KR20060129256A - 특이적이고 선택적인 전기 신호 및 전자기 신호에 의해생성된 장의 적용을 통해 골 세포에서의 골 형태형성단백질 (ｂｍｐ) 유전자 발현을 상향-조절하는 시스템 및방법 - Google Patents

특이적이고 선택적인 전기 신호 및 전자기 신호에 의해생성된 장의 적용을 통해 골 세포에서의 골 형태형성단백질 (ｂｍｐ) 유전자 발현을 상향-조절하는 시스템 및방법 Download PDF

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Abstract

질환에 걸리거나 손상된 골의 치료에 있어서 특이적이고 선택적인 전기 및 전자기 신호에 의해 생성된 장의 적용을 통해 골 세포에서 골 형태형성 단백질 유전자 발현을 조절하는 방법 및 장치가 기재된다. 유전자 발현은 인간 게놈 (DNA)의 특정 부분이 mRNA로 전사되고, 이어서 단백질로 번역되는 과정의 상향-조절 또는 하향-조절을 의미한다. 골 형태형성 단백질 유전자 발현의 증가에 대해 최적화된 장을 생성하는 특이적이고 선택적인 전기 및 전자기 신호를 생성시키고, 골을 특이적이고 선택적인 신호에 의해 생성된 장에 노출시켜 이러한 골 조직에서의 골 형태형성 단백질 유전자 발현을 조절하는 것을 포함하는, 손상되거나 질환에 걸린 골 조직의 표적화된 치료용 방법 및 장치가 제공된다. 결과로서의 방법 및 장치는 골 골절, 골절 위험, 지연된 유합, 골절의 불유합, 골 결함, 척추 융합, 골괴사 또는 혈관 괴사의 표적화된 치료에, 이들 중 하나 또는 이들 모두의 치료 및 골다공증의 치료를 위한 기타 치료법의 보조 요법으로서 유용하다.
골 형태형성 단백질, 특이적이고 선택적인 신호, 상향-조절, 진폭, 듀티 사이클, 진동수

Description

특이적이고 선택적인 전기 신호 및 전자기 신호에 의해 생성된 장의 적용을 통해 골 세포에서의 골 형태형성 단백질 (ＢＭＰ) 유전자 발현을 상향-조절하는 시스템 및 방법 {SYSTEM AND METHOD OF UP-REGULATING BONE MORPHOGENETIC PROTEIN (BMP) GENE EXPRESSION IN BONE CELLS VIA THE APPLICATION OF FIELDS GENERATED BY SPECIFIC AND SELECTIVE ELECTRIC AND ELECTROMAGNETIC SIGNALS}
<관련 출원의 상호 참조>
본 특허 출원은 2000년 2월 23일자로 출원된 미국 가 특허 출원 일련번호 60/184,491의 이권을 주장하는, 2001년 2월 23일자로 출원된 PCT/US01/05991의 미국 국내 단계 특허 출원인 미국 특허 출원 일련번호 10/257,126의 연속부 특허 출원이다. 본 특허 출원은 또한 2004년 1월 12일자로 출원된 미국 가 특허 출원 제60/535,755호의 우선권을 주장한다. 상기 특허 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 손상되거나 질환에 걸린 골의 치료를 위해 특이적이고 선택적인 전기 신호 및 전자기 신호에 의해 생성된 장의 적용을 통해 골 세포에서의 골 형태형성 단백질 (BMP) 유전자 발현을 상향-조절하는 방법, 및 이러한 신호를 생성하는 장치에 관한 것이다.
다양한 생물학적 조직 및 세포에 존재하는 것으로 생각되는 생체전기 상호작용 및 활동은 가장 덜 이해되고 있는 생리학적 과정 중 하나이다. 그러나, 최근에는 특정 조직 및 세포의 성장 및 회복과 관련하여 이러한 상호작용 및 활동에 대한 많은 연구가 행해지고 있다. 특히, 전기장 및 전자기장에 의한 자극 및 이들이 골 및 연골의 성장 및 회복에 미치는 영향에 대한 많은 연구가 행해졌다. 연구원들은 이러한 연구가 수많은 의학 문제를 위한 신규한 치료법의 개발에 유용할 수 있다고 생각한다.
통상 골다공증이라고 알려져 있는 질환에서, 골은 탈무기질화되고 비정상적으로 골 밀도가 낮다. 골은 세포 및 기질(matrix)의 유기 성분 뿐만 아니라, 무기 또는 무기질 성분을 포함한다. 세포 및 기질은 골에 강직도를 부여하는, 인산칼슘 (85％) 및 탄산칼슘 (10％)의 무기질 성분으로 채워진 교원 섬유의 기본 골격을 포함한다. 골다공증은 일반적으로 중장년층에게 발병하는 것으로 생각되지만, 특정 유형의 골다공증은, 골이 기능적 스트레스를 받지 않는 모든 연령대의 사람들에게 영향을 줄 수 있다. 이러한 경우에는, 환자들에게 장시간의 부동 기간 동안 피질골 및 해면골의 유의한 유실이 일어날 수 있다. 중장년층 환자들은 골 골절 후에 움직이지 못할 경우 불용으로 인해 골 유실이 일어나고, 이러한 골 유실은 궁극적으로 이미 골다공증에 걸린 골격의 2차 골절을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 골 밀도 감소는 척추골 허탈, 고관절, 아래팔, 손목, 발목의 골절 뿐만 아니라, 무력하게 하는 통증을 유발할 수 있다. 이러한 질환의 대안의 비-수술적 치료 법이 요구된다.
