KR20070043724A - 히알루론산과 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드의하이드로겔 및 생물의학 분야와 제약 분야에서 이들의 용도 - Google Patents

Abstract

히알루론산(hyaluronic acid) 및 중합 사슬(polymeric chain)을 따라 하이드라지도(hydrazido) 펜던트 기(pendent group)를 보유하는 단백질-유사 구조의 다중기능성 중합체(polyfunctional polymer)의 화학적 가교결합(chemical crosslinking)에 기초한 조성물과 산물. 적절하게는, 상기 중합체는 생체적합성 거대분자(biocompatible macromolecule)인 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드이다.

가교결합이후 수득된 물질, 특히, 하이드로겔은 출발 히알루론산과 달리, 화학 분해와 효소 분해가 감소하고, 생물의학 분야와 제약 분야에 이용되는 시스템을 제조하는데 사용될 수 있다.

하이드로겔

Description

히알루론산과 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드의 하이드로겔 및 생물의학 분야와 제약 분야에서 이들의 용도{HYDROGELS OF HYALURONIC ACID AND ALPHA, BETA-POLYASPARTYLHYDRAZIDE AND THEIR BIOMEDICAL AND PHARMACEUTICAL USES}

본 발명은 히알루론산과 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드의 새로운 하이드로겔 및 생물의학 분야와 제약 분야에서 이들의 용도에 관계한다. 특히, 본 발명은 히알루론산(hyaluronic acid) 및 중합 사슬(polymeric chain)을 따라 하이드라지도(hydrazido) 펜던트 기(pendent group)를 보유하는 단백질-유사 구조의 다중기능성 생체적합성 중합체의 화학적 가교결합(chemical crosslinking)에 기초한 조성물과 산물에 관계한다. 이런 가교결합이후, 출발 히알루론산과 달리, 화학 분해와 효소 분해에 대한 강한 저항성으로 특성화되는 물질을 수득할 수 있는데, 상기 물질은 생물의학 분야와 제약 분야에 이용되는 시스템을 제조하는데 사용될 수 있다.

공지된 바와 같이, 하이드로겔은 자연 중합체 또는 이들의 유도체, 합성 중합체, 또는 자연 중합체와 합성 중합체의 조합으로 구성되는데, 정전력(electrostatic force) 또는 화학적 결합(chemical linkage)으로 상호작용하는 이들의 분자는 친수성 가교결합된 중합체를 형성하고, 건물 중량(dry weight)의 10-20% 내지 수백배 범위의 양으로 물을 흡수할 수 있다. 하이드로겔은 잠재적 생 체적합성(biocompatibility)과 친수성으로 인하여, 제약 분야와 생물의학 분야에서 많은 주목을 받고 있다.

특히, 하이드로겔은 손상된, 병든 또는 퇴행된 인간 조직이나 기관을 치유하거나 ex novo에서 재구성하는 것을 목적으로 하는 조직 공학 기질(tissue engineering matrix)의 제조에 이상적인 후보이다. 조직 공학은 인간의 손상된 조직의 재생 또는 이들의 완전한 재현을 달성하는데 유용한 기술의 개발을 다루는 실질적으로 새로운 자연 과학이다. 회복중인 조직 세포(가령, 피부 조직용 섬유아세포, 연골 조직용 연골세포, 골 조직용 골아세포 등)의 성장과 분화 및 세포외 기질(ECM, 이는 모든 조직의 주요 성분이다)의 후속적 침착(deposition)이 가능하도록 3차원 구조, 특히, 다공성 시스템이 요구되는데, 여기서 세포는 자연 환경과 가능한 유사한 환경에서 부착하고 증폭하며 새로운 ECM을 침착시킬 수 있다. 이들 3차원 구조는 통상적으로, “골격(scaffold)”이라고 불리는데, 하이드로겔은 예로써, 이런 소수성 구조에 비하여 여러 이점을 고려하면, 조직 공학을 위한 유사 기질을 구성하는데 특히 적합하다. 특히, 이들 이점에는 하이드로겔 기질 내에서 세포의 부착, 증식, 성장을 촉진하기 위하여, 영양분의 세포로의 우수한 유동과 세포 외부로 산물의 유동을 가능하게 하는 하이드로겔의 능력, 이들의 통상적인 생체적합성과 점진적인 생체-재흡수(bio-reabsorption), 공유 결합이나 물리적 결합으로 세포 부착용 펩티드 리간드를 용이하게 통합하는 능력 등이 포함된다. 후자 이점으로 인하여, 하이드로겔은 동일한 목적에 이용되는 소수성 중합체, 예를 들면, PLGA(폴리락틱-글리콜산)과 구별된다. 다른 한편, 하이드로겔은 조작을 어렵게 할 만큼 낮은 기계적 저항성(mechanical resistance)의 단점을 보이거나, 또는 멸균하기 어려울 수도 있다.

