KR20070020408A - 분기 폴리머 당 및 그 뉴클레오티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구조체내에 하나 이상의 폴리머 수식성분(polymeric modifying moiety)을 포함하는 당(sugars), 뉴클레오티드당(nucleotide sugars), 활성화당(activated sugars)을 제공한다.

본 발명은 수용성 폴리머 폴리(에틸렌 글리콜) 등 선상 및 분기상 폴리머(linear and branched polymers)를 기준으로 하여 예시한다.

폴리머 수식성분, 활성화당

Description

분기 폴리머 당 및 그 뉴클레오티드{BRANCHED POLYMERIC SUGARS AND NUCLEOTIDES THEREOF}

(관련출원)

이 출원은 미국가특허출원 90/539,387(2004.01.26출원);미국가특허출원 60/544,411(2004.02.12출원);미국가특허출원60/546,631(2004.02.20출원);미국가특허출원60/555,504(2004.03.22출원);미국가특허출원60/570,891(2004.05.12출원);미국가특허출원60/590,649(2004.07.23출원);미국가특허출원60/590,573(2004.07.23출원);미국가특허출원60/592,744(2004.07.29출원);미국가특허출원60/611,790(2004.09.20출원);미국가특허출원60/614,518(2004.09.29출원);미국가특허출원60/623,387(2004.10.29출원);미국가특허출원60/626,678(2004.11.09출원);미국가특허출원10/997,405(2004.11.24출원);PCT/US04/03971(2004.11.24출원);PCT/US04/40709(2004.12.03출원);미국가특허출원60/641,956(2005.01.06출원);미국가특허출원60/643,347(2005.01.10출원);PCT/US05/00799(2005.01.10출원)의 우선권을 주장하며, 상기 출원 각각의 개시내용을 통합하여 출원목적에 따라 여기서 편집한 것이다.

본 발명은 수식당(modified sugars) 및 그 뉴클레오티드의 기술분야에 관한 것이다.

펩티드의 생체외 발현후 수식에는 새로운 부위에서 글리칸의 도입 또는 글리칸 구조의 수식 모두를 포함하며, 발현 시스템의 처리에 의해 글리코실화(glycosylation)의 조정이 좌우되는 방법의 결점을 해소하기 위한 기술적 관심이 있는 설계가 있다.

재조합형 진핵성 글리코실 전이효소의 광범위한 툴박스(tool box)를 이용할 수 있게 되어, 통상적으로 형성된 글리코실화 패턴과 글리코실 구조를 가진 포유동물의 글리코콘주게이트(glycoconjugates)의 생체외 효소합성이 가능하게 되었다.

예로서 아래의 특허 문헌을 참조할 수 있다.

USP5,876,980; 6,030,815; 5,728,554; 5,922,577 및 WO/9831826; US2003/80835; WO03/031404.

효소기질합성에는 레기오선택성(regioselectivity)과 입체선택성(stereoselectivity)의 이점이 있다. 더욱이, 효소합성은 비보호기질 (unprotected substrates)을 사용하여 실시한다.

카르보히드레이트, 글리코실전이효소(즉, 시알릴전이효소, 올리고사카릴전이효소, N-아세틸글루코사미닐 전이효소)및 글리코시다아제의 합성에서는 주요한 3종분류의 효소가 사용되었다.

그 글리코시다아제는 엑소글리코시다아제(즉, β-만노시다아제, β-글루코시다아제)와 엔도글리코시다아제(즉, 엔도-A, 엔도-M)로 더 분류하였다.

이들 분류의 효소각각을 계속적으로 사용하여 합성에 의해 카르보 히드레이트를 제조하였다.

일반적인 문헌으로 다음 문헌을 참조할 수 있다:

Crout등 Curr. Opin. Chem. Biol. 2; 98-111(1998)

글리코실 전이효소는 글리코 펩티드 상에서 올리고사카리드를 수식한다. 글리코실 전이효소는 입체화학적이며 레기오화학적(regiochemical)인 조절(control)이 좋은 특정 생성물의 제조에 효과적이다.

글리코실 전이효소는 올리고사카리드를 제조하여 말단 N-및 O-결합 카르보히드레이트 구조를 특히 포유동물의 세포에서 생성된 글리코 펩티드 상에서 수식하는데 사용하였다.

예로서, 글리코 펩티드의 말단 올리고사카리드는 완전하게 시알릴화 및/또는 푸코실화 하여 더 일정한 당구조를 제공하며, 그 당 구조는 글리코펩티드의 약역학적 특성과 다양한 다른 생물학적 특성을 향상(개량)시킨다.

예로서, β-1,4-갈락토실전이효소를 사용하여 락토사민을 합성하였다. 카르보히드레이트의 합성에서 글리코실 전이효소의 유용성에 대한 설명은 다음 문헌에서 참조할 수 있다:

Wong 등, J. Org. Chem. 47: 5416-5418(1982).

더욱이, 여러가지의 합성 처리공정에서 α-시알릴전이효소를 사용하여 시알산을 시티딘-5'-모노포스포-N-아세틸뉴라민산에서 갈락토오스의 3-OH 또는 6-OH로 전이하였다(참고문헌: Kevin 등, Chem. Eur J.2: 1359-1362(1996)참조).

합성경로에서 푸코실 전이효소를 사용하여 하나의 푸코오스 단위(fucose unit)를 구아노신-5'-디포스포푸코스에서 사카리드 수용체의 특정의 히드록시로 전 이하였다.

예로서, 다음 참고문헌(이치카와:Ichikawa)에서는 클론화(cloned) 푸코실 전이효소로 시알릴화 락토사민을 푸코실화 하는 것을 포함하는 방법에 의해 시알릴 류이스(sialyl Lewis)-X를 제조하였다(참고문헌: Ichigawa 등, J. Am. Chem. Soc. 114: 9283-9298(1992)). 치료용으로 쓰이는 글리코콘주게이트(glycoconjugate)합성에서 최근의 진보에 대한 논평에서는 다음 문헌을 참조할 수 있다: Koeller 등, Nature Biotechnology 18: 835-841(2000).

또, 다음 특허문헌을 예시할 수 있다:

USP 5,876,980; 6,030,815; 5,728,554; 5,922,577; 및 WO/9831826.

글리코실기의 구조를 폴리펩티드 상에서 처리하는 것 이외에, 수용성 폴리머 등 하나 이상의 비사카리드 수식단기(non-saccharide modifying group)으로 수식하는 글리코 펩티드의 제조개발에 기술적인 관심이 있었다.

폴리(에틸렌 글리콜)("PEG")은 폴리펩티드에 콘주게이팅(conjugating)하는 하나의 대표적인 폴리머이다. 펩티드 치료를 유도하는 PEG의 사용은 그 페티드의 면역원성을 감소하는 것으로 나타내었다.

예로서, 특허문헌 USP 4,179,337(Davis 등) 명세서에서는 효소와, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜에 결합된 펩티드 호르몬(peptide hormons)등 비면역원성 폴리펩티드에 대하여 기재되어 있다.

폴리펩티드 1mol당 폴리머 10~100mol을 사용하였다. 그 콘주게이트의 생체내 (in vivo) 클리어런스 시간(clearance time)이 그 폴리펩티드의 것에 비하여 지연 되나, 불과 약 15%의 생리활성만을 유지하였다.

이와 같이, 그 지연성 순환 반감기(prolonged circulation half- life)는 펩티드 효력의 현저한 감소에 의해 그 효과가 상쇄된다(counterbalance).

펩티드 활성의 상실(loss)은 그 수용성 폴리머를 콘주게이팅(conjugating)하는데 유용한 화학적 성분의 비선택 특성에 직접 기인된다.

펩티드에 PEG와 그 유도체를 결합하는 주요한 모드(mode)에는 펩티드 아미노산 잔기에 의한 비 특이성 결합(non-specific bonding)이 있다.

예로서, 특허문헌 USP 4,088,538 명세서에서는 효소가 PEG에 공유결합한 효소활성 폴리머-효소콘주게이트에 대하여 기재되어있다.

동일하게, 특허문헌 USP4,496,689 명세서에서는 PEG등의 폴리머와 α-1 단백질 가수분해효소 억제제(proteinase inhibitor)의 공유결합 복합체(complex)에 대하여 기재되어 있다.

참고문헌(Abuchowski 등, J. Biol. Chem. 252: 3578(1979))에서는 소혈청 알부민(bovine serum albumin)의 이민기에 MPEG의 공유결합에 대하여 기재되어있다.

특허문헌 USP 4,414,147 명세서에서는 폴리(에틸렌숙신 무수물)등 디카르복실산의 무수물에 인터페론을 콘주게이팅하여 인터페론의 소수성을 더 적게하는 방법에 대하여 기재되어 있다.

특허문헌 PCT WO87/00056 명세서에서는 인터페론-β, 인터류킨(interleukin)-2 및 면역독소 등의 단백질에 PEG 및 폴리(옥시에틸레이티드)폴리올의 콘주게이션(conjugation)에 대하여 기재되어 있다.

특허문헌 EP 154,316 명세서에서는 림포카인의 최소 하나의 1급 아미노기에 직접 결합한 PEG 함유 IL-2등 화학적으로 수식한 림포카인(lymphokines)에 대하여 기재되어 있으며, 특허권을 청구하고 있다.

특허문헌 USP 4,055,635 명세서에서는 폴리사카리드 등 폴리머 물질에 공유결합된 단백질 분해효소의 수용성 복합체의 의약 조성물에 대하여 기재되어 있다.

펩티드에 PEG를 결합하는 또다른 모드(mode)에는 글리코펩티드 상에서 글리코실 잔기의 비특이성 산화(non-specific oxidation)에 의한 것이있다. 그 산화된 당은 그 펩티드에 PEG성분을 결합하는 부위(locus)로서 유용하다.

예로서, 특허문헌 WO94/05332(M'Timkulu)명세서에서는 PEG를 당 단백질(glycoprotein)에 부가하는 아미노-PEG의 사용에 대하여 기재되어 있다.

여기서 그 글리코실 성분이 그 상응하는 알데히드에 대하여 임의로 산화시킨 다음에 그 아미노-PEG에 결합하였다.

위에서 설명한 각각의 방법에서는 폴리(에틸렌글리콜)이 펩티드 골격상에서 임의로 비특이성 있게 반응성 잔기에 부가하였다.

치료용 펩티드의 제조에 있어서, 특이성 있게 라벨링하고, 용이하게 특성화할 수 있으며, 본질적으로 균일성이 있는 생성물 형성을 얻을 수 있는 하나의 유도체도출설계를 사용하는 것이 바람직하다.

특이성있게 라벨링을 한 펩티드를 제조하는 하나의 바람직한 루트(route)는 수식당 성분을 펩티드 상에 부가하는 글리코실 전이효소 등 효소의 사용에 의한 것이다.

그 수식당 성분(modified sugar moiety)은 그 글리코실 전이효소용 기질로서 기능적 작용을 할 필요가 있으며, 적합하게 활성화 시킬 필요가 있다.

따라서, 활성화한 수식당에 용이하게 접근(acess)할 수 있는 합성루트가 바람직하다.

본 발명은 이와 같은 합성루트를 제공한다.

본 발명은 폴리머종(polymeric species), 당(sugars) 및 이들의 폴리머종에 콘주게이팅(conjugating)한 활성당(activated sugars)과 이들의 폴리머를 포함하는 뉴클레오티드 당을 제공한다.

상기 폴리머 종에는 수용성종과 수불용성 종을 모두 포함한다. 더욱이, 이들의 폴리머는 분기(branched) 또는 직쇄(straight-chain)폴리머이다.

예시적인 당 성분에는 직쇄 및 사이클릭(cyclic)구조와 알도오스 및 케토오스를 포함한다.

폴리머 수식단(polymeric modifying group)은 그 당성분의 어느 위치에서도 결합할 수 있다.

아래의 설명에서, 본 발명은 푸라노오스의 C-5 또는 피라노오스의 C-6에 폴리머 수식단이 결합되는 하나의 예를 참조하여 예시한다.

이 기술분야의 기술자들은 상기 설명의 요지는 설명을 명백하게 하기 위한 것으로 여기서 설명한 방법과 이 기술분야에서 알려진 방법을 사용하여 피라노오스와 푸라노오스의 다른 위치에 그 폴리머 성분을 결합시킬 수 있다는 것을 알 수 있다.

하나의 예에서, 본 발명은 아래에 나타낸 하나의 폴리머에 콘주게이팅을 한 당(sugar) 및/또는 당 뉴클레오티드를 제공한다.

위 식 Ⅰ및 Ⅱ에서,

R¹은 H, CH₂OR⁷, COOR⁷ 또는 OR⁷이며, 여기서 R⁷은 H, 치환 또는 비치환 알킬 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬을 나타낸다.

R²는 H, OH 또는 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 하나의 성분(moiety)이다.

이 예에 의한 하나의 예시적인 R²종은 다음에 나타낸 식을 가진다.

위 식에서, R⁸은 하나의 뉴클레오시드이다.

부호 R³, R⁴, R⁵, R⁶ 및 R^6'는 독립적으로, H, 치환 또는 비치환 알킬, OR⁹, NHC(O)R¹⁰을 나타낸다. 지수 d는 0 또는 1이다.

R⁹ 및R¹⁰은 독립적으로, H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 또는 시알산에서 선택한다.

R³, R⁴, R⁵, R⁶ 또는 R^6' 중 최소 하나는 폴리머 수식성분(molymeric modifying moiety), 즉 PEG를 포함한다.

하나의 예에서, R⁶ 및 R^6' 가 결합된 탄소를 동시에 가진 R⁶ 및 R^6' 는 시알산의 측쇄성분이다.

또 다른 예에서, 이 측쇄는 그 폴리머 수식성분과 기능적 작용을 한다.

하나의 예에서, 그 폴리머 수식성분은 일반적으로 당코어(sugar core) 상에서 헤테로 원자에 의해, 아래에 나타낸 바와 같이 하나의 링커(linker)L에 의해, 그 당코어에 결합되어 있다.

위 식에서 R¹¹은 폴리머 수식 성분이며, L은 하나의 결합과 하나의 결합기(linking group)에서 선택한다.

지수 w는 1-6, 바람직하게는 1-3, 더 바람직하게는 1-2의 정수를 나타낸다.

예로서 나타낸 결합기에는 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬성분 및 시알산을 포함한다.

상기 링커의 하나의 예시적 성분은 아실성분이다.

L이 하나의 결합일 때, 이것은 R¹¹의 전구물질 상에서 하나의 반응성 작용기와 L의 전구물질 상에서 상보적 반응성의 반응성 작용기 사이에서 형성된다.

L은 R¹¹과의 반응전에 사카리드 코어 상에 적합하게 존재할 수 있다.

또, R¹¹과 L은 사전에 형성된 카세트에서 혼합한 다음에 그 사카리드 코어에 결합한다.

여기서 설명한 바와 같이, 적합한 반응성 작용기를 가진 전구 물질의 선택과 제조는 이 기술분야의 기술자의 지식능력 범위 내에 있다.

더욱이, 그 전기 물질의 결합은 이 기술분야에서 충분하게 이해할 수 있는 화학성분에 의해 처리한다.

하나의 예에서, L은 아미노산, 또는 상기 폴리머 수식성분이 치환알킬링커에 의해 결합되는 수식당을 구성하는 크기가 작은 펩티드(즉, 1-4 아미노산 잔기)에서 형성되는 하나의 결합기(linking group)이다.

하나의 예에서 링커는 글리신이다.

하나의 예에서, R⁶에는 폴리머 수식성분을 포함한다.

또 다른 예에서, R⁶에는 상기 폴리머 수식성분과 그 분자의 잔부에 폴리머 수식성분을 결합하는 하나의 링커 L을 모두 포함한다.

하나의 예에서, 그 폴리머 수식성분은 중심성분(central moiety)에 결합된 2개 이상의 폴리머 사슬을 포함하는 하나의 분기구조체(branched structure)이다.

본 발명의 이 예에 의한 유용한 폴리머 수식성분 전구물질의 하나의 예의 구조는 아래에 나타낸 식(Ⅲ)을 가진다.:

위 식(Ⅲ)에 의한 당과 뉴클레오티드당은 순수 수용성 폴리머가 필수적이며 가장 중요한 것이다.

위 식(Ⅲ)에서 X^3'는 하나의 이온화 할 수 있는 작용기(즉, COOH 등)이거나, 기타 반응성 있는 작용기를 포함하는 하나의 성분이고(위에서 인용한 참고문헌 참조), C는 탄소이며, X⁵는 하나의 미반응성기(즉, H, 비치환 알킬, 비치환 헤테로알킬)가 바람직하고, R¹² 및 R¹³은 독립적으로 폴리머 암(polymeric arms), 즉, 비 펩티드(nonpeptidic)의 미반응성 폴리머 암을 선택한다.

X² 및 X⁴는 같거나 다른 생리적 조건 하에서 필수적으로 비반응성인 것이 바람직한 단일 결합 프라그멘트(linkage fragments)이다.

또, 이들의 결합에는 생리관련 상태 하에서 분해하도록 구성된 하나 이상의 성분, 즉, 에스테르, 디술피드 등을 포함할 수 있다.

X² 및 X⁴는 C에 폴리머암 R¹² 및 R¹³을 결합한다.

X^3'가 하나의 링커, 당 또는 링커-당카세트 상에서 반응성이 상보적인 하나의 반응성 작용기와 반응할 때, X^3'는 단일 결합프라그멘트의 하나의 성분 X³로 전환된다.

본 발명은 적합한 당 또는 당링커종(sugar linker species)과 상기 전구물질의 반응에 의해, 다음식 Ⅳ 및 Ⅴ를 가진 당 및 뉴클레오티드 당을 제공한다.

위 식에서, 여러가지의 부호에 의해 나타낸 래디컬의 동정(identity)은 위에서 설명한 것과 동일하며,

L^a는 치환 또는 비치환 알킬 또는 비치환 헤테로알킬 성분이다.

하나의 예에서, L^a는 위에서 나타낸 바와 같이 폴리머 수식성분과 기능적 작용을 하는 시알산의 측쇄성분이다.

상기 폴리머 수식성분은 수용성이거나 또는 필수적으로 수불용성인 2개 이상의 반복단위로 이루어진다.

본 발명의 화합물에서 사용하는 예시할 수 있는 수용성 폴리머에는 PEG, 즉 m-PEG, PPG, 즉 m-PPG, 폴리시알산, 폴리글루타메이트, 폴리아스파레이트, 폴리리신(polylysine), 폴리에틸렌이민, 생분해성 폴리머(즉, 폴리락티드, 폴리글리세리드) 및 기능성화 PEG, 즉 말단-기능성화 PEG를 포함한다.

본 발명의 폴리머 콘주게이트의 당 성분은 천영 및 비천연(unnatural)푸라노오스 및 헥사노오스에서 선택한다.

비천연 사카리드는 알킬화 또는 아실화히드록시 및/또는 아민성분, 즉 링(ring)상에서 에테르, 에스테르 및 아미드 치환기를 선택적으로 포함한다.

다른 비천연 사카리드에는 H, 히드록시, 에테르, 에스테르 또는 아미드 치환기를 상기 하나의 치환기가 천연 사카리드에 존재하지 않는 링(ring)상의 하나의 위치에서 포함한다.

또, 그 카르보히드레이트는 그 명칭이 유도되는 카르보히드레이트 즉, 데옥시당에서 발견되는 하나의 치환기를 상실한다.

또다른 예의 비천연당에는 산화(즉,-온산 및 -우론산)및 환원(당알코올) 카르보히드레이트를 포함한다.

그 당성분에는 모노, 올리고 또는 폴리사카리드가 있다.

본 발명에서 사용하는 예로서 나타낸 천연당에는 글루코오스, 글루코사민, 갈락토오스, 갈락토사민, 푸코오스, 만노오스, 만노사민, 키실로오스, 리보오스, N-아세틸 글루코오스, N-아세틸 글루코사민, N-아세틸갈락토오스, N-아세틸 갈락토사민 및 시알산을 포함한다.

하나의 예로 나타낸 시알산 기재 콘주게이트는 다음식을 가진다:

위 식에서, AA는 카르복실성분을 포함하지 않은 아미노산 잔기의 부분이고, NP는 뉴클레오티드 포스페이트이다. ONP는 또 활성성분에 의해 치환시켜 활성화당을 형성할 수 있다.

이 분야의 기술자에 의해 알 수 있는 바와 같이, 폴리머 수식성분-링커는 또 C-6, C-7 및/또는 C-9에서 시알산 측쇄에 결합시킬 수 있다.

또, 본 발명은 효소, 즉 글리코실 전이효소의 적합한 기질인 활성화 시알산-PEG 콘주게이트를 제조하는 합성방법을 제공한다.

