KR20060132265A - 초미립 고정화 발광미생물의 제조방법 및 이를 이용한 유독물질 모니터링 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 초미립 고정화 발광미생물과 그 제조방법 및 이를 이용한 유독물질 모니터링 방법에 관한 것으로써, 종래의 고정화 발광미생물은 크기가 3mm 전후로 크기 때문에 유독물질의 반응성이 떨어지고, 동결 건조된 발광미생물을 사용하여 모니터링하는 것이므로 취급 관리가 어렵고 유독물질의 접촉시간이 오래 걸리면서 반응성이 떨어져 모니터링의 정확성이 저하되는 문제점이 있다.

이에 본 발명은 유독물질의 농도에 비례하여 발광량이 감소하는 발광미생물을 고정화 물질로 고정화 시킬 때 직경 0.01 ~ 0.03mm 크기로 초미립화된 마이크로비드로 제조하고, 그러한 초미립 고정화 발광미생물을 이용하여 모니터링하는 것이다. 이러한 본 발명은 기존의 발광미생물(bead)에 비해 표면적의 차이가 1~10만배의 차이가 나타남에 따라 신속하게 중금속이 접촉되어 감도 높게 반응하게 되고, 유독성 모니터링시 대조군도 같이 측정하여 상대적인 발광도 값으로 평가를 하는 것이므로 대조군 자체에 의한 오류를 최소화 하면서 시료내에 존재하는 유독물질의 독성 정도를 보다 신속 정확하게 모니터링 할 수 있다.

고정화 발광미생물, 초미립 고정화 발광미생물, 유독물질 모니터링,

Description

초미립 고정화 발광미생물과 그 제조방법 및 이를 이용한 유독물질 모니터링 방법{Microsome fixed radiance microbe and it's manufacture method and by using a poisonous material monitor method}

도 1 은 본 발명에 의해 만들어진 초미립 고정화 발광미생물의 광학 현미경 사진.

도 2 는 종래의 고정화 발광미생물이 중금속 용액에 대하여 시간에 따라 발광량의 변화를 나타낸 그래프.

도 3 은 본 발명의 초미립 고정화 발광미생물이 중금속 용액에 대하여 시간에 따라 발광량의 변화를 나타낸 그래프.

도 4 는 종래의 고정화 발광미생물을 사용하여 중금속 용액에 대한 시간 단위당 발광량의 변화를 대조군에 대하여 상대 발광도로 나타낸 그래프.

도 5 는 본 발명의 초미립 고정화 발광미생물을 사용하여 중금속 용액에 대한 시간 단위당 발광량의 변화를 대조군에 대하여 상대 발광도로 나타낸 그래프.

도 6 은 종래의 고정화 발광미생물과 본 발명의 초미립 고정화 발광미생물의 지온 저장시 발광량의 변화를 나타낸 그래프.

본 발명은 초미립 고정화 발광미생물과 그 제조방법 및 이를 이용한 유독물질 모니터링 방법에 관한 것으로써, 좀 더 구체적으로는 상수원과 같은 공공성이 높은 시료 내에 존재하는 중금속과 같은 유독물질의 농도에 비례하여 발광미생물의 발광량이 감소되는 원리를 이용하여 시료내에 존재하는 유독물질의 데이터를 신속 정확하게 검출하여 실시간 검사하는 초미립 고정화 발광미생물과 그 제조방법 및 이를 이용한 유독물질 모니터링 방법에 관한 것이다.

일반적으로 발광미생물(bead)을 이용하여 유독물질을 검출하는 모니터링 방식과 기기는 여러 종류가 개발되어 상용화되어 있는 실정이며, 그 중에서 미국의 아즈르 인바이론멘탈(Azur Environmental)사에서 개발한 마이크로톡스(Microtox)는 동결 건조한 발광미생물인 비브리오휘셔리(Vibrio fischeri NRRL B-11177)를 이용하여 발광미생물이 유독성 물질과 접촉할 때 독성으로 인해 발광량이 저하되는 것에 기초하여 시료의 독성을 모니터링하여 분석하는 방식이다.

