KR20070023625A

KR20070023625A - 중아황산염을 활용한 디엔에이의 전환방법 및 그의사용용도

Info

Publication number: KR20070023625A
Application number: KR1020067006684A
Authority: KR
Inventors: 커트 베를린; 마티아스 발하우세; 카렌 카르돈
Original assignee: 에피제노믹스 아게
Priority date: 2003-10-09
Filing date: 2004-10-11
Publication date: 2007-02-28

Abstract

본 발명은 중아황산염을 활용한 DNA의 전환의 개선방법에 관한 것이다. 용제를 변성시키는 화합에 의해, 중아황산염의 효능에 대한 신규반응조건 및 신규 정제방법이 개선되어진다. 전환된 DNA는 서로 다른 방법에 의해 연속적으로 분석된다. 본 발명은 시토신 메틸화의 해석을 용이하게 한다.

DNA, 중아황산염

Description

중아황산염을 활용한 디엔에이의 전환방법 및 그의 사용용도{Improved bisulfite conversion of DNA}

본 발명은 DNA구조에서 시토신 메틸반응을 검출하는 방법에 관련한 것이다.

5-methylcytosine(메틸시토신)은 공유결합 형태의 염기로서 진핵세포의 DNA에 가장 널리 적용된다. 예를 들면 유전정보의 전환, 유전적 인식, 종양발생의 원인의 규명에 메틸시토신은 역할을 수행한다(참고: Miller et al.: Five not four: History and significance of the fifth base. in S. Beck and A. Olek, eds.: The Epigenome 신개체 발생학. Wiley-VCH 출판사 바인하임 2003년 페이지 3-20). 5-메틸시토신의 식별은 유전정보를 얻을 수 있는 주요요소에 속하며 대단한 관심을 유발시키는 주제이다.

5-메틸시토신의 위치는 유전자배영을 활용하여 찾아낼 수 없다. 찾을 수 없는 원인은 5-메틸시토신은 시토신처럼 쌍염기의 형태를 취하고 있으므로 어찌되었든지 찾을 수가 없다. 한가지 더 첨가하여 말하자면 폴리메라제연쇄반응 확대(PCR Amplification)에서 5-메틸시토신에서 발생되는 새로운 개체 유전정보가 완전히 소실된다. 메틸화 분석에서 사용되는 일반적인 방법은 두가지의 서로 다른 근본 원리에 의하여 시행되고 있다.

한가지는 특정의 메틸화 효소를 사용하거나, 다른 방법은(중아황산염을 처리하여)메틸화되지 않은 시토신에 선택적으로 화학적 변화를 발생시켜 시토신을 우라실로 전환시키는 방법이 있다. 효소학적으로 혹은 화학적으로 전처리된 DNA는 확대되고 여러 가지 방법에 의하여 분석되어진다(for review: Fraga and Esteller: DNA Methylation: A Profile of Methods and Application. Biotechniques 33:632-649, Sept. 2002 WO 02/072880 pp. 1 ff).

특수한 메틸화 효소의 사용은 DNA배열상의 부위에서 한정된 부위에서 이미 언급된 효소들의 인식작용으로 반응되며, 대부분의 이러한 적용은 중아황산염의 처리에 의하여 실행된다(랙 review: US 10/311, 661).

"중아황산염“ ”중아황산염의 처리“ ”중아황산염의 방법“ 들의 발명방법에 의하면 시토신 염기의 전환반응을 의미하며 이때 핵산에 포함된 시토신 염기를 우라실 염기로 전환시키며 중아황산이온의 존재 하에서 5-메틸시토신은 유의적으로 변화되지 않음을 의미한다. 중아황산염의 반응은 탈아미노 반응이 단계적으로 포함되고 탈설폰 반응도 단계에 포함되며 별도로 혹은 동시에 반응이 수행된다(더 자세한 내용과 반응단계는 EP 1394/72A1에서 설명되고 자료는 온전히 참고에 의하여 구체적으로 설명되어져 있다). Hayatsu외 여러 사람들을 포함하여 중아황산염의 반응에 관하여 특수한 현상에 관하여 여러 가지 실험 결과의 자료들을 언급하였다(Biochemistry 9 (1970) 2858-28659; Slae and Shapiro, J.Org. Chem. 43 (1978) 4197-4200; Paulin et al., Nucl. Acids Res. 26 (1998) 5009-5010;Raizis et al. Nucleic Acids Res. 8(1980) 4777-4790. 이 자료들은 종합요약되어 EP 1394172A1에 완전한 참고 자료로서 설명되고 있다.

중아황상염의 처리는 다음과 같은 방법으로 시행되었다. 유전체에서 DNA를 추출하여 기계적 혹은 효소학적으로 분획시킨다. 다음은 NaOH를 사용하여 변성시키고 농축된 중아황산염용액으로 몇시간 동안 반응시키고 마지막으로 탈설폰화시키고 탈염시킨다(예를 들면:유전자 배열의 초안은 각각 DNA가닥에 있는 5-메틸시토산의 잔유물에 확실히 표시를 할 수 있게 되었다. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Mar 1;89(5): 1827-31).

최근에 들어서면서 중아황산염으로 처리하는 방법에 관하여 여러 가지 기술적 방법이 개발되었다. 한천우무 아가 비즈 방법이 DNA와 결부되어 연구조사 하게 되고 한천우무아가배지에서 시행되어 DNA의 확산과 DNA의 원형재현 현상을 방지할 수 있게 되었다(중아황산염은 단지 단일한 DNA 가닥에만 작용한다). 모든 침전물과 정제는 단계별로 급속으로 분리시켜 제거하였다(Olek A. et al. 중아황산염에 의한 시토신의 메틸화 분석의 응용개발 방법, Nucl. Acids Res. 1996, 24, 5064-5066). 특허출원 WO 03/038121(=DE 100 29 915; = US application 10/311,661)에서 중아황산염의 처리 및 전환에 관한 방법을 제시하였고 방법은 DNA 시료를 중아황산염의 농도 0.1Mol/l에서 6 M0l/l이며 이 농도에서 변성물질과 최소 한가지의 포착제의 존재하에서 배양시킨다. 위의 언급된 특허출원에서 여러 가지 변성 물질과 포착제에 대하여 기술하였다(자료는 온전히 참고하여 구체적으로 설명되어졌다). 특허출원 WO 03/038121(=DE 101 54 317; =10/416,624)에서는 중아황산염으로 처리되는 동안 DNA는 고체의 표면에 결합되어져 분석이 되는 방법으로 방법론이 공개되었다. 결론적으로 정재와 세척은 단계별로 용이하게 시행될 수 있다. 한편 한층 더 개선된 방법이 특허출원 EP1394173A1과 EP1394172A1에서 설명되어지고 있다(참고문헌으로 온전히 설명되어졌다). 그렇지만 중아황산염의 처리로 인한 근본적인 문제는 완전한 전환과 잘 못된 결과를 배제하기 위하여 시행되는 장시간의 반응이 요구된다는 점이다. 동시에 장시간의 반응이 요구됨으로 인하여 DNA가 붕괴되는 현상을 초래한다.

