MXPA06008447A - Azucares polimericos ramificados y nucleotidos de los mismos - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona azúcares, azúcares de nucleótido, azúcares activados que incluyen una o más porciones de modificación polimérica dentro de su estructura. La invención se ejemplifica por referencia a polímeros lineales y ramificados, tales como el polímero soluble en agua poli(etilenglicol).

Description

AZUCARES POLIMERICOS RAMIFICADOS Y NUCLEOTIDOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención La presente invención reside en el campo de azúcares modificados y nucleótidos de estos .

Antecedentes de la Invención La modificación in vitro después de la expresión de péptidos es una estrategia' atractiva para remediar las deficiencias de los métodos que dependen de la glicosilación controlada mediante sistemas de expresión de ingeniería; incluyendo tanto la modificación de estructuras de glicano o introducción de glicanos en sitios novedosos. Un conjunto de herramientas comprensivas de glicosiltransferasas eucarióticas recombinantes se vuelve disponible, haciendo síntesis enzimática in vitro de glicoconjugados mamíferos con patrones de glicosilación diseñados a la medida y estructuras de glicosilo posibles. Ver, por ejemplo, la Patente de EUA No. 5,876,980; 6,030,815; 5,728,554; 5,922,577; y O/9831826; US2003180835; y WO 03/031464. Las síntesis basadas en enzimas tienen las desventajas de regioselectividad y estereoselectividad. Más aún, las síntesis enzimáticas se realizan usando sustratos no protegidos . En la síntesis de carbohidratos se usan tres clases principales de enzimas, glicosiltransferasa (por REF:i74139 ejemplo, sialiltransferasas, oligosacariltransferasas, N- acetilglucosaminiltransferasas) , y glucosidasas. Las glucosidasas además se clasifican como exoglucosidasas (por ejemplo, ß-manosidasa, ß-glucosidasa) , y endoglucosidasas (por ejemplo, Endo-A, Endo-M) . Cada una de estas clases de enzimas se ha usado exitosamente de forma sintética para preparar carbohidratos. Para una revisión general, ver, Crout y colaboradores, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:98-111 (1998). Las glucosiltransferasas modifican las estructuras de oligosacáridos en glucopéptidos . Las glucosiltransferasas son efectivas para producir productos específicos con buen control estereoquímico y regioquímico. Las glucosiltransferasas se han usado para preparar oligosacáridos y para modificar estructuras de carbohidratos ligados a terminación N- y 0- , particularmente en glucopéptidos producidos en células de mamíferos . Por ejemplo, los oligosacáridos terminales de glucopéptidos se han sialilatado y/o fucosilatado completamente para proporcionar estructuras de azúcar más consistentes, las cuales mejoran la farmacodinámica del glucopéptido y una variedad de propiedades biológicas diferentes. Por ejemplo, la' ß-l,4-galactosiltransferasa se usó para sintetizar lactosamina, una ilustración de la utilidad de glucosiltransferasas en la síntesis de carbohidratos (ver, por ejemplo, Wong y colaboradores, J. Org. Chem. 47:5416-5418 (1982) ) . Más aún, los numerosos procedimientos sintéticos han hecho uso de a-sialiltransferasas para transferir ácido siálico desde ácido citidin-5' -monofosfo-N-acetilneuramínico hasta el 3 -OH ó 6-OH de galactosa (ver, por ejemplo, Kevin y colaboradores, Chem. Eur. J. 2:1359-1362 (1996)). Las fucosiltransferasas se usan en vías sintéticas para transferir una unidad de mucosa desde fuanosina-5' - difosfofucosa hasta un hidroxilo específico de un aceptor sacárido. Por ejemplo, Ichikawa preparó sialilo Lewis-X mediante un método que involucra la fucosilación de lactosamina sialilada con una fucosiltransferasa clonada (Ichikawa y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 114: 9283-9298 (1992) ) . Para una descripción de avances recientes en síntesis de glucoconjugado para uso terapéutico ver, Koeller y colaboradores, Nature Biotechnology 18:835-841.(2000). Ver también, la Patente de EUA No. 5,876,980; 6,030,815; 5,728,554; 5,922,577; y O/9831826. Además de la manipulación de la estructura de grupos glucosilo en polipéptidos, se ha desarrollado el interés en la preparación de glucopéptidos que se modifican con uno o más grupos de modificación no sacáridos, tales como polímeros solubles en agua. El poli (etilenglicol) ("PEG") es un polímero ejemplar que se ha conjugado con polipéptidos . El uso de PEG para derivar terapéuticos de péptido ha demostrado reducir la inmunogenicidad de los péptidos. Por ejemplo, la Patente de EUA No. 4,179,337 (Davis y colaboradores) describe polipéptidos no inmunogénicos, tales como enzimas y hormonas de péptido acopladas a polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol. Se usan entre 10 y 100 moles de polímero por mol de péptido. Aunque el tiempo de liberación in vivo del conjugado se prolonga con relación a aquel del polipéptido, solamente alrededor de 15% de la actividad fisiológica se mantiene. Así, la vida media de circulación prolongada es contrabalanceada por la reducción dramática en la potencia del péptido. La pérdida de actividad del péptido se atribuye directamente a la naturaleza no selectiva de las químicas utilizadas para conjugar el polímero soluble en agua. El modo principal de anexar el PEG, y sus derivados, a péptidos es un enlazamiento no específico a través de un residuo de aminoácido de péptido. Por ejemplo, la Patente de EUA No. 4,088,538 describe un conjugado de enzima-polímero activo enzimáticamente de una enzima enlazada covalentemente a un PEG. Similarmente, la Patente de EUA No. 4,496,689 describe un complejo acoplado covalentemente de inhibidor de a-1 proteinasa con un polímero tal como PEG. Abuchowski y colaboradores, (J. Biol. Chem. 252: 3578 (1977) describe el acoplamiento covalente de MPEG a un grupo amina de albúmina de suero de bovino. La Patente de EUA No. 4,414,147 describe un método de volver al interferón menos hidrofóbico por conjugación de este a un anhídrido de un ácido dicarboxílico, tal como poli(etilen succínico anhídrido). La PCT WO 87/00056 describe la conjugación de PEG y polioles poli (oxietilatados) con tales proteínas como interferón-ß, interleucina-2 e inmunotoxinas . La EP 154,316 describe y reivindica linfocinas modificadas químicamente, tales como IL.2 que contienen PEG enlazado directamente a por lo menos un grupo amino primario de la linfocina. La Patente de EUA No. 4,055,635 describe las composiciones farmacéuticas de un complejo soluble en agua de una enzima proteolítica ligada covalentemente a una sustancia polimérica tal como un polisacárido. Otro modo de acoplar PEG a péptidos es a través de la oxidación no específica de residuos de glucosilo en un glucopéptido. El azúcar oxidado se utiliza como una ubicación del cromosoma para acoplar una porción de PEG al péptido. Por ejemplo M'Timkulu (WO 94/05332) describe el uso de un a ino-PEG para agregar PEG a una glucoproteína. Las porciones de glucosilo se oxidan aleatoriamente a los aldehidos que corresponden, los cuales se acoplan posteriormente al amino-PEG. En cada uno de los métodos descritos anteriormente, el poli (etilenglicol) se agrega de una manera aleatoria no específica a residuos reactivos en una columna de péptido. Para la producción de péptidos terapéuticos, evidentemente es deseable utilizar una estrategia de derivación que resulta en la formación de un producto esencialmente homogéneo, fácilmente caracterizable, etiquetado específicamente. Una ruta que . promete preparar péptidos etiquetados específicamente es a través del uso de enzimas, tal como glucotransferasas para anexar una porción de azúcar modificada en un péptido. La porción de azúcar modificada debe funcionar como un sustrato para la glucosiltransferasa y activarse apropiadamente. Por lo tanto, son deseables las rutas sintéticas que proporcionan acceso fácil a azúcares modificados activados. La presente invención proporciona una ruta tal .

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona especies poliméricas, azúcares y azúcares activados conjugados con aquellas especies poliméricas y azúcares de nucleótido que incluyen estos polímeros . Las especies poliméricas incluyen ambas especies solubles en agua e insolubles en agua. Más aún, los polímeros son ya sea polímeros de cadena ramificada o lineal. Las porciones de azúcar ejemplares incluyen estructuras de cadena lineal y cíclicas y aldosas y cetosas . El grupo de modificación polimérico se puede acoplar a cualguier posición de la porción de azúcar. En la descripción de a continuación, la invención se ejemplifica por referencia a una modalidad en la cual el grupo de modificación polimérico se anexa a C-5 de una furanosa o C-6 de una piranosa. Los expertos apreciarán que el enfoque de la discusión es para claridad de la ilustración, la porción polimérica puede ser anexada a otras posiciones de ambas piranosas y furanosas usando los métodos establecidos en la presente y los métodos reconocidos de la técnica. En una modalidad ejemplar, la invención proporciona un azúcar o un nucleótido de azúcar que se conjuga con un polímero : I II En las fórmulas I y II, R1 es H, CH2OR7, COOR7 u OR7, en los cuales R7 representa H, alquilo sustituido o no sustituido o heteroalquilo sustituido o no sustituido. R2 es H, OH, NH o una porción que incluye un nucleótido. Una especie R2 ejemplar de acuerdo con esta modalidad tiene la fórmula: en la cual R8 es un nucleósido. Los símbolos R3, R4, R5, R6, y Re' independientemente representan H, alquilo sustituido o no sustituido, OR9, NHC(0)R10. El índice d es O ó 1. R9 y R10 independientemente se seleccionan de H, alquilo sustituido o no sustituido, heterolaquilo sustituido o no sustituido o ácido siálico. Por lo menos uno de R3, R4, R5, R6, y Rs' incluye la porción de modificación polimérica, por ejemplo, PEG. En una modalidad ejemplar, R6, y R6' , junto con el carbono al cual están acopladas son componentes de la cadena lateral del ácido siálico. En una modalidad ejemplar adicional, esta cadena lateral es funcional con la porción de modificación polimérica. En una modalidad ejemplar, la porción polimérica se enlaza al núcleo de azúcar, generalmente a través de un heteroátomo en el núcleo, a través de una ligadura, L, como se muestra a continuación: R11 es la porción polimérica y L se selecciona a partir de un enlace y un grupo de ligadura. El índice w representa un entero seleccionado de 1-6, preferiblemente 1-3 y más preferiblemente 1-2. Los grupos de ligadura ejemplares incluyen porciones de alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido y ácido siálico. Un componente ejemplar de la ligadura es una porción de acilo.

Cuando L es un enlace, este se forma entre un grupo funcional reactivo en un precursor de R11 y un grupo funcional reactivo de reactividad complementaria en un precursor de L.

L puede estar en lugar en el núcleo- sacárido antes de la reacción con R11. Alternativamente, R11 y L se pueden incorporar en un cásete previamente formado que se acopla posteriormente a un núcleo de sacárido. Como se establece en la presente, la selección y preparación de precursores con grupos funcionales reactivos apropiados está dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica. Más aún, el acoplamiento de los precursores prosigue por químicas que son bien comprendidas en la técnica. En una modalidad ejemplar L es un grupo de ligadura que se forma a partir de un aminoácido, o péptido pequeño (por ejemplo, residuos de 1-4 aminoácidos) que proporciona un azúcar modificado en el cual la porción de modificación polimérica se acopla a través de una ligadura de alquilo sustituida. Una ligadura ejemplar es la glicina. En una modalidad ejemplar, Rs incluye la porción de modificación polimérica. En otra modalidad ejemplar, Re incluye tanto la porción de modificación polimérica como una ligadura, L, que une la porción de modificación al resto de la molécula. En una modalidad ejemplar, la porción de modificación polimérica es una estructura ramificada que incluye dos o más cadenas poliméricas acopladas a la porción central . Una estructura ejemplar de un precursor de porción de modificación polimérica útil de acuerdo con esta modalidad de la invención tiene la fórmula: Los azúcares y azúcares de nucleótido de acuerdo con esta fórmula son polímeros solubles en agua esencialmente puros .

X3' es una porción que incluye un grupo funcional ionizable (por ejemplo, COOH, etc.) u otro grupo funcional reactivo, ver, por ejemplo, infra. C es carbono. X5 preferiblemente es un grupo no reactivo (por ejemplo, H, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido) . R12 y R13 son brazos poliméricos seleccionados independientemente, por ejemplo, brazos poliméricos no reactivos, no peptídicos. R2 y R4 son fragmentos ligados que preferiblemente son esencialmente no reactivos bajo condiciones fisiológicas, las cuales pueden ser las mismas o diferentes. Alternativamente, estas ligaduras pueden incluir una o más porciones que se diseñan para degradarse bajo condiciones relevantes fisiológicamente, por ejemplo, esteres, bisulfuros, etc. X2 y X4 unen brazos poliméricos R12 y R13 a C. Cuando X3' se hace reaccionar con un grupo funcional reactivo de reactividad complementaria en una ligadura, azúcar o cásete de azúcar de ligadura, X3' se convierte en un componente de fragmento de ligadura X3. Mediante la reacción del precursor con un azúcar apropiado o especies de ligadura de azúcar, la invención proporciona azúcares y azúcares de nucleótido que tienen las fórmulas : IV V en la cual la identidad de los radicales representados por los diferentes símbolos es la misma que aquella descrita anteriormente en la presente. La es un alquilo sustituido o no sustituido o porción de heteroarilo sustituido o no sustituido. En una modalidad ejemplar, La es una porción de la cadena lateral de ácido siálico que es funcional con la porción de modificación polimérica como se muestra. La porción de modificación polimérica comprende dos o más unidades de repetición que pueden ser solubles en agua o esencialmente insolubles en agua. Los polímeros solubles en agua ejemplares de uso en los compuestos de la invención incluyen PEG, por ejemplo, m-PEG, PPG, por ejemplo, m-PPG, ácido polisiálico, poliglutamato, poliaspartato, polilisina, polietielenimina, polímeros biodegradables (por ejemplo, poliláctido, poliglicérido) , y PEG funcionalizado, por ejemplo, PEG funcionalizado terminal. La porción de azúcar de los conjugados poliméricos de la invención se selecciona de ambas furanosas y hexanosas naturales y no naturales . Los sacáridos no naturales opcionalmente incluyen una porción de hidroxilo y/o amina alquilada o acilada, por ejemplo, éteres, esteres y substituyentes de amida en el anillo. Otros sacáridos no naturales incluyen un substituyente de H, hidroxilo, éter, éster o amida en una posición en el anillo en la cual tal substituyente no está presente en el sacárido natural. Alternativamente, el carbohidrato carece de un substituyente que podría ser encontrado en el carbohidrato del cual se deriva su nombre, por ejemplo, azúcares desoxi. Todavía más ejemplarmente los azúcares no naturales incluyen ambos carbohidratos oxidados (por ejemplo, ácidos -ónicos y -urónicos) y reducidos (alcoholes de azúcar) . La porción de azúcar puede ser un mono-, oligo- o poli-sacárido. Los azúcares naturales ejemplares de uso en la presente invención incluyen glucosa, glucosalina, galactosa, galactosamina, mucosa, ma osa, manosamina, xilanosa, ribosa, N-acetil glucosa, N-acetil glucosalina, N-acetil galactosa, N-acetil galactosamina, y ácido siálico. Un conjugado basado en ácido siálico ejemplar tiene la fórmula: en la cual AA es aquella porción de un residuo de aminoácido que no incluye la porción de carboxilo y NP es un fosfato de nucleótido . ONP también se puede reemplazar mediante una porción de activación para formar un azúcar activado. Como se apreciará por aquellos de experiencia en la técnica, la ligadura de la porción modificada polimérica también se puede acoplar a la cadena lateral de ácido siálico en C-6, C-7 y/o C-9. También se proporciona un método sintético para la producción de un conjugado de ácido siálico-PEG activado que es un sustrato apropiado para una enzima, por ejemplo, glucosiltransferasa. El método incluye las etapas: (a) poner en contacto la manosamina con un aminoácido N-protegido, activado (o un aminoácido funcionalizado con una porción de modificación polimérica, un precursor de ligadura o un cásete de porción de modificación polimérica de ligadura) bajo condiciones apropiadas para formar un conjugado de amina entre la manosamina y el aminoácido N-protegido; (b) poner en contacto el conjugado de amina con piruvato y aldolasa de ácido siálico bajo condiciones apropiadas para convertir el conjugado de amida en un conjugado de amida de ácido siálico; (c) poner en contacto el conjugado de amida de ácido siálico con trifosfatos de citidina, y una sintetasa bajo condiciones apropiadas para formar un conjugado de amida de ácido siálico de monofosfato de citidina; (d) remover el grupo de N- protección del conjugado de amida de ácido siálico de monofosfato de citidina, produciendo de esa manera una amina libre; y (e) poner en contacto la amina libre con un PEG activado (cadena lineal o ramificada) , formando de esa manera el ácido siálico de monofosfato de citidina- poli (etilenglicol) . El nucleósido se puede seleccionar a partir de nucleósidos tanto natural como no natural. Los nucleósidos naturales ejemplares de uso en la presente invención incluyen citosina, timina, guanina, adenina y uracil. La técnica está llena con estructuras de nucleósidos no naturales y métodos de producción de estos. Los nucleótidos de azúcar modificados ejemplares de la invención incluyen GDP-Man, GDP-Fuc, UDP-Gal, UDP-GalNAc, UDP-Glc, UDP-GlcNAc, UDP-Glc, UDP-GlcUA y CMP-SA y similares modificados poliméricamente . Ejemplos incluyen UDP-Gal-2' -NH-PEG, UDP-Glc-2'-NH-PEG, CMP-5 ' -PEG-SA y similares. Los compuestos abarcados por la invención incluyen aquellos en los cuales la porción L-R11 se conjuga a una • furanosa o una piranosa, por ejemplo, en C-5 de furanosa o en C-6 de una piranosa, generalmente a través de un heteroátomo acoplado a este átomo de carbono. Cuando el compuesto de la invención es un azúcar nucleótido, o un azúcar activado, los conjugados poliméricos de los azúcares nucleótidos generalmente son sustratos para una enzima que transfiere la porción de azúcar y su substituyente polimérico sobre una porción aceptora apropiada de un sustrato. En consecuencia, la invención también proporciona sustratos modificados por glucoconjugación usando un conjugado polimérico de un azúcar nucleótido, o azúcar activado, y una enzima apropiada. Los sustratos que pueden ser glucoconjugados usando un compuesto de la invención incluyen péptidos, por ejemplo, glucopéptidos, péptidos, lípidos, por ejemplo, glucolípidos y aglucones (esfingosinas, ceramidas) .

