KR20070021102A - 아페레시스 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알츠하이머 질환을 치료하는데 사용되는 아페레시스 장치에 관한 것이다. 본 발명의 아페레시스 장치는 혈류 또는 혈장류가 접촉되는 고형의 지지체를 포함한다.

Description

아페레시스 장치 {APHERESIS DEVICE}

본 발명은 혈류 또는 혈장류와 접촉될 수 있는 고체 담체를 포함하는 아페레시스 장치에 관한 것이다.

아페레시스에 의한 치료 방법은 이의 치료적 효과가 혈액의 병원성 단백질, 단백질-결합된 병원성 기질, 유리 병원성 기질 또는 병원성 세포를 체외 제거하는 것에 근거한다. 병원성 단백질이 단지 세포 비함유 혈장으로부터 제거될 수 있을 경우, 혈장은 막 혈장 분리기에 의해 (혈장 분리) 또는 혈액분리기에 의해 혈구 세포로부터 분리된다. 비선택적 혈장 교환(혈장아페레시스)에서, 교환된 환자의 혈장은 대체로 분리되며, 이러한 경우, 병원체 이외에 모든 그 밖의 중요한 단백질이 제거된다. 이러한 이유로, 제거된 혈장의 전해질, 사람 알부민 또는 새로운 혈장으로의 대체가 필요하다. 선택적 혈장반출 방법에서, 병원성 단백질은 흡착, 침전 또는 여과에 의해 분리된 혈장으로부터 상당히 특이적으로 제거될 수 있어서, 제거가 수행된 이후 실질적인 용적 손실 없이 혈장을 재사용할 수 있게 된다. 이러한 선택적 방법은 대체 용액 없이 수행될 수 있다는 이점을 갖는다. 선택적 전혈 아페레시스 방법에 있어서, 병원성 단백질은 사전 혈장 분리 없이 사전처리되지 않은 혈액으로부터 직접적으로 특이적으로 흡착되므로써, 혈장 분리법과는 대조적으로 혈장 분리, 대체 용액 첨가 이 둘 모두가 생략될 수 있다. 아페레시스의 또 다른 아류형은 세포가 혈액으로부터 제거되는 혈구아페레시스(cytapheresis)이다. 이 방법에 의해, 백혈구, 적혈구, 혈소판, 과립구 또는 줄기 세포가 선택적으로 회수될 수 있다.

최근 아페레시스(예를 들어, 혈장아페리세스 또는 혈구아페레시스로서)이 기증자의 혈장을 회수하는 데 주로 사용되고 있지만(혈장 팩으로서, 각종 혈장 분획 또는 혈액 산물의 회수를 위해), 아페레시스 방법은 치료 분야에서도 점점 더 중요해지고 있다. 최근, 모든 계열의 대사 질병(예를 들어, (가족성) 고콜레스테롤혈증, 분리된 Lp(a)가 증가하는 진행성 관상 동맥 심질환, 고이단백혈증 증후군, 간부전 등), 신장 질환(굿패스처 증후군, 루푸스 신염이 있는 전신 홍반성 루푸스, 베게너 육아종증, 용혈성 요독증, 특발성 국소 분절성 사구체신염, 파라단백질혈증 관련 증후군, 한냉글로불린혈증성 자반증, 신장 이식의 경우에서의 HLA 감작 등), 신경계 질환(근무력증, 귈레인 바레 증후군, 만성 탈수초성 다발신경염, 파라단백질혈증성 다발신경병증, 랑버트-이튼 증후군, 레프섬 증후군 등), 면역계 질환(류마티스 관절염, 면역 억제성 혈우병, 천포창, 등), 순환계 및 미소순환계 질환(과점도 증후군, 항인지질항체 증후군, 골수 이식 후의 혈전성 미세혈관병, 연령 관련 황반병변, 급성 청력장애, 미소순환계의 말초 순환 장애, 지연성 심장 근육병, 심장 이식후의 이식 맥관장애, 동형접합체 가족성 고콜레스테롤혈증, 국소 분절성 사구체신염, 급성 간 부전, 용혈성 요독 증후군, 등), 중독증, 급성 간 부전, 신생물, 과수화, 갑상선 중독증 등이 아페레시스 방법에 의해 치료된다[참조: Pschyrembel (257. Edition), keyword "Plasmapherese"; www. nephrologie.de/172Apharese.htm)].

알츠하이머 질환(AD)은 진행성 신경계 장애이며, 최근까지도 효과적인 치료는 가능하지 않다. 이 질환의 특징은 아밀로이드 β-펩티드를 함유하는 대뇌 플라크, 및 미소세관 관련된 TAU 단백질로부터의 섬유성 뉴우런 구조이다. 아밀로이드-β 및 TAU가 병인과 관련있는 것으로서 간주되나, 가장 최근의 연구 결과는 아밀로이드-β가 이러한 병인의 주요 작용제임을 시사하는 것으로 보인다. 따라서, 아밀로이드-β 생성, 아미로이드-β 응집 또는 이러한 응집물에 의해 유발되는 신경독성 현상을 예방하고자 하는 치료제가 점점 더 개발되고 있다. 지금까지 이루어진 AD에 대한 치료 방법의 포괄적인 설명은 울페(Wolfe)의 조사 논문에 제시된다[참조: Nature Reviews Drug Discovery 1 (2002) 859-866].

아미로이드-β 플라크는 내재되는 막 횡단 단백질인 소위 아미로이드-β 전구체 단백질(APP)로부터 개시되어 형성된다(막 횡단 단백질의 생리적 기능이 분명하게 입증되어 있는 것은 아니지만, 가장 최근의 연구 결과는 APP가 키네신(kinesin) I에 대한 소위 막 수송(cargo) 수용체로서 작용함을 시사한다). APP는 소위 세크라타제에 의해 단백질 분해적으로 분해되며, 이 경우 40개의 아미노산 길이를 갖는 Aβ(아밀로이드 β) 펩티드(Aβ₄₀)가 생리적으로 주로 형성된다. 이외의 Aβ 펩티드의 보다 짧거나 보다 긴 형태는 또한 주로 높은 응집성을 나타내는 42개의 아미노산(Aβ₄₂)의 형태를 형성한다. 그러므로, 이러한 Aβ₄₂-형은 아밀로이드 플라크 내 우세적인 형태이다. 따라서, 이러한 상이한 분해에 대한 원인이 되는 세크레타제(α-, 및 주로 β- 및 감마 세크레타제)는 또한 가능한 AD 치료법에 의해 목적이 되는 주표적물을 형성한다. 그러므로, AD 치료에서의 이러한 효소(예를 들어, 벤조디아제핀, 설폰아미드, 벤조카프롤락탐과 같은)에 대해 조절제 또는 억제제를 각각 사용하는 것이 시도되었다.

AD와 관련된 또 다른 유전자는 아포리포단백질 E이며, 이에 대해서는 세개의 대립 변이체(APOE2, APOE3, 및 APOE4)가 존재한다. 하나 또는 두개의 APOE4 복사체를 갖는 사람은 AD의 위험성이 보다 높은 반면, APOE2 캐리어는 이러한 전체 집단과 비교하여 위험성이 보다 낮은 것으로 나타났다. 또한, 스타틴제, 즉 콜레스테롤 생합성을 억제하는 약제를 취한 사람은 AD에 대한 위험성이 현저히 감소되는 것으로 나타났다. 따라서, AD의 추가의 치료법은 예를 들어, 스타틴제와 같은 콜레스테롤 생합성을 억제시키는 데 집중되었다.