반응의 온도가 상승함에 따라서 전환율도 상승됨은 사실이나 DNA의 붕괴되는 강도는 더 많아진다. 온도, 반응시간, 전환비율, 붕괴 네가지 요소들이 상호연관관계에 관하여 오늘날 조직적으로 연구 조사되었다. 이 연구 조사에서 가장 높은 전환율이 온도 55℃ 반응시간 4-18시간 이 소요되었으며, 95℃에서는 반응시간이 약 1시간 소요됨을 보여 주었다. 심각한 문제는 이 반응과정에서 DNA가 붕괴된다는 현상이 발생된다. 반응온도 55℃에서 84-96%의 DNA가 95℃에서는 훨씬 더 많은 DNA가 붕괴 되었다(Grunau et al.: Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 2001 Jul 1;29(13): E65-5; 참고문헌이 온전히 설명되어졌다). 그러므로 대부분의 연구 발표자들은 반응 온도를 대략 50℃를 설정하였다(참고: Frommer et al., loc.cit. 1992, p. 1827; Ol다 et al., loc. cit. 1996, p. 5065; Raizis et al: A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal Biochem. 1995 Mar 20;226(1): 161-6,162). 첨부하여 DNA에 높은 붕괴율이 발생되는 점에 대하여 설명한다면 전통적 아황산염의 처리에서 다른 문제가 존재하고 있기 때문이며 실은 DNA전환을 위한 강력한 정제방법이 서술되어져 있지 않다. 대부분의 저자들은 침전법을 사용한다(참조 Grunau et al. loc.cit). 정제방법에 있어서는 DNA가 결합되는 표면을 정제하는 방법이였다 (참조. Kawakami et al.: 플라스마에 과다메틸 APC DNA 와 식도암 환자의 예후. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, No. 22, 2000, pp. 1805-11).

하지만 이렇게 정제하는 생산 방법으로는 한계가 있다. 전통적 방법인 중아황산 염의 처리에 의한 높은 손실은 이러한 방법을 적용하여 연구 조사하여 본 결과 DNA의 절량을 분석하는데 한계를 가져왔다. 특별히 메틸화 분석에 관심을 가지고 있는 분야는 체내의 체액, 혈액, 소변으로부터 DNA를 분석하여 메틸화 현상과 연관시켜 암 발생의 진단 혹은 질병의 진단에 적용될 수 있다. 그러나 메틸화 현상 분석의 적용은 전통적인 중아황산염 처리 방법으로는 분석하여 산출하는데 한계성이 있다. 따라서 시토신 메틸화 분석이 특별히 중요함을 근거로 하여, 또한 전통적인 방법에 타당성이 없음을 근거로 하고 있으므로 중아황산염을 이용한 전환 방법에서 상당한 기술적인 필요성과 개선된 방법으로 요구가 충족되어져야한다. 어떤 변성을 유발시킬수 있는 새로운 용매가 발견되고 이 용매의 첨가가 중아황산 염의 반응으로 전환율을 상승시키는 기대치 못한 놀라운 방법이 발견되었다. 동시에 전환율이 확실히 개선되고 붕괴율이 감소되었다. 이 변성용매는 용도가 형태적으로 알려졌지만 용매의 선발에 있어서 이러한 강력한 효과를 유발시킬 수 있으리 라고는 기대하지 못하였다. 동시에 명확히 향상된 전환율과 감소된 붕괴율은 이미 언급 한 새로운 용매의 적용으로 또 다른 중요한 장점을 창출하게 되었다. 일반적인 중아황산염의 처리는 고농도의 중아황산염의 존재하에서 시행된다(Fraga와 Esteller가 추천한 최종농도는 5 mol/l page 642, 왼쪽칼럼, 제 2절에서). 어찌되었든지 이러한 고 농도의 염 농도에서는 높은 붕괴율을 초래하며 다음단계에서 정제과정과 확대에서 문제를 초래한다. 한층 더 유리한 방법으로는 n-alkylenglycol(알킬렌 글리콜)을 변성물질로서 현재까지 발견된 변성물질보다 더 많은 수용성 용해도를 유지한다. 그런결과 반응물질, 포착제를 포함하여 적용할 수 있는 범위가 넓어졌다. 새로운 용매들과 결부되어 최상의 반응조건과 새로운 정제 방법으로 효과적인 전환방법으로 개선되어졌다. 민감한 DNA 메틸방법은 조직이나 체액의 분석이 가능하여졌다.

본 발명의 구체적인 내용은 중아황산염에 의한 DNA의 전향이며, 전향과정에서 DNA는 중아황산염과 반응을 하며, 반응은 디옥산(dioxane) 그룹으로부터 유래된 복합물, 이 복합물의 유도체 중 하나 및 지방족 고리 에테르와 유사한 물질의 존재하에서 진행됨을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 구체적인 내용은 중아황산염을 이용한 DNA의 전향이며, 전향과정에서 DNA는 중아황산염과 반응을 하며 다음의 형태와 같은 복합물의 존재하에서 반응이 진행됨을 특징으로 한다.

이때, n = 1-35000

m = 1-3

R₁ = H, Me, Et, Pr, Bu

R₂ = H, Me, Et, Pr, Bu

그러므로 n-알킬렌 글리콜 복합물이 선호되고, 특히 복합물 중 알킬 에테르가 선용되며 그 중에서도 디에틸렌네 글리콜 디메틸 에테르(DME)가 선용된다. 두가지의 구체적인 내용은 DNA는 의학적 진단분야와 과학적 연구 분야로 나누어져 의존되며 서로의 취지에 따라서 연구 조사가 착수된다. 진단학적인 연구 조사에서는 세포 조직이 시료가 선호적으로 선택되어 최초 시료물질로서 적용되며, 체액도 시료로서 사용이 가능하며 특히 유장액 이나 혈장이 사용되어진다. 뿐만 아니라 타액, 소변, 대변, 뇌 척수액의 DNA를 사용 하는 것도 가능하다. 선처되는 점은 DNA는 생물의 표본에서 채취되어져야 한다. DNA는 표준 방법으로 예를 들면 혈액 등으로부터 퀘아겐 울트라센스 DNA추출 도구를 사용하여 추출되어진다. 다른 방법에 있어서는 DNA의 정제방법에 대하여서는 기술적으로 숙달된 사람들에게는 방법이 알려져 있다. 다음단계는 연속적으로, 추출되고 정제된 DNA는 일정한 효소들의 작용으로 분해된 조각들로 나누어진다. 반응조건과 효소들의 작용은 기술적으로 숙달된 기술자에게는 알려져 있고, 예를 들면 제조업체들의 프로토콜 설명서에서 알아낼 수 있다.

중아황산염에 의한 전환은 이미 언급한 실천 계획에 따르면 성취될 것이다. 반응들은 용액에서 뿐만 아니라 DNA가 결합된 고체 상태에서도 발생될 수 있다. 나트륨 디슬피드(나트륨 비슬피드,피로 아황산 나트륨)가 나트륨 슬피드보다 물에 잘 녹기 때문에 우선적으로 적용이 된다. 디슬피드염은 수용액에서의 전리에서 히드로겐 슬피드 음이온이 시토신을 전환할 만큼 균형을 이루고 있지 않다. 중아황산염의 농도에 관하여 다음 아래에서 설명되며, 히드로겐 슬피드와 슬피드-음이온 들의 반응 용액에서 농도를 설명하고 있다. 본지의 발명 방법에 따르면 농도의 범위가 0.1에서 6 mol/l까지 가능한 범위이다. 특별히 선호 한다면 농도를 2-4mol/l 로 결정하면 된다. 디옥산이 사용되어지면 중아황산염의 사용될 수 있는 최대의 농도는 낮아진다(아래 사항을 참조). 중아황산염의 농도를 확정할 시 고농도의 중아황산염은 전환율을 높여주지만 이런 경우 pH가 저하되면서 붕괴율을 상승시켜준다.