Breve Descripción de las Figuras FIG. 1A-1N son tablas de sialiltransferasas para las cuales los nucleótidos de ácido siálico modificados seleccionados y los azúcares activados son sustratos. FIG. 2 es un esguema de reacción general de la invención para la preparación de un conjugado de ácido siálico-poli (etilenglicol) . FIG. 3 es un esquema de reacción de la invención para la preparación de un conjugado de ácido siálico-poli (etilenglicol) . FIG. 4 muestra ejemplos específicos de un nucleótido de ácido siálico que es modificado con un polímero soluble en agua.

FIG. 5 muestra ejemplos específicos de un nucleótido de ácido siálico que es modificado con un polímero soluble en agua.

Descripción Detallada de la Invención y las Modalidades Abreviaturas . PEG, poli (etilenglicol) , ramificado y no ramificado, por ejemplo, m-PEG, metoxi-poli (etilenglicol) ; PPG, poli (propilenglicol) , ramificado y no ramificado, por ejemplo, m-PPG, metoxi-poli (propilenglicol) ; Fue, fucosilo; Gal, galactosilo; GalNAc, N-acetilgalactosaminilo; Glc, glucosilo; GlcNAc, N-acetilglucosaminilo; Man, manosilo; ManAc, acetato de manosaminilo; Sia, ácido siálico; y NeuAc, N-acetilneuraminilo .

Definiciones El término "ácido siálico" se refiere a cualquier miembro de una familia de azúcares carboxilados de nueve carbonos. El miembro más común de la familia de ácido siálico es el ácido N-acetil-neuramínico (ácido 2-ceto-5-acetamido-3, 5-dideoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-l-ónico (a menudo abreviado como Neu5Ac, o NANA) . Un segundo miembro de la familia es el ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5Gc o NeuGc) , en el cual el grupo N-acetilo de NeuAc se hidroxilata. Un tercer miembro de la familia del ácido siálico es el"' ácido 2-ceto-3-desoxi-nonulosónico (KDN) (Nadano y colaboradores, (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550- 11557; Kanomori y colaboradores, J. Biol. Chem. 265: 211811- 21819 (1990) ) . También están incluidos los ácidos siálicos 9- sustituidos tales como un 9-0-C-C6acil-Neu5Ac como 9-0- lactil-Neu5Ac ó 9-0-acetil-Neu5Ac, 9-deoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-desoxi-Neu5Ac. Para revisión de la familia del ácido siálico, ver, por ejemplo, Varki, Glicobiology 2:25-40 (1992); Sialic Acids : Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992) ) . La síntesis y uso de los compuestos de ácido siálico en un procedimiento de sialilación se describen en la solicitud internacional WO 92/16640, publicada el 1 de Octubre de 1992. Como se usa en la presente, el término "azúcar modificada" , se refiere a un carbohidrato que se presenta naturalmente o no naturalmente que se agrega enzimáticamente en un aminoácido o un residuo de glucosilo de un péptido en un proceso de la invención. El azúcar modificado se selecciona de una variedad de sustratos de enzima que incluyen, pero no se limitan a nucleótidos de azúcar (mono-, di-, y tri-fosfatos) , azúcares activados (por ejemplo, halogenuros de glucosilo, mesilatos de glucosilo) y azúcares que son ya sea activados o nucleótidos. El "azúcar modificado" se funcionaliza covalentemente con un "grupo de modificación" . Los grupos de modificación útiles incluyen, pero no se limitan a, polímeros solubles en agua, porciones terapéuticas, porciones diagnósticas, biomoléculas y similares . El grupo de modificación preferiblemente es uno que no se presenta naturalmente, o un carbohidrato no modificado. La ubicación del cromosoma de funcionalización con el grupo de modificación se selecciona de manera que este no previene el "azúcar modificado" de ser agregado enzimáticamente a un péptido. El término "soluble en agua" se refiere a porciones que tienen el mismo grado detectable de solubilidad en agua. Los - métodos para detectar y/o cuantificar la solubilidad en agua son bien conocidos en la técnica. Los polímeros solubles en agua ejemplares incluyen péptidos, sacáridos, poli (éteres) , poli (aminas) , poli (ácidos carboxílicos) y similares. Los péptidos pueden tener secuencias mezcladas o estar compuestos de un aminoácido único, por ejemplo, poli (lisina) . Un polisacárido ejemplar es el poli (ácido siálico). Un poli (éter) ejemplar es el poli (etilenglicol) , por ejemplo, mPEG. La poli(etilen imina) es una poliamina ejemplar, y el ácido poli (acrílico) es un poli (ácido carboxílico) representativo. Los polímeros ejemplares comúnmente están compuestos de 2-8 unidades poliméricas. La columna de polímero del polímero soluble en agua puede ser poli (etilenglicol) (esto es, PEG). Sin embargo, se debe entender que otros polímeros relacionados también son apropiados para uso en la práctica de esta invención y que el uso del término PEG o poli (etilenglicol) se pretende que sea inclusivo y no exclusivo en este respecto. El término PEG incluye poli (etilenglicol) en cualquiera de sus formas, incluyen PEG alcoxi, PEG disfuncional, PEG de brazos múltiples, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG pendiente (esto es, PEG o polímeros relacionados que tiene uno o más grupos funcionales pendientes del soporte de polímero) , o PEG con ligaduras degradables en él. La columna de polímero puede ser lineal o ramificada. Las columnas de polímero ramificadas generalmente son conocidas en la técnica. Comúnmente, un polímero ramificado tiene una porción de núcleo de rama central y una pluralidad de cadenas de polímero lineal ligadas al núcleo de rama central . El PEG comúnmente se usa en formas ramificadas que se pueden preparar por adición de óxido de etileno a varios polioles, tales como glicerol, pentaeritritol y sorbitol. La porción de rama central también se puede derivar de varios aminoácidos, tales como lisina. El poli (etilenglicol) ramificado se puede representar en la forma de R(-PEG-OH)ra en la cual R representa la porción de núcleo, tal como glicerol o pentaeritritol, y m representa el número de brazos. Las moléculas de PEG de brazos múltiples, tales como aquellas descritas en la Patente de EUA No. 5,932,462, la cual está incorporada por referencia en la presente en su totalidad, también se pueden usar como la columna de polímero. Muchos otros polímeros- también son apropiados para la invención. Las columnas de polímero que son no peptídicas y solubles en agua, con desde 2 hasta alrededor de 300 terminaciones, son particularmente útiles en la invención. Ejemplos de polímeros apropiados incluyen, pero no se limitan a, otros poli (alquilenglicoles) , tales como poli (propilenglicol) ("PPG"), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol y similares, poli (poliol oxietilatado) , poli (alcohol olefínico) , poli (vinilpirrolidona) , poli (hidroxipropilmetacrilamida) , poli (ácido a-hidroxi) , poli (alcohol de vinilo), polifosfazeno, polioxazolina, poli (N-acriloilmorfolina) , tal como se describe en la Patente de EUA No. 5,629,384, la cual está incorporada por referencia en la presente en su totalidad, y copolímeros, terpolímeros y mezclas de estos. Aunque el peso molecular de cada cadena de soporte de polímero puede variar, comúnmente está en el rango de desde alrededor de 100 Da hasta alrededor de 100,000 Da, a menudo desde alrededor de 6,000 Da hasta alrededor de 80,000 Da.

El término "glucoconjugación" , como se usa en la presente, se refiere a la conjugación mediada enzimáticamente de una especie de azúcar modificada a un aminoácido o residuo de glucosilo de un polipéptido, por ejemplo, una hormona de crecimiento mutante de la presente invención. Un subgénero de "glucoconjugación" es "gluco-PEGilación" , en el cual el grupo de modificación del azúcar modificado es poli (etilenglicol) , y alquilo derivado (por ejemplo, m-PEG) o derivado reactivo (por ejemplo, H2N-PEG, HOOC-PEG) de este. El término, "grupo de ligadura de glucosilo", como se usa en la presente se refiere a un residuo de glucosilo para el cual ún grupo de modificación (por ejemplo, porción de PEG, porción terapéutica, biomolécula) se acopla covalentemente; el grupo de ligadura de glucosilo une al grupo de modificación al resto del conjugado. En los métodos de la invención, el "grupo de ligadura de glucosilo" se vuelve covalentemente acoplado a un péptido glucosilatado o no glucosilatado, ligando de esa manera al agente a un aminoácido y/ o residuo de glucosilo en el péptido. Un "grupo de ligadura, de glucosilo" generalmente se deriva de un "azúcar modificada" por el acoplamiento enzimático del "azúcar modificada" a un aminoácido y/o residuo de glucosilo del péptido . El grupo de ligadura de glucosilo puede ser una estructura derivada de sacárido que se degrada durante la formación del cásete de azúcar modificada del grupo de modificación (por ejemplo, oxidación?formación de base Schiff?reducción) , o el grupo de ligadura de glucosilo puede ser intacto. Un "grupo de ligadura de glucosilo intacto" se refiere a un grupo de ligadura que se deriva de una porción de glucosilo en el cual el monómero de sacárido que liga el grupo de modificación y al resto del conjugado no se degrada, por ejemplo, por metaperyodato de sodio. Los "grupos de ligadura de glucosilo intactos" de la invención se pueden derivar de un oligosacárido que se presenta naturalmente por adición de la o las unidades de glucosilo o remoción de una o más unidades de glucosilo de una estructura de sacárido precursor . Donde los grupos substituyentes se especifican por sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, igualmente abarcan los substituyentes químicamente idénticos, los cuales pueden .resultar de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo, -CH20- se pretende también que recite -0CH2- . El término "alquilo" , por sí mismo o como parte de otro substituyente significa, a menos que se establezca de otra manera, una cadena lineal o ramificada, o radical de hidrocarburo cíclico, o combinación de estos, los cuales pueden ser saturados completamente, mono- o poliinsaturados y pueden incluir radicales di- y multivalentes, que tienen el número de átomos de carbono designados (esto es, C?-C?0 significa de uno a diez carbonos) . Ejemplos de radicales de hidrocarburo saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciciohexilo, (ciclohexil) metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, y similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más enlaces dobles o enlaces triples. Ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no están limitados a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2- (buradienilo) , 2, 4-pentadienilo, 3- (1, 4-pentadienilo) , etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo, y los homólogos e isómeros mayores. El término "alquilo", a menos que se indique lo contrario, también se pretende que incluya aquellos derivados de alquilo definidos en más detalle a continuación, tales como "heteroalquilo" . Los grupos alquilo que están limitados a grupos de hidrocarburo se denominan "homoalquilo" . El término "alquileno" por sí mismo o como parte de otro substituyente significa un radical divalente derivado de un alcano, como se ejemplifica, pero no limitado, por CH2CH2CH2CH2-, y además incluye aquellos grupos descritos a continuación como "heteroalquileno" . Comúnmente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá desde 1 hasta 24 átomos de carbono, siendo preferidos en la presente invención aquellos grupos que tienen 10 o menos átomos de carbono. Un "alquilo menor" o "alquileno menor" es un grupo alguilo o alquileno de cadena más corta, que generalmente tienen ocho o menos átomos de carbono . Los términos "alcoxi" , "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) se usan en cualquier sentido convencional, y se refiere a aquellos grupos alquilo acoplados al resto de la molécula vía un átomo de oxígeno, un grupo amino, o un átomo de azufre, respectivamente. El término "heteroalquilo" , por sí mismo o en combinación con otro término, significa, a menos que se establezca de otra manera, una cadena lineal o ramificada estable, o radical de hidrocarburo cíclico, o combinaciones de estos, que consisten del número establecido de átomos de carbono y por lo menos un heteroátomo seleccionados del grupo que consiste de 0, N, Si y S, y en donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden ser oxidados opcionalmente y el heteroátomo de nitrógeno opcionalmente puede ser cuaternizado. El o los heteroátomos de O, N y S y Si se pueden colocar en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la cual el grupo alquilo se acopla al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, -CH2-CH2-0-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S (O) -CH3, -CH2-CH2-S (O) 2-CH3, -CH=CH-0-CH3, -SI(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, y -CH=CH-N (CH3) -CH3. Hasta dos átomos pueden ser consecutivos, tales como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-0-Si (CH3) 3. Similarmente, el término "heteroalquileno" por sí mismo o como parte de otro substituyente significa un radical divalente derivado de heteroalquilo, como se ejemplifica, pero no limitado por, - CH2-S-CH2-CH2- y-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para grupos heteroalquilenos, los heteroátomos también pueden ocupar cualquiera o ambas de las terminaciones de cadena (por ejemplo, alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquilendiamino, y similares) . Todavía además, para grupos de ligadura de alquileno y heteroalquileno, ninguna orientación del grupo de ligadura se implica por la dirección en la cual la fórmula del grupo de ligadura se escribe. Por ejemplo, la fórmula -C(0)2R'- representa a ambos: -C(0)2R'- y - R'C(0)2-. Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", por ellos mismo o en combinación con otros términos, representan, a menos que se establezca de otra manera, las versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Adicionalmente, para heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la cual el heterociclo se acopla al resto de la molécula. Ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciciohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo, y similares. Ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, 1- (1,2,5, 6-tetrahidropiridilo) , 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1-piperazinilo, 2-piperazinilo, y similares . Los términos "halo" o "halógeno" , por ellos mismos o como parte de otro substituyente, significan, a menos que se establezca de otra manera, un átomo de flúor, cloro, bromo, o yodo. Adicionalmente, los términos tales como "haloalquilo", se pretende que incluyan monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, el término "halo (C?-C4) alquilo" se pretende que incluya, pero no se limita "a, trifluorometilo, 2,2,2- trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo, y similares. El término "arilo" significa, a menos que se establezca de otra manera, un substituyente aromático poliinsaturado que puede ser un anillo único o anillos múltiples (preferiblemente desde 1 hasta 3 anillos) , los cuales se funden juntos o se ligan covalentemente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen desde uno hasta cuatro heteroátomos seleccionados de N, O, y S, en donde los átomos de nitrógeno y azufre opcionalmente se oxidan, y el o los átomos de nitrógeno son opcionalmente cuaternizados . Un grupo heteroarilo se puede acoplar al resto de la molécula a través de un heteroátomo. Ejemplos sin limitación de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilp, 4-bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, -imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tientilo, 3-tienilo, 2- piridilo, 3 -piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-benzimidazolilo, 5-indoilo, 1- isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5- quinoxalinilo, 3-quinolilo, tetrazolilo, benzo [b] furanilo, benzo [b] tienilo, 2, 3-dihidrobenzo [1,4] dioxin-6-ilo, benzo [1, 3] dioxol-5-ilo y 6-quinolilo. Los substituyentes de cada uno de los sistemas de anillo de arilo y heteroarilo anotados anteriormente se seleccionan del grupo de substituyentes aceptables descritos a continuación. Para abreviar, el término "arilo" cuando se usa en combinación con otros términos (por ejemplo, ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluye ambos anillos arilo y heteroarilo como se definió anteriormente. Así, el término "arilalquilo" se pretende que incluya aquellos radicales en los cuales un grupo arilo se acopla a un grupo alquilo (por ejemplo, bencilo, fenilo, piridilmetilo y similares) incluyendo aquellos grupos alquilo en los cuales un átomo de carbono (por ejemplo, un grupo metileno) se ha reemplazado por, por ejemplo, un átomo de oxígeno (por ejemplo, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3- (1-naftiloxi) propilo, y similares . Cada uno de los términos anteriores (por ejemplo, "alquilo", "heteroalquilo", "arilo" y "heteroarilo") se pretende que incluyan ambas formas sustituidas y no sustituidas del radical indicado. Los substituyentes preferidos para cada tipo de radical se proporcionan a continuación. Los substituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (que incluyen aquellos grupos a menudo se refieren como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, y heterocicloalquenilo) generalmente son referidos como "substituyentes del grupo alquilo", y pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados de, pero no limitados a: -OR' , =0, =NR' , =N-0R' , -NR'R'', -SR' , -halógeno, -SiR'R"R"', -0C(0)R', -C(0)R', -C02R' , -CONR'R", -0C(0)NR'R' ' , -NR"C(0)R', -NR' -C (0) NR" R' ' ' , -NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R' 'R' ' ' )=NR' " ' , -NR-C (NR' R' ' ) =NR' ' ' , -S(0)R', S(0)2R', -S(0)2NR'R' ' , NRS02R' , -CN y -N02 en un número en el rango desde cero hasta (2m'+l), donde m' es el total del número de átomos de carbono en tal radical. R' , R' ' , R' ' ' y R' ' ' ' cada uno preferiblemente de forma independiente se refieren a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, por ejemplo, arilo sustituido con 1-3 halógenos, alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R independientemente se selecciona como son cada uno de los grupos R' , R' ' , R' ' ' y R' ' ' ' cuando más de uno de estos grupos está presente. Cuando R' y R' ' se acoplan al mismo átomo de nitrógeno, pueden ser combinados con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5-, 6-, ó 7- miembros. Por ejemplo, -NR'R'' se pretende que incluyan, pero no se limiten a, 1-pirrolidinilo y 4- morfolinilo. De la descripción anterior de los substituyentes, un experto en la técnica entenderá que el término "alquilo" se pretende que incluya grupos que incluyen átomos de carbono enlazados a grupos diferentes a grupos de hidrógeno, tales como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y - CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C (O) CH20CH3, y similares) . Similar a los substituyentes descritos para el radical alquilo, los substituyentes para los grupos arilo y heteroarilo generalmente son referidos como "substituyentes del grupo arilo". Los substituyentes se seleccionan de, por ejemplo:, halógeno, -OR' , =0, =NR' , =N-0R' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -SÍR'R"R'", -0C(0)R', -C(0)R', -C02R' , -CONR'R", -0C(0)NR'R' ' , -NR"C(0)R', -NR' -C (0) NR" R' " , -NR"C(0)2R', -NR-C (NR'R' 'R' " )=NR' " ' , -NR-C (NR' R" ) =NR" ' , -S(0)R', S(0)2R', -S(0)2NR'R", NRS02R' , -CN y -N02, -R' , -N3, -CH(Ph)2, fluoro (C?-C4) alcoxi, y fluoro (C1-C4) alquilo, en un número en el rango desde cero hasta el número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y donde R' , R" , R' " y R' ' ' ' preferiblemente de forma independiente se seleccionan de hidrógeno, alguilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, y heteroarilo sustituido o no sustituido. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R independientemente se selecciona como son cada uno de los grupos R' , R" , R' " y R' ' ' ' cuando más de uno de estos grupos está presente. En los esquemas que siguen, el símbolo X representa "R" como se describe anteriormente . Dos de los substituyentes en los átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo opcionalmente pueden ser reemplazados con un substituyente de la fórmula -T-C(O)- (CRR')q-U-, en donde T y U independientemente son -NR- , -O-, -CRR'- o un enlace único, y q es- un entero de desde 0 hasta 3. Alternativamente, dos de los substituyentes en los átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo opcionalmente se pueden reemplazar con un substituyente de la fórmula -A- (CH2)r-B-, en donde y B independientemente son -CRR'-, -O-, -NR-, -S_, -S(O)-, -S(0)2-, -S(0)2NR'- o un enlace sencillo, y r es un entero de desde 1 hasta . Uno de los enlaces sencillos del anillo nuevo así formado opcionalmente se puede reemplazar con un enlace doble. Alternativamente, dos de los substituyentes en los átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo opcionalmente se pueden reemplazar con un substituyente de la fórmula - (CRR' ) 5-X- (CR"R" ' ) a- , donde s y d independientemente son enteros de desde 0 hasta 3, y X es - O-, -NR'-, -S-, -S(0)-, -S(0)2NR'-. Los substituyentes R, R' , R' ' y R' " preferiblemente son de forma independiente seleccionados de hidrógeno o (C?-C6) alquilo sustituido o no sustituido. Como se usa en la presente, el término "heteroátomo" se pretende que incluya oxígeno (O), nitrógeno (N) , azufre (S) y silicio (Si) . El uso de derivados reactivos de PEG (u otras ligaduras) para acoplar uno o más porciones de péptido a la ligadura están dentro del alcance de la presente invención. La invención no se limita por la identidad del análogo PEG reactivo. Muchos derivados activos de poli (etilenglicol) están disponibles comercialmente y en la literatura. Está dentro de las capacidades de un experto seleccionar, y sintetizar si es necesario, un derivado de PEG activado apropiado con el cual preparar un sustrato útil en la presente invención. Ver, Abuchwski y colaboradores, Cáncer Biochem. Biophys., 7:175-186 (1984); Abuchowski y colaboradores, J. Biol. Chem. 252:3582-3586 (1977); Jackson y colaboradores, Anal. Biochem. 165:114-127 (1987); Koide y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Común., 111: 659-667 (1983)), tresilato (Nilsson y colaboradores, Methods Enzymol., 104: 56-69 (1984); Delgado y colaboradores, Biotechnol. Appl. Biochem. 12: 119-128 (1990)); esteres activos derivados de N-hidroxisuccinimida (Buckman y colaboradores, Makromol. Chem., 182: 1379-1384 (1981); Joppich y colaboradores, Makromol. Chem., 180: 1381-1384 (1979); Abuchowski y colaboradores, Cáncer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984); Katre y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 84: 1487-1491 (1987); Kitamura y colaboradores, Cáncer Res., 51:4310-4315 (1991); Boccu y colaboradores, Z. Naturforsch. , 38C: 94-99 (1983), carbonatos (Zalpsky y colaboradores, Poli (etilenglicol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, Harris, Ed. , Plenum Press, New York, 1992, pp. 347-370; Zalipsky y colaboradores, Biotechnol. Appl. Biochem., 15: 100-114 (1992); Veronese y colaboradores, Appl. Biochem. Biotech., 11: 141-152 (1985)), formatos de imidazolilo (Beauchamp y colaboradores, Anal. Biochem., 131: 25-33 (1983); Berger y colaboradores, Blood, 71: 1641-1647 (1988)), 4-ditiopiridinas (Woghiren y colaboradores, Bioconjugato Chem., 4: 314-318 (1993)), isocianatos (Byun y colaboradores, ASAIO Journal, M649-M-653 (1992)) y epóxidos (Patente de EUA No. 4,806,595, emitida para Noishiki y colaboradores, (1989) . Otros grupos de ligadura incluyen la ligadura de uretano entre los grupos amino y el PEG activado. Ver, Veronese y colaboradores, Appl. Biochem. Biotechnol., 11: 141-152 (1985) . El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos que ocurren naturalmente y sintéticos, además de análogos de aminoácido y miméticos de aminoácido. Los aminoácidos que ocurren naturalmente son aquellos codificados por el código genético, además de aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, ?- carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácido se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica como un aminoácido que se presenta naturalmente, esto es, un carbono a que se enlaza a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, sulfonio de metilo metionina. Tales análogos han modificado los grupos R (por ejemplo, norleucina) o soportes de péptido modificados, pero retienen la misma estructura química básica como un aminoácido que se presenta naturalmente. "Imitadores de aminoácido" se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona en una manera similar a un aminoácido que se presenta naturalmente. "Péptido" se refiere a un polímero en el cual los monómeros son aminoácidos, análogos de aminoácido y/o miméticos de aminoácido y se unen juntos a través de enlaces de amida, alternativamente se refieren como un polipéptido. Adicionalmente, los aminoácidos no naturales, por ejemplo, ß-alanina, fenilglicina y homoarginina también se incluyen. Los aminoácidos que no son codificados por gen también pueden ser usados en la presente invención. Además, los aminoácidos que se han modificado para incluir los grupos reactivos, sitios de glucosilación, polímeros, porciones terapéuticas, biomoléculas y similares también se pueden usar en la invención. Todos los aminoácidos usados en la presente invención pueden ser ya sea isómeros D- o L- . El isómero L generalmente es el preferido. Además, otros peptidomiméticos también se usan en la presente invención. Como se usa en la presente, "péptido" se refiere a ambos péptidos glucosilatados y no glucosilatados . También están incluidos péptidos que son glucosilatados incompletamente mediante un sistema que expresa el péptido. Para una revisión general, ver, Spantola, A. F. en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New. Cork, p. 267 (1983) . El término "nucleósido" se refiere a una glucosilamina que es un componente de un ácido nucleico y que comprende un nitrógeno base ligado ya sea a ß-D-ribofuranosa para formar un ribonucleótido, o a 2-deoxi-ß-D-ribofuranosa para formar un desoiribonucleósido. La base puede ser una purina, por ejemplo, adenina o guanosina, o una pirimidina, por ejemplo, timidita, citidina, uridina o pseudouridina. El nucleósido también incluye el nucleósido inusual usado por microorganismos. El término "porción de direccionamiento" , como se usa en la presente, se refiere a especies que se localizarán selectivamente en un tejido o región particular del cuerpo.