그 방법에서는

(a) 만노사민과 N-보호아미노산 사이에서 아미드 콘주게이트를 형성하는데 적합한 조건 하에서 만노사민과 활성화 N-보호아미노산(또는 폴리머 수식성분, 링커 전구물질 또는 링커-폴리머 수식성분 카세트와 기능적 작용을 하는 아미노산)을 접촉하는 스텝(step)과,

(b) 아미드 콘주게이트를 시알산 아미드 콘주게이트로 전환하는데 적합한 조건 하에서 그 아미드 콘주게이트를 피루페이트 및 시알산 알돌라아제와 접촉하는 스텝(step)과,

(c) 시티딘 모노 포스페이트 시알산 아미드 콘주게이트를 형성하는데 적합한 조건 하에서 그 시알산 아미드 콘주게이트를 시티딘 트리포스페이트 및 신테타아제(sythetase)와 접촉하는 스텝(step)과,

(d) 상기 N-보호기를 시티딘 모노포스페이트 시알산 아미드 콘주게이트에서 이탈시킴으로써 유리아민을 생성하는 스텝(step)과,

(e) 그 유리아민을 활성화 PEG(직쇄 또는 분기)와 접촉함으로써 시티딘 모노포스페이트 시알산-폴리(에틸렌 글리콜)을 형성하는 스텝(step)을 포함한다.

그 뉴클레오시드는 천연 및 비천연 뉴클레오시드에서 선택할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 예시할 수 있는 천연 뉴클레오시드에는 시토신, 티민, 구아닌, 아데닌 및 우라실을 포함한다.

이 기술에는 비천연 뉴클레오시드의 구조체와 그 구조체의 제조방법을 충족한다.

본 발명에서 예시할 수 있는 수식당 뉴클레오티드에는 폴리머 수식 GDP-Man, GDP-Fuc, UDP-Gal, UDP-GalNAc, UDP-Glc, UDP-GlcUA 및 CMP-SA 등을 포함한다.

실시 예에는 UDP-Gal-2'-NH-PEG, UDP-Glc-2'-NH-PEG, CMP-5'-PEG-SA 등을 포함한다.

본 발명에 의해 포함된 화합물에는 푸라노오스 또는 피라노오스에, 즉 하나의 푸라노오스의 C-5 또는 하나의 피라노오스의 C-6에서 일반적으로 이 탄소원자에 결합된 하나의 헤테로 원자에 의해 L-R¹¹성분이 콘주게이팅을 하는 화합물을 포함한다.

본 발명의 화합물이 하나의 뉴클레오티드당 또는 활성화 당인 경우, 그 뉴클레오티드 당의 폴리머 콘주게이트는 일반적으로 하나의 기질의 적합한 수용체 성분 상에서 당성분과 그 폴리머 치환기를 전이하는 하나의 효소용 기질이다.

따라서, 또 본 발명은 뉴클레오티드 당, 또는 활성화당과 적합한 효소의 폴리머 콘주게이트를 사용하여 글리코콘주게이션(glycoconjugation)에 의해 수식한 기질을 제공한다.

본 발명의 화합물을 사용하여 콘주게이팅을 할 수 있는 기질에는 펩티드, 즉 글리코 펩티드, 펩티드, 리피드, 즉 글리코리피드 및 아글리콘(aglycones)(스핀고신, 세라미드)을 포함한다.

도 1은 선택한 수식 시알산 뉴클레오티드와 활성화당이 기질인 시알전이효소에 대한 표(table)를 나타낸다.

도 2는 시알산-폴리(에틸렌 글리콜)콘주게이트를 제조하는 본 발명의 일반적인 합성 메카니즘을 나타낸다.

도 3은 시알산-글리실-폴리(에틸렌글리콜) 콘주게이트를 제조하는 본 발명의 합성 메카니즘을 나타낸다.

아래에서 본 발명과 실시 예를 구체적으로 설명한다.

약어

분기 및 무분기(unbranched) PEG는 폴리(에틸렌글리콜)을 나타낸다.

즉, m-PEG는 메톡시-폴리(에틸렌글리콜)을 나타낸다.

분기 및 무분기 PPG는 폴리(프로필렌 글리콜)을 나타낸다. 즉, m-PPG는 메톡시-폴리(프로필렌 글리콜)을 나타낸다.

Fuc는 푸코실(fucosyl)을 나타내며, Gal은 갈락토실(galactosyl)을 나타내고; GlcNAc는 N-아세틸 갈락토사미닐을 나타내며, Glc는 글루코실을 나타내고; GlcNAc는 N-아세틸글루코사미닐을 나타내고; Man은 만노실을 나타내며; ManAc는 만노사미닐 아세테이트를 나타내고; Sia는 시알산을 나타내며; NeuAc는 N-아세틸 뉴라미닐을 나타낸다.

정의

용어, "시알산"은 9-탄소카르복실화당의 패밀리(family)의 어느 멤버를 말한다.

그 시알산 패밀리의 가장 공통적인 멤버에는 N-아세틸-뉴라민산(2-케토-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토노눌로피라노스-1-온산(종종 Neu5Ac, NeuAc 또는 NANA로 약해 기재함)이 있다.

상기 패밀리의 제 2멤버에는 N-글리코실 뉴라민산(Neu5Gc 또는 NeuGc)이 있으며, 여기서 NeuAc의 N-아세틸기가 히드록실화 한다.

제3 시알산 패밀리 멤버에는 2-케토-3-데옥시-노눌로손산(KDN)이 있다(Nadano 등,(1986)J. Biol. Chem.261: 11550-11557; Kanamori 등, J. Biol. Chem. 265: 21811-21819(1990)참조).

또, 9-치환시알산에는 9-0-락틸-Neu5Ac 또는 9-0-아세틸-Neu5Ac, 9-데옥시-9-플루오로-Neu5Ac 및 9-아지도-9-데옥시-Neu5Ac와 같은 9-O-C₁-C₆ 아실-Neu5Ac 등을 포함한다.

상기 시알산 패밀리의 참고문헌으로 다음 문헌을 참조할 수 있다:

Varki, Glycobiology 2: 25-40(1992);

Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R.Schauer, Ed.(Spring-Verlag, New York(1992).

시알릴화 처리공정에서 시알산 화합물의 합성 및 사용에 대해서는 특허문헌 WO92/16640(1992. 10. 1 공개)명세서에 개시되었다.

여기서 사용되는 용어 "수식당"(modified sugar)는 본 발명의 프로세스에서 펩티드의 글리코실 잔기 또는 아미노산에 효소에 의해 부가되는 천연산 또는 비천연산 카르보히드레이트를 말한다.

그 수식당은 당 뉴클레오티드(모노, 디 및 트리 포스페이트), 활성화당(즉, 글리코실 할라이드, 글리코실 메실레이트)및 활성화되어 있지 않으며 뉴클레오티가 아닌 당(sugars)을 포함하나 한정되지 않은 다수의 효소기질에서 선택한다.

그 "수식당"은 하나의 "수식단"(modifying group)과 공유결합에 의해 기능적 작용을 한다.

유용한 수식단에는 수용성 폴리머, 치료성분, 진단성분, 생체분자(biomolecules) 등을 포함하나 한정된 것은 아니다.

그 수식단은 천연산 또는 비수식 카르보히드레이트가 바람직하지 않다.

그 수식단과의 기능적 작용을 하는 부위를 선택하여 그 수식당이 펩티드에 효소에 의해 부가되도록 한다.

용어 "수용성"(water-soluble)은 수중에서 검출할 수 있는 용해도의 정도를 가진 성분을 말한다.

수 용해도를 검출 및/또는 정량화하는 방법은 이 기술 분야에서 공지되어 있 다. 예시할 수 있는 수용성 폴리머에는 펩티드, 사카리드, 폴리(에테르), 폴리(아민), 폴리(카르복실산)등을 포함한다.

펩티드는 혼합서열을 가지며, 또 단일 아미노산, 즉 폴리(시린)으로 이루어진다.

하나의 예시적인 폴리사카리드에는 폴리(시알산)이 있다.

하나의 예시적인 폴리(에테르)에는 폴리(에틸렌 글리콜), 즉 m-PEG가 있다.

폴리(에틸렌이민)에는 하나의 예시적인 폴리아민이 있으며, 폴리(아크릴)산에는 하나의 대표적인 폴리(카르복실산)이 있다.

예시적인 폴리머는 일반적으로 2-8개의 폴리머 단위로 이루어진다.

그 수용성 폴리머의 폴리머 골격에는 폴리(에틸렌글리콜)(즉, PEG)이 있다.

그러나, 다른 관련 폴리머도 본 발명의 실시에서 사용에 적합하며, 그 용어 PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)를 사용하도록 하는데 이 기술 분야에서 포함하며, 제외한 것은 아니다.

그 용어 PEG에는 알콕시 PEG, 기능성 PEG, 멀티암(multiarmed)PEG, 포오크형상(forked)PEG, 분기 PEG, 현수(pendent)PEG(즉, 그 폴리머 골격에 현수된 1개 이상의 작용기를 가진 PEG 또는 관련 폴리머) 또는 분해할 수 있는 결합을 가진 PEG를 포함하여, 어느 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다.

그 폴리머 골격은 선상(linear) 또는 분기상(branched)으로 할 수 있다. 분기상 폴리머 골격은 일반적으로 이 기술 분야에서 공지되었다. 일반적으로, 하나의 분기상 폴리머는 하나의 중심분기 코어성분과 그 중심분기 코어 성분에 결합된 다 수의 선상 폴리머 사슬을 가진다.

PEG는 글리세롤, 펜타에리트리톨 및 소르비톨 등 여러가지의 폴리올에 에틸렌 옥사이드를 부가시켜 제조할 수 있는 분기형상으로 하여 공통적으로 사용된다.

또, 그 중심 분기성분은 수개의 아미노산, 즉 리신(lysine)등의 아미노산에서 유도할 수도 있다.

그 분기 폴리(에틸렌 글리콜)은 R(-PEG-OH)_m에서와 같이 일반식으로 나타낼 수 있다(이식에서, R은 글리세롤 또는 펜타에리트리톨 등 코어성분을 나타내며, m은 암(arm)의 수를 나타낸다).

여기서 참고로 편집한 특허문헌 USP 5,932,462 명세서에서 기술한 것과 같은 PEG 분자 등 멀티암(multi-armed)PEG 분자는 또 폴리머 골격으로 사용할 수 있다.

또, 다수의 다른 폴리머도 이 발명에 적합하다. 수용성이며, 2~약 300개의 말단을 가진 비펩티드(non-peptide)인 폴리머 골격은 특히 이 발명에서 유용하다.

적합한 폴리머의 예에는 폴리(프로필렌글리콜)("PPG")등 다른 폴리(알킬렌글리콜), 에틸렌글리콜과 프로필렌글리콜 등의 코폴리머, 폴리(옥시에틸화폴리올), 폴리(올레핀알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시 프로필메타아크릴 아미드), 폴리(α-히드록시산), 폴리(비닐알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린)(여기서 참고로 편집한 특허문헌 USP5,629,384 명세서에서 기재된 것과 같음), 이들 화합물의 코폴리머, 테르폴리머(terpolymer) 및 그 혼합물을 포함하나, 한정되어있는 것은 아니다.

상기 폴리머 골격의 각각의 사슬의 분자량이 변동할 수 있으나, 그 분자량은 일반적으로 약 100Da~약 100,000Da의 범위이며, 주로 약 6,000Da~약 80,000Da의 범위이다.

여기서 사용되는 용어 "글루코콘주게이션"(glycoconjugation)은 폴리펩티드의 아미노산 또는 글리코실 잔기, 즉 본 발명의 변이체 인간성장 호르몬에 수식당 종(modified sugar species)을 효소에 의해 결합한 콘주게이션을 말한다.

"글리코콘쥬게이션"의 아속(subgenus)은 "글리콜-PEG화"(glycol-PEGylation)이며, 여기서 그 수식당의 수식단(modigying group)에는 폴리(에틸렌 글리콜)과, 그의 알킬유도체(즉, m-PEG) 또는 반응성 유도체(즉, H₂N-PEG, HOOC-PEG)가 있다.

여기서 사용하는 용어 "글리코실 결합기"(glycosyl linking group)는 하나의 수식단(modifying group)(즉, PEG 성분, 치료체성분, 생체분자)을 공유결합시키는 글리코실잔기를 말한다. 그 글리코실 결합기는 그 수식단을 그 콘주게이트의 잔부에 결합한다.

본 발명의 방법에서, 그 "글리코실 결합기"는 글리코실화 또는 비글리코실화 펩티드에 공유결합시킴으로써, 그 펩티드 상에서 아미노산 및/또는 글리코실 잔기에 그 약제(또는 작용물질:agent)를 결합한다.

"글리코실 결합기"는 그 펩티드의 아미노산 및/또는 글리코실잔기에 "수식당"을 효소에 의해 결합을 함으로써 "수식당"에서 일반적으로 유도한다.

그 글리코실 결합기는 수식단-수식당 카세트를 형성할 때(즉, 산화→시프염 기형성→환원)분해되는 사카리드 유도구조체이거나 또는 그 글리코실 결합기는 무손상상태(intact)로 할 수 있다.

"무손상글리코실 결합기"는 사카리드 모노머가 수식단을 결합하며 그 콘주게이트의 잔부가 소듐메타퍼아이오데이트에 의해 분해, 즉 산화되지 않는 글리코실 성분에서 유도되는 하나의 결합기를 말한다.

본 발명의 "무손상 글리코실 결합기"는 모(parent) 사카리드 구조에서 1개 이상의 글리코실 단위의 제거 또는 글리코실 단위의 부가에 의해 천연산 올리고 사카리드로부터 유도할 수 있다.

치환기를 좌측에서 우측으로 기재한 통상의 화학식에 의해 특정할 때, 이들의 치환기는 그 구조체를 우측에서 좌측으로 기재한 동일한 치환기를 포함한다. 즉, -CH₂O-는 또 -OCH₂-로 열거하도록 한다.

용어 "알킬"(alkyl)은 그 자체 또는 또 다른 치환기의 일부로서, 특별한 설명이 없으면, 직쇄 또는 분기사슬이거나 또는 환산(cyclic)의 탄화수소 래디컬 또는 이들의 조합을 말하며, 그 알킬기는 완전포화시킬 수 있고, 모노 또는 폴리 불포화시킬 수 있으며, 지정한(designated) 탄소원소의 수를 가진 2가 및 다가래디컬을 포함할 수 있다(즉, C₁-C₁₀은 탄소원자 1개 내지 10개를 의미한다).

포화탄화수소래디컬의 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필 메틸, 예로서 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등의 동족체 및 이성체를 포함하나, 한정 된 것은 아니다.

하나의 불포화 알킬기는 1개 이상의 2중 결합 또는 3중 결합을 가진 기(group)이다. 불포화 알킬기의 예에는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜틸, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1-및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고차 동족체 및 이성체를 포함하며, 한정된 것은 아니다.

그 용어 "알킬"은 또, 특별한 설명이 없는 경우 "헤테로알킬"등 아래에서 구체적으로 정의한 알킬의 유도체를 포함한 것을 의미한다.

탄화수소기로 한정된 알킬기를 "호모알킬"(homoalkyl)로 칭한다.

용어 "알킬렌"은 그 자체 또는 또 다른 치환기의 일부로서, -CH₂CH₂CH₂CH₂-로 예시되나 한정되지 않은 알칸에서 유도된 2가 래디컬을 의마하며, 또 "헤테로알킬렌"에서와 같이 아래에서 설명한 이들의 기를 포함한다.

일반적으로, 알킬기(또는 알킬렌기)는 탄소원소 1-24개를 가지며, 이 발명에서는 10개 또는 이보다 더 작은 수의 탄소원자를 가진 이들의 기가 바람직하다.

"저급알킬" 또는 "저급알킬렌"은 일반적으로 8개 또는 이보다 더 작은 수의 탄소원자를 가진 사슬이 더 짧은 알킬 또는 알킬렌기이다.

용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오"(또는 티오알콕시)는 통상의 의미로 사용되며, 그 분자의 잔부에 산소원자, 아미노기 또는 황원자 각각에 결합된 알킬기를 말한다.

용어 "헤테로알킬"(hetero alkyl)은 그 자체 또는 또 다른 용어아 결합하여, 특별한 설명이 없는 경우, 상기 설명한 개수의 탄소원자와, O, N, Si 및 S로이루어진 그룹에서 선택한 최소 하나의 헤테로 원자로서, 질소와 황원자는 선택적으로 산화시킬 수 있고 질소헤테로 원자는 선택적으로 사분화시킬 수 있는 헤테로 원자로 이루어진 안정성 있는 직쇄 또는 분기쇄(branched chain) 또는 시클릭(cyclic)탄화수소 래디컬 또는 그 조합을 의미한다.

그 헤테로 원자 O, N 및 S 및 Si는 그 헤테로알킬기의 어느 내부 위치에 또는 그 분자의 잔부에 알킬기가 결합된 위치에 지정할 수 있다. 예로는 CH_{2 -}CH₂-O-CH₃, -CH₂-CH₂-NH-CH₃, -CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃, -CH₂-S-CH₂-CH₃, -CH_{2 -}CH₂, -S(O)-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃, -CH=CH-O-CH₃, -Si-(CH₃)₃, -CH₂-CH=N-OCH₃, -CH=CH-N(CH₃)-CH₃ 가 있다.

2종까지의 헤테로 원자는 예로서 -CH₂-NH-OCH₃ 및 -CH₂-O-Si(CH₃)₃ 등 연속적으로 위치시킬 수 있다.

동일하게, 용어 "헤테로알킬렌"은 그 자체 또는 또다른 치환기의 일부로서, -CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-와, -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-의 예로 나타내나 한정된 것이 아닌 헤테로알킬에서 유도된 2가 래디컬을 의미한다.

헤테로알킬렌기에 있어서, 헤테로 원자는 또 그 사슬단부 중 양단부 또는 어느 일단부에 가질 수 있다(즉, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 등).

더 나아가서, 알킬렌과 헤테로알킬렌 결합기에 있어서, 그 결합기의 배향이 그 결합기의 식을 기재하는 방향을 의미하는 것은 아니다. 예로서, 식-C(O)₂R'-는 -C(O)₂R'-와 -R'C(O)₂-모두를 나타낸다.

용어 "시클로알킬" 및 헤테로시클로알킬"은 그 자체 또는 다른 용어와 결합하여, 다른 특별한 설명이 없는 경우, "알킬"과 "헤테로알킬"각각의 시클릭(cyclic)화 한 것을 나타낸다.

또, 헤테로시클로알킬에 있어서, 분자의 단부에 헤테로시클이 결합된 위치에 하나의 헤테로원자가 점유할 수 있다.

시클로알킬의 예에는 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥실, 3-시클로헥실, 시클로헵틸 등을 포함하나 한정된 것은 아니다.

헤테로시클로알킬의 예에는 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-포르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.

용어 "할로"(halo) 또는 "할로겐(halogen)은 이들 자체 또는 또다른 치환기의 일부로서, 특별한 설명이 없는 경우, 플루오린, 클로린, 브로민 또는 요오드 원자를 의미한다. 또, "할로알킬"(haloalkyl)등의 용어는 모노할로알킬과 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예로서, 용어 "할로(C₁-C₄)알킬"은 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등을 포함한 것을 의 미하나, 한정된 것은 아니다.

용어 "아릴"(aryl)은 특별한 설명이 없는 경우, 동시에 축합하거나 공유결합하는 단링(single ring) 또는 다링(multiple rings)(바람직하게는 1~3개의 링임)으로 할 수 있는 폴리불포화 방향족 치환기를 의미한다.

그 용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S에서 선택되는 1~4개의 헤테로 원자를 포함하며, 여기서 N과 S원자는 선택적으로 산화되고, N원자는 선택적으로 사분화되는 헤테로 원자를 포함하는 아릴기(또는 링)을 말한다.

하나의 헤테로아릴기는 분자의 잔부에 하나의 헤테로원자에 의해 결합할 수 있다.

아릴 및 헤테로 아릴기의 비한정 예에는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤린, 3-파라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이소옥사졸릴, 4-이소옥사졸릴, 5-이소옥사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 테트라졸릴, 벤조[b]푸라닐, 벤조[b]티에닐, 2,3-디히드로벤조[1,4]디옥신-6-일, 벤조[1,3]디옥솔-5-일 및 6-퀴놀릴을 포함한다.

상기 기재한 아릴 및 헤테로 아릴 링 시스템 각각의 치환기는 아래에서 설명한 허용할 수 있는 치환기의 그룹에서 선택한다.

요약하여 설명하면, 상기 "아릴""은 다른 용어와 결합하여 사용할 때(즉, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬)위에서 정의한 바와 같이 아릴 및 헤테로아릴링 모두를 포함한다.

따라서, 용어 "아릴알킬"은 하나의 탄소원자(즉, 메틸렌기)를 예로서 산소원자에 의해 치환시킨 알킬기(즉, 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등)을 포함하며, 하나의 아릴기가 하나의 알킬기에 결합된 래디컬(즉, 벤질, 펜에틸, 피리디메틸 등)을 포함하는 것을 의미한다.

상기 용어 각각(즉, "알킬", "헤테로알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴")은 상기 표시 래디컬의 치환 및 비치환 형태 모두를 포함하는 것을 의미한다.

각 타입의 래디컬의 바람직한 치환기는 아래에 나타낸다.