그리고 상기 방식에 의해 시료의 독성을 분석하는 기기는 발광탐지부, 온도조절부 및 동결 건조된 발광미생물과 시료의 주입부로 구성되어 있다. 상기 분석 기기를 이용한 모니터링 방식은 측정의 간편함과 정확성 때문에 많이 이용되고 있기는 하다.

하지만, 상기의 유독물질 모니터링 방식은 동결 건조된 발광미생물을 사용하는 것이기 때문에 취급에 주의를 기울여야 함과 아울러 동결 건조 상태의 발광미생 물을 별도 관리하여야 하는데 따르는 불편함이 많다.

또한 상기의 문제점을 감안하여 동결 건조되지 않은 발광미생물을 시험관에 미리 수동으로 넣어서 측정하는 반자동 상태의 측정방식이 개발되기도 하였으나, 이는 고정화된 발광미생물(bead)의 크기가 3mm 전후로 상당히 크기 때문에 비드내의 미생물에 유독물질이 접촉하는 시간이 필요이상 오래 걸리고 유독물질에 대한 반응성도 떨어지는 문제점을 내포하고 있다.

따라서 취급 및 관리가 용이하면서도 시료내에 존재하는 유독물질을 신속하고 감도 높게 검출할 수 있는 발광미생물과 그 제조방법 및 모니터링 방법을 개발하여야 할 필요성이 대두되고는 있으나 그동안 마땅한 대안이 제시되지 못하였다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 감안하여 개발된 것으로서, 본 발명의 목적은 유독물질의 농도에 비례하여 발광량이 감소하는 발광미생물을 고정화 물질로 초미립 고정화시켜서 시료의 유독물질이 접촉하는 시간을 최대한 단축시키고 유독물질에 대하여 감도높게 반응할 수 있는 초미립 고정화 발광미생물과 그 제조방법을 제공하는데 있다.

여기서 상기 고정화 물질은 알긴산, 한천(agar), 카라기난 또는 폴리아크릴아미드 등이고, 시료는 수질과 대기 또는 토양에서 추출한 액상의 오염물질을 포함한다.

이러한 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위해 유독물질의 농도에 비례하여 발광량이 감소하는 발광미생물을 고정화 물질로 고정화 시킬 때 직경 0.01~ 0.03mm 크기로 초미립화된 마이크로비드로 제조하면 되는 것으로서, 유독물질이 함유된 시료를 접촉시키고 일정한 시간마다 발광량을 측정하였을 때 기존의 발광미생물(bead)에 비해 표면적의 차이가 1~10만배의 차이가 나타남에 따라 신속하게 중금속이 접촉되어 감도 높게 반응하므로 상기 목적을 효과적으로 달성할 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 시료 내 존재하는 유독물질을 신속 정확하게 높은 감도로 검출하여 분석할 수 있는 초미립 고정화 발광미생물을 이용한 유독물질 모니터링 방법을 제공하는데 있다.

이러한 본 발명은 유독물질의 농도에 비례하여 발광량을 감소시키는 발광미생물을 직경 0.01 ~ 0.03mm 크기의 초미립 마이크로비드 상태로 고정화한 다음 그 초미립 고정화된 마이크로비드 일정량과 유독물질 시료를 시험관에 자동 주입되게 하고 일정한 시간 간격마다 발광량을 측정한 다음 수득한 데이터를 기준 데이터와 비교하면 감도높게 작용하는 초미립 고정화 발광미생물에 의해 시료내에 존재하는 유독물질의 독성 정도를 신속 정확하게 고감도로 모니터링 할 수 있으므로 상기 목적을 효과적으로 달성할 수 있다.

본 발명의 상기 목적을 효과적으로 달성할 수 있는 바람직한 기술구성 및 작용을 첨부한 별첨 도면에 의해 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 시료에 함유된 유독물질의 농도에 비례하여 발광량이 감소되는 발 광미생물을 구성함에 있어서, 고정화 물질에 현탁시킨 발광미생물 균체를 겔 상태에서 직경 0.01 ~ 0.03mm 크기의 마이크로비드(micro bead)로 만든 초미립 고정화 발광미생물을 특징으로 한다.