La localización es mediada por reconocimiento específico de determinantes moleculares, el tamaño molecular del agente o conjugado de dirección, interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas y similares. Otros mecanismos de direccionamiento de un agente a un tejido o región particular son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las porciones de dirección ejemplares incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, transferina, HS-glucoproteína, factores de coagulación, proteínas de suero, ß-glucoproteína, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO y similares. Como se usa en la presente, "porción terapéutica" significa cualquier agente útil para terapia que incluye, pero no se limita a, antibióticos, agentes anti- inflamatorios , fármacos antitumor, citotoxinas, y agentes radioactivos. "Porción terapéutica" incluye fármacos de agentes bioactivos, constructos en los cuales más de una porción terapéutica se enlaza a un portador, por ejemplo, agentes multivalentes . La porción terapéutica también incluye proteínas y constructos que incluyen proteínas. Las proteínas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, Eritropoietina (EPO) , Factor de Estimulación de Colonia de Granulocito (GCSF) , Factor de Estimulación de Colonia de Macrófago de Granulocito (GMCSF) , Interferón (por ejemplo, Interferón-a, -ß, -?) , Interleucina (por ejemplo, Interleucina II), proteínas de suero (por ejemplo, Factores VII, Vlla, VIII, IX, y X) , Gonadotropina Coriónica Humana (HCG) , Hormona de Estimulación del Folículo (FSH) y Hormona Lutenizing (LH) y proteínas de fusión de anticuerpo (por ejemplo, Receptor del Factor de Necrosis de Tumor ( (TNFR) /proteína de fusión de domino Fe) ) . Como se usa en la presente, "fármaco antitumor" significa cualquier agente útil para combatir cáncer incluyendo, pero no limitado a, citotoxinas y agentes tales como antimetabolitos, agentes de alquilación, antraciclinas, antibióticos, agentes antimicóticos, procarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, corticosteroides, interferonas y agentes radioactivos . También están abarcados dentro del alcance del término "fármaco antitumor" los conjugados de péptidos con actividad antitumor, por ejemplo, TNF-a. Los conjugados incluyen, pero no se limitan a aquellos formados entre una proteína terapéutica y una glucoproteína de la invención. Un conjugado representativo es aquel formado entre PSGL-1 y TNF-a. Como se usa en la presente, "un agente de citotoxina o citotóxico" significa cualquier agente que es dañino para las células. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vencristina, vinblastina, colcicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracinediona, mitoxantrina, mitramicina, actinomicina D, 1- deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de estos. Otras toxinas incluyen, por ejemplo, ricina, CC- 1065 y análogos, las duocarmicinas . Todavía otras toxinas incluyen toxina de difteria, y veneno de víbora (por ejemplo, veneno de cobra) . Como se usa en la presente, "un agente radioactivo" incluye cualquier radioisótopo que es efectivo en el diagnóstico o destrucción de un tumor. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, indio-111, cobalto-60. Adicionalmente, los elementos • radioactivos que ocurren naturalmente tales como uranio, radio, y torio, los cuales comúnmente representan mezclas de radioisótopos, son ejemplos apropiados de un agente radioactivo. Los iones de metal comúnmente son quilatados con una porción de quelación orgánica. Muchos grupos de quelación útiles, éteres de crown, criptandos y similares son conocidos en la técnica y se pueden incorporar en los compuestos de la invención (por ejemplo, EDTA, DTPA, DOTA, NTA, HDTA, etc. y sus análogos de fosfonato tales como DTPP, EDTP, HDTP, NTP, etc) . Ver, por ejemplo, Pitt y colaboradores, "The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload" , In, Inorganic Chemistry in Biology and Medicine; Martell, Ed. ; American Chemical Society, Washington, D. C. , 1980, pp. 279-312; Lindoy, The Chemistry of Macrocyclic Ligand Complexes; Cambridge University Press, Cambridge, 1989; Dugas, Bioorganic Chemistry; Springer-Verlag, New York, 1989, y referencias contenidas en ellas . Adicionalmente, un distribuidor de rutas que permite el acoplamiento de agentes de quelación, éteres crown y ciclodextrinas a otras moléculas es posible para aquellos de experiencia en la técnica. Ver, por ejemplo, Meares y colaboradores, "Properties of In Vivo Chelate-Tagged Proteins and Polipeptides" . En, Modification of Proteins: Food, Nutricional, and Pharmacological Aspects"; Feeney y colaboradores, Eds., American Chemical Society, Washington, D.C., 1982, pp. 370-387; Kasina y colaboradores, Bioconjugare Chem., 9: 108-117 (1998); Song y colaboradores, Bioconjugate Chem., 8: 249-255 (1997).

Introducción La presente invención proporciona especies poliméricas, y azúcares, azúcares activados y azúcares nucleótidos que están conjugados a estos polímeros. Los conjugados poliméricos de los azúcares de nucleótido generalmente son sustratos para una enzima que transfiere la porción de azúcar y su substituyente polimérico sobre una porción de aceptor apropiada de un sustrato. En consecuencia, la invención también proporciona sustratos modificados por glucoconjugación usando un conjugado polimérico de un azúcar nucleótido y una enzima apropiada. Los sustratos que pueden ser glucoconjugados usando un compuesto de la invención incluyen péptidos, por ejemplo, glucopéptidos, lípidos, por ejemplo, glucolípidos y aglucones (esfingosinas, ceramidas) . Como se discutió en las secciones precedentes, los métodos químicos reconocidos por la técnica de PEGilación covalente dependen de la conjugación química a través de grupos reactivos en aminoácidos o carbohidratos . A través del diseño cuidadoso del conjugado y las condiciones de reacción, los conjugados útiles se han preparado usando estrategias de conjugación mediadas químicamente. Un defecto principal de la conjugación química de polímeros a proteínas o glucoproteínas es la carencia de selectividad de los polímeros activados, lo cual a menudo resulta en acoplamiento de polímeros en sitios implicados en la bioactividad de la proteína o glucoproteína . Varias estrategias se han desarrollado para dirigir las químicas de conjugación selectiva de sitios, sin embargo, solamente un método universal apropiado para una variedad de proteínas recombinantes se ha desarrollado. En contraste a los métodos reconocidos por la técnica, la presente invención proporciona compuesto que son de uso en una estrategia novedosa para glucoconjugación dirigida a sitio altamente selectiva de polímeros solubles en agua ramificados, por ejemplo, gluco-PEGilación. En una modalidad ejemplar de la invención, el acoplamiento dirigido a sitio de polímeros solubles en agua ramificados se logra mediante glucosilación enzimática in vitro de secuencias de péptido específicas usando un azúcar de nucleótido o azúcar activado dé la invención. La gluco-conjugación se puede realizar enzimáticamente utilizando una glucosiltransferasa, por . ejemplo, una sialiltransferasa, capaz de transferir la especie de azúcar de polímero soluble en agua ramificada, por ejemplo, PEG-ácido siálico, a un sitio de glucosilación ("gluco-PEGilación") . Como se describió anteriormente, la presente invención proporciona un conjugado entre un azúcar que tiene cualquier estructura de carbohidrato deseada, modificada con una porción polimérica. Los nucleótidos de azúcar y azúcares activados basados en estas estructuras de azúcar también son un componente de la invención. La porción de modificación polimérica se acopla a la porción de azúcar por medios enzimáticos, medios químicos o una combinación de estos, produciendo de esta manera un azúcar de nucleótido modificado. Los azúcares se sustituyen con la porción de modificación polimérica en cualquier posición deseada. En una modalidad ejemplar, el azúcar es una furanosa que se sustituye en una o más de C-1, C-2, C-3, C-4 ó C-5. En otra modalidad, la invención proporciona una piranosa que se sustituye con la porción de modificación polimérica en uno o más de C-1, C-2, C-3, C-4, C-5 ó C-6. Preferiblemente, la porción de modificación polimérica es acopla directamente a un oxígeno, nitrógeno o azufre pendiente del carbono. Alternativamente, la porción de modificación polimérica se acopla a una ligadura que se interpone entre el azúcar y la porción de modificación. La ligadura se acopla a un oxígeno, nitrógeno o azufre pendiente del carbono seleccionado. En una modalidad preferida actualmente, la porción de modificación polimérica está anexada a una posición, que se selecciona de manera que las funciones del conjugado que resulta como un sustrato para una enzima usada liga la porción de azúcar modificada a otra especie, por ejemplo, péptido, glucopéptido, lípido, glucolípido, etc. Las enzimas ejemplares se describen en mayor detalle en la presente e incluyen transferasas de glucosilo (sialil transíerasas, glucosil transferasas, galactosil transferasas, N-acetilglucosil transferasas, N-acetilgalactosil transferasas, manosil transferasas, fucosil transferasas, etc.). Los conjugados de nucleótido de azúcar y azúcar activado ejemplares de la invención también incluyen sustratos para glucosidasas mutantes y glucoceramidasas mutantes que se modifican para tener actividad sintética, más que hidrofílica. En una modalidad ejemplar, el conjugado de la invención incluye un azúcar, azúcar activado o azúcar nucleótido que se conjuga a uno o más polímeros, por ejemplo, un polímero ramificado. Los polímeros ejemplares incluyen ambas especies solubles en agua e insolubles en agua. En una modalidad ejemplar, el grupo de modificación polimérico se acopla directa o indirectamente a una piranosa o una furanosa. Por. ejemplo: I II En las fórmulas I y II, R1 es H, CH2OR7, COOR7 u OR7, en la cual R7 representa H, alquilo sustituido o no sustituido o heteroalquilo sustituido o no sustituido. R2 es H, OH, NH o una porción que incluye un nucleótido. Una especie R2 ejemplar de acuerdo con esta modalidad tiene la fórmula: en la cual X1 representa O ó NH y R8 es un nucleósido. Los símbolos R3, R4, R5, Rs, y Rs' independientemente representan H, alquilo sustituido o no sustituido, OR9, NHC(0)R10. El índice d es 0 ó 1. R9 y R10 independientemente se seleccionan de H, alquilo sustituido o no sustituido, heterolaquilo sustituido o no sustituido o ácido siálico. Por lo menos uno • de R3, R4, R5, R6, y R6'- incluye la porción de modificación polimérica, por ejemplo, PEG. En una modalidad ejemplar, Re, y R6' , junto con el carbono al cual están acoplados son componentes de la cadena lateral del ácido siálico. En una modalidad ejemplar más, esta cadena lateral se modifica con la porción de modificación polimérica (o una porción de modificación polimérica de ligadura) en uno o más de C-6, C-7 ó C-9. Los símbolos R3, R4, R5 y R6 independientemente representan H, OR9, NHC(0)R10. R9 y R10. independientemente se seleccionan de H, alquilo sustituido o no sustituido o heterolaquilo sustituido o no sustituido. Por lo menos uno de R3, R4, R5, Re, o Rs' incluye la porción de modificación polimérica. En otra modalidad ejemplar, la porción de azúcar es una porción de ácido siálico que se ha oxidado y conjugado a una porción de modificación polimérica, tal como se describe en la Solicitud de Patente Provisional de EUA No. asignada comúnmente (Extracto de Gestoría No. 040853-01-5150), presentada en Enero 6, 2005. En una modalidad ejemplar, la porción de modificación polimérica se une al núcleo de azúcar a través de una ligadura: (R«XV—-L—§ en la cual R11 es la porción polimérica y L se selecciona a partir de un enlace y un grupo de ligadura y w es un entero de 1-6, preferiblemente 1-3 y más preferiblemente 1-2. Cuando L es un enlace, este se forma entre un grupo funcional reactivo en un precursor de R11 y un grupo funcional reactivo de reactividad complementaria en un precursor de L. Como se establece en la presente, la selección y preparación de precursores con grupos funcionales reactivos apropiados está dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica. Más aún, la combinación de los precursores prosigue por químicas que son bien comprendidas en la técnica. En una modalidad ejemplar L es .un grupo de ligadura que se forma a partir de un aminoácido, un imitador de aminoácido, o péptido pequeño (por ejemplo, residuos de 1-4 aminoácido) que proporciona un azúcar modificado en el cual la porción de modificación polimérica se acopla a través de una ligadura de alquilo sustituida. La ligadura se forma a través de reacción de la porción de amina y ácido carboxílico (o un derivado reactivo, por ejemplo, éster activo, halogenuro de ácido, etc.) del aminoácido con grupos de reactividad complementaria en posprecursores a L y RX1. Los elementos del conjugado se pueden conjugar en esencialmente cualquier orden conveniente. Por ejemplo el precursor a L puede estar en lugar en el núcleo de sacárido antes de conjugar al precursor de R11 y L. Alternativamente, un cásete R1:L-L, que lleva una funcionalidad reactiva en L se puede preparar y posteriormente se liga al sacárido a través de un grupo funcional reactivo de reactividad complementaria en esta especie. En unas modalidades ejemplares, la porción de modificación polimérica es R3 y/o Rs. En otra modalidad ejemplar, R3 y/o R6 incluye ambas: la porción de modificación polimérica y una ligadura, L, que une la porción polimérica al resto de la molécula. En otra modalidad ejemplar, la porción de modificación polimérica es R3. Y, en una modalidad ejemplar más, R3 incluye ambas, la porción de modificación polimérica y una ligadura, L, que une la porción polimérica al resto de la molécula. En todavía otra modalidad ejemplar en la cual el azúcar es un ácido siálico, la porción de modificación polimérica está en R5 o acoplada a una posición de la cadena lateral de ácido siálico, por ejemplo, C-9.