디옥산은 서로다른 농도에서 사용되어질 수 있다. 디옥산은 우선적으로 10-35%(용량/용량)으로 적용이 되며 특히 20-30%가 선호되며, 가장 많이 선호될 수 있는 농도는 특별히 25%이다. 디옥산의 농도가 35% 이상이면 두 개의 형상으로 반응용액내부에서 분리되는 결과를 초래하는 문제점을 발생시킨다.

특별히 언급할 구체적인 사항으로 디옥산은 농도가 22-28%이며, 최종적으로 선호될 수 있는 중아황산염의 농도는 3.3에서 3.6mol/l의 범위이며, 가장 특별히 언급할 구체적인 사항은 디옥산의 농도 25% 이며 이것은 3.5 mol/l에 해당된다( 실예 참조).

n-알킬렌 글리콜 복합물들은 본 연구에 의하면 서로 다른 농도의 범위에서 사용되어질 수 있다. DEM은 가 우선적으로 농도의 범위가 1-35%(용량/용량)에서 적 용될 수 있으며, 선호적으로는 5에서 25%까지의 범위에서 적용되며, DEM의 가장 적합한 선호 농도는 10%이다.

선호되는 포착제는 본 발명의 결과에 의하면 크로만 유도체이며, 예를 들면 6-히드록시-2,5,7,8,-테트라메틸크로만 2-카르복실 산(트로록시-C 로 알려져 있음).

포착제에 대하여 더욱 자세한 내용은 특허출원 WO 01/98528(=DE 100 29 915; = US 출원 10/311,661; 여기에 온전히 설명되어져 있음)

중아황산염에 의하여 전환되는 방법에서 상당히 넓은 범위 내에서 그 범위가 0-95℃에서 실행된다(위를 참조). 어떻게 되었든, 온도가 높을수록 전환율이 높고 DNA의 분해가 증가된다. 본 연구 발명에서 언급할 구체적인 사항은 반응온도 범위는 30-70℃이며 특별히 우선적으로 45-60℃를 선택을 하며, 가장 특별히 선호되는 온도는 50-55℃ 사이에 놓여있다. 중아황산염의 최적 반응시간은 처리에서 반응 온도에 의존되어져 있다. 반응시간은 정상적으로 1에서 18시간 사이로 정하여져 있다( 참고:Grunauet al. 2001, loc. cit). 반응시간은 반응온도 50℃에서 보통 4-6시간 소요된다.

특별히 구체적으로 언급할 발명의 방법에서는, 중아황산염으로 인한 전환은 온화한 반응 온도에서 반응온도는 명백히 짧은 시간에 증가하고 최소한 한번은 전환과정에서 발생되었다.

이러한 방법으로, 중아황산염으로 인한 전환은 놀랍게도 효력이 증가되었다. 이 짧은시간에 온도가 상승되는 현상을“테르모 스파이크”라고 부른다. 표준 반응 온도는 테르모스파이크를 제외하고 기초반응온도로 표시된다. 기초반응온도는 0℃에서 80℃의 범위에 놓여져 있으며 우선적으로 30-70℃가 적용되며, 가장 선호되는 온도 범위는 45-55℃로서 위에서 서술한 것과 같다. 테르모 스파이크가 발생되는 동안 반응온도는 단 한 번의 테르모 스파이크에도 85℃ 이상으로 증가 된다. 가장 적합한 테르모 스파이크의 횟수가 기본 반응 온도에서의 기능에 해당된다. 테르모 스파이크의 횟수가 높을수록 기초적인 반응온도는 감소한다. 필수적으로 최소한 한번의 테르모 스파이크 필요로한다. 한편으로는 원칙적으로 테르모 스파이크의 횟수가 얼마나 될지를 예상할 수 있다. 물론 온도가 많이 상승될 수 있다는 점도 참작할 수 있다. 그리고 DNA의 붕괴율도 증가하여, 최적의 전환을 기대하기 어렵다.

선호되는 테르모 스파이크의 숫자는 1에서 10회가 각각의 시간에 해당되지만, 기초 반응 온도에 따라 의존된다. 2에서 5의 테르모 스파이크 숫자가 특별히 선호된다. 테르모 스파이크는 반응온도가 85-100℃ 상승되며 특별히 선호되는 온도는 90-98℃이며 가장 선호되는 온도는 94-96℃ 범위에 놓여있다.

테르모 스파이크의 지속되는 시간은 반응조의 용량에 의존되어져 있다. 온도의 상승 속도는 반응 용액의 모든 내용물들에서 한결같이 일정한 속도로 상승된다. 20미크로 리터 용량의 반응조인 경우에는 테르모 사이클을 15초에서 1분범위 내에 유지하는 것이 유리하며, 선호되는 시간은 20 내지 50초 범위이며, 특별히 선호되는 지속시간은 30초이다. 100 미크로 리터의 용량을 적용할 경우 선호되는 범위는 0초에서 5분 범위이며, 특별히 1-3 분간 적용할 수 있으며, 특별히 선택되는 시간은 1.5분이다. 600미크로리터의 용량인 경우 지속되는 시간은 1-6분이며 특별히 2-4분간 선호되며, 가장 특별히 선호되는 지속시간은 3분으로 정할 수 있다. 기술적으로 숙달된 실험 담당자라면 합당한 테르모 스파이크 지속시간을 반응되는 용량에 따라서 산출하여 결정할 수 있다.

상기 기술된 테르모 스파이크의 적용방법은 중아황산염의 전환 반응에 있어서 유의적으로 비단 변성 재료를 사용하지 않았다 하더라도 전환율을 상승시킬 수 있다. 본 연구 발명에 의하면, DNA의 전환을 위한 중아황산염의 처리 방법은 본 연구에서 기초 반응온도는 0℃에서 80℃ 범위, 바람직하게는 30-70℃, 더욱 바람직하게는 45-55℃에서 처리되나 반응온도는 순간적으로 85℃이상으로 최소 한번은 상승된다. 우선적으로 선호되는 테르모 스파이크는 1에서 10회이며 근본적으로 반응 온도에 의존되어져 있다. 그 중에서 2번에서 5번의 테르모 스파이크가 특별히 선호된다. 테르모 스파이크가 진행되는 과정에서 반응온도는 85℃ 에서 100℃ 까지 상승이 된다. 특히 선호하여야 할 범위는 90-98℃이며, 가장 선호될 수 있는 범위는 94℃에서 96℃에 놓여 있다.

어떤 온도에서 지속되는 시간적 간격은 반응조의 용량에 의존되어져 있다.