이러한 본 발명은 고정화 발광미생물이 직경 0.01 ~ 0.03mm 크기의 마이크로비드이므로 기존의 3mm 크기인 발광미생물(bead)에 비해 표면적이 무려 1~10만배의 차이가 나게 된다.

따라서, 유독물질이 함유된 시료를 접촉시켰을 때 본 발명의 마이크로비드는 종래의 비드에 비해 중금속이 훨씬 신속하게 발광미생물에 접촉할 수 있으며, 발광미생물이 시료의 중금속에 매우 감도 높게 반응하므로 발광도의 차이가 확연하게 차이가 나게 되고 이에 따라 데이터를 정밀하게 얻을 수 있다.

이하에서는 본 발명의 마이크로비드를 제조하는 방법을 실시예1로 하고, 본 발명의 초미립 고정화 발광미생물을 이용한 유독물질 모니터링 방법을 실시예2로 하여 설명하기로 한다.

실시예1 (초미립 고정화 발광미생물의 제조방법)

본 발명은 시료에 함유된 유독물질의 농도에 비례하여 발광량이 감소되는 발광미생물을 제조할 때 고정화 물질과 혼합된 발광미생물을 해수 컴플리트 배지에서 22~27℃ 의 온도로 45~50시간 배양하는 단계와; 원심분리하여 회수된 발광미생물 균체를 0.5~0.8% 의 생리적 식염수에 1차 현탁하고, 그 후 다시 원심분리하여 얻은 균체를 2~3% 식염수에 재차 현탁하는 단계와; 상기 균체 혼탁액을 고정화 물질에 가하여 혼합한 후 칼슘염 또는 스트론튬염 용액에 분무하고, 그 후 0~5℃에서 1~3 시간 방치하여 겔 상태의 마이크로비드를 수득하는 단계; 로 이루어진 초미립 고정화 발광미생물의 제조방법을 특징으로 하며, 이를 단계별로 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

제 1 단계 (발광미생물의 균체 배양단계)

알긴산 등의 고정화 물질을 이용하여 비브리오휘셔리(Vibrio fischeri) 등과 같이 고정에 이용되는 발광미생물을 해수 컴플리트 배지(seawater complete 배지)에서 22~27℃ 의 온도로 45~50시간 배양한다. 여기서 상기 해수 컴플리트 배지는 3~5g 펩톤, 1~2g 효모추출물, 3~5ml 글리세롤, 70~80% 해수 1000ml 로 만들어진 것을 사용하는 것이 바람직하다.

제 2 단계 (균체의 현탁단계)

그런 다음 원심분리하여 발광미생물 균체를 회수하고 그 회수된 균체를 0.5~0.8% 의 생리적 식염수에 현탁하며, 그 후 다시 원심분리하여 얻은 균체를 2~3% 식염수에 잔 알갱이로 흩어져 떠있는 상태가 되도록 현탁한다.

여기서 상기 생리적 식염수에 의한 1차 현탁은 발광미생물을 깨끗하게 세척하는 과정이고, 그러한 발광미생물을 2~3% 식염수로 재차 현탁하면 그 발광미생물은 발광도를 오래 유지하게 된다. 따라서 상기와 같이 2회에 걸쳐 현탁하는 것이 바람직하다.

제 3 단계 (마이크로비드의 수득단계)

그 후 균체 혼탁액 1ml를 2~3% 알긴산나트륨 염 용액 100ml 에 가하고 잘 혼합한 후 멸균한 분무기에 넣고 고정화제인 칼슘염 또는 스트론튬염 용액에 균체 현 탁액을 분무한 다음 저온(0~5℃)에서 1~3시간 방치하면 겔 상태가 되면서 본 발명의 초미립 상태로 고정화된 발광미생물(micro bead)을 수득할 수 있다.