Conjugados de Polímero Lineal En una modalidad ejemplar, la presente invención proporciona un azúcar o conjugado de azúcar activado o conjugado de azúcar nucleótido que se forma entre un polímero lineal, tal como un polímero soluble en agua o insoluble en agua. En los conjugados de la invención, el polímero se acopla a un azúcar, azúcar activado o nucleótido de azúcar. Como se describe en la presente, el polímero se liga a la porción de azúcar, ya sea directamente o a través de una ligadura.

Un compuesto ejemplar de acuerdo con esta modalidad tiene una estructura de acuerdo con las Fórmulas I ó II, en las cuales por lo menos uno de R1, R3, R4, R5 o Rs tiene la fórmula : | HN„L„R11 Otro ejemplo de acuerdo con esta modalidad tiene la fórmula : 1—NHC{O){CH2)s-- HC{O}—R11 en la cual s es un entero desde 0 hasta 20 y R11 es una porción de modificación polimérica lineal . Las porciones PEG de cualquier peso molecular, por ejemplo, 2 Kda, 5 kda, 10 Kda, 20 Kda, 30 Kda y 40 Kda son de uso en la presente invención.

Conjugados de Polímero Ramificados En una modalidad ejemplar, la porción de modificación polimérica es una estructura que incluye dos o más cadenas poliméricas acopladas a la porción central, que tiene la fórmula : (R11 L | en la cual R11 y L son como se describió anteriormente y w' es un entero desde 2 hasta 6, preferiblemente desde 2 hasta 4 y más preferiblemente desde 2 hasta 3. Un precursor ejemplar de uso para formar los conjugados de acuerdo con esta modalidad de la invención tiene la fórmula: Las especies de polímeros ramificados de acuerdo con esta fórmula son esencialmente polímeros solubles en agua puros. X3' es una porción que incluye un ionizable, por ejemplo, COOH, H2P04, HS03, HP03, etc.) u otro grupo funcional reactivo, por ejemplo, infra. C es carbono. X5 preferiblemente es un grupo no reactivo (por ejemplo, H, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido) , y puede ser un brazo polimérico. R12 y R13 independientemente son brazos poliméricos seleccionados, por ejemplo, brazos poliméricos no reactivos no peptídicos . X2 y X4 son fragmentos de ligadura que preferiblemente son esencialmente no reactivos • bajo condiciones fisiológicas, los cuales pueden ser los mismos o diferentes. Alternativamente, estas ligaduras pueden incluir una o más porciones que diseñan para degradar bajo condiciones relevantes fisiológicamente, por ejemplo, esteres, disulfuros, etc. X2 y X4 unen brazos poliméricos R12 y R13 a C. Cuando X3' se hace reaccionar con un grupo funcional reactivo de reactividad complementaria en una ligadura, azúcar o cásete de azúcar de ligadura, X3' se convierte en un componente de fragmento de ligadura X3. Los fragmentos de ligadura ejemplares para X2 y X4 incluyen, S, SC(0)NH, HNC(0)S, SC(0)0, 0, NH, NHC(O), "(0) CNH y NHC(0)0, y 0C(0)NH, CH2S, CH20, CH2CH20, CH2CH2S, (CH2)a0, (CH2)aS, (CH2)aY'-PEG o (CH2)aY'-PEG en donde Y' es S _u 0 y a es un entero desde 1 hasta 50. En una modalidad ejemplar, el precursor (III) , o derivado activado de este, se enlaza al azúcar, azúcar activado o nucleótido de azúcar a través de una reacción entre X3' y un grupo de actividad complementaria en la porción de azúcar. Alternativamente, X3' reacciona con un grupo funcional reactivo en un precursor a la ligadura, L. Uno o más de R1, R3, R4, R5 o Re de las Fórmulas I y II pueden incluir la porción de modificación polimérica ramificada. En una modalidad ejemplar, la porción: es el brazo de ligadura, L. En esta modalidad, una ligadura ejemplar se deriva de un aminoácido natural o no natural, análogo de aminoácido o imitador de aminoácido, o un péptido pequeño formado desde una o más de las especies. Por ejemplo, ciertos polímeros ramificados encontrados en los compuestos de la invención tienen la fórmula: Xa es una porción de ligadura que se forma mediante la reacción de un grupo funcional reactivo sobre un precursor de la porción de modificación polimérica ramificada y la porción de azúcar, o un precursor a una ligadura. Por ejemplo, cuando X3' es un ácido carboxílico, este se puede activar y enlazar directamente a un grupo amina pendiente de un amino-sacárido (por ejemplo, GalNH2, GlcNH2, ManNH2, etc.), formando un Xa que es una amida. Adicionalmente los grupos funcionales reactivos y los precursores activados reactivos se describen en la presente a continuación. El índice c representa un entero desde 1 hasta 10. Los otros símbolos tienen la misma identidad como aquellos descritos anteriormente. En otra modalidad ejemplar, Xa es una porción de ligadura formado con otra ligadura: I Xa—I1- b- 1 en la cual Xb es una porción y se selecciona independientemente de estos grupos establecidos para Xa, y L1 es un enlace, alquilo sustituido o no sustituido o heteroalquilo sustituido o no sustituido. Especies ejemplares para Xa y Xb incluyen, S, SC(0)NH, HNC(0)S, SC(0)0, O, NH, NHC(O), (O) CNH y NHC(O) O, y OC(0)NH. Por ejemplo, S—NHC(O)(CH2)s—NHC(O)—R11 en el cual s es in entero desde 0 hasta 20 y R11 es una porción de modificación polimérica. En otra modalidad ejemplar, X4 es un enlace de péptido a R13, el cual es un aminoácido, di-péptido o tri-péptido en el cual la porción de amina alfa y/o el heteroátomo de cadena lateral se modifica con un polímero. En una modalidad ejemplar más, R6 incluye el grupo de modificación polimérica ramificado y el azúcar modificado o el azúcar de nucleótido tiene una fórmula que se selecciona de : en las cuales la identidad de los radicales representados por los diferentes símbolos es la misma que aquella descrita en la presente anteriormente. La es una porción de alquilo sustituido o no sustituido o de heteroalquilo sustituido o no sustituido. En una modalidad ejemplar, La es una porción de la cadena lateral de ácido siálico que es funcional con la porción de modificación polimérica como se mostró. En todavía otra modalidad ejemplar, la invención proporciona azúcares y azúcares nucleótidos que tienen la fórmula : VI VII La identidad de los radicales representados por los diferentes símbolos es la misma como aquella descrita en la presente anteriormente. Como aquellos expertos apreciarán, el brazo de ligadura de las Fórmulas VI y VIII es igualmente aplicable a otros azúcares modificados establecidos en la presente . Las modalidades de la invención establecidas anteriormente además se ejemplifican por referencia a especies en las cuales el polímero es un polímero soluble en agua, particularmente poli (etilenglicol) ( "PEG") , por ejemplo, metoxi-poli (etilenglicol) ("m-PEG"). Aquellos de experiencia apreciarán que el enfoque en las secciones que siguen es para claridad de ilustración y las diferentes porciones establecidas que usan PEG como un polímero ejemplar son igualmente aplicables a especies en las cuales un polímero diferente de PEG se utiliza.

Polímeros Solubles en Agua. Muchos polímeros solubles en agua son conocidos para aguellos de experiencia en la técnica y son útiles en la práctica de la presente invención. El término polímero soluble en agua abarca especies tales como sacáridos (por ejemplo, dextrano, amilasa, ácido hialourónico, poli (ácido siálico), heparanos, heparinas, etc.); poli (aminoácidos) , por ejemplo, poli (ácido aspártico) y poli (ácido glutámico); ácidos nucleicos; polímeros sintéticos (por ejemplo, poli (ácido acrílico), poli (éteres) , por ejemplo, poli (etilenglicol) ; péptidos, proteínas, y similares. Un polímero comúnmente comprende por lo menos dos unidades poliméricas. En una modalidad ejemplar el polímero se forma de 2-25 unidades. En otra modalidad ejemplar el polímero comprende de 2-28 unidades poliméricas. La presente invención puede ser practicada con cualguier polímero soluble en agua con la única limitación de que el polímero debe incluir un punto en el cual el resto del conjugado se pueda acoplar. Los métodos para activación de polímeros también se pueden encontrar en WO 94/17029, la Patente de EUA No. 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, la Patente de EUA No. 5,219,564, la Patente de EUA No. 5,122,614, WO 90/13540, la Patente de EUA No. 5,281,698, y más WO 93/15189, y para conjugación entre polímero y péptidos activados, por ejemplo, Factor de Coagulación VIII (WO 94/15625) , hemoglobina (WO 94/09027 (, molécula que porta oxígeno (Patente de EUA No. 4,412,989), ribonucleasa y dismutasa de superóxido (Veronese y colaboradores, App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)). Los polímeros solubles en agua preferidos son aquellos en los cuales una porción sustancial de las moléculas de polímero en una muestra del polímero son de aproximadamente el mismo peso molecular; los polímeros son "homodispersos" . La presente invención se ilustra además por referencia a un conjugado de poli (etilenglicol) . Están disponibles varias revisiones y monografías en la funcionalidad y conjugación de PEG. Ver, por ejemplo, Harris, Macronol . Chem. Phys . C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong y colaboradores, Enzyme Microb. Technol. 14:866-874 (1992) ; Delgado y colaboradores, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 0:249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); y Bhadra y colaboradores, Pharmazie, 57:5-29 (2002). Las rutas para la preparación de moléculas PEG reactivas y formación de conjugados usando las moléculas reactivos se conocen en la técnica. Por ejemplo, la Patente de EUA No. 5,672,662 describe un conjugado soluble en agua y aislable de un éster activo de un polímero seleccionado de poli (óxidos de alquileno) , poli (polioles oxietilatados) , poli (alcoholes olefínicos), y poli (acrilomorfolina) lineales o ramificados. La Patente de EUA No. 6,376,604 establece un método para preparación de un éster de 1-benzotriazolilcarbonato soluble en agua de un polímero soluble en agua y no peptídico por reacción de un hidroxilo terminal del polímero con di(l- benzotriazoil) carbonato en un solvente orgánico. El éster activo se usa para formar conjugados con un agente biológicamente activo tal como una proteína o péptido. WO 99/45964 describe un conjugado que comprende un agente biológicamente activo y un polímero soluble en agua activado que comprende un soporte de polímero que tiene por lo menos un término ligado al soporte del polímero a través de una ligadura estable, en donde por lo menos un término comprende una porción de ramificación que tiene grupos reactivos próximos ligados a la porción de ramificación, en la cual el agente biológicamente activo se liga a por lo menos uno de los grupos reactivos próximos . Otros poli (etilenglicoles) ramificados se describen en WO 96/21469, la Patente de ?UA No. 5,932,462 describe un conjugado formado con una molécula PEG ramificada que incluye una terminación ramificada que incluye grupos funcionales reactivos. Los grupos reactivos libres están disponibles para reaccionar con una especie biológicamente activa, tal como una proteína o péptido, formado conjugados entre el poli (etilenglicol) y la especie biológicamente activa. Lá Patente de EUA No. 5,446,090 describe una ligadura de PEG bifuncional y su uso en la formación de conjugados que tienen un péptido en cada una de las terminaciones de ligadura PEG. Los conjugados que incluyen ligaduras PEG degradables se describen en WO 99/34833; y WO 99/14259, además en la Patente de EUA No. 6,348,558. Tales ligaduras degradables son aplicables en la presente invención. Los métodos reconocidos en la técnica de activación de polímero establecidos anteriormente son de uso en el contexto de la presente invención en la formación de los polímeros ramificados establecidos en la presente y también para la conjugación de estos polímeros ramificados a otras especies, por ejemplo, azúcares, nucleótidos de azúcar y similares. Los grupos de modificación ejemplares se discuten a continuación. Los grupos de modificación se pueden seleccionar por su capacidad para impartir a un péptido una o más propiedades deseables. Las propiedades ejemplares incluyen, pero no se limitan a, farmacocinéticas mejoradas, farmacodinámicas mejoradas, biodistribución aumentada, proveer una especie polivalente, solubilidad en agua aumentada, lipofilicidad mejorada o disminuida, y direccionamiento a tejido. Las moléculas de poli (etilenglicol) ejemplares de uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, aquellas que tienen la fórmula: en la cual A2 es H, OH, NH2, alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, por ejemplo, acetal, OHC-, H2N-(CH2)q-, HS-(CH2)q, o - (CH2) qC (Yb) Zb. El índice "e" representa un entero desde 1 hasta 2500. Los índices b, d, y q independientemente representan enteros desde 0 hasta 20. Los símbolos Za y Zb independientemente representan OH, NH2, grupos de salida, por ejemplo, imidazol, p-nitrofenilo, HOBT, tetrazol, haluro, S-Ra, la porción de alcohol de esteres activados; - (CH2)pC(Yb) V, o (CH2)pU(CH2)5C(Yb)v. El símbolo Ya representa H(2), =0, =S, =N-Rb. Los símbolos Xa, Ya, Yb, A1, y U independientemente representan las porciones O, S, N-Rc. El símbolo V representa OH, NH2, halógeno, S-Ra, el componente de alcohol de esteres activados, el componente de amina de amidas activadas, nucleótidos de azúcar, y proteínas. Los índices p, q, s y v son miembros seleccionados independientemente de los enteros desde 0 hasta 20. Los símbolos Ra, Rb y Rc independientemente representan H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido. Las modalidades específicas de polímeros lineales y ramificados, por ejemplo, de uso en la invención incluyen: y carbonatos y esteres activos de estas especies, tales como: se pueden usar para formar las especies poliméricas lineales y ramificadas, conjugados de brazo de ligadura de estas especies y conjugados entre estos compuestos y azúcares y azúcares de nucleótido. Los índices e y f independientemente se seleccionan de 1 hasta 2500. Otros grupos de activación, o de salida ejemplares, apropiados para activación de PEG lineales de uso en la preparación de los compuestos establecidos en la presente incluyen, pero no se limitan a las especies: Está dentro de las capacidades de aquellos de experiencia en la técnica seleccionar un grupo de activación apropiado para una porción seleccionada en el precursor hacia la porción de modificación polimérica. Las moléculas PEG que son activadas con estas y otras especies y métodos de producción de los PEG activados se establecen en WO 04/083259. En modalidades ejemplares, el polímero ramificado es un PEG basado en un núcleo de cisteína, serina, lisina, di- o tri-lisina. Así, además los PEG ramificados ejemplares incluyen: Los índices e y f independientemente se seleccionan de 1 hasta 2500. En todavía otra modalidad, la porción PEG ramificada se basa en un péptido de trilisina. La trilisina puede ser mono, di, tri o tetra-PEGilatada. Especies ejemplares de acuerdo con esta modalidad tienen las fórmulas : y en las cuales e, f y f independientemente son enteros seleccionados de 1 hasta 2500; y q, q' y q' ' independientemente son enteros seleccionados de 0 a 20. En modalidades ejemplares de la invención, PEG es m-. PEG(5 kD, 10 kD, 20 kD, 30 kD ó 40 kD) . Una especie PEG ramificada ejemplar es una lisina, serina- o cisteína- (m- PEG)2 en la cual el m-PEG es un m-PEG de 20 kD. Como se apreciará para aquellos de experiencia, los polímeros ramificados de uso en la invención incluyen variaciones en los temas establecidos anteriormente . Por ejemplo el conjugado de di-lisina-PEG mostrado anteriormente puede incluir tres subunidades poliméricas, el tercer enlace a la a-amina muestra como no modificado en la estructura anterior. Similarmente, el uso de una tri-lisina funcionarizada con tres o cuatro subunidades poliméricas está dentro del alcance de la invención. Aquellos de experiencia en la técnica apreciarán que uno o más de los brazos m-PEG del polímero ramificado se pueden reemplazar por una porción PEG con una terminación diferente, por ejemplo, OH, COOH, NH2, C2-C?0-alquilo, etc. Más aún, las estructuras anteriores se modifican fácilmente mediante la inserción de ligaduras de alguilo (o remoción de átomos de carbono) entre el átomo a-carbono y el grupo funcional de la cadena lateral. Así, los derivados "homo" y homólogos mayores, además de homólogos menores están dentro del alcance de los núcleos de los PEG ramificados de uso en la presente invención. Las especies PEG ramificadas establecidas en la presente se preparan fácilmente mediante métodos tales como aquel establecido en el esquema de reacción siguiente: en el cual Xb es 0, NH o S y r es un entero desde 1 hasta 10. El índice e y f independientemente son enteros seleccionados desde 1 hasta 2500. Las especies PEG ramificadas ejemplarmente son 10,000, 15,000, 20,000, 30,000 y 40,000 daltones . Así, de acuerdo con este esquema de reacción, un aminoácido natural o no natural se contacta con un derivado de m-PEG activado, en este caso el tosilato, que forma 1 por alquilación del heteroátomo de cadena lateral Xb. El aminoácido m-PEG mono-funcionalizado se somete a condiciones de N-acilación con un derivado de m-PEG reactivo, ensamblando de esa manera el m-PEG ramificado 2. Como apreciará un experto, el grupo de salida de tisolato puede ser cambiado por cualquier grupo de salida apropiado, por ejemplo, halógeno, mesilato, triflato, etc. Similarmente, el carbonato reactivo utilizado para acilatar la amina puede ser cambiado por un éster activo, por ejemplo, N-hidroxisuccinimida, etc., o el ácido puede ser activado in situ usando un agente de deshidratación tal como diciclohexilcarbodiimida, carbonildiimidazol, etc. En el esquema de reacción ejemplar establecido anteriormente, el grupo de modificación es una porción de PEG lineal, sin embargo, cualquier grupo de modificación, por ejemplo, polímero soluble en agua, polímero insoluble en agua, polímero ramificado, porción terapéutica, etc., se puede incorporar en una porción de glucosilo a través Además las especies poliméricas ramificadas de uso en los compuestos de la invención se ejemplifican por núcleos ramificados funcionalizados con PEG, tal como los ejemplos establecidos a continuación: en los cuales R14 es OH u otro grupo funcional reactivo. Un grupo funcional reactivo ejemplar es C(0)Q', en el cual Q' se selecciona de manera que C(0)Q' es un grupo funcional reactivo. Especies ejemplares para Q' incluyen halógenos, NHS, pentafluorofenilo, HOBT, HOAt, y p-nitrofenilo. El índice "e" y el índice "f" son enteros seleccionados independientemente de 1 hasta 2500. Los compuestos ramificados establecidos anteriormente, y los compuestos ramificados adicionales de uso en los compuestos de la invención se preparan fácilmente a partir de los materiales de inicio como: Especies de Azúcares Modificados de Polímero. La porción de azúcar de los azúcares de nucleótido de la invención se puede seleccionar tanto de las furanosas como de las hexanosas naturales y no naturales . Los sacáridos no naturales opcionalmente incluyen una porción de hidroxilo y/o amina alquilatada o acilatada, por ejemplo, substituyentes de éteres, esteres y amida en el anillo. Otros sacáridos no naturales incluyen un substituyente de H, hidroxilo, éter, éster o amida en una posición en el anillo en la cual tal substituyente no está presente en el sacárido natural . La porción de azúcar puede ser un mono, oligo o polisacárido.