AD 치료를 위한 또 다른 방법은 세크레타제-억제제에 의해 수행될 수 있는, 대뇌 플라크 중에서 아밀로이드 응집을 억제하는 것과 관련된다. 또한, 생리적으로 관련된 농도에서 아연은 Aβ의 응집을 유도할 수 있기 때문에 아연 함량을 낮추는 것이 제안되었다.

끝으로, 예를 들어 Aβ₄₂와의 면역화와 같은 면역학적 방법이 개시되어 있으나, 이는 임상적 연구의 범주내에서 심각한 부작용으로 인해 중단되었다[참조: Willke, Bild der Wissenschaft, 9(2003, 24-28].

선행 기술에서 제안된 추가의 AD 치료법은 APP 발현의 방지 및 Aβ 제거(clearance) 증가와 관련되며, 여기에서 APP 프로모터 영역과 상호작용하는 물질은 APP 발현에 대해 연구되었다. Aβ 제거와 관련하여, 특정 프로테아제, 예컨대 인슐린 저하 효소 및 네프롤리신(neprolysin)의 활성 증가, 또는 항-Aβ-항체의 말초 투여(De Mattos et al., PNAS 98(15)(2001), 8850-8855)이 제안되었다. 끝으로, 예를 들어, AD 환자의 혈청에서 아밀로이드 β 수준을 낮추므로써 이미 존재하는 아밀로이드 플라크를 재용해시키려는 시도가 이루어졌다. 이러한 맥락에서, 아페레시스 방법에 의해 뇌에서 β-아밀로이드 단백질의 플라크 침착물을 감소시키는 것이 제안되었으나(US 6,551,266, 아페레시스에 의해 500kD 초과의 분자량을 갖는 거대분자의 제거가 제안되었음), 이는 사실상 AD에 대해서는 기재되는 바는 없었다. 그러나, 아페레시스 방법에 의해 직접적으로 뇌 세포내 이미 존재하는 플라크의 용해는 가능하지 않다(혈액/뇌 배리어는 플라크에 의해, 또는 500kD보다 큰 분자에 의해 통과될 수 없다).

그러므로, 본 발명의 목적은 알츠하이머 질환에 대한 새로운 치료법 및 예방법을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명에 의해, 혈류 또는 혈장류와 접촉될 수 있는 고체 담체를 포함하고, 아밀로이드-β 전구체 단백질(APP)-결합 수용체를 포함하는 아페레시스 장치가 제공된다. 본 발명의 아페레시스 장치의 경우, APP의 또는 APP 분해 생성물, 특히 Aβ₄₀ 또는 Aβ₄₂의 의미있는 제거가 AD 환자, 또는 AD의 위험이 있는 환자 에게서 아페레시스에 의해 수행될 수 있다. 중추신경계(CNS)와 혈장 간에는 Aβ₄₂ 동적 평형 상태로 존재하는 것으로 공지되어 있다. 마우스 모델에서, 항 Aβ항체의 말초 투여가, 항 Aβ항체가 혈액/뇌 배리어를 극복하지 않으면서 CNS 및 혈장 Aβ₄₂ 제거에 영향을 미쳐서, 뇌에서 Aβ₄₂ 부하를 감소시키는 것이 입증되었다[참조: DeMattos PNAS 2001, 상기]. 이러한 결과는 마쯔오카(Matsuoka) 등의 문헌(Journal of Neuroscience 2003: 29-33)에 의해 다른 Aβ₄₂ 결합 분자(겔솔린(gelsolin) 및 G_M1)의 말초 투여에 의해서 확인되었다. 따라서, 뇌내 플라크의 형성 과정은 혈액 중에서 Aβ₄₂ 를 트래핑하므로써 예방될 수 있다. 이와 같이 함에 있어서, 환자의 혈액 또는 혈액에 접촉되는 아페레시스 장치내 수용체가 Aβ₄₂ 에 대해 또는 APP의 다른 분해형에 대해 특이적인지 아닌지의 여부는 중요하기 않으며, APP 및 이의 (단백질분해적) 분해 생성물, 특히, Aβ₄₂ 이 이러한 특이적 흡착에 의해 혈액으로부터 제거되는 것만이 필수적이고, 이에 따라 "잘못된" 단백질 분해(즉, Aβ₄₂ 로)를 일으키지 않을 것이다. 따라서, 본 발명은 미국 특허 제 6,551,266호의 것과는 완전히 상이한 아페레시스의 적용법, 즉, 플라크 자체가 아닌, 가능성이 있는 플라크 형성 블록의 제거를 기초로 한다. 이외에, 아페레시스에 의한 플라크의 제거는, 혈액 혈장교환이 뇌내 플라크 형성 영역에 이를 수도 없기 때문에 AD의 치료에 효과적이지 않은 것처럼 처음부터 선택권이 제거되어야 한다.

다른 한편, 본 발명에 따른 아페레시스은 체내 자체에서 Aβ의 고갈을 유발시키는 방법(참조예: Demattos et al., PNAS 98(15) (2001), 8850-8855 with peripheral anti-Aβ antibodies)에 비해, 본 발명의 경우에서는 어떠한 자가면역 반응도 유발될 수 없다는 점에서 중대한 이점을 갖는다. 또한, 본 발명에 따르면, 적당한 체내에만 작용할 수 있는(가능하게는 특정 부위에 이식된 후에만) 물질이 환자에게 공급될 필요가 없고, 병원성 제가 선택적으로 제거된다. 즉, 질병의 원인이 체내 반응물을 제거하지 않고 특이적으로 체외로 분리된다.

이와 같이 하므로써, 본 발명에 따르면, 모든 구체예에서 현존하거나 이미 공지된 아페레시스 장치가 용이하게 본 발명에 사용될 수 있다. 특히, 고체 담체(및 아페레시스 장치)를 선택하는 경우에는, 이의 의학적-기술적 유용성이 고려되어야 한다. 이러한 담체, 방법 또는 장치가 문헌 WO 제 97/48483호, US 특허 제 5,476,715호, 제 6,036,614호, 제 5,817,528호 또는 제 6,551,266호에 기재되어 있다. 상응하는 상업적 혈장교환 장치로는 프레세니우스(Fresenius), 아피나(Affina), 플라즈마셀렉트(Plasmaselect), 아사히(ASAHI), 카네카(Kaneka), 브라운(Braun)사 등에 의한, 예컨대, LDL-테라소르브®(LDL-Therasorb®), 이뮤노소르바®(Immunosorba®), 프로소르바®(Prosorba®), 글로바핀®(Globaffin®), Ig-테라소르브®(Ig-Therasorb), 이뮤소르바®(Immusorba®), 리포소르바®(Liposorba®), HELP®, DALI®, 빌리루빈(bilirubin)-담즙산 흡수장치 BR-350, 프로메테우스®(Prometheus®) 해독장치, MARS®, 메티캡(Medicap) 또는 플라스마 PLO-시스템(Plasma FLO-System)으로부터의 ADA소르브-시스템이 시판된다. 이들 시스템은 모 두, 이들의 상용형이 항상 주로 단일 단백질의 특이적 제거를 목적으로 하는 것은 아니지만, 혈장교환 당업자들에게 어떠한 문제도 없이, 예를 들어, 면역아페레시스(immunapheresis)으로서, 및/또는 아페레시스 장치에서 고체 담체(예를 들어, 칼럼으로서)를 구비시키므로써 본 발명에 따라 적용될 수 있다.