이와 같이 생성된 본 발명의 초미립 고정화 발광미생물은 도1 에서와 같이 직경 0.01 ~ 0.03mm 크기의 초미립 마이크로비드로서 기존 비드의 직경인 3mm 에 비해 매우 미세한 크기임을 알 수 있다.

여기서 상기 외의 다른 조건을 갖춘 대조군으로서, 상기 균체 혼탁액 1ml를 2~3% 알긴산나트륨 염 용액 100ml 에 가하고 잘 혼합한 후 마이크로 펌프를 이용하여 칼슘염 또는 스트론튬염 용액에 균체 현탁액을 적가하면 겔 상태가 되면서 본 발명의 초미립 고정화 발광미생물(micro bead)을 수득할 수 있다.

이와 같이 수득된 본 발명의 초미립 고정화 발광미생물은 발광도가 오래 유지되고, 직경 0.01 ~ 0.03mm 크기의 초미립화된 마이크로비드로 제조된 것이므로 기존의 3mm 크기인 발광미생물(bead)과 표면적을 비교해 볼 때 무려 1~10만배의 차이가 나타나며, 이로 인해 유독물질이 함유된 시료를 접촉시켰을 때 중금속이 훨씬 신속하게 발광미생물에 접촉할 수 있음을 알 수 있다.

따라서 본 발명은 발광미생물이 시료의 중금속에 매우 감도 높게 반응하게 되어 그 발광도의 차이가 확연하게 차이가 나게 되므로 신속하고 정밀한 데이터를 얻을 수 있는 것이다.

실시예2 (상기 발광미생물을 이용한 유독물질 모니터링 방법)

도2 는 종래의 고정화 발광미생물이 중금속 용액에 대하여 시간에 따라 발광량 변화를 나타낸 그래프이고, 도3 은 본 발명의 초미립 고정화 발광미생물이 중금 속 용액에 대하여 시간에 따라 발광량 변화를 나타낸 그래프로서, 이는 양자를 일반적인 유독물질 모니터링 방법으로 발광량 변화를 측정한 일례이다.

이는 종래의 비드와 본 발명의 마이크로비드를 각각 마이크로플레이트에 가하고 15분간 20℃를 유지하여 균을 활성화 시킨 후 시료를 1ppm 농도의 납(Pb), 크롬(Cr), 카드뮴(Cd), 수은(Hg), 비소(As) 용액 및 대조군으로서 증류수를 각각 150㎕ 씩 가한 후 발광량의 변화를 측정하였으며, 시료 투입이 완료된 마이크로플레이트의 발광미생물에 의한 발광량 변화를 96-웰마이크로플레이트 광 측정장치(Packard Instrument사, USA)를 이용하여 490nm에서 5분 간격으로 측정한 결과로서 발광도의 감소를 나타내고 있다.

이때 도2 및 도3 에서 dH2O는 대조군을 타나내고 있으나 대조군 역시 시간이 경과함에 따라 발광도의 감소가 나타나므로 유해물질의 접촉에 의한 발광도의 감소를 판별하기 힘든 단점이 있다.

또한 대조군의 발광도 감소율은 균의 상태에 따라 약간씩 달라지게 되므로 매번 대조군과 발광도의 감소를 비교한 상대 발광도로 나타내야 정확한 결과를 얻을 수 있으며, 특히 대조군의 발광도의 변화는 비드 제조 및 저장 조건 등에 의해 가변성이 매우 크므로 정확한 발광도의 감소를 정확히 측정하기 곤란하다.

따라서, 본 발명의 유독물질 모니터링 방법은 유독물질의 농도에 비례하여 발광량을 감소시키는 발광미생물을 직경 0.01 ~ 0.03mm 크기의 초미립 마이크로비드 상태로 고정화시킨 다음 그 초미립 고정화된 마이크로비드 일정량과 유독물질 시료를 시험관에 자동 주입되게 하고 일정한 시간 간격마다 발광량을 측정한 후 중 금속의 투입에 의한 발광량의 변화를 상기 측정 시점에서 대조군의 발광량을 100%로 한 기준 발광량과 비교하여 산출된 값인 상대 발광량에 의해 모니터링함을 특징으로 한다.

다시 말해 시료에 함유된 유독물질의 농도에 비례하여 발광미생물의 발광량을 모니터링하는 방법에 있어서, 상기 발광미생물을 직경 0.01 ~ 0.03mm 크기의 초미립 마이크로비드 상태로 고정화시키는 제1단계와; 유독물질 시료에 대하여 상기 고정화된 초미립 마이크로비드의 발광량을 일정시간마다 측정하는 제2단계와; 상기 각 발광량 측정 시점에서 대조군의 발광도를 100%로 하여 계산한 시료의 상대 발광도로부터 시료 내에 존재하는 유독물질의 독성 정도를 분석, 평가하는 제3단계; 로 이루어진 유독물질 모니터링 방법을 특징으로 한다.

이와 같이 수득한 데이터를 기준 데이터와 비교하면 감도높게 작용하는 초미립 고정화 발광미생물에 의해 시료내에 존재하는 유독물질의 독성 정도를 신속 정확하게 고감도로 모니터링 할 수 있다.

그 일례로 도4 는 종래 비드의 중금속 용액에 대한 시간 단위당 발광량 변화를 대조군에 대하여 상대 발광도로 나타낸 그래프이고, 도5 는 본 발명의 마이크로비드를 중금속 용액에 대한 시간 단위당 발광량 변화를 대조군에 대하여 상대 발광도로 나타낸 그래프이다.

즉, 통상적인 비드와 본 발명의 마이크로비드를 각각 마이크로플레이트에 가하고 15분간 20℃를 유지하여 균을 활성화 시킨 후 시료를 1ppm 농도의 납(Pb), 크롬(Cr), 카드뮴(Cd), 수은(Hg), 비소(As) 용액 및 대조군으로서 증류수를 각각 150 ㎕ 씩 가한 후 발광량의 변화를 측정하고, 시료 투입이 완료된 마이크로플레이트의 발광미생물에 의한 발광량의 변화를 96-웰마이크로플레이트 광 측정장치(Packard Instrument사, USA)를 이용하여 490nm에서 5분 간격으로 측정한 것은 상기의 일반적인 측정 과정과 같다고 할 수 있다.

이때 본 발명은 상기와 같이 일정 시간 간격마다 발광량 변화를 측정한 후 각 발광량 측정 시점에서 대조군의 발광도를 100%로 하여 계산한 시료의 상대 발광도로부터 시료 내에 존재하는 유독물질의 독성 정도를 분석, 평가하는 것이므로 고감도로 작용하는 초미립 고정화 발광미생물에 의해 시료내에 존재하는 유독물질의 독성 정도를 보다 신속 정확하게 모니터링 할 수 있게 된다.

그리고 상기와 같이 제조되는 본 발명의 마이크로비드는 저온에서 냉장 보관하는 것만으로도 종래의 일반적인 비드에 비해 그 유효기간이 길다고 할 수 있다.

그 일례로 도6 에서와 같이 상기한 종래의 일반적인 비드와 본 발명의 마이크로비드에 대한 유효기간을 평가하기 위하여 10일간 냉장 보관을 하면서 그 발광량을 측정한 결과 본 발명의 마이크로비드가 통상적인 비드보다 발광도의 감소속도가 현저하게 낮음을 알 수 있다.

또한, 5일 이후에는 발광도가 약 2배 정도의 차이가 나타나고 있으며, 초기 발광도의 30% 를 유지하면 유독물질의 독성 평가에는 큰 영향이 없다고 할 수 있다. 따라서 마이크로비드로 고정된 발광미생물의 유효기간은 0~5℃에서 약 7~10일로 기존 비드의 저장기간인 4일 전후보다 2배 정도 개량되었음을 알 수 있다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명 의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

이상에서와 같이 본 발명은 유독물질의 농도에 비례하여 발광량이 감소하는 발광미생물을 2회의 현탁과정을 거쳐 초미립 상태의 마이크로비드로 만든 것이므로 종래의 발광미생물에 비해 발광도가 오래 유지되고, 표면적의 차이로 인해 시료의 유독물질과 발광미생물의 접촉시간과 기회를 증가시키므로 훨씬 신속하면서도 고감도로 유독물질의 독성평가가 이루어질 수 있는 효과가 있다.