중아황산염에 의한 전환이 완료되면 DNA는 탈설폰화 과정과 정제과정에 들어선다. 이러한 목표를 달성시키기 위하여 여러방법들이 알려져 있다(예를들면: DE 101 54 317 A1 = US 10/416,624; Grunau et al. 2001,loc. cit.). 정상적인 처리에서, 반응용액은 최초로 가성소다와 함께 처리된다. 처리 후 중화시키고 알콜을 이용하여 DNA를 침전시킨다. 본 발명에서 상세한 내용들이 구체적으로 설명되면, 정제는 젤-여과(예를 들면: 세파덱스-G25 칼름)를 이용하여 시행되었다. 중아황산 염 은 차 후에 세척의 필요성이 없도록 효과적으로 제거되었다. 제 이차적으로 언급할 구체적인 내용은 정제는 DNA가 결합된 표면에서 수행되었다. 예를 들면 프로메가의 비자드 DNA 정제 수지를 이용하여 시행되었다(참조: Kawakami et al., loc. cit.). 제 삼차적으로 언급할 구체적인 내용은 정제하기 위하여 자석입자들을 사용하였으며, 예를 들면 마그나-퓨어의 도움으로 진행하였다. 이러한 정제방법은 본 발명에 의하면 n-알킬렌 글리콜 복합체와의 결합에서 특히 DEM과의 결합에서 좋은 결과를 가져왔다. 정제 방법은 제조업자의 지시방법에 의하여 시도되었다. 숙달된 기술자에게는 표준화된 실험법에 의한 제조 지침서의 응용으로 한 층 더 수확을 확보할 수 있다. 이와 동반하여, 최상의 실험기획서가 발명의 한 분야가 된다. 한 층 더 나아가서 젤 여과, DNA-결합 표면 방법 그리고 자석 입자들을 적용한 핵산을 정제 방법은 핵산을 기술적으로 정제하기 위한 기술적인 지침이였으며 기술적으로 숙달된 사람들에게는 방법이 알려져 있고 제조업체들의 사용 지침서에서 적용될 수 있다. 가장 특별히 구체적으로 언급할 사항은 정제는 초여과 방법에 의하여 시행된다. 이러한 정제처리 방법은 기술적으로 유리한 점이 많이 있으며 전환된 DNA의 정제에서 놀라운 성공적인 결과를 가져왔다. 전환된 DNA의 수확율은 대단히 높다(85% 이상, 실예 6을 참조). 이것은 고분자 DNA 뿐만 아니라 DNA의 일부인 파편(예를 들면 체액)에서도 좋은 결과를 가져온다는 점은 사실이다. 중아황산염으로 처리된 DNA의 전통적인 추출방법은, 상대적으로, 단지 수확율이 약 25%에 지나지 않는다. 초여과 방법은 또 다른 장점을 기대할 수 있다. 예를 들면 정제는 사용되어지는 시료의 분량에 대하여 대단히 융통성이 있다는 점이다. 덧붙여 이야기 하면 중아황산 염은 거의 완전히 제거될 수 있다. 한마디 더 말한다면 탈설폰은 시간당 축척할 수 있는 여과막을 통하여 제거될 수 있다. 정제방법은 이러한 기구를 제조하는 업체의 사용 설명서를 참고 할 수 있다. 정제라는 목적을 달성키 위하여, 중아황산 반응 용액이 수분과 함께 혼합되어 초여과 장치에서 시행된다. 여과가 끝나면 15분간 원심분리를 시행하고 TE-완충용액 한번의 세척이 실시된다. 이과정에서 DNA는 여과막에 잔류 하게 된다. 다음단계는 탈설폰이 시행된다. 탈설폰을 실행하기 위하여 0.2 mol/l 가성소다가 첨가되고 DNA 는 10분간 배양되었다. 재차 원심분리가 10분간 실시되고 난 후 TE-완충용액으로 한번의 세척이 실시되었다. 다음단계에서 DNA는 용리시켰다. 이 목적을 달성하기 위하여 여과막은 50 미키로리터의 따뜻한(50℃) TE-완충용액으로 10분간 침지하였다. 투과막은 제조업체의 지시대로 한번 뒤집었다. 여과막에서 DNA가 제거되고 그리고 원심분리가 실시되었다. 이제 용혈이 시작되고 용혈은 직접 의도형 측정반응법이 적용되었다. 초 여과 분야에서 숙달된 기술자라면 다른 과정에서도 다른 초 여과 시스템을 적용하고 지시할 수 있을 것이고, 위에서 제시한 조건들을 변경시켜 옳은 수확을 거두어 드릴 것이다. 여기에 상응되는 구체적인 방법들은 물론 본 발명의 한 분야로 보아야 한다. 변성용매가 적용되지 않거나 테르모 스파이크가 발생되지 않고 전환이 발생 되었을 때, 적용된 초 여과 방법은 중아황산염으로 전환된 DNA의 정제를 명확히 향상시켰으며 유용한 방법임을 제시하였다. 그러므로 본 연구에 의하면 중아황산염에 의한 DNA의 전환은 본 발명에서 전환된 DNA가 초 여과 방법에 의하여 정제가 될 수 있음을 특징으로 할 수 있다. 최초의 시험물질은 설명한바 진행된다. 테르모 스파이크가 적용된다. 선호될 수 있는 온도의 범위, 테르모 스파이크의 횟수, 스파이크의 지속시간은 위에서 서술한 범위와 상응한다. 초 여과 방법은 위에서 서술한 것처럼 선호적으로 적용될 수 있다. 선호된 사항을 구체적으로 나열한다면 밀리포 업체가 제작한 미크로콘 칼름이 사용되었다. 정제방법은 선호적으로 위에서 설명한 것처럼 제조업체가 설명한 설명서를 응용하였다. 기술적으로 숙달된 사람이라면 다근 초 여과 시스템의 진행 방법을 설명하고 지시할 수 있다. 위에서 제시한 조건을 변경하여 향상된 수확을 가져올 수 있다. DNA가 위에서 언급한바 여러 가지 구체적인 방법을 경유하여 전환되고 정제되었으며 여러 가지 방법으로 현재까지 분석되었다. 특별히 처음으로 폴리메라제 체인 반응(PCR)에 의하여 확대되는 점을 설명하려고 한다. 원래 메틸화 되거나 메틸화 되지 않은 DNA는 여러 가지 방법을 통하여 선택적 확대를 확실히 할 수 있다. 예를 들면 소위 말하는“중메틸"방법(참조: 메틸 반응 특수 차단제를 이용하여 실시간 PCR 분석을 통한 메틸반응 Nucleic Acids Res. 2004 Jan 13,32(1): e10. WO 02/072880.) 혹은 소위 말하는“메틸 반응에 민감한 PCR”:( 참조: Herman et al.: 메틸 반응에 특수한 PCR 효소: CPG 농축된 섬 상태를 분서하기위한 새로운 PCR효소. Proc Natl Acad Sci. U S A 1996 Sep 3;93(18): 9821-6). 확대는 전통적인 방법을 이용하여 발견하였다. 확보된 확대는 전통적인 방법을 이용하여 검출하였다(예를 들면: 일차확대반응(MsSNuPe: 참조 예: DE 100 10 280= U S 10/220,090) 혹은 오리고 분자들을 분석하기위한 중합반응을 경유하여(참조: Adorjan et al., 미량분석을 토대로한 DNA-메틸화 분석에 의한 종양 종류의 예견과 발견. Nucleic Acids Res. 2002 Mar 1;30(5):e21). 확대는 PCR 실재시간을 사용하여 변이체를 분 석되었다는 점을 한가지 특별히 선호적으로 언급한다(참조: US 6,331,393 "메틸 빛“). 변이체들은 ”태크만 방법“ 과 ”라이트 사이클 방법“에 의하여 분석되었다.