상기 알킬 및 헤테로알킬 래디컬의 치환기(알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐 및 헤테로시클로알케닐로 자주 칭하는 이들의 기 포함)는 일반적으로 "알킬기 치환기"라 하며, 이들의 치환기는 -OR', =O, =NR', =N-OR'. -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR' R"R'", -OC(O)R'. -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR' -C(O)NR"R"', -NR"C(O)₂R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"', -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -NRSO₂R', -CN 및 -NO₂에서 선택하나, 한정되지 않은 다수기(group) 중 하나이상이다. 래리컬의 탄소원자수는 0(zero)~(2m'+1)의 범위에 걸쳐있는 수이고, m'는 상기 래디컬에서 탄소원자의 총수를 나타낸다.

R', R", R"' 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 즉 1-3내의 할로겐으로 치환시킨 아릴, 치환 또는 비치환 알킬, 즉 1~3개의 할로겐으로 치환시킨 아릴, 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기 또는 아릴알킬기인 것이 바람직하다.

본 발명의 하나의 화합물이 하나 이상의 R기를 포함할 경우, 예로서, 각각의 상기 R기를 포함할 경우, 예로서, 각각의 상기 R기는 독립적으로 이들기의 하나 이상이 존재할 경우 각각의 R', R", R"' 및 R""기에서와 같이 선택한다.

R'와 R"가 동일한 질소원자에 결합될 경우, 이들이 질소원자와 결합하여 5-, 6- 또는 7-멤버링을 형성한다. 예로서, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하는 것을 의미하나, 그 범위가 한정되어 있는 것은 아니다.

상기 치환기의 설명에서, 이 분야의 기술자는 용어 "알킬"이 할로알킬(즉, -CF₃ 및 -CH₂CF₃)과 아실(즉, -C(O)CH₃,-C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등)등 수소기이외 기에 결합한 탄소원자를 포함하는 기를 포함하는 것을 의미함을 알 수 있다.

상기 알킬래디컬에 대하여 설명한 치환기와 동일하여, 상기 아릴 및 헤테로 아릴기의 치환기는 일반적으로 "알릴기 치환기"라 한다.

그 치환기(그 방향족링 시스템 상에서 개방원자가 0(zero)~총수에 걸친 수임)는 예로서, 할로겐, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)₂R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -NRSO₂R', -CN 및 -NO₂, -R', -N₃, -CH(Ph)₂, 플루오로(C₁-C₄)알콕시 및 플루오로(C₁-C₄)알킬로부터 선택한다.

R', R", R"' 및 R'"'은 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로아릴에서 독립적으로 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 하나의 화합물이 하나 이상의 R기를 포함할 경우, 예로서, 각각의 그 R기는 이들 기 중 하나 이상이 존재할 때 각각의 R', R", R'" 및 R"''에서와 같이 독립적으로 선택한다. 다음의 제조공정(schemes)에서, 부호 X는 위에서 설명한 바와 같이 "R"를 나타낸다.

아릴 또는 헤테로 아릴링의 인접원자 상에서의 2개 치환기는 식 -T-C(O)-(CRR')_q-U-의 치환기로 치환시킬 수 있다(여기서, T및 U는 독립적으로 -NR-, -O-, -CRR'- 또는 단일결합이며, q는 0~3의 정수이다.)

또, 아릴 도는 헤테로아릴링의 인접원자 상에서 2개의 치환기는 식 -A-(CH₂)_r-B-의 하나의 치환기로 선택치환 할 수 있다(여기서, A 및 B는 독립적으로 -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)₂-, -S(O)₂NR'-또는 단일 결합이며, r은 1~4의 정수이다.

이와 같이 형성된 새로운 링의 단일결합 중 하나는 하나의 2중 결합으로 선택치환할 수 있다.

또, 아릴 또는 헤테로아릴링의 인접원자 상에서 2개의 치환기는 식-(CRR')_s-X-(CR"R"')_d-의 치환기로 선택치환 할 수 있다(여기서, s,d는 독립적으로 0~3의 정수이고, X는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂- 또는 -S(O)₂NR'-이다.

상기 치환기 R, R', R" 및 R"'는 수소 또는 치환 또는 비치환(C₁-C₆)알킬에서 독립적으로 선택하는 것이 바람직하다.

여기서 사용되는 바와 같이 용어 "헤테로 원자"는 산소(O), 질소(N), 황(S) 및 실리콘(si)을 포함하는 것을 의미한다.

하나 이상의 펩티드 성분을 링커에 결합하는 PEG(또는 다른 링커)의 반응성 유도체의 사용은 본 발명의 범위 내에 있다.

본 발명은 반응성 PEG 동족체의 동정에 의해 한정되어 있는 것은 아니다.

폴리(에틸렌 글리콜)의 다수의 활성화 유도체는 상품으로 시중에서 입수할 수 있고, 기술 문헌에서 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용한 하나의 기질을 제조하는 적합한 활성화 PEG 유도체를 필요할 경우 선택하여 합성하는 것은 이 기술분야의 기술자의 능력범위에 있다.

참고문헌으로 다음 문헌을 참조할 수 있다:

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다른 결합기에는 아미노기와 활성화 PEG 사이에 우레탄 결합을 포함한다.

참고문헌으로 다음문헌을 참고할 수 있다.

Veronese 등, Appln. Biochem. Biotechnol., 11: 141-152(1985)

용어 "아미노산"은 천연산 및 합성 아미노산과 아미노산 동족체 및 아미노산 유사체를 말한다.

천연산 아미노산은 유전암호에 의해 엔코딩한 아미노산과 후수식한 아미노산, 즉 히드록시 프롤린, r-카르복시 글루타메이트 및 O-포스포세린이 있다.

아미노산 동족체는 하나의 천연산 아미노산과 동일한 기본적인 화학구조, 즉 하나의 수소에 결합한 하나의 α탄소, 하나의 카르복실기, 하나의 아미노기 및 하나의 R기를 가진 화합물, 즉 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸술포늄을 말한다.

이와 같은 동족체는 수식된 R기(즉, 노르류신)또는 수식된 펩티드 골격을 가지나, 천연산 아미노산과 동일한 기본적인 화학구조를 가진다.

"아미노산 유사체"는 아미노산의 일반적인 화학구조와 다르나, 천연산 아미노산과 동일하게 기능적 작용을 하는 하나의 구조를 가진 화학적 화합물을 말한다.

"펩티드"(peptide)는 모노머가 아미노산, 아미노산 동족체 및/또는 아미노산 유사체이며, 아미드 결합에 의해 동시에 결합되는 폴리머를 말하며, 또 폴리펩티드라고도 한다. 추가하여, 비천연 아미노산, 예로서 β-알라닌, 페닐글리신 및 호모아르기닌도 포함한다.

또, 본 발명에서는 유전 암호화하지 않은 아미노산도 사용할 수 있다.

더 나아가서, 반응성기, 글리코실화 부위, 폴리머, 치료성분, 생체분자 등을 포함하여 수식하는 아미노산도 본 발명에서 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 아미노산 모두는 D-또는 L-이성체로 할 수 있다. 상기 L-이성체가 일반적으로 바람직하다.

또, 다른 펩티드 유사체도 본 발명에서 유용하다. 여기서 사용한 바와 같이 "펩티드"는 글리코실화 및 비글리코실화 펩티드를 말한다. 또, 상기 펩티드를 발현하는 시스템에 의해 불완전하게 글리코실화된 펩티드를 포함한다.

일반적인 기술문헌으로 다음 문헌을 참조할 수 있다:

Spatola, A. F, in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, P. 267(1983).

용어 "뉴클레오시드"(nucleoside)는 핵산의 성분이며, β-D-리보프라노오스에 결합하여 리보 뉴클레오시드를 형성하거나, 또는 2- 데옥시-β-D-리보푸라노오스에 결합하여 디옥시리보 뉴클레오시드를 형성하는 질소성 기재(nitrogenous base)로 이루어진 글리코실아민을 말한다.

상기 질소성 기재에는 푸린, 즉 아데닌 또는 구아노신, 또는 피리미딘, 즉 티미딘, 시티딘, 우리딘 또는 슈도우리딘이 있다.

또, 뉴클레오시드에는 미생물에 의해 사용되는 특정의 뉴클레오시드를 포함한다.

여기서 사용되는 용어 "표적설정성분(targeting moiety)은 신체(body)의 특정조직 또는 부위에 선택적으로 위치설정하는 종(species)을 말한다.

그 국소화(localization)는 분자 결정인자, 분자크기의 표적설정제 또는 콘주게이트(conjugate), 이온 상호작용, 소수성 상호작용 등에 대한 특정인식에 의해 조정(mediation)된다.

하나의 특정조직 또는 부위에 하나의 작용물질(agent)로 표적설정하는 다른 메카니즘은 이 분야의 통상의 기술자에 의해 공지되었다.

예시할 수 있는 표적설정 성분(targeting moiety)에는 항체, 항체프라그멘트, 트랜스페린(transferin), HS-당단백질, 응고인자, 혈청단백질, β-당 단백질, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO등을 포함한다.

여기서 사용되는 "치료성분"(therapeutic moiety)은 치료에 유용한 어느 작용 물질을 말하며, 항생물질, 항염증제, 항암약, 세포독성물질 및 방사성제를 포함한다.

"치료성분"에는 생체 활성제의 전구약물(prodrugs)를 포함하며, 1종 이상의 치료성분이 캐리어(carrier), 즉 다가작용물질(multivalent agent)에 결합하는 구성물을 포함한다.

또 치료성분에는 단백질과 단백질 함유구성물을 포함한다.

예시할 수 있는 단백질에는 에리트로포이에틴(EPO), 과립구콜로니자극인자(GCSF), 과립구마크로파아지 콜로니 자극인자(GMCSF), 인터페론(즉, 인터페론 -α,-β,-τ), 인터류킨(즉, 인터류킨Ⅱ), 혈청단백질(즉, 인자 Ⅶ,Ⅶa,Ⅷ,Ⅸ 및 Ⅹ), 사람태반 융모성 생성 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin)(HCG), 난포자극호르몬(Follicle Stimulating Hormone)(FSH) 및 황체형성호르몬(lutenizing Hormone)(LH), 항체융합단백질(즉, 종양괴사인자수용체(TNFR)/FC 영역융합 단백질)을 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.

여기서 사용되는 "항암약"은 암과 투쟁하는데 유용한 어느 작용물질을 말하 며, 세포독성물질과, 항대사물질, 알킬레이팅제, 안트라시클린, 항생물질, 항분열성제(antimitotic agents), 프로카르바진, 히드록시우레아, 아스파라기나아제, 코르티코스테로이드, 인터페론 및 방사성제 등의 작용물질을 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.

또, 항암 활성을 가진 펩티드의 콘주게이트(conjugates), 즉, TNF-α는 용어 "항암약"의 범위 내에 포함된다.

콘주게이트에는 본 발명의 치료단백질과 당 단백질 사이에 형성된 콘주게이트를 포함하나, 한정되어있는 것은 아니다. 하나의 대표적인 콘주게이트는 PSGL-1과 TNF-α사이에 형성된 콘주게이트이다.

여기서 사용되는 "세포독소"(cytotoxin) 또는 "세포독성 작용물질"(cytotoxic agent)은 세포에 유해한 어느 작용물질(agent)을 말한다.

예로는 탁솔(taxol), 시토칼라신(cytochalasin)B, 그라미시딘(gramicidin)D, 에티듐 브로미드, 에미틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드, 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신(colchicin), 독소루비신, 다우모루비신, 디히드록시안트라신디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-디히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 푸로마이신 및 그 동족체 또는 상동체를 포함한다.

다른 독고(toxins)에는 예로서 리신(ricin), CC-1065 및 그 동족체, 두오카르마이신(duocarmycins)을 포함한다. 또 다른 독소에는 디프테리아 독소 및 뱀독(snake venom)(즉, 코브라 독)을 포함한다.

여기서 사용되는 "방사성제"(radioactive agent)에는 종양을 진단 또는 파괴하는데 효과적인 어느 방사성 동위원소를 포함한다. 예에는 인듐-111와 코발트-60을 포함하나, 한정된 것은 아니다.

또, 방사성제의 적합한 예에는 방사성 동위원소의 혼합물을 일반적으로 나타내는 우라늄, 리듐 및 토륨 등 천연산 방사성 원소가 있다.

그 금속이온은 유기 킬레이팅(chelating)성분과 일반적으로 킬레이팅을 한다.

다수의 유용한 킬레이팅 그룹, 크라운 에테르(crown ethers), 크랩탠드(cryptands) 등은 이 기술에서 공지되어 있고, 본 발명의 화합물에 결합할 수 있다(즉, EDTA, DTPA, DOTA, NTA, HDTA 등과, DTPP, EDTP, HDTP, NTP 등 이들의 포스포네이트 동족체).

참고 문헌의 예로서, 다음의 인용문헌을 참조할 수 있다:

Pitt 등, " The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron overload," in Inorganic Chemistry in Biology and medicine, Martell, Ed;

American Chemical Society, Washington, D.C. 1980, pp. 279-312;

Lindoy, The Chemistry of Macrocyclic Ligand Complexes; Cambride University Press, Cambridge, 1989;

Dugas, Bioorganic Chemistry; Springer -Verlag, New York. 1989, 및 여기서 포함되어 있는 참고문헌.

또, 다른 분자에 킬레이팅제, 크라운 에테르 및 시클로덱스트린의 결합을 하 도록 하는 여러가지의 루트(routes)는 이 분야의 기술자에 의해 이용할 수 있다.

참고기술 문헌의 예로서 다음 예시문헌을 참조할 수 있다:

Meares 등, "Properties of In Vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides", In, "Modification of Proteins: Food, Nutritional, and Parmacological Aspect"; Feeney 등, Eds., American Chemical Society, Washington, D.C., 1982, pp.370-387; Kasina 등, Bioconjugate Chem. 9: 108-117(1998); Song 등, Bioconjugate Chem., 8: 249-255(1997).

본 발명의 구성을 아래에서 구체적으로 설명한다.

본 발명은 폴리머 종(polymeric species)과, 당, 활성화당 및 이들의 폴리머에 콘주게이팅(conjugating)을 한 뉴클레오티드 당으로 제공한다.

상기 뉴클레티드 당의 폴리머 콘주게이트는 일반적으로 기질(substrate)의 적합한 수용체 성분상에서 상기 당 성분과 그 폴리머 치환기를 전이하는 효소의 기질이다.

따라서, 본 발명은 또 뉴클레오티드 당과 적합한 효소의 폴리머 콘주게이트를 사용하여 글리코콘주게이션(glycoconjugation)에 의해 수식한 기질을 제공한다.

본 발명의 화합물을 사용하여 글리코콘주게이팅을 할 수 있는 기질에는 펩티드, 즉 글리코펩티드, 리피드, 즉 글리코리피드와 아글리콘(스핀고신, 세라미드)을 포함한다.

앞에서 설명한 바와 같이, 공유결합하는 PEG화의 공지된 화학적 방법은 아미노산 또는 카르보히드레이트 상에서 반응성기에 의한 화학적인 콘주게이 션(chemical conjugation)에 따라 의존된다.

유용한 콘주게이트는 그 콘주게이트와 반응조건에 대한 설계구성에 의해, 화학적으로 조정되는 콘주게이션 설계를 사용하여 제조하였다.

단백질 또는 당 단백질에 폴리머의 화학적인 콘주게이션에 대한 주요한 결점은 활성화 폴리머의 선택성(selectivity)결여에 있다. 여기서 단백질 또는 당 단백질의 생체 활성을 포함한 부위에서 폴리머가 결합하는 경우가 자주 있었다.

부위 선택성 콘주게이션의 화학적 특성에 대하여 역점을 두고 처리하는 수종의 설계기술 구성이 개발되었으나, 다양한 여러가지의 재조합 단백질에 적합한 하나의 일반적인 방법만이 개발되었다.

종래에 공지된 방법에 비하여, 본 발명은 수용성 분기폴리머의 선택성이 높고 부위 지향성인 글리코콘주게이션, 글리코-PEG화(glyco-PEGylation)에 대한 새로운 설계전략에 유용한 화합물을 제공한다.

본 발명의 하나의 예에서, 수용성 분기 폴리머의 부위지향성 결합은 본 발명의 뉴클레오티드 당 또는 활성화 당을 사용하여 특정의 펩티드 서열에 대한 생체외 효소글리코실화에 의해 이루어진다.

글리코 - 콘주게이션(Glyco - conjugation)은 수용성분기폴리머 - 당의 종 (species), 즉 PEG-시알산을 글리코실화 부위("글리코-PEG화")에 전이할 수 있는 글리코실 전이효소, 즉, 시알릴 전이효소를 이용하여 효소에 의해 실시할 수 있다.

위에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 소정의 카르보 히드레이트 구조를 가진 당과 폴리머성분 사이에서 수식된 하나의 콘주게이트(conjugate)를 제공한다.

당 뉴클레오티드와 이들의 당구조를 기준으로 한 활성화 당은 또 본 발명의 하나의 성분이다.

폴리머 수식성분은 효소수단, 화학적 수단 또는 그 조합수단에 의해 그 당성분에 결합함으로써, 수식된 뉴클레오티드 당을 생성한다.

이들의 당은 어느 소정의 위치에서 폴리머 수식성분으로 치환된다. 하나의 예에서, 그 당은 C-1, C-2, C-3, C-4 또는 C-5 중 하나 이상에서 치환된 푸라노오스이다.

또 다른 예에서, 본 발명은 C-1, C-2, C-3, C-4, C-5 또는 C-6 중 하나이상에서 폴리머 수식성분으로 치환된 피라노오스를 제공한다.

폴리머 수식성분은 그 탄소에서 현수된 산소, 질소 또는 황에 직접 결합하는 것이 바람직하다. 또, 그 폴리머 수식성분은 그 당과 그 수식성분 사이에 설정된 하나의 링커에 결합된다. 그 링커는 선택된 탄소에서 현수된 산소, 질소 또는 황에 결합된다.

바람직한 하나의 예에서, 그 폴리머 수식성분은 그 얻어진 콘주게이트가 그 수식당 성분을 또다른 종(즉, 펩티드, 글리코펩티드, 리피드, 글리코리피드등)에 결합하는데 사용된 효소용 기질로서 기능적 작용을 하도록 선택된 하나의 위치에 부가된다.

예시할 수 있는 효소는 여기서 구체적으로 설명하며, 글리코실 전이효소(시알릴 전이효소, 글루코실 전이효소, 갈락토실 전이효소, N-아세틸 글루코실 전이효소, N-아세틸 갈락토실 전이효소, 만노실 전이효소, 푸코실 전이효소 등)를 포함한 다.

또, 본 발명의 예시할 수 있는 당 뉴클레오티드와 활성화당 콘주게이트에는 변이체 글리코시다아제와 변이체 글리코세라미다아제 용 기질을 포함한다(이들의 기질은 가수분해활성보다 오히려 수식하여 합성활성을 가진다).

하나의 예에서, 본 발명의 콘주게이트에는 당, 활성화 당 또는 뉴클레오티드당(하나 이상의 폴리머, 즉 분기 폴리머에 콘주게이팅 되어있음)을 포함한다.

예시할 수 있는 폴리머에는 수용성종과 수불용성종을 모두 포함한다.

하나의 예에서, 그 폴리머 수식단(polymeric modifying group)은 피라노오스 또는 푸라노오스에 직접 또는 간접으로 결합된다.

예로서, 아래에 식 Ⅰ및 Ⅱ를 나타낸다.

위 식Ⅰ및 Ⅱ에서,

R¹은 H, CH₂OR⁷, COOR⁷ 또는 OR⁷이며,

R⁷은 H, 치환 또는 비치환 알킬 또는 치환 또는 비치환헤테로알킬이다.

R²는 H, OH, NH 또는 하나의 뉴클레오티드를 포함한 성분이다.

이 예에 의한 하나의 예시할 수 있는 R²종은 다음 식을 가진다.

위 식에서,

X¹은 O 또는 NH를 나타내며,

R⁸은 하나의 뉴클레오시드이다.

상기 부호 R³, R⁴, R⁵, R⁶및 R^6'는 H, 치환 또는 비치환 알킬, OR⁹, NHC(O)R¹⁰을 독립적으로 나타낸다.

지수 d는 0 또는 1이다.

상기 R⁹와 R¹⁰은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 또는 시알산에서 독립적으로 선택한다.

R³, R⁴, R⁵, R⁶ 및 R^6' 중 최소 하나에는 폴리머 수식성분, PEG를 포함한다.

하나의 예에서, R⁶ 및 R^6' 는 탄소와 함께 결합되어 있으며, 시알산의 측쇄의 성분이다.

또 다른 예에서, 이 측쇄는 C-6, C-7 또는 C-9 중 최소 하나 이상에서 폴리머 수식성분(또는 링커-폴리머 수식성분)으로 수식된다.

상기 부호 R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶은 H, OR⁹, NHC(O)R¹⁰을 독립적으로 나타내며, R⁹ 및 R¹⁰은 H, 치환 또는 비치환 알킬 또는 치환 또는 비치환헤테로알킬에서 독립적으로 선택한다. R³, R⁴, R⁵, R⁶ 또는 R⁶ 중 최소 하나는 폴리머 수식성분을 포함한다.

또 다른 예에서, 상기 당성분은 미국가특허출원 60/641,956(2005.01.06 출원)의 명세서에서 기재된 바와 같이, 산화시켜 폴리머 수식성분에 콘주게이팅을 하는 시알산 성분이다.