조직 공학 적용에는 관절 연골 재생을 위한 생물분해성 스펀지 또는 생물분해성 필름을 이용하거나, 또는 외상(즉, 화상) 또는 질병(당뇨병, AIDS)에 의해 유발되는 상처를 보호하거나 이의 치유를 뒷받침하는 가능성이 포함된다. 이런 경우에, 상처에 대한 적용은 섬유아세포의 더욱 빠른 재생 활성을 뒷받침할 수 있는데, 이들 섬유아세포는 골격에 부착된 이후, 새로운 ECM을 더욱 빠르게 합성하고 상처를 치유한다. 대안으로, 시험관내에서 골격을 먼저 이용하여 실제의 인공 피부를 생성시키고, 이후 이를 이용하여 상처를 감싸고 피부 기능을 수행할 수 있다. 유사한 피부 치환체는 상처로부터 삼출액 손실 및 감염 위험을 감소시킬 수 있는 일시적인 덮개 기능을 수행한다. 약제로 선택적으로 채워진 골격은 또한, 약제 전달 기능을 수행하고, 실례로써 상처의 유형에 따라 항생제 또는 성장 인자의 연장된 방출을 뒷받침할 수 있다. 예로써, 콜라겐 기초된 골격으로부터 획득된 여러 산물은 이미, 피부 치환체(특히, 상품명 Apligraft^TM으로 시판되고 있는, 섬유아세포와 각화세포의 성장으로 수득되는 세포 이중층)로서 시판되고 있다.

잠재력으로 인하여 많은 주목을 받고 있는 하이드로겔의 다른 생물의학적 적용은 수술후 유착(post-surgical adhesion)의 예방이다. 공지된 바와 같이, 수술후 유착은 수술 과정에서 조직에 가해지는 외상으로부터 발생하는, 2개의 마주보는 조직 표면 사이에 섬유성 봉합선의 형성에 기인한다. 이런 수술후 유착은 심혈관 수 술에서 뿐만 아니라 위장 수술과 부인과 수술에서 주요한 문제점인데, 유착은 이들 수술에서 장 폐쇄(intestinal obstruction), 불임, 골반 통증을 유발할 수 있다. 이러한 귀찮은 문제를 예방하는데 가장 많이 이용되는 방법은 접촉하는 조직 사이에, 이들의 완전한 분리를 조장하는데 적합하고 수술이후 위험한 기간 동안 정위(正位)할 수 있는 물리적 장벽으로서 생체적합성 물질의 배치이다.

이런 용도로 이미 시판되고 있는 장벽 중에서, 심낭(pericardial) 치환체로서 제안된, 확대된 폴리테트라플루오르에틸렌(Preclude^TM, W.L. Gore, Flagstaff, AZ)을 이용하여 실현된 장벽은 우수한 임상적 효능을 보유하긴 하지만 완전한 생물분해성이 아니기 때문에, 이의 제거를 위한 이차 수술 작업이 필요하다. 재생된 셀룰로오스-기초된 장벽(Intercede^TM, Johnson & Johnson Medical Inc., Arlington, TX) 역시 이용되긴 하지만, 이들은 혈액 접촉을 피하여 이용되는 경우에만 우수한 효능을 보였다. 하지만, 현재, 가장 널리 시판되고 있는 항유착 장벽은 Seprafilm(Genzyme, Cambridge, MA)이다; 이는 카르복시메틸셀룰로오스로 변형된 히알루론산에 기초한 물질이다. 상기 물질은 긍정적인 특성에도 불구하고, 조작이 용이하지 않고 쉽게 부서지며 탄력적이지 않고, 히알루론산에서 수행된 화학적 변형에도 불구하고 매우 급속한 재흡수 시간으로 특성화된다.

공지된 바와 같이, 아래에 보고된 생물의학적 적용과 제약학적 적용을 위한 우수한 후보는 D-글루콘산(GlcUA)과 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)의 교대 단위(alternating unit)로 구성되는 고분자량의 선형 다당류인 히알루론산인데, 이의 화학 구조는 아래의 화학식으로 표시될 수 있다:

여기서, 2개의 연속되는 이당류 단위가 도시되는데, 여러 쌍의 반복 단위의 총수 n은 다당류 분자량이 50,000 내지 수백만 달톤이 되도록 결정된다.

히알루론산(HA)은 동물 조직에서 폭넓게 분포하는, 세포외 기질의 기초 성분인데, 여기서 히알루론산은 세포 증식과 분화를 조절하는 기능을 한다. 이는 여러 중요한 생물학적 공정, 예를 들면, 세포 이동성(cellular mobility)과 조직 치유(tissue healing)에 참여한다; 이는 염증 반응을 조절하고 유리 라디칼(free radical)의 “소거제(scavenger)”로서 기능한다. HA는 세포 표면에 위치하는 특정 수용체와 상호작용함으로써 종양 성장에 관여하는 것으로 확인되었다: 이는 상기 중합체가 항종양 활성을 갖는 새로운 거대분자 프로드러그의 생산에서 가용성 담체로서 적용될 가능성에 대한 최근의 관심을 설명할 수 있다.

일반적으로, 히알루론산은 안과 분야에서 점성보충(viscosupplementation) - 약제 및 수술 보조제로서 이용되고, 관절내 주사로 투여되는 윤활제(lubricating agent)로서 상이한 성격의 골관절염에 의해 유발된 관절 통증을 완화하는 점성 보충에서 폭넓게 시험되고 있으며, “약제 전달 시스템”, 다시 말하면, 약제의 연장 된 또는 통제된 방출을 위한 담체로서 및 미용제로서 이용되고 있다. 게다가, 상기한 생물학적 기능에 비추어, HA는 주사에 의해 신경 재생을 조장하고, 상처에 배치되는 경우에 조직 재생을 조장하는 것으로 보고되었다. 이에 더하여, 신속한 피부 침투성(cutaneous permeability)과 표피 유지(epidermic retention)의 특성은 예로써 경피 투여로서 적용되는 제약학적 장치에서, 히알루론산과 동시에 투여된 약제의 반감기를 연장할 수 있다.