그러므로, 본 발명에 따르면, "APP 결합 수용체"에 의해 모든 이러한 물질은 APP 리간드, 및 이의 생물학적 부산물, 특히 Aβ₄₂ 에 대해 친화성을 가지며, AD 환자 또는 AD의 위험이 있는 사람의 혈액 또는 혈장으로부터 이러한 폴리펩티드를 제거할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 APP- 또는 Aβ₄₂ 수용체는 각각 바람직하게는 (폴리클로날 또는 모노클로날) 항체, 단백질, 펩티드, 강글리오시드(ganglioside) 또는 핵산일 수 있다.

이러한 관점에서, 항 APP 항체, 항-Aβ₄₀ 항체 또는 항-Aβ₄₂ 항체, APP 결합 단백질, 특히, 겔솔린, apoJ 또는 apoE, APP 결합 펩티드, APP 결합 강글리오시드, 특히, G_M1, 또는 APP 결합 핵산, 특히 아프타머(aptamer), 또는 이들 수용체의 혼합물이 특히 바람직하다.

이러한 항체의 예로는 3D6(Aβ_1-5), 2H3(Aβ_1-12), 2G3(Aβ_33-40), 21F12(Aβ_33-42), 12H7(Aβ_33-42)(Johnson-Wood et al., PNAS 1997:1550-1555), 10D5, 16C11(Bard et al., Nature Medicine 2000:916-919), 데마토스(DeMattos) 등(2001)에 의해 기술된 항체(m266, m243) 뿐만 아니라 동일한 특이성의 항체가 있다. 이러한 항체는 예를 들어, APP, Aβ₄₂, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 함유하는 백신 제형을 면역화시키고, 이후, 선택적으로 세포 융합 및 클론 선택 프로토콜(모노클로날 항체인 경우) 동안에 얻어진다.

겔솔린(Matsuoka et al. 2003, 상기 참조), apoJ 및 apoE(DeMattos et al., 2001, 상기 참조)는 APP 결합 단백질 수용체의 또 다른 예이다. G_M1은 APP 결합 강글리오시드 수용체의 예이다[참조: Matsuoka et al., 2003, 상기 참조].

APP 결합 단백질의 또 다른 예로는 CETP(콜레스테릴-에스테르-전이 단백질) 및 ERAB 단백질(크기 261aa; He et al., JBC 273(17)(1998), 10741-10746; Lustbader et al., Science 304(2004), 448-452; 특히 aa 1-186, 및 1-158, 각각)이 있다. APP 결합 펩티드의 예로는 APP 결합 단백질로부터 유래된 APP 결합 단편이 있다. APP 결합 펩티드의 특정 예로는 KTYNLKKGQT-C("펩티드 4077"), GIAVASKTYNLKKGQTHTLEDFQRVLDV(ERAB 93-120), SKTYNLKKGQTHT(ERAB 98-110), C-HQKLVFFAED("펩티드 1323"), C-EVHHQKLVFFAEDVGS("펩티드 1324"), C-HQKIVFFAED("펩티드 1325"), 및 FGFPEHLLVDFLQSLS-C("펩티드 1208"), (및 APP 결합 영역을 포함하는 그 밖의 모든 ERAB, CETP, 또는 β-파괴 단편)(이들 펩티드에서, 말단 시스테인은 원래의 단백질 서열 부분이 아니고, 펩티드의 커플링을 위해 부착된 것일 뿐이다)가 있다.

APP 결합 수용체로서 펩티드는 D- 또는 L-아미노산 또는 D와 L 아미노산의 조합으로 어셈블링될 수 있으며, 선택적으로 추가의 변경, 고리 폐쇄 또는 유도체 화에 의해 변경될 수 있다. Aβ₄₂에 대한 적합한 펩티드 수용체는 예를 들어 상업적으로 입수할 수 있는 펩티드 라이브러리로부터 제공될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 펩티드는 길이가 5개 이상, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산, 특히 8개 이상의 아미노산이고, 길이가 11개 이하, 바람직하게는 14 또는 20개 이하의 아미노산이 바람직하다. 그러나, 본 발명에 따르면, 보다 긴 펩티드도 어떠한 문제 없이 APP 결합 수용체로서 사용될 수 있다. 추가로, 올리고머(예컨대, 폴리에틸렌-이민 및 폴리리신)이 수용체로서 적합하다.

이러한 APP 결합 수용체를 제조하기 위해, 예를 들어 조합 화학에 의해 또는 가장 많이 변화되는 구조에 대한 고출력 스크리닝법에 의해 제조된 펩티드 라이브러리, 파지 라이브러리가 적합하다[참조예: Phage Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al.: Willats WG, Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec., 50(6): 837-54; http://www. microcollections.de/showpublications.php#)]. 무작위화에 근거하는 파지 라이브러리 이외에, 리보좀 디스플레이 또는 세균 디스플레이를 이용하는 라이브러리가 적합하다. 이를 생성시키기 위한 적합한 라이브러리 및 방법은 당업자들에게 공지되어 있으며, US 2004/0110281 A, WO 00/72880 A 및 WO 02/059148 A에 기술되어 있다.

또한, 핵산에 기초하는 APP 결합 수용체("아트파머"; 또한 "데코이"-올리고데옥시누클레오티드(이들 서열로 인해, 전사 인자에 대해 결합 부위를 구성하는 ds 올리고누클레오티드))가 사용될 수 있으며, 후자는 가장 많이 변화되는 (올리고누클레오티드-) 라이브러리(예를 들어, 2-180 핵산 잔기를 갖는)로 발견될 수 있다[참조예: Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5 (5) (2002), 690-700; Famulok et al., Acc. Chem. Res. 3 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98(2001), 4961-4965, 및 기타 다수의 문헌]. 핵산 골격은 예를 들어 천연 포스포로디에스테르 화합물에 의해, 또한 포스포로티오에이트 또는 조합물 또는 화학적 변이체(예를 들어 PNA로서)에 의해 형성될 수 있으며, 본 발명에 따르면, 염기로서 주로 U, T, A, C, G, H 및 mC가 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 누클레오티드의 2'-잔기는 바람직하게는 H, OH, F, Cl, NH₂, O-메틸, O-에틸, O-프로필 또는 O-부틸이며, 핵산이 다른 방식으로 개질되는 것, 즉, 예를 들어 올리고누클레오티드 합성에서 통상적으로 사용되는 것과 같이 보호기가 제공되는 것이 가능하다. 그러므로, APP 결합 아프타머는 본 발명의 범주내에서 바람직한 APP 결합 친화성 분자이다.

APP에 대한 아프타머는 이후 기술되는 방법에 의해 발견되며, 예를 들어, 부동화된 APP(또는 상기 기술된 형태 중 또 다른 하나)는 핵산 혼합물과 접촉되며, 여기에서 높은 친화성 결합 핵산은 낮은 친화성 결합 핵산으로부터 또는 전혀 결합하지 않은 핵산으로부터 분리된다. 핵산과의 혼합물은 일반적으로 예를 들어 조합 화학에 의해 제조된 핵산 라이브러리이다. 핵산 라이브러리는 다수개의 서로 상이한 핵산을 함유하며, 이러한 핵산에서 적어도 일부 서열 영역에 무작위화(천연 및/ 또는 비천연 누클레오티드에 의해)가 제공된다. 보존된 서열 영역에는 제공될 필요가 없다. m개의 상이한 누클레오티드로의 n개의 위치에서의 무작위화는 n^m개의 엘레먼트를 갖는 라이브러리를 형성할 것이다.