맥동성 전자기장 (PEMF) 및 용량 결합 (capacitive coupling; CC)은 1979년에 미국 식품의약국에 의해 인가받은 이래로 비-치유 골절 (불유합) 및 골 치유 관련 문제점을 처치하는 데 널리 사용되어 왔다. 이러한 유형의 치료법을 시도하는 데 있어서 기본 원리는 골에 가해지는 물리적 스트레스가 작은 전류의 출현을 초래한다는 관찰이며, 이는 역학적 변형과 함께, 물리적 스트레스가 골 형성을 촉진하는 신호로 변환되는 것의 기초가 되는 메카니즘인 것으로 생각된다. 불유합의 치료에서 성공적인 직접적인 전기장 자극과 함께, PEMF 및 용량 결합을 사용하는 비-침습성 기술 (전극을 치료 영역의 피부 상에 둠) 또한 효과적인 것으로 밝혀졌다. PEMF는 고-전도성 세포외액에서 작은 유도 전류 (패러데이(Faraday) 전류)를 발생시키고, 반면 용량 결합은 직접적으로 조직에서 전류를 발생시키며, 그에 따라 PEMF 및 CC는 둘 다 내재성 전류를 모의한다.
원래 골의 결정체 표면에서 발생하는 현상 때문인 것이라고 생각되는, 내재성 전류는 주로 "유동 전위"라고 하는 것을 발생시키는 고정된 음 전하를 갖는 유기 구성요소를 함유하는 골의 채널에서 전해질을 함유하는 체액의 이동 때문인 것으로 나타났다. 골에서의 전기적 현상에 대한 연구는, 골이 물리적으로 압박될 때 나타나는 역학적-전기적 변환 메카니즘을 입증하였는데, 이는 골 기질에서 프로테오글리칸 및 교원질의 고정된 음 전하의 표면에 걸쳐서 체액 및 전해질의 이동을 초래한다. 이러한 유동 전위는 골에서 소정의 역할을 하며, 역학적 변형과 함께 석회화가능한 기질의 골 세포 합성을 자극할 수 있는 신호 변환을 유도하여 골 형 성을 유도한다.
직류, 용량 결합, 및 PEMF의 적용은 주로 정형외과에서 불유합 골 골절의 치유에서 사용된다 (문헌 [Brighton et al., J. Bone Joint Surg. 63: 2-13, 1981]; 문헌 [Brighton and Pollack, J. Bone Joint Surg. 67: 577-585, 1985]; 문헌 [Bassett et al., Crit. Rev. Biomed. Eng. 17: 451-529, 1989]; 문헌 [Bassett et al., JAMA 247: 623-628, 1982]). 성인의 고관절 무혈성 괴사 및 아동의 레그-퍼시스병(Legg-Perthes's disease)에서의 임상 반응이 보고되었다 (문헌 [Bassett et al., Clin. Orthop. 246: 172-176, 1989]; 문헌 [Aaron et al., Clin. Orthop. 249: 209-218, 1989]; 문헌 [Harrison et al., J. Pediatr. Orthop. 4: 579-584, 1984]). 또한 PEMF (문헌 [Mooney, Spine 15: 708-712, 1990]) 및 용량 결합 (문헌 [Goodwin, Brighton et al., Spine 24: 1349-1356, 1999])은 요추 융합술의 성공률을 유의하게 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다. 또한 말초 신경 재생 및 기능의 증대, 및 혈관형성의 촉진이 보고되었다 (문헌 [Bassett, Bioessays 6: 36-42, 1987]). 스테로이드 주사 및 기타 통상적인 조치로 치료하기 어려운 지속성 회전 근개 건염을 앓고 있는 환자는 플라시보-처치된 환자와 비교하였을 때 유의한 이점을 보였다 (문헌 [Binder et al., Lancet 695-698, 1984]). 최종적으로, 브라이튼(Brighton) 등은 래트에서 요추골에서의 척추 골다공증을 예방하고 퇴행시키는 적합한 용량 결합 전기장의 능력을 입증하였다 (문헌 [Brighton et al., J. Orthop. Res. 6: 676-684, 1988]; 문헌 [Brighton et al., J. Bone Joint Surg. 71: 228-236, 1989]).
보다 최근에는, 이 분야에서의 연구는 조직 및 세포에서 자극이 미치는 영향에 촛점을 맞추고 있다. 예를 들면, 직류는 세포막을 통과하지 못하고, 세포외 기질 분화를 통해 제어되는 것으로 추측된다 (문헌 [Grodzinsky, Crit. Rev. Biomed. Eng. 9: 133-199, 1983]). 직류와 달리, PEMF는 세포막을 통과하여 세포내 세포기관을 자극하거나 또는 직접적으로 영향을 줄 수 있는 것으로 보고되었다. PEMF가 세포외 기질 및 생체내 연골내 골화에 미치는 영향에 대한 조사에서 연골 분자의 합성 및 골 지주의 성숙이 증가하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Aaron et al., J. Bone Miner. Res. 4: 227-233, 1989]). 보다 최근에, 로리치(Lorich) 등 (문헌 [Clin. Orthop. Related Res. 350: 246-256, 1998]) 및 브라이튼 등 (문헌 [J. Bone Joint Surg. 83-A, 1514-1523, 2001])은 용량 결합된 전기 신호의 신호 변환은 전압 개폐형 칼슘 채널을 통한 것이고, 반면 PEMF 또는 혼합된 전자기장의 신호 변환은 세포내 저장소로부터의 칼슘의 방출을 통한 것이라는 것을 보고하였다. 3가지 유형의 모든 전기 자극시, 시토졸 칼슘이 증가하고 그 후에 활성화된 (세포골격) 칼모둘린이 증가한다.
본 발명자들은 1996년에 반복형 이축 0.17％ 역학적 변형이 배양된 MC3T3-E1 골 세포에서 TGF-β1 mRNA의 유의한 증가를 초래한다는 것을 보고하였다 (문헌 [Brighton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 229: 449-453, 1996]). 여러가지 중요한 후속 연구가 1997년에 수행되었다. 한 연구에서는, 동일한 반복형 이축 0.17％ 역학적 변형이 유사한 골 세포에서 PDGF-A mRNA의 유의한 증가를 초래한 다는 것이 보고되었다 (문헌 [Brighton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 43: 339-346, 1997]). 또한 20 mV/cm의 60 kHz 용량 결합된 전기장이 유사한 골 세포에서 TGF-β1의 유의한 증가를 초래한다는 것이 보고되었다 (문헌 [Brighton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 237: 225-229, 1997]). 그러나, 이러한 장이 다른 유전자에 미치는 영향은 문헌에 보고되지 않았다.