상기한 내용으로부터, 히알루론산에 기초한 생체적합물질(biomaterial)은 생체적합성으로 인하여, 생체내와 시험관내에서 세포 성장 과정을 조장하는데 유용한 조직 공학용 보조 물질 및 수술후 유착의 예방에서 장벽으로서 매우 적합하다. 하지만, 그럼에도 불구하고, HA 단독은 그다지 탄력적이지 않고 쉽게 부서지는 골격을 발생시키는 단점으로 그 사용이 제한된다. 게다가, 이들 골격의 표면은 친수성이 너무 강하여 부착과 세포 분화가 불량하다. 특히, 이런 이유로, HA를 콜라겐 또는 젤라틴과 같은 생체적합성 중합체, 또는 폴리리신과 같은 합성 중합체와 혼합하거나 가교결합함으로써, 또는 HA를 소수성기로 화학적으로 변형함으로써 HA를 변형하는 것이 여러 번 제안되었다.

펜던트 기능기(pendent functional group)의 도입에 의한 HA의 다당류 분자의 화학적 변형은 연장된 방출 제약학적 시스템(약제 전달 시스템)을 획득하기 위한 추가의 표적인데, 여기서 약제는 다당류 담체 사슬에 화학적으로 연결된 상태로 작용 부위로 운반되고, 이의 생체이용효율을 증가시킬 수 있는 방식과 시점에 이로부터 방출될 수 있다.

본 발명에서 고려되는 히알루론산의 다른 중요한 단점은 급속한 화학 분해와 효소 분해에 기인한, 생체내에서 이의 짧은 체류 시간(residence time)이다. 실제로, 이는 인간 세포와 혈청에 널리 분포하는 편재성 효소인 히알루로니다아제(HAase)에 의해 분해될 뿐만 아니라 효소 활성이 부재하는 경우에도 화학적 가수분해가 진행된다. 이런 이유로, 일부 적용에서 보고된 바와 같이, 상기 물질이 기능을 수행한 이후 재흡수될 수 있다는 사실은 한편으로, 필요하고 긍정적인 특성이지만, 다른 한편으로, 이러한 분해는 산물 반감기 또는 작용 부위에서 성능을 과도하게 감소시킬 만큼 빠르지 않아야 한다.

이런 이유로, 특히, 앞서 언급된 생물의학적 적용과 제약학적 적용에서 이런 생체적합성 물질의 유리한 특성을 활용하면서, 이와 동시에 더욱 우수한 기계적 특성과 탄성 및 무엇보다도 화학 가수분해와 효소 가수분해에 대한 더욱 우수한 시험관내와 생체내 저항성을 나타냄으로써 적용 부위에서 연장된 작용을 수행할 수 있는 히알루론산 기초된 물질을 개발하는데 여전히 관심이 집중되고 있다. 이에 더하여, 현재 고려되는 하이드로겔로서, 연구 물질은 수용성 매체와의 접촉시에 물을 포획하고 팽창하는 능력을 보유해야 한다.

이런 요구를 충족시키기 위하여, 본 발명에서는 실질적으로 선형이고 단백질-유사 구조를 보유하며 생체적합성 특징이 이미 입증된 폴리아미노산 구조의 적절한 가교결합제와 HA를 반응시켜 HA를 화학적으로 변형하는 가능성을 고려하였다. 특히, 본 발명에서 제안된 가교결합제는 폴리하이드라지드 구조를 보유하는데, 그 이유는 상기 구조가 각 반복 단위에서, 히알루론산의 반복 이당류 단위의 카르복실 기를 공유 결합시키는데 잠재적으로 이용될 수 있는 펜던트 하이드라지도 기(CONHNH2)를 보유하기 때문이다.

비스-하이드라지도 기로 기능화(functionalization)에 의한 히알루론산의 화학적 변형은 예로써, US 특허 US 5616568과 US 5652347(Pouyani et al., The Research Foundation of State University of New York) 및 상응하는 과학 논문(T. Pouyani, G. D. Prestwich, Functionalized Derivatives of Hyaluronic Acid Oligosaccharides: Drug Carriers and Novel Biomaterials, Bioconjugate Chem., 1994, 5, 339-347)에서 이미 보고되었다. 하지만, 이 경우에, 하이드라지도 펜던트 기를 보유하는 기능화된 히알루론산: HA-CO-NH-NH-CO-A-CO-NH-NH₂를 생산하기 위하여 HA의 가교결합이 아닌 기능화가 수행되는데, 여기서 다당류 카르복실산은 화학식 H₂N-NH-CO-A-CO-NH-NH₂의 이중기능기와 반응하고, A는 포괄적 스페이서 기(spacer group)를 나타낸다.