여기에 게시된 방법은 환자 또는 일반인의 역 현상에 대한 진단 및/또는 예후에 대해 적절하게 이용되는 것으로서, 역 현상은 예컨대 다음의 범주 중 적어도 어느 하나 즉, 원치않은 약물상호작용; 암질환; 중추신경계 기능장애, 손상 또는 질환; 공격적 성향 또는 습관적 행동불안증상; 뇌손상의 임상적, 심리적 및 사회적 고통과; 심리불안 및 정서분열; 노인성 치매 및/또는 그와 관련된 증후군; 심혈관 질환, 기능장애 및 손상; 위장계의 기능장애, 손상 또는 질환, 호흡기관계의 기능장애, 손상 또는 질환; 장애, 염증, 전염, 면역 및/또는 회복기; 발달단계에서의 비정상적 신체의 기능장애, 손상 또는 질환; 피부, 근육, 결체조직 또는 뼈의 기능장애, 손상 또는 질환; 내분비선 및 신진대사의 기능장애, 손상 또는 질환; 두통 또는 성기능장애 중 어느 하나에 속한다.

신규의 방법은 또한 세포형식의 조직을 식별하거나 또는 세포파생을 조사하기 위한 대표적인 방도로 역할한다.

이 신규의 방법은 또한 특히 환자의 약물처리에 대한 반응을 분석하기 위한 방법에서도 바람직한 역할을 한다.

본 발명의 과제는 또한 중아황산염을 포함하는 시약을 포함하고, 이 시약 또는 용제, 및 포착제, 확대제의 제조를 위한 프라이머를 변성시키고, 선택적으로 시료분석을 실행하기 위한 초정제관 또는 지시서를 담고 있는 키트에 관련된다.

도 1 은 실시예 1 의 결과를 보여 준다. PCR-확대 중아황산염 처리 DNA 스트랜드의 겔 패턴이 도시되어 있다(좌측 : 분자량 마커, 우측 : PCR 생산량).

도 2 는 실시예 3 (DME의 용도)의 결과를 보여 준다. DNA는 플라즈마 샘플로부터 격리되고, 중아황산염으로 처리되고 그리고 Ligtcycler PCR에 의해 확대된다. Y-축은 각 사이클에서 측정된 형광신호를 보여 준다. X-축선은 사이클 수를 지시한다. 본 발명에 따른 방법의 곡선들은 좌측에 나타나 있고 종래방법의 곡선들은 우측에 나타나 있다. 최적의 방법은 소수의 사이클에서조차도 중요한 형광신호를 나타내고 있는 것을 보여 준다. 본 발명방법에서의 DNA 수율은 종래방법에 비해 높다.

도 3 은 실시예 4 의 결과를 보여 준다. PCR 확대 후 전기영동으로부터 생긴 겔이 나타나 있다. 2개의 서로 상이한 중아황산염 특정파편, 2개의 비특정 파편 및 하나의 게놈 파편이 매번 확대된다. 최상부측 도면은 제로값(반응시간 = 0시간)을 보여 준다. 제 2 도면은 총 1시간의 반응시간동안 1개의 테르모스파이크를 갖추고서 행한 반응을 보여 준다. 제 3 도면은 2개의 테르모스파이크와 그리고 2시간의 반응시간 동안의 반응을 보여 준다. 최하측 도면은 3개의 테르모스파이크 및 3시간의 반응시간동안의 반응을 보여 준다. DNA의 대부분은 1시간 후에도 본 발명에 따른 방법(제2도면)으로 전환된다. 적어도 3시간후에는 게놈 DNA는 더 이상 검출될 수 없다(최하측 도면).

도 4 는 실시예 5 의 결과를 보여 준다. 겔의 전기영동은 PCR 확대 후 보여 준다. 2개의 서로 다른 중아황산염 특정확대부가 확대된다. 좌측의 그림은 종래의 중아황산염 처리를 보여주고, 우측도면은 본 발명에 따른 방법을 보여준다. 3시간의 반응시간은 상부측에 그리고 5시간의 반응시간은 하부측에 도시되어 있다. 보다 명료한 검출은 본 발명에 따른 방법(테르모스파이크)과 더불어 가능하다. 따라서, 좌측레인에 도시된 파편은 3시간의 반응시간 후에 검출될 수 있는 반면, 종래방법으로부터의 파편은 5시간의 잠복시간 후에도 검출되지 않는다.

다음의 실시예는 본 발명을 설명한다.

실시예 1 : 중아황산염반응의 자동화실행

제조자의 지시에 따라 제한 엔도뉴클리아제로 처리된 게놈 DNA 샘플의 Ⅷ 유전인자의 시토신의 메틸화상태를 검출하기 위한 방법의 응용이 이번 실시예에서 설명된다. 이 방법은 피펫용 팁을 교환하기 위한 4개의 분리된 수직 가동형 어댑터를 갖춰서 횡방향 오염을 배제하도록 한 자동피펫시스템(MWG RoboSeg 4204)의 사용을 기초로 한다. 이 피펫시스템은 100㎕[aliquots]의 피펫을 ±2㎕이하의 오차범위로 가능하게 한다. 자동피펫시스템의 동작 플레이트는 6개의 피펫팁용 랙 및 8개의 피펫위치부를 갖추고 있으며, 그중 2개 위치부는 냉각될 수 있고, 그리고 냉각가능한 시약 랙, 10 마이크로티터 플레이트용 스태킹시스템, 피펫팁·세척소 및 피펫팁을 어댑터로부터 분리시키기 위한 기구를 갖추고 있다.

이 자동형 피펫시스템은 일련의 인터페이스에 의해 컴퓨터에 연결되고 소프트웨어 프로그램에 의해 제어되어서 방법응용에 필요한 모든 피펫단계의 자유 프로 그래핑을 가능하게 한다.

이 방법의 제 1 단계에 있어, DNA 샘플의 알리쿼트(aliquot)는 손에 의해 마이크로티터 플레이트의 96개의 자유선택위치 중 하나로 피펫된다. 이 마이크로티터 플레이트는 그 다음 미리처리된 DNA 샘플을 변성시키기 위한 Eppendorf MasterCycler의 사용으로 96℃까지 가열된다. 이 마이크로티터 플레이트는 그 다음 자동형 피펫시스템으로 이동된다. 변성제(다이옥신)의 알리쿼트, 3.3M 아황산수소나트륨, 용액, 및 사용된 변성제에 있는 포착제의 용액은 다른것들이 시약 랙으로부터 프로그램 제어방식으로 처리된 다음 DNA를 포함하는 모든위치로 피펫된다. 그다음 마이크로티터 플레이트가 Eppendorf Mastersyler에 잠복되어져서, DNA 샘플에 있는 모든 비메틸화된 시토신 잔류물이 아황산수소나트륨의 작용으로 중아황산염 부가물로 전환된다.