APP 특이적 친화성 핵산을 위치시키기 위해, 하기 단계가 수행된다. a) 칼럼(내측으로)에 APP(등)가 적재되고, APP (등)이 칼럼에 부동화되는 단계; b) 핵산 혼합물이 칼럼의 제 1 말단에 적용되어, 칼럼의 제 1칼럼으로부터 제 2 말단으로 칼럼을 통해 흐르는 담체 물질의 정해진 용적 흐름이 제공되는 단계; c) 핵산이 칼럼의 제 1말단으로부터 증가되는 거리에서 친화성이 감소되면서 APP (등)에 결합되어 부동화되는 단계; d) 칼럼을 통한 담체 물질의 용적 흐름이 정해진 수행 시간 후에 완료되는 단계; e) 칼럼이 칼럼 세그먼트로 수개의 파티션(partition)에 의해 분할되고, 각각의 세그먼트가 관련 수행 경로 좌표를 수용하는 단계; f) 하나 이상의 세그먼트로부터 부동화된 핵산이 비특이적으로 탈착되어 상기 세그먼트와 관련된 수행 경로 좌표의 할당에 의해 회수되는 단계. "칼럼의 내측으로"라는 표현은 루멘 내에 있음을 의미하며 상당히 일반적이다. "칼럼"이라는 표현은 모든 유형의 고체 담체 시스템을 포함하고, 또한 완전히 폐쇄된 것은 아닌 담체 시스템도 가능하다.

APP (등)의 부동화는 통상적인 칼럼 크로마토그래피 방법에 따라 수행될 수 있다. 칼럼으로서, 두개의 말단을 갖는 루멘을 갖는 임의의 기계적인 구조를 나타낼 수 있다. 구조 물질로서는, 칼럼에 통상적인 모든 물질, 예를 들어 금속, 유리 및/또는 합성물질이 가능하다. 칼럼은 APP- (등) 결합 매트릭스가 내측으로 구비될 수 있고/있거나 구조 물질은 표적 분자의 직접 결합에 적합할 수 있거나 이를 위해 제조된 것이다. 핵산의 혼합물은 다수의, 일반적으로 10⁶ 내지 10²²/Mol, 특히 10¹⁰ 내지 10²¹/Mol의 서로 상이한 핵산 종을 갖는 핵산 라이브러리를 나타낸다. 칼럼에 적용되는 라이브러리에 있어서, 각각의 핵산 종은 통계학적으로 예를 들어 10 내지 10¹⁷, 특히 100 내지 10¹³개의 분자를 나타낸다. 일반적으로 담체 물질은 핵산 라이브러리가 가용성이고 안정한 액체이다. 이를 위해, 핵산 라이브러리에 대해 통상적인 모든 완충액 및 이의 유사물이 적합하다. 담체 물질의 용적 흐름은 핵산 라이브러리를 적용하기 전에 조정될 수 있다. 이후, 핵산 라이브러리는 칼럼의 도입측에서 담체 물질 흐름에 첨가된다. 그러나, 핵산 라이브러리는 또한 직접 첨가될 수도 있다. 칼럼의 셋업에 의해 결정되고, 용적 흐름에 의해 조절되는 수행 시간이 경과한 후, 핵산 라이브러리에 의해 가해진 "플러그"는 칼럼의 배출측(확산에 의한 폴딩(folding)에 의해 넓어진)에 다시 "플러그"로부터 분리되고 칼럼에 부동화된 결합된 핵산을 남긴다. 적합하게는, 칼럼을 통한 용적 흐름은 거의 없는 것으로, 또는 비난류형으로, 바람직하게는 층형(칼럼 용적에 대해, 특히 칼럼 단면에 대해 담체 물질의 가속 벡터의 합이 최소, 이상적으로 0으로)이 되도록 조절된다. 칼럼내 APP 분자의 전체 수는 일반적으로 적용된 핵산 라이브러리에서의 개별 종의 핵산 분자 수의, 10² 내지 10¹⁶배, 특히 10³ 내지 10¹⁵배일 것이다. APP 분자로의 핵산의 결합은 바람직하게는 예를 들어 온도, 이온 강도, pH 및 완충액 상태에 있어서 적합하게 조절된 적합한 완충액 중에서 혈장교환 동안에 핵산의 후 사용에 상응하는 조건 하에서 일어난다. 이후, 핵산 라이브러리의 용매 뿐만 아니라 담체 물질은 그의 성분과 관련하여 이에 따라 선택되어야 한다. 다수의 칼럼 세그먼트로의 칼럼 분리는 예를 들어, 칼럼을 부분으로 절삭하므로써 수행될 수 있으며, 이러한 절삭 부분은 바람직하게는 용적 흐름 벡터에 대해 직교한다. 그러나, 칼럼은 또한 칼럼 세그먼트로 어셈블링될 수 있으며, 이 경우 어느 한 칼럼 세그먼트는 바람직하게는 용적 흐름 벡터의 방향으로(용적 흐름 벡터에 직교하는 어셈블링 단면) 다음 칼럼 세그럼트와 인접한다. 이후, 칼럼 세그먼트의 이미 형성된 복합체를 떼어 놓으므로써 분리가 수행될 수 있다. 충분히 강한 리간로의 용리에 의해 물리 화학적이거나 열적으로 APP를 치환, 착화, 개질 및/또는 분해시키므로써 비특이적 탈착이 수행될 수 있다. 또한, 기계적 공정, 예를 들어, 초음파처리가 탈착을 위해 또는 탈착을 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 상술된 탈착 방법의 조합이 사용될 수 있다. 핵산이 사용된 탈착 방법에 의해 분해되지 않아야 함은 말할 필요도 없다.

상기 기술된 단계는, 핵산 라이브러리가 APP (등)에 대해 본원에 기술된 경우에서 표적 분자에 대한 친화성에 따라 공간적으로 친화성 크로마토그래피에 의해 단백질 혼합물과의 유사체로 분리될 수 있다는 발견에 근거한다. 추가로, 본 발명은 비특이적 탈착에 의해 일어나는 다양한 친화성을 갖는 탈착 핵산의 혼합이, 비특이적 탈착 전에 그 안에 결합된 핵산을 갖는 칼럼이 사실상 친화성 섹션으로 분 할된다는 점과, 이에 따라 얻어진 친화성 섹션 또는 칼럼 세그먼트에 결합된 핵산이 각각 예를 들어 PCR 또는 RT-PCT의 범위내에서 간섭하는 리간드 커플링 없이 용이하고 비특이적으로 탈착될 수 있고, 비특이적으로 증폭될 수 있다는 점에서 피해질 수 있다는 발견에 근거한다. 후속되는 인공물 선택도 피해진다. 탈착에는 리간드, 특히 고농도의 리간드도 요구되지 않는다, 결국, 실질적으로 모든 결합된, 그리고 이후 탈착된 핵산 분자가 증폭에 이용될 수 있다. 이는 저농도의 핵산으로 수행가능하게 한다. 기본적으로, 통계학적 평균으로, 핵산 라이브러리내 각각의 종이 어느 한 분자에 의해 대표되는 것이라면 이미 충분하다. 칼럼 세그먼트내 APP 분자 수가 통계학적으로 1인 경우, 단일 핵산 종도 표적 분자에 대한 그의 친화성에 따라 분리될 수 있다.

본 발명의 방법의 특정의 이점을 이하 기재하고자 한다. 친화성에 따른 핵산의 분리는 한 컬럼 세그먼트중의 핵산이 상이한 특이성을 지니면서 유사한 친화성을 지니게 되는 결과를 초래한다(APP의 상이한 영역이 APP 친화성 핵산에 의해서 결합되거나 APP 친화성 핵산을 위한 결합 부위이다).

기본적으로는, 요구된 친화성이 부여된 한 세그먼트가 탈착을 위해서 추가로 처리되면 충분하다. 그러나, 이를 위한 선결요건은, 체적 흐름 벡터에 대한 상관관계에서 첫 번째 컬럼 세그먼트가 추가로 처리되는 최대 친화성의 경우를 제외하고는 적용된 핵산 라이브러리에서의 친화성 분포를 알아야 한다. 따라서, 일반적으로, 회수된 핵산에 대한 각 세그먼트의 작동-경로 좌표를 각각 할당하면서, 각각의 분획의 고정화된 핵산은 개별적으로 탈착되고 회수될 수 있는 것이 바람직하다.

기본적으로는, 모든 형태의 탈착이 가능하다. 바람직하게는, 비특이적 탈착이 통상의 물리화학적 또는 열적 방법에 의해서 수행된다. 열적 탈착은 컬럼 세그먼트, 또는 그 안에 있는 용액을 각각 가열함으로써 수행된다. 가열은 전기적 가열 또는 마이크로파의 조사 또는 IR에 의해서 수행될 수 있다. PCR 기술로부터의 가열 기술이 특히 적합하다. 폴리머라제에 의한 핵산, 또는 앱타머(aptamer)의 증폭 이외에, 그 밖의 증폭방법이, 예를 들어, 리가아제에 의해서 이용될 수 있다. 비특이적 탈착은 APP의 화학적 변화, 예를 들어, 과요오드산 나트륨 등에 의한 산화, 또는 비특이적 복합체 형성, 예를 들어, 보레이트 등에 의해서 탄수화물중의 시스-트랜스 디올 결합을 차단함으로써 보조될 수 있다.

따라서, 비특이적 탈착이 PCR 또는 RT-PCR의 바람직하게는 연장된 고온상에서 열적 탈착으로 수행되면 바람직하다. 그 결과, 상승 효과가 달성되며, 그 이유는 일반적으로 특히 핵산 종의 낮은 농도에서 핵산 라이브러리로 작업하는 경우, 증폭이 요구되기 때문이다. 수율을 높이기 위해서, 예를 들어, 5 내지 60, 바람직하게는 20 내지 60, 가장 바람직하게는 45 내지 55 사이클로 수행된다. 증폭의 범위내에서, 하나 이상의 표지된 프라이머로 작업하는 것이 가능하다. 프라이머는 하나 이상의 내인성뉴클레아제 분해부위를 지닐 수 있다. 그러한 분해 부위는, 예를 들어, 증폭된 물질을 프라이머 서열의 더 큰 영역으로부터 유리시키는 역할을 한다. 프라이머 내에 있거나 소정의 핵산 중에 있는 뉴클레오티드 형성 블록은 형광염료에 의해서 표지될 수 있다. 형광 염료로서, 예를 들어, 알렉사 TM 플루오린 488(Alexa TM Fluorine 488), 플루오린 532, 플루오린 546, 플루오린 568, 플루오 린 594, 오레곤 그린 488(Oregon Green 488), 플루오레세인(Fluoresceine), 로다민 6G, 테트라메틸로다민, 로다민 B 및 텍사스 레드(Texas Red)가 언급될 수 있다. 증폭된 물질은, 변화 동안 도입된 그룹이 적합하여 각각 상이한 친화성 매트릭스에 리간드로서 결합될 수 있는 한, 상이한 단부에서 두 가지의 상이한 화학적 변화에 의해서 표지될 수 있다.

비친화성 또는 저친화성 핵산의 신뢰 가능한 분리의 경우, 적합한 방법 스테이지 사이에 세척 단계를 도입시키는 것이 권장될 수 있다. 특히, 1회 이상의 세척단계가 단계 d) 내지 e) 사이에 수행되면 바람직하다. 세척하는 경우, 예를 들어, 용매, 또는 핵산 라이브러리의 매질, 또는 담체 물질이 각각 적합하다.

APP(등)에 의한 컬럼의 내부 코팅 및 이의 고정이, 바람직하게는 높은 화학적 반응성 기(예, 트레실 클로라이드, 시아노브로미드 및/또는 과요오드산염)에 의한 활성화 후에 공유결합에 의해서, 또는 화학적으로 낮은 반응성 기(예, 아민, 히드록시, 케토 및/또는 카르복실)로 변화된 후에 이작용성 스페이서 링크를 통해서 수행되는 것이 바람직하다. 적합한 스페이서 링크를 위한 스페이서 주쇄의 예는 치환된 및 비치환된 C₂-C₁₀ 알킬기, 치환된 및 비치환된 C₂-C₁₀ 알케닐기, 치환된 또는 비치환된 C₂-C₁₀ 알키닐기, 치환된 및 비치환된 C₄-C₇ 카르보시클로알킬기, 치환된 및 비치환된 C₄-C₇ 카르보시클로알케닐기, 치환된 및 비치환된 C₇-C₁₄ 아르알킬기, 및 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자를 지니는 헤테로사이클 분자이고, 여기서, 치환체는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 티올, 티오알콕시, 히드록실, 아릴, 벤질, 페닐, 니트로, 할로겐, 2 내지 10개의 탄소원자와 1 내지 4 개의 산소 또는 황 원자를 지니는 에테르기, 폴리알킬글리콜, 할로겐, 히드록실, 티올, 케토, 카르복실, 아미드, 에테르 화합물, 티오에테르, 아미딘 유도체, 구아니딘 유도체, 글루타밀 유도체, 니트레이트(ONO₂), 니트로(NO₂), 니트릴, 티오플루오로메틸(-CF₃), 트리플루오로메톡시(-OCF₃), O-알킬, S-알킬, NH-알킬, N-디알킬, O-아르알킬, S-아르알킬, NH-아르알킬, 아미노, 아지도(N₃), 히드라지노(NHNH₂), 히드록실아미노(ONH₂), 술폭시드(SO), 술폰(SO₂), 술피드(S-), 디술피드(S-S), 실릴로 이루어질 수 있다. 전형적으로는, 스페이서 링크는 이작용성이며, 그러한 작용성은 동일하거나 상이할 수 있으며, 예를 들어, "N-히드록시숙신이미드 및 히드라지드"로 이루어진 군으로부터 선택된다.

하나 이상의 컬럼 세그먼트로부터 얻을 수 있는 핵산내의 다양성을 감소시키기 위해서, 각각의 컬럼 세그먼트가 통계적 평균으로 0.1 내지 10³, 바람직하게는 1 내지 10², 가장 바람직하게는 1 내지 10, APP (등) 분자를 함유하는 것이 바람직하다. 이와 연관되어, 적용되는 핵산 라이브러리는 이의 통계적 평균으로 0.1 내지 10³, 바람직하게는 1 내지 10², 가장 바람직하게는 1 내지 10, 한 종류의 핵산분자를 함유할 수 있다.

컬럼의 구조 물질에 있어서, 기본적으로는 친화성 크로마토그래프로부터 공 지된 모든 물질이 이용될 수 있다. 이들 중에는 실리카겔 또는 폴리머 컬럼, 예컨대, 화학적 유도체와 또는 플라즈마 활성화에 의해서 활성화된 후의 폴리에틸렌 컬럼이 있다. 컬럼 세그먼트의 길이는 적합하게는 0.1　㎛ 내지 1　mm, 바람직하게는 0.1 내지 100　㎛, 가장 바람직하게는 0.5 내지 10　㎛의 범위내에 있다. 그러한 섹션은 마이크로톰에 의해서 용이하게 제조될 수 있다. 컬럼의 내경은 적합하게는 0.05 내지 1　mm, 바람직하게는 0.1 내지 0.5　mm, 가장 바람직하게는 0.2 내지 0.4　mm의 범위 내에 있다.

바람직하지 않은 핵산은 핵산의 분리(결합 또는 기계적 분리) 전에 제거되는 것이 적합하다. 바람직하지 않은 핵산은, 예를 들어, 컬럼의 APP-유리 내부 표면에 결합하는 핵산이다. 이어서, APP-유리 컬럼은 상향류로 제공될 수 있으며, 핵산 라이브러리가 우선적으로 그러한 컬럼을 통해서 유도된다.

상기된 방법의 형태에 있어서, 작동은, 예를 들어, 연속적으로 연결된 컬럼에 의해서 연속적이거나 선행 컬럼으로부터의 용리액의 간헐적 수거에 의해서 불연속일 수 있다.

친화성 분리를 더 개선시키기 위해서, 기본적으로는 다양한 방식으로 진행시킬 수 있다. 임의적으로 증폭 후에 하나 또는 수개의 세그먼트로부터 탈착된 핵산이 본 발명의 방법에 반복적으로 적용될 수 있고/거나, 탈착 동안의 용리 조건을 상승시킬 수 있다(온도, 이온 강도, pH, 완충 조건). 또한, 컬럼 세그먼트내의 APP의 공간 밀도, 및 그에 따른 결합된 핵산의 공간 밀도, 즉, APP 분자의 수를 감소시킬 수 있다.

APP-결합 앱타머(상기된 본 발명에 따르면, Aβ₄₂-결합 앱타머를 포함)는 본 발명의 범위내에 있는 바람직한 APP-결합 수용체이다.

본 발명에 따르면, 펩티드, 항체 또는 핵산으로 구성되는 APP-결합 수용체가 알츠하이머(위험) 환자에서의 APP 및 이의 단백질 분해 생성물의 체외 제거를 위한 적합한 담체 물질로 사용된다.

의학적 경로의 실행에서 본 발명을 이용하는 경우, 담체는 무균이며 발열성물질이 없는 초순수이어야 하며, 이러한 요건에 부합되는 어떠한 담체 물질 또는 어떠한 수용체/담체 조합이 본 발명에 바람직하다(참조예, US 6,030,614 또는 US 5,476,715). 적합한 예로서는, EP 110　409　A 및 DE 36　17　672　A에 기재된 바와 같은, 비닐 함유 단량체(예, 아크릴산, 예컨대, TSK 토요피얼(TSK Toyopearl), 프락토겔 TSK(Fractogel TSK))의 호모폴리머, 코- 또는 터-폴리머, 옥시란 함유 화합물(예, 에피클로로히드린)로 변화(활성화)되고 임의로 NH₃, 아미노 또는 카르복실 함유 화합물과 더 반응된 담체, 또는 CNBr 또는 CNCl 흡착제가 있다. 치료 목적으로 특히 바람직한 흡착 물질은 혈구의 손실을 방지하기에 적합하며, 보체계를 활성화시키지 않거나 약간만 활성화시키며, 가능한 한 체외 순환에서의 응집체 형성을 방지한다. 또한, 사용된 담체 물질은, 바람직하게는, 수용체에 결합되는 경우의 무균화 과정에 대해서, 특히 에틸렌-옥시드 포화, 글루타르알데히드 포화, 감마-조사, 증기 처리, UV 처리, 용매 처리 및/또는 세정제 처리 등에 대해서 충분히 안정해야 한다. 구매 가능한 형태에서 이미 APP-결합 수용체의 결합을 위한 적합한 작 용기를 포함하는 세파로스(sepharose), 아가로스(agarose), 아크릴, 비닐, 덱스트란 등을 기재로 하는 생성물이 사용될 수 있다. 추가의 적합한 담체는 모노리스(monolith) (가교된 글리시딜-메타크릴레이트-코-에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트-폴리머를 기재로 하는 담체) 수폴(Supol)을 포함한다[문헌: Poschalko et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, Nov. 5; 125 (44): 13415-26].

수용체를 적합한 담체에 결합시키는 경우, 당업자에게는 공지된 화학(예, Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Ed., Academic Press Inc., San Diego, CA, 1995, 785pp.)이 이용될 수 있다.

추가의 관점으로, 본 발명은 알츠하이머 질환을 앓고 있는 환자의 치료를 위한 장치를 적합하게 제조함으로써 그러한 환자를 치료하거나 치료 절차를 수행하거나, 그러한 질환을 예방하는 본 발명의 장치의 용도에 관한 것이다. 그러한 치료를 수행하는 경우, 환자는 APP 폴리펩티드를 효과적으로 제거하기에 충분한 시간 동안 아페레시스(apheresis) 장치에 연결되며, 여기서, 환자의 혈류 또는 혈장류가 APP-결합 수용체를 포함하는 고형 담체와 접촉되며, 이때 APP 및/또는 APP의 단백질 분해 생성물, 특히 Aβ₄₂가 결합된다. 아페레시스 처리 동안에, 물론, 말초 또는 중심정맥 삽입기기(peripheral or central-venous vein access) 또는 동정맥루는 충분히 항응집되어야 하며, 요구되는 정량화 및 측정 데이타가 기록되어야 한다. 또한, 대부분 아페레시스 방법에서, 혈장 및 혈구의 일차 분리는 혈장 처리전에 요구될 것이다. 예방이 요구되는 특정의 사람은 혈통적 원인이 있는 사람, 노 년(연령 >50, >60 또는 >70) 또는 AD에 대한 인자, 특히 유전적 인자가 있는 사람이다.

본 발명은 본 발명을 제한하는 것이 아닌 도면뿐만 아니라 이하 실시예로 상세히 설명될 것이다.

도 1은 펩티드 1208(BSA에 결합되고 ELISA 플레이트에 코팅됨)에 대한 Aβ₄₂ 의 결합을 나타낸다.

도 2는 Aβ₄₂(ELISA 플레이트에 코팅됨)에 대한 펩티드 1208(및 1208-BSA)의 결합을 나타낸다.

도 3은 1208-BSA에 대한 Aβ₄₂의 경쟁적 결합을 나타낸다.

1. APP 수용체 담체의 생산

1.1 모놀리스 컬럼

CIM^® 에폭시 모놀리스 컬럼(BIA 분리, SI)을 제조자의 지시에 따라서 pH8.0의 0.5　m Na 포스페이트 완충액으로 평형시키고, 제조자의 지시에 따라서 Aβ 펩티드에 대한 단일클론성 항체를 활성화시키고, CIM 컬럼에 커플링시켰다. 컬럼을 포스페이트 완충액(+ 1　M NaCl)으로 수회 세척하고, 과량의 에폭시기를 임의로 차단하였다.

세척 및 평형 용리액중의 검사에 의해서 품질을 검사하고; 용리액중에 활성 에폭시기와 항체 유출이 없는 산이 아페레시스 장치에서 추가로 사용되며 설치된다.

1.2 세파로스 컬럼

아가로스 벌크 물질(세파로스 CL4B)를 무균이며 발열성 물질이 없는 초순수 용기에 무균적으로 넣고, 물질을 무균적으로 세척하고, 겔 물질을 각각의 세척 단계 사이에 완전히 건조시켰다. 후속하여, 세파로스를 오토클레이브중의 115℃에서 30분 동안 증기 살균하였다.