앞서 언급된 문헌에서는 또한, 반응과 관련하여, 반응을 활성화시키는 약물로서 카르보디이미드(화학식: R¹-N=C=N-R²)의 공지된 용도를 기술한다. 생성 산물이 하이드로겔을 형성할 수 있도록 하는 방식으로, 기능화된 HA의 가능한 후속적 가교결합에 대하여, 이들 문헌에서는 넓은 범위의 공지된 가교결합제와의 추가 반응을 제안한다.

동일한 연구 라인의 프레임에서, Vercruysse 등(Vercruysse et al., “Synthesis and in Vitro Degradation of New Polyvalent Hydrazide Cross-Linked Hydrogels of Hyaluronic Acid”, Bioconjugate Chem., 1997, 8, 686-694) 역시 하이드로겔과 유사한 물질을 생산하기 위하여, 출발 다당류의 실제 가교결합을 유도할 수 있는 2개 이상의 말단 하이드라지도 기를 보유하는 약물을 이용한 HA의 변형을 제안하였다. 논문 제목이 “다가 하이드라지드”를 인용함에도 불구하고, 상기 연구에 고려된 반응물은 중합 사슬이 아닌 2개 내지 6개의 하이드라지도 기능기를 보유하는 합성 화합물이다. 상기 연구에서 사용된 비스-, 트리-, 테트라-, 펜타- 또는 헥사하이드라지드의 생체적합성에 관한 고려가 전혀 없음을 별개로 하더라도, 이들 문헌에서는 본 발명에서 고려되는 것들과 상이한 특징과 구조를 보유하는 물질의 생산을 기술하는데, 그 이유는 우선적으로, 상이한 특성을 갖는 다른 선형 중합체와의 화학적 결합이 아닌 상대적으로 작은 분자 크기를 갖는 다중기능성 반응물을 이용하여 HA 가교결합을 달성하기 때문이다.

상기한 내용에 비추어, 본 발명에서는 HA에 대한 가교결합제로서, 폴리펩티드 골격을 보유하는 폴리하이드라지드 중합체의 사용을 제안하는데, 여기서 각 반복 단위는 하나의 하이드라지도 펜던트 기를 보유한다. 특히, 적절한 유형의 중합체는 본 연구를 제안하는 연구 그룹(G. Giammona, B. Carlisi, G. Cavallaro, G. Pitarresi, S. Spampinato, A new water-soluble synthetic polymer, α,β-polyasparthydrazide, J. Control. Rel., 1994, 29, 63-72)에 의해 이미 합성되고 연구된 수용성 생체적합성 중합성 물질인 알파,베타-폴리-아스파틸하이드라지드(PAHy)이다. 상기 물질은 앞서 언급된 문헌에서 보고된 바와 같이, 하이드라진(hydrazine)으로 고분자량 폴리숙신이미드(polysuccinimide)의 아미노분 해(aminolysis)로 수득하였다. 특히, 폴리숙신이미드(PSI)는 D,L-아스파라긴산(aspartic acid)의 중중합(polycondensation)으로 수득하고, 이후 하이드라진(₂HN-NH₂)과 반응시켜 아래의 화학식으로 대표되는 중합체를 수득하였다:

상기 화학식에서 확인되는 바와 같이, 출발 폴리숙신이미드의 환형 구조로 인하여, 하이드라진의 커플링(coupling)은 메틸렌기가 중합성 골격에 또는 펜던트 기능기에 남아있도록 하는 방식으로 진행될 수 있다. 이런 이유로, 반복 단위(상기 화학식에서는 5개의 반복 단위를 보여준다)는 첫 번째와 두 번째 경우에서 약간 상이한 구조를 나타낼 수 있지만 이의 분자량은 동일하다.

앞서 언급된 문헌에서는 PAHy의 합성과 특성화를 보고하고, 또한 이런 단백질-유사 중합체를 혈장 치환체로서 이용하는 방안을 제안한다. 이런 목적으로, 독성 연구(toxicity study), 면역원성 능력(immunogenic ability), 혈소판 응집(platelet aggregation) 검사가 보고되었는데, 이들은 상기 폴리하이드라지도 중합체의 완전한 생체적합성을 입증하였다.

이런 이유로, 본 발명에서는 폴리하이드라지드(polyhydrazide) 중합체와 화학적으로 가교결합된 히알루론산(hyaluronic acid)을 함유하는 조성물을 제시하는데, 여기서 히알루론산의 이당류 단위의 하나이상의 카르복실기가 폴리하이드라지드 중합체의 하나이상의 하이드라지도(hydrazido) 기에 개별적으로 화학적으로 연결된다. 적절하게는, 앞서 지적된 바와 같이, 상기 폴리하이드라지드 중합체는 수용성, 생체적합성, 비-면역원성 특징과 관련하여 광범위하게 연구된 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드(PAHy)이다. 하지만, 사슬을 따라 하이드라지도(hydrazido) 펜던트 기(pendent group)를 보유하고 본질적으로 선형 사슬의 폴리아미노산 구조를 갖는 다른 중합체를 동일한 방식으로 이용하여 히알루론산을 가교결합시킴으로써 가공성(processability), 기계적 저항성(mechanical resistance), 분해에 대한 저항성(resistance to degradation)의 적절한 특성을 보유하는 조성물과 물질을 제공할 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 조성물에서 히알루론산은 50,000 내지 1,500,000 달톤의 분자량을 보유하는 반면, 폴리하이드라지드 중합체가 PAHy인 경우에 이는 2,000 내지 40,000 달톤의 분자량을 보유한다.