중아황산염처리 후, 마이크로티터 플레이트는 테르모사이클러로부터 자동 피펫시스템으로 옮겨진다. 동일형식의 제 2 마이크로티터 플레이트가 그때 위치한다. 우선, 기본 트리스-HCL버퍼(pH 9.5)와 그리고 중아황산염처리된 DNA의 알리쿼트가 제 1 마이크로티터 플레이트 상에 있는 등가의 위치들이 중아황산염처리된 DNA 샘플을 대표하고 있는 모든 챔버에 제 2 마이크로티터 플레이트의 대응위치에 전달된다. 비메틸화된 시토신 잔류물의 중아황산염 부가물은 기초용액중에서 우라실 잔류물로 전환된다.

중아황산염처리된 DNA의 1 스트랜드(본실시예에서는 센스 스트랜드)의 목표된 확대는 폴리머라제 연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR)에 의해 실시된 다. 형식 1 CAGG GAG TTT TTT TTA GGG AAT AGA GGG A (SEQ. ID : 1) 및 TAA TCC CAA AAC CTC TCC ACT ACA ACA A (SEQ.ID : 2)로된 1쌍의 프라이머가 사용되어서, 성공적인 중아황산염 처리된 DNA 스트랜드의 특수확대를 허용하고, 그러나 DNA 스트랜드는 아니며, 그의 비메틸화된 시토신 잔류물은 우라실 잔류물로 전환되지 않거나 또는 불완전하게 전환되어진다. 동일형식의 제 3 마이크로티터 플레이트가 PCR 반응을 위한 자동피펫시스템에 놓여진다. 모든 챔버에 있어 제 1 마이크로티터 플레이트상 등가 위치들은 중아황산염처리된 DNA 샘플을 포함하고, PCR 버퍼, DNA 폴리머라아제 및 타입 1 의 프라이머를 포함하고 있는 저장용액의 알리쿼트는 먼저 자동적으로 피펫된다. 그다음, 희석된 중아황산염처리된 DNA의 알리쿼트는 제 2 마이크로티터 플레이트의 각 위치로부터 제 3 마이크로티터 플레이트의 대응위치로 자동적으로 이동되는데, 이것은 제 3 마이크로티터 플레이트가 PCR 반응을 실시하기 위한 시이클러에 이동되기 전에 이루어진다. PCR 생성물은 아가로제 겔 전기영동(agarose gel electropho resis)에 의해 확인되고 그리고 후속하여 브롬화에 티듐으로서 착색된다(도1). 도 1 은 PCR-확대 중아황산염 처리된 DNA 스트랜드의 겔 이미지를 보여준다(좌측 : 분자량 마커, 우측 : PCR 생성물).

실시예 2 : 플라즈마 샘플들에서 DNA의 검출을 위한 디옥산의 부가에 의한 최적의 중아황산염 전환

이 실시예에서 최적의 중아황산염 방법이 생체유체로부터 획득된 DNA의 민감메틸화분석을 가능하게 함을 보여준다. 이 목적을 위해, 인간 플라즈마의 1㎖이 인간 DNA의 특정량과 함께 혼합된다. 이 DNA는 제조자의 지시에 따라 Magna Pure 방 법(Roche)을 통해 플라즈마 샘플들로부터 격리된다. 정제로부터 결정된 용출액(eluate)의 100㎕이 다음의 중아황산염반응에서 완전히 이용되어진다. 표준방법(Frommer et.al., loc. cit.)에 따른 전환은 제어에 의해 행해진다. 본 발명에 따른 방법의 절차는 다음과 같다; 용출액은 354㎕의 중아황산염용액(5.89 ㏖/ℓ) 및 급진적인 포착제를 포함하는 146㎕의 디옥산(2.5/㎖의 디옥산 중에 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로마네 2-카르복실 산, 98.6㎎)과 혼합된다. 반응혼합물은 99℃에서 3분동안 변성처리되고 그리고 후속하여 50℃의 30분, 3분동안 1회 테르모스파이크(thermospike)(99,9℃), 50℃의 1.5시간, 3분동안 1회 테르모스파이크(99.9℃), 50℃의 3시간의 총 5시간동안 온도프로그램으로 잠복처리된다. 양측의 제어롤 및 본 발명에 따른 방법의 반응혼합물은 등록상표, "Millipore Microcon" 컬럼에 의해 초정제 상태로 정제된다. 정제는 제조자의 지시에 따라 실행된다. 이를위해, 반응혼합물은 300㎕의 물과 혼합되고, 초정제막에 장하되어 15분동안 원심처리되고 그리고 후속하여 1×TE 버퍼로서 세척된다. DNA는 이 처리중에 막에 남게 된다. 그다음 탈설폰화(desulfonation)가 수행된다. 이 목적을 위해, 0.2㏖/ℓ NaOH가 가해져서 10분동안 잠복된다. 그다음 원심처리(10분)가 행해지고, 1×TE 버퍼와의 세척단계가 뒤따른다. 이후, DNA는 용출된다. 이를위해, 막은 10분동안 50㎕의 따뜻한 1×TE 버퍼(50℃)와 함께 혼합된다. 막은 다시 제조자의 지시에 따라 턴오버된다. 후속적으로, 반복적인 원심처리가 행해지고, 이와함께 DNA는 막으로부터 제거된다. 10㎕의 용출액이 다음의 Lightcyler Real Time PCR에 이용된다. 인간의 베타-악틴 유전자의 영역은 실시예 2 에서 설명한 프라이머와 프로브를 이용함으로서 분석된 다(Miyamoto : Nucleotide sequence of the human beta-actin promoter 5' flanking regin; Nucleic Acids Res. 15(21), 9095(1987)). 다음의 프라이머 및 프로브가 사용된다. 즉, 전방 프라이머 : TGG GTA TGG AGG AGG TTT AGT AAG T (SEQ ID 3), 역 프라이머 : AAC CAA TAA AAC CTA CTC CTC CCT TAA (SEQ ID 4), 기증자 프로브 : TTG TGA ATT TGT GTT TGT TAT TGT GTG TTG - flou (SEQ ID 5), 수혜자 프로브 : LC Red 640 - TGG TGG TTA TTT TTT TTA TTA GGT TGT GGT - Phos(SEQ ID 6).

확대는 중아황산염 특정시료에 의해 행해진다. Lightcycle 소프트웨어로서 형광신호들이 검출되고 연산된다. 변화되어 격리된 DNA의 양은 측정곡선과 비교하여 정량화될 수 있다. 최적의 방법으로 133,21 ng/100㎕의 DNA 농도를 제조가능하고, 종래의 방법은 41.03 ng/100㎕의 농도를 유도한다. 따라서 본 발명에 따른 방법은 종래의 방법보다 3배 더 큰 제조를 가능하게 한다.

실시예 3 : 플라즈마 샘플에서의 DNA 검출을 위한 DME의 부가에 의한 최적 중아황산염 전환.