Los azúcares naturales ejemplares de uso en la presente invención incluyen glucosa, galactosa, fucosa, mañosa, xilanosa, ribosa, glucosa de N-acetilo, ácido siálico y galactosa de N-acetilo. Similarmente, el nucleósido se puede seleccionar a partir de nucleósidos naturales y no naturales o inusuales . Los nucleósidos naturales ejemplares de uso en la presente invención incluyen citosina, timina, guanina, adenina y uracilo. Los nucleósidos inusuales pueden incluir pero no se limitan a las moléculas como espongouridina y espongortimidina. La técnica está llena de estructuras de nucleósidos no naturales e inusuales y métodos de producción de estos. Los nucleósidos de azúcar modificados ejemplares de la invención incluyen GDP-Man, GDP-Fuc, UDP-Gal, UDP-Gal-NH2, UDP-GalNAc, UDP-Glc, UDP-Glc-NH2, UDP-GlcNAc, UDP-Glc, UDP-GlcUA y CMP-Sia. Como con los azúcares de la invención descritos anteriormente, los nucleótidos de azúcar de la invención se pueden sustituir con una porción modificada polimérica (o porción de modificación de ligadura) en cualquier posición del sacárido. Por ejemplo, los compuestos abarcados por la invención incluyen aquellos en los cuales la porción L-R11 se conjuga a C-5 de un azúcar de nucleótido a base de furanosa o C-6 de un azúcar de nucleótido a base de piranosa.

Las porciones ejemplares acopladas a los conjugados descritos en la presente incluyen, pero no se limitan a, derivados de PEG (por ejemplo, alquil-PEG, acil-PEG, acil- alquil-PEG, alquil-acil-PEG carbamoil-PEG, aril-PEG) , derivados de PPG (por ejemplo, alquil-PPG, acil-PPG, acil- alquil-PPG, alquil-acil-PPG carbamoil-PPG, aril-PPG) , porciones terapéuticas, porciones de diagnóstico, mañosa-6- fosfato, heparina, heparano, SLex, mañosa, manosa-6-fosfato, Sialil Lewis X, FGF, VFGF, proteínas, condroitina, queratano, dermatano, albúmina, integrinas, oligosacáridos antenarios, péptidos y similares. Los métodos de conjugación de los diferentes grupos de modificación para una porción de sacárido son fácilmente accesibles para aquellos de experiencia en la técnica (Poli (Ethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed. , Plenum Pub. Corp., 1992; Poli (Ethylene Glycol) Chemical and Biological Applications, J. Milton Harris, Ed., ACS Symposium Series No. 680, American Chemical Society, 1997; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; y Dunn y colaboradores, Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Sustems, ACS, Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991) . Los nucleótidos de azúcar ejemplares de la presente invención, en su forma modificada, incluyen mono-, di- o trifosfatos de nucleótido o análogos de estos de un UDP- glicósido, CMP-glicósido, o un GDP-glucósido. Aún más preferiblemente, el nucleótido de azúcar modificado se selecciona de un UDP-galactosa, UDP-galactosamina, UDP- glucosa, UDP-glucosamina, GDP-manosa, GDP-fucosa, CMP-ácido siálico, o CMP-NeuAc. Los derivados de N-acetilamina de los nucleótidos de azúcar también son de uso en el método de la invención. En otras modalidades, el azúcar modificado es un azúcar activado. Los azúcares modificados activados, los cuales son útiles en la presente invención comúnmente son glicósidos los cuales se han alterado sintéticamente para incluir un grupo de salida activado. Como se usa en la presente, el término "grupo de salida activado" se refiere a aquellas porciones, las cuales son desplazadas fácilmente en reacciones de sustitución nucleofílicas reguladas por enzima. Muchos azúcares activados se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Vocadlo y colaboradores, en Carbohidrate Chemistry and Biology, Vol. 2, Ernst y colaboradores, Ed. , Wiley-VCH Verlag: Weinheim, Germany, 2000; Kodama y colaboradores, Tetrahedrom Lett. 34:6419 (1993); Lougheed, y colaboradores, J. Biol. Chem. 274: 37717 (1999). Ejemplos de grupos de activación (grupos de salida) incluyen flúor, cloro, bromo, éster de tosilato, éster de mesilato, éster de triflato y similares. Los grupos de salida activados preferidos, para uso en la presente invención, so aquellos que no obstruyen esféricamente de forma significante la transferencia enzimática del glicósido al aceptor. En consecuencia, las modalidades preferidas de los derivados de glicósido activados incluyen fluoruros de glucosilo y mesilatos de glucosilo, siendo particularmente preferidos los fluoruros de glucosilo. Entre los fluoruros de glucosilo, los más preferidos son: fluoruro de a-galactosilo, fluoruro de a-manosilo, fluoruro de a-glucosilo, fluoruro de a-fucosilo, fluoruro de oc-xilosilo, fluoruro de a-sialilo, fluoruro de a-N-acetilglucosaminilo, fluoruro de a-N-acetilgalactosaminilo, fluoruro de ß-galactosilo, fluoruro de ß-manosilo, fluoruro de ß-glucosilo, fluoruro de ß-fucosilo, fluoruro de ß-xilosilo, fluoruro de ß-sialilo, fluoruro de ß-N-acetilglucosaminilo, fluoruro de ß-N-acetilgalactosaminilo. A manera de ilustración, los fluoruros de glucosilo se pueden preparar a partir de azúcar libre primero por acetilación del azúcar y luego tratándola con HF/piridina. Esto genera el anómero más estable termodinámicamente del fluoruro de glucosilo (acetilatado) protegido (esto es, el fluoruro de a-glucosilo) . Si se desea el anómero menos estable (esto es, el fluoruro de ß-glucosilo) , se puede preparar por conversión del azúcar peracilatado con HBr/HOAC o con HCl para generar el bromuro o cloruro anomérico. Este intermedio se hace reaccionar con una sal de fluoruro tal como fluoruro de plata para generar el fluoruro de glucosilo.

Los fluoruros de glucosilo acetilatados se pueden desproteger por reacción con base suave (catalítica) en metanol (por ejemplo, NaOMe/MeOH) . Además, muchos fluoruros de glucosilo están disponibles comercialmente. Otros derivados de glucosilo activados se pueden preparar usando métodos convencionales conocidos por aquellos de experiencia en la técnica. Por ejemplo, los mesilatos de glucosilo se pueden preparar por tratamiento de la forma hemiacetal benzilatada completamente del azúcar con cloruro de mesilo, seguida de hidrogenación catalítica para remover los grupos bencilo. En una modalidad ejemplar adicional, el azúcar modificada es un oligosacárido que tiene una estructura antenaria. En otra modalidad, una o más de las terminales de las antenas portan la porción de modificación. Cuando más de una porción de modificación se acopla a un oligosacárido que tiene una estructura antenaria, el oligosacárido es útil para "amplificar" la porción de modificación; cada unidad de oligosacárido conjugado con el péptido acopla copias múltiples de grupos de modificación al péptido. La estructura general de un conjugado típico de la invención como se establece en los dibujos anteriores, abarca especies multivalentes que resultan de la preparación de un conjugado de la invención utilizando una estructura antenaria. Muchas estructuras de sacárido antenarias se conocen en la técnica, y el método presente se puede practicar con ellas sin limitación. En una modalidad ejemplar, el azúcar modificado activado es un sustrato de una enzima mutante que transfiere el azúcar sobre una porción aceptora apropiada de un sustrato. Las enzimas mutantes ejemplares incluyen, por ejemplo, aquellas establecidas en las publicaciones PCT WO 03/046150 y WO 03/045980 asignadas de forma común. Las especies de azúcar, azúcar activado y azúcar de nucleótido modificadas de polímero soluble en agua, en las cuales la porción de azúcar se modifica con un polímero soluble en agua, por ejemplo, un polímero soluble en agua, son de uso en la presente invención. Un nucleótido de azúcar modificado ejemplar porta un grupo de azúcar que se modifica a través de una porción amina en el azúcar. Los nucleótidos de azúcar modificados, por ejemplo, derivados de sacaril-amina de un nucleótido de azúcar, también son de uso en los métodos de la invención. Por ejemplo, una amina de sacarilo (sin el grupo de modificación) puede ser conjugada enzimáticamente a un péptido (u otras especies) y la porción de amina de sacarilo posteriormente conjugada a un grupo de modificación deseado. Alternativamente, el nucleótido de azúcar modificado puede funcionar como un sustrato para una enzima que transfiere el azúcar modificado a un aceptor de sacarilo en un sustrato, por ejemplo, un péptido, glucopéptido, lípido, aglucon, glucolípido, etc.

En una modalidad, el azúcar se conjuga con una especie polimérica ramificada, tal como aquellas establecidas en la presente . En otra modalidad, la porción de azúcar es un ácido siálico modificado. Cuando en ácido siálico es el azúcar, el ácido siálico se sustituye con el grupo de modificación ya sea en la posición 9 sobre la cadena lateral de piruvilo o en la posición 5 sobre la porción de amina que se acetila normalmente en ácido siálico. En otra modalidad, en la cual el núcleo de sacárido es galactosa o glucosa, R5 es NHC(0)Y. En una modalidad ejemplar, el azúcar modificado se basa en una porción de 6-amino-N-acetil-glucosilo. Como se muestra a continuación para N-acetilgalactosamina, la porción de 6-amino-azúcar se prepara fácilmente por métodos estándar: a. ^0^ /°^^0^3 En el esquema de reacción anterior, el índice n representa un entero desde 1 hasta 2500, preferiblemente desde 10 hasta 1500, y más preferiblemente desde 10 hasta 1200. El símbolo "A" representa un grupo de activación, por ejemplo, un halo, un componente de un éster activado (por ejemplo, un éster de N-hidroxisuccinimida) , un componente de un carbonato (por ejemplo, carbonato de p-nitrofenilo) y similares. Aquellos de experiencia en la técnica apreciarán que otros azúcares de nucleótido de PEG-amida se preparan fácilmente mediante este y otros métodos análogos. Más aún, un polímero ramificado, como se establece en la presente, se puede sustituir por el PEG lineal. Otro azúcar de nucleótido modificado poliméricamente ejemplar de la invención en el cual la posición C-6 se modifica tiene la fórmula: en la cual X6 es un enlace u O, J es S u O, e y es O ó l . Los índices e y f independientemente se seleccionan desde 1 hasta 2500 .

En otra modalidad ejemplar, la porción de amida se reemplaza por un grupo tal como un uretano o una urea. En la discusión que sigue, se establece una variedad de ejemplos específicos de azúcares modificados que son útiles en la práctica de la presente invención. En las modalidades ejemplares, un derivado de ácido siálico se utiliza como el núcleo de azúcar al cual el grupo de modificación se acopla. El enfoque de la discusión en derivados de ácido siálico es para claridad de ilustración solamente y no debe ser construido para limitar el alcance de la invención. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que se pueden activar y derivar una variedad de porciones de azúcar diferentes de una manera análoga a aquella establecida usando el ácido siálico como un ejemplo. Por ejemplo, los numerosos métodos están disponibles para modificación de galactosa, glucosa, N-acetilgalactosamina y mucosa por nombrar unos pocos sustratos de azúcar, los cuales se modifican fácilmente por los métodos reconocidos por la técnica. Ver, por ejemplo, Elhalabi y colaboradores, Curr. Med. Chem. 6:93 (1999); y Schafer y colaboradores, J. Org. Chem. 65:24 (2000)). En la FIG. 2 se establece un esquema de reacción general de acuerdo con la presente invención. Así, de acuerdo con la FIG. 2, se forma un conjugado de amida entre manosamina y un aminoácido protegido, mediante contacto de la manosamina con un aminoácido N-protegido bajo condiciones apropiadas para formar el conjugado. La terminación carboxilo del aminoácido protegido se activo in situ o se convierte opcionalmente a un grupo reactivo que es estable para almacenamiento, por ejemplo, N-hidroxi-succinimida. El aminoácido se puede seleccionar de cualquier aminoácido natural o no natural . Aquellos expertos en la técnica entienden cómo proteger los aminoácidos de cadena lateral de reacción indeseable en el método de la invención. El conjugado de amida se hace reaccionar con piruvato y aldolasa de ácido siálico bajo condiciones apropiadas para convertir el conjugado de amida a un conjugado de amida de ácido siálico, el cual se convierte posteriormente a un conjugado de amida de ácido siálico de fosfato de nucleótido por reacción del conjugado de amida de ácido siálico con un precursor del fosfato de nucleótido y una enzima apropiada. En una modalidad ejemplar, el precursor es trifosfato de citidina y la enzima es una sintetasa. Después de la formación del azúcar de nucleótido, la amina de aminoácido se desprotege, proporcionando una amina reactiva libre. La amina sirve como un lugar del cromosoma para conjugación de la porción de modificación al azúcar de nucleótido. En la FIG. 2, la porción de modificación se ejemplifica por un polímero soluble en agua, esto es, poli (etilenglicol) , por ejemplo, PEG, m-PEG, etc. La presente invención además se ejemplifica en la FIG. 3 , la cual establece un esquema de reacción para preparación de monofosfato de ácido siálico-PEG-citidina. Similar al esquema de reacción establecido en la FIG. 2, que de la FIG.3 origina con manosamina. El azúcar se conjuga con FMOC- glicina, usando el derivado activado de N-hidroxisuccinimida del aminoácido protegido. El conjugado de amida que resulta se convierte al ácido siálico que corresponde por la acción de la aldolasa de ácido siálico en el conjugado de piruvato. El conjugado de ácido siálico que resulta se convierte al análogo de monofosfato de citidina usando " trifosfato de citidina y una sintetasa. El análogo de CMP se desprotege mediante la remoción del grupo de protección desde la porción amina de aminoácido, convirtiendo esta porción a una ubicación de cromosoma reactivo para conjugación. La porción de amina se hace reaccionar con una especie PEG activada (carbonato de m-PEG-O-nitrofenilo) , formando de esa manera el monofosfato de ácido siálico-glicil-PEG-citidina. Los núcleos de azúcar ejemplares basados en ácido siálico tienen la fórmula: en la cual D es -OH o (R1:L)W'-L-. El símbolo G representa H, (R1:L)W<-L- o -C (O) (Ca-C3) alquilo. R11 es como se describe anteriormente. Por lo menos uno de D y G es R1:L-L- .