하나의 예에서, 그 폴리머 수식 성분은 아래에서 나타낸 바와 같이 링커(linker)에 의해 그 당코어에 결합된다.

위 식에서,

R¹¹은 폴리머 수식성분이며, L은 하나의 결합(bond)과 하나의 결합기(linking group)에서 선택되며, 지수 w는 1-6, 바람직하게는 1-3, 더 바람직하게는 1-2의 정수이다.

L이 하나의 결합일 경우, 이것은 R¹¹의 전구물질(전구체)상에서의 반응성 작용기와 L의 전구물질 상에서 상보적인 반응성이 있는 반응성 작용기 사이에 형성된다. 여기서 설명한 바와 같이, 적합한 반응성 작용기를 가진 전구물질(전구체)의 선택과 제조는 이 기술 분야의 능력범위 내에 있다.

더욱이, 그 전구 물질의 결합은 이 기술에서 잘 이해되는 화학적 특성에 의해 처리한다.

하나의 예에서, L은 하나의 결합기이며, 그 결합기는 하나의 아미노산, 하나의 아미노산 유사체, 또는 하나의 치환 알킬 링커에 의해 폴리머 수식성분이 결합되는 하나의 수식당을 구성하는 크기가 작은 펩티드(즉, 1-4아미노산 잔기)로 부터 형성된다.

그 링커는 그 아민성분 및 그 아미노산의 카르복실산(또는 반응성 유도체, 즉 활성 에스테르, 산 할라이드 등)과 그 전구물질 상에서 상보적인 반응성의 기를 L 및R¹¹에 반응시켜 형성된다.

그 콘주게이트의 구성성분요소들은 간편한 순서에 따라, 콘주게이팅을 할 수 있다. 예로서, R¹¹의 전구물질과 L을 콘주게이팅 하기 전에 그 사카리드 코어 상에서 그 전구물질을 L의 적합한 위치에 설정할 수 있다.

또, L상에서 반응성 기능적 작용을 가진 R¹¹-L 카세트를 제조한 다음에, 이 종(species) 상에서 상보적인 반응성의 반응성 작용기에 의해 그 사카리드에 결합할 수 있다.

하나의 예에서, 그 폴리머 수식성분은 R³ 및/또는 R⁶이다.

또 다른 예에서, R³ 및/또는 R⁶에는 폴리머 성분을 그 분자의 잔부에 결합하는 하나의 링커 L과, 폴리머 수식성분 모두를 포함한다.

다른 예에서, 폴리머 수식성분은 R³이다. 또 다른 하나의 예에서, R³에는 폴리머 수식성분과, 그 폴리머 수식성분을 그 분자의 잔부에 결합하는 하나의 링커, L 모두를 포함한다.

그 당이 시알산인 하나의 예에서, 그 폴리머 수식성분은 R⁵에서 결합하거나, 또는 그 시알산인 하나의 예에서, 그 폴리머 수식성분은 R⁵에서 결합하거나, 또는 그 시알산 측쇄의 위치, 즉 C-9에서 결합한다.

선상 폴리머 콘주게이트(linar polymer conjugates)

하나의 예에서, 본 발명은 수용성 또는 수불용성 폴리머 등 선상폴리머 사이에서 형성된 당 또는 활성화당 콘주게이트 또는 뉴클레오티드 당 콘주게이트를 제공한다.

본 발명의 상기 콘주게이트에서, 그 폴리머는 당, 활성화당 또는 당 뉴클레오티드에 결합된다.

여기서 설명한 바와 같이, 그 폴리머는 당 성분에 직접 결합되거나, 또는 하나의 링커를 통해 결합된다.

이 예에 의한 하나의 예시할 수 있는 화합물은 식Ⅰ또는 Ⅱ에 의한 구조를 가진다. 그 식에서, R¹, R³, R⁴, R⁵ 또는 R⁶ 중 최소 하나는 다음 식을 가진다.

이 예에 의한 또 하나의 예에서는 다음에 나타낸 식을 가진다:

위 식에서,

s는 0~20의 정수이고, R¹¹은 선상 폴리머 수식성분이다.

어느 분자량, 즉 2Kda, 5Kda, 10Kda, 20Kda, 30Kda, 40Kda의 PEG 성분은 본 발명에서 유용하다.

분기 폴리머 콘주게이트(branched polymer conjugates)

하나의 예에서, 그 폴리머 수식성분은 아래에 나타낸 식을 가진 중심성분(central moiety)에 결합된 2개 이상의 폴리머 사슬을 포함하는 하나의 분기구조이다.

위 식에서, R¹¹과 L은 위에서 설명한 정의와 같으며, w'는 2~6, 바람직하게는 2~4, 더 바람직하게는 2~3의 정수이다.

본 발명의 이 예에 의한 콘주게이트를 형성하는데 사용할 수 있는 하나의 예시할 수 있는 전구물질은 아래에 나타낸 식(Ⅲ)을 가진다:

이 식에 의한 분기 폴리머종은 필수적으로 순수한 수용성 폴리머이다.

X^3'는 이온화 할 수 있거나(즉, COOH, H₂PO₄, HSO₃, HPO₃ 등)또는 다른 반응성 있는 작용기이다(즉, 상기 참고문헌 참조).

C는 탄소이다.

X⁵는 미반응성기(즉, H, 비치환 알킬, 비치환 헤테로알킬)이며, 폴리머암(polymeric arm)이다.

R¹² 및 R¹³은 폴리머 암, 즉 비펩티드이고, 미반응성인 폴리머암을 독립적으로 선택한다.

X² 및 X⁴는 같거나 다른 생리적 조건 하에서 필수적으로 미반응성이 바람직한 결합프라그멘트이다.

또, 이들의 결합에는 생리적인 관련 조건 하에서 분해하도록 형성된 1종 이상의 성분, 즉 에스테르, 디술피드 등을 포함한다.

X² 및 X⁴는 폴리머 암 R¹² 및 R¹³을 탄소 C에 결합한다.

X^3'가 링커, 당 또는 링커-당 카세트 상에서 반응성이 상보적인 하나의 반응성 작용기와 반응할 경우, X^3'는 결합관련 X³의 성분으로 전환된다.

X² 및 X⁴의 예시할 수 있는 결합단편에는 S, SC(O)NH, HNC(O)S, SC(O)O, O, NH, NHC(O), (O)CNH 및 NHC(O)O, OC(O)NH, CH₂S, CH₂O, CH₂CH₂O, CH₂CH₂S, (CH₂)_aO, (CH₂)_aS 또는 (CH₂)_aY'-PEG 또는 (CH₂)_aY'-PEG(여기서, Y'는 S 또는 O이고, a는 1~5의 정수이다)를 포함한다.

하나의 예에서, 그 전구물질(Ⅲ) 또는 그 활성화 유도체는 X^3'와 그 당성분 상에서 상보적인 반응성의 기(a group)사이의 반응을 통해 당, 활성화 당 또는 당 뉴클레오티드에 결합된다.

또, X^3'는 전구물질 상에서 링커 L에 반응성인 작용기와 반응한다.

식 Ⅰ및 Ⅱ에서 1 이상의 R¹, R³, R⁴, R⁵ 또는 R⁶에는 분기 폴리머 수식성분을 포함할 수 있다.

하나의 예에서, 아래에 나타낸 그 분기 폴리머 수식성분은 링커암 L이다.

이 예에서, 하나의 링커는 천연 또는 비천연 아미노산, 아미노산 동족체 또는 아미노산 유사체, 또는 하나 이상의 상기 종에서 형성된 크기가 작은 펩티드에서 유도된다. 예로서, 본 발명의 화합물에서 확인된 어느 분기 폴리머는 아래에서 나타낸 식을 가진다.

위 식에서, X^a는 분기 폴리머 수식성분과 당 성분의 전구물질 또는 전구 물질 상에서 링커와 반응성 작용기의 반응에 의해 형성된 결합성분(linking moiety)이다.

예로서, X^3'가 카르복실산인 경우 이것은 활성화 되어 아미노-사카리드(즉, GalNH₂, GlcNH₂, ManNH₂ 등)에서 현수된 하나의 아민기에 직접 결합됨으로써 아미드인 X^a를 형성할 수 있다.

추가 예로서 반응성 작용기와 활성화 전구물질은 아래에서 설명한다.

지수 c는 1~10의 정수를 나타낸다.

다른 부호는 위에서 설명한 것과 동일한 정의를 가진다.

또 다른 예에서, X^a는 다음에 나타낸 또 다른 링커로 형성된 결합성분이다.

위 식에서, X^b는 하나의 결합성분(linking moiety)으로, X^a에 대하여 설명한 기(groups)에서 독립적으로 선택되며, L¹은 하나의 결합, 치환 또는 비치환 알킬 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬이다.

X^a 및 X^b의 예시할 수 있는 종(species)에는 S, SC(O)NH, HNC(O)S, SC(O)), O, NH, NHC(O), (O)CNH 및NHC(O)O, OC(O)NH를 포함한다.

예로서, 다음 종을 식으로 나타낼 수 있다:

위 식에서, s는 0~20의 정수이고, R¹¹은 선상 폴리머 수식성분이다.

또 다른 예에서, X⁴는 R¹³에 결합하는 펩티드 결합으로, 알파-아민 성분 및/또는 측쇄헤테로원자가 폴리머로 수식되는 아미노산, 디-펩티드 또는 트리-펩티드이다.

또 다른 예에서, R⁶에는 분기 폴리머 수식단을 포함하며, 그 수식당 또는 뉴클레오티드당은 아래에 나타낸 식 Ⅳ 및 Ⅴ에서 선택한 하나의 식을 가진다.

위 식에서,

여러 가지의 부호로 나타낸 래디컬의 동정은 위에서 설명한 정의와 같으며, L^a는 치환 또는 비치환 알킬, 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬 성분이다.

하나의 예에서, L^a는 위 식에서 나타낸 바와 같이 폴리머 수식성분으로 기능 적 작용을 하는 시알산의 측쇄성분이다.

또 하나의 예에서, 본 발명은 아래에 나타낸 식 Ⅵ 및 Ⅶ을 가진 당(sugars) 및 뉴클레오티드 당을 제공한다.

위 식에서,

여러 가지의 부호로 나타낸 래디컬의 동정은 위에서 설명한 정의와 같다. 이 분야의 기술자가 이해하고 있는 바와 같이, 식Ⅵ 및 Ⅶ에서 그 링커얌은 여기서 설명한 다른 수식당에 동일하게 적용할 수 있다.

위에서 설명한 본 발명은 그 폴리머가 수용성 폴리머, 특히, 폴리(에틸렌 글리콜)("PEG"), 즉 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)("m-PEG")인 종(species)을 참고로 추가하여 예시한다.

이 분양의 기술자들은 다음에 설명하는 기술적 요지가 설명을 명백하게 하기 위한 것이며, 하나의 예시할 수 있는 폴리머로서 PEG를 사용하여 설명한 여러가지의 특징이 PEG 이외의 폴리머를 사용하는 종(species)에도 동일하게 적용할 수 있다는 것을 알 수 있다.

수용성 폴리머(water-soluble polymers)

다수의 수용성 폴리머는 이 분야의 기술자에 의해 공지되어 있으며, 본 발명 의 실시에 유용하다.

용어 수용성 폴리머에는 사카리드(즉, 덱스트란, 아밀로오스, 히알로우론산, 폴리(시알산), 헤파란, 헤파린 등); 폴리(아미노산), 즉 폴리(아스파르트산) 및 폴리(글루탐산); 핵산; 합성폴리머(즉, 폴리(아크릴산)), 폴리(에테르), 즉 폴리(에틸렌 글리콜)); 펩티드, 단백질 등을 포함한다.

하나의 폴리머는 일반적으로 최소 2개의 폴리머 단위로 이루어진다. 예시할 수 있는 하나의 예에서 그 폴리머는 2~25개의 단위를 가진다.

또 다른 예에서 그 폴리머는 2~8개의 폴리머 단위로 이루어진다.

본 발명은 상기 콘주게이트의 잔부를 결합시킬 수 있는 하나의 결합지점(a point)을 상기 폴리머가 포함할 필요가 있는 단독 한정조건을 가진 어느 수용성 폴리머라도 실시할 수 있다.

또, 폴리머의 활성화 방법은 특허문헌 WO94/17039; USP5,324,844; WO94/18247; WO94/04193; USP 5,219,564; USP 5,122,614; WO90/13540; USP 5,281,698; WO93/15189의 명세서에서 확인할 수 있으며, 활성화 폴리머와 펩티드 사이의 콘주게이션(conjugation)에 있어서, 즉 응고인자(coagulation factor)Ⅷ는 특허문헌 WO94/15625 명세서에, 헤모글로빈은 특허문헌 WO94/09027명세서에, 산소보유분자(oxygen carrying molecule)는 특허문헌 USP4,412,989 명세서에, 리보 뉴클리아제 및 수퍼옥시드 디스뮤타아제(superoxide dismutase)는 참고문헌(Veronese 등, App. Biochem. Biotech. 11:141-45(1985))에 각각 기재되어 있다.

바람직한 수용한 폴리머는 그 폴리머의 샘플 중에서 폴리머 분자의 실제상의 비가 거의 동일한 분자량으로 이루어진 폴리머이다. 이와 같은 폴리머는 "균일분산"(homodisperse)의 특성이 있다.

또, 본 발명은 폴리(에틸렌 글리콜)콘주게이트에 대하여 참고로 설명한다.

PEG의 기능적 작용과 콘주게이션에 대한 수종의 참고문헌과 단행본을 참조하여 이용할 수 있다.

예로서, 다음 참고문헌과 단행본을 인용하여 참조할 수 있다:

HArris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373(1985); Scouten, Methods in Enzymology 135 : 30-65(1987); Song 등, Enzyme Microb. Technol.14: 866-874(1992); Delgado 등, Critical Reviews in therapeutic Drug Carrier system 9: 249-304(1992);

Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165(1995); Bhadra 등, Pharmazie. 57: 5-29(2002).

반응성 PEG 분자를 제조한 다음, 그 반응성 PEG 분자를 사용하여 콘주게이트를 형성하는 루트(routes)는 이 기술에서 공지되었다.

예로서, 특허문헌 USP 5,672,662 명세서에서는 선상 또는 분기상 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(옥시에틸화폴리올), 폴리(올레핀알코올)및 폴리(아크릴로모르폴린)에서 선택한 폴리머산의 활성 에스테르의 분리할 수 있는 수용성 콘주게이트에 대하여 개시되었다.

특허문헌 USP 6,376,604 명세서에서는 유기용매 중에서 디(1-벤조트리아조일카르보네이트와 수용성 비펩티드폴리머의 말단 히드록실을 반응시켜 수용성 비펩티 드폴리머의 수용성 1-벤조트리아조일 카르보네이트 에스테르를 제조하는 방법에 대하여 기재되어 있다.

상기 활성 에스테르를 사용하여 단백질 또는 펩티드 등 생물학적 활성제를 가진 콘주게이트를 형성하였다.

특허문헌 WO99/45964 명세서에서는 생물학적 활성제와, 하나의 안정성 있는 결합을 통하여 그 폴리머 골격에 결합되는 최소 하나의 말단을 가진 폴리머 골격으로 이루어진 수용성의 활성화 폴리머를 구성하여, 최소 하나의 말단이 인접 반응성기를 결합시킨 분기성분으로 이루어지며, 그 분기 성분에서는 그 생물학적 활성제가 최소 하나의 인접 반응성기에 결합하는 것을 특징으로 하는 하나의 콘주게이트에 대하여 기재되어 있다.

다른 분기폴리(에틸렌 글리콜)은 특허문헌 WO96/21467 명세서에 기재되어 있으며, 특허문헌 USP5,932,462 명세서에서는 반응성 작용기를 포함한 분기 말단를 구비한 하나의 분기 PEG 분자로 형성된 하나의 콘주게이트에 대하여 기재되어 있다.

그 유리 반응성 작용기는 단백질 또는 펩티드 등 생물학적 활성종과 반응하는데 이용할 수 있어, 그 폴리(에틸렌 글리콜)과 생물학적 활성 종 사이에서 콘주게이트를 형성한다.

특허문헌 USP5,446,090 명세서에서는 PEG링커 말단의 각각에 하나의 펩티드를 가진 콘주게이트의 형성에 있어서 2작용성 PEG 링커와 그 사용에 대하여 기재되어있다.

분해성 PEG 결합을 포함한 콘주게이트는 특허문헌 WO99/34833, 특허문헌 WO99/14,259 및 특허 문헌 USP 6,348,558명세서에 기재되어 있다.

이와 같은 분해성 결합은 본 발명에서 적용할 수 있다.

위에서 설명한 폴리머 활성화의 공지방법은 여기서 설명한 분기 폴리머의 형성과, 또 다른 종, 즉 당, 당 뉴클레오티드 등에 이들의 분기 폴리머의 콘주게이션에 대해서도 본 발명과 관련하여 볼 때 유용하다.

예시할 수 있는 수식단(modifying groups)을 아래에서 설명한다. 그 수식단은 펩티드에 한가지 이상의 특성을 전달하는 수식단의 특성 전달능(ability)에 대하여 선택할 수 있다.

예시할 수 있는 특성에는 약물 동태학적인 증강, 약동학적인 증강, 생체내 분산성(biodistribution)향상, 다가종(polyvalent species)형성능, 물용해도 향상, 친유성 증강 또는 감소 및 조직의 표적설정을 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.

본 발명에 유용한 예시할 수 있는 폴리(에틸렌 글리콜)분자에는 아래에 나타낸 식을 가진 분자를 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.

위 식에서, A²는 H, OH, NH₂, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환아릴, 치환 또는 비치환헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환헤테로알킬, 즉 아세탈, OHC-, H₂N-(CH₂)_q-, HS-(CH₂)_q 또는 -(CH₂)_qC(Y^b)Z^b이다.

지수 "e"는 1~2500의 정수를 나타낸다.

지수 b, d 및q는 0~20의 정수를 독립적으로 나타낸다.

부호 Z^a 및 Z^b는 OH, NH₂, 이탈기, 즉 이미다졸, P-니트로페닐, HOBT, 테트라졸, 할라이드, S-R^a, 활성화에스테르의 알코올부분; -(CH₂)_pC(Y^b)V, 또는 -(CH₂)_pU(CH₂)₅C(Y^b)v를 각각 나타낸다.

부호 Y^a는 H(2),=O,=S,=N-R^b를 나타낸다.

부호 X^a, Y^a, Y^b, A¹ 및 U는 성분 O,S,N-R^c를 독립적으로 나타낸다.

부호 V는 OH, NH₂, 할로겐, S-R^a, 활성화에스테르의 알코올 성분, 활성화아미드의 아민성분, 당-뉴클레오티드 및 단백질을 나타낸다.

지수 p,q,s 및 v는 0~20의 정수에서 독립적으로 선택한 수이다.

부호 R^a, R^b 및 R^c는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환헤테로알킬, 치환 또는 비치환아릴, 치환 또는 비치환헤테로시클로알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로아릴을 독립적으로 나타낸다.

본 발명에서 유용한 선상 및 분기상 폴리머, 즉 PEG의 특정의 예는 다음 식을 포함하며,

아래에 나타낸 식을 가진 종의 카르보네이트와 활성에스테르를 사용하여 선상 및 분기상 폴리머종, 이들 종의 링커암 콘주게이트와, 이들 화합물과 당 및 뉴클레오티드당 사이의 콘주게이트를 형성할 수 있다.

위 식에서, 지수 e 및 f는 1~2500의 정수에서 독립적으로 선택한다.

여기서 설명한 화합물의 제조에 유용한 선상 PEG를 활성화하는데 적합한 다른 예시할 수 있는 활성기 또는 이탈기에는 다음에 나타낸 식의 종(species)을 포함하나, 한정되어있는 것은 아니다.

상기 폴리머 수식성분의 전구물질 상에서 선택성분에 대한 적합한 활성기는 이 기술분야의 기술자의 능력범위 내에서 적합하게 선택할 수 있다.

이와 같은 종과 다른 종으로 활성화하는 PEG 분자와 그 활성화된 PEG의 제조방법은 특허문헌 WO04/083259 명세서에서 기재되어있다.

예시할 수 있는 예에서, 그 분기상 폴리머는 시스테인, 세린, 리신, 디 또는 트리시린코어를 기재로 한 PEG이다.

이와 같이, 예시할 수 있는 다른 분기상 PEG에는 아래에 나타낸 식을 포함한다:

위 식에서 지수 e 및 f는 1~2500의 정수에서 독립적으로 선택한다.

또 하나의 예에서, 그 분기상 PEG 성분은 트리리신 펩티드를 기재로 한다. 그 트리리신 펩티드는 모노-. 디-, 트리- 또는 테트라-PEG화 할 수 있다. 이 예에 의한 예시할 수 있는 종(species)에는 아래에 나타낸 식을 가진다:

위 식에서,

e, f 및 f'는 1~2500의 정수에서 독립적으로 선택되며, q, q' 및 q"는 0~20의 정수에서 독립적으로 선택한다.

본 발명의 예시할 수 있는 예에서, 상기 PEG는 m-PEG(5kD, 10kD, 20kD, 30kD 또는 40kD)가 있다.

하나의 예시할 수 있는 분기상 PEG 종에는 리신, 세린 또는 시스테인(m-PEG)₂이 있다. 여기서, 상기 m-PEG는 20kDm-PEG이다.