"특이적이고 선택적인 전기 신호 및 전자기 신호의 적용을 통한 유전자의 조절(Regulation of Genes Via Application of Specific and Selective Electrical and Electromagnetic Signals)"이라는 표제하의 상기 언급한 모 특허 출원에, 질환에 걸리거나 손상된 조직의 표적 유전자를 조절하는 장을 형성하는 데 사용하기 위한 특이적이고 선택적인 전기 신호 및 전자기 신호의 결정 방법이 개시되어 있다. 본 발명은 새로 발생한 골절, 골절 위험, 지연된 유합, 골절 불유합, 골 결함, 척추 융합, 골괴사 또는 무혈성 괴사의 치료를 위해, 이들 중 하나 또는 이들 모두의 치료 및 골다공증의 치료를 위한 기타 치료법의 보조 요법으로서, 특이적이고 선택적인 전기 신호 및 전자기 신호에 의해 생성된 장의 적용을 통해 하나의 표적 유전자 부류, 즉 골 형태형성 단백질(들) 유전자 발현을 조절하는 방법을 기술함으로써, 상기 특허 출원에 개시된 기술을 보강한다.
<발명의 요약>
본 발명은 특이적이고 선택적인 전기 신호 및(또는) 전자기 신호에 의해 생성된 장의 적용을 통해 골 세포에서의 골 형태형성 단백질 유전자 발현을 조절하는 것에 관한 것이다. 전기장 기간, 진폭, 진동수, 및 듀티 사이클에 관한 투여량-반응 곡선을 작성함으로써, 골 세포에서의 골 형태형성 단백질 mRNA를 상향-조절하는 최적의 신호를 발견하였다. 최적의 신호는 진폭이 20 mV/cm이고, 기간이 24 시간이고, 진동수가 60 kHz이고, 듀티 사이클이 50％이며, 사인파 배향을 갖는 용량 결합된 전기장을 생성한다. 특히, 본 발명은 이러한 신호에 의해 생성된 장의 적용을 통해 골 세포에서의 골 형태형성 단백질 (BMP) 유전자 발현을 상향-조절하는 것에 관한 것이다.
본 발명에 따라서, 용량 결합된 전기장, 전자기장, 또는 혼합된 장을 사용하여 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 및 BMP-7의 유전자 발현 (mRNA에 의해 측정됨)을 특이적 및 선택적으로 상향-조절하는 방법이 제공된다. 새로 발생한 골절, 골절 위험, 지연된 유합, 불유합 골절, 골 결함, 골괴사, 골다공증 등을, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 및 BMP-7 mRNA의 발현을 상향-조절하는, 전기장 기간이 약 24 시간이고, 진동수가 60 kHz이고, 듀티 사이클이 약 50％이며, 사인파 배향을 갖는 약 20 mV/cm의 용량 결합된 전기장을 사용하여 치료한다. 본 발명의 방법에 따라서, "특이적이고 선택적인" 신호는 BMP 유전자의 발현을 상향-조절하는 진폭, 기간, 듀티-사이클, 진동수, 및 파형과 같은 소정의 특징을 갖는 신호이다 (특이성). 그에 따라 주어진 생물학적 또는 치료적 반응을 일으키기 위하여 BMP 유전자 발현을 상향-조절하는 서로 다른 신호를 선택할 수 있게 된다 (선택성). 본 발명은 추가로 본원에 기술된, BMP 유전자의 발현을 상향-조절하는 장을 형성하는 특이적이고 선택적인 신호를 생성하는 방법을 사용하는 장치에 관한 것이다.
관련 측면에서, 본 발명은 새로 발생한 골절, 골절 위험, 지연된 유합, 불유합, 골 결함, 척추 융합, 골괴사 중 하나 이상의 치료 및 골다공증의 치료를 위한 기타 치료법의 보조 요법으로서, 새로 발생한 골절, 골절 위험, 지연된 유합, 불유합, 골 결함, 척추 융합, 골괴사의 치료 방법 및 장치에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 또한 BMP의 세포 생산을 증가시키는 것으로 공지되거나 또는 증가시키는 것으로 예상되는 출발 신호의 기간을 체계적으로 변화시킴으로써 BMP 유전자 발현을 위한 "특이적이고 선택적인" 신호를 결정하는 방법론을 포함한다. 최적의 기간을 발견한 후에, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 및 BMP-7의 유전자 발현에 의해 결정된 최적 시간의 기간 동안 신호의 진폭을 변화시킨다. 듀티 사이클, 진동수, 및 파형을 다른 신호 특징을 일정하게 유지하면서, 상기와 동일한 투여량 반응 방식으로 체계적으로 변화시킨다. BMP의 발현의 최대 증가를 초래하는 최적의 신호가 결정될 때까지 이 과정을 반복한다.
본 발명의 상기 측면 및 기타 측면은 본 발명의 하기 상세한 설명으로 설명될 것이다.
본 발명은 첨부 도면과 함께 본 발명의 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다.
도 1은 골 세포가 다양한 시간의 기간 동안 20 mV/cm의 용량 결합된 전기장에 노출되었을 때 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 및 BMP-7의 mRNA 발현을 그래프로 나타낸 것이다. 나타낸 것처럼, 다양한 BMP mRNA의 최대 발현은 24 시간 기간의 신호를 사용하였을 때 발생하였다.
도 2는 골 세포가 24 시간의 기간으로 다양한 진폭의 용량 결합된 전기장에 노출되었을 때 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 및 BMP-7의 mRNA 발현을 그래프로 나타낸 것이다. 나타낸 것처럼, 다양한 BMP mRNA의 최대 발현은 20 mV/cm의 장 진폭을 사용하였을 때 발생하였다.
도 3은 골 세포가 20 mV/cm의 장 진폭 및 24 시간의 신호 기간으로 다양한 진동수의 용량 결합된 전기장에 노출되었을 때 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 및 BMP-7의 mRNA 발현을 그래프로 나타낸 것이다. 나타낸 것처럼, 다양한 BMP mRNA의 최대 발현은 60 kHz의 진동수를 사용하였을 때 발생하였다.
도 4는 골 세포가 60 kHz의 진동수, 20 mV/cm의 장 진폭, 및 24 시간의 신호 기간으로 다양한 듀티 사이클의 용량 결합된 전기장에 노출되었을 때 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 및 BMP-7의 mRNA 발현을 그래프로 나타낸 것이다. 나타낸 것처럼, 다양한 BMP mRNA의 최대 발현은 50％의 듀티 사이클을 사용하였을 때 발생하였다.
도 5는 골 세포가 20 mV/cm의 장 진폭 및 60 kHz의 진동수로 다양한 온-오프(on-off) 시간의 50％ 듀티 사이클의 용량 결합된 전기장에 노출되었을 때 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 및 BMP-7의 mRNA 발현을 그래프로 나타낸 것이다. 나타낸 것처럼, 다양한 BMP mRNA의 최대 발현은 1분 온/1분 오프의 50％의 듀티 사이클을 사용하였을 때 발생하였다.
도 6은 골 세포가 용량 결합된, 지속성 50％ 듀티 사이클 신호 (20 mV/cm, 60 kHz, 사인파) 대 맥동성 50％ 듀티 사이클 신호에 노출되었을 때 BMP-2 mRNA 발현을 그래프로 나타낸 것이다. 나타낸 것처럼, 두 신호 모두 본질적으로 동일하게 BMP-2 mRNA의 5배 증가를 보였다.
도 7은 골 세포가 24 시간 동안 50％ 듀티 사이클의 용량 결합된 신호 (20 mV/cm, 60 kHz, 사인파)에 노출되었을 때 BMP-2 단백질 생산 및 알칼리성 포스파타제 활성을 그래프로 나타낸 것이다. 나타낸 것처럼, BMP-2 생산은 1.9배 증가하였고 알칼리성 포스파타제 활성은 1/6배 증가하였다.
도 8은 본 발명의 예시 실시양태에 따라서, 골 형태형성 단백질의 유전자 발현을 상향-조절하는 장치를 도해하는 도식도이다.
본 발명은 도 1 내지 8을 참조로 하기에 상세히 설명될 것이다. 당업자라면 도면과 관련하여 본원에 기술된 설명이 예시용일 뿐이며 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님을 알 것이다. 본 발명의 범위에 관한 모든 의문점은 첨부된 특허청구범위를 참조함으로써 해결될 수 있다.
본 발명은 특정 유전자의 발현이 특이적이고 선택적인 전기 신호 및(또는) 전자기 신호에 의해 생성된 장의 적용에 의해 조절될 수 있다는 발견을 기초로 한다. 바꾸어 말하면, 본 발명자들은 골, 연골 및 기타 조직 세포에서 각 유전자를 조절하는 장을 생성하는 특이적인 전기 신호 및(또는) 전자기 신호가 있고, 이러한 특이적인 신호가 상기 세포에서 유전자를 특이적 및 선택적으로 조절할 수 있다는 것을 발견하였다. 특히, 조직 또는 세포의 성장, 유지, 회복, 및 퇴화 또는 퇴행을 지배하는 유전자 발현은 본 발명에 따라 특이적이고 선택적인 전기 신호 및(또는) 전자기 신호에 의해 생성된 장의 적용을 통해 조절되어 유익한 임상 효능을 초래할 수 있다. 이러한 발견은 새로 발생한 골 골절, 골절 위험, 지연된 유합, 불유합, 골 결함, 골괴사 중 하나 이상의 치료 및 골다공증의 치료를 위한 보조 요법으로서, 새로 발생한 골 골절, 골절 위험, 지연된 유합, 불유합, 골 결함, 골괴사를 비롯한 특정 의학적 증상을 표적화하는 치료 방법의 개발에 유용하다.
본원에서 사용되는 "신호"라는 구는 장치에 의해 출력되는 역학적 신호, 초음파 신호, 전자기 신호 및 전기 신호를 비롯한 다양한 신호를 지칭하는 데 사용된다. 본원에서 사용되는 용어 "장"은 표적 조직 내 전기장을 지칭하고, 이는 혼합된 장 또는 맥동성 전자기장이거나 또는 직류, 용량 결합 또는 유도 결합에 의해 생성된다.
"원격"이라는 구는 소정의 거리로부터 작동하거나, 작동되거나, 제어되는 것을 의미한다. "원격" 조절은 소정의 거리로부터 유전자의 발현을 제어하는 것을 지칭한다. "원격" 제공이란 소정의 거리로부터 제공하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 원격원으로부터 특이적이고 선택적인 신호를 제공하는 것은 조직 또는 세포로부터 소정의 거리에 있는 기원, 또는 신체의 바깥쪽 또는 외부의 기원으로부터 신호를 제공하는 것을 지칭할 수 있다.
"특이적이고 선택적인" 신호라는 구는 표적화된 유전자 또는 표적화된 기능상 보족 유전자를 상향-조절 또는 하향-조절하는 진폭, 기간, 듀티 사이클, 진동수, 및 파형과 같은 소정의 특징을 갖는 전기장을 생성하는 신호를 의미한다 (특이성). 그에 따라 주어진 생물학적 또는 치료적 반응을 일으키기 위해 다양한 유전자의 발현을 상향-조절 또는 하향-조절하는 서로 다른 "특이적이고 선택적인" 신호를 선택할 수 있게 된다 (선택성).
용어 "조절"이란 유전자 발현을 제어하는 것을 의미한다. 조절이란 상향-조절 및 하향-조절을 둘 다 포함하는 것으로 이해된다. 상향-조절은 유전자의 발현을 증가시키는 것을 의미하는 반면, 하향-조절은 유전자의 발현을 억제하거나 방지하는 것을 의미한다.
"기능상 보족"이란 주어진 세포 또는 조직에서 유전자의 발현이 상보적이거나 또는 상승적인 2개 이상의 유전자를 지칭한다.
"조직"은 세포와, 환자의 구조 물질 중 하나를 형성하는 세포외 물질의 집합체를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "조직"은 근육 및 장기 조직, 종양 조직 뿐만 아니라, 골 또는 연골 조직을 포함하고자 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "조직"은 개별 세포를 지칭할 수 있다.
"환자"는 동물, 바람직하게는 포유 동물, 보다 바람직하게는 인간을 지칭한다.
본 발명은 특정 조직, 세포, 또는 질환을 표적으로 하는 치료 방법 및 장치를 제공한다. 특히, 손상되거나 질환에 걸린 조직 또는 세포에서의 회복 과정과 관련있는 유전자 발현은 표적 조직 또는 세포에서 조절될 유전자에 대해 특이적이고 선택적인 전기 신호에 의해 생성된 장의 적용에 의해 조절될 수 있다. 유전자 발현은 각 유전자 또는 보족 유전자의 각 세트에 대해 특이적이고 선택적인 신호의 적용에 의해 상향-조절 또는 하향-조절되어 이로운 임상 효능을 초래할 수 있다. 예를 들면, 특이적이고 선택적인 특정 신호는 목적하는 특정 유전자 발현을 상향-조절하는 전기장을 형성할 수 있고, 반면 동일하거나 또다른 특이적이고 선택적인 특정 신호는 원치않는 특정 유전자 발현을 하향-조절하는 진기장을 형성할 수 있다. 특정 유전자는 하나의 특이적이고 선택적인 특정 신호에 의해 생성된 장에 의해 상향-조절될 수 있고 특이적이고 선택적인 또다른 신호에 의해 생성된 장에 의해 하향-조절될 수 있다. 당업자라면 조직의 성장, 유지, 회복, 및 퇴화 또는 퇴행을 지배하는 유전자를 조절함으로써 치료를 위해 질환에 걸리거나 손상된 특정 조직을 표적화할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 방법 및 장치는 질환에 걸리거나 손상된 특정 표적 조직과 관련있는 유전자 발현에 대해 특이적이고 선택적인 장을 생성하는 신호의 확인을 기초로 한다. 예를 들면, 다양한 형태 (예, 용량 결합, 유도 결합, 혼합된 장)의 전기가 각 선택된 유전자를 위해 적용되는 장의 진동수, 진폭, 파형 또는 듀티 사이클을 변화시킴으로써 환자 신체의 표적 조직 또는 세포에서의 유전자 발현을 특이적 및 선택적으로 조절할 수 있다. 전기에 노출되는 시간의 기간은 또한 환자 신체의 표적 조직 또는 세포에서의 유전자 발현을 특이적 및 선택적으로 조절하는 전기의 능력에 영향을 줄 수 있다. 특이적이고 선택적인 신호는 유전자 발현에 목적하는 영향을 미치는 진동수, 진폭, 파형, 듀티 사이클, 및 기간의 적절한 조합이 발견될 때까지 체계적으로 각 유전자에 적용되는 전기장을 생성할 수 있다.
특정 유전자 발현에 대한 전기장의 특이성 및 선택성이 수많은 인자에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 질환에 걸리거나 손상된 다양한 조직 또는 질환 상태가 치료를 위해 표적화될 수 있는 것으로 이해된다. 특히, 적합한 진동수, 진폭, 파형 및(또는) 듀티 사이클의 전기장은 특정 유전자의 발현에 대해 특이적이고 선택적이어서 표적 치료를 제공할 수 있다. 시간 인자 (예, 전기장에 노출되는 시간의 기간) 또한 특정 유전자 발현을 위한 전기장의 특이성 및 선택성에 영향을 줄 수 있다. 유전자 발현의 조절은 특정 시간의 기간 동안의 전기장의 적용을 통해 보다 효과적이 될 수 있다 (또는 가능해질 수 있다). 따라서, 당업자라면 본 발명이 질환에 걸리거나 손상된 다양한 조직 또는 질환을 표적으로 하는 치료를 제공하기 위해, 특정 유전자 발현에 대해 특이적이고 선택적인 전기장이 발견될 때까지 전기장의 진동수, 진폭, 파형, 듀티 사이클 및(또는) 적용 기간을 변화시키는 것을 제공한다는 것을 이해할 것이다.
따라서, 본 발명은 적합한 시간의 기간 동안 적합한 진동수, 진폭, 파형 및(또는) 듀티 사이클의 특이적이고 선택적인 신호에 의해 생성된 장의 적용을 통해 질환에 걸리거나 손상된 특정 조직과 관련있는 특정 유전자의 발현을 조절할 수 있기 때문에 표적화된 치료법을 제공할 수 있다. 따라서 전기장을 생성하는 신호의 특이성 및 선택성은 치료하기 위한 질환에 걸리거나 손상된 특정 조직 또는 질환 상태를 표적화하기 위해 특정 유전자의 발현을 조절하도록 영향받을 수 있다. 특히, 본 발명은 새로 발생한 골 골절, 골절 위험, 불유합, 골 결함, 척추 융합, 골괴사 중 어느 하나의 치료 및 골다공증의 치료를 위한 보조 요법으로서, 새로 발생한 골 골절, 골절 위험, 불유합, 골 결함, 척추 융합, 골괴사의 표적화된 치료법을 제공한다.
본 발명은 또한 BMP 유전자 발현에 대해 특이적이고 선택적인 하나 이상의 신호원을 포함하는 장치를 제공한다. 본 발명의 장치는 특이적이고 선택적인 신호에 의해 생성된 장을 적용하도록 조작된 하나 이상의 전극에 의해 골 세포에 적용되는 신호의 발생을 제공할 수 있다.