일부 바람직한 구체예에서, 본 발명은 앞서 정의된 바와 같이, 폴리하이드라지드 중합체와 화학적으로 가교결합된 히알루론산(hyaluronic acid)으로 구성되는 하이드로겔을 제시한다. 이 경우에도, 폴리하이드라지드 중합체는 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드이고, 적절하게는 하이드로겔 생산에 사용되는 히알루론산은 50,000 내지 1,500,000 달톤의 분자량을 보유하고, 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드는 2,000 내지 40,000 달톤, 가장 바람직하게는 10,000 내지 30,000 달톤 범위의 분자량을 보유한다.

적절하게는, 가교결합된 중합성 물질의 생산에서, 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드의 반복 단위(repeating unit)의 몰과 히알루론산의 반복 단위의 몰 사이의 비율은 0.01 내지 5, 가장 바람직하게는 0.5 내지 3이다.

본 발명에 따른 하이드로겔을 구성하는 두 중합체의 화학 구조에 비추어, 가교결합 반응으로부터 아래의 구조를 갖는 산물이 생산된다고 추측할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 제안된 하이드로겔은 활성화제(activating agent)로서 카르보디이미드(화학식: R¹-N=C=N-R²)의 존재하에 히알루론산과 폴리하이드라지드 중합체를 반응시킴으로써 수득될 수 있다. 선호되는 활성화 산물은 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC)이지만, 다른 유사한 약물, 예를 들면, N,N'-디사이클로-엑실카르보디이미드, 사이클로헥실-β-(N-메틸모르폴린)에틸 카르보디이미드 p-톨루엔술포네이트(CMC) 또는 N-알릴-N'(β-하이드록시에틸)카르보디이미드가 대용될 수 있다. 적절하게는, EDC가 사용되는 경우에, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드의 몰과 히알루론산의 반복 단위의 몰의 비율은 0.01 내지 10이다.

가교결합 반응을 활성화시키기 위하여, 활성 매체에 다른 활성화제, 예를 들면, N-하이드록시숙신이미드(NHS), 구체적으로, N-하이드록시술포숙신이미드(NHSS)를 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 경우에, N-하이드록시술포숙신이미드는 가급적, 상기 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드와 동일한 몰량(molar amount)으로 존재한다.

본 발명의 다른 특정 측면에서, 본 발명은 폴리하이드라지드 중합체와 화학적으로 가교결합된 히알루론산으로 구성되는 하이드로겔을 생산하는 제조 방법을 제시하는데, 여기서 동물이나 식물성 공급원으로부터 또는 생물공학 공정에 의해 획득되고 상기한 분자량을 보유하는 히알루론산 및 앞서 보고된 분자량을 보유하는 폴리하이드라지드 중합체, 바람직하게는, PAHy는 이중-증류수(double-distilled water)에서 미리 정해진 몰 비율(molar ratio)로 용해되고, 여기에 정해진 양의 카르보디이미드, 바람직하게는, EDC가 첨가된다. 반응 혼합물은 1시간 내지 5일의 기간동안 0℃ 내지 60℃의 온도에서 유지되고, 후속으로 상기 산물이 하이드로겔 형태로 회수된다. 이 경우에, 반응 동안, pH는 특히, 1 내지 500 mM 농도로 0.1N HCl 용액 또는 비스(2-하이드록시에틸)아미노트리스(하이드록시메틸)메탄 하이드로클로라이드 용액을 이용함으로써 3 내지 8의 범위에 유지된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 공정은 상기 카르보디이미드 이외에, 반응을 활성화시키는 추가의 약물로서 미리 정해진 양의 N-하이드록시숙신이미드, 바람직하게는, NHSS의 첨가를 수반할 수 있다. 이 경우에, 반응 동안, pH는 4 내지 10의 범위에 유지된다.

반응 시간이후, 각 산물은 이중-증류수에서 수회 세척으로 정제하고, 이후 냉동 건조(lyophilization)(나노입자, 마이크로입자 또는 스펀지를 수득하기 위하여)로 건조시키거나, 또는 적절한 주형 내에서 1 atm의 압력, 25℃ 온도에서 수일간 건조시켜 필름, 막 또는 막대를 수득한다. 보고된 실험 데이터에서 확인되는 바와 같이, 제조된 시스템은 생물의학 분야와 제약 분야에서 다양하게 적용될 수 있는데, 예로써 상처를 치유하고 수술후 유착을 예방하며 관절을 윤활하고 시험관내와 생체내 세포 성장을 가능하게 하며 약제 전달 시스템을 실현하는데 적합하다.

또한, HA와 폴리하이드라지드 중합체 용액 모두 단독으로 멸균될 수 있다. 이들의 혼합이후, 겔화 시간(gelation time)은 항상 10분 이상이며, 수분후 조직에서 직접적으로 겔을 형성하기 위하여 겔 형성 용액(gel forming solution)이 in situ에서 적용될 수 있도록 한다. 이 분야에는 동일한 목적으로 제안된 산물, 예를 들면, 혼합이후 in situ에서 가교결합할 수 있는 PEG(폴리에틸렌글리콜) 유도체에 기초한 적절한 반응물을 보유하는 이중 주사기로 구성되는 산물이 이미 시판되고 있다. 이들 용액은 수술후 유착을 피하기 위하여 조직에 뿌려진다.