이 기술분야의 기술자가 이해하고 있는 바와 같이, 본 발명에서 유용한 상기 분기상 폴리머에는 위에서 설명한 기술적인 주제(subjects)의 변형도 포함한다.

예로서, 위에서 나타낸 디-리신-PEG 콘주게이트에는 3개의 폴리머 서브유닛(subunits: 소단위체)를 포함하며, 위 구조체에 수식하지 않은 상태로 나타낸 α-아민에 결합한 3차구조이다.

동일하게, 3개 또는 4개의 폴리머 서브유닛으로 기능적 작용을 하는 트리-리신(tri-lysine)을 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다.

이 분야의 기술자들은 상기 분기상 폴리머의 1개 이상의 m-PEG암(arms)이다른 말단, 즉 OH, COOH, NH₂, C₂-C₁₀-알킬 등을 가진 하나의 PEG 성분에 의해 치환시킬 수 있다는 것을 이해하고 있다.

더욱이, 상기 구조는 상기 α-탄소원자와 측쇄의 작용기 사이에서 알킬링커를 삽입(또는 탄소원자들을 이탈)함으로써 용이하게 수식(변형)된다.

이와 같이 "호모"(homo) 유도체 및 고급 동족체(higher homologues)와 저급 동족체는 본 발명에서 유용한 분기상 PEG의 코어 범위 내에 있다.

여기서 설명한 분기상 PEG 종은 아래에 나타낸 제조 공정(scheme)에서 설명한 방법에 의해 쉽게 제조된다.

위 식에서,

X^b는 O, NH 또는 S이며, r은 1~10의 정수이다.

지수 e 및 f는 1~2500의 정수에서 독립적으로 선택한다. 예시할 수 있는 분기상 PEG 종에는 10,000, 15,000, 20,000, 30,000 및 40,000 달톤이 있다.

이와 같이, 상기 제조공정(scheme)에 의해 천연아미노산 또는 비천연아미노산은 활성화 m-PEG 유도체, 이 경우 토실레이트(tosylate)와 접촉시켜, 측쇄헤테로원자를 알킬화함으로써 식 1을 형성한다. 단(mono)작용성 m-PEG 아미노산을 반응성m-PEG유도체로 N-아실화상태에 따르도록 함으로써 분기상 m-PEG(식2)를 구축(집합)한다.

이 분야의 기술자들이 알고 있는 바와 같이, 그 토실레이트 이탈기는 그 대신 어느 적합한 이탈기, 즉 할로겐, 메실레이트, 트리플레이트 등으로 할 수 있다.

동일하게, 그 아민을 아실레이팅 하는데 사용되는 반응성 카르보네이트는 그 대신 활성에스테르, 즉 N-히드록시숙신이미드 등으로 할 수 있다. 또, 그 산은 디시클로 헥실 카르보디이미드, 카르보닐디이미다졸 등 탈수제를 사용하여 현장에서 활성화 할 수 있다.

위에서 설명한 예시할 수 있는 제조공정에서, 그 수식단(modifing group)은 하나의 선상 PEG성분이나, 어느 수식단, 즉 수용성 폴리머, 수불용성 폴리머, 분기 폴리머, 치료성분 등은 글리코실 성분 중에서 충분하게 혼합시킬 수 있다.

또, 본 발명의 화합물에 유용한 분기상 폴리머 종은 아래에 나타낸 예 등 PEG로 기능적 작용을 시킨 분기상 코어로 예시한다.

위 식에서,

R¹⁴는 OH 또는 또 다른 반응성 작용기이다.

하나의 예시할 수 있는 반응성 작용기는 C(O)Q'이다. 여기서 Q'는 C(O)Q'가 하나의 반응성 작용기가 되도록 선택한다.

Q'의 예시할 수 있는 종에는 할로겐, NHS, 펜타플루오로페닐, HOBT, HOAt 및P-니트로페닐을 포함한다.

지수 "e"와 "f"는 1~2500에서 독립적으로 선택한다.

위에서 설명한 분기상 화합물과, 본 발명의 화합물에서 유용한 추가분기화하불은 아래에 나타낸 출발재로부터 용이하게 제조한다.

폴리머 수식당 종(polymer modified sugar species)

본 발명의 뉴클레오티드 당의 당 성분은 천연 및 비천연 푸라노오스 및 헥사노오스에서 선택할 수 있다.

그 비천연 사카리드는 알킬화 또는 아실화 히드록실 및/또는 아민성분, 즉 그 링(ring) 상에서 에테르, 에스테르 및 아미드 치환기를 선택적으로 포함한다.

다른 비천연 사카리드에는 다음에 예시한 어느 하나의 치환기가 천연 사카리드 중에 존재하지 않은 링 상에서의 한 위치에서 H, 히드록실, 에테르, 에스테르 또는 아미드 치환기를 포함한다. 그 당 성분은 모노-, 올리고- 또는 폴리-사카리드로 할 수 있다.

본 발명에서 유용한 예시할 수 있는 천연 당에는 글루코오스, 갈락토오스, 푸코오스, 만노오스, 키실로오스, 리보오스, N-아세틸 글루코오스, 시알산 및 N-아세틸 갈락토오스를 포함한다.

동일하게, 그 뉴클레오시드는 천연 및 비천연 또는 특정의 뉴클레오시드에서 선택할 수 있다.

본 발명에서 유용한 예시할 수 있는 천연 뉴클레오시드에는 시토신(cytosine), 티민, 구아닌, 아데닌 및 우라실을 포함한다.

특정의 뉴클레오시드에는 스폰고우리딘(spongouridin) 및 스폰고티미딘 등의 분자를 포함할 수 있으나, 한정된 것은 아니다.

이 기술에 의해 비천연 특정 뉴클레오시드의 구조와 그 제조방법을 충족한다.

본 발명의 예시할 수 있는 수식당 뉴클레오티드에는 GDP-Man, GDP-Fuc, UDP-Gal, UDP-Gal-NH₂, UDP-GalNAc, UDP-Glc, UDP-Glc-NH₂, UDP-GlcNAc, UDP-Glc, UDP-GlcUA 및CMP-Sia를 포함한다.

본 발명의 당에 대하여 위에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 당뉴클레오티드는 그 사카리드의 어느 위치에서 폴리머 수식성분(또는 링커-수식성분)으로 치환시킬 수 있다.

예로서, 본 발명에 의해 포함된 화합물에는 푸라노오스기재 뉴클레오티드당의 C-5 또는 피라노오스 기재 뉴클레오티드 당의 C-6에 L-R¹¹성분이 콘주게이팅되어 있는 화합물을 포함한다.

여기서 설명한 콘주게이트에 결합된 예시할 수 있는 성분에는 PEG 유도체(즉, 알킬-PEG, 아실-PEG, 아실-알킬-PEG, 알킬-아실-PEG, 카르바모일-PEG, 아릴-PEG), PPG 유도체(즉, 알킬-PPG, 아실-PPG, 아실-알킬-PPG, 알킬-아실-PPG, 카르바모일-PPG, 아릴-PPG), 치료성분, 진단성분, 만노오스-6-포스페이트, 헤파린, 헤파 란, SLex, 만노오스, 만노오스-6-포스페이트, 시알릴루이스X, FGF, VFGF, 단백질, 콘드로이틴, 케라탄, 테르마탄, 알부민, 인터그린(integrins), 촉각형상(antennary)올리고사카리드, 펩티드 등을 포함한다.

사카리드 성분에 여러 가지의 수식단(modifying groups)을 콘주게이팅 하는 방법은 이 분야의 기술자에 의해 용이하게 이해할 수 있다.

참고문헌으로 다음 문헌을 예시할 수 있다.

POLY(ETHYLENE GLYCOL CHEMISTRY: BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, Ed., Plenum Pub. Corp., 1992; POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMICAL AND BIOLOGICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, Ed., ACS Symposium Series No. 680, American Chemical Society, 1997; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; and Dunn 등, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991

본 발명의 예시할 수 있는 당뉴클레오티드에는 UDP-글리코시드, CMP-글리코시드 또는 GDP-글리코시드의 뉴클레오티드 모노-, 디-또는 트리포스페이트 또는 그 동족체를 수식(또는 변형)형태로 포함한다.

그 수식당 뉴클레오티드는 UDP-갈락토오스, UDP-갈락토사민, UDP-글루코오스, UDP-글루코사민, GDP-만노오스, GDP-푸코오스, CMP-시알산 또는 CMP-NeuAc에서 선택하는 것이 더 바람직하다.

또, 그 당 뉴클레오티드의 N-아세틸아민 유도체가 본 발명의 방법에서 유용 하다.

다른 예에서, 그 수식당은 활성화당이다.

본 발명에서 유용한 활성화 수식당은 일반적으로 글리코시드이며, 그 글리코시드는 하나의 활성화 이탈기를 포함하도록 합성에 의해 변경시킨다.

여기서 사용되는 용어 "활성화이탈기"는 효소에 의해 조절하는 친핵치환반응으로 용이하게 치환되는 성분을 말한다.

다수의 활성당은 이 기술분야에서 공지되어 있다. 예로서 참고문헌을 아래에 인용하며 참조할 수 있다:

Vocado 등, In Carbohydrate Chemistry and Biology, Vol. 2, Ernest 등 Ed. Wiley-VCH Verlag: Weinheim, Germany, 2000;

Kodama 등, Tetrahedron Lett. 34: 6419(1993); Lougheed 등, J. Biol. Chem. 274: 37717(1999).

활성기(이탈기)의 예에는, 플루오로, 클로로, 브로모, 토실레이트에스테르, 메실레이트 에스테르, 트리플레이트 에스테르 등을 포함한다.

본 발명에서 사용하는 바람직한 활성화 이탈기는 수용체(acceptor)에 글리코시드의 효소전이를 입체적으로 현저하게 방해하지 않은 기(groups)이다.

따라서, 활성화 글리코시드 유도체의 바람직한 예에는 글리코실 플루오리드 및 글리코실메실레이트를 포함하며, 글리코실 플루오리드가 특히 바람직하다.

그 글리코실 플루오리드 중에서, α-갈락토실 플루오리드, α-만노실 플루오리드, α-글루코실 플루오리드, α-푸코실 플루오리드, α-키실로실 플루오리드, α-시알릴 플루오리드, α-N-아세틸글루코사미닐 플루오리드, α-N-아세틸 갈락토사미닐 플루오리드, β-갈락토실 플루오리드, β-만노실 플루오리드, β-글루코실 플루오리드, β-푸코실 플루오리드, β-키실로실 플루오리드, β-시알릴 플루오리드, β-N-아세틸 글루코사미닐 플루오리드 및 β-N-아세틸 갈락토사미닐 플루오리드가 가장 바람직하다.

구체적으로 설명하기 위하여, 글리코실 플루오리드는 1차적으로 그 유리당을 아세틸화한 다음에 이것을 HF/피리딘으로 처리시켜 그 유리당으로부터 제조할 수 있다.

이것은 보호(아세틸화)글리코실 플루오리드(즉, α-글리코실 플루오리드)의 열역학적으로 가장 안정성 있는 아노머(anomer)를 생성한다.

안정성이 덜한 아노머(즉, β-글리코실 플루오리드)가 바람직할 경우, 이것은 퍼아세틸화당을 HBr/HOAc 또는 HCl로 전화시켜 아노머 브로미드 또는 클로리드를 생성하여 제조할 수 있다.

이 중간체는 실버(silver) 플루오리드 등 플루오리드염과 반응하여 글리코실 플루오리드를 생성한다.

아세틸화 글리코실 플루오리드는 메타놀(즉, NaOMe/MeOH) 중에서 온화한(촉매)염기와의 반응에 의해 탈보호할 수 있다.

또, 다수의 글리코실 플루오리드는 상품으로 사용할 수 있다.

다른 활성화 글리코실 유도체는 이 분야의 기술자에 의해 공지된 통상의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

예로서, 글리코실 메실레이트는 상기 당과 메실 클로리드의 완전 벤질화 헤미아세탈 형태처리를 한 다음에 촉매 수소첨가처리를 하여 벤질기를 제거시켜 제조할 수 있다.

또 다른 예에서, 그 수식당은 하나의 촉각형상구조를 가진 올리고사카리드이다. 다른 예에서, 그 촉각형상구조의 1개 이상의 말단에는 그 수식성분을 가진다.

하나 이상의 수식성분이 하나의 촉각형상구조를 가진 올리고사카리드에 결합될 경우, 그 올리고사카리드는 그 수식성분을 "중폭"(amplify)하는데 유용하며, 그 펩티드에 콘주게이팅을 한 각각의 올리고 사카리드는 그 펩티드에 그 수식단의 다중 복제를 결합한다.

위 도면에서 설명한 본 발명의 일반적인 콘주게이트의 구조에는 하나의 촉각형상 구조를 이용하는 본 발명의 콘주게이트의 제조에서 얻어진 다가종(multivalent species)을 포함한다.

다수의 촉각형상 사카리드 구조는 이 기술에서 공지되어 있으며, 본 발명의 방법은 제한하지 않고 이들의 구조로 실시할 수 있다.

하나의 예시할 수 있는 예에서, 그 활성화 수식당은 하나의 기질의 적합한 수용체 성분 상에서 상기 당을 전이하는 하나의 변이체 효소의 기질이다.

예시할 수 있는 변이체 효소에는 특허문헌 PCT공개공보(WO03/046150 및 WO03/045980)에서 설명한 변이체 효소를 포함한다.

수용성 폴리머 수식당, 활성화당 및 상기 당성분이 수용성 폴리머로 수식한 뉴클레오티드 당 종, 즉 수용성 폴리머는 본 발명에서 유용하다.

하나의 예시할 수 있는 수식당 뉴클레오티드는 상기당에서 아민성분에 의해 수식된 하나의 당기(sugar group)를 가진다.

수식당 뉴클레오티드, 즉 당뉴클레오티드의 사카릴-아민유도체는 또 본 발명의 방법에서 유용하다.

예로서, 사카릴아민(그 수식단 없음)은 펩티드(또는 다른 종)에 효소에 의해 콘주게이팅 시킨 다음, 그 유리 사카릴 아민 성분은 소정의 수식단에 콘주게이팅 할 수 있다.

또, 그 수식당 뉴클레오티드는 하나의 기질(즉 펩티드, 글리코펩티드, 리피드, 아글리콘, 글리코리피드 등)상에서 그 수식당을 사카릴 수용체로 전이하는 효소의 기질로서 기능적인 작용을 할 수 있다.

하나의 예에서, 그 당은 여기서 설명한 폴리머종등 하나의 분기상 폴리머 종에 콘주게이팅을 한다.

또 다른 예에서, 그 당성분은 수식된 시알산이다. 시알산이 상기 당인 경우, 그 시알산은 피루빌 측쇄 상에서의 9-위치 또는 시알산 중에서 정상 상태하에 아세틸화하는 상기 아민성분 상에서의 5-위치에서 상기 수식단으로 치환된다.

또 다른 예에서, 그 사카리드 코어가 갈락토오스 또는 글루코오스인 경우에 R⁵는 NHC(O)Y이다.

하나의 예시할 수 있는 예에서, 그 수식당은 6-아미노-N-아세틸-글리코실 성분을 기재로 한다.

N-아세틸 갈락토사민에 대해서는 아래에서 나타내는 바와 같이 그 6-아미노-당성분이 다음에 나타낸 기준이 되는 방법에 의해 용이하게 제조된다:

위 제조 공정(scheme)에서, 지수 n은 1~2500, 바람직하게는 10~1500, 더 바람직하게는 10~1200의 정수를 나타낸다.

부호 "A"는 하나의 활성기, 즉 할로, 활성화에스테르(즉, N-히드록시 숙신이미드 에스테르)의 성분, 카르보네이트(즉, P-니트로페닐 카르보네이트)의 성분 등을 나타낸다.

다른 PEG-아미드 뉴클레오티드 당이 이 방법 및 이 방법과 동일한 방법에 의해 용이하게 제조된다는 것을 이 분야의 기술자에 의해 알 수 있다.

더욱이, 여기서 설명한 바와 같이, 분기 폴리머는 그 선상 PEG로 치환시킬 수 있다.

상기 C-6위치가 수식되어있는, 또 다른 예시할 수 있는 본 발명의 폴리머 수식 뉴클레오티드 당은 아래에 나타낸 식을 가진다.

위 식에서,

X⁶은 하나의 결합 또는 O이고, J는 S 또는 O이며, y는 0 또는 1이다.

지수 e 및 f는 1~2500에서 독립적으로 선택한다.

예시할 수 있는 다른 예에서, 그 아미드 성분은 우레탄 또는 우레아 등 하나의 기(group)에 의해 치환된다.

본 발명의 실시에 유용한 수식당의 다수의 특정 예를 아래의 설명에서 기재한다. 그 특정 예에서, 시알산 유도체는 그 수식단이 결합되어있는 당핵으로 이용된다.

시알산 유도체에 대한 구체적 설명의 요지는 그 설명을 명백하게 하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석할 필요는 없다.

하나의 예로서 시알산을 사용하여 설명한 것과 동일한 방법으로 하여 여러가지의 다른 당성분을 활성화시켜 유도체화 할 수 있다는 것은 이 분야의 기술자에 의해 알 수 잇따.

예로서, 공지의 방법에 의해 용이하게 수식되는 수종의 당기질로 칭하는 갈라토오스, 글루코오스, N-아세틸 갈락토사민 및 푸코오스의 수식에 여러가지의 방 법을 사용할 수 있다.

그 예로서 다음 문헌을 참조할 수 있다:

Elhalabi 등, Curr. Med. Chem. 6: 93(1999); Schafer 등, J. Org. Chem. 65: 24(2000).

도 2는 본 발명에 의한 일반적인 제조공정(scheme)을 설명한 것이다.

이와 같이, 도 2에 의해 만노사민과 보호 아미노산 사이의 아미드 콘주게이트는 그 콘주게이트의 형성에 적합한 조건 하에서 만노사민과 N-보호 아미노산을 접촉시켜 형성한다.

그 보호 아미노산의 카르복실 말단은 현장에서 활성화시키거나, 또는 저장에 안정성이 있는 반응성기, 즉, N-히드록시-숙신이미드로 선택적 전환을 시킨다.

그 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산에서 선택할 수 있다.

본 발명의 방법에서 측쇄 아미노산의 바람직하지 않게 반응하는 것을 보호하는 방법은 이 분야의 기술자에 의해 알 수 있다.

그 아미드 콘주게이트는 그 아미드 콘주게이트를 시알산 아미드 콘주게이트로 전환시킨 다음, 그 시알산 아미드 콘주게이트와 그 뉴클레오티드 페스페이트의 전구물질 및 적합한 효소를 반응시켜 뉴클레오티드 포스페이트 시알산 아미드 콘주게이트로 전환하는 데 적합한 조건 하에서 피루베이트 및 시알산 알돌라아제와 반응시킨다.

하나의 예에서, 그 전구물질은 시티딘 트리포스페이트이며, 그 효소는 신테타아제(sythetase)이다.

그 뉴클레오티드 당을 형성한 다음에, 그 아미노산 아민은 탈보호되어 유리 반응성 아민을 구성한다. 그 아민은 그 수식성분을 뉴클레오티드 당으로 콘주게이팅을 하는 하나의 부위(locus)로 작용한다.

도 2에서, 그 수식성분은 수용성 폴리머, 즉 폴리(에틸렌 글리콜), 즉 PEG, m-PEG 등으로 예시할 수 있다.

또, 본 발명을 도 3에서 예시할 수 있다. 도 3은 시알산-글리실-PEG-시티딘 모노포스페이트를 제조하는 하나의 제조공정도를 설명한 것이다.

도 2에서 설명한 제조공정도와 동일하게, 도 3의 제조공정도에는 출발물질로서 만노사민에서 출발한다. 그 당은 그 보호 아미노산의 N-히드록시 숙신이미드 활성화 유도체를 사용하여 FMOC-글리신과 콘주게이팅을 한다.

그 결과 얻어진 아미드 콘주게이트는 그 콘주게이트 상에서 시알산 알돌라아제와 피루베이트를 작용시켜 그 상응하는 시알산으로 전환시킨다. 그 결과 얻어진 시알산 콘주게이트는 트리포스페이트와 신테타아제(synthetase)를 사용하여 시티딘 모노 포스페이트 동족체로 전환시킨다. 그 CMO-동족체는 아미노산아민성분에서 보호기를 이탈시키고, 이 성분을 콘주게이션 반응성 부위로 전환시킴으로써 탈보호된다. 그 아민성분은 활성화 PEG종(m-PEG-O-니트로페닐 카르보네이트)과 반응시킴으로써, 시알산-글리실-PEG-시티딘 모노포스페이트를 형성한다.

시알산을 기재로한 예시할 수 있는 당 코어는 다음에 나타낸 식을 가진다.

위 식에서,

D는 -OH 또는 (R¹¹)_w'-L-이다. 부호 G는 H, (R¹¹)_w'-L- 또는 -C(O)(C₁-C₆)알킬이다. R¹¹은 위에서 설명한 정의와 같다. D와 G 중 최소하나는 R¹¹-L-이다.