본 발명의 장치는 특이적이고 선택적인 신호에 의해 생성된 장을 환자의 질환에 걸리거나 손상된 조직, 골 및(또는) 피부에 직접 적용할 수 있다. 본 발명의 장치는 또한 특이적이고 선택적인 장의 원격 적용 (예, 질환에 걸리거나 손상된 조직으로부터 소정의 거리를 두고 장의 적용)을 제공할 수 있지만, 용량 결합된 장치는 피험체의 피부에 접촉한 상태이어야만 한다는 것을 알 것이다. 본 발명의 장치는 용량 결합의 경우에 손상되거나 질환에 걸린 조직 근처의 환자의 신체에 전극을 부착하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 8에 도시된 것처럼, 자가-부착형 전도성 전극이 골절된 골 (18) 또는 관절 (20)의 양 측면에서 환자의 피부에 부착될 수 있다. 본 발명의 장치는 장치를 환자의 신체에 부착하기 위한 자가-부착형 전극을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 장치 (10)는 그 이면에 벨크로(VELCRO)(등록상표) 패치 (16)를 갖는 전력 단위 (14)에 부착된 전극 (12)을 포함하여 전력 단위 (14)는 환자의 깁스 주변에 장착된 벨크로(등록상표) 스트랩(strap)에 부착될 수 있다. 유도 결합의 경우에는, 본 발명의 장치가 전극 대신에 전력 단위에 연결된 코일 또는 솔레노이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 장치 (10)는 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 장치 (10)는 휴대용이거나 또는 환자의 신체에 일시적으로 또는 영구적으로 부착될 수 있다. 본 발명의 장치 (10)는 바람직하게는 비-침습성이다. 예를 들면, 본 발명의 장치 (10)는 소정의 특이적이고 선택적인 신호에 의해 생성된 장의 적용을 위해 환자의 피부와 접촉하도록 조작된 전극 (12)을 붙임으로써 환자에 피부에 붙여질 수 있다. 이러한 신호는 또한 시간 경과에 따라 다양한 전류가 흐르는, 코일 또는 솔레노이드 (도시하지 않음)를 통해 적용되어 조직을 통과하는 특이적이고 선택적인 전자기장을 발생시킬 수 있다. 본 발명의 장치 (10)는 또한 환자의 골과 직접 접촉하는 피하 이식을 비롯하여, 환자에게 이식될 수 있다.
당업자라면 본 발명의 장치가 한 쌍 또는 여러 쌍의 전극에 적용되는 프로그래밍형, 다중성, 가변성, 특이적 및 선택적 신호를 갖는 용량 결합된 전력 단위, 또는 가변성, 다중성, 특이적 및 선택적 신호를 갖는 전력 단위에 부착된 전자기 코일 또는 솔레노이드, 및 특이적이고 선택적인 신호를 생성하는 전력 공급 장치를 갖는 초음파 자극 장치를 포함하는 다양한 형태로 제공될 수 있다는 것을 추가로 이해할 것이다. 일반적으로, 장치는 환자의 용인성 및 환자의 순응도를 기초로 선택된다. 현재 당업계에서 이용가능한 최소형의 휴대용 단위는 용량 결합 단위이지만, 피부가 매우 민감한 환자는 유도 결합 단위 사용을 선호할 수 있다. 한편, 초음파 단위는 대부분 환자의 협조를 요구하지만, 특정 환자는 초음파 장치를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 입증되며, 이는 설명을 목적으로 하고 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
재료 및 방법
MC3T3-E1 골 세포 (5 x 105 세포/cm2)를 특별히 변형된 구리 디쉬 상에 플레이팅하였다. 세포를 실험 조건의 시작 직전에 변화된 배지로 7일까지 성장시켰다. 상기 연구 전반에 걸쳐 실험 세포 배양물은 44.81 V 피크-대 피크의 출력 진폭을 갖는 60 kHz 사인파 신호 전기장으로 용량 결합되었다. 이는 300 ㎂/cm2의 직류 밀도를 갖는 20 mV/cm의 디쉬의 배양 배지에서 계산된-장 강도를 생성하였다. 대조 세포 배양 디쉬는 전극이 기능 발전기에 연결된 것을 제외하고는 자극된 디쉬와 동일하였다.
실험의 마지막에, 총 RNA를 제조업자의 지시사항에 따라 TRIzol을 사용하여 단리하고, 수퍼스크립트(SuperScript) II 역전사효소를 사용하여 역전사 (RT)를 수행하였다. 실시간 RT-PCT 기술에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 공개된 cDNA 서열로부터 선별하거나, 프라이머 익스프레스(Primer Express) 소프트웨어 프로그램을 사용하여 설계하였다. RT-PCR 생성물의 정량적 실시간 분석을 ABI 프리즘(Prisme)(등록상표) 7000 서열 추적 시스템(Sequence Detection System)을 사용하여 수행하였다.
다른 것들 중에서, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 및 BMP-7의 유전자를 비롯한 (BMP) 유전자의 목적하는 상향 조절을 위한 최적 신호는 하기와 같이 체계적으로 밝혀졌다. 주어진 단백질의 세포 생산을 증가시키는 (또는 심지어 단지 증가시키 는 것으로 예상되는) 전기 신호 (예를 들어 60 kHz 사인파)를 상기 단백질의 유전자 발현 (mRNA)에 대한 장을 생성시키는 특이적 신호를 결정하는 출발 신호로서 취하였다. 용량-반응 곡선은 먼저 모든 다른 신호 특징 (진폭, 듀티 사이클, 진동수 및 파형)을 일정하게 유지하면서 신호의 기간을 변화시킴으로써 수행하였다 (도 1). 이는 상기 단백질의 유전자 발현에 대한 출발 신호의 최적 기간을 결정한다. 도 1에 나타낸 것처럼, 다양한 BMP mRNA에 대한 최대 발현은 24 시간의 신호 기간으로 일어났다. 그 후, 제2 용량-반응 곡선을 수행하였으며, 이때 최적 기간 및 다른 신호 특징을 일정하게 유지하면서 전기장의 진폭 (mV/cm 단위)을 변화시켰다 (도 2). 나타낸 것처럼, 다양한 BMP mRNA에 대한 최대 발현은 20 mV/cm의 장 진폭으로 일어났다. 제3 용량 반응을 수행하였으며, 이때 앞에서 밝혀진 바와 같은 최적 기간 및 최적 진폭을 일정하게 유지하면서 신호 진동수를 변화시켰다 (도 3). 나타낸 것처럼, 다양한 BMP mRNA에 대한 최대 발현은 60 kHz의 진동수로 일어났다. 제4 용량-반응을 앞에서 밝혀진 바와 같은 최적 기간, 진폭 및 진동수를 일정하게 유지하면서 듀티 사이클을 100％ (일정) 내지 10％ 이하로 변화시켜 수행하였다 (도 4). 나타낸 것처럼, 다양한 BMP mRNA에 대한 최대 발현은 50％ 듀티 사이클로 일어났다. 마지막으로, 제5 용량-반응을 앞에서 밝혀진 바와 같이 듀티 사이클을 50％로, 진폭 및 진동수를 각각 20 mV/cm 및 60 kHz로 유지하면서 타임 오프/타임 온 파라미터를 변화시켜 수행하였다 (도 5). 나타낸 것처럼, 다양한 BMP mRNA에 대한 최대 발현은 1분 온/1분 오프 50％ 듀티 사이클로 일어났다.