따라서, 본 발명은 폴리하이드라지드 중합체, 바람직하게는, 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드와 화학적으로 가교결합된 히알루론산으로 구성되는 하이드로겔의 in situ 제조를 위한 키트를 제시하는데, 상기 키트는 첫 번째 히알루론산-기초된 성분을 보유하는 용기 및 두 번째 폴리하이드라지도 중합체-기초된 성분을 보유하는 용기를 포함하고, 이들 두 성분은 상호 접촉이후, 적용 부위(application site)에서 직접적으로 하이드로겔을 형성할 수 있다.

본 발명에 따라 수득된 각 산물은 20℃ 내지 40℃의 온도 범위에서 이중-증류수 및 일부 생물 유체(세포외액(extracellular fluid), 위액(gastric fluid), 장액(intestinal fluid), 활액(synovial fluid), 전방수(aqueous humor) 또는 초자체(vitreous humor))에서 분광광도 기술(spectophotometric technique)과 팽창 측정으로 특성화된다. 팽창 수치는 아래에 보고된 바와 같이, 수용성 매체에 대한 본 발명에 따라 제조된 하이드로겔의 높은 친화성(affinity)을 입증한다. 친화성 정도는 가교결합 정도(crosslinking degree) 및 팽창 매체의 조성과 pH(1 내지 9의 pH 범위)에 좌우되었다.

본 발명의 각 산물은 또한, 1 내지 30일의 항온처리(incubation) 기간 동안, 일부 생물학적 유체를 모방하는 다양한 염수 조성과 pH 수치를 보유하는 매체를 이용함으로써, 37℃에서 화학 가수분해 연구를 실시하였다. 아래에 부분적으로 보고된 획득된 결과는 제안된 산물이 가수분해 매체(조성과 pH), 항온처리 시간, 하이드로겔의 가교결합 정도의 함수로서 화학 가수분해에 저항한다는 것을 입증한다.

최종적으로, 본 발명에 따른 산물은 37℃의 온도에서 30분 내지 30일 범위의 항온처리 기간 동안, 다양한 농도(1 내지 1000 U/㎖)로 HAase를 함유하는 수용액을 이용함으로써 효소 가수분해 연구를 실시하였다. 이 경우에, 아래에 보고된 바와 같이, 획득된 결과는 본 발명의 산물이 효소 농도, 항온처리 시간, 하이드로겔의 가교결합 정도의 함수로서 히알루로니다아제(hyaluronidase)에 의한 가수분해에도 저항한다는 것을 입증한다.

본 발명의 독특한 특징 및 이의 이점과 상응하는 작업 조건은 본 발명에서 수행된 실험의 결과 및 선행 기술과의 비교를 위한 데이터와 함께, 실례의 목적으로 아래에 보고된 상세한 설명으로부터 더욱 명확할 것이다. 일부 실험 결과는 첨부된 도면에서 보고된다.

도 1에서는 구연산염 완충액 pH 6.3을 포함하는 수용액에서, 본 발명에 따른 HA-PAHy 하이드로겔에 기초한 일련의 스펀지의 팽창 행태(swelling behaviour)를 도시한다;

도 2에서는 Dulbecco 인산염 완충액 용액(DPBS) pH 7.4를 포함하는 수용액에서, 도 1에서와 유사한 일련의 스펀지의 팽창 행태(swelling behaviour)를 도시한다;

도 3에서는 HAase의 부재하에, 본 발명에 따른 HA-PAHy 하이드로겔에 기초한 일련의 스펀지의 분해 연구 결과를 도시한다;

도 4에서는 효소 가수분해에 의한 유사한 일련의 스펀지의 분해 연구 결과를 도시하는데, 여기서 사용된 HAase 효소의 농도는 75 U/㎖이다;

도 5에서는 효소 가수분해에 의한 유사한 일련의 스펀지의 분해 연구 결과를 도시하는데, 여기서 사용된 HAase 효소의 농도는 150 U/㎖이다.

실시예 1

PAHy의 반복 단위의 몰과 히알루론산의 반복 단위의 몰의 비율(“X”로 표시된 비율)이 2가 되도록 하는 일정량의 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드(PAHy)에 히알루론산(0.5 % w/v)을 함유하는 수용액을 첨가하였다.

히알루론산과 PAHy 사이의 반응을 활성화시키기 위하여, EDC의 몰과 히알루론산의 반복 단위의 몰의 비율(“Y”로 표시된 비율)이 1.8이 되도록 하는 양으로 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC) 단독을 사용하였다.

반응 혼합물은 37℃에서 4시간동안 유지시켰다. 반응 동안, pH 수치는 300 mM의 농도로 비스(2-하이드록시에틸)아미노트리스(하이드록시메틸)메탄 하이드로클로라이드 용액을 이용함으로써 4.75의 일정한 수치로 유지시켰다.

반응 시간이후, 획득된 산물은 이중-증류수에서 수회 세척으로 정제하고, 이후 냉동 건조시켜 마이크로입자를 수득하였다.

획득된 산물은 칭량하고(수율 94% ± 1.9), 분광광도 기술로 특성화시켰다.

동일한 절차를 이용함으로써, 나노입자, 필름, 막대, 스펀지, 겔을 수득할 수도 있다.

실시예 2

가교결합 반응이 활성제로서 EDC의 존재하에서 및 동일한 몰량의 N-하이드록 시술포숙신이미드(NHSS)의 존재하에서 수행된 점을 제외하고, 실시예 1에서 보고된 동일한 절차를 반복하였다.

이 경우에, pH 수치는 7.5로 유지되었다.

실시예 1에서와 동일하게 반응을 수행함으로써, 분광광도 기술로 특성화되는 정제된 산물에 대하여 유사한 수율이 달성되었다.

팽창 연구

다양한 크기와 형상으로 획득된 산물, 예를 들면, 나노입자, 마이크로입자, 필름, 막대, 스펀지, 겔은 이중-증류수에서 높은 팽창 정도를 보인다. 앞서 보고된 바와 같이, 이런 특성은 본 발명의 하이드로겔에 잠재적 생체적합성을 공여하는데, 이는 양 출발 중합체의 생체적합성에 의해 확증되고, 따라서, 생물의학 분야와 제약 분야에서 이들 산물의 광범위한 활용 가능성을 제공한다.

앞서 정의된 몰 비율 X와 Y를 변화시킴으로써 이들 실시예의 설계에 따라 수득된 일련의 HA-PAHy 스펀지를 이용하여, DPBS 완충액 pH 7.4와 구연산염 완충액 pH 6.3에서 팽창 검사를 수행하였다. 적절한 절차를 이용함으로써, 팽창 행태(swelling behavior)는 팽창된 스펀지의 평형 중량(equilibrium weight)과 동일한 스펀지의 건물 중량(dry weight) 사이의 비율(Q)로 표시하였다.

수용성 매체로서 2가지 상이한 완충액을 이용함으로써 수행된 이들 실험의 일부 결과는 도 1과 2에 도시한다. 이들 수치를 검토함으로써, 인산염 완충액에서 팽창 수치가 구연산염 완충액에서 상응하는 Q 수치의 2배임은 명백하다. 게다가, 양 매체에서, 스펀지에서 PAHy의 양(1 내지 2 사이의 X 비율)을 증가시킴으로써, 팽창 능력에서 약간의 증가가 발생하는데, 이는 더욱 작은 Y 수치에서 더욱 명백하다.

화학 분해와 효소 분해 연구

상기 실시예 1과 2의 설계에 따라 수득된 산물은 인산염 완충액 pH 7.4(이는 세포외액을 모방한다)와 pH 5.5(이는 피부 pH를 모방한다)에서 10일간 37℃에서 화학 가수분해 연구를 실시하였다. 10일후, 산물은 회수하고, 이중-증류수에서 세척으로 정제하며, 냉동 건조시키고, 칭량하여 분해 비율을 결정하였는데, 이는 4% 이하이었다.

다른 일단의 실험에서, 다양한 몰 비율 X와 Y에서 수득되는 상기한 일련의 하이드로겔은 폭넓게 세척하고 냉동 건조시키며, 이후 히알루로니다아제의 존재 또는 부재하에 구연산염 완충액 pH 6.3에 유지시켰다. 후자는 각각, 75와 150 U/㎖의 농도에서 2가지 상이한 검사에 이용하였다. 고정된 시간동안 교반하에 37℃에서 항온처리(incubation)이후, 적절한 분석 절차를 이용하여 하이드로겔 분해의 정도를 평가하였다.

책임 효소의 2가지 상이한 농도로 화학 분해(HAase의 부재)와 효소 분해의 일부 검사의 결과는 각각, 도 3, 4, 5에서 도시한다. 이 경우에, 이들 검사는 하이드로겔 제조에 이용된 몰 비율 X와 Y의 함수로서 일련으로 집합된다. 이들 도면을 검토함으로써, 이 실험을 위하여 선택된 각 매체에 대하여 스펀지의 점진적인 분해가 발생한다는 것은 명백하다. 각 일련에서, X의 수치가 동등한 경우에, 분해는 Y의 수치를 증가시킴으로써 감소한다. 이는 예상된 바와 같이, 가교결합의 효율이 EDC와 NHSS의 양을 증가시킴으로써 증가한다는 것을 의미한다.

이에 더하여, Y의 수치가 동등한 경우에, 가교결합제(PAHy)의 양, 다시 말하면, X의 수치를 증가시킴으로써 분해 비율에서 명백한 감소가 관찰되는데, 이는 가교결합 정도를 감소시킴으로써 분해 속도가 증가한다는 것을 입증한다. 최종적으로, 분해에 최대 저항성을 보이는 스펀지는 X=1과 Y=1에서 수득되는 스펀지일 것으로 예측될 수 있다; 실제로, 2주후, 이는 HAase의 부재하에 10%의 분해만을 보인다.

이들 결과를 고려하면, 본 발명에 따른 하이드로겔이 시간에 따라 가수분해 또는 효소 분해가 진행되는 이점을 보유하고, 게다가 본 발명의 산물의 제조 조건을 변화시킴으로써 원하는 적용의 함수로서 사전에 고정될 수 있음은 명백하다. 제조된 물질은 우수한 압축성(compactness)과 탄성(elasticity) 이외에, 수일간 화학 가수분해와 효소 가수분해에 저항하지만, 오랜 기간이후 완전히 생물분해되고 재흡수될 수 있다.