다른 예에서, 본 발명은 아래에 나타낸 구조로 이루어진 당, 활성당 또는 당 뉴클레오티드를 제공한다.

위 식에서, L²는 상기 L에 대해서 위에서 설명한 정의와 같다. 즉, 하나의 결합, 치환 또는 비치환알킬, 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬기이다.

지수 e는 1~2500의 정수를 나타낸다.

또 다른 예에서, 그 당 또는 그 당 뉴클레오티드는 아래에 나타낸 구조로 이루어진다.

위 식에서,

s는 0~20의 정수에서 선택되고, e는 1~2500의 정수이다.

하나의 분기상 폴리머로 기능적 작용을 시켜 선택한 시알산 기재 뉴클레오티드 당은 다음에 나타낸 식을 가진다:

위 식에서,

AA는 하나의 아미노산 잔기이며, PEG는 폴리(에틸렌글리콜) 또는 메톡시-폴리(에틸렌글리콜)이고, NP는 뉴클레오티드이며, 이것은 하나의 포스포디에스테르 결합에 의해 글리코실 성분에 연결(결합)되어있다("뉴클레오티드 포스페이트").

ONP가 여기서 설명한 바와 같이 활성성분에 의해 치환시킬 수 있다는 것은 이 분야의 기술자에 의해 알 수 있다.

또 하나의 예에서, 그 시알산 유도체는 아래에 나타낸 화합물에서 선택한 하나의 멤버인 구조를 가진다:

위 구조식에서,

X⁶은 하나의 결합 또는 O이고, J는 S 또는 O이다.

지수 a, b 및 c는 0~20에서 독립적으로 선택하며, e 및 f는 1~2500에서 독립적으로 선택한다.

더욱이, 위에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 직쇄 또는 분기상인 수용성 폴리머로 수식한 뉴클레오티드 당을 제공한다.

예로서, 아래에서 나타낸 식을 가진 화합물은 본 발명의 범위 내에 있다:

위 식에서,

X⁶은 0 또는 하나의 결합이고, J는 S또는 0이다.

지수 e와 f는 1~2500에서 독립적으로 선택한다.

또 본 발명의 조성물을 포함하는 펩티드와 글리코 펩티드, 리피드와 글리코리피드의 콘주게이트를 제공한다.

그 콘주게이트는 본 발명의 뉴클레오티드 당 또는 활성화 당 및 하나의 기질을, 수용체 성분상에서 수식당을 뉴클레오티드당으로 전이하는데 적합한 조건 하에서 수식 뉴클레오티드 당이 하나의 기질인 효소 및 당 성분의 적합한 수용체 성분을 배합시켜 형성한다.

예로서, 본 발명은 아래에 나타낸 식을 가진 콘주게이트를 제공한다.

위 식에서,

J 및 X⁶은 위에서 설명한 것과 같다.

지수 a, b, c, e 및 f는 위에서 설명한 것과 같다.

본 발명의 선택 화합물은 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스의 입체화학특성을 가진 종(species)을 기재로 한다.

이들 화합물의 일반식을 아래에 나타낸다:

위 식에서,

R³~R⁶ 중 하나는 수식성분, 즉 폴리머 수식성분 또는 폴리머 수식성분-링커 구조이다.

위에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 어느 화합물에는 폴리머 수식당 뉴클레오티드가 있다.

본 발명에서 수식형태로 사용되는 예시할 수 있는 당 뉴클레오티드에는 뉴클레오티드 모노, 디 또는 트리포스페이트 또는 그 동족체를 포함한다.

하나의 바람직한 예에서, 그 수식당 뉴클레오티드는 UDP- 글리코시드, CMP-글리코시드, 또는 GDP-글리코시드에서 선택한다.

그 수식당 뉴클레오티드는 UDP-갈락토오스, UDP-갈락토사민, UDP- 글루코오스, UDP-글루코사민, GDP-만노오스, GDP-푸코오스, CMP-시알산 또는 CMP-Sia에서 선택하는 것이 더 바람직한다.

하나의 예에서, 뉴클레오티드 모노-, 디-또는 트리-포스페이트는 C-1에 결합된다.

상기 당 뉴클레오티드의 사카릴-아민 유도체는 또 본 발명의 방법에서 유용하다.

예로서, 그 사카릴 아민(그 수식당능 없음)은 펩티드(또는 다른종)에 효소에 의해 콘주게이팅을 하고, 그 다음 그 유리사카릴 아민성분이 소정의 수식단에 콘주게이팅을 할 수 있다.

본 발명의 당 뉴클레오티드 콘주게이트는 일반적으로 아래에 나타낸 식에 의 해 설명한다.

위 식에서,

부호들은 위에서 설명한 기(groups)를 나타낸다.

그 당코어가 만노오스일 때, 폴리머 수식성분은 R³, R⁴ 또는 R⁶에 있는 것이 바람직하다.

글루코오스에 있어서, 그 폴리머 수식성분은 선택적으로 R⁵ 또는 R⁶에 있다. 지수 "u"는 0,1 또는 2이다.

GDP 만노오스를 기재로 하여 본 발명의 또 하나의 예시할 수 있는 뉴클레오티드 당은 아래에 나타낸 구조를 가진다:

또 다른 하나의 예에서, 본 발명은 아래에 나타낸 구조를 가진 UDP 갈락토오스를 기재로 한 하나의 콘주게이트를 제공한다.

또 다른 예에서, 그 뉴클레오티드 당은 글루코오스를 기재로 하며, 다음에 나타낸 구조를 가진다:

위 3종의 구조식에서 각각 그 래디컬 및 지수는 위에서 설명한 정의와 같다.

이 분야의 기술자에 의해 알 수 있는 바와 같이, 그 선상 PEG 성분은 여기서 설명한 바와 같이 분기상 폴리머 종 또는 다른 선상 폴리머종에 의해 치환시킬 수 있다.

그 사카리드 코어가 갈락토오스 또는 글루코오스인 하나의 예에서, R⁵는 NHC(O)Y이다.

불수용성 폴리머(water-insoluble polymers)

다른 예에서, 위에서 설명한 것과 동일한 그 수식당에는 하나의 수용성 폴리머라고 하기보다 오히려 수 불용성 폴리머를 포함한다.

수용성 폴리머와 같이 수불용성 폴리머는 일반적으로 최소 2개의 폴리머 단 위로 구성되어 있다.

하나의 예에서, 그 수불용성 폴리머는 2~25개의 폴리머 단위로 구성되어 있다. 또 다른 예에서, 그 수불용성 폴리머는 2~8개의 폴리머 단위로 구성되어 있다.

또, 본 발명의 콘주게이트에는 하나 이상의 수불용성 폴리머를 포함한다.

본 발명의 이 예에서는 치료 펩티드를 조정할 수 있게 투여(전달)하는 매개체(vehicle)로서 그 콘주게이트의 사용을 설명한다.

폴리머 약물전달(투여)시스템은 이 기술분야에서 공지되어있다. 예로서 다음 참고문헌을 예시할 수 있다:

Dunn 등, Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS symposium series vol. 489, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991.

본 발명의 콘주게이트에 실질상 어느 공지된 약물전달(투여) 시스템이 적용될 수 있다는 것은 이 분야의 통상의 기술자에 의해 알 수 있다.

대표적인 수불용성 폴리머에는 폴리포스파진, 폴리(비닐알코올), 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리알킬렌, 폴리아크릴아미드, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 할라이드, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리글리콜리드, 폴리실록산, 폴리우레탄, 폴리(메틸 메타아크릴레이트), 폴리(에틸 메타아크릴레이트), 폴리(부틸 메타아크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타아크릴레이트), 폴리(헥실 메타아크릴레이트), 폴리(이소데실 메타아크릴레이트),폴리(라우릴 메타아크릴레이트), 폴리(페틸 메타아크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이 소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트)폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 아세테이트), 폴리비닐 클로리드, 폴리스티렌, 폴리비닐 피롤리돈, 플루로릭 및 폴리비닐 페놀 및 그 코폴리머를 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.

본 발명의 콘주게이트에서 유용한 합성에 의해 수식된 천연 폴리머에는 알킬 셀룰로오스, 히드록시알킬 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 에스테르 및 니트로 셀룰로오스를 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.

합성에 의해 수식된 천연 폴리머의 광범위한 분류 중 특히 바람직한 멤버에는 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 히드록시 프로필 메틸 셀룰로오스, 히드록시 부틸 메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 프로피오네이트, 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 카르복시 메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 트리아세테이트, 셀룰로오스 술페이트 소듐염, 아크릴 및 메타아크릴 에스테르와 알긴산의 폴리머를 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.

여기서 설명한 폴리머와 다른 폴리머는 상품제조업자 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA), Polysciences(Warreton, PA, USA), Aldrich(Milwaukee, WI, USA), Fluka(Ronkonkoma, NY, USA) 및 BioRad(Richmond, CA, USA) 등의 상품 공급원에서 용이하게 구입할 수 있고, 또는 그밖에 표준 기술을 사용하여 상기 제조업자로부터 얻은 모노머에 의해 합성할 수도 있다.

본 발명의 콘주게이트에 유용한 대표적인 당분해성 폴리머에는 폴리락티드, 폴리글리코티드 및 그 코폴리머, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락티드-코-카프로락톤), 폴리(락티드-코-글리코리드), 폴리안히드리드, 폴리오르토에스테르, 그 블렌드 및 코폴리머를 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.

콜라겐, 플루로닉(pluronics) 등을 포함하는 조성물 등 겔형성 조성물이 특히 유용하다.

본 발명에서 유용한 폴리머에는 구조체의 최소 일부분 내에 생체 재흡수성 분자(bioresorbable molecule)를 가진 수불용성재를 포함하는 "혼성"(hybrid) 폴리머를 포함한다.

이와 같은 폴리머의 예에는 폴리머 사슬당 하나의 생체재흡수성 영역, 친수성 영역 및 다수의 가교성 작용기를 가진 수불용성 코폴리머를 포함하는 폴리머가 있다.

본 발명에서, "수불용성재"에는 물 또는 물함유환경에서 실질상 불용성인 재(materials)를 포함한다.

이와 같이, 상기 코폴리머의 어느 영역 또는 세그멘트는 친수성이거나, 또는 수용성이라도, 전체적으로 그 폴리머 분자는 수중에서 실질상 어느 정도까지는 용해하지 않는다.

본 발명에서, 용어 "생체재흡수성분자"(bioresorbable molecule)에는 신체에 의한 정상적인 배설루트를 통하여 대사작용을 할 수 있거나, 파괴작용을 할 수 있고 재흡수 및/또는 배설할 수 있는 영역을 포함한다.

이와 같은 대사물 또는 파괴생성물은 그 신체에 실질상 비독성인 것이 바람직하다.

상기 생체 재흡수성 영역은 그 코폴리머 조성물이 전체적으로 볼 때 수용성으로 되지 않는 한 소수성이거나, 또는 친수성으로 할 수 있다.

이와 같이, 상기 생체재흡수성영역은 그 폴리머가 전체적으로 볼 때 수불용성으로 잔류되는 선택적인 특권(preference)을 기초로 하여 선택한다.

따라서, 상대적인 특성, 즉 포함된 작용기의 종류와 생체재흡수성 영역과 친수성 영역의 상대적 비율을 선택하여 유용한 생체재흡수성 조성물이 불용성으로 잔류되도록 한다.

예시할 수 있는 재흡수성 폴리머에는 예로서 폴리(α-히드록시-카르복실산)/폴리(옥시알킬렌)의 합성에 의해 생성된 재흡수성 블록 코폴리머를 포함한다(참고문헌: Cohn 등, USP 4,826,945 참조).

이들의 코폴리머는 가교결합되지 않으며 수용성이므로, 그 생체는 분해성 블록 코폴리머 조성물을 배설할 수 있다(참고문헌: Younes 등, J. Biomed. Mater, Res. 21: 1301~1316(1987); Cohn 등, J. Biomed, Mater. Res. 22: 993~1009(1988)참조).

현재 바람직한 생체재흡수성 폴리머에는 폴리(에스테르), 폴리(히드록시산), 폴리(락톤), 폴리(아미드), 폴리(에스테르-아미드), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(오르토에스테르), 폴리(카르보네이트), 폴리(포스파진), 폴리(포스포에스테르), 폴리(티오에스테르), 폴리사카리드 및 그 혼합물로부터 선택한 1종 이상의 성분을 포함한다.

그 생체 재흡수성 폴리머에는 폴리(히드록시)산 성분을 포함하는 것이 더 바람직하다.

그 폴리(히드록시)산 중에서 폴리랙트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로산, 폴리부티르산, 폴리발레르산과 그 코폴리머 및 그 혼합물이 바람직하다.

생체 내에서 흡수되는("생체재흡수성":bioresorbed)프라그멘트의 형성 이외에, 본 발명의 방법에서 사용하는 바람직한 폴리머 코팅은 또 배설할 수 있고 대사작용을 할 수 있는 프라그멘트를 형성할 수 있다.

또 본 발명에서는 고차 코폴리머(higher order copolymers)를 사용할 수 있다. 예로서, 참고문헌(Casey 등, USP 4,438,253; 1984. 03.20. 권리취득)에서는 폴리(글리콜산)과 히드록실말단폴리(알킬렌글리콜)의 에스테르교환반응 (transesterification)으로부터 제조된 트리-블록코폴리머에 대하여 개시되었다.

이와 같은 조성물은 재흡수성 모노필라멘트 봉합사(suture)로서의 사용에 대하여 개시되었다.

이와 같은 조성물의 가요성(flexibility)은 테트라-P-톨릴 오르토카르보네이트 등 방향족 오르토카르보네이트를 그 코폴리머 구조체에 결합시킴으로써 조절된다.

또, 락트산 및/또는 글리콜산을 기재로 한 다른 폴리머를 사용할 수 있다. 예로서, 특허문헌(Spinu, USP 5,202,413; 1993.04.13. 권리취득)에서는 올리고머 디올 또는 디아민 잔기에서 락티드 및/또는 글리콜리드를 개환 중합한 다음에 디이 소시아네이트, 디아실클로리드 또는 디클로로실란 등 2작용성 화합물로 사슬연장(chain extension)시켜 제조된 폴리락티드 및/또는 폴리글리콜리드의 순차 배열된 블록을 가진 생분해성 다블록코폴리머(biodegradable multi-block copolymers)에 대해서 개시되어있다.

본 발명에서 유용한 코팅의 생체재흡수성영역은 가수분해 및/또는 효소작용에 의해 분할할 수 있도록 구성할 수 있다.

본 발명에서, "가수분해작용에서 분할할 수 있는"(hydrolytically clevable)의 의미는 물 또는 물함유 환경에서 가수분해에 대한 그 코폴리머, 특히 생체재흡수성영역의 감수성(susceptibility)를 말한다.

동일하게, 여기서 사용되는 "효소에 의해 분할할 수 있는"(enzymatically cleavable)의 의미는 내인성 및 외인성 효소에 의한 분할에 대한 그 코폴리머, 특히 생체재흡수성영역의 감수성을 말한다.

그 친수성 영역은 그 생체 내에 설정될 때, 배설 및/또는 대사작용을 할 수 있는 프라그멘트 내에 처리할 수 있다.

이와 같이, 그 친수성 영역에는 예로서 폴리에테르, 폴리알킬렌옥사이드, 폴리올, 폴리(비닐 피롤리딘), 폴리(비닐 알코올), 폴리(알킬 옥사졸린), 폴리사카리드. 카르보히드레이트, 펩티드, 단백질과 그 폴리머 및 혼합물을 포함한다.

더나아가서, 그 친수성 영역은 또 예로서 폴리(알킬렌)옥사이드로 할 수 있다.

이와 같은 폴리(알킬렌)옥사이드에는 예로서 폴리(에틸렌)옥사이드, 폴리(프 로필렌)옥사이드와, 그 혼합물 및 그 코폴리머가 있다.

또, 히드로겔 성분인 폴리머는 본 발명에서 유용하다.

히드로겔은 비교적 다량의 물을 흡수할 수 있는 폴리머재이다. 히드로겔 생성 화합물의 예에는 폴리아크릴산, 소듐카르복시메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리딘, 젤라틴, 카라기난 및 다른 폴리사카리드, 히드록시 에틸렌 메타아크릴산(HEMA)과 그 유도체 등을 포함하며, 한정되어 있는 것은 아니다.

안정성이 있고, 생분해성이 있으며, 생체 재흡수성이 있는 히드로겔을 제조할 수 있다. 더욱이, 히드로겔 조성물에는 이들 특성의 1종 이상을 나타내는 서브유닛(subunits)를 포함할 수 있다.

가교에 의해 보존상태(integrity)를 조정할 수 있는 생체적 상용성(bio-compatible)을 가진 히드로겔 조성물은 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에서 사용에 바람직하다.

예로서, 특허문헌 [USP 5,410,016(Hubbell 등), 1995.04.25 권리 취득; USP 5,529,914(Hubbell 등), 1996.06.25 권리취득]에서는 수용성계(water-soluble systems)에 대해서 개시되어 있으며, 이들의 수용성계는 가수분해하기 용이한 2개의 신장(extensions)사이에 간삽된 수용성 중심 블록 세그먼트를 가진 블록 코폴리머를 가교하는 수용성계이다. 이와같은 코폴리머는 또 광중합할 수 있는 아크릴레이트 작용성으로 엔드-캐핑(end-capping)되어있다.

이들의 수용성계는 가교할 때 히드로겔로 된다. 이와 같은 코폴리머의 수용성 중심블록에는 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함할 수 있으며, 이에 대하여 상기 가수 분해가 용이한 신장은 폴리글리콜산 또는 폴리락트산 등 폴리(α-히드록시산)으로 할 수 있다.

참고문헌으로 다음 문헌을 참조할 수 있다:

Sawhney 등, Macromolecules 26: 581-587(1995).

또 다른 예에서, 그 겔은 열가역성겔이다.

열가역성겔은 플루로닉, 콜라겐, 젤라틴, 히알로우론산, 폴리사카리드, 폴리우레탄 히드로겔, 폴리우레탄-우레아 히드로겔 및 그 조합 등의 성분을 포함하는 것이 현재로선 바람직하다.

또 하나의 예에서, 본 발명의 콘주게이트에는 리포솜의 성분을 포함한다. 리포솜은 예로서 특허문헌 USP 4,522,811(Eppstein 등, 1985.06.11. 권리취득)명세서에서 기재된 바와 같이, 이 기술분야의 기술자에 의해 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.

예로서, 리포솜 제제(formulation)는 적합한 리피드(스테아로일 포스파티딜 에타놀아민, 스테아로일 포스파티딜 클로린, 아라카도일 포스파티딜 클로린 및 콜레스테롤)를 무기용매 중에 용해시켜 제조할 수 있으며, 그 용매는 증발시킨 후 콘테이너의 표면 상에서 건조리피드의 엷은 필름으로 잔류하도록 한다.

그 다음, 활성화합물 또는 의약적으로 허용할 수 있는 그 염의 수용액을 콘테이너 내에 도입하고, 이어서 그 콘테이너를 수동으로 회전(swirl)시켜 그 콘테이너의 양측면에서 리피드재를 유리하여 리피드 집합체를 분산시킴으로써, 그 리포솜 현탁액을 형성한다.

위에서 설명한 마이크로 입자와 그 마이크로 입자의 제조방법은 실시 예에 의해 제공하며, 본 발명에서 유용한 마이크로 입자의 범위를 규정한 것은 아니다.

여러 가지의 방법에 의해 제조한 마이크로 입자의 배열이 본 발명에서 유용하다는 것은 이 분야의 기술자에 의해 알 수 있다.

직쇄와 분기상의 수용성 폴리머의 구성에서 위에서 설명한 구성포맷(structual formats)은 일반적으로 수불용성폴리머에 대해서도 적용할 수 있다.

이와 같이, 예로서, 그 시스테인, 세린, 디리신 및 트리리신 분기코어는 2종의 수불용성폴리머 성분으로 기능적인 작용을 할 수 있다.

이들의 종의 제조에 사용되는 방법은 일반적으로 수용성 폴리머의 제조에 사용되는 방법과 밀접한 관련을 가져 동일하다.

또, 치료 글리코 펩티드의 생체 내 반감기는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)등 PEG 성분으로 증강(향상)시킬 수 있다.

예로서, PEG(PEG화 :PEGylation)에 의한 단백질의 화학적 수식(변형)은 이들 단백질의 분자크기를 증대시키고 이들 단백질의 표면-및 작용기-접근성을 감소시켜 그 특성 각각은 단백질에 결합된 PEG의 크기에 따라 좌우된다.

이와 같은 구성결과, 플라즈마 반감기가 향상되고 단백질 분해 안정서이 얻어지며, 면역원성(항원성)과 간 섭취(hepatic uptake)가 감소된다(참고문헌: Chaffee 등, J. Clin. Invest. 89: 1643-1651(1992); Pyatak 등, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 29: 113-127(1980)참조).

인터류킨-2의 PEG화는 생체 내에서 항암효력의 증가에 대하여 보고된 바 있 으며(참고문헌: Katre 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 1487-1491(1987)참조), 단일 클론성 항체 A7에서 유도된 F(ab')2의 PEG화는 그 종양 국소화(정위)(tumor localization)를 향상(개선)시킨다는 연구보고가 있었다(참고문헌:Kitamura 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 28: 1387-1394(1994)참조).