En otra modalidad, la invención proporciona un azúcar, azúcar activado o nucleótido de azúcar que comprende la estructura: en la cual L es como se describió anteriormente en el contexto de L, por ejemplo, un enlace, grupo alquilo sustituido o no sustituido o heteroalquilo sustituido o no sustituido. El índice e representa un entero desde 1 hasta 2500. En otra modalidad, el azúcar o nucleótido de azúcar comprende la estructura: en la cual s se selecciona de los enteros desde 0 hasta 20, y e es 1 hasta 2500. Los azúcares de nucleótido a base de ácido siálico seleccionados funcionalizados con un polímero ramificado tienen la fórmula: en la cual AA es un residuo de aminoácido, PEG es poli (etilenglicol) o metoxi-poli (etilenglicol) y NP es un nucleótido, el cual se liga a la porción de glucosilo vía un enlace de fosfodiéster ("fosfato de nucleótido"). Los expertos apreciarán que ONP se puede reemplazar mediante una porción de activación como se describe en la presente . En todavía más modalidades, el derivado de ácido siálico tiene una estructura que es un miembro seleccionado de: en el cual X6 es un enlace u O, y J es S u O. Los índices a, b y c se seleccionan independientemente desde 0 hasta 20, y e y f se seleccionan independientemente desde 1 hasta 2500. Más aún, como se describió anteriormente, la presente invención proporciona azúcares de nucleótido que se modifican con un polímero soluble en agua, el cual es ya sea de cadena lineal o ramificada. Por ejemplo, los compuestos que tienen la fórmula mostrada a continuación están dentro del alcance de la presente invención: en la cual X6 es O ó un enlace, y J es S u O. Los índices e y f se seleccionan independientemente desde 1 hasta 2500. También se proporcionan conjugados de péptidos y glucopéptidos, lípidos y glucolípidos que incluyen las composiciones de la invención. Los conjugados se forman por combinación de un azúcar de nucleótido o azúcar activado de la invención y un sustrato con una porción aceptora apropiada para la porción de azúcar y una enzima para la cual el azúcar de nucleótido modificado es un sustrato bajo las condiciones, apropiadas para transferir el azúcar modificado del azúcar de nucleótido a la porción del aceptor. Por ejemplo, la invención proporciona conjugados que tienen las siguientes fórmulas : en donde J y X6 son como se discutieron anteriormente. Los índices a, b, c, e y f son como se discutieron anteriormente. Los compuestos seleccionados de la invención se basan en especies que tienen la estereoquímica de mañosa, galactosa y glucosa. Las fórmulas generales de estos compuestos son: en los cuales uno de R3-R6 es la porción de modificación, por ejemplo, porción de modificación polimérica o el constructo de ligadura de porción de modificación polimérica. Como se discutió anteriormente, ciertos compuestos de la presente invención son nucleótidos de azúcar modificados poliméricos. Los nucleótidos de azúcar ejemplares que se usan en la presente invención en su forma modificada incluyen mono, di o trifosfatos de nucleótido o análogos de estos. En una modalidad preferida, el nucleótido de azúcar modificado se selecciona de un UDP-glicósido, CMP-glicósido, o un GDP-glicósido. Aún más preferiblemente, El nucleótido de azúcar modificado se selecciona de un UDP-galactosa, UDP-galactosamina, UDP-glucosa, UDP-glucosamina, GDP-manosa, GDP-fucosa, CMP-ácido siálico, o CMP-Sia. En una modalidad ejemplar, el mono, di o trifosfato de nucleótido se acopla a C-1. Los derivados de amina sacarilo de los nucleótidos de azúcar también son de uso en el método de la invención. Por ejemplo, la amina de sacarilo (sin el grupo de modificación) puede ser conjugado enzimáticamente a un péptido (u otra especie) y la porción de amina de sacarilo libre posteriormente se conjuga a un grupo de modificación deseado. Los conjugados de nucleótido de azúcar de la invención se describen genéricamente mediante la fórmula: en la cual los símbolos representan grupos como se discutió anteriormente. Cuando el núcleo del azúcar es mañosa, la porción de modificación polimérica está preferiblemente en R3, R4 o R6. Para glucosa, la porción de modificación polimérica opcionalmente está en R5 o R6. El índice "u" es 0, 1 ó 2. Un azúcar de nucleótido ejemplar adicional de la invención, basado en GDP mañosa tiene la estructura: En todavía una modalidad ejemplar adicional, la invención proporciona un conjugado, basado en UDP galactosa que tiene la estructura: En otra modalidad ejemplar, el azúcar de nucleótido se basa en glucosa y tiene la fórmula: En cada una de las tres fórmulas precedentes, la identidad de los radicales e índices es como se discutió anteriormente. Como es apreciable para aquellos expertos en la técnica, la porción PEG lineal se puede reemplazar por una especie polimérica ramificada u otra polimérica lineal como se describe en la presente . En una modalidad en la cual el núcleo de sacárido es galactosa o glucosa, R5 es NHC(0)Y.

Polímeros insolubles en agua. En otra modalidad, análoga a aquellas discutidas anteriormente, los azúcares modificados incluyen un polímero insoluble en agua mejor que un polímero soluble en agua. Un polímero insoluble en agua, similar a un polímero soluble en agua comúnmente se comprende de por lo menos dos unidades poliméricas. En una modalidad ejemplar el polímero se comprende de desde 2 hasta 25 unidades poliméricas. En otra modalidad ejemplar el polímero se comprende de 2 hasta 8 unidades poliméricas. Los conjugados de la invención también pueden incluir uno o más polímeros insolubles en agua. Esta modalidad de la invención se ilustra por el uso del conjugado como un vehículo con el cual suministra un péptido terapéutico de una manera controlada. Los sistemas de suministro de fármaco polimérico son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Dunn y colaboradores, Eds. Polimeric Drugs And Drug Delibery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que sustancialmente cualquier sistema de suministro de fármaco conocido es aplicable a los conjugados de la presente invención. Los polímeros insolubles en agua representativos incluyen, pero no se limitan a, polifosfazinas, poli (alcoholes vinílicos) , poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, poliacrilamidas, polialquilenglicoles, óxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, éteres de polivinilo, esteres de polivinilo, halogenuros de polivinilo, polivinilpirrolidona, poliglicólidos, polisiloxanos, poliuretanos, poli (metil metacrilato), poli (etil metacrilato), poli (butil metacrilato), poli (isobutil metacrilato), poli (hexil metacrilato), poli (isodecil metacrilato), poli (laurel metacrilato), poli (fenil metacrilato), poli (metil acrilato), poli (isopropil acrilato), poli (isobutil acrilato), poli (octadecil acrilato), polietileno, polipropileno, poli (etilenglicol) , poli(etilen óxido), poli(etilen tereftalato), poli (vinil acetato), polivinil cloruro, poliestireno, polivinil pirrolidona, plurónicos, y polivinilfenol y copolímeros de estos. Los polímeros naturales modificados sintéticamente de uso en conjugados de la invención incluye, pero no se limitan a, celulosas de alquilo, celulosas de hidroxialquilo, éteres de celulosa, esteres de celulosa, y nitrocelulosas . Los miembros particularmente preferidos de las amplias clases de polímeros naturales modificados sintéticamente incluyen, pero no se limitan a, metil celulosa, etil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, hidroxibutil metil celulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, butirato de acetato de celulosa, ftalato de acetato de celulosa, carboximetil celulosa, triacetato de celulosa, sal de sodio de sulfato de celulosa, y polímeros de esteres acrílicos y metacrílicos y ácido algínico. Estos y otros polímeros discutidos en la presente se pueden obtener fácilmente a partir de fuentes comerciales tales como Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO.), Polisciences (Warrenton, PA.), Aldrich (Milwaukee, Wl., Fluka (Ronkinkoma, NY) , y BioRad (Richmond, CA) , o además sintetizados de monómeros obtenidos de estos proveedores usando técnicas estándar. Los polímeros biodegradables representativos de uso en los conjugados de la invención incluyen, pero no se limitan a, polilácticos, poliglicólidos y copolímeros de estos, poli(etilen tereftalato), poli (ácido butírico), poli (ácido valérico), poli (lacturo-co-caprolactona) , poli (láctico-co-licólido) , polianhídridos, poliortoésteres, mezclas y copolímeros de estos. De uso particular son composiciones que forman geles, tales como aquellas que incluyen colágeno, plurónicos y similares. Los polímeros de uso en la invención incluyen polímeros "híbridos" que incluyen materiales insolubles en agua que tienen dentro por lo menos una porción de su estructura, una molécula de bioreabsorción. Un ejemplo de un polímero tal es uno que incluye un copolímero insoluble en agua, el cual tiene una región de bioreabsorción, una región hidrofílica y una pluralidad de grupos funcionales de reticulación por cadena de polímero.

Para propósitos de la presente invención, los ""materiales insolubles en agua" incluyen materiales que son sustancialmente insolubles en agua o en ambientes que contienen agua. Así, aunque ciertas regiones o segmentos del copolímero puede ser hidrofílica o aún soluble en agua, la molécula de polímeros, como un todo, no disuelve ninguna medición sustancial en agua. Para propósitos de la presente invención, el término "molécula de bioreabsorción" incluye una región que es capaz de ser metabolizada o degradada y reabsorbida y/o eliminada a través de rutas excretorias normales por el cuerpo. Tales metabolitos o productos de descomposición preferiblemente son sustancialmente no tóxicos al cuerpo. La región de bioreabsorción puede ser ya sea hidrofóbica o hidrofílica, tanto como la composición del copolímero como un todo no se vuelva a hacer soluble en agua. Así, la región de reabsorción se selecciona con base en la preferencia de que el polímero, como un todo, permanece insoluble en agua. En consecuencia, las propiedades relativas, esto es, los tipos de grupos funcionales contenidos, y las proporciones relativas de la región de bioreabsorción, y la región hidrofílica se seleccionan para asegurar que las composiciones de bioreabsorción útiles permanecen insolubles en agua. Los polímeros de reabsorción ejemplares incluyen, por ejemplo, copolímeros de bloque de reabsorción producidos sintéticamente de poli (ácido a-hidroxi- carboxílico) /poli (oxialquileno) , (ver, Cohn y colaboradores, Patente de EUA No. 4,826,945). Estos copolímeros no están reticulados y son solubles en agua de manera que el cuerpo puede excretar las composiciones de copolímero de bloque degradadas. Ver, Younes y colaboradores, J Biomed. Mater. Res. 21:1301-11316 (1987); y Cohn y colaboradores, J Biomed. Mater. Res. 22:993-1009 (1988). Los polímeros de bioreabsorción preferidos actualmente incluyen uno o más componentes~ seleccionados de poli (esteres) , poli (ácidos hidroxi), poli (lactonas) , poli (éster-amidas) , poli (aminoácidos) , poli (anhídridos) , poli (ortoésteres) , poli (carbonatos) , poli (fosfazinas) , poli (fosfoésteres) , poli (tioésteres) , polisacáridos y mezclas de estos. Más preferiblemente todavía, el polímero de reabsorción incluye un componente de ácido poli (hidroxi) . De los ácidos poli (hidroxi) , son preferidos el ácido poliláctico, ácido poliglicólico, ácido policapróico, ácido polibutírico, ácido polivalérico y copolímeros y mezclas de estos. Además para formar fragmentos que se absorben in vivo ("bioreabsorción"), los recubrimientos poliméricos preferidos para uso en los métodos de la invención también pueden formar un fragmento excretable y/o metabolizable.

Los copolímeros de orden mayor también se pueden usar en la presente- invención. Por ejemplo, Casey y colaboradores, Patente de EUA No. 4,438,253, la cual se emitió en Marzo 20, 1984, describe copolímeros tribloques producidos a partir de transesterificación de poli (ácido glicólico) y un poli (alquilenglicol) terminado en hidroxilo. Tales composiciones se describen para uso como estructuras de monofilamento de reabsorción. La flexibilidad de las composiciones se controla por la incorporación de un ortocarbonato aromático, tal como tetra-p-tolil ortocrabonato en la estructura del copolímero. Otros polímeros basados en ácidos lácticos y/o glicólico también se pueden utilizar. Por ejemplo, Spinu, Patente de EUA No. 5,202,413, la cual se emitió en Abril 13, 1993, describe copolímero de bloque múltiple biodegradables que tienen bloques ordenados secuencialmente de poliláctido y/o poliglicólido producidos por polimerización de abertura de anillo de lacturo y/o glucoluro en cualquiera de un diol oligomérico o un residuo de diamina seguido por extensión de cadena con un compuesto difuncional, tal como, un - diisocianato, diacilcloruro o diclorosilano. Las regiones de bioreabsorción de recubrimientos útiles en la presente invención se pueden diseñar para ser desdoblables hidrolítica y/o enzimáticamente. Para propósitos de la presente invención, "desdoblable hidrolíticamente" se refiere a la susceptibilidad del copolímero, esencialmente la región de bioreabsorción, para hidrólisis en agua o un ambiente que contiene agua. Similarmente, "desdoblable enzimáticamente" como se usa en la presente se refiere a la susceptibilidad del copolímero, especialmente la región de bioreabsorción, para desdoblar por enzimas endógenas o exógenas . Cuando está dentro del cuerpo, la región hidrofílica puede ser procesada en fragmentos excretables y/o metabolizables . Así, la región hidrofílica puede incluir, por ejemplo, poliéteres, óxidos de polialquileno, polioles, poli (vinil pirrolidina), poli (vinil alcohol), poli (alquil oxazolinas) , polisacáridos, carbohidratos, péptidos, proteínas y copolímeros y mezclas de estos. Además, la región hidrofílica también puede ser, por ejemplo, un óxido de poli (alquileno) . Los óxidos de poli (alquileno) pueden incluir, por ejemplo, óxido de poli (etileno) , óxido de poli (propileno) y mezclas y copolímeros de estos. Los polímeros que son componentes de hidrogeles también son útiles en la presente invención. Los hidrogeles son materiales poliméricos que son capaces de absorber relativamente grandes cantidades de agua. Ejemplos de hidrogel que forma compuestos incluyen, pero no se limitan a, ácidos poliacrílicos, carboximetilcelulosa de sodio, alcohol de polivinilo, pirrolidina de polivinilo, gelatina, carrageenan y otros polisacáridos, ácido hidroxietilenometacrílico (HEMA) , además de derivados de estos, y similares. Los hidrogeles se pueden producir para ser estables, biodegradables y de bioreabsorción. Más aún, las composiciones de hidrogel pueden incluir subunidades que exhiben una o más de estas propiedades . Las composiciones de hidrogel biocompatibles cuya integridad se puede controla a través de reticulación se conocen y son preferidas actualmente para uso en lo métodos de la invención. Por ejemplo, Hubbell y colaboradores, Patente de EUA No. 5,410,016, la cual se emitió en Abril 25, 1995 y 5,529,914 la cual se emitió en Junio 25, 1996, describen sistemas solubles en agua, los cuales son copolímeros de bloque reticulados que tienen un segmento de bloque central soluble en agua intermedio entre dos extensiones hidrolíticamente inestables. Tales copolímeros además se tapan en el extremo con funcionalidades de acrilato fotopolimerizable. Cuando se reticulan, estos sistemas se vuelven hidrogeles . El bloque central soluble en agua de los copolímeros puede incluir poli (etilenglicol) ; si, las extensiones hidrolíticamente inestables pueden ser un poli (ácido a-hidroxi) , tal como ácido poliglicólico o ácido poliláctico. Ver, Sawhney y colaboradores, Macromolecules 26:581-587 (1993) . En otra modalidad, el gel es un gel termorreversible.

Los geles termorreversibles incluyen componentes, tales como plurónicos, colágeno, gelatina, ácido hialourónico, polisacáridos, hidrogel de poliuretano, hidrogel de poliuretano-urea y combinaciones de estos se prefieren actualmente . En todavía otra modalidad ejemplar, el conjugado de la invención incluye un componente de un liposoma. Los liposomas se pueden preparar de acuerdo con los métodos conocidos por aquellos experimentados en la técnica, por ejemplo, como se describe en Eppstein y colaboradores, Patente de EUA No. 4,522,811, la cual se emitió en Junio 11, 1985. Por ejemplo, las formulaciones de liposoma se pueden preparar por disolución apropiada de lípidos (tales como estearoil fosfatidil etanolamina, estearoil fosfatidil colina, arachadoil fosfatidil colina, y colesterol) en un solvente inorgánico que luego se evapora, dejando a un lado una película fina de lípido seco en la superficie del recipiente. Una solución acuosa del compuesto activo o su sal farmacéuticamente aceptable se introduce luego en el recipiente. El recipiente se agita luego a mano para liberar el material lípido de los lados del recipiente y para dispersar los agregados lípidos, formado de esa manera la suspensión liposomal. Las micropartículas descritas anteriormente y los métodos de preparación de las micropartículas se ofrecen a manera de ejemplo y no se pretende definir el alcance de las micropartículas de uso en la presente invención. Será apreciable para aquellos expertos en la técnica que un arreglo de micropartículas fabricadas por métodos diferentes, es de uso en la presente invención. Los formatos estructurales descritos anteriormente en el contexto de los polímeros solubles en agua, tanto de cadena lineal como ramificada generalmente se aplican con respecto a los polímeros insolubles en agua también. Así, por ejemplo, la cisteína, serina, dilisina, , y trilisina que ramifican núcleos se pueden funcionalizar con dos porciones de polímero insoluble en agua. Los métodos usados para producir estas especies generalmente son cercanamente análogos a aquellos usados para producir los polímeros solubles en agua. La vida media in vivo de glucopéptidos terapéuticos también se puede mejorar con porciones de PEG tales como polietilenglicol (PEG) . Por ejemplo, la modificación química de proteínas con PEG (PEGilación) aumenta su tamaño molecular y disminuye su accesibilidad de superficie y de grupo funcional, cada una de las cuales son dependientes del tamaño del PEG acoplado a la proteína. Esto resulta en un mejoramiento de las vidas medias de plasma y en estabilidad proteolítica, y una disminución en la i?münogenicidad y absorción hepática (Chaffee y colaboradores, J. Clin. Invest. 89:1643-1651(1992); Pyatak y colaboradores, Res. Común. Chem.

Pathol Pharmacol. 29:113-127 (1980)). La PEGilación de interleucina-2 se ha reportado que incrementa su potencia antitumor in vivo (Katre y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 84: 1487-1491 (1987)) y la PEGilación de un derivado F(ab')2 del anticuerpo monoclonal A7 ha aumentado su localización de tumor (Kitamura y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Común. 28:1387-1394 (1990)). Así, en otra modalidad, la vida media in vivo de un péptido derivado con una porción PEG por un método de la invención se incrementa relevante a la vida media in vivo del péptido no derivado. El aumento en la vida media in vivo del péptido se expresa mejor como un rango de por ciento incrementado en esta cantidad. La terminación menor del rango de por ciento de incremento es alrededor de 40%, alrededor de 60%, alrededor de 80%, alrededor de 100%, alrededor de 150% o alrededor de 200%. La terminación superior del rango es alrededor de 60%, alrededor de 80%, alrededor de 100%, alrededor de 150%, o más que alrededor de 250%.