살균 후에, 세파로스를 60% 아세톤/물중의 무균 용기에 취하고, CNBr 및 트리에틸아민(96ml의 아세톤당 14　g의 CNBr; 66.2　ml의 87% 아세톤중의 30　ml의 트리에틸아민)으로 활성화시켰다. 이어서, 아세톤/HCl 용액을 가하였다(392　ml의 무균이며 발열성 물질이 없는 초순수 물; 16.3　ml의 5N HCl, 408　ml의 아세톤). 활성화된 세파로스를 세척하고 활성화된 기의 가수분해를 방지하기 위해서 2 시간 이내에 커플링 반응에 공급하였다.

무균-여과된 항체 용액(각각 m266 및 m243)을 반응 용기에 도입하고, 90분 이상 동안 교반하였다. 최종적으로, 반응 용액을 용리액에서 반응 생성물이 검출되지 않을 때까지 완전히 세척하고(등장성 포스페이트 완충액으로), 항체 커플링된 세파로스를 유리 소결에 의해서 무균 및 탈발열성물질화된 유리 컬럼에 충전하고, 최종 품질 검사를 하였다(반응 생성물, 및 중금속 등에 대한 용리액 분석; 입자 분석, 발열원성; 무균성).

2. 알츠하이머 환자의 아페레시스 처리를 위한 동물 모델

당뇨병 "게르하트 캐츠(Gerhardt Katsch)"에 대한 연구에서, 소형 동물 모델 래트에서의 아페레시스 치료를 위해서 소형의 체외 시스템이 개발되었다. 세계적 으로, 그러한 아페레시스 시험 시스템은 아주 제한적인 범위로만 이용되고 있다. 동일한 시험 동물에 대한 반복된 아페레시스 처리 및 치료의 성공을 평가하는 후속 기간에서의 후속된 시험은 아주 새로운 시험이며 국제 공개문헌에서는 기재된 바 없다.

아페레시스는 체외 혈액으로부터 병원성 물질이 추출되는 또 다른 치료 방법이다. 인간 의학에서, 100 가지 이상의 질환의 치료에 대해서 사용되어 왔다. 아페레시스의 도움으로, 질환 관련 물질이 완전히 또는 적어도 부분적으로 자가 면역 질환, 예컨대, 관절염, 중증근육무력증, 내분비성 눈병증, 다발성 경화증, 전신 루프스 홍반, 스티프-맨 증후군(Stiff-Man Syndrome), 및 타입 1 당뇨병중의 혈액i.a.로부터 제거될 수 있다. 지금까지, 그러나 아페레시스는 감염된 환자의 생활의 질이 아주 부담되고 현저하게 저하되는 치료 내성의 만성 질환의 치료를 위한 또 다른 방법으로만 허용되고 있다. 그러한 실질적인 이유는 성공적인 아페레시스 치료법의 작용 기전에 관한 상세한 지식이 없다는 것이다.

예를 들어, 타입 I 당뇨병 및 관절염 둘 모두에 대한 알려진 동물 모델을 사용함으로써 아페레시스 방법의 작용 기전이 추가로 명백해질 수 있으며 아페레시스 치료에 대한 신규한 방법이 예비 임상적으로 시험될 수 있다. 아페레시스 치료를 수행하기 위해서, 시험 동물에게 우선 영구적인 혈관 카테테르를 장착한다. 체외 순환에서, 혈액의 혈장 및 세포 성분이 혈장 필터에 의해서 분리된다. 세포 성분은 동물에게 즉각적으로 재주입되면서, 혈장은 재주입되기 전에 다양한 흡착 방법(면역흡착 및 그 밖의 방법)으로 정제될 수 있다. 그러한 반복된 아페레시스 치료 의 양호한 관용성은 상이한 래트종(신체질량, 헤마토크릿, 일반적인 조건)에서 이미 입증되었다. 아페레시스 시험 시스템은 최소 체충 250g의 동물에서 시험되고, 래트 모델에서 자가면역 질환에 대해서 사용되었다(타입 I 당뇨병, 콜라겐 타입 II-유도된 관절염).

작은 동물 모델에서의 혈장아페레시스를 위한 체외 시스템은 상이한 형태의 흡착을 위해서 사용될 수 있다. 만성 질환에 대한 모델에서의 이러한 시험 시스템의 이용은 (A) 새로운 치료 및 예방 방법의 시험, 및 상이한 아페레시스 기술의 작용 기전의 해명, 및 (C) 각각의 아페레시스 치료법을 위한 처방의 결정을 가능하게 한다. IDK는 새롭게 개발된 아페레시스 방법의 임상전 시험에서의 적격의 파트너이며, 동물 실험에서의 사용을 통한 개발단계로부터 환자에서의 임상 적용까지 새로운 치료 방법의 이전과 마케팅에 근본적으로 기여할 수 있다(http://www.praeklinik.de/).

실험적인 아페레시스 치료법을 개시하기 전에 동물에게 동맥 및 정맥 카테테르가 제공되거나, 영구적으로 카테테르화된 래트(시험 물질을 적용 및 혈액 샘플을 채집할 뿐만 아니라 동물 모델에서의 아페레시스 치료 및 클램프 시험을 수행하기에 적합한 혈관 카테테르)가 이용된다. 아페레시스에서, 초기 혈구와 혈장은 제 1 단계에서 혈장 필터에 의해서 분리된다. 혈구는 동물에게 즉시 재주입되면서(정맥 카테테르를 통해서), 분리된 혈장은 동물에게 재주입되기 전에 실시예 1에서 제조된 흡착 수단을 통해서 유도된다(여기서, 리간드는 고정된 친화성 펩티드에 결합시킴으로써 혈장으로부터 분리된다).

3. Aβ₄₂ 앱타머

3.1 트레실 클로라이드에 의한 실리카겔 컬럼의 활성화

컬럼을 아세톤으로 세정한다. 활성화 동안, 무수 용액(2　ml의 아세톤, 1　ml의 트레실 클로라이드, 피리딘 수 방울)이 컬럼을 통과하고(컬럼 용적의 10 배) 얼음 상에서 밤새 인큐베이팅된다. 이어서, 컬럼을 컬럼 용적의 20 배의 100% 아세톤(무수)으로 세정한다. 활성화된 컬럼을 1　mM HCl중에 저장한다.

3.2 폴리에틸렌 컬럼의 활성화

실온에서, 폴리에틸렌 튜브를 컬럼 용적의 20배의 용액(진한 황산(H₂SO₄)중의 2% 과망간산칼륨(KMnO₄) (w/v))으로 세정하고, 이어서, 증류수로 세정한다. 컬럼 표면의 추가의 커플링 전에, 적어도 하나 이상의 반응성 알테히드기(예, 1% 글루타르알데히드)를 지니는 이가 및 다가 분자가 가교를 위해서 사용된다. 이들은 4℃에서 1 시간 동안 컬럼을 통과한다. 이어서, 반응이 환원 조건, 예를 들어, 나트륨 시아노보로히드라이드(0.15　M NaCl중의 0.00025% w/v, pH 3.9)에 의해서 안정화된다.

3.3 활성화된 실리카겔 컬럼에 대한 Aβ₄₂의 커플링

트레실 클로라이드-활성화된 컬럼을 0.1　M Na₂CO₃ (pH 8.5)로 세정한다. 커플링을 위해서, 펩티드 또는 단백질(2　mg/ml 0.1　M Na₂CO₃, pH 8.5)을 37℃에서 2 시간 동안 및 이어서 얼음상에서 4 시간 동안 수회 컬럼을 통과시킨다. 컬럼의 자 유 결합 부위를 차단하기 위해서, 후속하여 과량의 0.2　M 글리신, pH 8을 컬럼에 통과시킨다.

3.4 활성화된 폴리에틸렌 컬럼에 대한 당단백질의 커플링

활성화된 컬럼을 0.1　M Na₂CO₃ (pH 8.5)로 세정한다. 커플링을 위해서, Aβ₄₂ (2　mg/ml, 0.1　M Na₂CO₃, pH 8.5)을 37℃에서 2 시간 동안 및 이어서 얼음상에서 4 시간 동안 수회 컬럼을 통과시킨다. 컬럼의 자유 결합 부위를 차단하기 위해서, 후속하여 과량의 0.2　M 글리신, pH 8을 컬럼에 통과시킨다. 반응을 개선시키기 위해서, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC), 5% w/v를 가할 수 있다.

3.5 바람직하지 않은 분자를 제거하기 위한 컬럼의 생산

트레실 클로라이드-활성화된 컬럼을 0.1　M Na₂CO₃ (pH 8.5)으로 세정한다. 하나 또는 몇 가지의 일차 또는 이차 아민을 지닌 분자에 대해서 제거가 수행되어야 하면, 이러한 분자, 또는 이의 혼합물(2　mg/ml 0.1　M Na₂CO₃, pH 8.5)을 실온에서 밤새 수회 컬럼에 통과시킨다. 컬럼의 자유 결합 부위를 차단하기 위해서, 이어서 과량의 0.2　M 글리신, pH 8을 컬럼에 통과시킨다. 하나 이상의 일차 또는 이차 아민을 지닌 특정의 분자의 제거가 요구되지 않으면, 컬럼의 모든 결합 부위가 글리신으로 차단된다.

추가의 유도체화 방법은 이하 참조 문헌을 참조할 수 있다. 문헌[Patterson, W. J., National Aeronautics and Space Administration, Technical Memorandum, NASA TMX-73311, U.S. Government Printing Office, Washington, D. C., 1976, Ma, S. M., Gregonis, D. E., von Wagenen, R. A., and Andrade, J. D., in "Hydrogels for Medical and Related Applications" (J. D. Andrade, Ed.), Amer. Chem. Soc. Symp. Series, Vol. 31, p. 241, 1976, Harris, J. M., Struck, E. C., Case, M. G., Paley, M. S., Van Alstine, J. M., and Brooks, D. E., J. Polymer Sci., Polymer Chem. Ed., 22, 341 (1984), Regnier and Noel, Regnier, F. E., and Noel, R. J., J. Chromatog. Sci., 14, (1976), Yalpani, M. and Brooks, D. E., J. Polymer Sci., Polymer Chem. Ed., 23, 395 (1985)].

3.6 Aβ₄₂ 에 대한 핵산 접촉의 수행 및 컬럼의 분리

코팅된 컬럼을 누출부 없이 직렬로 연결하는데, 첫 번째 컬럼은 바람직하지 않은 분자를 제거하기 위한 컬럼이며, 이어서, Aβ₄₂ 컬럼이 연결된다. 평형 목적을 위해서, 적합한 완충액, 예를 들어, 완충용액(10　mM 트리스-HCl, 50　mM KCl, 1.5　mM MgCl₂ 및 젤라틴 0.001% (w/v) pH 8.3)이 얼음상에서 1 시간 동안 컬럼에 통과된다. 조합성 핵산 라이브러리의 핵산을 1ml의 동일한 완충액에 취하고 이중 가닥의 용융을 위해서 95℃에서 10분 동안 가열되며, 이들을 컬럼에 수회(4 내지 30회) 통과시킨다. 이어서, 컬럼을 분리하고 얼음상에서 밤새 선택된 완충액(상기 참조)으로 세척한다. 흐름 방향으로의 컬럼의 분리가 적합한 커팅 기구에 의해서 수행되었다.

4. 펩티드 1208(FGFPEHLLVDFLQSLS-C)에 대한 Aβ₄₂의 결합 시험

펩티드 1208에 대한 아밀로이드-베타-결합의 분석을 위해서, 우선 펩티드를 담체 단백질(BSA)에 커플링시켰으며, 상기 펩티드의 농도는 500　μMol(약 1mg/ml)이다. 1208-BSA 컨주게이트를 ELISA 플레이트에 결합시키는데, 웰당 100ng의 펩티드를 결합시켰다. ELISA 플레이트를 PBS, 1% BSA로 포화시키고, 이어서, 아밀로이드-베타 (1-42)의 결합을 8-100ng/웰의 농도 범위에서 분석하였다. 결합된 아밀로이드-베타는 특이적 마우스 항체로 검출되었다. 마지막으로, 결합된 아밀로이드의 양을 비오티닐화된 항-마우스 항체 및 스트렙타비딘-커플링된 퍼옥시다제를 사용하여 칭량하였다. 기질로서, ABTS가 사용되었으며, ELISA 리더에서 405nm 파장으로 분석을 수행하였다(도 1).

펩티드 1208의 결합에 대한 분석을 위해서, 아밀로이드-베타 (1-42)를 ELISA 플레이트(웰당 500ng)에 결합시켰다. 이어서, ELISA 플레이트를 PBS, 1% BSA로 포화시키고, 이어서, 유리 펩티드 1208 또는 1208-BSA 컨주게이트를 각각 가하였다(1.6 내지 50ng). 결합된 펩티드를 특이적 모노클론성 항체로 검출하였다. 최종의 정량화를 위해서, 비오티닐화된 항-마우스 항체 및 스트렙타비딘-커플링된 퍼옥시다제를 사용하였다. 기질로서, ABTS가 사용되었으며, ELISA 리더에서 405nm 파장으로 분석을 수행하였다(도 2).

1208-BSA 컨주게이트를 ELISA 플레이트(웰당 100ng의 펩티드)에 결합시키고, 플레이트를 PBS, 1% BSA로 포화시켰다. 이어서, 자유 펩티드 1208 또는 대조-펩티드(농도 범위 30 내지 2000ng/)의 존재하에 아밀로이드-베타(1-42)(100ng/웰)의 결합을 분석하였다. 결합된 아밀로이드-베타의 검출은 상기된 바와 같았다(도 3).

Claims (4)

1. 혈류 또는 혈장류와 접촉될 수 있는 고형 담체를 포함하는 아페레시스 장치로서, 고형 담체가 아밀로이드-β-전구체-단백질(APP)-결합 수용체를 포함함을 특징으로 하는 아페레시스 장치.
2. 제 1항에 있어서, APP-결합 수용체가 항-APP 항체, 항-Aβ₄₀ 항체, 항-Aβ₄₂ 항체, APP-결합 단백질, 특히 겔솔린(gelsolin), apoJ 또는 apoE, APP-결합 펩티드, APP-결합 간글로시드, 특히, GM1, 또는 APP-결합 핵산, 특히, 앱타머, 또는 이들 수용체의 혼합물임을 특징으로 하는 아페레시스 장치.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 담체가 무균이며 발열성 물질이 없는 초순수 컬럼임을 특징으로 하는 아페레시스 장치.
4. 알츠하이머 질환을 치료 또는 예방하기 위한 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 아페레시스 장치의 용도.

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