이와 같이, 또 다른 예에서 본 발명의 방법에 의해 PEG성분으로 유도체화한 펩티드의 생체 내 반감기는 비유도체화 펩티드의 생체내 반감기와 비교하여 향상된다.

펩티드의 생체내 반감기 증가는 이 펩티드 품질에서의 증가% 범위로 가장 적합하게 나타낸다. 증가 % 범위의 하한(lower end)은 약 40%, 약 60%, 약 80%, 약 100%, 약 150% 또는 약 250% 이상이다.

그 증가 % 범위의 상한(upper end)은 약 60%, 약 80%, 약 100%, 약 150% 또는 약 250%이상이다.

수식(변형)당(modified sugars)의 제조

일반적으로 그 당성분과 수식단(modifying group)은 하나의 새로운 유기질 작용기 또는 미반응성 종에 그 결합 프로세스에 의해 일반적으로 형질전환시키는 반응성기를 사용하여 동시에 결합된다.

그 당 반응성 작용기는 그 당성분상에서 어느 위치에 설정된다.

본 발명의 실시에 유용한 반응성기와 반응분류는 일반적으로 바이오콘주게이트(bioconjugate) 화학기술에서 공지되었다.

반응성 당 성분으로 사용할 수 있는 반응에서 현재 바람직한 분류는 비교적 유연한 조건 하에서 처리되는 반응분류이다. 이들의 반응분류에는 친핵성 치환(즉, 아민 및 알코올과 아실 할라이드, 활성 에스테르의 반응), 친전자치환(즉, 에나민반응) 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 다중결합의 부가(즉, 미카엘 반응, 디엘스-알더부가)를 포함하나, 한정된 것은 아니다.

이들의 반응과 다른 유용한 반응은 예로서 다음 참고문헌에서 기재되어 있다:

March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; Feeney 등, Modification of Proteins, Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C. 1982.

당 핵(sugar nucleus), 링커 전구물질 또는 폴리머 수식성분 전구 물질에서 현수된(pendent) 유용한 반응성 작용기에는

(a) N-히드록시 숙신 이미드 에스테르, N-히드록시 벤즈 트리아졸 에스테르, 산 할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스테르, P-니트로페닐 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 방향족에스테르를 포함하나, 한정되지 않은 카르복실기 및 여러가지의 그 유도체;

(b) 에스테르, 에테르, 알데히드 등으로 전환시킬 수 있는 히드록실기;

(c) 상기 할라이드가 예로서 하나의 아민, 하나의 카르복실레이트 아니온, 티올 아니온, 카르바니온 또는 하나의 알콕시드 이온 등 친핵성기로 후치환시킴으 로써, 그 할로겐 원자의 작용기에서 하나의 새로운 기의 공유결합이 얻어지는 할로알킬기;

(d) 예로서, 말레이미도기 등 디엘스-알더반응에 참가할 수 있는 친디엔체기(dienophile groups);

(e) 예로서, 이민, 히드라존, 세키카르바존 또는 옥심 등 카르보닐 유도체의 형성에 의해, 또는 그리냐르부가(Grignard addition) 또는 알킬리튬 부가 등의 메카니즘에 의해 후유도체화가 가능하도록 하는 알데히드 또는 케톤기;

(f) 예로서, 술폰아미드를 형성하는 아민과의 후반응을 하는 술포닐 할라이드기;

(g) 예로서, 디술피드로 전환시키거나 또는 아실할라이드와 반응시킬 수 있는 티올기;

(h) 예로서 아실화, 알킬화 또는 옥사이드화 시킬 수 있는 아민 또는 술프히드릴기;

(i) 예로서, 시클로부가, 아실화, 미카엘 부가 등의 반응을 실시할 수 있는 알켄; 및

(j) 예로서 아민 및 히드록실 화합물과 반응할 수 있는 에폭사이드를 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.

상기 반응성 작용기는 그 작용성 당 핵 또는 수식단(modifying group)을 집합하는데 필요로 하는 반응에 참가 또는 간섭하지 않도록 선택할 수 있다.

또, 반응성 작용기는 보호기의 존재에 의해 그 반응의 참가로부터 보호받을 수 있다.

이 분야의 기술자들에 의해 소정의 작용기가 선택된 반응조건과 간섭하지 않도록 그 작용기를 보호하는 방법을 알 수 있다.

유용한 보호기의 예에 있어서는 아래의 참고문헌을 참조할 수 있다;

Greene 등, Protective Groups in Organic systhesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.

아래의 설명에서, 본 발명의 실시에 유용한 수식당의 다수의 예를 기재한다.

예시할 수 있는 예에서, 하나의 시알산 유도체는 그 수식단이 결합되어있는 당 핵으로 이용된다.

시알산 유도체에 대한 구체적 설명의 요지는 그 설명만을 명백하게 하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석할 필요는 없다.

이 분야의 기술자들에 의해, 하나의 예로서 시알산을 사용하여 설명한 것과 동일하게 다수의 다른 당 성분을 활성화할 수 있고 유도체화 할 수 있다는 것을 알 수 있다.

예로서, 다음 기술문헌은 참조할 수 있다;

Elhalabi 등, Curr. Med. Chem. 6: 93(1999); Schafer 등, J. Org. Chem. 65: 24(2000).

아래의 처리공정(scheme)에서, 아미노글리코시드 1을 보호 아미노산(즉, 글리신)유도체의 활성에스테르와 처리하여, 그 당 아민 잔기를 그 상응하는 보호 아미노산 아미드 첨가생성물(adduct)로 전환시킨다.

이 첨가 생성물(adduct)을 알돌라아제로 처리하여 α-히드록시 카르복실레이트2를 생성한다.

그 화합물 2는 CMP-SA 신테타아제(synthetase)의 작용에 의해 그 상응하는 CMP 유도체로 전화시킨 다음, 그 CMP 유도체를 촉매수소첨가 반응을 시켜 화합물 3을 생성한다.

상기 글리신 첨가 생성물의 형성에 의해 도입된 상기 아민은 그 화합물 3과 활성화 (m-)PEG 또는 (m-)PPG유도체(즉, PEG-C(O)NHS, PPG-C(O)NHS)를 반응시켜 PEG 또는 PPG 결합을 하는 하나의 부위(locus)로서 이용되어, 각각 화합물 4 또는 5를 생성한다.

처리 공정도 1

이 분야의 기술자들이 알고 있는 바와 같이, 또 그 폴리머 수식성분은 여기서 설명한 성분 등 하나의 분기상 성분으로 할 수 있다.

본 발명의 분기상 폴리머 수식당을 제조하는 하나의 예시할 수 있는 제조공정도를 아래에 제공한다.

본 발명의 폴리머 수식당을 제조하는 또 다른 예시할 수 있는 제조공정도를 아래에 설명한다:

폴리머 수식성분, 즉 분기- 또는 직쇄 PEG 또는 PPG 성분으로 유도체화한 당 모노포스페이트의 대표적인 예를 다음 표 1에서 설명한다.

표 1의 명백한 화합물들은 제조공정도 1의 방법에 의해 제조한다.

다른 유도체는 공지의 방법에 의해 제조한다.

예로서 아래의 참고문헌을 참조할 수 있다:

Keppler 등, Glycobiology 11:11R(2001); Charter 등, Glycobiology 10:1040(2000).

다른 아민 반응성 폴리머 수식성분 전구물질과 성분, 즉 PEG 및PPG 동족체는 상품으로 이용할 수 있으며, 또는 이 분야의 기술자에 의해 용이하게 가까이 할 수 있는 방법에 의해 제조할 수 있다.

위 식에서,

R은 폴리머(분기 또는 직쇄) 수식성분이다.

본 발명의 실시에 유용한 수식당 포스페이트는 다른 위치와 위에서 설명한 위치에서 치환시킬 수 있다.

현재 바람직한 시알산의 치환은 아래의 식에서 설명한다.

위 식에서, X^c, Y^a, Y^b, Y^c 및 Z 중 하나이상은 하나의 결합기이며, 그 결합기는-O-, -N(H)-, -S, CH₂- 및 N(R)₂로부터 선택하는 것이 바람직하다.

X^c, Y^a, Y^b, Y^c 및 Z 가 하나의 결합기일 때, 이것은 R^c, R^d, R^e, R^f 및 R^g에 의해 나타낸 바와 같이 폴리머 수식성분에 결합된다.

또, 이들의 부호는 분기 또는 직쇄수용성 또는 수불용성 폴리머, 치료성분, 셍체분자 또는 다른 성분에 결합되어있는 하나의 링커(linker)를 나타낸다.

R^c, R^d, R^e, R^f 및 R^g가 하나의 폴리머 수식성분이 아닐 경우, X^cR^c, Y^aR^d. Y^bR^e, Y^cR^f 또는 ZR^g 는 H, OH 또는 NC(O)CH₃이다.

또 하나의 수용체(acceptor)상에서 상기 수식당 성분을 전이하는 효소, 즉 글리코실 전이효소의 적합한 기질인 활성화 시알산-폴리머 수식단 콘주데이트를 제조하는 하나의 합성방법을 제공한다.

그 방법에는 (a) 만노사민과 활성화 N-보호아미노산(또는 폴리머 수식성분, 링커 전구물질 또는 링커-폴리머 수식성분 카세트로 기능적 작용을 하는 아미노산)을 그 만노사민과 N-보호아미노산 사이에 하나의 아미드 콘주게이트를 형성하는데 적합한 조건 하에서 접촉하며;

(b) 그 아미드 콘주게이트와 피루베이트 및 시알산 알돌라아제를, 그 아미드 콘주게이트를 시알산 아미드 콘주게이트로 전환하는데 적합한 조건 하에서 접촉하고;

(c) 그 시알산 아미드 콘주게이트와 시티딘 트리포스페이트 및 신테타아제(synthetase)를 시티딘 모노포스페이트 시알산 아미드 콘주게이트의 형성에 적합한 조건하에서 접촉하며;

(d) 그 N-보호기를 시티딘 모노포스페이트 시알산 아미드 콘주게이트에서 이탈시킴으로써 유리아민을 생성하고;

(e) 그 유리아민과 활성화 PEG(직쇄 또는 분기상)를 접촉함으로써 시티딘 모노포스페이트 시알산-폴리(에틸렌 글리콜)을 형성하는 스텝을 포함한다.

가교결합기(cross-linking groups)

본 발명의 방법에서 사용하는 수식당의 제조에는 하나의 당 잔기에 하나의 수식기의 결합과, 글리코실 전이효소의 기질인 안정성 있는 첨가생성물(adduct)의 형성을 포함한다.

상기 당 및 수식기는 0(zero)화 또는 고차(higher order) 가교결합제에 의해 결합시킬 수 있다.

수식기를 카르보히드레이트 성분에 결합하는데 사용될 수 있는 예시가능한 2작용기성 화합물에는 2 작용기성 폴리(에텔린글리콜), 폴리아미드, 폴리에테르, 폴리에스테르 등을 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.

카르보히드레이트를 다른 분자에 결합하는 일반적인 접근방법은 다음 참고문헌에서 공지되어있다.

다음 참고문헌을 예시할 수 있다:

Lee 등, Biochemistry 28: 1856(1989); Bhatia 등, Anal. Biochem.178: 408(1989); Janda 등, J. Am. Chem. Soc,112:8886(1990); Bednarski 등, WO92/18135.

아래의 설명에서, 그 반응성기는 초기 수식당의 당성분상에서 온화한 상태로 처리된다. 그 설명의 요지는 설명을 명백하게 하는 데 있다. 이 기술분야의 기술자들에 의해 그 수식기 상에서 반응성기에 대하여 그 설명이 관련되어 있다는 것을 알 수 있다.

하나의 예시할 수 있는 설계계획에는 헤테로 2 작용기성 가교결합제 SPDP(n-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트를 사용하여 그 당상에서 보호된 술프히드릴을 결합한 다음에, 그 술프히드릴을 탈보호하여 그 수식기 상에서 또 다른 술프히드릴로 하나의 디술피드 결합을 형성하는 것을 포함한다.

여러 가지의 시약을 사용하여 그 수식당의 성분을 분자내 화학적 가교결합으로 수식한다.

가교결합 시약과 가교결합 처리공정에 대한 참고문헌으로 다음 문헌을 참조할 수 있다:

Wold, F.,Meth. Enzymol. 25: 623-651, 1972; Weetall, H.H., 및Cooney, D.A., In: Enzymes As Drugs(Holcenberg, and Roberts, eds.)pp. 395-442, Wiley, New York, 1981;Ji, T.H., Meth.Enzymol. 91: 580-609, 1983; Mattson 등, Mol. Biol. Rep. 17: 167-183, 1993(상기 문헌 모두는 참고문헌으로 여기에 인용된 것임).

바람직한 가교결합시약은 여러 가지의 0(zero)길이 이고, 호모-2작용기성 및 헤테로-2작용기성인 가교결합 시약에서 유도된다.

0(zero) 길이 가교결합시약에는 외인성 재(extrinsic material)의 도입없는 2개의 내인성 화학기(intrinsic chemical groups)의 직접 콘주게이션을 포함한다.

펩티드에 수식당의 콘주게이션(conjugation of modified sugars to peptides)

그 수식당은 그 콘주게이션을 조정하는 적합한 효소를 사용하여 글리코실화 또는 비글리코실화 펩티드에 콘주게이팅을 한다.

이와 같이, 본 발명의 화합물, 특히 뉴클레오티드 당은 아미노산, 글리코실, 또는 아글리콘 수용체 서운의 뉴클레오티드 당에서 당 성분을 전이하는 효소의 기질이 바람직하다.

수용체, 즉 갈락토실 수용체의 당 도너(sugar donors)로서 작용하는 뉴클레오티드 당은 즉, GalNAc, Galβ1, 4GlcNAc, Galβ1, 3GlcNAc, 락토-N-테트라오스, Galβ1, 3GlcNAc, Galβ1, 3Ara, Galβ1, 6GlcNAc, Galβ1, 4Glc(락토오스) 및 이 기술분야의 기술자에 의해 공지된 다른 수용제가 있다(참고문헌: Paulson 등, J. Biol. Chem. 253: 5617-5624(1978)참조).

본 발명의 수식 뉴클레오티드 당이 기질인 예시할 수 있는 효소에는 글리코실 전이효소가 있다.

그 글리코실 전이효소는 어느 소오스(source)로부터 클로닝(cloning)할 수 있거나, 분리시킬 수 있다.

다수의 클로닝 된 글리코실 전이효소는 이들의 폴리뉴클레오티드 서열에서와 같이 공지되어 있다. 참고문헌을 아래에 예시할 수 있다.

즉, "The WWW Guide to Cloned Glycosyltransferases"(http://WWW. vei.co,uk/TGN/gt guide.htm)(참조).

글리코실 전이효소 아미노산 서열과 그 아미노산 서열에서 유도할 수 있는 글리코실 전이효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또 GenBank, Swiss-Prot, EMBL 및 기타를 포함하여 여러 가지의 이용할 수 있는 공공 데이터베이스에서 확인되었다.

본 발명의 화합물이 기질인 글리코실 전이효소에는 갈락토실 전이효소, 푸코실 전이효소, 글루코실 전이효소, N-아세틸갈락토사미닐 전이효소, N-아세틸 글루코사미닐 전이효소, 글루쿠로닐 전이효소, 시알릴 전이효소, 만소실 전이효소, 글루쿠론산 전이효소, 갈락투론산 전이효소 및 올리고사카릴 전이효소를 포함하나, 한정된 것은 아니다.

적합한 글리코실 전이효소에는 진핵생물과 원핵생물에서 얻어진 전이효소를 포함한다.

하나의 예에서, 본 발명의 화합물은 푸코실 전이효소의 기질이다. 푸코실 전이효소는 일반적으로 이 분야의 기술자에 의해 공지된 것으로 L-푸코오스를 GDP-푸코오스에서 수용체 당의 히드록시 위치로 전이하는 효소를 예시할 수 있다.

또 다른 예에서, 그 화합물은 갈락토실 전이효소의 기질이다.

예시할 수 있는 갈락토실 전이효소에는 α(1,3)갈락토실 전이효소를 포함한다[EC. NO. 2.4.1.151, 즉, Dabkowski 등, Transplant Proc. 25: 2921(1993) 및 Yamamoto 등, Nature 345: 229-233(1990), bovine(GenBank j04989, Joziasse 등, J. Biol. Chem. 264: 14290-14297(1989)), murine(GenBank m26925; Larsen 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 8227-8231(1989)), Porcine(GenBank L36152; Strahan 등, Immunogenetics 41: 101-105(1995))참조].

또 다른 적합한 α1,3 갈락토실 전이효소는 형액형 B항원의 합성에서 포함된 전이효소이다(EC2.4.1.37, Yamamoto등, J.Biol.Chem.265:1146-1151(1990)(human)).

또 다른 예시할 수 있는 갈락토실 전이효소는 코어 Gal-T1이다. 또 하나의 다른 예에는 β(1,4)갈락토실전이효소를 포함하며, 이 효소는 예로서 EC2.4.1.90(LacNAc신테타아제)와 EC2.4.1.22(락토오스신테타아제) [bovine (D'Agostaro등, Eur J. Biochem. 183:211-217(1989)), human(Masri 등, Biochem. Biophys. Res, Commun. 157: 657-663(1988)), murine(Nakazawa 등, J. Biochem. 104; 165-168(1988)], E.C.2.4.1.38 및 세라미드갈락토실전이효소(EC2.4.1.45, Stahl. 등, J. Neurosci. Res. 38: 234-242(1994))를 포함한다.

다른 적합한 갈락토실 전이효소에는 예로서 α1,2 갈락토실 전이효소를 포함한다[참고문헌: Schizo saccharomyces pombe, Chapell 등, Mol. Biol. Cell. 5: 519-528(1994)참조).

또, α1,3-갈락토실 전이효소[참고문헌(Cho 등, J. Biol. Chem. 272: 13622-13628(1997))에서 보고된 효소 등]의 용해성 형태가 이 발명의 실시에 적합하다.

a) 시알릴 전이효소

시알릴 전이효소는 본 발명의 화합물이 기질인 또 다른 타입의 글리코실 전이효소이다. 이들의 예에는 ST3GalⅢ(즉, 랫(rat) 또는 사람(human) ST3GalⅢ), ST3GalⅣ, ST3GalⅠ, ST6GalⅠ, ST3GalⅤ, ST6GalⅡ, ST6GalNAcI, ST6GalNAcⅡ 및 ST6GalNAcⅢ(여기서 사용된 시알릴 전이효소 명명은 참고문헌(Tsuji 등, Glycobiology 6:V-Xiv(1996))에 기재되어 있음)을 포함한다.

α(2,3)시알산 전이효소(EC2.4.99.6)인 하나의 예시할 수 있는 α(2,3)시알릴 전이효소는 시알산을 Galβ1→3Glc 디사카리드 또는 글리코시드의 비환원 말단 Gal로 전이한다.

참고문헌으로 다음 문헌을 참조할 수 있다:

Van den Eijnden 등, J. Biol. Chem. 256:3159(1981); Weinstein 등, J.Biol. 257: 13845(1982); Wen 등, J. Biol. Chem. 267:21011(1992).

또 다른 예시할 수 있는 α2,3-시알릴 전이효소(EC 2.4.99.4)는 시알산을 상기 디사카리드 또는 글리코시드의 비환원 말단 Gal로 전이한다.

참고문헌으로 다음 문헌을 참조할 수 있다.:

Rearich 등, J. Biol. Chem. 254:4444(1979); Gillespie 등, J. Biol. Chem. 267:21004(1992).

또 다른 예시할 수 있는 효소에는 Gal-β-1, 4-GlcNAcα-2,6 시알릴 전이효소를 포함한다.(참고문헌: Kurosawa 등, eur. J. Biochem. 219: 375-381(1994)참조).

본 발명의 화합물이 기질인 다른 시알릴 전이효소에는 폴리시알산을 형성하는 전이효소를 포함한다.

이들의 예에는 α-2,8-폴리시알릴 전이효소, 즉 ST8SiaI, ST8SiaⅡ, ST8SiaⅢ, ST8SiaⅣ 및 ST8SiaⅤ를 포함한다.

예로서 아래의 참고문헌을 참조할 수 있다:

Angota 등, J. Biol. Chem. 275: 18594-18601(2000); Kono 등, J. Biol. Chem. 271: 29366-29371(1996); Greiner 등, Infect. Immuno. 72: 4249-4260(2004); Jones 등, J. Biol. Chem. 277: 14598-14611(2002).

본 발명의 청구범위에 청구된 방법에서 유용한 시알릴 전이효소의 하나의 예에는 ST3GalⅢ가 있으며, 이것은 또 α(2,3)시알릴 전이효소(EC2.4.99.6)로 칭한다. 이 효소는 Galβ1, 3GlcNAc의 Gal 또는 Galβ1,4GlcNAc 글리코시드로 시알산의 전이를 촉진한다.

참고 문헌으로 다음 문헌을 참조할 수 있다:

Wen 등, J. Biol. Chem. 267: 21011(1992); Van den Eijnden 등, J. Biol. Chem. 256: 3159(1991).