Preparación de Azúcares Modificados. En general, la porción de azúcar y el grupo de modificación se ligan juntos a través del uso de grupos reactivos, los cuales se transforman comúnmente por el proceso de ligadura dentro de un grupo funcional orgánico nuevo o especie no reactiva. El o los grupos funcionales reactivos de azúcar, se localizan en cualquier posición en la porción del azúcar. Los grupos reactivos y clases de reacciones útiles en la práctica de la presente invención generalmente son aquellos que son bien conocidos en la técnica de química de bioconjugado. Las clases favorecidas comúnmente de reacciones disponibles con porciones de azúcar reactiva son aquellas, las cuales proceden bajo condiciones relativamente suaves. Estas incluyen, pero no se limitan a, sustituciones nucleofílicas (por ejemplo, reacciones de aminas y alcoholes con halogenuros de acilo, esteres activos) , sustituciones electrofílicas (por ejemplo, reacciones de enamina) y adiciones a enlaces múltiples carbono-carbono y carbono-heteroátomo (por ejemplo, reacción de Michael, adición de Diels-Alder) . Estas y otras reacciones útiles se describen en, por ejemplo, March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; y Feeney y colaboradores, Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D. C. , 1982. Los grupos funcionales reactivos pendientes de un núcleo de azúcar, precursor de ligadura o precursor de porción de modificación polimérica incluye, pero no se limitan a: (a) grupos carboxilo y varios derivados de estos incluyendo, pero no se limitan a, esteres de N- hidroxisuccinimida, esteres de N-hidroxibenztriazole, halogenuros ácidos, imidazoles de acilo, tioésteres, esteres de p-nitrofenilo, alquilo, alquenilo, alquinilo y esteres aromáticos; (b) grupos hidroxilo, los cuales se pueden convertir a, por ejemplo, esteres, éteres, aldehidos, etc. (c) grupos haloalquilo, en donde el halogenuro puede ser desplazado posteriormente con un grupo nucleofílico tal como, por ejemplo, una amina, un anión de carboxilato, anión de tiol, carbanión, o un ion alcóxido, resultando de esa manera en el acoplamiento covalente de un grupo nuevo en el grupo funcional del átomo de halógeno; (d) grupos de dienofilo, los cuales son capaces de participar en reacciones Diels-Alder tales como, por ejemplo, grupos maleimido; (e) grupos aldehido o cetona, tales que la derivatización subsiguiente es posible vía la formación de derivados de carbonilo tales como, por ejemplo, iminas, hidrazonas, semicarbazonas o oximas, o vía tales mecanismos como adición de Grignard o adición de alquilitio; (f) grupos halogenuro de sulfonilo para reacción subsiguiente con aminas, por ejemplo, para formar sulfonamidas ; (g) los grupos tiol, los cuales pueden ser, por ejemplo, convertidos a disulfuros o reaccionados con halogenuros de acilo; (h) grupos amina o sulfhidrilo, los cuales pueden ser, por ejemplo, acilatados, alquilatados u oxidados; (i) alquenos, los cuales puede someterse a, por ejemplo, cicloadiciones, acilación, adición de Michel, etc; y (j) epóxidos, los cuales pueden reaccionar con, por ejemplo, aminas y compuestos hidroxilo. Los grupos funcionales reactivos se pueden seleccionar de manera que ellos no participen o interfieran con, las reacciones necesarias para ensamblar el núcleo de azúcar de reacción o grupo de modificación. Alternativamente, un grupo funcional reactivo se puede proteger por la participación en la reacción por la presencia de un grupo de protección. Aquellos expertos en la técnica entienden cómo proteger un grupo funcional particular tal que no interfiere con un conjunto seleccionado de condiciones de reacción. Para ejemplos de grupos de protección útiles, ver, por ejemplo, Greene y colaboradores, Protective Groups in Organic Síntesis, John Wiley & Sons, New York, 1991. En la discusión que sigue, se establece un número de ejemplos específicos de azúcares modificados que son útiles en la práctica de la presente invención. En las modalidades ejemplares, un derivado de ácido siálico se utiliza como el núcleo del azúcar al cual se acopla el grupo de modificación.

El enfoque de la discusión sobre los derivados de ácido siálico es para claridad de ilustración solamente y no debe ser tomado para limitar el alcance de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que pueden ser activado y derivados una variedad de porciones de azúcar diferentes de una manera análoga a aquella establecida usando el ácido siálico como un ejemplo. Por ejemplo, numerosos métodos están disponibles para modificación de galactosa, glucosa, N-acetilgalactosamina y fucosa por nombrar unos cuantos sustratos de azúcar, los cuales se modifican fácilmente por métodos reconocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Elhalabi y colaboradores, Curr. Med. Chem. 6:93 (1999); y Schafer y colaboradores, J. Org. Chem. 65:24 (2000) ) . En el esquema de reacción 1 a continuación, el glicósido de amino 1, se trata con el éster activo de un derivado de aminoácido protegido (por ejemplo, glicina) , convirtiendo el residuo de amina de azúcar en el aducto de amida de aminoácido protegido correspondiente. El aducto se trata con una aldosa para formar a-hidroxi carboxilato 2. El compuesto 2 se convierte al derivado CMP correspondiente por la acción de la sintetasa CMP-SA, seguido por hidrogenación catalítica del derivado CMP para producir el compuesto 3. La amina inducida por medio de la formación del aducto de glicina se utiliza como una ubicación en el cromosoma de PEG o PPG acoplado por reacción del compuesto 3 con un derivado de (m-)PEG o (m-)PPG activado (por ejemplo, PEG-C(0)NHS, PPG-C (O) NHS) , produciendo 4 ó 5, respectivamente .

CMP-SA-5-NHCOCai2NH— PP© {tTI-PPG) 5 Esquema de reacción 1 Como apreciarán los expertos, la porción de modificación polimérica también puede ser una porción ramificada, tal como aquellas descritas en la presente. Un esquema de reacción ejemplar para la preparación de los azúcares modificados poliméricamente ramificados de la invención se proporciona a continuación: Otro esquema de reacción ejemplar para la preparar los azúcares modificados poliméricamente de la invención se establece a continuación: La Tabla 1 establece ejemplos representativos de monofosfatos de azúcar que se derivan con una porción de modificación polimérica, por ejemplo, una porción de PEG o PPG de cadena ramificada o lineal . Ciertos de los compuestos de la Tabla 1 se preparan por el método del Esquema de reacción 1. Otros derivados se preparan por métodos reconocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Keppler y colaboradores, Glycobiology 11: 11R(2001); y Charter y colaboradores, Glycobiology 0: 1049 (2000)) . Otros precursores y componentes de porción de modificación polimérica reactiva de amina, por ejemplo, análogos a PEG y PPG están disponibles comercialmente, o se pueden preparar por métodos fácilmente accesibles para ' aquellos expertos en la técnica. TABLA 1 CMP-SA-S-NH-R CMP-NeuAe-9-O- CMP-NcuAc-8-NH-R CMt?«euA<> -NH-R CMF-Ne???e- -G-K. en la cual R es la porción de modificación (cadena ramificada o lineal) polimérica. Los fosfatos de azúcar modificados de uso en la práctica de la presente invención se pueden sustituir en otras posiciones además de aquellas establecidas anteriormente. Las sustituciones preferidas actualmente de ácido siálico se establecen en la fórmula de a continuación: en la cual uno o más de Xc, Ya, Y , Yc y Z es un grupo que liga, el cual se selecciona preferiblemente de -O-, -N(H)-, -S, CH2-, y N(R)2. Cuando Xc, Ya, Yb, Yc y Z es un grupo que liga, este se acopla a la porción de modificación polimérica como se representa por Rc, Rd, Re, Rf y Rg. Alternativamente, estos símbolos representan una ligadura que se enlaza a una ' biomolécula de porción terapéutica de polímero soluble en agua o insoluble en agua de cadena ramificada o lineal, u otra porción. Cuando Rc, Rd, Re, Rf o Rg no es una porción de modificación polimérica, la combinación de XCRC, YaRd, YbRe, YcRf, o ZRg es H, OH o NC(0)CH3. También se proporciona un método sintético para producir un conjugado de grupo de modificación polimérica de ácido siálico activado que es un sustrato apropiado para una enzima que transfiere la porción de azúcar modificada sobre un aceptor, por ejemplo, una glucosiltransferasa. El método incluye las etapas: (a) poner en contacto manosamina con un aminoácido N-protegido activado (o un aminoácido funcionalizado con una porción de modificación polimérica, un precursor de ligadura o un cásete de porción de modificación polimérica de ligadura) bajo condiciones apropiadas para formar un conjugado de amida entre la manosamina y el aminoácido N-protegido,- (b) poner en contacto el conjugado de amida con piruvato y aldolasa de ácido siálico bajo condiciones apropiadas para convertir el conjugado de amida a un conjugado de amida de ácido siálico; (c) poner en contacto el conjugado de amida de ácido siálico con trifosfatos de citidina, y una sintetasa bajo condiciones apropiadas para formar un conjugado de amida de ácido siálico de monofosfato de citidina; (d) remover el grupo de N-protección del conjugado de amida de ácido siálico de monofosfato de citidina, produciendo de esa manera una amina libre; y (e) poner en contacto la amina libre con un PEG activado (cadena lineal o ramificada) ,. formando de esa manera ácido siálicode monofosfato de citidina-poli (etilenglicol) .

Grupos de reticulación. Preparación del azúcar modificada para uso en los métodos de la presente invención incluye acoplamiento de un grupo de modificación a un residuo de azúcar y formación de un aducto estable, el cual es un sustrato para una glucosiltransferasa. El azúcar y el grupo dé modificación se pueden_ conectar por un agente de reticulación de orden mayor o cero. Los compuestos bifuncionales ejemplares que se pueden usar para acoplar grupos de modificación a porciones de carbohidrato incluyen, pero no se limitan a, poli (etilenglicoles) , apoliamidas, poliéteres, poliésteres bifuncionales y similares . Propuestas generales para carbohidratos de ligadura a moléculas diferentes se conocen en la literaria. Ver, por ejemplo, Lee y colaboradores, Biochemistry 28:1856 (1989); Bhatia y colaboradores, Anal. Biochem. 178:408 (1989); Janda y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 112:8886 (1990) y Bednarski y colaboradores, WO 92/18135. En la discusión que sigue, los grupos reactivos se tratan como benignos en la porción de azúcar del azúcar modificado naciente. El enfoque de la discusión es para claridad de ilustración. Los expertos en la técnica apreciarán que la discusión es relevante para grupos reactivos en el grupo de modificación también. Una estrategia ejemplar involucra la incorporación de un sulfhidrilo protegido sobre el azúcar usando el (n- succinimidil-3- (2 -piridiltio) ropionato de SPDP de reticulación heterobifuncional y luego la desprotección del sulfhidrilo para formación de un enlace de disulfuro con otro sulfhidrilo en el grupo de modificación. Una variedad de reactivos se usan para modificar los componentes del azúcar modificado con reticulados químicos intramoleculares (para revisión de reactivos de reticulación y procedimientos de reticulación ver: Wold, F., Meth. Enzymol. 25:623-651, 1972; Weetall, H. H. , y Cooney, D. A., En: Enzymes as Drugs. (Hoelcenberg, and Roberts, eds.) pp. 395-442, Wiley, New York, 1981; Ji, T. H. Meth. Enzymol. 91: 580-609, 1983; Mattson y colaboradores, Mol. Biol. Rep. 17:167-183, 1993, todas las cuales están incorporadas en la presente por referencia) . Los reactivos de reticulación preferidos se derivan de varios reactivos de reticulación de longitud cero, homo-bifuncionales, y hetero-bifuncionales . Los reactivos de reticulación de longitud cero incluyen conjugación directa de dos grupos químicos intrínsecos sin introducción de material extrínseco.

Conjugación de Azúcares Modificados a Péptidos. Los azúcares modificados se conjugan a un péptido glucosilatado o no glucosilatado usando una enzima apropiada para mediar la conjugación. Así, los compuestos de la invención, particularmente los azúcares de nucleótido son preferiblemente sustratos para enzimas que transfieren porciones de azúcar desde un azúcar de nucleótido sobre un aminoácido, glucosilo, o porción aceptora de aglucon. Los azúcares de nucleótido que actúan como donadores de azúcar para aceptores, por ejemplo, aceptores de galactosilo, por ejemplo, GalNAc, Galßl, GlcNAc, Galßl, 4GalNAc, Galßl, 3GalNAc, lacto-N-tetraosa, Galßl, 3GlcNAc, Galßl, 3Ara, Galßl, 6GlcNAc, Galßl, 4Glc (lactosa), y otros aceptores bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Paulson y colaboradores, J. Biol. Chem. 253:5617-5624 (1978)). Las enzimas ejemplares para las cuales los azúcares de nucleótido modificados de la invención son sustratos incluyen glucosiltransferasas. Las glucosiltransferasas se pueden clonar, o aislar de cualquier fuente. Se conocen muchas glucosiltransferasas clonadas, como son sus secuencias de polinucleótido. Ver, por ejemplo, "The WWW Guide To Cloned Glycosyltransíerases" , (http : //www.vei . co . uk/TGN/gt guide . htm) . Las secuencias de aminoácido de glucosiltransferasa y las secuencias de nucleótido que codifican glucosiltransferasas de las cuales las secuencias de aminoácido se pueden deducir también se encuentran en varias bases de datos disponibles públicamente, que incluyen GenBank, Swiss-Prot, EMBL, y otras. Las glucosiltransferasas para las cuales los compuestos de la invención son sustratos incluyen, pero no se limitan a, glucosiltransferasas , fucosiltransferasas, glucosiltransferasas, N-acetilgalactosaminiltransferasas, N-acetilglucosaminiltransferasas , glucuroniltransferasas , sialiltransferasas, monosiltransferasas, transíerasas de ácido glucurónico, transferasas de ácido galacturónico, y oligosacariltransferasas. Las glucosiltransferasas apropiadas incluyen aquellas obtenidas de eucariotas, además de procariotas . En algunas modalidades, el compuesto de la invención es un sustrato para una fucosiltransferasa. Las fucosiltransferasas generalmente son conocidas por aquellos expertos en la técnica, y se ejemplifican por enzimas que transfieren L-fucosa desde GDP-fucosa a una posición hidroxi de un azúcar aceptor. En otro grupo de modalidades, el compuesto es un sustrato para una galactosiltransferasa. Las galactosiltransferasas ejemplares incluyen (1, 3) galactosiltransferasas (E.C. No. 2.4.1.151, ver, por ejemplo, Dabkowski y colaboradores, Transplant Proc. 25:2921 (1993) y Yamamoto y colaboradores, Nature 345:229-233 (1990), bovino (GenBankj04989, Joziasse y colaboradores, J. Biol.

Chem. 264:14290-14297 (1989)), murino (GenBank m26925; Larsen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86:8227-8231 (1989)), porcino (GenBank L36152; Strahan y colaboradores, Immunogenetics 41:101-105 (1995)). Otra al,3 galactosiltransferasa apropiada es aquella que está involucrada en la síntesis de antígeno del grupo sanguíneo B (EC 2.4.1.37, Yamamoto y colaboradores, J. Biol. Chem. 265:1146-1151 (1990) (human) ) . Todavía una galactosiltransfera ejemplar adicional es la Gal-Tl de núcleo. Todavía más ejemplos incluyen ß (1, 4) galactosiltransferasas, las cuales incluyen, por ejemplo, EC 2.4.1.90 (sintetasa LacNAc) y EC' 2.4.1.22 (sintetasa de lactosa) (bovino (D'Agostaro y colaboradores, Eur. J. Biochem. 183: 211-217 (1989)), humano (Masri y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Común. 157:657-663 (1988)), murino (Nakazawa y colaboradores, J. Biochem. 104:165-168 (1988)), además de E.C. 2.4.1.38 y la galactosiltransferasa de ceramida (EC 2.4.1.45, Srahl y colaboradores, J. Neurosci. Res. 38:234-242 (1994)). Otras galactosiltransferasas apropiadas incluyen, por ejemplo, al,2 galactosiltransferasas (de por ejemplo, Schizosaccharomyces pombe, Chapell y colaboradores, Mol. Biol. Cell 5:519-528 (1994) ) . También apropiadas en la práctica de la invención son las formas solubles de al, 3-galactosiltransferasa tales como aquellas reportadas por Cho y colaboradores, J. Biol.