상기 방법에 의해, 다양한 BMP의 유전자 발현의 최대 증가를 가져오는 최적 신호를 결정하였다.
제6 실험을 연속성 50％ 듀티 사이클 (용량 결합, 20 mV/cm, 60 kHz 사인파)과 펄스성 50％ 듀티 사이클 (용량 결합, 20 mV/cm, 60 kHz)을 비교하여 수행하였다. 나타낸 것처럼, BMP-2 mRNA의 증가는 각각의 신호와 비교시 약 5배였다 (도 6).
BMP mRNA 생성물, 즉 BMP-2 단백질의 생성 증가 및 BMP-2 수준에 의해 유도될 수 있는 알칼리성 포스파타제 활성 증가를 입증하는 최종 실험을 수행하였다. 50％ 듀티 사이클 (용량 결합, 20 mV/cm, 60 kHz, 사인파)로 24 시간 자극한 후에, BMP-2 생성물 및 알칼리성 포스파타제 활성이 각각 1.9배 및 1.6배 증가하였다 (도 7).
도 8은 무릎의 골관절염을 갖는 환자를 치료하는데 사용되는 본 발명에 따른 장치 (10)를 예시한다. 예시된 바와 같이, 2개의 둥근 약 전도성 자가-부착 전극 (12)이 관절 선 (20)의 수준에서 무릎 양 쪽의 피부 상에 놓여 있다. 전극 (12)은 반대쪽에 벨크로(등록상표) 패치 (16)를 갖는 전력 단위 (14)에 부착되어 전력 단위 (14)가 종아리, 허벅지 또는 허리 주위에 고정된 벨크로(등록상표) 스트랩 (도시되지 않음)에 부착된다. 전극 (12)은 환자가 각 저녁 취침 전 또는 임의의 다른 편리한 시간에 피부 상에 놓일 수 있다. 물론, 다른 적합한 종류의 전극 (12)도 사용될 수 있다.
전력 단위 (14)는 바람직하게는 작으며 (예를 들어 6 내지 8 온스), 피부 상에 놓인 전극 (12)에 5-볼트 피크-대-피크, 6 내지 10 mAmp, 20 mV/cm, 60 kHz 사 인파 신호를 방출하는 표준 9-볼트 배터리에 의해 전력적용된다. 상기 신호가 1분 온 및 1분 오프 증분으로 적당한 듀티 사이클 (50％)로 매일 대략 24 시간 동안 제공될 경우, BMP를 코딩하는 유전자가 유의하게 상향-조절되는 것으로 나타났다.
본 발명은 실시예에 기재된 최적 전기장이 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 및 BMP-7 mRNA를 매우 유의하게 상향-조절하며, 따라서 골 형성을 증가시킴을 명백히 나타낸다. 당업자는 본원에 용량 결합으로 기재된 적절한 전기장이 또한 유도 결합 및 동일하거나 거의 동일한 전기장 특징을 생성하는 모든 전자기장 시스템과 동등하게 효과적임을 이해할 것이다. 당업자는 또한 보다 독특한 신호 특징은 보다 많은 데이타 점 (예를 들어 30±3 분 동안 100±3％ 듀티 사이클)를 갖는 보다 많은 실험을 통해 밝혀질 수 있지만, 각각의 신호 특징에서 이러한 상대적으로 부차적인 편차는 본원의 교시사항을 보는 당업자의 수준 내에 있는 것으로 믿어짐을 이해할 것이다.
당업자는 또한 본 발명에 대한 수많은 다른 변형이 본 발명의 범위 내에서 가능함을 이해할 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 최적 장은 2개 이상의 적절한 표면 전극을 통해 쌍으로 또는 스트립으로 임의의 골에 적용되고, 버팀대, 랩 또는 주형 내에 혼입되고, 용량 결합에 의해 전달될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 최적 장은 버팀대, 랩 또는 주형 내로 혼입된 코일(들) 또는 솔레노이트를 통해 임의의 골에 적용되고, 유도 결합에 의해 전달될 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 기재된 바람직한 실시양태에 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 단지 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한된다.

Claims (25)

  1. a. 신호가 조직에 적용될 때 mRNA에 의해 측정된 바 골 형태형성 단백질(들) (BMP)의 유전자 발현을 상향-조절하도록 선택되는 신호 특징을 갖는 하나 이상의 특이적이고 선택적인 신호를 생성시키는 단계; 및
    b. 골 조직을 특이적이고 선택적인 신호에 의해 생성된 장(field)에 소정 시간의 기간 동안 소정 간격으로 노출시켜 mRNA에 의해 측정된 바 BMP의 발현을 상향-조절하는 단계
    를 포함하는, 조직에서의 골 형태형성 단백질(들)의 유전자 발현을 특이적이고 선택적으로 상향-조절하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 생성 단계가, 골 조직에서의 mRNA에 의해 측정된 바 BMP의 유전자 발현의 생성된 장에 의한 상향 조절이 실질적으로 증가될 때까지, 특이적이고 선택적인 신호의 진폭, 기간, 듀티 사이클, 진동수 및 파형을 선택적으로 변화시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 생성 단계가 특이적이고 선택적인 신호를 원격원에서 생성시키는 단계를 포함하고, 상기 노출 단계가 특이적이고 선택적인 신호에 의해 생성된 장을 골 조직에 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 노출 단계가 특이적이고 선택적인 신호를 골 조직 근처에 위치한 전극, 코일(들) 또는 솔레노이드에 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 노출 단계가 특이적이고 선택적인 신호에 의해 생성된 장을 용량 결합(capacitive coupling) 및 유도 결합 중 하나를 통해 골 조직에 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 특이적이고 선택적인 신호가, 전극은 하나의 용량 결합 전기장을 생성하도록 하고, 코일(들) 또는 솔레노이드는 전자기장 또는 혼합된 장을 생성하도록 하는 것인 방법.