생체유체로부터 획득된 DNA의 민감한 메틸화 분석을 가능하게 하는 최적의 중아황산염 방법을 설명하겠다. 이를위해, 인간 플라즈마의 1㎖이 인간 DNA의 특정량과 혼합된다. 이 DNA는 제조자의 지시에 따른 Magna Pure 방법(Roche)에 의해 플라즈마 샘플로부터 격리된다. 정제처리 후 100㎕의 용출액은 다음의 중아황산염 반응에 완전히 이용된다. 표준형방법(Frommer et al., loc. cit.)에 따른 전환은 제어장치에 의해 실행된다. 본 발명에 따른 방법을 위한 절차는 다음과 같다. 즉, 용출액은 354㎕의 중아황산염용액(5.89 ㏖/ℓ) 및 급진적인 포착제를 포함하는 46㎕ 의 디옥산(787㎖의 DME 중에 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로마네 2-카르복실 산, 98.6㎎)과 혼합된다. 반응혼합물은 99℃에서 3분동안 변성처리되고 그리고 후속하여 50℃의 30분, 3분동안 1회 테르모스파이크(thermospike)(99,9℃), 50℃의 1.5시간, 3분동안 1회 테르모스파이크(99.9℃), 50℃의 3시간의 총 5시간동안 온도프로그램으로 잠복처리된다. 양측의 컨트롤 및 본 발명에 따른 방법의 반응혼합물은 등록상표, "Millipore Microcon" 컬럼에 의해 초정제 상태로 정제된다. 정제는 제조자의 지시에 따라 실행된다. 이를위해, 반응혼합물은 300㎕의 물과 혼합되고, 초정제막에 장하되어 15분동안 원심처리되고 그리고 후속하여 1×TE 버퍼로서 세척된다. DNA는 이 처리중에 막에 남게된다. 그다음 탈설폰화(desulfonation)가 수행된다. 이 목적을 위해, 0.2㏖/ℓ NaOH가 가해져서 10분동안 잠복된다. 그다음 원심처리(10분)가 행해지고, 1×TE 버퍼와의 세척단계가 뒤따른다. 이후, DNA는 용출된다. 이를위해, 막은 10분동안 50㎕의 따뜻한 1×TE 버퍼(50℃)와 함께 혼합된다. 막은 다시 제조자의 지시에 따라 턴버된다. 후속적으로, 반복적인 원심처리가 행해지고, 이와함께 DNA는 막으로부터 제거된다. 10㎕의 용출액이 다음의 Lightcycler Real Time PCR에 이용된다. 인간의 베타-악틴 유전자의 영역은 실시예 2 에서 설명한 프라이머와 프로브를 이용함으로서 분석된다.

확대는 중아황산염 특정시료에 의해 실행된다. Lightcyler 소프트웨어에 의해 계산된 결과가 도 2 에 도시되어 있다. 좌측 곡선은 최적방법에 상응하고, 우측곡선은 종래방법에 상응한다. 최적방법은 소수의 사이클에서 조차 충분한 형광신호를 발생시키는 것을 보여준다. DNA생성은 따라서 종래방법보다 더 높다. 전환된 DNA의 양은 특정곡선에 비해 정량화될 수 있다. 최적방법은 133.27 ng/100㎕의 DNA 농도를 보여주는 반면, 종래방법은 41.03 ng/100㎕의 농도를 보여준다. 본 발명에 따른 방법은 따라서 종래방법에 비해 3배 높은 생산을 가능하게 한다.

실시예 4 : 테르모스파이크에 의한 중아황산염 전환

2㎕의 ddH₂O가 MssI(Promega : 160ng)로 온침된 1㎕의 고순도 인간 DNA에 가해진다. 96℃에서 샘플들이 10분동안 변성된다. 그다음 대략 10㎕의 중아황산염 용액(5.85 ㏖/ℓ) 및 7㎕의 급속 포착제/디옥산 혼합물(5㎕의 디옥산 + 2㎕의 포착제)가 가해진다. 이후, 제 1 샘플(0 시간 값)은 제거되어 얼음에 놓여진다. 반응혼합물이 96℃에서 30초동안 잠복되고 후속적으로 50℃에서 59.5분동안 잠복된다. 제 2 샘플(1시간 값)이 제거되어 얼음위에 놓인다. 제 3 샘플(2시간 값)은 96℃에서 30초동안 다시한번 잠복되고 50℃에서 59.5분동안 후속하여 잠복된다. 후속적으로, 이 샘플은 역시 얼음위에 놓인다. 제 4 샘플(3시간 값)은 96℃에서 30초동안 그리고 50℃에서 59.5분동안 다시한번 잠복되며, 후속하여 냉각된다. 30㎕의 ddH₂O가 샘플에 가해진다. G25 Sephadex 컬럼을 통해 반응혼합물이 정제된다. 용출액이 50㎕의 100n㏖/ℓ Tris-HCL(pH 9.5)과 혼합되고 20분동안 96℃에서 탈설폰화된다. 이 용액의 2㎕은 각각의 PCR 반응에 사용된다. 2개의 중아황산염 특정파편들, 2개의 비특정 파편들 및 게놈파편이 PCR에서 매회 확대된다. 중아황산염-특정 파편들은 점점 더 격렬하게 확대되고 아울러 중아황산염 전환도 점차 진행된다. 비특정 파편들은 중아황산 전환에 무관하게 확대되고 DNA의 분해(degradation)의 징조를 나타 낸다. 게놈파편은 단지 중아황산염과 함께 전환되지 않은 게놈 DNA가 아직까지 존재하는 한에 한해 확대된다. 게놈 DNA의 확대는 따라서 불완전한 중아황산염 전환을 위한 측정이다. 아가로제 겔에서 분리된 확대부분들을 도 3 에서 알 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서, DNA의 대부분이 1시간 후 까지도 전환되는 것을 보여준다. 게놈 DNA는 적어도 3시간 후에는 더 이상 검출이 불가능하다. 다시 말해, 중아황산염 전환이 완료된다는 것이다. 종래의 중아황산염 처리에 있어 대응값들은 5시간 후 초기에 형성된다(하기참조).

실시예 5 : 테르모스파이크를 갖춘 상태에서의 중아황산염 처리와 테르모스파이크 없이 행한 중아황산염처리의 비교

실시예 4 에서와 같이 처리된 샘플들이 2개의 테르모스파이크를 갖추고서 3 또는 5시간 동안의 반응시간으로 잠복된다. 제어부들은 테르모스파이크없이 발생된다. 정제 및 PCR을 상기한 바와 실행된다. 2개의 중아황산염-특정파편들이 확대된다. 그중 한 파편은 시토신 과량체이다. 완전한 전환을 얻는데 비교적 긴 반응시간이 필요하다. 다른 파편은 이에 대조하여 시토신 소량체이며 따라서 비교적 짧은시간 후 완전히 전환된다. 확대의 결과가 도 4 에 도시되었다. 종래의 중아황산염 전환은 좌측에 나타나 있고, 테르모스파이크를 가진 최적의 전환은 도면 우측에 나타나 있다. 시토신 과량파편은 매번 좌측에 표시되고, 시토신 소량 파편은 우측에 구성된다. 본 발명에 따른 방법은 말끔하고도 보다 민감한 검출을 가능하게 함을 보여준다. 따라서 시토신 과량파량은 테르모스파이크 처리와 함께 3시간 후에도 말끔하게 검출될 수 있지만, 종래의 방법은 5시간의 반응시간후에도 검출이 불가능하 다.

실시예 6 : 본 발명에 따른 방법에서의 DNA 회복률

본 발명에 따른 방법은 매우 효과적인 중아황산염 전환 및 정제가 실현가능함을 보여준다. 이를위해, 서로 다른 양의 M13-DNA 및 인간 DNA가 100㎕의 물에 용해된다. DNA 용액은 354㎕의 중아황산염용액(5.89 ㏖/ℓ) 및 급진적인 포착제를 포함하는 146㎕의 디옥산(2.5/㎖의 디옥산 중에 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로마네 2-카르복실 산, 98.6㎎)과 혼합된다. 반응혼합물은 99℃에서 3분동안 변성처리되고 그리고 후속하여 50℃의 30분, 3분동안 1회 테르모스파이크(thermospike)(99,9℃), 50℃의 1.5시간, 3분동안 1회 테르모스파이크(99.9℃), 50℃의 3시간의 총 5시간동안 온도프로그램으로 잠복처리된다. 양측의 제어 및 본 발명에 따른 방법의 반응혼합물은 등록상표, "Millipore Microcon" 컬럼에 의해 초정제 상태로 정제된다. 정제는 제조자의 지시에 따라 실행된다. 이를위해, 반응혼합물은 300㎕의 물과 혼합되고, 초정제막에 장하되어 15분동안 원심처리되고 그리고 후속하여 1×TE 버퍼로서 세척된다. DNA는 이 처리중에 막에 남게된다. 그다음 탈설폰화(desulfonation)가 수행된다. 이 목적을 위해, 0.2㏖/ℓ NaOH가 가해져서 10분동안 잠복된다. 그다음 원심처리(10분)가 행해지고, 1×TE 버퍼와의 세척단계가 뒤따른다. 이후, DNA는 용출된다. 이를위해, 막은 10분동안 50㎕의 따뜻한 1×TE 버퍼(50℃)와 함께 혼합된다. 막은 다시 제조자의 지시에 따라 턴오버된다. 후속적으로, 반복적인 원심처리가 행해지고, 이와함께 DNA는 막으로부터 제거된다. 이 DNA 농도는 그다음 결정된다(올리브 그린). 표 1 에 데이타가 나타나 있다. DNA 의 회복률은 적어도 75%에 달한다. 이에반해, DNA의 중아황산염 전환 및 정제를 위한 공지의 방법에 있어서의 회복률은 25%이하로 존재한다.

표 1

DNA 이용량(ng)	초여과후 M13 DNA	초여과후 인간 단일-표준 DNA
6000	미결정	108.5%
4000	미결정	87.1%
2000	86.91%	84.8%
1000	90.54%	81.51%
200	92.69%	91.59%
100	96.77%	74.23%

Claims

게놈 DNA가 중아황산염 시약으로 반응되는 DNA의 중아황산염 전환방법에 있어서, 상기 반응이 콤파운드의 존재하에서 수행되고, 디옥산, 그의 유도체 중 어느하나 및 유사한 지방족 사이클릭 에테르의 그룹으로부터 수행되고, 상기 콤파운드의 농도는 체적당 10-35%의 양인 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.
제 1 항에 있어서, 상기 콤파운드의 농도가 체적당 20-30%의 양인 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.
게놈 DNA가 중아황산염 시약으로 반응되는 중아황산염 DNA의 전환방법에 있어서, 상기 반응이 콤파운드의 존재하에서 다음의 공식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.

이때, n = 1-35000

m = 1-3

R₁ = H, Me, Et, Pr, Bu

R₂ = H, Me, Et, Pr, Bu
제 3 항에 있어서, 상기 콤파운드가 n-알킬렌 글리콜 콤파운드를 포함하는 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.
제 4 항에 있어서, 상기 콤파운드가 디알킬 에테르를 포함하는 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.
제 5 항에 있어서, 상기 콤파운드가 디에틸렌 글리콜 디메틸 에테르를 포함하는 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.
제 3 항에 있어서, 상기 콤파운드가 체적당 1-35%의 농도로 나타나는 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.
제 3 항에 있어서, 상기 콤파운드가 체적당 5-25%의 농도로 나타나는 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.
격리된 게놈 DNA가 중아황산염 시약과 함께 반응되는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법에 있어서, 반응이 0-80℃의 범위의 온도에서 실행되고 그리고 반응 온도는 전환의 코스 중(테르모스파이크) 85-100℃의 범위로 증가하는 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.
제 9 항에 있어서, 짧은주기(테르모스파이크)의 온도 증가의 수가 2 내지 5 에 이르는 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.
제 9 항에 있어서, 짧은주기(테르모스파이크)의 온도 증가 중 반응온도가 85 내지 100℃까지 증가하는 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.
제 11 항에 있어서, 짧은주기(테르모스파이크)의 온도증가는 반응온도를 90 내지 98℃까지 증가시키는 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.
제 6 항에 있어서, 전환된 DNA가 자기 입자들에 의해 정제되는 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.
DNA의 중아황산염 전환방법에 있어, 전환된 DNA가 초여과에 의해 정제되는 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.
제 1 항, 제 3 항, 제 9 항 또는 제 14 항에 있어서, 전환된 DNA가 다음의 방법 : MSP, Heavy Methyl MsSNuPE, Methyl Light 중 어느 하나에 의해 해석되는 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.
제 1 항, 제 3 항, 제 9 항 또는 제 14 항에 있어서, 조직샘플 또는 인체유체의 DNA가 조사되어지는 것을 특징으로 하는 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법.
환자 또는 일반인의 역 현상에 대한 진단 및/또는 예후에 대해 적절하게 이용되는 것으로서, 역 현상은 예컨대 다음의 범주 중 적어도 어느 하나 즉, 원치않은 약물상호작용; 암질환; 중추신경계 기능장애, 손상 또는 질환; 공격적 성향 또는 습관적 행동불안증상; 뇌손상의 임상적, 심리적 및 사회적 고통과; 심리불안 및 정서분열; 노인성 치매 및/또는 그와 관련된 증후군; 심혈관 질환, 기능장애 및 손상; 위장계의 기능장애, 손상 또는 질환, 호흡기관계의 기능장애, 손상 또는 질환; 장애, 염증, 전염, 면역 및/또는 회복기; 발달단계에서의 비정상적 신체의 기능장애, 손상 또는 질환; 피부, 근육, 결체조직 또는 뼈의 기능장애, 손상 또는 질환; 내분비선 및 신진대사의 기능장애, 손상 또는 질환; 두통 또는 성기능장애 중 어느 하나에 속하는 것을 특징으로 하는 제 1 항, 제 3 항, 제 9 항 또는 제 14 항에 따른 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법의 사용용도.
세포형식이나 조직을 식별하거나 또는 세포분화를 조사하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항, 제 3 항, 제 9 항 또는 제 14 항에 따른 중아황산염을 활용한 DNA의 전환방법의 사용용도.
시약 또는 용제를 변성시키는 중아황산염을 포함하는 시약으로 구성되고, 그리고 확대제의 제조를 위해 포획제 및 프라이머를 포함하고 그리고 선택적으로 전술한 항들 중 어느 한 항에 따른 분석시험을 실행하기 위한 초여과관 또는 지시서를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
중아황산염을 활용한 DNA의 전환을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 크로마네(chromane) 유도체의 사용용도.
중아황산염을 활용한 DNA의 전환을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 6-히드록시-2, 5, 7, 8-테트라메틸크로마네 2-카르복실릭산의 사용용도.