KR20060124475A - 법랑모세포의 분화 또는 성숙을 위한 ｏｄ314 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 법랑모세포의 분화 또는 성숙을 위한 OD314 유전자에 관한 것으로서, OD314유전자는 법랑모세포의 분화 또는 성숙을 위한 유전자로서 법랑모세포 분화과정에 중요한 인자인 OD314 유전자와 이로부터 유래하는 폴리펩타이드 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명이 제공하는 특이적 항체는 법랑모세포의 분화 및/또는 성숙중인 세포를 검출하거나 OD314 단백질을 다량으로 분리하는데 매우 유용하며, OD314의 항원성 펩타이드는 OD314에 특이적인 항체를 제조하는데 유용하게 사용될 수 있다.

OD314유전자, 법랑모세포

Description

법랑모세포의 분화 또는 성숙을 위한 오디314 유전자{OD314 gene for differentiation and maturation of ameloblast}

도 1A. 법랑모세포의 다양한 기능적 단계 중 분비 전단계의 법랑모세포를 나타낸다.

도 1B. 법랑모세포의 다양한 기능적 단계 중 분비기의 법랑모세포를 나타낸다.

도 1C. 법랑모세포의 다양한 기능적 단계 중 성숙기의 평탄끝 법랑모세포를 나타낸다.

도 1D. 법랑모세포의 다양한 기능적 단계 중 성숙단계의 주름끝 법랑모세포를 나타낸다.

도 2A. OD314의 cRNA 프로브를 이용한 3주령 쥐의 하악 전치의 OD314 mRNA 발현을 나타내는 저배율현미경사진(헤마톡실린과 에오신 염색, ×40) 이다.

도 2B. 도 2A의 I 영역의 고배율 사진(헤마톡실린과 에오신 염색, ×100) 이다.

도 2C. 도 2A의 II 영역의 고배율 사진(헤마톡실린과 에오신 염색, ×100)이다.

도 2D. 도 2A의 영역 III의 고배율 사진(헤마톡실린과 에오신 염색, ×100)이다.

도 3A. 법랑모세포의 다양한 기능적 단계 중 분비전단계 법랑모세포의 OD314 단백질의 면역조직학적 염색을 나타낸다.

도 3B. 법랑모세포의 다양한 기능적 단계 중 분비기 법랑모세포의 OD314 단백질의 면역조직학적 염색을 나타낸다.

도 3C. 법랑모세포의 다양한 기능적 단계 중 성숙기 평탄끝 법랑모세포의 OD314 단백질의 면역조직학적 염색을 나타낸다.

도 3D. 법랑모세포의 다양한 기능적 단계 중 성숙기 주름끝 법랑모세포의 OD314 단백질의 면역조직학적 염색을 나타낸다. [Am, 법랑모세포(Ameloblast); RDE, 퇴축 치아 상피(reduced dental epithelium); E, 법랑질(enamel); D, 상아질(dentin), 헤마톡실린과 에오신 염색, × 200].

도 5는 OD314를 암호화하고 있는 신규의 cDNA의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 보인다. 뉴클레오타이드의 순서는 왼쪽에 보여졌고, 항체 생산을 위해 사용되어진 두개의 아미노산 서열은 밑줄로 표시했다.

미분화한 세포가 특정세포로 분화하는 과정에는 특별한 전사인자 (transcription factor)나 분화 유도인자 (differentiation factor)가 중추적인 역할을 한다. 최근 들어 다양한 세포들의 분화 유도인자를 동정할 목적으로 각각의 분화한 세포들이 갖는 독특한 세포-특이적 유전자들에 대한 관심이 높아지고 있다[첨부 참고문헌 5].

Nakashima 등[첨부 참고문헌 21]은 골격근 전구세포인 C2C12 세포주에 BMP-2 (bone morphogenic protein-2)를 투여하여 골격근 전구세포를 골모세포로 분화 시킨 후 분화전 골격근 전구세포와 골모세포의 유전자를 감손(subtraction) 법으로 비교하여 골모세포-특이 단백질인 오스테릭스(osterix)를 동정하였고, 기능 분석을 통하여 오스테릭스가 Runx2/CBFA1과 더불어 골모세포의 분화와 막내골화 그리고 연골성 골화를 조절하는 분화유도 인자라고 하였다.

