA-β-gal 염색 용액과 인큐베이션하여, pH 6.0에서의 SA-β-gal 활성을 검출하였다. 용액은, 1 ml 당 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토사이드(X-gal) 1 mg, 디메틸-포름아미드 20 mg, 40 mM 시트르산, 5 mM 포타슘 페리시아나이드, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂로 구성된다. 세포를 D-PBS로 헹구고, 명시야 현미경을 이용하여 각 샘플의 SA-Gal 염색 양성율을 결정하였다.

실시예 1. KIAA1764 유전자 클로닝

유전자의 염기 서열을 염기서열 분석 키트(Applied Biosystmes, USA)를 제조자의 권고대로 사용하여 염기서열 분석하고, BLASTN 프로그램(Altschul et al, 1990; http://www,ncbi.nlm.nih.gov)으로 상동성 분석 결과, GenBank EAW87120(사람), NP_208325.3(사람), 마우스의 AK004646(마우스)의 일부를 구성하는 서열로서, 구체적 기능은 알려진 바가 없다.

상기 EAW87120을 KIAA1764-1(유전자 서열: 서열번호 1 , 단백질 서열: 서열번호 2), NP_208325.3를 KIAA1764-2(유전자 서열: 서열번호 3, 단백질 서열 4)로 명명하였다. KIAA1764-1, KIAA1764-2, 마우스의 KIAA1764 상동체(AK004646), 마우스의 잘린(truncated) 11-61 cDNA의 일차 구조는 도 1에 나타내었다.

사람 KIAA1764 유래의 두 종류의 cDNA 및 마우스의 KIAA1764 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 도 2에 나타내었다.

KIAA1764-1과 KIAA1764-2의 서열 차이는 cDNA가 코딩하는 단백질 서열 차이를 염색체 상의 엑손 및 인트론 구조를 기반으로 도 3에 나타내었다. KIAA1764-1은 1번 엑손의 ATG에서 시작되고, KIAA1764-2는 2번의 a엑손의 ATG에서 시작되는 것으로 나타났다.

실시예 2. KIAA1764의 노화 촉진 활성 검증

KIAA1764-1 및 -2의 mRNA

인간 유래의 섬유모세포주인 WI38, IMR90과, 사람 육종암 세포주(SaOs-2) 및 대장암 세포주(HCT116)의 mRNA를 추출하고, RT-PCR을 수행하였다. 법으로 KIAA1764-1 및 -2의 mRNA의 존재 여부를 확인한 것이다. 그 결과는 도 4에 나타내었다. 정상 세포와 암 세포 모두에서, KIAA1764-1 및 -2 mRNA의 존재가 확인되었다.

노화 촉진 활성 검증

11-61로 명명한 절단형 cDNA를 제작하여, 발현 벡터에 클로닝한 후, 이를 SaOs-2 세포에 형질감염시켰다. 11-61을 발현하는 SaOs-2 세포와 대조군 SaOs-2 세포에, 0, 50, 150 MOI의 p53 아데노바이러스를 감염시킨 후, 6일 후에 세포의 노화를 측정하는 노화-관련 베타-갈락토시다제(SA-beta-Gal)의 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 11-61 cDNA를 발현하는 세포에서 p53유전자의 발현에 의해 노화 마커인 SA-갈락토시다제 활성이 증가되는 것으로 나타났다.

또한, KIAA1764-1와 KIAA1764-2 cDNA를 각각 제작하여, 발현 벡터에 클로닝한 후, 이를 SaOs-2 세포에 형질감염시켰다. KIAA1764-1 및 KIAA1764-2를 각각 발현하는 SaOs-2 세포와 대조군 SaOs-2 세포에, 0, 50, 150 MOI의 p53 아데노바이러스를 감염시킨 후, 일정 시간이 지난 후에 세포의 노화를 측정하는 노화-관련 베타-갈락토시다제(SA-beta-Gal)의 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, KIAA1764-1, -2를 발현하는 세포에서 p53 유전자의 발현에 의해 노화 마커인 SA-갈락토시다제 활성이 증가되는 것으로 나타났다.

이러한 결과는, KIAA1764-1와 KIAA1764-2, 그리고 이의 일부분인 11-61 단편이 p53 유전자 발현에 의한 세포 노화 과정을 촉진시킴을 입증하는 것이다.

실시예 3. KIAA1764의 세포사멸 촉진 활성 검증

i) 시험관내 테스트

SaOs-2 세포에 p53 유전자를 발현시키면 일부 세포는 죽고, 일부 세포는 세포주기가 정지된다. 세포주기가 정지된 세포는 p53 유전자 발현이 감소되면 다시 성장하게 된다. KIAA1764 유래의 cDNA를 발현하는 SaOs-2 세포와 발현하지 않는 SaOs-2 세포의 세포사멸을 비교하여, KIAA1764의 세포사멸 촉진 기능을 하기와 같이 분석하였다.

총 4 x 10⁴ 세포/웰로 세포를 24-웰 플레이트에 넣고, 48시간 후 세포를 1x D-PBS로 헹군 다음 p53을 발현하는 아데노바이러스 50 내지 150 MOI(multiplicity of infection)를 감염시켰다. 각 웰에 있는 모든 세포들을 각각의 용기에 모은 후, 0.4% 트립판 블루(Sigma)로 염색하여, 현미경하에서 사멸된 세포의 수를 측정하여 세포 사멸을 정량하였다.

도 7은 두 종류의 KIAA1674 유래의 cDNA, KIAA1764-1와 KIAA1764-2를 각각 발현하는 SaOs-2 세포와 대조군의 SaOs-2 세포를 p53 아데노바이러스를 감염시킨 후 일정 시간이 지난 후에 세포사멸을 측정한 그래프로, KIAA1764 유래의 cDNA가 p53 유전자의 발현에 의한 세포사멸을 촉진시키는 것으로 나타났다.

ii) 동물 실험

KIAA1764-1와 KIAA1764-2를 각각 발현하는 발현 벡터를 대장암 세포주인 HCT116에 각각 발현시키고, 이를 누드 마우스에 주입하여 종양 형성을 측정하였다.

세포를 100 ㎕ 멸균수에 재부유시킨 후, 4주령 Balb/c 암컷 누드 마우스 옆구리에 피하로 주입하였다. 종양의 크기는 캘리퍼를 이용하여 길이(A)와 폭(B)을 측정한 뒤 종양의 부피는 (A x B²)/2로 계산하였다.

도 10은 KIAA1764-1, KIAA1764-2를 각각 발현하는 대장암 세포주 HCT116과 대조군 HCT116세포를 누드 마우스에 주입하여 시간에 경과에 따른 종양 크기 변화를 측정하여 나타낸 것으로, KIAA1764를 발현하는 암 세포의 종양 크기가 대조군(HCT116)에 비해 현저하게 작은 것으로 나타났다. 따라서, KIAA1764가 종양의 형성을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.

실시예 4. KIAA1764 유전자에 의한 암세포의 항암제 감수성 증가

독소루비신은 DNA 손상을 유발하는 항암제로서 세포의 성장을 억제한다. 이에 대조군 HCT116 세포와 KIAA1764를 발현하는 HCT116 세포에 독소루비신을 처리하여 암세포의 성장 억제를 확인하였다.

i) 대장암 세포에서의 항암제 감수성 증가

도 8은 KIAA1764-1 유전자를 발현하는 HCT116 대장암 세포와 대조군 HCT116 세포에 DNA 손상을 유발하는 항암제 독소루비신을 24시간 처리한 후 세포성장을 측정한 것이다. KIAA1764-1을 발현하는 암 세포주는 대조군에 비해 세포의 성장이 현저하게 감소하였다.

ii) 골육종 세포에서의 항암제 감수성 증가

도 9는 인간 유래의 KIAA1764-1을 발현하는 골육종 세포 Saos2와 대장암 세포주 HCT116 및 대조군 세포주에 DNA 손상을 유발하는 항암제 독소루비신을 24시간 처리한 후, 6일 후에 노화를 측정하는 SA-갈락토시다제 활성을 측정한 것이다. KIAA1764를 발현하는 세포에서 DNA 손상에 의해 노화 마커인 SA-갈락토시다제 활성이 증가됨을 보여준다.

iii) 동물 실험

세포사멸 및 세포노화는 암 성장을 억제하는 주요한 기전이므로 생체내(in vivo)에서 KIAA1764의 암세포의 성장 및 종양 형성 능력을 다음과 같이 확인하였다.

세포를 100 ㎕ 멸균수에 재부유시킨 후, 4주령 Balb/c 암컷 누드 마우스 옆구리에 피하로 주입하였다. 독소루비신을 PBS에 용해시킨 후 복강내로 주사하였다. 종양의 크기는 캘리퍼를 이용하여 길이(A)와 폭(B)을 측정한 뒤 종양의 부피는 (A x B²)/2로 계산하였다.

도 11은 KIAA1764 유전자를 발현하는 대장암 세포주 HCT116과 대조군 HCT116 세포를 누드마우스에 이식하여 100일간 성장시킨 후, 독소루비신을 처리하였을 때의 종양의 크기를 나타낸 것이다. 그 결과, KIAA1764 유전자를 발현하는 HCT116 세포를 누드 마우스에 이식하여 종양을 성장시킨 후 독소루비신을 처리하면, KIAA1764 유전자를 발현하는 HCT116 세포가 대조군 HCT116 세포에 비하여 항암제에 대한 감수성을 현격하게 증가시켜 종양 증식이 크게 감소되었다.

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서열번호 2 또는 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 단백질, 서열번호 2 또는 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 코딩하는 유전자를 발현가능하게 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제6항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 기재된 핵산 서열로 구성된 유전자인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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제6항에 있어서, 상기 조성물은 항암제의 민감성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제6항에 있어서, 항암제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
서열번호 2 또는 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 코딩하는 유전자의 전사 제어 영역 및 상기 유전자 또는 리포터(report) 유전자를 포함하는 형질전환 세포 또는 시험관내 발현 시스템에, 후보 물질을 접촉시키는 단계;
상기 유전자 또는 리포터 유전자의 발현량을 검출하는 단계; 및
상기 발현량이 증가된 경우 상기 후보 물질을 암의 치료 또는 예방용 물질로 선정하고, 상기 발현량이 감소된 경우 상기 후보 물질을 중추신경계 질환, 심혈관계 질환 또는 자가면역질환의 치료 또는 예방용 물질로 선정하는 것을 특징으로 하는, 세포사멸 촉진제 또는 억제제를 스크리닝하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 중추신경계 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌허혈증 또는 뇌졸증이고, 상기 자가면역질환은 그레이브스 병 또는 　제2형 당뇨병인 것인 방법.
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