  7. a. mRNA에 의해 측정된 바 골 형태형성 단백질(들)의 유전자 발현을 상향-조절하는 하나 이상의 특이적이고 선택적인 신호를 생성시키는 단계; 및
    b. 골 조직을 특이적이고 선택적인 신호에 의해 생성된 장에 소정 기간 동안 소정 간격으로 노출시켜 mRNA에 의해 측정된 바 골 형태형성 단백질의 유전자 발현을 선택적으로 상향-조절하는 단계
    를 포함하는, 골 골절, 골절 위험, 지연된 유합, 불유합, 골 결함, 척추 융합, 골 괴사 및 골다공증 중 하나 이상의 치료 방법.
  8. 제7항에 있어서, 노출 단계가 장을 골 조직에 용량 결합시키는 단계를 포함 하는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 노출 단계가 전자기장 및 혼합된 장 중 하나를 골 조직에 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 생성 단계가 대략 20 mV/cm의 진폭, 사인파 형태, 대략 50％의 듀티 사이클 및 대략 60 kHz의 진동수를 갖는 전기장을 생성시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 노출 단계가 전기장을 골 조직에 매 24 시간마다 대략 24 시간의 기간 동안 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 노출 단계가 전기장을 골 조직에 1분 온(ON) 및 1분 오프(OFF)의 50％ 듀티 사이클 동안 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  13. 제7항에 있어서, 생성 단계가, 골 조직에서의 mRNA에 의해 측정된 바 BMP의 유전자 발현의 생성된 장에 의한 상향 조절이 실질적으로 증가될 때까지, 특이적이고 선택적인 신호의 진폭, 기간, 듀티 사이클, 진동수 및 파형을 선택적으로 변화시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 노출 단계가 특이적이고 선택적인 신호에 의해 생성된 장을 용량 결합 및 유도 결합 중 하나를 통해 골 조직에 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 특이적이고 선택적인 신호가, 환자의 피부에 적용된 전극이 용량 결합 전기장, 전자기장 및 혼합된 장 중 하나를 생성하도록 하는 것인 방법.
  16. mRNA에 의해 측정된 바 골 형태형성 단백질(들)의 유전자 발현을 상향-조절하는데 특이적이고 선택적인 장을 생성하는 하나 이상의 신호를 제공하는 신호원, 및 장을 골 조직에 소정 기간 동안 소정 간격으로 적용하여 상기 골에서의 mRNA에 의해 측정된 바 골 형태형성 단백질(들)의 유전자 발현을 선택적으로 상향-조절하는 상기 하나 이상의 특이적이고 선택적인 신호를 수용하는 신호원에 연결된 전극 또는 코일(들)을 포함하는, 골 골절, 골절 위험, 지연된 유합, 불유합, 골 결함, 척추 융합, 골괴사 및 골다공증 중 하나 이상의 치료용 장치.
  17. 제16항에 있어서, 상기 신호원을 유도하는 휴대용 전력 단위를 추가로 포함하는 장치.
  18. 제16항에 있어서, 전극을 골 조직 근처의 환자의 신체에 부착하는 수단을 추 가로 포함하는 장치.
  19. 제16항에 있어서, 신호원을 환자의 신체에 부착하는 수단을 추가로 포함하는 장치.
  20. 제16항에 있어서, 상기 하나 이상의 특이적이고 선택적인 신호에 의해 생성된 장이 용량 결합 및 유도 결합 중 하나를 통해 상기 골 조직에 적용되는 것인 장치.
  21. 제20항에 있어서, 특이적이고 선택적인 신호가 사인파 배향을 갖고, 대략 50％ 듀티 사이클과 60 kHz에서 약 20 mV/cm의 진폭을 갖는 전기장을 생성하는 것인 장치.
  22. 골 조직을 제21항에 따른 장치에 의해 생성된 특이적이고 선택적인 장에 노출시켜 골 조직에서의 mRNA에 의해 측정된 바 골 형태형성 단백질(들)의 유전자 발현을 상향-조절하는 단계를 포함하는, 골 골절, 골절 위험, 지연된 유합, 불유합, 골 결함, 척추 융합, 골괴사 및 골다공증 중 하나 이상의 치료 방법.
  23. 제22항에 있어서, 노출 단계가 특이적이고 선택적인 장을 매 24 시간마다 대략 24 시간의 기간 동안 1분 온 및 1분 오프의 50％ 듀티 사이클로 적용하는 단계 를 포함하는 것인 방법.
  24. 골 형태형성 단백질(들)의 세포 생산을 증가시키는 것으로 공지되거나 영향을 줄 것으로 예상되는 신호 형태 및 진동수를 갖는 출발 신호를 선택하는 단계, BMP(들)의 매우 유의한 증가를 제공하는 기간이 발견될 때까지 상기 출발 신호의 적용 기간을 선택적으로 변화시키는 단계, BMP(들)의 매우 유의한 증가를 제공하는 진폭이 발견될 때까지 상기 출발 신호의 진폭을 변화시키는 단계, BMP(들)의 매우 유의한 증가를 제공하는 듀티 사이클이 발견될 때까지 상기 출발 신호의 듀티 사이클을 변화시키는 단계, 및 BMP(들)의 매우 유의한 증가를 제공하는 온-오프 간격이 발견될 때까지 신호의 듀티 사이클의 온-오프 간격의 기간을 변화시키는 단계를 포함하는, 골 형태형성 단백질(들)을 상향조절하는 전기장을 생성하는 선택적 신호의 측정 방법.
  25. 제24항에 있어서, mRNA에 의해 측정된 바 BMP의 유전자 발현의 최대 증가가 발견될 때까지, 다른 신호 특징을 일정하게 유지하면서 상기 신호의 진동수 및 파형을 선택적으로 변화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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