덴틴 시알로포스포프로테인(Dentin sialophosphoprotein; DSPP)은 비교원질성 단백질에 속하는 대표적인 상아질-특이 단백질로, 하나의 유전자로부터 덴틴 시알로프로테인(dentin sialoprotein; DSP)과 덴틴 포스포프로테인(dentin phosphoprotein; DPP)의 두 가지 단백질을 합성한다[첨부 참고문헌 6, 7, 8, 18, 23, 24]. 그러나, 스리나스(Sreeenath) 등[첨부 참고문헌 26]은 상아모세포-특이 유전자로 널리 알려진 DSPP는 골모세포의 오스테릭스와는 달리 상아질의 석회화 과정에는 중요한 역할을 하나, 상아모세포의 분화를 조절하거나 유도하는 인자로는 볼 수 없다고 하여, 상아모세포의 분화에 관여하는 현재까지 알려지지 않은 또 다른 상아모세포-관련 유전자나 특이 유전자 연구의 존재 가능성을 암시하였다.

최근에 Dey 등[첨부 참고문헌 12] 이 상아모세포의 분화와 상아질 형성과정에 관여하는 기전을 밝힐 목적으로 두개골의 골모 세포(calvarial osteoblast)와 치 유두 세포(dental papilla cell)에서는 발현되지 않고 상아모세포/치수세포 (odontoblast/pulpal cell)에서 특이하게 발현되는 상아모세포-특이 인자 OD314를 보고하였다. 또한, 노던 분석에서 OD314 mRNA가 뼈, 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 골격근에서는 발현되지 않으며 상아모세포에서 선택적으로 발현된다고 하여, OD314의 상아모세포 분화과정과 상아질 형성과정에서의 역할을 암시하였다. 또한, 김 등[첨부 참고문헌 1, 2] 은 OD314가 154아미노산을 합성하는 그 기능이 알려져 있지 않는 새로운 유전자로 주로 세포질에 존재하며, mRNA와 그 합성 단백질이 상아모세포에서 선택적으로 발현되며, 사람 치수세포의 분화과정에서 OD314가 치수세포가 상아모세포로 분화하는 초기 과정에 발현되어 그 발현이 유지되다가 석회화 과정에서 더욱 증가한다고 하여 OD314가 상아질의 석회화 과정에 관여함을 시사하였다. 그러나 최근에 김[첨부 참고문헌 3] 은 상아모세포-특이 인자로 보고된 OD314가 치아 발생과정에서 상아질을 형성하는 상아모세포 뿐 아니라 법랑모세포에서도 발현된다고 하여 OD314의 법랑모세포에서의 역할을 암시하였다.

이는 OD314를 동정하는 과정에서 법랑모세포-특이 유전자인 아메로제닌(amelogenin)이 Dey 등[첨부 참고문헌 12] 이 보고한 상아모세포-특이 유전자 군에 포함되어 있었던 것으로 보아, 감손(subtraction)을 위하여 상아모세포/치수세포군 조직을 분리할 때 법랑모세포가 일부 포함되어 있었던 것으로 생각된다. 결과적으로 상아모세포-특이 유전자군에 법랑모세포 관련 유전자들이 섞여 있게 되었고, OD314가 상아모세포 뿐만 아니라 법랑모세포에서도 발현된 것으로 보인다.