그리고, 유독성 모니터링시 대조군도 같이 측정하여 상대적인 발광도 값으로 평가를 하는 것이므로 대조군 자체에 의한 오류를 최소한으로 하면서 시료내에 존재하는 유독물질의 독성 정도를 보다 신속 정확하게 모니터링 할 수 있는 효과가 있다.

또한, 액상으로 추출 가능한 모든 오염물질을 시료로 이용할 수 있으므로 상수원의 오염, 공장의 수질 및 대기 오염 또는 토양 오염 등 다양한 분야에 적용시킬 수 있고, 저온에서 냉장 보관하는 것만으로도 종래의 일반적인 비드에 비해 그 유효기간이 2배 정도로 오래 유지되므로 취급 보관이 용이한 효과도 있다.

Claims (7)

1. 시료에 함유된 유독물질의 농도에 비례하여 발광량이 감소되는 발광미생물에 있어서,

   고정화 물질에 현탁시킨 발광미생물 균체를 직경 0.01 ~ 0.03mm 크기의 겔 상태 마이크로비드로 만든 것을 특징으로 하는 초미립 고정화 발광미생물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 고정화 물질은,

   알긴산, 한천(agar), 카라기난, 폴리아크릴아미드 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 초미립 고정화 발광미생물.
3. 시료에 함유된 유독물질의 농도에 비례하여 발광량이 감소되는 발광미생물을 제조함에 있어서,

   고정화 물질과 혼합된 발광미생물을 해수 컴플리트 배지에서 22~27℃ 의 온도로 45~50시간 배양하는 제1단계와;

   원심분리하여 회수된 발광미생물 균체를 0.5~0.8% 의 생리적 식염수에 1차 현탁하고, 그 후 다시 원심분리하여 얻은 균체를 2~3% 식염수에 재차 현탁하는 제2단계와;

   상기 균체 혼탁액을 고정화 물질에 가하여 혼합한 후 칼슘염 또는 스트론튬염 용액에 분무하고, 그 후 0~5℃에서 1~3시간 방치하여 겔 상태의 마이크로비드를 수득하는 제3단계;

   로 이루어진 것을 특징으로 하는 초미립 고정화 발광미생물의 제조방법.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 제3단계에서 수득되는 겔 상태의 마이크로비드는,

   직경 0.01 ~ 0.03mm 크기의 마이크로비드인 것을 특징으로 하는 초미립 고정화 발광미생물의 제조방법.
5. 제 3 항에 있어서, 상기 제1단계의 해수 컴플리트 배지는,

   3~5g 펩톤, 1~2g 효모추출물, 3~5ml 글리세롤, 70~80% 해수 1000ml 로 만들어진 것임을 특징으로 하는 초미립 고정화 발광미생물의 제조방법.
6. 시료에 함유된 유독물질의 농도에 비례하여 발광미생물의 발광량을 모니터링하는 방법에 있어서,

   상기 발광미생물을 초미립 마이크로비드 상태로 고정화시키는 제1단계와;

   유독물질 시료에 대하여 상기 고정화된 초미립 마이크로비드의 발광량을 일 정시간마다 측정하는 제2단계와;

   상기 각 발광량 측정 시점에서 대조군의 발광도를 100%로 하여 계산한 시료의 상대 발광도로부터 시료 내에 존재하는 유독물질의 독성 정도를 분석, 평가하는 제3단계;

   로 이루어진 것을 특징으로 하는 초미립 고정화 발광미생물을 이용한 유독물질 모니터링 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 제1단계에서 고정화되는 초미립 마이크로비드는,

   직경 0.01 ~ 0.03mm 크기의 마이크로비드인 것을 특징으로 하는 초미립 고정화 발광미생물을 이용한 유독물질 모니터링 방법.

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