또 다른 시알릴 전이효소에는 상기 α(2,3)을 포함하여, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 에서 분리된 것을 포함한다(참고문헌: WO99/49051).

본 발명의 화합물은 그 수식 시알산을 서열 Galβ1,4GlcNAc-로 전이하는 효소의 기질이 바람직하며, 가장 공통적인 말단에서 두번째 서열은 그 말단 시알산을 완전 시알릴화 카르보히드레이트 구조상에서 기초로 한다.

b) GalNAc 전이효소

본 발명의 선택된 화합물은 N-아세틸갈락 토사미닐 전이효소의 기질이다.

예시할 수 있는 N-아세틸 갈락토사미닐 전이효소에는 α(1,3)N-아세틸갈락토사미닐 전이효소, β(1,4)N-아세틸 갈락토사미닐 전이효소(참고문헌: Nagata 등, J.Biol.Chem, 267: 12082-12089(1992); Smith 등, J. Biol. Chem 269:15162(1994) 참조, 폴리펩티드 N-아세틸 갈락토사미닐전이효소(참고문헌: Homa 등, J. Biol. Chem. 268: 12609(1993)참조)를 포함하나, 한정된 것은 아니다.

c) 글리코시라아제(glycosidases)

또, 본 발명은 야생형 글리코시다아제와 변이체 글리코시다아제의 기질을 포함한다.

변이체 β-갈락토시다아제 효소는 갈락토실 악셉터 분자에 α-글리코실 플루오리드의 결합에 의해 디사카리드의 형성을 촉진하는 것을 나타낸다(참고문헌: Withers, USP6,284,494; 2001. 09.4 권리취득).

본 발명에서 유용한 다른 글리코시다아제에는 예로서 β-글루코시다아제, β-갈락토시다아제, β-만노시다아제, β-아세틸 글루코사미니다아제, β-N-아세틸 갈락토사미니다아제, β-키실로시다아제, β-푸코시다아제, 셀룰라아제, 키실라나아제, 갈락타나아제, 만나나아제, 헤미셀룰라아제, 아밀라아제, 글루코 아밀라아제 , α-글루코시다아제, α-갈락토시다아제, α-만노시다아제, α-N-아세틸 글루코사미다아제, α-N-아세틸 갈락토오스-아미니다아제, α-키실로시다아제, α-푸코시다아제, 뉴라미니다아제/시알리다아제, 엔도글리코세라미다아제를 포함한다.

다음 실시 예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하며 본 발명의 범위를 한정한 것은 아니다.

실시예 1

UDP-GalNAc-6'-CHO의 제조

UDP-GalNAc(200㎎, 0.30m㏖)를 1mM CuSO₄ 용액(20㎖)과 25mM NaH₂PO₄ 용액(pH6.0; 20㎖)중에 용해하였다.

그 다음 갈락토오스 옥시다아제(240U; 240μL)와 카탈라아제(catalase)(1300U; 130μL)을 산소로 채운 밸룬(balloon)을 장치한 반응 시스템에 첨가하여 실온에서 7일간 교반하였다.

그 다음 그 반응 혼합액을 여과시켜(스핀카트리지; MWCO 5K), 그 여액(~40㎖)을 필요로 할 때까지 4℃에서 저장하였다.

TLC(실리카; EtOH/물(7/2); R_f=0.77; 아니스알데히드 염색으로 눈에 보이도 록 조절하였음).

실시예 2

UDP-GalNAc-6'-NH₂):의 제조

암모늄 아세테이트(15㎎, 0.194m㏖)와 NaBH₃CN(1M THF용액, 0.17㎖, 0.17 m㏖)을 0℃에서 상기 실시예 1의 UDP-GalNAc-6'-CHO용액(2㎖ 또는 ~30㎎)에 첨가시켜, 하룻밤 실온까지 가온하도록 하였다.

그 반응액은 물로 G-10 컬럼을 통하여 여과하여 그 생성물을 회수하였다.

그 적합한 프랙션을 냉동 건조시켜 냉동 저장하였다.

TLC(실리카; 에타놀/수(7/2); R_f=0.72; 닌하드린 시약으로 눈에 보이도록 조절하였음).

실시예 3

UDP-GalNAc-6-NHCO(CH₂)₂-0-PEG-OMe(1 KDa)의 제조

갈락토사미닐-1-포스페이트-2-NHCO(CH₂)₂-0-PEG-OMe(1 KDa)(58㎎, 0.045m㏖)을 DMF(6㎖)와 피리딘(1.2㎖) 중에서 용해하였다.

그 다음, UMP-모르폴리데이트(60㎎, 0.15m㏖)를 첨가하여 얻어진 혼합물을 70℃에서 48시간 동안 교반하였다.

그 반응 혼합물을 통하여 질소를 버블링(bubbling)시켜 용제를 제거하고, 그 잔류물(residue)을 역상크로마토그래피(C-18 실리카, 10~80% 사이에서의 스텝 구 배; 메타놀/물)에 의해 정제하였다.

그 소정의 프랙션을 회수하여 감압하에서 건조시켜 백색 고체를 얻었다.

TLC(실리카, 프로파놀/H₂0/NH₄OH, (30/20/2), R_f=0.54). MS(MALDI) : 관찰 되었음, 1485, 1529, 1618, 1706.

실시예 4

시스레인-PEG₂(2)의 제조

4.1 화합물 1의 합성

L-시스테인(93.7㎎, 0.75m㏖)을 무수메타놀(20L) 중에서 용해한 용액에 아르콘의 존재하에서 포타슘 히드록사이드(분말로서 84.2㎎, 1.5m㏖)를 첨가하였다.

얻어진 혼합액을 실온에서 30분간 교반시킨 다음, 분자량 20킬로달톨의 mPEG-0-토실레이트(Ts;1.0g, 0.05m㏖)를 수회 소량으로 나누어 2시간에 걸쳐 첨가하였다.

얻어진 그 혼합액을 실온에서 5일간 교반하고, 최전식 증발에 의해 농축하였다.

그 잔류물은 물(30㎖)로 희석하고 실온에서 2시간 동안 교반시켜 과잉의 20킬로달톤의 m-PEG-0-토실레이트를 파괴하였다.

그 다음, 그 얻어진 용액을 아세토산으로 중화시켜 그 pH를 pH 5.0으로 조정하였으며, 액상 크로마토그래피(C-18실리카) 컬럼 상에서 로딩(loading)하였다.

그 컬럼은 메타놀/물의 구배로 용리하였으며(그 생성물은 약 70% 메타놀에서 용리 함), 생성물 용리는 증발성 광산란(evaporative light scattering)에 의해 모니터링을 하였으며, 적합한 프랙션을 회수하여 물(500㎖)로 희석하였다.

이 용액을 크로마토그래피에 의해 처리시켜(이온교환, XK 50Q, BIG Beads, 300㎖, 히드록사이드 형태; 물과 물/아세트산의 구배 -0.75N), 그 적합한 프랙션의 pH는 아세트산으로 pH 6.0까지 저하시켰다.

그 다음, 이 용액을 역상컬럼(C-18 실리카) 상에서 포획(capturing)하고 위에서 설명한 바와 같이 메타놀/물의 구배로 용리하였다.

그 생성물 프랙션을 풀링(pooling)하여, 농축시키고, 수중에서 재용해시킨 다음, 냉동 조건하여 백색 고체(1)를 얻었다.

그 화합물의 구조데이터는 다음과 같다:

¹H-NMR(500㎒;D₂O)δ 2.83(t, 2H, O-C-CH ₂-S), 3.05(q, 1H, S-CHH-CHN), 3.18(q, 1H, S-CHH-CHN), 3.38(s, 3H, CH ₃O), 3.7(t, OCH ₂CH ₂O), 3.95(q, 1H, CHN). 그 생성물의 순도는 SDS PAGE에 의해 확인하였다.

4.2 화합물 2(시스테인-PEG₂)의 합성

무수 CH₂Cl₂(30㎖) 중에서 화합물 1(440㎎, 22μ㏖)을 용해한 용액이 염기성으로 될 때까지 그 용액에 트리에틸아민(~0.5㎖)을 적가하였다.

20킬로달톤의 mPEG-O-p-니트로페닐 카로보네이트(660㎎, 33μ㏖)와 N-히트록시숙신이미드(3.6㎎, 30.8μ㏖)을 CH₂Cl₂(20㎖) 중에 용해한 용액을 수회로 나누어 소량씩 실온에서 1시간에 걸쳐 첨가하였다.

그 반응 혼합액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다.

그 다음, 그 용매를 회전식 증발에 의해 제거시키고, 그 잔류물을 물(100㎖) 중에 용해하였으며, 그 pH를 1.0N NaOH를 사용하여 pH 9.5로 조정하였다.

그 염기성 용액을 실온에서 2시간 교반시킨 다음, 아세트산으로 pH 7.0까지 중화하였다.

그 다음, 그 용액은 역상크로마토그래피(C-18 실리카) 컬럼 상에서 로딩하였다.

그 컬럼은 메타놀/물의 구배로 용리하였으며(그 생성물은 약 70% 메타놀에서 용리하였 음). 생성물 용리는 증발성 광산란에 의해 모니터링 하였으며 적합한 프랙션은 회수하여 물(500mL)로 희석하였다.

이 용액을 크로마토그래피 처리(이온교환, XK 50Q, BIG Beads, 300㎖, 히드록시드 형태; 물과 물/아세트산의 구배 -0.75N)를 하였으며, 적합한 프랙션의 pH는 아세트산으로 6.0까지 저하하였다.

그 다음, 그 용액은 역상 컬럼(C-18 실리카) 상에서 포착시켜 위에서 설명한 바와 같이 메타놀/물의 구배로 용리하였다.

그 생성물 프랙션은 풀링(pooling)시켜, 농축하고, 물로 재용해시킨 다음에 동결 건조하여 백색 고체(2)를 얻었다.

상기 화합물의 구조 데이터는 다음과 같다:

¹H-NMR(500㎒;D₂0)δ 2.83(t, 2H, O-C-CH ₂-S), 2.95(t, 2H, O-C-CH ₂-S), 3.12(q, 1H, S-CHH-CHN), 3.39(s, 3H, CH ₃0), 3.71(t, OCH ₂CH ₂O). 그 생성물의 순도는 SDS PAGE에 의해 확인하였다.

실시예 5

UDP-GalNAc-6-NHCO(CH₂)₂-O-PEG-OMe(1 KDa)의 제조

갈락토사미닐-1-포스페이트-2-NHCO(CH₂)₂-O-PEG-OMe(1킬로달톤)(58㎎, 0.045m㏖)를 DMF(6㎖)와 피라린(1.2㎖) 중에서 용해하였다.

그 다음, UMP-모르폴리데이트(60㎎, 0.15m㏖)를 첨가하여, 얻어진 혼합액을 70℃에서 48시간 동안 교반하였다.

그 용매는 그 반응 혼합물을 통하여 질소를 버블링(bubbling)시켜 제거하였으며, 그 잔류물은 역상 크로마토그래피(C-18 실리카, 10~80%의 메타놀/물 사이의 스텝 구배)에 의해 정제하였다.

소정의 프랙션을 회수하여 감압하에서 건조시켜 백색 고체를 얻었다.

TLC(실리카, 프로파놀/H₂O/NH₄OH, (30/20/2), R_f=0.54), MS(MALDI) : 관찰되 었음, 1485, 1529, 1618, 1706.

SDS PAGE 처리공정(procedure)

생성물 1 및 2의 순도를 SDS PAGE에 의해 확인하였다.

4~20%의 트리스-글리신 SDS PAGE 겔(인트로겐 : Introgen)이 사용되었다. 그 샘플은 SDS 샘플버퍼와 1:1로 혼합하였으며, 일정한 전압(125V)에서 1시간 50분간 트리스-글리신 실행 버퍼(LC2675-5) 중에서 실시하였다.

전기영동 후, 그 겔을 물(100㎖)로 10분간 세척시킨 다음에 5% 바륨클로리드 수용액(100㎖)으로 10분간 세척하였다.

생성물 1 또는 2는 실온에서 0.1N 요오드용액(4.0㎖)으로 그 겔을 염색처리(staining)시켜 눈에 보이도록 조절하였으며, 그 염색처리는 물로 그 겔을 세척시켜 정지하였다.

눈에 보이도록 조절한 생성물 밴드(product bands)는 HP Scanjet 7400C로 스캐닝(scanning)시켜, 그 겔의 화상(image)은 HP Precision Scan Program으로 최적화 하였다.

본 발명은 소정의 예를 참조하여 설명하였으나, 본 발명의 다른 예와 변형은 본 발명의 범위와 기본 기술 사상에서 벗어남이 없이 이 분야의 기술자에 의해 발명해 낼 수 있다는 것을 알 수 있다.

본 특허 출원에서 인용한 모든 특허, 특허출원 및 다른 특허 공보는 여기서 본 발명을 참조하기 위하여 편집한 것이다.

Claims (23)

1. 아래에 나타낸 식 Ⅰ및 Ⅱ에서 선택된 하나의 멤버(member)인 하나의 식을 가진 화합물.

   

   위 식에서,

   R¹은 H, CH₂OR⁷, COOR⁷, 또는 OR⁷ 이고, 여기서, R⁷은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 또는 치환 또는 비치환 헤테로 알킬이며,

   R²는 H, OH, 활성기 및 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 성분에서 선택한 하나의 멤버(member)이고,

   R³, R⁴, R⁵, R⁶ 및 R^6'는 H, 치환 또는 비치환 알킬, OR⁹ 및 NHC(O)R¹⁰에서 독립적으로 선택되며, 여기서 R⁹ 및 R¹⁰은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 또는 치환 또는 비치환 헤테로 알킬이고,

   R³, R⁴, R⁵, R⁶ 및 R^6' 중 최소 하나는 하나의 폴리머 수식성분을 포함한다.
2. 제 1항에 있어서,

   R²는 아래에 나타낸 식을 가짐을 특징으로 하는 화합물.

   

   위 식에서,

   R⁸은 하나의 뉴클레오시드이다.
3. 제 2항에 있어서,

   R⁸은 시토신, 우리딘, 구아노신, 아데노신 및 티미딘에서 선택한 하나의 멤버임을 특징으로 하는 화합물.
4. 제 1항에 있어서,

   R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶ 중 최소 하나는 아래에 나타낸 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.

   

   위 식에서,

   R¹¹은 하나의 폴리머 수식성분이며,

   L은 하나의 결합과 하나의 결합기(linkinh group)에서 선택한 하나의 멤버이고,

   w는 1~6의 정수에서 선택한다.
5. 제 4항에 있어서,

   상기 결합기는 치환 또는 비치환 알킬과, 치환 또는 비치환 헤테로 알킬 성분에서 선택한 하나의 멤버인 것을 특징으로 하는 화합물.
6. 제 5항에 있어서,

   아래에 나타낸 성분은 아래에 나타낸 식을 가짐을 특징으로 하는 화합물.

   

   (성분)

   

   (식)

   위 식에서,

   X² 및 X⁴는 결합프라그멘트에서 독립적으로 선택하며,

   X^a는 하나의 결합프라그멘트이고,

   R¹² 및 R¹³은 폴리머암(polymeric arms)을 독립적으로 선택하며,

   c는 1~20의 정수이다.
7. 제 5항에 있어서,

   상기 결합기는 다음에 나타낸 식을 가짐을 특징으로 하는 화합물.

   

   위 식에서,

   X^a 및 X^b는 결합프라그멘트를 독립적으로 선택하며,

   L¹은 하나의 결합, 치환 또는 비치환 알킬 또는 치환 또는 비치환 헤데로 알킬에서 선택한 하나의 멤버이다.
8. 제 7항에 있어서,

   X^a 및 X^b는 S, SC(O)NH, HNC(O)S, SC(O)O,O,NH, NHC(O), (O)CNH 및 NHC(O)O와, OC(O)NH에서 독립적으로 선택한 결합프라그멘트(linkage fragments)인 것을 특징으로 하는 화합물.
9. 제 5항에 있어서,

   상기 링커는 하나의 아실성분으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 화합물.
10. 제 9항에 있어서,

    L-R¹¹은 아래에 나타낸 식을 가짐을 특징으로 하는 화합물.

    

    위 식에서,

    s는 0~20의 정수이고,

    R¹¹은 상기 폴리머 수식성분이다.
11. 제 1항에 있어서,

    상기 폴리머 수식성분은 아래에 나타낸 식을 가짐을 특징으로 하는 화합물.

    

    위 식에서,

    X² 및 X⁴는 결합프라그멘트에서 독립적으로 선택하며,

    X⁵는 하나의 미반응성기(non-reactive group)이고,

    R¹² 및 R¹³은 폴리머암(polymeric arms)을 독립적으로 선택한다.
12. 제 11항에 있어서,

    X² 및 X⁴는 S, SC(O)NH, HNC(O)S, SC(O)O,O,NH, NHC(O), (O)CNH 및 NHC(0)O, OC(O)NH 및 (CH₂)_gY"에서 독립적으로 선택한 결합프라그멘트인 것을 특징으로 하는 화합물.

    위 결합프라그멘트에서, g는 1~50의 정수이고, Y"는 O, S 및 NH에서 선택한 하나의 멤버이다.
13. 제 11항에 있어서,

    X⁴는 하나의 펩티드 결합이고,

    R¹³은 하나의 아미노산잔기인 것을 특징으로 하는 화합물.
14. 제 1항에 있어서,

    아래에 나타낸 식을 가짐을 특징으로 하는 화합물.

    

    위 식에서,

    D는 -OH 및 (R¹¹)_w'-L-에서 선택한 하나의 멤버이고,

    G는 H, (R¹¹)_w'-L-및-C(O)(C₁-C₆) 알킬에서 선택한 하나의 멤버이며,

    w'는 2~6의 정수이고,

    D 및 G중 최소 하나는(R¹¹)_w'-L-이다.
15. 제 14항에 있어서,

    아래에 나타낸 식 Ⅳ 및 Ⅴ를 가짐을 특징으로 하는 화합물.

    

    위 식에서,

    L^a는 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬에서 선택한 하 나의 멤버이다.
16. 제 1항에 있어서,

    아래에 나타낸 식 Ⅳ 및 Ⅴ를 가짐을 특징으로 하는 화합물.

    

    위 식에서,

    L^a는 하나의 아미노산잔기와, 2~4개의 아미노산잔기를 가진 하나의 펩티딜잔기에서 선택한 하나의 멤버이고,

    X² 및 X⁴는 결합프라그멘트에서 독립적으로 선택하며,

    X⁵는 하나의 미반응성기이며,

    R¹² 및 R¹³은 폴리머암을 독립적으로 선택한다.
17. 제 16항에 있어서,

    아래에 나타낸 식 Ⅵ 및 Ⅶ을 가짐을 특징으로 하는 화합물.

    

    위 식에서,

    X² 및 X⁴는 결합프라그멘트에서 독립적으로 선택하며,

    X^a는 하나의 결합프라그멘트이고,

    R¹² 및 R¹³은 폴리머암을 독립적으로 선택하며,

    c는 1~20의 정수이다.
18. 제 1항에 있어서,

    아래에 나타낸 식을 가짐을 특징으로 하는 화합물.

    

    위 식에서,

    AA-NH는 하나의 아미노산잔기이고,

    P는 하나의 폴리머 수식단(polymeric modifying group)이다.
19. 제 18항에 있어서,

    -AA-NH는 -CH₂NH인 것을 특징으로 하는 화합물.
20. 제 1항에 있어서,

    상기 화합물은 하나의 활성화당, 하나의 뉴클레오티드당 및 그 조합에서 선택한 하나의 멤버에서 하나의 기질의 수용체 성분으로 하나의 당성분을 전이하는 효소의 기질인 것을 특징으로 하는 화합물.
21. 제 20항에 있어서.

    상기 수용체 성분은 글리코실잔기, 아미노산잔기 및 아글리콘에서 선택한 하나의 멤버인 것을 특징으로 하는 화합물.
22. 시티딘 모노포스페이트 시알산-폴리(에틸렌글리콜)의 제조방법에 있어서,

    (a) 만노사민과 활성화된 N-보호아미노산을 상기 만노사민과 상기 활성화된 N-보호아미노산 사이에서 아미드 콘주게이트(amide conjugate)의 형성에 적합한 조건하에서 접촉하고,

    (b) 상기 아미드 콘주게이트와 피루베이트 및 시알산알도라아제를 시알산 아미드 콘주게이트로 상기 아미드 콘주게이트를 전환하는데 적합한 조건하에서 접촉 하며,

    (c) 상기 시알산 아미드 콘주게이트와 시티딘트리포스페이트 및 신테타아제(synthetase)를, 시티딘 모노포소페이트 시알산 아미드 콘주게이트의 형성에 적합한 조건하에서 접촉하고,

    (d) 상기 시티딘 모노포스페이트 시알산 아미드 콘주게이트에서 상기 N-보호기를 이탈시킴으로써 유리 아민을 생성하며,

    (e) 상기 유리아민과 활성화 PEG를 접촉함으로써, 상기 시티딘 모노포스페이트 시알산-폴리(에틸렌글리콜)을 형성하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
23. 제 22항에 있어서,

    상기 활성화된 N-보호 아미노산은 아래에 나타낸 식을 가짐을 특징으로 하는 제조방법.

    

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