치아 발생과정에서 법랑모세포의 분화는 순차적인 상피-간엽 상호작용에 의하여 조절되나, 그 정확한 기전은 잘 알려져 있지 않다[첨부 참고문헌 9]. 법랑질은 치아기 (dental organ)에 의해서 만들어지는데, 치아기는 중심부의 성상세망세포(stellate reticulum), 치유두와 인접한 부위에 내치상피세포 (internal dental epithelium), 성상세망세포와 내치상피세포 사이에 입방형의 한 층의 세포들로 구성된 중간층 (stratum intermedium), 그리고 외치상피 (external dental epithelium)로 구성되어 있다. 내치상피세포가 법랑질을 분비하는 법랑모세포로 분화하는 데에는 상아모세포와 상호작용이 필수적이며, 분화에서 법랑질 형성과 소실까지 복잡한 생활 주기 (life cycle)를 보인다[첨부 참고문헌 15]. 법랑모세포의 생활 주기는 입방형의 키가 작은 내치상피의 형태발생기 (morphogenetic stage), 핵이 근심부에 위치하며 원주형으로 키가 큰 내치상피의 조직분화기 (histodifferentiation stage), 톰스(Tomes) 돌기가 없는 법랑모세포의 초기-분비기(initial-secretory stage), Tomes' 돌기가 있는 법랑모세포의 분비기(secretory stage), 주름끝(ruffle-ended) 법랑모세포의 성숙기(maturative stage) 및 평탄끝(smooth-ended) 법랑모세포의 성숙기이다. 또한 이 과정에서 주름끝 법랑모세포는 세포의 원심 끝단에 세포주름을 형성하여 미성숙 법랑질로 부터 유기기질을 제거하고, 평탄끝 법랑모세포는 세포의 근심 끝단에서부터 칼슘 이온을 형성중인 법랑질 쪽으로 이동시키서 결과적으로 법랑질을 석회화 시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다[첨부 참고문헌 16].

이러한 분화과정동안 법랑모세포는 세포 끼리 긴밀하게 결합하고 다양한 물질을 분비하며, 또한 수많은 유전자와 단백질 그리고 다른 세포들과의 상호작용을 하게 된다[첨부 참고문헌 20].

법랑모세포는 치아의 법랑질을 형성하는 세포로 외배엽에서 기원한다. 법랑모세포는 법랑질의 유기기질을 분비하고 독특한 양상의 법랑질 석회화 과정에도 관여한다. 법랑질 형성과정의 법랑모세포는 형태와 기능적으로 분비 전단계(presecretory stage)와 분비기 (secretory stage) 그리고 성숙기 (maturation stage)의 분화-성숙의 주요 3단계로 구분할 수 있다[첨부 참고문헌 15].

법랑모세포는 법랑질을 형성할 때 유기기질과 무기질을 동시에 분비하여 부분 광화된 상태로 존재하다가 성숙해감에 따라 높은 함량의 유기기질을 제거하고 석회화 기질 성분을 높여가는 형태로 법랑질을 석회화 시키기 때문에, 유기기질이 먼저 분비되고 나중에 석회화가 진행되는 뼈, 상아질 그리고 백악질의 석회화 과정과는 다르다[첨부 참고문헌 20]. 또한 법랑모세포는 법랑질 형성 후에 치은의 접합상피(junctional epithelium)로 잔존하는 극히 일부를 제외하고는 치아에 존재하지 않기 때문에 골모세포, 상아모세포 그리고 백악모세포가 치아에 존재해서 경우에 따라 골, 상아질, 백악질의 유지와 치유 및 재생에 관여하는 양상과도 다르다. 최근에 활발한 분자생물학적 연구를 포함하여 법랑모세포에 관한 많은 연구에도 불구하고[첨부 참고문헌 4, 19, 25, 27], 법랑모세포가 법랑질 완성 후에 존재하지 않는 세포 접근의 한계와 법랑모세포가 갖는 세포의 단계에 따른 다양한 변화와 석회화의 독특한 특성으로 인하여, 현재까지 법랑모세포의 분화와 성숙 그리고 법랑질의 석회화에 관련된 인자와 기전에 관하여는 잘 알려져 있지 않다.

이에 본 발명자는 생쥐 하악 전치의 다양한 시기의 법랑모세포를 이용하여, 형태학적과 분석과 인사이투 하이브리드(in-situ hybridization)에 의한 OD314 mRNA의 발현 그리고 OD314 항체를 이용한 면역조직화학적 분석을 통하여 OD314 유전자의 법랑모세포의 분화와 성숙과정에서 특이적으로 발현되는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 법랑모세포의 분화 및/또는 성숙을 위한 OD314 유전자 및 이로부터 발현된 폴리펩타이드의 특성을 규명하는 것이다.

본 발명은 법랑모세포의 분화 및/또는 성숙을 위한 OD314 유전자에 관한 것이다.

본 발명은 법랑모세포의 분화 및/또는 성숙을 위한 OD314 mRNA에 의해 발현되는 OD314 폴리펩타이드 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조방법은 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 유전공학적 방법에 의한 제조방법이다.

본 발명은 법랑모세포의 분화 및/또는 성숙을 위한 OD314 폴리펩타이드를 코드하는 분리된 DNA 서열 및 이를 함유하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 상기 OD314 폴리펩타이드에 면역학적으로 결합하는 항체를 제공한다.

본 발명은 상기 OD314 폴리펩타이드에 면역학적으로 결합하는 항체, 상기 OD314 폴리펩타이드, 및 상기 OD314 유전자를 사용하여 법랑모세포의 분화 및/또는 성숙을 위한 인자를 스크링하는 방법을 제공한다.

제 1양태로, 본 발명은 법랑모세포의 분화 및/또는 성숙을 위한 핵산서열을 제공한다. 상기 핵산서열은 OD314로 지칭된 DNA 및 RNA 서열이다. 상기 핵산서열들은 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 OD314이다.

본 명세서에서 사용된 "법랑모세포(ameloblast)"는 치아의 법랑질을 형성하는 세포로 외배엽에서 기원하며, 법랑질의 유기기질을 분비하고 독특한 양상의 법랑질 석회화 과정에도 관여하는 세포를 말한다.

상기 "핵산서열"이란 용어는 선택적 발현성이 확인된 천연의 mRNA, 그에 상보적인 cDNA 서열 및 이에 등가의 핵산서열을 포함한다.

"등가의 핵산서열"에는 본 명세서에서 제공하는 서열과 알릴(allelic)변형에 의한 서열, 종(species)간의 변이에 의한 서열 또는 코돈 축퇴성 서열을 포함한다.

"코돈 축퇴성 서열"이란 상기 자연 발생의 서열과는 상이하나 본 발명에 개시된 자연 발생의 OD314 폴리펩타이드와 동일한 서열의 폴리펩타이드를 코드하는 핵산서열을 의미한다.

"알릴(allelic) 변형에 의한 서열" 또는 "종(species)간 변형에 의한 서열"은 상기 자연 발생의 핵산서열과는 상이하나 본 명세서에 개시된 상기 폴리펩타이드들과 실질적으로 동일한 기능적 성질을 보유하는 폴리펩타이드를 코드하는 핵산서열을 의미한다.

제 2 양태로, 본 발명은 법랑모세포의 분화 및/또는 성숙을 위한 핵산서열로부터 발현되는 서열번호 2의 폴리펩타이드를 제공한다. 일예로, 본 발명은 상기 유전자 OD314로부터 발현되는 서열번호 2로 표시되는 OD314 폴리펩타이드를 제공한다.

본 명세서에 사용된 "OD314 폴리펩타이드"에는 법랑모세포의 분화 및/또는 성숙과정을 가진 포유동물 종에서 얻어지는 분리된 폴리펩타이드로서 상기 서열번호 2로 표시되는 OD314 폴리펩타이드, 그의 기능적 동등물 및 기능적 유도체가 포함된다.

본 발명의 정의상 OD314 폴리펩타이드의 "기능적 동등물"이란 천연형 OD314 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "동질의 생리활성"이란 법랑모세포에서는 발현되지만 인접한 다른 세포에서는 발현되지 않거나, 또는 그 발현 농도가 극소량인 것으로서, 법랑모세포의 분비기에 그 발현이 증가하며, 상기 서열번호 2의 OD314 폴리펩타이드와 적어도 60% 이상의, 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 90%이상의 서열 상동성을 갖는 것을 말한다.

본 발명의 "기능적 동등물"에는 천연형 단백질 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Rhe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 OD314의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.

" 기능적 유도체" 는 상기 OD314 폴리펩타이드의 단편, 상기 단편을 포함하는 단백질, 또는 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질을 말한다. " 단편" 이란 용어는 단백질의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 메카니즘을 가진 것을 말한다. OD314 폴리펩타이드의 안정성, 저장성, 용해도 등을 변경시키기 위한 변형 또는 예를 들어 OD314와 상호 작용하는 물질과의 관계를 변경시키기 위해 변형을 가한 유도체도 본 발명의 범위에 포함된다. 상기와 같은 단백질의 기능적 유도체를 만드는 방법은 공지되어 있다.

특히 바람직한 OD314 단백질의 제조방법은 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이다. OD314를 코드하는 DNA 또는 RNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 그 세포 용해물을 만들거나 OD314 mRNA를 in vitro 번역한 후 당업계에 공지된 단백질 분리 방법에 의해 OD314 단백질을 정제할 수 있다. 통상, 세포 조각 (cell debris) 등을 제거하기 위해 상기 세포 용해물 또는 in vitro 번역한 결과물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그라피 등을 적용한다. 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등은 컬럼 크로마토그라피의 예이다. 친화성 컬럼은, 예를 들어, 항-OD314 항체를 이용하여 만들 수 있다.

본 발명의 OD314 폴리펩타이드 유래의 단편을 비롯한 OD314 단백질의 기능적 유도체는 펩타이드 합성에 대한 공지의 유기화학적 방법 중 하나를 이용하여 제조할 수 있다. 펩타이드 합성의 유기 화학적 방법은 균질상에서 또는 소위 고체상의 지지체에서 축합 반응에 의해 필요한 아미노산을 커플링시키는 것을 포함한다. 축합 반응에 관한 가장 통상적인 방법으로는 카르보디이미드 방법, 아지드 방법, 혼합 무수물 방법 및 활성 에스테르를 사용한 방법이 있는데, 이들 방법에 대해서는 문헌[The Peptides Analysis, Synthesis, Biology Vol. 1-3 (Gross, E. 및 Meienhofer,J. 편집), 1979-1981(Academic Press Inc.)]에 개시되어 있다.

특히 적합한 고체상으로는 문헌(Wang, J. Am. Chem. Soc., 95, 132 (1974))에 기재된 p-알콕시벤질 알코올 수지(4-히드록시-메틸-페녹시-메틸-코폴리스티렌-1% 디비닐벤젠 수지)가 있다. 합성 후 펩타이드는 부드러운 조건하에 상기 고체상으로부터 분리될 수 있다. 목적하는 아미노산 서열의 합성 후, 수지로부터 펩타이드의 탈리는 트리이소프로필 실란, 아니솔 또는 에탄디티올, 티오아니솔과 같은 스캐빈저를 함유하는 트리플루오로아세트산을 사용하여 실시한다. 축합 반응에 관여할 수 없는 반응성기는 산, 염기를 사용하여 가수분해시키거나 또는 환원시키므로써 매우 용이하게 다시 제거될 수 있는 기에 의해 효과적으로 보호된다. 가능한 보호기에 대해서는 문헌[The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1-9 (Gross, Udenfriend and Meienhofer 편집) 1979-1987 (Academic Press Inc.)]에 보다 상세하게 설명되어 있다.

본 발명은, 제 3 양태로는 법랑모세포의 분화 및/또는 성숙을 위한, 포유동물, 바람직하게는 인간 유래의 OD314 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 DNA 분절 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 상기의 OD314 폴리펩타이드를 코드하는 분리된 DNA 분절을 제공한다. 상기 "DNA 분절" 에는 서열번호 1, 및 서열번호 2로 표시되는 OD314 폴리펩타이드, 그의 기능적 동등물 및 기능적 유도체를 코드하는 서열이 포함된다. 나아가, 본 발명은 상기 DNA 분절을 포함하는 각종 벡터, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 파지, 바이러스 등의 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 제 4 양태로는, 상기 OD314 폴리펩타이드에 면역학적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체에는 다클론성 항체 및 단클론성 항체가 모두 포함된다.

본 발명의 제 5 양태로는, 상기 OD314 폴리펩타이드에 면역학적으로 결합하는 항체, 상기 OD314 폴리펩타이드, 및 상기 OD314 유전자를 사용하여 법랑모세포의 분화 및/또는 성숙을 위한 인자를 스크링(screening)하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정이 되는 것은 아니다.

<실시예 1>

(1)재료 및 방법

(가) 조직 표본제작과 헤마톡실린-에오신 염색

생후 7일, 21일, 40일의 생쥐를 각 각 5마리씩 4% 파라포름알데하이드(PFA) 용액을 이용하여 관류 고정 시킨 후 하악전치를 포함한 하악골을 적출한 다음 4℃, 4% 파라포름알데하이드 용액에서 16시간 후 고정하였다. 고정 후 인산완충생리식염수(Phosphate Buffered Saline; PBS, pH 7.4)용액으로 2시간 세척하고, 10% EDTA (pH 7.4) 용액에서 2주에서 4주간 탈회하고, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% I, 100% II, 100% III, 100% IV 에탄올로 각각 12시간씩 탈수하였다. 클로로포름 용액에서 4회 2시간씩 처리한 후 통법에 따라 파라핀 포매 하고 5 μm 두께로 전치부에서부터 순차적으로 치아의 장축에 직각되게 박절한 후, 일부는 헤마톡실린-에오신 염색을 시행하여 형태학적으로 관찰하고, 나머지는 4℃ 상태에서 보관하여 mRNA 본자리 교잡(in-situ hybridization)과 면역조직화학적 염색에 이용하였다.

(나) 인싸이투 하이브리드(In-situ hybridization)

서열번호 1의 1197 bp의 OD314 cDNA를 제한 효소 절단한 후 pBluescript- SK(+) 벡터 (Stratagene Cloning System, La Jolla, CA, USA)에 서브클로닝(subcloning) 한 다음, 다시 한번 시퀀싱(sequencing)하여 DNA 삽입(insert)의 방향을 확인하였다. DNA를 선형화하고 프로티나제 K(Proteinase K) 처리 후 DIG RNA 라벨링 키트(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)와 T3 및 T7 RNA 중합효소(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)를 이용하여 센스와 안티센스 cRNA 탐침자(probe)을 작성하였다.

절편들을 자일렌(xylene)으로 탈 파라핀 처리하고 100%, 90%, 80%, 70% 에탄올의 순서로 수화한 후, 4% PFA에 10분간 고정하였다. PBS로 두 차례 세척하고 아세틸레이션 용액 (0.25% acetic anhydrate in 0.1M triethanolamine-HCI, pH 8.0)에 10분간 처리한 후 2× SSC (0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate)로 두 차례 세척한 다음 탈수 및 탈지 (70% 에탄올: 1분, 80% 에탄올: 1분, 95% 에탄올: 2분, 100% 에탄올: 1분, 100% 에탄올: 5분, 95% 에탄올: 1분) 과정을 거쳐 공기 중에서 건조 시켰다. 50% 포름아미드, 10 mM Tris-HCl, 200μg/ml tRNA, 600 mM NaCl, 0.25% SDS, 1 mM EDTA, 1× 덴하드트 용액(Denhardt's solution), 10% 덱스트란 설페이트가 함유된 용액에 OD314 cRNA 프로브를 50℃에서 16시간 교잡 하였다. 교잡후 2× SSC, 0.2× SSC I, 0.2× SSC II로 각각 세척한 다음 1.5% 블록킹제(Bloking Reagent; Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)가 함유된 Dig 완충용액 I (100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl)으로 다시 세척하고 anti-Dig 항체를 1:88으로 Dig 완충용액 I에 희석하여 4℃에서 30분간 처리하였다. 다시 Dig 완충용액 II (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 500 mM MgCl₂)로 세척하고 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium) 염 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트(NBT/ BCIP)로 발색하고 Dig 완충용액 IV (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA)로 3분간 세척한 다음 메틸 그린으로 대조 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.

(다) 항체의 제작 및 면역조직화학적염색

1) 항체의 제작

OD314 단백질 영역에서 서열번호 3을 이용하여 주문 제작된 항체 CST15와 서열번호 4를 이용하여 주문 제작된 CPE14를 이용하였다.

2) 면역조직화학적 염색

인싸이투 하이브리드(In-situ hybridization)때 사용된 것과 동일한 절편을 자일렌으로 탈 파라핀 처리하고 100%, 90%, 80%, 70% 에탄올의 순서로 함수 후, 0.1M PBS로 두 차례 세척하고, 0.3% 과산화수소가 포함된 완충액 (메탄올 40ml + 30% H₂O₂ 0.4 ml)에서 20-30분 동안 엔도지너스 퍼옥시다아제 블록킹(endogenous peroxidase block) 처리한 후 다시 PBS로 세 차례 세척하였다. 이 절편을 0.5% BSA (bovine serum albumin)가 함유된 PBS 용액을 사용하여 희석된 노르말 시럼(normal serum)으로 20분 동안 예비 항온 처리한 뒤, PBS로 세척하였다. 절편을 느로말 시럼을 사용하여 1:100의 비율로 희석한 OD314 항혈청 (1차 항체)으로 4℃에서 하룻밤 동안 항온 처리하였다. PBS로 40분 동안 세척한 후, 절편을 2차 항체로서 0.5% BSA로 희석(1drop/0.5% BSA sol 10ml)한 염소 항토끼 IgG항체 (Vector Lab, Burlingame, CA, USA)와 실온에서 1시간 동안 항온 처리하였다. PBS로 20분 동안 세척한 후, 단편을 사용하기 30분전에 PBS로 희석한 ABC 시약 (Vector Lab, Burlingame, CA, USA)과 45분 동안 반응시켰다. PBS로 20분 동안 세척한 후 0.05% DAB (Deaminobenzidine Tetrahydrochloride)를 이용한 비색반응으로 발색시킨 후, 절편을 세척하고 헤마톡실린으로 대조 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.

(2)결과

(가) 헤마토실린-에오신(Hematoxylin-eosin) 염색 소견

하악전치의 종단표본에서 전체적으로 외치상피(external dental epithelium)와 성상세망세포(stellate reticulum) 그리고 중간층(stratum intermedium)의 세포가 법랑모세포위에 3-4 세포 층 두께로 배열되어 있었으며, 하부에서 법랑질의 형성이 진행되고 있었다.

1) 분비 전단계 법랑모세포(presecretory ameloblasts)

법랑모세포는 키가 큰 원주형태로 세포질이 풍부하였으나, 입방형의 세포의 핵들이 근심측에 배열하고 세포질의 호염기성 염색성이 증가하는 것과 같은 뚜렷한 세포 극성 소견은 관찰 되지 않았다 (도 1A).

2) 분비기 법랑모세포(secretory ameloblasts)

법랑모세포는 키가 큰 원주형태로 세포질이 풍부하였고, 세포의 핵이 근심측에 배열하고 세포질의 핵 근처는 일부 밝게 보이면서 중앙부위는 호염기성 염색성이 증가하는 전형적인 세포 극성을 띄면서 단백질을 분비하는 세포의 소견을 보였다. 세포질의 원심부에는 톱니 모양인 톰스 돌기들이 일부 관찰 되었다 (도 1B).

3) 성숙기(maturation stage): 평탄끝법랑모세포(smooth-ended ameloblast)

분비기 세포에 비하여 법랑모세포의 형태가 입방형으로 바뀌고 세포의 핵은 근심부에 치우쳐 존재하였다. 세포의 전체적인 크기가 감소하면서 세포질의 양도 감소된 양상이었으나, 법랑모세포와 형성된 법랑질 사이에는 간격 없이 평탄한 모양을 보였다 (도 1C).

4) 성숙기: 주름끝법랑모세포 (ruffle-ended ameloblast)

법랑모세포의 형태는 분비기 세포에 비하여 입방형으로 형태를 띄며 세포의 핵은 근심부에 치우쳐 존재하였으나, 세포질의 양이 감소되었다. 법랑모세포와 형성된 법랑질 사이에는 약간의 공간이 나타나면서 불규칙한 형태를 보였다(도 1C).

(나) OD314 mRNA와 단백질의 발현

설치류의 치아 특성에 맞게 종단된 하악전치는 치근쪽 에서부터 법랑모세포의 분화 단계를 3단계로 구분할 수 있었다 (도 2A). 치근쪽(영역 I)은 법랑모세포의 분화과정에서 내치상피 (internal dental epithelium)와 분비전단계 법랑모세포들이 관찰되었고, 치아의 중앙부(영역 II)에서는 분비전단계와 분비기의 법랑모세포들이 관찰 되었으며, 치관부에서는(영역 III)에서는 성숙기의 법랑모세포들이 관찰 되었다.

본자리 교잡(in-situ hybridization) 실험에서 OD314 mRNA는 법랑모세포의 분비기에서부터 발현되기 시작하여 법랑모세포가 성숙해갈 수록 그 발현이 증가하는 소견을 보였다 (도 2 B, C, D).

면역조직화학적 분석에서 OD314 단백질은 분비전단계의 법랑모세포에서는 발현되지 않다가, 분비기의 법랑모세포에서는 세포질의 중앙부위에서 원심쪽으로 산재된 형태의 약한 발현을 나타냈다(도 3A, B). 반면에 성숙기의 평탄끝 법랑모세포와 주름끝 법랑모세포에서는 OD314가 강하게 발현되었다. OD314는 세포의 중앙 부위와 형성된 법랑질에 인접한 세포질의 원심끝단에서 특히 강하게 발현되었으며, 발현 정도는 주름끝 법랑모세포에서 더욱 뚜렷한 소견을 보였다(도 3C, D).

본 발명의 OD314유전자는 법랑모세포의 분화 또는 성숙을 위한 유전자로서 법랑모세포 분화과정에 중요한 인자인 OD314 유전자와 이로부터 유래하는 폴리펩타이드 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명이 제공하는 특이적 항체는 법랑모세포의 분화 및/또는 성숙중인 세포를 검출하거나 OD314 단백질을 다량으로 분리하는데 매우 유용하며, OD314의 항원성 펩타이드는 OD314에 특이적인 항체를 제조하는데 유용하게 사용될 수 있다.

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Claims (12)

1. 법랑모세포의 분화 또는 성숙과정을 위한 OD314 유전자.
2. 제 1항에 있어서, 상기 유전자가 서열번호 1인 것을 특징으로 하는 법랑모세포의 분화 또는 성숙을 위한 OD314 유전자.
3. 제 2항에 있어서, OD314 유전자의 mRNA를 코딩하는 cDNA.
4. 제 1항에 기재된 상기 OD314 유전자의 mRNA에 의해 발현되는 OD314 폴리펩타이드 및 그 기능적 동등물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 2에 기재된 서열인 것이 특징인 OD314 폴리펩타이드.
6. 제 5항에 기재된 OD314 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 DNA 분절.
7. 제 6항에 기재된 DNA 분절을 포함하는 재조합 벡터.
8. 법랑모세포의 분화 또는 성숙을 분석을 위한 제 1 항의 OD314 유전자, 제 3 항의 OD314의 cDNA, 및 제 4항의 OD314 폴리펩타이드 및 그의 기능적 동등물로 이루어진 그룹에서 선택되어지는 것을 특징으로 하는 생물학적 표지자.
9. 법랑모세포의 분화 또는 성숙을 분석하기 위한 OD314의 서열번호 3 또는 서열번호 4의 항원성 펩타이드.
10. 제 9항에 기재된 항원성 펩타이드에 대하여 면역학적으로 결합하는 항체.
11. 제 9항의 항원성 펩타이드를 이용하여 항체를 제조하는 방법.
12. 상기 제 1 항의 OD314 유전자, 상기 제 3 항의 OD314 폴리펩타이드, 및 제 10 항의 OD314 폴리펩타이드에 면역학적으로 결합하는 항체로 이루어진 그룹에서 선택되어지는 것을 사용하여 법랑모세포의 분화 및/또는 성숙을 위한 인자를 스크링(screening)하는 방법.

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