이들 이점은 비용 및 용이한 생산을 불리하게 하지 않으면서 본 발명에 의해 달성된다. 대조적으로, 후자는 매우 간편하고 저렴하며 높은 수율로 쉽게 재현될 수 있다. 최종적으로, 본 발명에 따라 제안된 생체적합물질이 히알루론산의 생체적합성과 합성(인공) 중합체의 독특한 특성 사이의 우수한 조합, 예를 들면, 화학적 다능성(chemical versatility), 용이한 가공성(easy processability), 저렴한 생산(low-cost production)을 달성함은 명백하다.

본 발명은 일부 특정 구체예를 참조하여 기술되었지만, 첨부된 특허청구범위 에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 다양한 개변이 당업자에 의해 가능하다.

Claims (23)

1. 폴리하이드라지드(polyhydrazide) 중합체와 화학적으로 가교결합된 히알루론산(hyaluronic acid)을 함유하는 조성물에 있어서, 히알루론산의 이당류 단위의 하나이상의 카르복실기가 폴리하이드라지드 중합체의 하나이상의 하이드라지도(hydrazido) 기에 개별적으로 화학적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 폴리하이드라지드 중합체는 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1항 또는 2항에 있어서, 히알루론산은 50,000 내지 1,500,000 달톤의 분자량을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 2항 또는 3항에 있어서, 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드는 2,000 내지 40,000 달톤의 분자량을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 폴리하이드라지드 중합체와 화학적으로 가교결합된 히알루론산으로 구성되는 하이드로겔(hydrogel)에 있어서, 히알루론산의 이당류 단위의 하나이상의 카르복실기가 폴리하이드라지드 중합체의 하나이상의 하이드라지도 기에 개별적으로 화학적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
6. 제 5항에 있어서, 폴리하이드라지드 중합체는 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
7. 제 6항에 있어서, 히알루론산은 50,000 내지 1,500,000 달톤의 분자량을 보유하고, 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드는 2,000 내지 40,000 달톤의 분자량을 보유하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
8. 제 6항 또는 7항에 있어서, 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드의 반복 단위(repeating unit)의 몰과 히알루론산의 반복 단위의 몰 사이의 비율은 0.01 내지 5인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
9. 제 5항 내지 8항중 어느 한 항에 있어서, 활성화제(activating agent)로서 카르보디이미드(carbodiimide)의 존재하에 히알루론산과 폴리하이드라지드 중합체를 반응시킴으로써 수득되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
10. 제 9항에 있어서, 카르보디이미드는 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
11. 제 10항에 있어서, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드의 몰 과 히알루론산의 반복 단위의 몰의 비율은 0.01 내지 10인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
12. 제 9항 내지 11항중 어느 한 항에 있어서, 추가의 활성화제로서 N-하이드록시숙신이미드의 존재하에 더욱 수득되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
13. 제 12항에 있어서, N-하이드록시숙신이미드는 N-하이드록시술포숙신이미드인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
14. 제 13항에 있어서, N-하이드록시술포숙신이미드는 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드와 동일한 몰량(molar amount)으로 존재하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
15. 제 5항 또는 6항에 정의된 하이드로겔을 생산하는 제조 방법에 있어서, 히알루론산과 폴리하이드라지드 중합체는 이중-증류수(double-distilled water)에서 미리 정해진 몰 비율(molar ratio)로 용해되고, 여기에 정해진 양의 카르보디이미드가 첨가되고, 생성된 반응 혼합물은 1시간 내지 5일의 기간동안 0℃ 내지 60℃의 온도에서 유지되고, 후속으로 상기 산물이 하이드로겔 형태로 회수되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
16. 제 15항에 있어서, 폴리하이드라지드 중합체는 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드이고, 카르보디이미드는 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
17. 제 15항 또는 16항에 있어서, 반응 동안, pH는 3 내지 8의 범위에 유지되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
18. 제 15항 또는 16항에 있어서, 카르보디이미드 이외에, 사전에 미리 정해진 양의 N-하이드록시숙신이미드가 첨가되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
19. 제 18항에 있어서, N-하이드록시숙신이미드는 N-하이드록시술포숙신이미드인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
20. 제 18항 또는 19항에 있어서, 반응 동안, pH는 4 내지 10의 범위에 유지되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
21. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 나노입자, 마이크로입자, 필름, 막, 막대, 스펀지 또는 겔의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물과 겔.
22. 폴리하이드라지드 중합체와 화학적으로 가교결합된 히알루론산으로 구성되는 하이드로겔의 in situ 제조를 위한 키트에 있어서, 첫 번째 히알루론산-기초된 성분을 보유하는 용기 및 두 번째 폴리하이드라지도 중합체-기초된 성분을 보유하는 용기를 포함하고, 이들 두 성분은 상호 접촉이후, 적용 부위(application site)에서 직접적으로 하이드로겔을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 키트.
23. 제 22항에 있어서, 폴리하이드라지드 중합체는 알파,베타-폴리아스파틸하이드라지드인 것을 특징으로 하는 키트.

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