Chem. 272:13622-13628 (1997). a) Sia.liltransf erasas Las sialiltransferasas son otro tipo de glucosiltransferasas para las cuales los compuestos de la invención son sustratos. Ejemplos incluyen ST3Gal III (por ejemplo, un ST3Gal III de ratón o humano) , ST3Gal IV, ST3Gal I, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, ST6GalNAc I, ST6GalNAc II, y ST6GalNAc III (la nomenclatura de sialiltransferasa usada en la presente es como se describe en Tsuji y colaboradores, Glycobiology 6:v-xiv (1996)). Una o: (2, 3) sialiltransferasa ejemplar referida como a (2, 3) sialiltransferasa (EC 2.4.99.6) transfiere ácido siálico a la terminal sin reducción Gal de un Galßl?3Glc disacárido o glicósido. Ver, Van den Eijnden y colaboradores, J. Biol. Chem. 256:3159 (1981), Weinstein y colaboradores, J. Biol. Chem. 257:13845 (1982) y Wen y colaboradores, J. Biol. Chem. 267: 21011 (1992). Otra a2,3-sialiltransferasa ejemplar (EC 2.4.99.4) transfiere ácido siálico al Gal terminal sin reducción del disacárido o glicósido. Ver, Rearick y colaboradores, J. Biol. Chem. 254-4444 (1979) y Gillespie y colaboradores, J. Biol. Chem. 267:21004 (1992). Más enzimas ejemplares incluyen Gal-ß-1,4-GlcNAc a-2,6 sialiltransferasa (Ver, Kurosawa y colaboradores, Eur. J. Biochem. 219:375-381 (1994)). Otras sialiltransferasas para las cuales los compuestos de la invención son sustratos incluyen aquellos- que forman ácidos polisiálicos . Ejemplos incluyen las o¡-2,8- polisialiltransferasas, por ejemplo, ST8SiaI, STdSialI, STdSialII, STdSialV y ST8SiaV. Ver, por ejemplo, Angata y colaboradores, J. Biol. Chem. 275:18594-18601 (2000); Kono y colaboradores, J. Biol. Chem. 271: 29366-29371 (1996); Greiner y colaboradores, Infect. Immun. 72:4249-4260 (2004); y Jones y colaboradores, J. Biol. Chem. 277:14598-14611 (2002) . Un ejemplo de na sialiltransferasa que es útil en los métodos reivindicados es ST3Gal III, la cual también es referida como a (2, 3) sialiltransferasa (EC 2.4.99.6). Esta enzima cataliza el transfer de ácido siálico para el Gal de un glicósido Galßl, 3GlcNAc o Galßl, 4GlcNAc (ver, por ejemplo, Wen y colaboradores, J. Biol. Chem. 267:21011 (1992); Van den Eijnden y colaboradores, J. Biol. Chem. 256:3159 (1991)). Todavía otras sialiltransferasas incluyen aquellas aisladas de Campylobacter jejuni, que incluyen la OÍ (2, 3). Ver por ejemplo, WO99/49051. Preferiblemente, los compuestos de la invención son sustratos para una enzima que transfieren las modificaciones de ácido siálico a la secuencia Galßl, 4GlcNAc-, la secuencia penúltima más común que subraya el ácido siálico terminal en estructuras de carbohidrato sialiladas completamente. b) Transferasas GalNAc Los compuestos seleccionados de la invención son sustratos para N-acetilgalactosaminiltransferasas . Las N- acetilgalactosaminiltransferasas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, OÍ(1,3) N- acetilgalactosaminiltransferasas, ß(l,4) N- acetilgalactosaminiltransferasas (Nagara y colaboradores, J. Biol. Chem. 267:12082-12089 (1992) y Smith y colaboradores, J. Biol. Chem. 269:15162 (1994)) y polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferasas (Homa y colaboradores, J. Biol. Chem. 268:12609 (1993)). c) Glucosidasas Esta invención también abarca sustratos para glucosidasas de tipos silvestres o mutantes. Las enzimas ß-galactosidasa mutantes han demostrado catalizar la formación de disacáridos a través del contacto de fluoruro de -glucosilo a una molécula aceptora de galactosilo. (Withers, Patente de EUA No. 6,284,494; emitida en Sept . 4, 2001). Otras glucosidasas de uso en esta invención incluyen, por ejemplo, ß-glucosidasas, ß-galactosidasas, ß-manosidasas, ß-acetil glucosaminidasas, ß-N-acetil galactosaminidasas, ß-xilosidasas, ß-fucosidasas, celulasas, xilanasas, galactanasas, mananasas, hemicelulasas, amilasas, glucoamilasas, a-glucosidasas, a-galactosidasas, OÍ-manosidasas, a-N-acetil glucosaminidasas, a-N-acetil galactosa-aminidasas, a-xilosidasas, a-fucosidasas, y neuraminidasas/sialidasas, endoglucoceramidasas . Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar modalidades seleccionadas de la invención y no son para ser construidas como limitación de su alcance .

EJEMPLOS Ejemplo 1 Preparación de UDP-GalNAc-6' -CHO El UDP-GalNAc (200 mg, 0.30 mmoles) se disolvió en una solución de CuS04 1 mM (20 mL) y una solución de NaH2P04 25 mM (pH 6.0; 20 mL) . La oxidasa de galactosa (240 U; 240 µL) y catalasa (13000 U; 130 µL) fueron luego agregadas, el sistema de reacción equipado con un globo lleno con oxígeno y agitado a temperatura ambiente por siete días. La mezcla de reacción fue filtrada luego (cartucho de giro; MWCO 5K) y el filtrado (~40 mL) fue almacenado a 4°C hasta que se requirió. CCD (sílice; EtOH/agua (7/2); Rf=0.77; visualizada con teñido de anisaldehído) .

Ejemplo 2 Preparación de UDP-GalNAc-6' -NH2) : Acetato de amonio (15 mg, 0.194 mmoles) y NaBh3CN (solución de THF 1M; 0.17 mL, 0.17 mmoles) fueron agregados a la solución de UDP-GalNAc-6' -CHO del ejemplo anterior (2 mL o ~20 mg) a 0°C y se dejó calentar a temperatura ambiente durante la noche. La reacción fue filtrada a través de una columna G-10 con agua y el producto recolectado. Las fracciones apropiadas fueron secadas por congelamiento y congeladas para almacenar. CCD (sílice; etanol/agua (7/2); Rf=0.72; visualizada con reactivo de nihidrina) . _ Ejemplo 3 Preparación de ÜDP-GalNAc- 6-NHCO (CH2) 2-0-PEG-0Me (1 KDa).

El galactosamil-l-fosfato-2-NHCO(CH2)2-0-PEG-OMe (1 KDa) (58 mg, 0.045 mmoles) fueron disueltos en DMF (6 mL) y piridina (1.2 mL) . UMP-morfolidato (60 mg, 0.15 mmoles) fueron luego agregados y la mezcla que resulta se agitó a 70 °C por 48 h. El solvente fue removido por burbujeo de nitrógeno a través de la mezcla de reacción y el residuo fue purificado por cromatografía de fase inversa (C-18 sílice, paso gradiente entre 10 a 80%, metanol/agua) . Las fracciones deseadas fueron recolectadas y secadas a presión reducida para producir un polvo blanco. CCD (sílice; propano/H20/NH4OH, (30/20/2); Rf=0.54). EM (MALDI) : Observado, 1485, 1529, 1618, 1706.

Ejemplo 4 Preparación de Cistein-PEG2 (2 ) 4.1 Síntesis del Compuesto 1 Se agregó hidróxido de potasio (84.2 mg, 1.5 mmol, como un polvo) a una solución de L-cisteína (93.7 mg, 0.75 mmol) en metanol anhidro (20 L) bajo argón. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente por 30 min, y se agregó luego mPEG-0-tosilato de masa molecular 20 kilodaltones (Ts; 1.0 g, 0.05 mmol) en varias porciones durante 2 horas. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente por 5 días, y concentrada por evaporación rotativa. El residuo fue diluido con agua (30 mL) , y agitado a temperatura ambiente por 2 horas hasta destruir cualquier exceso de mPEG-O-tosilato de 20kilodalton. La solución fue luego neutralizada con ácido acético, el pH se ajustó a pH 5.0 y se cargó en una columna de cromatografía de fase inversa (C-18 sílice) . La columna fue eluída con un gradiente de metanol/agua (el producto se eluye a aproximadamente 70% metanol) , el producto de elusión se revisó por difusión luminosa evaporadora, y las fracciones apropiadas fueron recolectadas y diluidas con agua (500 mL) . Esta solución fue procesada por cromatografía (intercambio de iones, XK 50 Q, perlas BIG, 300 ml, forma de hidróxido; gradiente de agua para agua/ácido acético-0.75 N) y el pH de las fracciones apropiadas se disminuyó hasta 6.0 con ácido acético. Esta solución fue luego capturada en una columna de fase inversa (C-18 sílice) y eluída con un gradiente de metanol/agua como se describió anteriormente . Las fracciones del producto fueron acumuladas, concentradas, vueltas a disolver en agua y secadas por congelamiento para proporcionar un sólido blanco (1) . Los datos estructurales para el compuesto fueron los siguientes: *"H-RMN (500 MHz; D20) d 2.83 (t, 2H, 0-C-CH2-S) , 3.05 (q, 1H, S-CHH-CHN), 3.18 (q, 1H (q, 1H, S-CHH-CHN), 3.38 (s, 3H, CH30) , 3.7 (t, OCH2CH20) , 3.95 (q, 1H, CHN) . La pureza del producto fue confirmada por SDS-PAGE. 4 . 2 Síntesis del Compuesto 2 (Ciste£na-PEG2) Se agregó trietilamina (~0.5 mL) por goteo a una solución del compuesto 1 (440 mg, 22 µmol) disuelto en CH2C12 anhidro (30 mL) hasta que la solución fue básica. Una solución de carbonato de mPEG-P-p-nitrofenilo de 20 kilodaltones (660 mg, 33 µmol) y N-hidroxisuccinimida (3.6 mg, 30.8 µmol) en CH2C12 (20 mL) fue agregada en varias porciones durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente por 24 horas . El solvente fue removido luego por evaporación rotativa, el residuo fue disuelto en agua (100 mL) , y el pH se ajustó a 9.5 con NaOH 1.0 N. La solución básica fue agitada a temperatura ambiente por 2 horas y luego fue neutralizada con ácido acético hasta un pH de 7.0. La solución fue luego cargada en una columna de cromatografía de fase inversa (C-18 sílice) . La columna fue eluída con un gradiente de metanol/agua (el producto eluye a aproximadamente 70% de metanol) , el producto de elusión se revisó por difusión de luz evaporadora, y las fracciones apropiadas fueron recolectadas y diluidas con agua (500 mL) . Esta solución se procesó por cromatografía (intercambio de iones, XK 50 Q, perlas BIG, 300 ml, forma de hidróxido; gradiente de agua para agua/ácido acético-0.75 N) y el pH de las fracciones apropiadas se disminuyó hasta 6.0 con ácido acético. Esta solución fue luego capturada en una columna de fase inversa (C-18 sílice) y eluída con un gradiente de metanol/agua como se describió anteriormente. Las fracciones del producto fueron acumuladas, concentradas, vueltas a disolver en agua y secadas por congelamiento para proporcionar un sólido blanco (2) . Los datos estructurales para el compuesto fueron los siguientes: -?-RMN (500 MHz; D20) d 2.83 (t, 2H, 0-C-CH2-S) , 2.95 (t, 2H, 0-C-CH2-S) , 3.12 (q, 1H, S-CHH-CHN), 3.39 (s, 3H, CH30) , 3.71 (t, OCH2CH20) . La pureza' del producto fue confirmada por SDS-PAGE-.- Ejemplo 5 Preparación de UDP-GalNAc-6-NHCO (CH2) 2-0-PEG-OMe (1 KDa).

Se disolvió Galactosaminil-l-fosfato-2-NHCO (CH2) 2-0-PEG- OMe (1 Kilodalton) (58 mg, 0.045 mmoles) en DMF (6 mL) y piridina (1.2 mL) . Luego se agregó UMP-morfolina (60 mg, 0.15 mmoles) y la mezcla que resulta se agitó a 70 °C por 48 h. El solvente fue removido por burbujeo de nitrógeno a través de la mezcla de reacción y el residuo fue purificado por cromatografía de fase inversa (C-18 sílice, paso gradiente entre 10 a 80%, metanol/agua) . Las fracciones deseadas fueron recolectadas y secadas a presión reducida para producir un sólido blanco. CCD (sílice, propanol/H20/NH4OH, (30/20/2), Rf=0.54). MS(MALDI): Observado, 1485, 1529, 1618, 1706.

Procedimiento SDS PAGE La pureza de los productos, 1 y 2, fue confirmada por SDS PAGE. Se usó un gel SDS PAGE de Tris-Glicina 4-20%. La muestra se mezcló 1:1 con Solución Amortiguadora de Muestra SDS, y fue corrida en Solución Amortiguadora de Corrida Tris-Glicina (LC2675-5) a un voltaje constante (125 V) por 1 hr 50 min. Después de electroforesis, el gel fue lavado con agua (100 mL) por 10 min seguido por un lavado con una solución acuosa de cloruro de bario 5% (100 mL) por 10 min. Los productos 1 ó 2 fueron visualizados por teñido de los geles con solución de yodo 0.1 N (4.0 mL) a temperatura ambiente y el proceso de teñido se detuvo por lavado de los geles con agua. Las bandas del producto visualizado fueron revisadas con un HP Scanjet 7400C, y la imagen del gel fue optimizada con el HP Precisión Sean Program. Aungue esta invención se ha descrito con referencia a modalidades específicas, es palpable que otras modalidades y variaciones de esta invención pueden ser vistas por otros expertos en la técnica sin apartarse del espíritu y alcance verdadero de la invención. Todas las patentes, solicitudes de patentes, y otras publicaciones citadas en esta solicitud están incorporadas por referencia en la presente en su totalidad para todos los propósitos . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un compuesto que tiene una fórmula que es un miembro seleccionado de: caracterizado porque R1 es H, CH2OR7, COOR7 u OR7 en las cuales R7 representa H, alquilo sustituido o no sustituido o heteroalquilo sustituido o no sustituido; R2 es un miembro seleccionado de H, OH, un grupo de activación y una porción que incluye un nucleótido; R3, R4, Rs, Rs, y Re' independientemente se seleccionan de H, alquilo sustituido o no sustituido, OR9, y NHC(0)R10 en donde R9 y R10 independientemente se seleccionan de H, alquilo sustituido o no sustituido, heterolaquilo sustituido o no sustituido, y por lo menos uno de R3, R4, R5, Re, y R6' incluye una porción de modificación polimérica. 2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque R2 tiene la fórmula: en la cual R8 es un nucleósido.
3. 3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 2 caracterizado porque R8 es un miembro seleccionado de citosina, uridina, guanosina, adenosina y timidina.
4. 4. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque por lo menos uno de R3, R4, R5 y Rs incluye la porción: ( % L en donde R11 es una porción de modificación polimérica; L es un miembro seleccionado de un enlace y un grupo de ligadura; y w se selecciona de los enteros desde 1 hasta 6.
5. 5. El compuesto de conformidad con la reivindicación 4 caracterizado porque el grupo de ligadura es un miembro seleccionado de porciones de alguilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido.
6. 6. El compuesto de conformidad con la reivindicación 5 caracterizado porque la porción: (R ) L" tiene la fórmula: en donde X2 y X4 independientemente se seleccionan de fragmentos de ligadura; Xa es un fragmento de ligadura; R12 y R13 independientemente se seleccionan de brazos poliméricos; y c es un entero de 1 hasta 20.
7. 7. El compuesto de conformidad con la reivindicación 5 caracterizado porque el grupo de ligadura tiene la fórmula: | X?—L1 Xb en la cual Xa y Xb se seleccionan independientemente de fragmentos de ligadura; y L1 es un miembro seleccionado de un enlace, alquilo sustituido o no sustituido o heteroalquilo sustituido o no sustituido.
8. 8. El compuesto de conformidad con la reivindicación 7 caracterizado porque Xa y Xb son fragmentos de ligadura seleccionados independientemente de S, SC(0)NH, HNC(0)S, SC(0)0, O, NH, NHC(O), (O) CNH y NHC (O) O, y OC(0)NH.
9. 9. El compuesto de conformidad con la reivindicación 5 caracterizado porque la ligadura comprende una porción de acilo.
10. 10. El compuesto de conformidad con la reivindicación 9 caracterizado porque L-R11 tiene la fórmula: |—NHC(O)(CH2)—NHC(O}—R1 en la cual s es un entero desde 0 hasta 20; y R11 es la porción de modificación polimérica.
11. 11. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque la porción de modificación polimérica tiene la fórmula: en donde X2 y X4 se seleccionan independientemente de fragmentos de ligadura; X5 es un grupo no reactivo; y R12 y R13 se seleccionan independientemente de brazos poliméricos .
12. 12. El compuesto de conformidad con la reivindicación 11 caracterizado porque X2 y X4 son fragmentos de ligadura seleccionados independientemente de S, SC(0)NH, HNC(0)S, SC(0)0, 0, NH, NHC(O), (O) CNH y NHC (O) O, 0C(0)NH y (NH2)gY'' en donde g es un entero desde 1 hasta 50; y Y'' es un miembro seleccionado desde O, S y NH.
13. 13. El compuesto de conformidad con la reivindicación 11 caracterizado porque X4 es un enlace de péptido; y R13 es un residuo de aminoácido.
14. 14. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque tiene la fórmula: en la cual D es un miembro seleccionado de -OH y (R1:L)W<-L-; G representa un miembro seleccionado de H, (R1:L)W»-L- y C(O) (C?-C6) alquilo; w' es un entero desde 2 hasta 6, y por lo menos uno de D y G es (R?:L)w<-L-.
15. 15. El compuesto de conformidad con la reivindicación 14, que tiene la fórmula:
16. IV V caracterizado porque La es un miembro seleccionado de alquilo sustituido o no sustituido o de heteroalquilo sustituido o no sustituido. 16. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, que tiene la fórmula: caracterizado porque La es un miembro seleccionado de un residuo de aminoácido y un residuo de peptidilo que tiene desde 2 hasta 4 residuos de aminoácido; X2 y X4 se seleccionan independientemente de fragmentos de ligadura; X5 es un grupo no reactivo; y R12 y R13 se seleccionan independientemente de brazos poliméricos . 17. El compuesto de conformidad con la reivindicación 16, que tiene la fórmula:
17. VI VII caracterizado porque X2 y X4 independientemente se seleccionan de fragmentos de ligadura; Xa es un fragmento de ligadura; R12 y R13 independientemente se seleccionan de brazos poliméricos; y c es un entero de 1 hasta 20.
18. 18. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, que tiene la fórmula: caracterizado porque AA-NH es un residuo de aminoácido; y P es un grupo de modificación polimérico.
19. 19. El compuesto de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque -AA-NH es -CH2NH.
20. 20. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto es un sustrato para una enzima que transfiere una porción de azúcar desde un miembro seleccionado de un azúcar activo, un azúcar de nucleótido y combinaciones de estos sobre una porción aceptora de un sustrato .
21. 21. El compuesto de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la porción aceptóra es un miembro seleccionado de residuo de glucosilo, un residuo de aminoácido y una aglicona.
22. 22. Un método de preparación de ácido siálico de monofosfato de citidina-poli (etilenglicol) , caracterizado porque comprende : (a) poner en contacto manosamina con un aminoácido N-protegido activado bajo condiciones apropiadas para formar un conjugado de amida entre la manosamina y el aminoácido N-protegido; (b) poner en contacto el conjugado de amida con piruvato y aldolasa de ácido siálico bajo condiciones apropiadas para convertir el conjugado de amida a un conjugado de amida de ácido siálico; (c) poner en contacto el conjugado de amida de ácido siálico con trifosfatos de citidina, y una sintetasa bajo condiciones apropiadas para formar un conjugado de amida de ácido siálico de monofosfato de citidina; (d) remover el grupo de N-protección del conjugado de amida de ácido siálico de monofosfato de citidina, produciendo de esa manera una amina libre; y (e) poner en contacto la amina libre con un PEG activado, formando de esa manera el ácido siálico de monofosfato de citidina-poli (etilenglicol) .
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el aminoácido N-protegido activado tiene la fórmula: