KR20060121244A - 개선된 가스트린 방출 펩티드 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 식 M-N-O-P-G를 가지는 진단용 영상화 또는 치료에 사용되는 신규하고 개선된 화합물이 제공되는데, 상기 식에서 M은 광학 표지 또는 금속 킬레이터이고 (금속 방사성 핵종과 복합체를 형성하는 형태이거나 그렇지 않은 형태임), N-O-P는 링커이며, G는 GRP 수용체 표적화 펩티드이다. 본 발명의 화합물을 사용하여 환자를 영상화하는 방법 및/또는 환자에게 방사성 치료 또는 방사성 사진을 제공하는 방법이 또한 본원에서 제공된다. 화합물로부터 진단용 영상화제를 제조하기 위한 방법 및 키트도 또한 제공된다. 방사성 치료제를 제조하기 위한 방법 및 키트도 본 발명에서 제공된다.

가스트린 방출 펩티드 (GRP), 방사성 핵종, 방사성 치료법, 진단용 영상화, 방사성 약제, 금속 킬레이터, 가스트린 방출 펩티드 수용체 (GRP-R), 봄베신.

Description

개선된 가스트린 방출 펩티드 화합물{IMPROVED GASTRIN RELEASING PEPTIDE COMPOUNDS}

본 발명은 진단용 영상화제 또는 방사성 치료제로서 유용한, 신규한 가스트린 방출 (GRP) 화합물에 관한 것이다. 이들 GRP 화합물은 생체 내 광 영상화에 의해 검출가능한 방사성 핵종 또는 표지로 표지화되고, 표지와 표적으로 하는 펩티드 사이에 신규한 링커를 사용하는 것을 포함하며, 개선된 약물학적 특성을 제공한다.

암을 검출하고 치료하기 위한 방사성 약제 (예컨대 진단용 영상화제, 방사성 치료제)의 용도는 잘 알려져 있다. 최근 몇 년 동안에 암 진단 및/또는 치료를 위한 부위-특정 방사성 약제의 발견은 점점 인기를 얻어가고 있고, 그런 화합물의 특이성, 효율 및 활용성의 진가를 더 낫게 인정하는 의료업으로서 계속 성장하고 있다.

보다 새로운 이들 방사성 약제들은 전형적으로 금속 킬레이터에 연결된 표적화제로 구성되는데, 금속 킬레이터는 진단용 금속 방사성 핵종, 예컨대 네크네튬 또는 인듐, 또는 치료용 금속 방사성 핵종, 예컨대 루테튬, 이트륨, 또는 레늄과 킬레이트를 형성할 수 있다 (예컨대 복합체를 형성할 수 있다). 금속 킬레이터의 역할은 방사성 약제가 원하는 부위에 전달됨에 따라 금속 방사성 핵종을 붙잡는 (즉 킬레이트화) 것이다. 금속 방사성 핵종에 강력하게 결합하지 않는 금속 킬레이터는 금속 방사성 핵종이 그것의 원하는 부위에 도달하지 않기 때문에 그것의 원하는 용도에 대해 방사성 약제가 비효율적이 되게 만들 것이다. 그러므로 금속 킬레이터의 발견을 유도하는 추가의 연구 및 개발, 예컨대 미국 특허 제 5,662,885호에 보고된 것과 같은 금속 킬레이터는 금속 방사성 핵종에 대해 강력한 결합 친화력 및 표적화제와 포합하는 능력을 나타냈다. 계속해서 금속 킬레이터와 표적화제 사이를 물리적으로 분리하기 위해 사용되는 "스페이서"의 개념이 추가로 도입되었다 (예컨대 미국 특허 제 5,976,495호 참조).

특정 결합 부위에 대한 친화력에 의해 나타나는 표적화제의 역할은 진단제, 예컨대 금속 방사성 핵종을 함유하는 방사성 약제를 검출하거나 치료를 위해 원하는 부위에 향하게 하는 것이다. 전형적으로 표적화제는 주어진 수용체에 대해 특정 친화력을 나타내는 단백질, 펩티드, 또는 다른 마크로분자를 포함할 수 있다. 다른 공지된 표적화제로는 단클론성 항체 (MAbs), 항체 단편 (Fab' 및 (Fab)₂), 및 수용체-아비드 펩티드가 있다 (Donald J. Buchsbaum, "Cancer Therapy with Radiolabeled Antibodies; Pharmacokinetics of Antibodies and Their Radiolabels; Experimental Radioimmunotherapy and Methods to Increase Therapeutic Efficacy," CRC Press, Boca Raton, Chapter 10, pp.115-140, (1995); Fischman, et al. "A Ticket to Ride: Peptide Radiopharmaceuticals," The Journal of Nuclear Medicine, vol. 34, No. 12, (Dec. 1993)).

최근에 이르러 일부 암 세포가 많은 하위타입을 가지고 있는 가스트린 방출 펩티드 (GRP) 수용체 (GRP-R)을 함유하는 것이 알려졌다. 특히 여러 유형의 암세포가 GRP 수용체를 과잉발현하거나 독특하게 발현하는 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로 GRP 수용체 패밀리에 결합하는 GRP 및 GRP 유사체에 대해 많은 연구 및 조사가 이루어졌다. 그런 하나의 유사체는 사람 GRP의 유사체이고 GRP 수용체에 높은 특이성 및 GRP와 유사한 친화력으로 결합하는, 피부로부터 분리되는 14 아미노산 펩티드 (즉 테트라데카펩티드)인 봄베신 (BBN)이다.

봄베신과 GRP 유사체는 아고니스트 또는 길항제의 형태를 취할 수 있다. GRP 수용체에 대한 GRP 또는 BBN의 결합은 이들 암세포의 세포 분화를 증가시키고, 그러한 아고니스트는 세포에 의해 내부화되는 한편, GRP 또는 BBN 길항제의 결합은 일반적으로 세포에 의한 내부화 또는 세포 분화의 증가된 속도를 유발하지 않는다. 그런 길항제는 GRP 수용체에 대한 내인성 GRP의 결합을 경합적으로 억제하고 암세포 증식 속도를 감소시킬 수 있도록 고안된다 (Hoffen, K.; Peptides in Oncology II, Somatostatin Analogues and Bombesin Antagonists (1993), pp. 87-112). 이러한 이유로 길항제로서의 BBN 또는 GRP 유사체를 개발하기 위한 수많은 작업이 이루어졌고, 지금도 진행중이다 (Davis et al., Metabolic Stability and Tumor Inhibition of Bombesin/GRP Receptor Antagonists, Peptides, vol.13, pp.401- 407, 1992).

암에 대한 진단 또는 치료제로서 사용하기에 효과적인 화합물을 고안할 때 약물이 적절한 생체내 표적화 및 약물학적 특성을 가지는 것이 중요하다. 예를 들 어 방사성 약제의 경우 방사성 표지된 펩티드가 암세포에 의해 매우 특이하게 흡수 (예컨대 GRP 수용체를 통하여)되는 것이 바람직하다. 또한 일단 방사성 핵종이 암 부위에 위치하면, 부위에 고도로 국소화된 방사능 용량을 전달하기 위해 원하는 시간 동안 거기에 잔류되는 것이 바람직하다.

더욱이 정상 조직으로부터 효율적으로 제거되는 방사성 표지된 펩티드를 개발하는 것이 또한 방사성 약제에 대해서는 중요한 요소이다. 금속성 방사성 핵종으로 표지된 (킬레이트 포합을 통하여) 생체 분자 (예컨대 MAb, Fab 또는 펩티드)가 사람과 같은 동물에게 투여될 때 금속성 방사성 핵종 (일부 화학적 형태의)의 대다수는 신장이나 간의 연조직에 "붙잡히게" 될 수 있다 (즉 소변이나 담즙으로 분비되지 않는다) (Duncan et al.; Indium-111-Diethylenetriaminepentaacetic Acid-Octreotide Is Delivered in Vivo to Pancreatic, Tumor Cell, Renal, and Hepatocyte Lysosomes, Cancer Research 57, pp. 659-671, (Feb. 15,1997)). 보다 작은 방사성 표지된 생체분자 (예컨대 펩티드 또는 Fab)의 경우 활성이 제거되는 주요 경로는 신장을 통해서인데, 신장 또한 고도의 (즉 정상적으로 > 주사된 용량의 10-15 %) 방사성 금속을 보유할 수 있다. 금속 방사성 핵종이 신장이나 간에 보유되는 것은 명백하게 바람직하지 않다. 역으로, 혈류로부터 방사성 약물이 신장에 의해 너무 빨리 제거되는 것 또한, 장시간 동안 진단을 위한 영상화 또는 방사성 치료를 위해 고도의 종양 흡수가 필요한 경우에는 바람직하지 않다.

미국 특허 제 6,200,546호 및 US 2002/0054855 (Hoffman, et al)에서 설명된 것과 같은 후속 작업들이 일반식 X-Y-B의 식을 가지는 화합물을 형성함으로써 이 문제를 해결하려고 시도하였는데, 상기 식에서 X는 금속의 복합체를 형성할 수 있는 기이고, Y는 스페이서 기에 있는 공유 결합이며, B는 봄베신 아고니스트 결합 부분이다. 그런 화합물은 GRP 수용체에 대해 높은 결합 친화력을 가지고 있는 것으로 보고되며, 방사능은 연장된 시간 동안 세포 내부에 보유된다. 또한 정상 마우스를 이용한 생체내 연구 결과, 신장에서의 방사성 금속의 보유는 당해기술 분야에서 공지된 것보다 낮았는데, 대부분의 방사능은 소변으로 분비되었다.

현재 약물학 및 신장 분비가 개선된 (즉 방사성 금속이 신장이 더 오랫동안 보유된다) 새롭고 개선된 방사성 약제 및 다른 진단용 화합물들이 진단을 목적으로 한 영상화 및 치료 용도로 발견되었다. 방사성 치료 용도에 대해서는 더 높은 종양 흡수 및 더 좋은 종양 표적화를 가능하게 하고 신장 보유율은 낮게 하기 위한 혈액내 제거 속도가 더 느린 것이 중요하다.

도 1A는 실시예 I에서 설명되는 바와 같이, A (메틸-(3β,5β)-3-아미노콜란-24-에이트) 및 B ((3β,5β)-3-아미노콜란-24-오산)으로부터 중간체 C ((3β,5β)-3-(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노콜란-24-오산)을 합성하기 위한 일련의 화학 반응을 도시한다.

도 1B는 실시예 I에서 설명되는 바와 같이, N-[(3β,5β)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]콜란-24-일]-L-글로타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L62)의 합성을 위한 순차적인 반응을 도시한다.

도 2A는 실시예 II에서 설명되는 바와 같이, N-[4-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L70)의 합성을 위한 순차적인 반응을 도시한다.

도 2B는 실시예 II에서 설명되는 바와 같은, N-[4-[2-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]에톡시]벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L73), N-[3-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]메틸]벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L115), 및 N-[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]메틸]페닐아세틸]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L116)의 합성을 위한 순차적인 반응을 일반적으로 도시한다.

도 2C는 실시예 II에서 설명되는 바와 같은, N-[4-[2-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]에톡시]벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L73)의 합성을 위해 도 2B의 합성 반응에 사용된 링커의 화학적 구조를 도시한다.

도 2D는 실시예 II에서 설명되는 바와 같은, N-[3-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]메틸]벤조일]-L-글 루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L115)의 합성을 위해 도 2B의 합성 반응에 사용된 링커의 화학적 구조를 도시한다.

도 2E는 실시예 II에서 설명되는 바와 같은, N-[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]메틸]페닐아세틸]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L116)의 합성을 위해 도 2B의 합성 반응에 사용된 링커의 화학적 구조를 도시한다.

도 2F는 실시예 II에서 설명되는 바와 같은, N-[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]글리실-4-피페리딘카르보닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-메티오닌아미드(L74)의 합성을 위한 순차적인 반응을 도시한다.

도 3A는 실시예 III에서 설명되는 바와 같은, 중간체(3β,5β)-3-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노]아세틸]아미노-12-옥소콜란-24-오산(C)의 합성을 위한 일련의 화학반응을 도시한다.

도 3B는 실시예 III에서 설명되는 바와 같은, N-[(3β,5β)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-12,24-디옥소콜란-24-일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L67)의 합성을 위한 순차적인 반응을 도시한다.

도 3C는 실시예 III에서 설명되는 바와 같은, (3β,5β)-3-아미노-12-옥소콜란-24-오산(B)의 화학적 구조를 도시한다.

도 3D는 실시예 III에서 설명되는 바와 같은, (3β,5β)-3-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노]아세틸]아미노-12-옥소콜란-24-오산(C)의 화학적 구조를 도시한다.

도 3E는 실시예 III에서 설명되는 바와 같은, N-[(3β,5β)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-12,24-디옥소콜란-24-일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L67)의 화학적 구조를 도시한다.

도 4A는 실시예 IV에서 설명되는 바와 같은, 중간체 (3β,5β,12a)-3-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노]아세틸]아미노-12-히드록시콜란-24-오산(3a) 및 (3β,5β,7a,12a)-3-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노]아세틸]아미노-7,12-히드록시콜란-24-오산(3b)를 얻기 위한 반응의 순서를 도시한다.

도 4B는 실시예 IV에서 설명되는 바와 같은, N-[(3β,5β,12a)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-12-히드록시-24-옥소콜란-24-일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L63)의 합성을 위한 순차적인 반응을 도시한다.

도 4C는 실시예 IV에서 설명되는 바와 같은, N-[(3β,5β,7a,12a)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸] 아미노]아세틸]아미노]-7,12-디히드록시-24-일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L64)의 합성을 위한 순차적인 반응을 도시한다.

도 4D는 실시예 IV에서 설명되는 바와 같은, (3β,5β,7a,12a)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산(2b)의 화학적 구조를 도시한다.

도 4E는 실시예 IV에서 설명되는 바와 같은, (3β,5β,12a)-3-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노]아세틸]아미노-12-히드록시콜란-24-오산(3a)의 화학적 구조를 도시한다.

도 4F는 실시예 IV에서 설명되는 바와 같은, (3β,5β,7a,12a)-3-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노]아세틸]아미노-7,12-히드록시콜란-24-오산(3b)의 화학적 구조를 도시한다.

도 4G는 실시예 IV에서 설명되는 바와 같은, N-[(3β,5β,12a)-3-[[[[[4, 7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-12-히드록시-24-옥소콜란-24-일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 (L63)의 화학적 구조를 도시한다.

도 4H는 실시예 IV에서 설명되는 바와 같은, N-[(3β,5β,7a,12a)-3-[[[[[4, 7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-7,12-디히드록시-24-옥소콜란-24-일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 (L64)의 화학적 구조 를 도시한다.

도 5A는 실시예 V에서 설명되는 바와 같은, 4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]메틸]벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L71); 및 트란스-4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]메틸]시클로헥실카르보닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L72)의 합성을 위한 순차적인 반응을 도시하고, 이때 링커는 각각 도 5B 및 도 5C로부터 사용된다.

도 5B는 도 5A에 도시되고 실시예 V에서 설명되는 바와 같이 화합물 L71에 사용된 링커의 화학적 구조를 도시한다.

도 5C는 도 5A에 도시되고 실시예 V에서 설명되는 바와 같이 화합물 L72에 사용된 링커의 화학적 구조를 도시한다.

도 5D는 실시예 V에서 설명되는 바와 같은 봄베신[7-14](B)로 기능화된 링크 아미드 수지의 화학적 구조를 도시한다.

도 5E는 실시예 V에서 설명되는 바와 같은, 트란스-4-[[[[(9H-플루오렌-9- 일메톡시)카르보닐]아미노]메틸]시클로헥산카르복실산(D)의 화학적 구조를 도시한다.

도 6A는 실시예 VI에서 설명되는 바와 같은, 중간체 링커 2-[[[9H-플루오렌- 일메톡시)카르보닐]아미노]메틸]벤조산(E)의 합성을 위한 반응의 순서를 도시한다.

도 6B는 실시예 VI에서 설명되는 바와 같이, 중간체 링커 4-[[[9H-플루오렌- 9-일메톡시)카르보닐]아미노]메틸]-3-니트로벤조산(H)의 합성을 위한 반응의 순서를 도시한다.

도 6C는 실시예 VI에서 설명되는 바와 같은, N-[2-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]메틸]벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-레실-L-메티오닌아미드(L75)의 합성을 도시한다.

도 6D는 실시예 VI에서 설명되는 바와 같은, N-[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]메틸]-3-니트로벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L76)의 합성을 도시한다.

도 7A는 실시예 VII에서 설명되는 바와 같은, 중간체 링커 [4-[[[9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]메틸]페녹시]아세트산(E)의 합성을 위한 반응의 순서를 도시한다.

도 7B는 실시예 VII에서 설명되는 바와 같이, N-[[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]메틸]페녹시]아세틸]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L124)의 합성을 도시한다.

도 7C는 실시예 VII에서 설명되는 바와 같은, N-[[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]메틸]페녹시]아세틸]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티 오닌아미드(L124)의 화학적 구조를 도시한다.

도 8A는 실시예 VIII에서 설명되는 바와 같이, 중간체 4-[[[9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]메틸]-3-메톡시벤조산(E)의 합성을 위한 반응의 순서를 도시한다.

도 8B는 실시예 VIII에서 설명되는 바와 같이, N-[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]메틸]-3-메톡시벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L125)의 합성을 도시한다.

도 8C는 실시예 VIII에서 설명되는 바와 같은, N-[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]메틸]-3-메톡시벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L125)의 화학적 구조를 도시한다.

도 9A는 실시예 IX에서 설명되는 바와 같은, 3-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]아세틸]아미노벤조산(B)의 합성을 위한 반응을 도시한다.

도 9B는 실시예 IX에서 설명되는 바와 같은, 6-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]아세틸]아미노나프토산(C)의 합성 반응을 도시한다.

도 9C는 실시예 IX에서 설명되는 바와 같은, 4-[[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]아세틸]메틸아미노]벤조산(D)의 합성 반응을 도시한다.

도 9D는 실시예 IX에서 설명되는 바와 같은, N-[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]페닐 아세틸]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L146); N-[3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L233); N-[6-[ [[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]나프토일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L234), 및 N-[4-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]메틸아미노]벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L235)의 합성 반응을 도시한다.

도 10A는 실시예 X에서 설명되는 바와 같은, 7-[[비스(1,1-디메틸에톡시)포스피닐]메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,10-트리아세트산 4,10-비스-(1,1-디메틸에틸)에스테르(H)의 합성 반응을 도시한다.

도 10B는 실시예 X에서 설명되는 바와 같은, N-[4-[[[[4,10-비스(카르복시메틸)-7-(디히드록시포스피닐)메틸-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L237)의 합성 반응을 도시한다.

도 11A는 실시예 XI에서 설명되는 바와 같은, N-디메틸글리실-L-세리닐-[S- [(아세틸아미노)메틸]]-L-시스테이닐-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L238)의 합성 반응을 도시한다.

도 11B는 실시예 XI에서 설명되는 바와 같은, N,N-디메틸글리실-L-세리닐-[S-[(아세틸아미노)메틸]]-L-시스테이닐-글리실-(3β,5β,7a,12a)-3-아미노-7,12-디히드록시-24-옥소콜란-24-일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L239)의 합성 반응을 도시한다.

도 12A는 실시예 XII에서 설명되는 바와 같은, 4-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]아세틸]아미노-3-메톡시벤조산 (A)의 합성 반응을 도시한다.

도 12B는 실시예 XII에서 설명되는 바와 같은, 4-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]아세틸]아미노-3-클로로벤조산 (D)의 합성 반응을 도시한다.

도 12C는 실시예 XII에서 설명되는 바와 같은, 4-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]아세틸]아미노-3-메틸벤조산 (D)의 합성 반응을 도시한다.

도 12D는 실시예 XII에서 설명되는 바와 같은, N-[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸)글리실]아미노]-3-메톡시벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L240)의 합성 반응을 도시한다.

도 12E는 실시예 XII에서 설명되는 바와 같은, 화합물 N-[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,1O-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]글리실]아미노]3-클로로벤조일]L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L241)의 합성 반응을 도시한다.

도 12F는 실시예 XII에서 설명되는 바와 같은, N-[4-[[[[4,7,10-트리스(카르 복시메틸)-1,4,7,1O-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]글리실]아미노]3-메틸벤조일]L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L242)의 합성 반응을 도시한다.

도 13A는 실시예 XIII에서 설명되는 바와 같은, 4-[N,N'-비스[2-[(9-H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노에틸]아미노]-4-옥소부탄산 (D)의 합성 반응을 도시한다.

도 13B는 실시예 XIII에서 설명되는 바와 같은, N-[4-[[4-[비스[2-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]에틸]아미노-1,4-디옥소부틸]아미노]벤조일]L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L244)의 합성 반응을 도시한다.

도 13C는 실시예 XIII에서 설명되는 바와 같은 화합물 L244의 화학 구조를 도시한다.

도 14A 및 도 14B는 실시예 XLIII에서 설명되는 바와 같은, 결합 및 경합 곡선을 도시한다.

도 15A는 실시예 LV에서 설명되는 방사성 치료 실험의 결과를 도시한다.

도 15B는 실시예 LV에서 설명되는 다른 방사성 치료 실험의 결과를 도시한다.

도 16은 N-[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]글리실]아미노]-L-라이시닐-(3,6,9)-트리옥사운데칸-1,11-디카 르복실산-3,7-디데옥시-3-아미노콜산)-L-아르기닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L65)의 화학 구조를 도시한다.

도 17은 N-[2-S-[[[[[12a-히드록시-17a-(1-메틸-3-카르복시프로필)에티콜란-3β-카바모일메톡시에톡시에톡시아세틸]-아미노-6-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1, 4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]헥사노일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L66)의 화학 구조를 도시한다.

도 18A는 N-[4-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L70)의 화학 구조를 도시한다.

도 18B는 N-[4-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]-3-카르복시프로피오닐]아미노]아세틸]아미노]벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L114)의 화학 구조를 도시한다.

도 18C는 N-[4-[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]-2-히드록시-3-프로폭시]벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L144)의 화학 구조를 도시한다.

도 18D는 N-[(3β,5β,7a,12a)-3-[[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1, 4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]에톡시에톡시]아세틸]아미노]-7,12-디히드록시콜란-24-일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L69)의 화학 구조를 도시한다.

도 18E는 N-[4-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]페닐아세틸]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L146)의 화학 구조를 도시한다.

도 19는 실시예 LVI에서 설명되는 바와 같은 화합물 L64 및 L70을 제조하기 위해 사용될 수 있는 중간체들의 화학 구조를 도시한다.

도 20은 실시예 LVI에서 설명되는 것과 같은 절편 결합을 사용하여 L64를 제조하는 것을 도시한다.

도 21은 (1R)-1-(비스{2-[비스(카르복시메틸)아미노]에틸}아미노)프로판-3-카르복실산-1-카르복실-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L201)의 제조를 도시한다.

도 22A는 L202를 제조하기 위해 사용된 화학 중간체의 화학 구조를 도시한다.

도 22B는 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-4-히드라지노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌 아미드(L202)의 제조를 도시한다.

도 23A는 L203을 제조하기 위해 사용된 화학 중간체의 화학 구조를 도시한다.

도 23B는 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L203)의 제조를 도시한다.

도 24는 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-4-아미노벤조일-글리실-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L204)의 제조를 도시한다.

도 25는 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-4-아미노벤조일-글리실-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L205)의 제조를 도시한다.

도 26A는 L206을 제조하기 위해 사용된 화학 중간체의 화학 구조를 도시한다.

도 26B는 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-[4'-아미노-2'-메틸 비페닐-4-카르복실]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜- L-로이실-L-메티오닌아미드(L206)의 제조를 도시한다.

도 27A는 L207을 제조하기 위해 사용된 화학 중간체의 화학 구조를 도시한다.

도 27B는 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-[3'-아미노-비페닐-3-카르복실]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L207)의 제조를 도시한다.

도 28은 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-[1,2-디아미노에틸-테레프탈릴]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L208)의 제조를 도시한다.

도 29A는 L209를 제조하기 위해 사용된 화학 중간체의 화학 구조를 도시한다.

도 29B는 L209의 제조를 도시한다.

도 30A는 L210을 제조하기 위해 사용된 화학 중간체의 화학 구조를 도시한다.

도 30B는 L210의 화학 구조를 도시한다.

도 31은 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L 211)의 화학 구조를 도시한다.

도 32는 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타밀-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L212)의 화학 구조를 도시한다.

도 33은 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L213)의 화학 구조를 도시한다.

도 34는 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-D-페닐알라닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L214)의 화학 구조를 도시한다.

도 35는 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-아르기닐-L-로이실-글리실-L-아스파르기닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L215)의 화학 구조를 도시한다.

도 36은 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-아르기닐-L-티로시닐-글리실-L-아스파르기닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발 릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L216)의 화학 구조를 도시한다.

도 37은 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-라이실-L-티로시닐-글리실-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L217)의 화학 구조를 도시한다.

도 38은 L218의 화학 구조를 도시한다.

도 39는 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-D-페닐알라닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-아미노펜틸(L219)의 화학 구조를 도시한다.

도 40은 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-세리닐-L-발릴-D-알라닐-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L220)의 화학 구조를 도시한다.

도 41은 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-D-페닐알라닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-로이신아미드(L221)의 화학 구조를 도시한다.

도 42는 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-D-티로시닐-L-글 루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-베타알라닐-L-히스티딜-L-페닐알라닐-L-노르로이신아미드(L222)의 화학 구조를 도시한다.

도 43은 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-페닐알라닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-베타알라닐-L-히스티딜-L-페닐알라닐-L-노르로이신아미드(L223)의 화학 구조를 도시한다.

도 44는 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-글리실-L-히스티딜-L-페닐알라닐-L-노르로이신아미드(L224)의 화학 구조를 도시한다.

도 45는 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-로이실-L-트립토필-L-알라닐-L-발리닐-글리실-L-세리닐-L-페닐알라닐-L-메티오닌아미드(L225)의 화학 구조를 도시한다.

도 46은 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-히스티딜-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L226)의 화학 구조를 도시한다.

도 47은 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-로이실-L-트립 토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-세리닐-L-페닐알라닐-L-메티오닌아미드(L227)의 화학 구조를 도시한다.

도 48은 N-[(3β,5β,12a)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스트딜-L-페닐알라닐-L-메티오닌아미드(L228)의 화학 구조를 도시한다.

도 49A는 실시예 LVII에서 설명되는 바와 같은 (3β,5β,7a,12a)-3-(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산 (B)의 합성 반응을 도시한다.

도 49B는 실시예 LVII에서 설명되는 바와 같은, N-[3β,5β,7a,12a)-3-[[[2-[2-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]에톡시]에톡시]이세틸]아미노]-7,12-디히드록시-24-옥소콜란-24-일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스트딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L69)의 합성 반응을 도시한다.

도 50은 실시예 LVII에서 설명되는 바와 같은, N-[4-[2-히드록시-3-[4,7,1 0-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]프로폭시]벤조일]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스트딜-L-로이실-L-메티오닌아미드(L144)의 합성 반응을 도시한다.

도 51은 L300의 화학 구조를 도시한다.

도 52는 25 ℃에서 DMSO-d₆중에서의 Lu-L70의 TOCSY 스펙트럼을 도시한다.

도 53은 25 ℃에서 DMSO-d₆중에서의 Lu-L70의 OCSY 스펙트럼을 도시한다.

도 54는 25 ℃에서 DMSO-d₆중에서의 Lu-L70의 NOESY 스펙트럼을 도시한다.

도 55는 25 ℃에서 DMSO-d₆중에서의 Lu-L70의 gHSQC 스펙트럼을 도시한다.

도 56은 25 ℃에서 DMSO-d₆중에서의 Lu-L70의 gHMBC 스펙트럼을 도시한다.

도 57은 25 ℃에서 DMSO-d₆중에서의 Lu-L70의 gHSQCTOCSY 스펙트럼을 도시한다.

도 58은 15 ℃에서 DMSO-d₆중에서의 Lu-L70의 3.5 ppm에서의 물 피크의 규칙적인 1H-NMR (바닥) 및 선택적인 단일-커플링 제거를 도시한다.

도 59는 25 ℃에서 DMSO-d₆중에서의 ¹⁷⁵Lu-DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂의 TOCSY 스펙트럼을 도시한다.

도 60은 L70의 화학 구조를 도시한다.

도 61은 ¹⁷⁵Lu-DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂의 화학 구조를 도시힌다.

도 62는 결합된 물 분자를 가지는 ¹⁷⁵Lu-L70의 화학 구조를 도시한다.

도 63은 L301의 화학 구조를 도시한다.

본 발명의 구체예에서 진단용 영상화 또는 방사성 치료에 사용하기 위한 새롭고 개선된 화합물이 제공된다. 그런 화합물은 GRP 수용체를 표적으로 하는 펩티드에 링커 또는 스페이서 기에 의해 부착된 의료적으로 유용한 금속 이온 또는 방사성 핵종 (금속 킬레이터)을 복합체로 형성할 수 있는 화학적 부분을 포함한다. 다른 구체예에서 이들 화합물은 GRP 수용체를 표적으로 하는 펩티드에 링커 또는 스페이서 기에 의해 부착된 광학적 표지 (예컨대 광 영상화, 광음향 영상화 또는 광루미네선스에 의해 검출될 수 있는 광표지 또는 다른 표지)를 포함한다.

일반적으로 본 발명의 화합물은 다음 식으로 표현될 수 있다:

M-N-O-P-G

상기 식에서, M은 금속 킬레이터 (금속 방사성 핵종과 복합체를 형성한 형태이거나 그렇지 않거나)이거나, 또는 광학 표지이고, N-O-P는 링커이며, G는 GRP 수용체 표적화 펩티드이다.

금속 킬레이터 M은 의료적으로 유용한 금속 이온 또는 방사성 핵종과 복합체를 형성하는 것으로 당해 기술분야에 공지되어 있는 금속 킬레이터중 어느 것이든지 될 수 있다. 바람직한 킬레이터로는 DTPA, DOTA, D03A, HP-D03A, EDTA, TETA, EHPG, HBED, NOTA, DOTMA, TETMA, PDTA, TTHA, LICAM, MECAM, 또는 펩티드 킬레이터, 예컨대 본원에서 논의되는 것들이 있다. 금속 킬레이터는 금속 방사성핵종과 복합체를 형성하거나 형성하지 않을 수 있으며, 단일 아미노산과 같은 임의의 스페이서를 포함할 수 있다. 신티그래피 또는 방사성 치료에 바람직한 금속 방사성 핵종으로는 ^{99 m}Tc, ^{5 l}Cr, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁴⁷Sc, ⁵¹Cr, ¹⁶⁷Tm, ¹⁴¹Ce, ¹¹¹In, ¹⁶⁸Yb, ¹⁷⁵Yb, ¹⁴⁰La, ⁹⁰Y, ⁸⁸Y, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁶⁵Dy, ¹⁶⁶Dy, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁹⁷Ru, ¹⁰³Ru, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²⁰³Pb, ²¹¹Bi, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹⁴Bi, ²²⁵Ac, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ¹¹⁷mSn, ¹⁴⁹Pm, ^l6lTb, ^l77Lu, ¹⁹⁸Au 및 ^l99Au가 있다. 금속의 선택은 원하는 치료 또는 진단 적용에 따라 결정될 것이다. 예를 들어 진단을 목적으로 한다면 바람직한 방사성 핵종은 ⁶⁴Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ^{99 m}Tc, 및 ¹¹¹In이며, ^{99 m}Tc 및 ¹¹¹In이 특히 바람직하다. 치료를 목적으로 하는 경우에 바람직한 방사성 핵종은 ⁶⁴Cu, ⁹⁰Y, ¹⁰⁵Rh, ¹¹¹In, ^117mSn, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵³Sm, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁶Ho, ¹⁷⁵Yb, ¹⁷⁷Lu, ^186/188Re, 및 ¹⁹⁹Au이며, ¹⁷⁷Lu 및 ⁹⁰Y가 특히 바람직하다. 본 발명의 화합물에 사용되는 가장 바람직한 킬레이터는 1-치환된 4,7,10-트리카르복시메틸 1,4,7,10 테트라아자시클로도데칸 트리아세트산 (DO3A)이다.

광학 표지 M은 당해 기술 분야에 공지되어 있는 다양한 광학 표지 중 하나일 수 있다. 바람직한 표지로는 제한 없이, 광학 염료, 이를테면 유기 크로모포어 또는 플루오로포어, 예컨대 시아닌 염료 광 흡수 화합물, 광 반사 및 산란 화합물, 및 생체발광 분자가 있다.

한 구체예에서 링커 N-O-P는 최소한 하나의 비-알파 아미노산을 함유한다.

다른 구체예에서 링커 N-O-P는 최소한 하나의 치환된 담즙산을 함유한다.

또 다른 구체예에서 링커 N-O-P는 고리 기를 포함하는 최소한 하나의 비-알파 아미노산을 함유한다.

GRP 수용체 표적화 펩티드는 GRP, 봄베신 또는 그것의 어떠한 유도체 또는 유사체일 수 있다. 바람직한 구체예에서 GRP 수용체 표적화 펩티드는 아고니스트로서 작용하는 GRP 또는 봄베신 유사체이다. 특히 바람직한 구체예에서 GRP 수용체 표적화 펩티드는 미국 특허 제 6,200,546호 및 US 2002/0054855에 개시된 봄베신 아고니스트 결합 부분이다.

또한 본 발명에서는 본 발명의 화합물을 사용하여 영상화하는 신규 방법이 제공된다.

본 발명의 진단 또는 치료제를 제조하기 위해 필요한 화합물의 전부를 함유하는 단일 또는 다중-바이알 키트가 본 발명의 예시적인 구체예에 제공된다.

또한 본 발명의 화합물을 함유하는 물질을 주사가능한 영상화 매질에 첨가하는 단계를 포함하는, 진단용 영상화제를 제조하기 위한 신규 방법이 제공된다.

본 발명의 화합물을 사용하는 새로운 방사성 치료 방법이 또한 본원에 제공되는데, 그것은 본 발명의 화합물을 포함하는 물질을 주사가능한 치료 매질에 첨가하는 단계를 포함하는, 방사성 치료제의 제조를 위한 신규 방법과 같다.

본 명세서에서 사용되는 약어

Aoc- : 8-아미노옥탄산

Apa3- : 3-아미노프로피온산

Abu4- : 4-아미노부탄산

Adca3- : (3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산 또는 3-아미노-3-데옥시콜산

Ah12ca- : (3β,5β,12α)-3-아미노-12-히드록시콜란-24-오산

Akca- : (3β,5β,7α,12α)-3-아미노-12-옥사콜란-24-오산

Cha- : L-시클로헥실알라닌

Nal1- : L-1-나프틸알라닌

Bip- : L-비페닐알라닌

Mo3abz4- : 3-메톡시-4-아미노벤조산 또는 4-아미노메틸-3-메톡시벤조산

Bpa4- : 4-벤조일페닐알라닌

Cl3abz4- : 3-클로로-4-아미노벤조산

M3abz4- : 3-메틸-4-아미노벤조산

Ho3abz4- : 3-히드록시-4-아미노벤조산

Hybz4- : 4-히드라지노벤조산

Nmabz4- : 4-메틸아미노벤조산

Mo3amb4- : 3-메톡시-4-아미노벤조산

Amb4- : 4-아미노메틸벤조산

Aeb4- : 4-(2-아미노에톡시)벤조산

Dae- : 1,2-디아미노에틸

Tpa- : 테레프탈산

A4m2biphc4- : 4'-아미노-2'-메틸 비페닐-4-카르복실산

A3biphc3- : 3-아미노-3'-비페닐카르복실산

Amc4- : 트란스-4-아미노메틸시클로헥산 카르복실산

Aepa4- : N-4-아미노에틸-N-1-피페라진-아세트산

Inp- : 이소니페코트산

Pial- : N-1-피페라진아세트산

Ckbp- : 4-(3-카르복시메틸-2-케토-1-벤즈아미다조일)-피페리딘

Abz3- : 3-아미노벤조산

Abz4- : 4-아미노벤조산

J : 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산

Ava5 : 5-아미노발레르산

f : (D)-Phe

y : (D)-Tyr

Ala2(또는 Bala) : 베타-알라닌

아래의 설명에서, 본 발명의 다양한 측면이 추가로 설명될 것이다. 설명을 목적으로 특정 형태와 상세한 설명이 본 발명을 총체적으로 이해할 수 있도록 제공된다. 그러나 또한 당업자는 본 발명이 구체적인 상세한 설명 없이도 실시될 수 있음을 인지하게 될 것이다. 나아가 잘 알려져 있는 특징은 본 발명을 명백히 하기 위하여 생략되거나 단순화될 수 있다.

본 발명의 한 구체예예에서는 진단용 영상화 또는 방사성 치료에 사용하기 위한 새롭고 개선된 화합물이 제공된다. 화합물은 GRP 수용체 표적화 펩티드에 링커 또는 스페이서 기에 의해 부착된 의료적으로 유용한 금속 이온 또는 방사성 핵종 (금속 킬레이터)와 복합체를 형성할 수 있는 광학 표지 또는 화학적 부분을 포함한다.

일반적으로 본 발명의 화합물은 다음의 일반식으로 표시된다:

M-N-O-P-G

상기 식에서 M은 금속 킬레이터 (금속 방사성 핵종과 복합체를 형성한 형태이거나 그렇지 않거나), 또는 광학 표지이며, N-O-P는 링커이고, G는 GRP 수용체 표적화 펩티드이다. 금속 킬레이터, 광학 표지, 링커, 및 GRP 수용체 표적화 펩티드의 각각은 아래에서 설명된다.

본 발명의 다른 구체예에서는 GRP 수용체 표적화 펩티드에 광학 표지 또는 금속 킬레이터를 연결시킬 수 있는 새롭고 개선된 링커 또는 스페이서 기가 제공된다. 일반적으로 본 발명의 링커는 다음 식으로 표시될 수 있다:

N-O-P

상기 식에서 N, O 및 P는 각각 명세서 전체를 통해서 규정되는 것과 같다.

본원에서 규정된 기준을 만족하는 화합물은 당해 기술 분야에 공지되어 있는 다른 GRP 수용체 표적화 펩티드 포합체와 비교하여 개선된 약물 동력학 특성을 가지는 것으로 발견되었다. 예를 들어 본 발명의 링커를 함유하는 화합물은 혈류에 더 오랫동안 보유되고, 그로써 공지의 선행 화합물보다 더 긴 반감기를 갖는다. 더 긴 반감기는 그것이 진단용 영상화에 유용하고, 특히 치료 용도로 유용한 더 좋은 종양 표적화를 가능하게 하기 때문에 의료적으로 유익하며, 그때 암세포 및 종양은 더 많은 양의 방사성 표지된 펩티드를 받게 된다. 또한 본 발명의 화합물은 선행 기술 화합물과 비교하여 개선된 조직 수용체 특이성을 갖는다.

1A. 금속 킬레이터

용어 "금속 킬레이터"는 금속 원자와 복합체를 형성하는 분자를 말하며, 그 복합체는 생리적 조건하에서 안정하다. 즉 금속은 생체내에서 킬레이터 골격에 대해 형성된 복합체를 유지할 것이다. 보다 구체적으로 금속 킬레이터는 생리적 조건하에서 안정하고 또한 링커 N-O-P와의 포합을 위해 최소한 하나의 반응성 기능기를 가지는 금속 복합체를 형성하기 위하여 방사성 핵종 금속에 대해 복합체를 형성하는 분자이다. 금속 킬레이터 M은 의료적으로 유용한 금속 이온 또는 방사성 핵종을 복합체화하는 것으로 당해 기술분야에 공지되어 있는 금속 킬레이터 중 어느 하나일 수 있다. 금속 킬레이터는 금속 방사성 핵종과 복합체를 형성하거나 그렇지 않을 수 있다. 나아가 금속 킬레이터는 금속과는 복합체를 형성하지 않지만 금속 킬레이터와 링커 사이에서 물리적 분리를 야기하는 임의의 스페이서, 예컨대 단일 아미노산 (예컨대 Gly)을 포함할 수 있다.

본 발명의 금속 킬레이터는 예를 들면 선형의, 거대고리형, 테르피리딘, 및 N₃S, N₂S₂, 또는 N₄ 킬레이터 (미국 특허 제 5,367,080호, 5,364,613호, 5,021,556호, 5,075,099호, 5,886,142호 참조)를 포함하고, 당해 기술 분야에 공지되어 있는 다른 킬레이터, 예를 들면 그것들에 한정되지는 않지만 HYNIC, DTPA, EDTA, TETA, 및 비스아미노 비스티올 (BAT) 킬레이터 (미국 특허 제 5,720,934호)를 포함한다. 예를 들어 N₄ 킬레이터는 미국 특허 제 6,143,274호; 6,093,382호; 5,608,110호; 5,665,329호; 5,656,254호; 및 5,688,487호에 기재되어 있다. 어떤 N₃S 킬레이터는 PCT/CA94/00395, PCT/CA94/00479, PCT/CA95/00249 및 미국 특허 제 5,662,885호; 5,976,495호; 및 5,780,006호에 기재되어 있다. 킬레이터는 또한 킬레이트화 리간드 메르캅토아세틸-글리실-글리실-글리신 (MAG3)의 유도체를 포함하는데, 그것은 N₃S, 및 N₂S₂ 시스템, 예컨대 MAMA (모노아미드모노아민디티올), DADS (N₂S 디아민디티올), CODADS 등을 함유한다. 이들 리간드 시스템 및 다양한 다른 것은 문헌에 기재되어 있다 (Liu and Edwards, Chem Rev. 1999, 99, 2235-2268).

금속 킬레이터는 또한 테트라덴테이트 배열의 금속에 기증되지 않은 리간드 원자들을 함유하는 복합체를 포함할 것이다. 그러한 것으로는 테크네튬 및 레늄 디옥심의 보론산 부가물, 예를 들면 미국 특허 제 5,183,653호; 5,387,409호; 및 5,118797호에 기재되어 있는 것들이 있다.

바람직한 킬레이터의 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (DTPA), 1,4,7,10-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA), 1-치환된 1,4,7-트리카르복시메틸 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 트리아세트산 (DO3A), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 4-카르보닐메틸-10-포스포노메틸-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,7-디아세트산(Cm4pm10d2a); 및 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산 (TETA)가 있다. 추가의 킬레이트화 리간드는 에틸렌비스-(2-히드록시-페닐글리신)(EHPG), 및 그것의 유도체, 이를테면 5-Cl-EHPG, 5-Br-EHPG, 5-Me-EHPG, 5-t-Bu-EHPG, 및 5-sec-Bu-EHPG; 벤조디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (벤조-DTPA) 및 그것의 유도체, 이를테면 디벤조-DTPA, 페닐-DTPA, 디페닐-DTPA, 벤질-DTPA, 및 디벤질-DTPA; 비스-2-(히드록시벤질)-에틸렌-디아민디아세트산 (HBED) 및 그것의 유도체; 최소한 3개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 최소한 6개의 탄소 원자, 및 최소한 2개의 헤테로원자 (O 및/또는 N)를 함유하는 거대고리형 화합물 부류, 이 거대고리 화합물은 하나의 고리, 또는 헤테로 고리 엘레먼트에서 함께 결합되는 둘 또는 세 개의 고리, 예컨대 벤조-DOTA, 디벤조-DOTA, 및 벤조-NOTA (NOTA는 1,4,7-트리아자시클로노난 N,N',N''-트리아세트산이다), 벤조-TETA, 벤조-DOTMA (DOTMA는 1,4,7,10-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,7,10-테트라(메틸시클로테트라아세트산이다), 및 벤조-TETMA (TETMA는 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-(메틸테트라아세트산이다); 1,5,10-N,N',N''-트리스(2,3-디히드록시벤조일)-트리카테콜레이트 (LICAM) 및 1,3,5-N,N',N''-트리스(2,3-디히드록시벤조일) 아미노메틸벤젠 (MECAM)이다. 본 발명에 포함되는 대표적인 킬레이터와 킬레이트화 기의 실례는 WO 98/18496, WO 86/06605, WO 91/03200, WO 95/28179, WO 96/23526, WO 97/36619, PCT/US98/01473, PCT/US98/20182, 및 미국 특허 제 4,899,755호, 5,474,756호, 5,846,519호 및 6,143,274호에 기재되어 있다.

특히 바람직한 금속 킬레이터로는 하기 식 1, 2 및 3의 킬레이터 (¹¹¹In 및 방사성 란탄계 원소들, 예컨대 ¹⁷⁷Lu, ⁹⁰Y, ¹⁵³Sm, 및 ¹⁶⁶Ho의 경우) 및 식 4, 5, 및 6의 킬레이터 (방사성 ^{99 m}Tc, ¹⁸⁶Re, 및 ¹⁸⁸Re의 경우)가 있다. 이들 및 다른 금속 킬레이트화 기는 미국 특허 제 6,093,382호 및 5,608,110호에 기재되어 있다. 또한 식 3의 킬레이트화 기는 예를 들면 미국 특허 제 6,143,274호에; 식 5의 킬레이트화기는 예컨대 미국 특허 제 5,627,286로 및 6,093,382호에, 식 6의 킬레이트화기는 예를 들면 미국 특허 제 5,662,885호, 5,780,006호 및 5,976,495호에 기재되어 있다. 식 6의 구체적인 금속 킬레이터로는 N,N-디메틸Gly-Ser-Cys; N,N-디메틸Gly-Thr-Cys; N,N-디에틸Gly-Ser-Cys; N,N-디벤질Gly-Ser-Cys; 및 그것들의 다른 변이체가 있다. 예를 들어 실제로 금속 방사성 핵종과는 복합체를 형성하지 않는 스페이서, 예컨대 엑스트라 단일 아미노산인 Gly는 이들 금속 킬레이터에 부착된 수 있다 (예컨대 N,N-디메틸Gly-Ser-Cys-Gly; N,N-디메틸Gly-Thr-Cys-Gly; N,N-디에틸Gly-Ser-Cys-Gly; N,N-디벤질Gl-Ser-Cys-Gly). 미국 특허 제 6,334,996호에 개시되어 있는 것들과 같은 다른 유용한 금속 킬레이터들도 포함된다 (예컨대 디메틸gly-L-t-부틸gly-L-Cys-Gly; 디메틸gly-D-t-부틸gly-L-Cys-Gly; 디메틸gly-L-t-부틸gly-L-Cys, 등).

나아가 황 보호기, 예컨대 Acm (아세트아미도메틸), 트리틸 또는 다른 공지된 알킬, 아릴, 아실, 알카노일, 아릴로일, 메르캅토아실 및 유기티올기가 이들 금속 킬레이터의 시스테인 아미노산에 부착될 수 있다.

추가로 다른 유용한 금속 킬레이터로는 다음과 같은 것들이 있다:

상기 식 1과 2에서 R은 알킬, 바람직하게는 메틸이다. 상기 식 5a와 5b에서 X는 CH₂ 또는 O이고, Y는 C₁-C₁₀ 분지된 또는 분지되지 않은 알킬; 아릴, 아릴옥시, 아릴아미노, 아릴아미노아실; 아릴알킬이며, 이때 알킬 기 또는 아릴기에 부착된 기들은 C₁-C₁₀ 분지된 또는 분지되지 않은 알킬 기, C₁-C₁₀ 분지된 또는 분지되지 않은 히드록시 또는 폴리히드록시알킬기 또는 폴리알콕시알킬 또는 폴리히드록시-폴리알콕시알킬기이고; J는 임의의, 그러나 존재하는 경우 C(=O)-, OC(=O)-, SO₂-, NC(=O)-, NC(=S)-, N(Y), NC(=NCH₃)-, NC(=NH)-, N=N-, 합성 또는 천연 발생 아미노산으로부터 유도된 호모폴리아미드 또는 헤테로폴리아민이고, n은 1 내지 100이다. 이들 치환기의 다른 변이체도 예를 들면 미국 특허 제 6,093,382호에 기재되어 있다. 식 6에서 기 S-NHCOCH₃은 SH 또는 S-Z로 대체될 수 있으며, Z는 상기에서 열거된 것과 같은 공지된 황 보호기 중 하나이다. 식 7은 금속 킬레이터로서 유용한 t-부칠 화합물의 한 구체예를 설명한다.

바람직한 구체예에서 금속 킬레이터는 고리형 또는 비고리형 폴리아미노카르복실산, 예컨대 DOTA (1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DTPA (디에틸렌트리아민펜타아세트산), DTPA-비스메틸아미드, DTPA-비스모르폴린아미드, Cm4pm10d2a (1,4-카르보닐메틸-10-포스포노메틸-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,7-디아세트산), DO3A N-[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸, HP-DO3A, DO3A-모노아미드 및 그것들의 유도체를 포함한다.

신티그래피 또는 방사성 치료에 바람직한 금속 방사성 핵종으로는 ^{99 m}Tc, ⁵¹Cr, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁴⁷Sc, ¹⁶⁷Tm, ¹⁴¹Ce, ¹¹¹In, ¹⁶⁸Yb, ¹⁷⁵Yb, ¹⁴⁰La, ⁹⁰Y, ⁸⁸Y, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁶⁵Dy, ¹⁶⁶Dy, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁹⁷Ru, ¹⁰³Ru, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²⁰³Pb, ²¹¹Bi, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹⁴Bi, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ^117mSn, ¹⁴⁹Pm, ¹⁶¹Tb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁹⁸Au 및 ¹⁹⁹Au 및 그것들의 산화물 또는 질화물이 있다. 금속의 선택은 원하는 치료 또는 진단 적용에 따라 결정될 것이다. 예를 들어 진단이 목적이라면 (예컨대 일차 종양 및 전이의 치료적 진전을 진단하고 모니터하기 위해) 바람직한 방사성 핵종은 ⁶⁴Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ^{99 m}Tc, 및 ¹¹¹In이고, ^99mTc 및 ¹¹¹In이 특히 바람직하다. 치료가 목적인 경우 (예컨대 전립선, 유방, 폐 등의 암에 관련된 일차 종양 및 전이에 대한 방사성 치료를 제공하기 위해) 바람직한 방사성 핵종으로는 ⁶⁴Cu, ⁹⁰Y, ¹⁰⁵Rh, ¹¹¹In, ^117mSn, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵³Sm, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁶Ho, ¹⁷⁵Yb, ¹⁷⁷Lu, ^186/188Re, 및 ¹⁹⁹Au가 있으며, ¹⁷⁷Lu와 ⁹⁰Y가 특히 바람직하다. ^{99 m}Tc가 특히 유용하며 진단용 방사성 핵종에 대해 바람직한데, 왜냐하면 그것의 저렴한 가격, 활용성, 영상화 특성, 및 고도의 특이한 활성 때문이다. ^{99 m}Tc의 핵 및 방사성 특성이 이 방사성 동위원소가 이상적인 신티그래피 영상화제가 되는 것을 가능하게 한다. 이 방사성 동위원소는 140 keV의 단일 광양자 에너지와 약 6 시간의 방사능 반감기를 가지며, ⁹⁹Mo-^{99 m}Tc 발생기로부터 쉽게 활용할 수 있다. 예를 들어 ^{99 m}Tc 표지된 펩티드는 일차 종양 및 전이에서 치료적 진행을 진단하고 모니터하기 위해 사용될 수 있다. ¹⁷⁷Lu, ⁹⁰Y 또는 다른 치료용 방사성 핵종으로 표지된 펩티드는 전립선, 유방, 폐 등의 암과 관련된 일차 종양 및 전이에 대한 방사성 치료법을 제공하는 데 사용될 수 있다.

1B. 광학 표지

실험적 구체예에서 본 발명의 화합물은 광표지, 예컨대 광범위한 탈위치 고리 시스템을 가지고 400 내지 1500 nm의 범위에서 흡수 또는 방출이 최대인 광학 염료, 이를테면 유기 크로모포어 또는 플루오로포어와 포합될 수 있다. 또는 달리 본 발명의 화합물은 생체 발광 분자로 유도될 수 있다. 광표지에 대한 최대 흡수의 바람직한 범위는 헤모글로빈으로부터의 신호와의 간섭을 최소화하기 위해 600 내지 1000 nm 사이이다. 바람직하게도, 광흡수 표지는 예컨대 10⁵ cm^-1M^-1보다 큰 몰 흡수성을 가지는 한편, 형광 광학 염료는 높은 양자 수율을 가질 것이다. 광학 염료의 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 WO 98/18497, WO 98/18496, WO 98/18495, WO 98/18498, WO 98/53857, WO 96/17628, WO 97/18841, WO 96/23524, WO 98/47538, 및 이들 공보에 참고로 인용된 문헌들에 기재된 것들을 들 수 있다. 예를 들어 광표지는 본 발명의 화합물, 예를 들면 GRP 수용체 표적화 펩티드와 본 발명의 링커로 구성된 화합물에 직접 공유 결합될 수 있다. 전자기 스펙트럼의 가시 및 적외선에 가까운 영역에서 빛을 흡수하고 방출하는 여러 염료는 현재 생체적합성, 높은 몰 흡수성, 및/또는 높은 형광 양자 수율로 인해 다양한 생체 의료 응용분야에 사용되고 있다. 대조 제제로서 염료와의 포합시에 광학 양상의 높은 민감성은 핵의학의 그것과 평행을 이루며, 기관이나 조직이 바람직하지 못한 이온화 방사선의 영향을 받지 않으면서 가시화되는 것을 가능하게 한다. 적외선에 가까운 영역 (NIR)에서 흡수 및 방출이 집중적인 시아닌 염료가 특히 유용한데, 왜냐하면 생물학적 조직이 이 영역에서 광학적으로 투명하기 때문이다. 예를 들어 NIR 영역에서 흡수하고 방출하는 인도시아닌 그린은 심장 출력, 간 기능, 및 간 혈류를 모니터하는 데 사용되었고, 그것의 기능화된 유도체는 진단 목적으로 생체분자를 포합하기 위해 사용되었다 (R. B. Mujumdar, L. A. Ernst, S. R. Mujumdar, et al., Cyanine dye labeling reagents: Sulfoindocyaninesuccinimidyl esters. Bioconjugate Chemistry, 1993, 4(2), 105-111; Linda G. Lee and Sam L. Woo. "N- Heteroaromatic ion and iminium ion substituted cyanine dyes for use as fluorescent labels", 미국 특허 제 5,453,505호; EricHohenschuh, et al. "Light imaging contrast agents", WO98/48846; Jonathan Turner, et al. "Optical diagnostic agents for the diagnosis of neurodegenerative diseases by means of near infra-red radiation", WO 98/22146; Kai Licha, et al. "In-vivo diagnostic process by near infrared radiation", WO 96/17628; Robert A. Snow, et al., Compounds, WO 98/48838). 다양한 영상화 기법 및 시약이 문헌들에 기재되어 있다 (미국 특허 제 6,663,847호, 6,656,451호, 6,641,798호, 6,485,704호, 6,423,547호, 6,395,257호, 6,280,703호, 6,277,841호, 6,264,920호, 6,264,919호, 6,228,344호, 6,217,848호, 6,190,641호, 6,183,726호, 6,180,087호, 6,180,086호, 6,180,085호, 6,013,243호, 및 공개된 미국 특허 출원 2003185756호, 20031656432호, 2003158127호, 2003152577호, 2003143159호, 2003105300호, 2003105299호, 2003072763호, 2003036538호, 2003031627호, 2003017164호, 2002169107호, 2002164287호, 및 2002156117호).

2A. 최소한 하나의 비-알파 아미노산을 함유하는 링커

본 발명의 한 구체예에서 링커 N-O-P는 최소한 하나의 비-알파 아미노산을 함유한다. 그러므로 이 링커 N-O-P의 구체예에서

N은 0 (0은 없다는 것을 의미한다), 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이고;

O는 알파 또는 비-알파 아미노산이며,

P는 0, 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이고,

이때 N, O 또는 P 중 최소한 하나는 비-알파 아미노산이다.

그러므로 한 실례에서 N은 Gly이고, O는 비-알파 아미노산이며, P는 0이다.

알파 아미노산은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 자연 발생 및 합성 아미노산을 포함한다.

비-알파 아미노산도 또한 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 자연 발생적인 것 또는 합성된 것을 포함한다. 바람직한 비-알파 아미노산으로는 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산; N-4-아미노에틸-N-1-아세트산; 및 식 NH₂-(CH₂CH₂O)n-CH₂CO₂H 또는 NH₂-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂CO₂H (n은 2 내지 100이다)의 폴리에틸렌 글리콜 유도체가 있다.

최소한 하나의 비-알파 아미노산을 가지는 링커를 함유하는 식 M-N-O-P의 화합물의 실례는 하기 표 1에 열거한다. 이들 화합물은 본원, 특히 실시예에 개시된 방법, 뿐만 아니라 당업자에게 공지되어 있는 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다.

2B. 최소한 하나의 치환된 담즙산을 함유하는 링커

본 발명의 다른 구체예에서 링커 N-O-P는 최소한 하나의 치환된 담즙산을 함유한다. 그러므로 링커 N-O-P의 이 구체예에서

N은 0 (0은 없다는 것을 의미한다), 알파 아미노산, 치환된 담즙산 또는 다른 연결기이고;

O는 알파 아미노산 또는 치환된 담즙산이며,

P는 0, 알파 아미노산, 치환된 담즙산 또는 다른 연결기이고,

이때 N, O 또는 P 중 최소한 하나는 치환된 산이다.

담즙산은 담즙 (간의 분비물)에서 발견되는, 히드록실기와 카르복실기에서 끝나는 5개의 탄소 원자 측쇄를 가지는 스테로이드이다. 치환된 담즙산에서 담즙산의 수소 원자와 같은 최소한 하나의 원자는 다른 원자, 분자 또는 화학기로 치환된다. 예를 들어 치환된 담즙산은 위치 7 및 12에서 수소, 히드록실 또는 케토 기능기로 임의로 치환된 3-아미노,24-카르복실 기능을 가지는 것들을 포함한다.

본 발명에서 다른 유용한 치환된 담즙산은 치환된 콜산 및 그것의 유도체를 포함한다. 특정한 치환된 콜산 유도체로는 (3β,5β)-3-아미노콜란-24-오산; (3β,5β,12a)-3-아미노-12-히드록시콜란-24-오산; (3β,5β,7a,12a)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산; Lys-(3,6,9)-트리옥사운데칸-1,11-디카르보닐-3,7-디데옥시-3-아미노콜산; (3β,5β,7a)-3-아미노-7-히드록시-12-옥소콜란-24-오산; 및 (3β,5β,7a)-3-아미노-7-히드록시콜란-24-오산이 있다.

최소한 하나의 치환된 담즙산을 가지는 링커를 함유하는 식 M-N-O-P를 가지는 화합물의 실례는 하기 표 2에 열거한다. 이들 화합물은 본원, 특히 실시예에 개시된 방법뿐만 아니라 당업자에게 공지되어 있는 유사한 방법들에 의해 제조될 수 있다.

2C. 고리형 기를 가지는 최소한 하나의 비-알파 아미노산을 함유하는 링커

본 발명의 또 다른 구체예에서 링커 N-O-P는 고리형 기를 가지는 최소한 하나의 비-알파 아미노산을 함유한다. 그러므로 링커 N-O-P의 구체예에서

N은 0 (0은 없음을 의미한다), 알파 아미노산, 고리형 기를 가지는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이고;

O는 알파 아미노산 또는 고리형 기를 가지는 비-알파 아미노산이며;

P는 0, 알파 아미노산, 고리형 기를 가지는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이며, 이때 N, O 또는 P 중 최소한 하나는 고리형 기를 가지는 비-알파 아미노산이다.

고리형 기를 가지는 비-알파 아미노산은 치환된 페닐, 비페닐, 시클로헥실 또는 다른 아민과 카르복실 함유 고리형 지방족 또는 헤테로고리형 부분을 포함한다. 그러한 실례로는 다음과 같다: 4-아미노벤조산 (이하 "Abz4"로 언급함), 3-아미노벤조산, 4-아미노메틸 벤조산, 8-아미노옥탄산, 트란스-4-아미노메틸시클로헥산 카르복실산, 4-(2-아미노에톡시)벤조산, 이소니페코트산, 2-아미노메틸벤조산, 4-아미노-3-니트로벤조산, 4-(3-카르복시메틸-2-케토-1-벤즈이미다졸릴-피페리딘, 6-(피페라진-1-일)-4-(3H)-퀴나졸리논-3-아세트산, (2S,5S)-5-아미노-1,2,4,5,6,7-헥사히드로-아제피노[3,21-hi]인돌-4-온-2-카르복실산, (4S,7R)-4-아미노-6-아자-5-옥소-9-티아비시클로[4.3.0]노난-7-카르복실산, 3-카르복시메틸-1-페닐-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데칸-4-온, N1-피페라진아세트산, N-4-아미노에틸-N-1-피페라진아세트산, (3S)-3-아미노-1-카르보시메틸카프로락탐, (2S,6S,9)-6-아미노-2-카르복시메틸-3,8-디아자비시클로-[4,3,0]-노난-1,4-디온, 3-아미노-3-데옥시콜산, 4-히드록시벤조산, 4-아미노페닐아세트산, 3-히드록시-4-아미노벤조산, 3-메틸-4-아미노벤조산, 3-클로로-4-아미노벤조산, 3-메톡시-4-아미노벤조산, 6-아미노나프토산, N,N'-비스(2-아미노에틸)-숙신암산.

고리형 기를 가지는 최소한 하나의 알파 아미노산을 포함하는 링커를 함유하는 식 M-N-O-P의 화합물의 실례는 하기 표 3에 열거한다. 이들 화합물은 본원, 특히 실시예에 개시된 방법뿐만 아니라 당업자에게 공지되어 있는 유사한 방법들에 의해 제조될 수 있다.

바람직한 링커 및 다양한 GRP 수용체 표적화 펩티드를 함유하는 화합물의 하위세트를 하기 표 4에 열거한다. 이들 화합물은 본원, 특히 실시예에 개시된 방법뿐만 아니라 당업자에게 공지되어 있는 유사한 방법들에 의해 제조될 수 있다.

2D. 다른 연결기

링커 N-O-P 내에 사용될 수 있는 다른 연결기는 금속 킬레이터 또는 광학 표지에 대해 GRP 수용체 표적화 펩티드를 결합시키기 위해 작용하는 한편 GRP 수용체 표적화 펩티드의 표적화 기능이나 금속 킬레이터의 금속 복합체 형성 기능 또는 광학 표지의 검출가능성에 불리한 영향을 미치지 않는 화학적 기를 포함한다. 적당한 다른 연결기로는 펩티드 (즉 함께 연결된 아미노산) 단독, 비-펩티드 기 (예컨대 탄화수소 사슬) 또는 아미노산 서열과 비-펩티드 스페이서의 조합이 있다.

한 구체예에서 링커 N-O-P 내에 사용하기 위한 다른 연결기로는 L-글루타민 및 탄화수소 사슬, 또는 그것들의 조합이 있다.

다른 구체예에서 링커 N-O-P에 사용하기 위한 다른 연결기로는 일련의 아미노산으로 이루어진 순수한 펩티드 연결기 (예컨대 디글리신, 트리글리신, gly-gly-glu, gly-ser-gly 등)가 있는데, 이때 GRP 수용체 표적화 펩티드의 N-말단 잔기와 중합체 사슬의 금속 킬레이터 또는 광학 표지 사이의 원자의 총 수는 12개 이하이다.

또 다른 구체예에서 링커 N-O-P에 사용하기 위한 다른 연결기로는 또한 탄화수소 사슬, 즉 R₁-(CH₂)n-R₂가 있는데, 이때 n은 0 내지 10, 바람직하게는 3 내지 9이고, R₁은 리간드 골격 또는 실행된 금속 킬레이터 또는 금속 복합체화 골격 또는 광학 표지에 공유 결합하기 위한 부위로서 사용될 수 있는 기 (예컨대 H₂N-, HS-, -COOH)이며, R₂는 GRP 수용체 표적화 펩티드의 N-말단 NH₂-기에 공유 커플링하기 위해 사용되는 기 (예컨대 R₂는 활성화된 COOH 기이다)이다. 리간드 (즉 킬레이터) 또는 바람직한 금속 킬레이트를 생체 분자에 포합시키기 위한 여러 가지 화학적 방법은 문헌에 잘 설명되어 있다 (Wilbur, 1992; Parker, 1990; Hermanson, 1996; Frizberg et al., 1995). 이들 방법 중 하나 또는 그 이상은 복합체를 형성하지 않은 리간드 (킬레이터) 또는 방사성 금속 킬레이트 또는 광학 표지를 링커에 연결하기 위해, 또는 GRP 수용체 표적화 펩티드에 링커를 연결하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 방법으로는 산 무수물, 알데하이드, 아릴이소티오시아네이트, 활성화된 에스테르, 또는 N-히드록시숙신이미드의 형성이 포함된다 (Wilbur, 1992; Parker, 1990; Hermanson, 1996; Frizberg et al., 1995).

바람직한 구체예에서 링커 N-O-P에 사용되는 다른 연결기는 하기에 설명되는 바와 같은 일렉트로필(electrophile) 또는 뉴클레오필(nucleophile)을 가지는 링커 전구체로부터 형성될 수 있다:

LP1: 링커의 최소한 두 위치에 동일한 일렉트로필 E1 또는 동일한 뉴클레오필 Nu1을 가지는 링커 전구체;

LP2: 일렉트로필 E1과 링커의 다른 위치상에 상이한 일렉트로필 E2를 가지는 링커 전구체;

LP3: 뉴클레오필 Nu1과 링커의 다른 위치상에 상이한 뉴클레오필 Nu2를 가지는 링커 전구체;

LP4: 일렉트로필 E1으로 기능화된 한 단부와 뉴클레오필 Nu1으로 기능화된 다른 단부를 가지는 링커 전구체.

바람직한 뉴클레오필 Nu1/Nu2로는 -OH, -NH, -NR, -SH, -HN-NH₂, -RN-NH₂, 및 -RN-NHR'이 있으며, 이때 R'과 R은 상기에서 주어진 R에 대한 정의로부터 독립적으로 선택되지만, R'은 H가 아니다.

바람직한 일렉트로필 E1/E2로는 -COOH, -CH=O(알데하이드), -CR=OR'(케톤), -RN-C=S, -RN-C=O, -S-S-2-피리딜, -SO₂-Y, -CH₂C(=O)Y 및

가 있으며, 이때 Y는 다음의 기들로부터 선택될 수 있다:

3. GRP 수용체 표적화 펩티드

GRP 수용체 표적화 펩티드 (즉 식 M-N-O-P-G에서 G)는 GRP 수용체 패밀리에 대한 결합 친화력을 가지는 어떠한 펩티드, 그것의 동등물, 유도체 또는 유사체이다.

GRP 수용체 표적화 펩티드는 아고니스트 또는 길항체 형태를 취할 수 있다. GRP 수용체 표적화 펩티드 아고니스트는 높은 친화력으로 결합한 후에 세포를 "활성화"시키는 것으로 알려져 있으며, 세포에 의해 내부화될 수 있다. 역으로 GRP 수용체 표적화 펩티드 길항체는 세포에 의해 내부화되는 일 없이, 그리고 세포를 "활성화시키지" 않으면서 세포 상의 GRP 수용체에만 결합하는 것으로 알려져 있다. 바람직한 구체예에서 GRP 수용체 표적화 펩티드는 아고니스트이다.

본 발명의 보다 바람직한 구체예에서, GRP 아고니스트는 봄베신(BBN) 유사체 및/또는 그것의 유도체이다. BBN 유도체 또는 그것의 유사체는 바람직하게는 BBN 결합 영역 (즉 BBN(7-14)[SEQ ID NO:1])의 동일한 일차 구조 또는 유사한 일차 구조를 함유하는데, 그것은 BBN 단독으로서 더 좋거나 유사한 결합 친화력 (즉 Kd<25 nM)을 가지는 GRP 수용체에 특이적으로 결합할 특이한 아미노산 치환을 갖는다. 적당한 화합물로는 펩티드, 펩티드 모방물 및 그것의 유사체 및 유도체가 있다. 위치 BBN-14에서의 L-메티오닌(Met)의 존재는 일반적으로 아고니스트 특성을 부여하는 한편, BBN-14에서의 이 잔기의 부재는 일반적으로 길항체 특성을 부여한다 (Hoffken, 1994). 일부 유용한 봄베신 유사체는 미국 특허 공보 2003/0224998에 개시된다.

당해 기술분야에서는 결합 친화력이 감소되는 일 없이 BBN(8-14) 결합 영역에 약간의 선택적인 수의 특이한 아미노산 치환 (예컨대 L-Gly¹¹에 대해 D-Ala¹¹ 또는 L-Trp⁸에 대해 D-Trp⁸)이 이루어질 수 있다는 것이 증명되어 있다 (Leban et al., 1994; Qin et al., 1994; Jensen et al., 1993). 또한 위치 BBN-8 (즉 Trp⁸ 잔기)에서 일부 아미노산 사슬 또는 다른 기의 N-말단 아민기에의 부착은 GRP 수용체에 대한 BBN 유사체의 결합 친화력을 극적으로 감소시킬 수 있다 (Davis et al., 1992; Hoffken, 1994; Moody et al., 1996; Coy, et al., 1988; Cai et al., 1994). 몇몇 경우에 추가의 아미노산 또는 화학적 부분을 결합 친화력을 감소시키는 일 없이 첨부하는 것이 가능하다.

BBN 수용체 표적화 펩티드의 유사체는 BBN보다 크거나 동등한 아비디티(avidity)로 GRP 수용체를 표적화하는 분자와, 그 외에 뮤테인 (mutein), 레트로펩티드 및 GRP 또는 BBN의 레트로-인버소-펩티드를 포함한다. 당업자는 이들 유사체가 또한 하나 또는 여러 아미노산의 치환, 및/또는 결실 및/또는 첨가를 포함하는 변형을, 그러한 변형이 본원에 개시된 펩티드의 생물학적 활성을 불리하게 바꾸지 않는 한 함유할 수 있음을 인지할 것이다. 이들 치환은 하나 또는 둘 이상의 아미노산을 그것들의 유사 아미노산으로 대체함으로써 수행될 수 있다. 한 그룹 내의 유사 아미노산은 분자의 생물학적 기능을 보존하기 위하여 그룹 내의 구성원들 사이의 치환을 가능하게 하기에 충분한 물리화학적 특성을 가지는 아미노산으로서 규정된다.

아미노산의 결실 또는 삽입 또한 그것들이 상기 서열의 생물학적 기능을 변경시키지 않는다면 규정된 서열안에 도입될 수 있다. 바람직하게도 그런 삽입 또는 결실은 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산으로 제한되어야 하며, 기능적 형태에 결정적인 아미노산을 제거하거나 물리적으로 방해 또는 대체해서는 안된다. 본원에 설명된 GRP 수용체 표적화 펩티드의 뮤테인은 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입이 하나 또는 둘 이상의 아미노산 위치에 존재하는 본 명세서에 개시된 서열에 상동하는 서열을 가질 수 있다. 뮤테인은 본원에서 설명되는 펩티드의 최소한 40 %, 바람직하게는 최소한 50 %, 보다 바람직하게는 60 내지 70 %, 가장 바람직하게는 80 내지 90 %의 생물학적 활성을 가질 것이다. 그러나 그것들은 또한 구체적으로 예시된 펩티드보다 더 큰 생물학적 활성을 가질 수 있고, 그러므로 례시된 펩티드의 생물학적 기능과 반드시 동일할 필요는 없다. GRP 수용체 표적화 펩티드의 유사체는 또한 펩티드 골격의 아미드 결합에 변화를 가져온 펩티드 모방물 또는 위펩티드, 이를테면, 티오아미드, 메틸렌 아민, 및 E-올레핀을 포함한다. 또한 GRP, BBN 또는 N-치환된 히드라진 카르보닐 화합물 (또는 아자 아미노산)에 의해 대체된 아미노산을 가지고 있는 그것들의 펩티드 유사체 구조를 토대로 한 펩티드도 본원에서 사용되는 의미의 유사체에 포함된다.

GRP 수용체 표적화 펩티드는 선택된 킬레이터에 따라 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 펩티드는 일반적으로 수립되어 있고 펩티드 합성 분야에 공지되어 있는 기법, 예컨대 고체-상 합성 (SPPS) 접근법에 의해 가장 편리하게 제조될 수 있다. 고체-상 펩티드 합성법 (SPPS)은 아미노산이 폴리스티렌과 같은 불용성 지지체 또는 매트릭스에 연결된 성장하는 펩티드 사슬에 단계식으로 첨가되는 것을 포함한다. 펩티드의 C-말단 잔기가 먼저 아미노시가 N-보호제, 예컨대 t-부틸옥시카르보닐기 (Boc) 또는 플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc)기로 보호되어 있는 시판중인 지지체에 고착된다. 아미노 보호기는 적당한 탈보호제, 예를 들면 Boc의 경우에는 TFA, Fmoc의 경우에는 피페리딘으로 제거되고, 다음 아미노산 잔기 (N-보호된 형태)가 커플링제, 예를 들면 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 또는 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 또는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU)를 사용하여 첨가된다. 펩티드 결합이 형성될 때 시약은 지지체로부터 세척된다. 최종 잔기가 첨가된 후 펩티드는 적당한 시약, 예를 들면 트리플루오로아세트산 (TFA) 또는 플루오르화 수소 (HF)를 사용하여 지지체로부터 제거된다.

그런 다음 링커는 링커의 적절한 기능기와 GRP 수용체 표적화 펩티드의 Trp⁸ 잔기의 유리 아미노시를 반응시킴으로써 포합체를 형성하기 위해 결합될 수 있다. 상기에서 논의된 킬레이터, 링커 및 표적화 부분의 전체 구조는 또한 수지상에서 조립될 수 있고, 그런 다음 적당한 시약, 예컨대 트리플루오로아세트산 또는 HF의 작용에 의해 제거된다.

봄베신(7-14)는 생체내에서나 시험관에서 단백질 가수분해성 절단이 쉬우며, 그 결과 펩티드의 반감기가 짧아진다. 폴리펩티드의 골격의 아미드 결합이 치환되거나 활성을 보유할 수 있는 한편으로 단백질 가수분해성 절단에 내성이라는 것은 문헌에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 원하지 않는 단백질 가수분해, 또는 감소되거나 없어지는 생체내 활성을 유발할 혈청 안정성을 감소시키는 다른 분해 경로를 감소 또는 제거하기 위하여, 또는 형태적 유연성을 제한 또는 증가시키기 위하여, 펩티드의 골격 내에 있는 아미드 결합을 원하는 방식으로 기존의 형태를 모방하거나 형태를 변경하는 기능성으로 치환하는 것은 통상적인 일이다. 그러한 변형은 결합 친화력의 개선 또는 약물학적 행동방식의 개선을 초래한다. 펩티드 합성 분야의 당업자들은 두 개의 아미노산을 연결하는 어떠한 아미드 결합 (예컨대 표적화 부분, 링커, 킬레이터 등의 아미드 결합)에 대하여 다음의 아미드 결합 변화를 일으킬 수 있으며, 그 결과의 펩티드의 활성이 동일하거나 개선될 수 있을 것이라는 기대를 가질 수 있음이 인지된다: 알파-N-메틸아미드 또는 골격 티오아미드의 삽입, 카르보닐의 제거로 인한 동족 이차 아민의 생성, 한 아미노산의 아자-아미노산으로의 대체로 인한 세미카르바존(semicarbazone) 유도체의 생성, 및 E-올레핀 및 치환된 E-올레핀의 아미드 결합 대용물로서의 용도. 골격 아미드 결합은 또한 옥사졸, 피롤리디논, 이미다졸, 및 케토메틸렌과 플루오로올레핀과 같은 헤테로고리에 의해 대체될 수 있다.

그러한 아미드 결합 변형을 포함하는 몇몇 특정 화합물을 하기 표 4a에 열거한다. 다양한 아미드 결합 변형에 대해 표 4a에 사용된 약어를 하기에 예시한다:

4. 방사성 약제 화합물의 표지화 및 투여

방사성 약제 포합체 안으로의 금속의 통합은 배위 화학 분야에 통상적으로 알려져 있는 다양한 방법들에 의해 이루어질 수 있다. 금속이 진단용 영상화에 바람직한 방사성 핵종인 ^{99 m}Tc인 경우, 테크네튬 복합체를 형성하기 위하여 다음의 일반 과정이 사용될 수 있다. 펩티드-킬레이터 포합체 용액이 먼저 포합체를 물, 희석 산, 또는 에탄올과 같은 알코올 수용액에 녹임으로써 형성된다. 그런 다음 용액은 임의로 가스 제거되어 용해된 산소가 제거된다. -SH 기가 펩티드에 존재할 때 티올 보호기, 예컨대 Acm (아세트아미도메틸), 트리틸 또는 다른 티올 보호기가 임의로 티올을 산화로부터 보호하기 위해 사용될 수 있다. 티올 보호기(들)은 적당한 시약, 예를 들면 수산화 나트륨에 의해 제거된 후, 유기산, 예컨대 아세트산 (pH 6.0-6.5)으로 중화된다. 또는 달리 티올 보호기는 테크네튬 킬레이트화 동안에 제자리에서 제거될 수 있다. 표지화 단계에서, 몰리브덴 생성기로부터 얻어진 소디움 퍼테크네이트가 충분한 양의 환원제, 예컨대 염화 주석과 함께 포합체 용액에 첨가되어 테크네튬이 제거되고 실온에 방치되거나 가열된다. 표지된 포합체는 오염물인 ^99mTcO₄ ^- 및 콜로이드상 ^{99 m}TcO₂로부터 크로마토그래피, 예컨대 C-18 Sep Pak 카트리지 (Millipore Corporation, Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milord, Massachusetts 01757)에 의해, 또는 당업자에게 공지되어 있는 방법들을 사용하여 HPLC에 의해 분리될 수 있다.

대체 방법으로, 표지화는 트랜스킬레이션 반응에 의해 이루어질 수 있다. 이 방법에서 네크네튬 공급원은 환원되고, 선택된 킬레이터와의 반응 전에 가변성 리간드와 복합체를 형성함으로써 선택된 킬레이터로의 리간드 교환이 용이한 네트네튬 용액이다. 트랜스킬레이션에 적당한 리간드의 실례는 타르타르산염, 시트르산염, 글로콘산염, 및 헵타글루콘산염이다. 포합체는 상기에서 설명된 기법을 사용하여 표지될 수 있거나, 또는 달리 킬레이터 자체는 표지되고 계속해서 펩티드와 결합하여 포합체를 형성할 수 있고, 이 과정은 "사전표지된 킬레이트" 방법으로서 언급된다. Re와 Tc는 둘 다 주기율표의 제 VIIB 열에 속하는 것으로 화학적으로 같은 성질을 갖는다. 그러므로 대부분의 경우, 시험관내에서나 생체내에서 고도의 안정성을 나타내는 리간드 프레임워크를 가지는 이들 두 금속의 복합체화 화학은 동일하고 (Eckelman, 1995), 유사한 킬레이터 및 과정이 Re로 표지하기 위해 사용될 수있다. 펩티드 및 단백질과 안정한 방사성 금속 복합체를 형성하기 위해 사용된 많은 ^{99 m}Tc 또는 ^186/188Re 복합체는 이들 금속을 그것들의 +5 산화 상태에서 킬레이트한다 (Lister-James et al., 1997). 이 산화 상태는 선택적으로 ^{99 m}Tc 또는 ^186/188Re를 다양한 ^{99 m}Tc(V) 및/또는 ^186/188Re(V) 약한 킬레이트로부터 구성된, 이미 생체분자에 포합되어 있는 리간드 프레임워크 (예컨대 ^{99 m}Tc-글루코헵토네이트, 시트레이트, 글루콘산염 등)로 대체되는 것을 가능하게 한다 (Eckelman, 1995; Lister-James et al., 1997; Pollak et al., 1996).

5. 진단 및 치료 용도

진단적으로 및/또는 치료적으로 유용한 금속 또는 광학 표지로 표지될 때, 본 발명의 화합물은 GRP 수용체 (또는 NMB 수용체)의 과잉발현을 포함하는 어떠한 병리학이든지 방사성 진단, 방사성 치료 및 광학 영상화의 기술분야에서 수립된 과정에 의해 치료 및/또는 검출하는 데 사용될 수 있다 (Bushbaum, 1995; Fischman et al., 1993; Schubiger et al., 1996; Lowbertz et al., 1994; Krenning et al., 1994; 광학 염료의 실례로는 그것들에 한정되지는 않지만 WO 98/18497, WO 98/18496, WO 98/18495, WO 98/18498, WO 98/53857, WO 96/17628, WO 97/18841, WO 96/23524, WO 98/47538에 기재되어 있는 것들을 포함한다).

GRP-R 발현은 다양한 사람 종양에서 고도로 상향조절된다 (WO 99/62563). 그러므로 본 발명의 화합물은 전립선암 (일차 및 전이), 유방암 (일차 및 전이), 결장암, 위암, 췌장암, 비소포성 폐암, 소포성 폐암, 다발성 위궤양, 흑색종, 교아세포종, 신경아세포종, 자궁 레이오미오사르코마 (leiomyosarcoma) 종양, 전립선 상피내 종양 형성 (PIN), 및 난소암과 같은 암을 치료하고 진단하는 데 광범위하게 유용할 수 있다. 또한 본 발명의 화합물은 GRP 수용체가 상향조절되는 상태와 그렇지 않은 상태 (예컨대 각각 만성 최장염과 도관 췌장 암종) 사이를 구별하는데 유용할 수 있다.

하기 실시예에서 보다 상세하게 설명될 본 발명의 화합물은 본원에 개시된 신규한 링커가 없는 화합물보다 생체내에서 종양에 더 큰 특이성 및 더 높은 흡수를 나타내고, GRP 수용체-발현 종양을 표적으로 하고, 따라서 이들 조직을 영상화하거나 이들 조직에 방사성 치료를 전달하는 능력이 개선된다. 실제로 실시예에서 알 수 있는 것처럼 방사성 치료는 본 발명의 화합물을 사용할 때 더 효과적이다 (생존시간도 연장된다).

이들 화합물의 진단 적용은 암 치료에서 제일선의 치료법으로서, 이들 제제가 보조 화학요법과 합동으로 활용될 수 있는 연합 치료법으로서, 및/또는 쌍을 이룬 치료제로서 사용될 제제로서 규정될 수 있다. 쌍을 이룬다는 개념은 적절한 킬레이트에 대한 결합을 위해 선택된 방사성 금속에 따라 진단제 및 치료제 둘 다로서 작용할 수 있는 단일한 비금속화된 화합물을 말한다. 만약 킬레이터가 원하는 금속을 수용할 수 없다면, 상이한 금속을 수용하면서 약리학을 유지함으로써 생체내에서의 진단 화합물의 행동방식이 방사성 치료 화합물의 행동방식을 예견하는 데 사용될 수 있도록 적절한 치환이 이루어질 수 있다. 보조 화학요법과 공동으로 사용될 때 어떠한 적당한 화학요법제든지 사용될 수 있는데, 이를테면 항종양제, 예컨대 백금 화합물 (예컨대 스피로플라틴, 시스플라틴, 및 카브로플라틴), 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 미토마이신, 안사미토신, 블레오마이신, 시토신, 아라비노시드, 아라비노실 아데닌, 메르캅토폴리라이신, 빈크리스틴, 부술판, 클로람부실, 멜팔란 (예컨대 PAM, a, L-PAM 또는 페닐알라닌 머스타드), 메르캅토퓨린, 미토탄, 프로카르바진 염산염, 닥티노마이신 (악티노마이신 D), 다우노루비신 염산염, 독소루비신 염산염, 탁솔, 미노마이신, 플리카아미신 (미트라마이신), 아미노글루테티미드, 에스트라무스틴 포스페이트 소디움, 플루타미드, 로이프롤리드 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 타목시펜 시트레이트, 테스톨락톤, 트릴로스탄, 암사크린 (m-AMSA), 아스파라기나제 (L-아스파라기나제), 에위나 아스파라기나제 (Erwina aparaginase), 에토포시드-(VP-16), 인터페론 α-2a, 인터페론 α-2b, 테니포시드 (VM-26), 빈블라스틴 술페이트 (VLB), 및 아라비노실이 있다. 어떤 구체예에서 치료제는 단클론성 항체, 예컨대 흑색종 항원에 결합할 수 있는 단클론성 항체일 수 있다.

방사성 핵종 금속, 예컨대 ^{99 m}Tc로 표지된 포합체는 사람 환자를 포함하여 동물 또는 대상에게, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 용액, 예컨대 등장 식염수와 같은 염 용액 중의 정맥내, 피하 또는 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 의해 적당한 양의 방사능을 가지는 방사성 표지된 신티그래피 영상화제가 제공된다. 99mTc 방사성 복합체를 형성할 때 ml 당 약 0.01 밀리큐리 (mCi) 내지 100 mCi의 농도로 방사능을 함유하는 용액 중에서 방사성 복합체를 형성하는 것이 대체로 바람직하다. 일반적으로 투여될 단위 용량은 약 0.01 mCi 내지 약 100 mCi, 바람직하게는 약 1 mCi 내지 30 mCi의 방사능을 가진다. 단위 투여형태로 주사될 용액은 약 0.01 ml 내지 약 10 ml이다. 투여에 적절한 표지된 포합체의 양은 빠르게 제거된 포합체가 덜 빠르게 제거되는 것보다 더 많은 양으로 투여될 필요가 있을 것이라는 점에서 선택된 포합체의 분포 프로필에 따라 좌우된다. 생체내 분포 및 위치는 투여 후 적절한 시간에서 표준 신티그래피 기법에 의해 그 자취를 알 수 있으며; 전형적으로 비-표적 조직의 제거 속도와 관련하여 표적 부위에서의 축적 속도에 따라 30분에서 180분 사이이다. 예를 들어 본 발명의 진단용 방사성 핵종-표지된 화합물이 환자에게 투여된 후에, 영상화제에 통합된 핵종의 감마선 에너지에 대해 보정된 감마 카메라를 사용하여 제제가 흡수된 영역을 영상화하고 그 부위에 존재하는 방사능의 양을 정량할 수 있다. 부위의 생체내 영상화는 수분 내에 이루어질 수 있다. 그러나 영상화는 필요한 경우 방사성 표지된 펩티드가 환자에게 투여된 후 수시간 또는 심지어 더 긴 시간 후에 이루어질 수도 있다. 대부분의 경우 충분한 양의 투여된 용량이 약 0.1 시간 내에 영상화될 영역에 축적되어 신티그래피에 의한 사진(scintiphoto)을 찍는 것이 가능하게 될 것이다.

본 발명의 화합물은 환자에게 단독으로 또는 부형제, 희석제, 라디칸 스캐빈저, 안정제, 및 담체와 같은, 모두 당해 기술분야에 널리 공지되어 있는 다른 성분을 함유하는 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 화합물은 정맥내로 또는 복강내로 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명에는 많은 장점이 있다. 본 발명에 따라 제조된 화합물은 안정하고 잘 규정된 ^{99 m}Tc 또는 ^186/188Re 표지된 화합물을 형성한다. 본 발명의 유사한 화합물 또한 ¹⁵³Sm, ⁹⁰Y, ¹⁶⁶Ho, ¹⁰⁵Rh, ¹⁹⁹Au, ¹⁴⁹Pm, ¹⁷⁷Lu, 111In 또는 다른 방사성 금속으로 표지된 안정하고 잘 규정된 생성물을 형성하기 위해 각각의 방사성 금속에 대한 적절한 킬레이터 프레임워크를 사용함으로써 제조될 수 있다. 방사성 표지된 GRP 수용체 표적화 펩티드는 선택적으로 GRP 수용체를 발현하는 신생 세포에 결합하고, 만약 아고니스트가 사용된다면 내부화되며, 더 길어진 시간 동안 종양 세포에 보유된다. 암세포에 도달하지 못한 (즉 결합하지 못한) 방사성 물질은 우선적으로 효과적으로 뇨로 분비됨으로써 신장에는 방사성 금속이 최소한으로 보유된다.

6. 광학 영상화, 루미네센스 ( sonoluminescence ), 포토어쿠스틱 (photoacoustic) 영상화 및 광선치료법

본 발명에 따라 본 발명의 광학-표지된 화합물로 환자에게 주사한 후에 생체내 광 영상화로 표적의 위치를 측정하기 위하여 많은 광학 매개변수들이 사용될 수 있다. 영상 제조시 검출될 광학 매개변수로는 전파된 방사선, 흡수, 형광 또는 인광 방출, 광 반사, 흡수 폭 및 최대치, 및 탄력적으로 산란된 방사선이 있다. 예를 들어 생물학적 조직은 상대적으로 650 내지 1000 nm의 적외선 근접 (NIR) 파장 범위에서 빛에 반투명하다. NIR 방사선은 조직을 수 cm 까지 침투하여 본 발명의 화합물이 생체내에서 표적-함유 조직을 영상화하는 데 사용되는 것을 가능하게 한다. 가시광 및 적외선 근접 (NIR) 광을 실제로 임상에 사용하는 것은 빠르게 진전되고 있다. 전자기 스펙트럼에서 가시 영역, NIR 영역 또는 긴 파장 (UV-A, >350 nm) 영역은 잠재적으로 광학 X선 단층 촬영 영상화, 내시경 가시화, 및 광선 치료에 유용하다.

생물의학적 광학의 주요 장점은 그것의 치료적 가능성에 있다. 광선치료는 다양한 표면 병변, 외부적인 것과 내부적인 것 둘 다의 치료에 안전하고 효과적인 과정인 것으로 증명되었다. 광학 영상화 및 광선 치료에서 신호 검출 및/또는 조직의 광민감화에 염료가 중요하다. 이전의 연구들은 특정 염료가 종양의 위치를 파악할 수 있게 하고 작은 암들의 검출 및 치료에 있어 강력한 프로브로서 작용한다는 것을 보여주었다 (D. A. Bellnier et al., Murine pharmacokinetics and antitumor efficacy of the photodynamic sensitizer 2-[1-hexyloxyethyl]-2-devinyl pyropheophorbide-a, J. Photochem. Photobiol., 1993, 20, pp.55-61; G. A. Wagnieres et al., In vivo fluorescence spectroscopy and imaging for oncological applications, Photochem. Photobiol., 1998, 68, pp.603-632; J. S. Reynolds et al., Imaging of spontaneous canine mammary tumors using fluorescent contrast agents, Photochem. Photobiol., 1999, 70, pp. 87-94). 그러나 이들 염료는 악성 조직에서는 우선적으로 위치가 정해지지 않는다.

예시적인 구체예에서 가지는 본 발명의 화합물은 광범위한 위치이동 고리 시스템 및 400 내지 1500 nm 범위의 흡수 또는 방출을 유기 크로모포어 또는 플루오로포어를 포함하여 광표지, 예컨대 광학 염료와 포합될 수 있다. 또는 달리 본 발명의 화합물은 생체발광 분자로 유도될 수 있다. 광표지의 바람직한 최대 흡수 범위는 헤모글로빈으로부터의 신호로 간섭되는 것을 최소화하기 위하여 600 내지 1000 nm 사이이다. 바람직하게도, 광흡수 표지는 더 큰 몰 흡수성, 예컨대 >10⁵ cm^-1M^-1을 가지는 한편, 형광 광학 염료는 높은 양자 수율을 가질 것이다. 광학 염료의 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 US 6,641,798, WO 98/18497, WO 98/18496, WO 98/18495, WO 98/18498, WO 98/53857, WO 96/17628, WO 97/18841, WO 96/23524, WO 98/47538, 및 이 공보들에 인용된 참고문헌들에 개시되어 있는 것들이다. 예를 들어 광표지는 본 발명의 화합물, 예를 들면 본 발명의 GRP 수용체 표적화 펩티드 및 링커로 구성되는 화합물에 직접 공유 결합될 수 있다. 전자기 스펙트럼의 가시 영역 및 적외선-근접 영역에서 빛을 흡수하고 방출하는 여러 염료가 현재 그것들의 생체적합성, 높은 몰 흡수성, 및/또는 높은 형광 양자 수율로 인하여 다양한 생물의학 분야에 적용되어 사용되고 있다. 명암 대비제로서의 염료와 결합하여 광학적 양식의 높은 민감성은 핵 의학의 그것과 평행을 이루며, 이온화 방사선의 바람직하지 못한 영향 없이 기관 및 조직의 가시화를 가능하게 한다. 적외선-근접 (NIR) 영역에서 집중적인 흡수 및 방출을 보이는 시아닌 염료가 특히 유용한데, 왜냐하면 생물학적 조직이 이 영역에서 광학적으로 투명하기 때문이다 (B. C. Wilson, Optical properties of tissues. Encyclopedia of Human Biology, 1991, 5, 587-597). 예를 들어 NIR 영역에서 흡수하고 방출하는 인도시아닌 그린은 심장 출력, 간 기능, 및 간 혈류를 모니터하는 데 사용되어 왔고 (Y-L. He, H. Tanigami, H. Ueyama, T. Mashimo, and I. Yoshiya, Measurement of blood volume using indocyanine green measured with pulse-spectrometry: Its reproducibility and reliability. Critical Care Medicine, 1998, 26(8), 1446-1451; J. Caesar, S. Shaldon, L. Chiandussi, et al., The use of Indocyanine green in the measurement of hepatic blood flow and as a test of hepatic function. Clin. Sci. 1961, 21,43-57), 그것의 기능화된 유도체는 진단 목적으로 생체분자를 포합하는 데 사용되어 왔다 (R. B. Mujumdar, L. A. Ernst, S. R. Mujumdar, et al., Cyanine dye labeling reagents: Sulfoindocyanine succinimidyl esters. Bioconjugate Chemistry, 1993, 4(2), 105-111; Linda G. Lee and Sam L. Woo. "N-Heteroaromatic ion and iminium ion substituted cyanine dyes for use as fluorescent labels", 미국 특허 제 5,453,505호; EricHohenschuh, et al. "Light imaging contrast agents", WO 98/48846; Jonathan Turner, et al. "Optical diagnostic agents for the diagnosis of neurodegenerative diseases by means of near infra-red radiation", WO 98/22146; Kai Licha, et al. "In-vivo diagnostic process by near infrared radiation", WO 96/17628; Robert A. Snow, et al., Compounds, WO 98/48838, US 6,641,798).

광학적으로 표지된 화합물의 주사 후에 환자는 제제에 사용된 광표지에 대해 적절한 파장 범위의 하나 또는 둘 이상의 광원 (예컨대 레이저)으로 스캔된다. 사용된 빛은 단색성이거나 다색성일 수 있으며 연속적이거나 펄스일 수 있다. 전파되거나, 산란되거나 또는 반사된 빛은 표적-함유 조직 (예컨대 GRP 함유 조직)의 위치를 측정하기 위하여 하나 또는 다중 파장에 조정된 광검출기를 통해 검출된다. 광학적 매개변수의 변화는 표적 부위 (예컨대 종양 또는 GRP 수용체를 가지고 있는 다른 부위)에서의 광학-표지된 시약의 축적을 검출하기 위하여 시간 경과에 따라 모니터될 수 있다. 표준 영상 처리 및 검출 장치는 본 발명의 광학 영상화 시약과 연합으로 사용될 수 있다.

상기에서 설명된 광학 영상화 시약은 또한 광학-표지된 영상화제로 수행된 음향-광학적 또는 소노루미네센트 영상화를 위해 사용될 수 있다 (US 5,171,298, WO 98/57666 참조). 음향-광학적 영상화에서 초음파 방사선이 환자에게 적용되고 전파되거나, 방출되거나 또는 반사된 빛의 광학 매개변수에 영향을 미친다. 소노루미네센트 영상화에서 적용된 초음파는 실제로 검출된 빛을 생성한다. 그러한 기법을 사용하는 적당한 영상화 방법은 WO 98/57666에 설명되어 있다.

다양한 영상화 기법 및 시약들이 문헌에 기재되어 있다:

미국 특허 제 6,663,847호, 6,656,451호, 6,641,798호, 6,485,704호, 6,423,547호, 6,395,257호, 6,280,703호, 6,277,841호, 6,264,920호, 6,264,919호, 6,228,344호, 6,217,848호, 6,190,641호, 6,183,726호, 6,180,087호, 6,180,086호, 6,180,085호, 6,013,243호, 및 공개된 미국 특허 출원 2003185756호, 20031656432호, 2003158127호, 2003152577호, 2003143159호, 2003105300호, 2003105299호, 2003072763호, 2003036538호, 2003031627호, 2003017164호, 2002169107호, 2002164287호, 및 2002156117호.

7. 방사성 치료

방사성 동위원소 치료는 표적화된 조직에 손상을 입피거나 파괴하기에 충분한 양의 방사성 표지된 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 화합물을 투여한 후에 (예컨대 정맥내, 피하, 또는 복강내 주사에 의해), 방사성 표지된 약물은 우선적으로 질병 부위 (이 경우 종양 조직 또는 적절한 GRP 수용체를 발현하는 다른 조직)에 위치한다. 일단 위치가 정해지면 방사성 표지된 화합물은 투여된 방사성 동위원소의 방사능이 자연 붕괴되는 동안 방출되는 에너지로 질병 조직에 손상을 입히거나 파괴한다. 본원에서 논의되는 바와 같이 본 발명은 또한 보조적인 화학요법과 연합되는 (또는 어떠한 다른 적절한 치료제와 공동으로) 방사성 치료의 사용도 포함한다.

성공적인 방사성 치료 계획은 여러 가지 결정적인 요인을 포함한다:

1. 질병 부위에 방사능을 전달하기 위한 적절한 표적화 기의 선택;

2. 실질적으로 인접한 정상 조직은 손상시키지 않으면서 그 질병 부위를 손상시키기에 충분한 에너지를 방출하는 적절한 방사성 핵종의 선택; 및

3. 질병 부위에서 이 포합체가 위치를 정하는 능력에 불리한 영향을 미치지 않는 표적화 기와 방사성 핵종의 적절한 조합의 선택. 방사성 금속의 경우 이것은 때로 방사성 핵종과 정확하게 배위결합하여 표적화 기에 상기 킬레이트를 결합시키는 링커와 연합되고, 표적 조직에서의 흡수를 최대화하고 정상의 비-표적 기관에서는 흡수를 최소화하기 위하여 화합물의 전체적인 생체 분포에 영향을 미치는 킬레이트화 기를 포함한다.

본 발명은 표적화 기, 방사성 핵종, 금속 킬레이트 및 링커의 적절한 선택을 통하여 상기 세 가지 기준을 모두 만족시키는 방사성 치료제를 제공한다.

방사성 치료제는 란타니드 (원자 번호 57-71의 원소들)로서 알려져 있는 원소 부류로부터의 킬레이트화된 3+ 금속 이온 및 그것들의 유사체 (즉 이트륨 및 인듐과 같은 M^{3 +} 금속)를 함유할 수 있다. 이 부류의 전형적인 방사성 금속으로는 동위원소 90-이트륨, 111-인듐, 149-프로메튬, 153-사마륨, 166-디스프로슘, 166-홀뮴, 175-이테르븀, 및 177-루테튬이 있다. 이들 금속은 모두 (및 란타니드 계의 다른 금속까지) 널리 공지되어 있는 킬레이트 DTPA (디에틸렌트리아민펜타아세트산)의 유도체 및 폴리아자-폴리카르복실레이트 거대고리, 예컨대 DOTA (1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산) 및 그것의 밀접한 유사체에 의해 예시되는 바와 같이, 그것들이 +3 산화 상태를 유지하고, 단단한 (산소/질소) 공여 원자를 포함하는 리간드에 우선적으로 킬레이트를 형성한다는 점에서 매우 유사한 화학을 가지고 있다. 이들 킬레이트화 리간드의 구조를 그것들의 양자가 완전히 제거된 형태로 아래에 도시한다.

이들 킬레이트화 리간드는 방사성 금속을 다중 질소와 산소 원자를 경유하여 결합시킴으로써 그것을 캡슐화하여, 유리 (미결합된) 방사성 금속이 신체로 방출되는 것을 방지하게 된다. 이것은 중요한데, 왜냐하면 3+ 방사성 금속의 그것의 킬레이트로부터의 생체내 분리는 간, 뼈 및 비장에서의 방사성 금속의 흡수를 유발할 수 있기 때문이다 (Brechbiel MW, Gansow OA, "Backbone-substituted DTPA ligands for 90Y radioimmunotherapy", Bioconj. Chem. 1991; 2:187-194; Li, WP, Ma DS, Higginbotham C, Hoffman T, Ketring AR, Cutler CS, Jurisson, SS, "Development of an in vitro model for assessing the in vivo stability of lanthanide chelates." Nucl. Med. Biol. 2001; 28(2):145-154; Kasokat T, Urich K. Arzneim.- Forsch, "Quantification of dechelation of gadopentetate dimeglumine in rats". 1992; 42(6):869-76). 이들 기관을 특별히 표적으로 하지 않는 한, 그러한 비-특이적 흡수는 그것이 비-표적 조직의 비-특이적인 조사 (irradiation)를 유발하고, 골수의 조사로 인한 조혈성 억제와 같은 문제를 유발할 수 있기 때문에 매우 바람직하지 못하다.

방사성 치료 적용을 위해서 본원에서 개시된 치료용 방사성 핵종에 대한 킬레이터 중 어떠한 것도 사용될 수 있다. 그러나 DOTA 킬레이트 (Tweedle MF, Gaughan GT, HaganJT, "1-Substituted-1,4,7-triscarboxymethyl-1,4,7,10- tetraazacyclododecane and analogs." 미국 특허 제 4,885,363호, Dec. 5, 1989)의 형태가 특히 바람직한데, DOTA 킬레이트가 DTPA 또는 다른 선형 킬레이트보다 신체에서 탈킬레이트화되는 것이 적을 것으로 예상되기 때문이다. 화합물 L64 및 L70 (적절한 치료용 방사성 핵종으로 표지되었을 때)이 방사성 치료에 특히 바람직하다.

DOTA-형 거대고리를 링커를 통하여 표적화 기에 결합시키는 일반적인 방법 (예컨대 활성 에스테르를 형성하기 위하여 DOTA의 카르복실레이트를 활성화시킴으로써, 활성 에스테르는 다음 단계로 링커 상의 아미노기와 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성한다)은 당업자들에게 공지되어 있다 (예컨대 미국 특허 제 4,885,363호, Tweendle et al.). 결합은 또한 폴리아자 고리의 골격상에서 변형된 DOTA-형 거대고리상에서 수행될 수 있다.

특정 방사성 치료 적용에 사용하기 위한 적절한 핵의 선택은 다음의 것들을 포함하여 많은 요인들에 좌우된다:

a. 물리적 반감기 - 이것은 방사성 금속 및 포합체로부터의 방사성 치료 구성물의 합성 및 정제, 및 상기 구성물이 주사 전에 상당량의 방사능이 자연 붕괴되는 일 없이 주사 부위에 전달되는 것을 가능하기에 충분할 정도로 길어야 한다.

b. 방사성 핵종으로부터의 에너지 방출(들) - 입자 방출기 (예컨대 알파 방출기, 베타 방출기 및 오거(Auger) 전자 방출기)인 방사성 핵종이 특히 유용한데, 왜냐하면 그것들이 그것들의 에너지를 짧은 거리에 걸쳐 침착하는 고에너지 입자를 방출함으로써 고도로 국소화된 손상을 유발하기 때문이다. 베타 방출 방사성 핵종이 특히 바람직한데, 이들 동위원소로부터의 베타 입자 방출로부터 나오는 에너지는 5 내지 약 150 세포 직경 내에 침착되기 때문이다. 이들 핵종으로부터 제조된 방사성 치료제는 국소화된 그것들의 부위에 상대적으로 가까이 있는 병에 걸린 세포를 죽일 수 있지만 골수와 같은 인접한 정상 조직을 손상시키기 위해 먼 거리를 이동할 수는 없다.

c. 비활성 (specific activity)(즉 방사성 핵종의 질량 당 방사능) - 높은 비활성을 가지는 방사성 핵종 (예컨대 발생기는 90-Y, 111-In, 177-Lu를 생성하였다)이 특히 바람직하다. 방사성 핵종의 비활성은 그것의 제조 방법, 그것을 생성하는 데 사용되는 특정 표적, 및 관심의 동위원소의 특성에 의해 결정된다.

많은 란타니드와 란타노이드는 베타 입자를 방출하기 때문에 그것들을 방사성 치료제로서 사용하기에 적당하게 만드는 핵 특성을 가지는 방사성 동위원소를 포함한다. 이들 중 몇 가지를 아래의 표에 열거한다.

베타-방출 란타니드 방사성 동위원소와 같은 방사성 금속의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌 등에도 설명되어 있다 (Cutler C S, Smith CJ, Ehrhardt GJ.; Tyler TT, Jurisson SS, DeutschE. "Current and potential therapeutic uses of lanthanide radioisotopes." Cancer Biother. Radiopharm. 2000;15(6):531-545). 이들 동위원소는 많은 경우 비교적 저렴한 비용으로 고수율로 제조될 수 있고, 많은 것들이 (예컨대 ⁹⁰-Y, ¹⁴⁹-Pm, ¹⁷⁷-Lu) 담체-유리 비활성에 가깝게 (즉 거의 대부분의 원자들이 방사성이다) 제조될 수 있다. 비-방사성 원자들이 표적 조직상의 수용체에 대한 결합에 대해 그것들의 방사성 유사체와 경합할 수 있기 때문에 비활성이 높은 방사성 동위원소의 사용이 중요하며, 표적 조직에 대해 가능한 한 고용량의 방사능을 전달하는 것이 가능하다.

레늄의 베타-방출 동위원소 (¹⁸⁶-Re 및 ¹⁸⁸-Re)를 포함하여 본 발명의 방사성 치료 유도체도 또한 바람직하다.

8. 용량 및 첨가제

본 발명의 화합물에 대한 적절한 용량 스케줄은 당업자에게 공지되어 있다. 화합물은 그것들에 한정되는 것은 아니지만 단일 또는 다중 IV 또는 IP 주사를 포함한 많은 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 방사성 약물의 경우 영상화하기에 충분한 방사능 양, 또는 방사성 치료의 경우 표적으로 하는 GRP-R 내포 조직의 손상 또는 제거를 유발하기에 충분하지만 비-표적 (정상 조직)에는 실질적으로 손상을 유발하지 않을 정도의 양의 방사능을 투여할 수 있다. 방사성 치료에 필요한 양 및 용량은 또한 상이한 구성물에 대해 사용되는 동위원소의 에너지 및 반감기, 제제가 신체로 흡수되고 신체로부터 제거되는 정도 및 종양의 크기에 따라 상이하다. 일반적으로 용량은 약 30 내지 50 mCi의 단일 용량으로부터 약 3 큐리(Cury)의 축적량까지 다양할 수 있다.

광학 영상화 화합물의 경우 바람직한 영상 증대를 이루기에 충분한 용량은 당업자에게 공지되어 있고, 사용되는 염료 또는 다른 화합물, 손상시켜야 할 기관 또는 조직, 사용되는 영상화 장비 등에 따라 광범위하게 달라질 수 있다.

본 발명의 조성물은 생리적으로 허용되는 완충제를 포함할 수 있고, 주사 전에 화합물에 대한 방사능 분해 손상을 방지하기 위해 방사선 안정제를 필요로 할 수도 있다. 방사선 안정제는 당업자들에게 알려져 있으며, 예를 들면 파라-아미노벤조산, 아스코르브산, 겐티스트산 등이 있다.

본 발명의 진단 또는 치료제를 제조하기 위해 필요한 모든 성분을 함유하는 단일, 또는 다중-바이알 키트는 본 발명의 일부이다. 방사성 약물의 경우 그런 키트는 흔히 방사성 핵종을 제외한 모든 필요한 성분들을 함유할 것이다.

예를 들어 본 발명의 방사성 약물을 제조하기 위한 단일-바이알 키트는 바람직하게도 식 M-N-O-P-G의 킬레이터/링커/표적화 펩티드 포합체, 주석염의 공급원 (환원이 필요한 경우, 예컨대 테크네튬을 사용하는 경우), 또는 다른 약제학적으로 허용되는 환원제를 함유하며, 약제학적으로 허용되는 산 또는 염기로 적절하게 완충되어 pH 값이 약 3 내지 약 9로 조정된다. 사용되는 환원제의 양 및 유형은 형성되어야 할 교환 복합체의 성질에 매우 의존적일 것이다. 적절한 조건은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 키트 내용물은 동결건조된 형태인 것이 바람직하다. 그런 단일 바이알 키트는 임의로 가변적이거나 교환할 수 있는 리간드, 예컨대 글루코헵토네이트, 글루코네이트, 만니톨, 말레이트, 시트르산 또는 타르타르산을 함유할 수 있으며, 또한 최종 생성물의 방사성 화학적 순도 및 안정성을 개선시키는 작용을 하는 디에틸렌트리아민-펜타아세트산 (DPTA), 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 또는 α, β, 또는 γ-시클로덱스트린을 함유할 수 있다. 키트는 또한 안정제, 냉동-건조 과정을 보조하기 위해 고안된 벌크화제, 예컨대 만니톨, 및 당업자들에게 공지되어 있는 다른 첨가들을 함유한다.

다중-바이알 키트는 바람직하게도 단일 바아알과 동일한 일반 성분을 함유하지만 방사성 약물을 재구성하는 데는 하나 이상의 바이알을 사용한다. 예를 들어 하나의 바이알은 퍼테크네테이트 (예컨대 주석 공급원 또는 다른 환원제)의 첨가시 가변성 Tc(V) 복합체를 형성하는 데 필요한 모든 성분들을 함유할 수 있다. 이 바이알에 퍼테크네테이트가 첨가되고, 적절한 시간을 기다린 후에 이 바아알의 내용물은 킬레이터와 표적화 펩티드와, pH를 그것의 적정 값으로 조정하기 위해 적절한 완충제가 들어있는 두 번째 바이알에 첨가된다. 약 5 내지 60분의 반응 시간 후에 본 발명의 복합체가 형성된다. 이 다중-바이알 키트의 두 바이알의 내용물은 모두 동결건조되는 것이 유익하다. 상기와 같이 반응 변형제, 교환 리간드, 안정제, 벌크화제, 등이 각각의 바이알 또는 두 개의 바이알 모두에 존재할 수 있다.

화합물의 일반적 제조

본 발명의 화합물은 선택된 킬레이터에 따라 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 화합물의 펩티드 부분은 가장 편리하게는 펩티드 합성 분야에서 일반적으로 수립되고 공지되어 있는 기법, 예컨대 고체-상 펩티드 합성법 (SPPS) 접근법에 의해 제조될 수 있다. 고체-상 합성법을 따르기 때문에 또 다른 FMOC 보호 및 탈보호를 사용하는 것이 짧은 펩티드를 만들기에는 바람직한 방법이다. 재조합 DNA 기법은 단백질 및 그것의 긴 단편을 제조하는 데 바람직하다.

고체-상 펩티드 합성법 (SPPS)은 아미노산 잔기를 불용성 지지체 또는 매트릭스, 예컨대 폴리스티렌에 결합되어 있는 점점 길어지는 펩티드 사슬에 단계식으로 첨가하는 것을 포함한다. 펩티드의 C-말단 잔기는 먼저 N-보호제, 예컨대 t-부틸옥시카르보닐기 (Boc) 또는 플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 기로 아미노기가 보호되어 있는 시판되는 지지체에 고착된다. 아미노 보호기는 적당한 탈보호제, 예를 들면 Boc의 경우 TFA, Fmoc의 경우 피페리딘으로 제거되고, 다음 아미노산 잔기 (N-보호된 형태인 경우)가 디이소프로필카르보디이미드 (DIC)와 같은 커플링제를 사용하여 첨가된다. 펩티드 결합이 형성될 때, 시약들은 지지체로부터 세척된다. 최종 잔기가 첨가된 후에 펩티드는 트리플루오로아세트산 (TFA) 또는 플루오르화 수소 (HF)와 같은 적당한 시약으로 지지체로부터 절단된다.

절편 커플링을 통한 화합물의 또 다른 제조 방법

본 발명의 화합물은 또한 절편 커플링 또는 단편 축합으로서 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다 (Barlos, K. and Gatos, D.; 2002 "Convergent Peptide Synthesis" in Fmoc Solid Phase Synthesis-A Practical Approach; Eds. Chan, W. C. and White, P. D.; Oxford University Press, New York; Chap. 9, pp.215-228). 이 방법에서 보통 측쇄 보호 형태인 펩티드의 절편은 별도로 용액상 합성법 또는 고체상 합성법에 의해 제조되거나 두 가지 방법의 조합에 의해 제조된다. 절편의 선택은 중요하며, 그것의 C-말단 잔기와 N-말단 잔기가 펩티드 합성시 완벽한 커플링을 제공하도록 돌출되어 있는 관리가능한 수의 절편을 제공할 수 있는 분할 스트래티지를 사용하여 제조된다. 최상의 절편의 C-말단 잔기는 키랄 알파 탄소가 없는 것이거나 (글리신 또는 커플링 단계에서 활성화될 카르복실기에 대해 탄소 ∝에서 아키랄인 다른 부분) 또는 활성화되고 커플링되는 동안 라세미화하려는 경향이 선택 가능한 것들 중에서 가장 낮은 아미노산을 포함한다. 각 절편에 대한 N-말단 아미노산의 선택은 아미노기에 대한 활성화된 아실 중간체의 커플링의 용이함을 토대로 한다. 일단 분할 스트래티지가 선택되면 절편의 각각의 커플링 방법은 필요한 중간체의 합성 용이성 및 최종 생성물의 조작 및 정제 용이성 (필요한 경우)을 토대로 선택된다. 그런 다음 절편이 함께, 둘 다 용액 중에서, 또는 하나는 고체상에서 다른 하나는 용액 중에서 결합되어 전체가 또는 부분적으로 보호된 형태의 최종 구조가 형성된다.

그런 다음 보호된 표적 화합물에 대해 보호기의 제거, 정제 및 분리 단계가 수행되어 원하는 최종 화합물이 형성된다. 절편 커플링 접근법의 장점은 각 절편이 별도로 정제될 수 있어서, 불완전한 커플링으로부터 생성된 결실 서열 또는 커플링 단계 중에 측쇄 아미드 탈수와 같은 반응, 또는 Fmoc 기의 탈보호 과정 중에 알파 아미노기에 대한 측쇄의 내부 고리화 (예컨대 Gln의 고리화)로부터 유도된 결실 서열과 같은 부산물의 제거가 가능하다는 것이다. 그러한 부산물은 모두 종래의 수지-기초 '직선적인' 펩티드 사슬 어셈블리의 최종 생성물에 존재할 수 있는 한편, 이들 물질의 제거는 필요하다면 절편 커플링 스트래티지에서 많은 단계에서 수행될 수 있다. 절편 커플링 스트래티지의 중요한 다른 장점은 상이한 용매, 시약 및 조건이 각 절편의 합성을 고순도로 최적화하여 최종 생성물의 순도 및 수율을 개선시키는 결과를 초래하는 데 사용될 수 있다는 것이다. 현실화되는 다른 장점은 시약을 덜 사용한다는 것과 저렴한 비용이다.

다음의 실시예들을 본 발명의 다양한 화합물을 제조하기 위해 사용될 수 있는 상이한 방법들의 실례로서 제공한다. 각 실시예에서 화합물은 굵은 한 개의 대문자로 표시되며, 표시된 도면에서 동일하게 표지된 상응하는 화합물과 관련이 있다.

일반 실시예

A. 사용된 추가 약어의 정의

다음의 공통적인 약어를 본 명세서 전체를 통하여 사용한다:

1,1-디메틸에톡시카르보닐 (Boc 또는 Boc);

9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc);

알릴옥시카르보닐 (Aloc);

1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt 또는 HOBT);

N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC);

N-메틸피롤리디논 (NMP);

아세트산 무수물 (Ac₂O);

(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)-3-메틸부틸 (iv-Dde);

트리플루오로아세트산 (TFA);

시약 B (TFA:H2O:페놀:트리이소프로필실란, 88:5:5:2);

디이소프로필에틸아민 (DIEA);

O-(1H-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페 이트 (HBTU);

O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU);

N-히드록시숙신이미드 (NHS);

고체상 펩티드 합성 (SPPS);

디메틸술폭시드 (DMSO);

디클로로메탄 (DCM);

디메틸포름아미드 (DMF);

디메틸아세트아미드 (DMA);

1,4,7,10-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA);

트리이소프로필실란 (TIPS);

1,4,7,10-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA);

(1R)-1-[1,4,7,10-테트라아자-4,7,10-트리스(카르복시메틸)시클로도데실]에탄-1,2-디카르복실산 (CMDOTA);

우태아 혈청 (FBS);

사람 혈청 알부민 (HSA);

사람 전립선 암 셀라인 (PC3);

이소부틸클로로포르메이트 (IBCF);

트리부틸 아민 (TBA);

방사성 화학적 순도 (RCP); 및

고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC).

B. 재료

사용된 Fmoc-보호된 아미노산은 Nova-Biochem (San Diego, CA, USA), Advanced Chem Tech (Louisville, KY. , USA), Chem-Impex International (Wood DaleIll., USA), 및 Multiple Peptide Systems (San Diego, CA., USA)로부터 구입하였다. 합성에 필요한 다른 화합물, 시약 및 흡수제는 Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) 및 VWR Scientific Products (Bridgeport, NJ., USA)로부터 구입하였다. 펩티드 합성을 위한 용매는 Pharmco Co. (Brookfield CT., USA)로부터 얻었다. HPLC 분석 및 정제를 위한 칼럼은 Waters Co. (Milford, MA., USA)로부터 얻었다. 상업적으로 활용할 수 없는 것들에 대한 상세한 실험은 아래에 제시한다.

C. 펩티드 합성을 위한 기기

펩티드는 Advanced ChemTech 496Ω MOS 합성기, Advanced ChemTech 357 FBS 합성기를 사용하여 및/또는 수동 펩티드 합성법에 의하여 제조하였다. 그러나 사용된 반복적인 탈보호 및 사슬 연장에 대한 프로토콜은 모두 동일하였다.

D. 심포니 기기 ( Rainin 제조)를 사용하는 자동 합성법

합성은 Protein Technologies Inc.사에 의해 제공된 Symphony 소프트웨어 (Version 3)를 사용하여 이루어졌다. 0.25 mmol/g이 치환된 Novogel TGR 수지를 사용하였고, 각각은 0.2 g (50 μmol)의 수지를 함유하였다. 아미노산을 NMP에 녹였고, 농도는 0.25 M이었다. DMF 중의 HBTU 및 N-메틸모르폴린의 0.25 M 용액을 제조하여 커플링에 사용하였다. 모든 커플링은 2.0 시간 동안 수행하였다. 절단은 기기 밖에서 수지를 다른 반응 용기로 옮겨 수행하였고, 시약 B를 수동 합성에서처럼 사용하였다.

E. 분석 및 정제에 사용된 기기

분석용 HPLC는 Shimadzu-ClassVP 소프트웨어 버전 4.1을 시스템 제어, 데이터 획득, 및 후 작동 프로세싱을 위해 사용하는 Shimadzu-LC-10A 이중 펌프 구배 분석 LC 시스템을 사용하여 수행하였다. 질량 스펙트럼을 직접 흐름 주사 또는 Waters Associates XTerra MSC18 칼럼 (4.6 mm x 50 mm, 5μ 입자, 120A 기공)상에의 주사에 대해 맞춰진 Agilent Technologies 1100 시리즈로 짜여진 Hewlett-Packard Series 1100 이중 펌프 구배 HPLC 시스템과 계면을 형성한 Hewlett-Packard Series 1100 MSD 질량 분광계 상에서 획득하였다. 기기는 샘플 서브미션(submission)에 대해서는 'MSD Anyone' 소프트웨어를 사용하고 기기 제어 및 데이터 획득을 위해서는 HP Chemstation을 사용하여 HP Kayak 워크 스테이션에 의해 구동하였다. 대부분의 경우 샘플을 1 mg/ml 농도에서 5 μL 샘플 용액의 직접 주사를 경유하여 주입하고, 구조 확인을 위해 m/e 및 m/z (다중 하전된) 이온에 대한 포지티브 이온 일렉트로스프레이(electrospray)를 사용하여 분석하였다. 500 MHz에서의 Varian Innova 분광계상에서 ¹H-NMR 스펙트럼을 얻었다. 동일한 기기 상에서 125.73 Hz에서 ¹³C-NMR 스펙트럼을 얻었다. 일반적으로 잔류하는 ¹H 흡수, 또는 ¹³C-NMR의 경우에는 사용된 용매의 ¹³C 흡수는 내부 참조로서 사용하였고; 다른 경우에는 테트라메틸실란 (δ=0.00 ppm)을 사용하였다. 공명 값은 δ 유니트로서 제공한 다. 마이크로 분석 데이터는 Quantitative Technologies Inc., Whitehouse NJ로부터 얻었다. 예비 HPLC는 시스템 제어, 데이터 획득, 분획 수집 및 후 작동 프로세싱을 위해 Shimadzu-ClassVP 소프트웨어 버전 4.3을 사용하는 Shimadzu-LC-8A 이중 펌프 구배 예비 HPLC 시스템을 상에서 수행하였다.

F. 펩티드 합성을 위한 일반 과정

Rink Amide-Novagel HL 수지 (0.6 mmol/g)를 고체 지지체로서 사용하였다.

G. 커플링 과정

전형적인 실험에서 첫 번째 아미노산을 0.1 g의 수지 (0.06 mmol) 위에 로딩하였다. NMP 중의 적절한 Fmoc-아미노산 (0.25 M 용액; 0.960 ml)을 수지에 첨가한 후 N-히드록시벤조트리아졸 (NMP 중의 0.5 M; 0.48 ml)을 첨가하고, 반응 블록 (자동 펩티드 합성인 경우) 또는 개별적인 반응 용기 (수동 펩티드 합성인 경우)를 약 2분 동안 흔들었다. 상기 혼합물에 디이소프로필카르보디이드 (NMP 중의 0.5 M; 0.48 ml)를 첨가하고, 그 반응 혼합물을 4시간 동안 주변 온도에서 흔들었다. 그런 다음 반응 블록 또는 개별 반응 용기를 포지티브 압력의 건조 질소의 인가에 의해 반응물을 퍼지하였다.

H. 세척 과정

반응 블록의 각 웰을 1.2 ml의 NMP로 채우고, 블록을 5분 동안 흔들었다. 용액을 질소의 포지티브 압력하에서 배수하였다. 이 과정을 3회 반복하였다. 개별 용기를 사용하는 수동 합성의 경우에는 동일한 과정을, 적절한 부피의 NMP와 함께 사용하였다.

I. Fmoc 보호기의 제거

Fmoc-보호된 아미노산을 포함하고 있는 수지를 1.5 ml의 DMF 중의 20 % 피페리딘 (v/v)으로 처리하고, 반응 블록 또는 개별적인 수동 합성 용기를 15분 동안 흔들었다. 용액을 수지로부터 배수하였다. 이 과정을 1회 반복하고, 수지를 상기에서 설명된 세척 과정을 사용하여 세척하였다.

J. 리간드 ( DOTA 및 CMDOTA )의 최종 커플링

수지 결합된 펩티드 링커 구조의 N-말단 아미노기를 블록제거하고 수지를 세척하였다. 원하는 리간드 및 HBTU의 NMP 중의 0.25 M 용액을 제조하고, 2-배 동등량의 DIEA로 처리하였다. 그 결과의 활성화된 리간드 용액을 수지 (1.972 ml, 0.48 mmol)에 첨가하고, 반응 혼합물을 주변 온도에서 24 내지 30시간 동안 흔들었다. 용액을 배수하고 수지를 세척하였다. 수지의 최종 세척은 1.5 mL의 디클로로메탄으로 3회 수행하였다.

K. 최종 펩티드의 탈보호 및 정제

시약 B의 용액 (2 mL, 88:5:5:2-TFA:페놀:물:TIPS)을 수지에 첨가하고, 반응 블록 또는 개별 용기를 4.5 시간 동안 주변 온도에서 흔들어주었다. 그 결과의 탈보호된 펩티드를 함유하는 용액을 바이알 안으로 배수하였다. 이 과정을 1 mL의 시약 B를 사용하여 2회 더 반복하였다. 여과물을 조합하여 Genevac HT-12 시리즈 II 원심분리 농축기를 사용하여 감압하에 농축하였다. 그런 다음 각 바이알에 있는 잔류물을 2 mL의 Et₂O를 넣어 분쇄하고, 상층액을 따라버렸다. 이 과정을 2회 반복하 여 펩티드를 무색 고체로서 얻었다. 이 미정제 펩티드를 물/아세토니트릴에 용해시키고, Waters XTerra MS Cl 8 예비용 HPLC 칼럼 (50 mm x 19 mm, 5 미크론 입자 크기, 120 Å 기공 크기) 또는 Waters-YMC C18 ODS 칼럼 (250 mm x 30 mm i.d., 10 미크론 입자 크기, 120 Å 기공)을 사용하여 정제하였다. 생성물-함유 분획을 수집하여 HPLC에 의해 분석하였다. 95 % 이상의 순도를 가지는 분획을 모아서 펩티드를 동결건조에 의해 분리하였다.

예비 HPLC (Waters XTerra 칼럼)에 대한 조건:

용출 속도: 50 mL/분; 검출: UV, λ=220 nm;

용출액 A: 0.1 % aq.TFA; 용출액 B: 아세토니트릴 (0/1 % TFA).

HPLC 분석을 위한 조건:

칼럼: Waters XTerra (Waters Co.: 4.6 × 50 mm; MS C18; 5 미크론 입자 크기, 120 Å 기공 크기);

용출 속도: 3 mL/분; 검출: UV, λ=220 nm

용출액 A: 0.1 % aq.TFA; 용출액 B: 아세토니트릴 (0.1 % TFA).

실시예 I - 도 1A-B: L62 의 합성

요약: 도 1A-B에서 알 수 있는 바와 같이, L62를 다음 단계를 사용하여 제조하였다: (3β,5β)-3-아미노콜란-24-오산 메틸 에스테르 A를 NaOH를 사용하여 가수분해하여 상응하는 산 B를 얻었고, 그것을 Fmoc-Cl과 반응시켜서 중간체 C를 얻었다. 옥타펩티드 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ (BBN[7-14][SEQ ID NO:1])로 기능화된 링크 아미드 수지를 차례로 C, Fmoc-글리신 및 DOTA 트리-t-부틸 에스테르와 반응시켰다. 절단하고 시약 B로 탈보호한 후 미정제 생성물을 예비 HPLC로 정제하여 L62를 얻었다. 전체 수율: 2.5 %. 보다 상세한 설명은 아래에 제시한다:

A. 봄베신[7-14]로 기능화된 링크 아미드 수지 (A)

고체상 펩티드 합성 용기 (인클로저 No.1 참조)에서, Fmoc-아미노산 (24 mmol), N-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)(6.37 g; 24 mmol)을 차례로 DMF (45 ml)중의 링크 아미드 NovaGel^TM 수지 (10 g; 6.0 mmol) 현탁액에 첨가하였다. 그 혼합물을 3시간 동안 실온에서 벤치 탑 진동기를 이용하여 흔들어 준 다음 용액을 비우고 수지를 DMF로 세척하였다 (45 mL로 5회). 수지를 DMF (45 mL)중의 25 % 피페리딘과 함께 4분 동안 흔든 다음, 용액을 비우고 새로운 DMF (45 mL)중의 25 % 피페리딘을 첨가하였다. 현탁액을 10분 동안 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMF로 세척하였다 (45 mL로 5회).

이 과정을 차례로 다음 아미노산에 적용하였다: N-α-Fmoc-L-메티오닌, N-a-Fmoc-L-로이신, N-a-Fmoc-N^im-트리틸-L-히스티딘, N-a-Fmoc-글리신, N-a-Fmoc-L-발린, N-a-Fmoc-L-알라닌, N-a-Fmoc-Nⁱⁿ-Boc-L-트립토판.

마지막 커플링 반응에서 N-a-Fmoc-N-y-트리틸-L-글루타민 (14.6 g; 24 mmol), HOBt (3.67 g; 24 mmol), 및 DIC (3.75 mL; 24 mmol)를 DMF (45 mL)중의 수지에 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔든 다음 용액을 제거하고 수지 를 DMF (5×45 mL), CH₂Cl₂ (5×45 mL)로 세척하고 진공건조하였다.

B. 중간체 B 및 C의 제조 (도 1A):

1. (3β,5β)-3- 아미노콜란 -24-오산 (B)의 합성

NaOH 1 M 용액 (16.6 mL; 16.6 mmol)을 MeOH (65 mL)중의 (3β,5β)-3-아미노콜란-24-오산 메틸 에스테르 (5.0 g, 12.8 mmol) 용액에 45 ℃에서 한 방울씩 첨가하였다. 45 ℃에서 3시간 후, 혼합물을 25 mL로 농축하고 H₂O (40 mL) 및 1 M HCl (22 mL)을 첨가하였다. 침전된 고체를 여과하고, H₂0 (2×50 mL)로 세척한 다음 진공 건조하여 B를 백색 고체로서 얻었다 (5.0 g, 13.3 mmol). 수율 80 %.

2. (3β,5β)-3-(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 ) 아미노콜란 -24-오산 (C)의 합성

1,4-디옥산 (9 mL)중의 9-플루오레닐메톡시카르보닐 클로라이드 (0.76 g, 2.93 mmol) 용액을, 0 ℃에서 교반된 10 % aq. Na₂CO₃ (16 mL) 및 1,4-디옥산 (9 mL)중의 (3β,5β)-3-아미노콜란-24-오산 B (1.0 g, 2.66 mmol)의 현탁액에 한 방울씩 첨가하였다. 실온에서 6시간 동안 교반한 후에 H₂O (90 mL)를 첨가하고, 수성상을 Et₂O로 세척한 후 (2×90 mL), 2 M HCl (15 mL)을 첨가하였다 (최종 pH: 1.5). 수성상을 EtOAc로 추출하고 (2×100 mL), 유기상을 Na₂SO₄상에서 건조시킨 다음 증발시켰다. 미정제 생성물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 C를 백색 고체로서 얻었다 (1.2 g, 2.0 mmol). 수율 69 %.

C. L62 (N-[(3β,5β)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라 아자시클로도데스 -1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-콜란-24-일]-L- 글루타미닐 -L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드) (도 1B)의 합성:

수지 A (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 고체상 페비드 합성 용기에서 10분 동안 흔들어 준 다음, 용액을 제거하고 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 그 현탁액을 20분 동안 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). (3β,5β)-3-(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노콜란-24-오산 C (0.72 g, 1.2 mmol), N-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)(0.18 g, 1.2 mmol), N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC)(0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 24시간 동안 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔든 다음, 용액을 비우고 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). N-a-Fmoc-글리신 (0.79 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔든 다음, 용액을 비우고 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척한 후 (5×7 mL), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트 산 트리스(1,1-디메틸에틸)에스테르의 NaCl 부가물 (0.79 g; 1.2 mmol), HOBt (0. 18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL; 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL; 2.4 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B (25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4.5시간 동안 흔들었다. 수지를 여과하고 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제 생성물을 얻었고, 그것을 Et₂O (20 mL)로 분쇄하여 침전을 얻었다. 침전을 원심분리에 의해 수집하여 Et₂O로 세척한 후 (3×20 mL), HPLC에 의해 분석하고 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L62를 백색 고체로서 얻었다 (6.6 mg, 3.8×10^-3 mmol). 수율 4.5 %.

실시예 II - 도 2A - F: L70 , L73 , L74 , L115 및 L116 의 합성

요약: 생성물은 링크 아미드 수지 상에서 옥타펩티드 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ (BBN[7-14][SEQ ID NO:1])(측쇄는 적절히 보호됨)를 상이한 링커와 커플링한 후, DOTA 트리-t-부틸 에스테르로 기능화함으로써 얻었다. 절단 및 시약 B를 사용한 탈보호 후에 최종 생성물을 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 전체 수율 3 내지 9 %.

A. L70 (도 2A)의 제조:

수지 A를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용 기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 Fmoc-4-아미노벤조산 (0.43 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). Fmoc-글리신 (0.36 g; 1.2 mmol), HATU (0.46 g; 1.2 mmol) 및 DIEA (0.40 mL; 2.4 mmol)를 DMA (7 mL)중에서 15분 동안 교반한 후, 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 트리스(1,1-디메틸에틸) 에스테르의 NaCl 부가물 (0.79 g; 1.2 mmol), HOBt (0.18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL; 2.4 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 여과물 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (5 mL)로 분쇄하였다. 침전을 원심분리에 의해 수집하여 Et₂0로 세척한 후 (5×5 mL),HPLC에 의해 분석하고 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하고 있는 분획을 동결건조하여 L70을 백색의 보풀이 선 고체로서 얻었다 (6.8 mg, 0.005 mmol). 수율 3 %.

B. L73 , L115 및 L116 의 합성 (도 2B-2E).

수지 A를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 Fmoc-링커-OH (1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 트리스(1,1-디메틸에틸) 에스테르의 NaCl 부가물 (0.79 g; 1.2 mmol), HOBt (0.18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL; 2.4 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 여과물 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (5 mL)로 분쇄하였다. 침전을 원심분리에 의해 수집하여 Et₂0로 세척한 후 (5×5 mL),HPLC에 의해 분석하고 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하고 있는 분획을 동결건조하였다.

C. L74 의 합성 (도 2F):

수지 A를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 Fmoc-이소니페코트산 (0.42 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). Fmoc-글리신 (0.36 g; 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 트리스(1,1-디메틸에틸) 에스테르의 NaCl 부가물 (0.79 g; 1.2 mmol), HOBt (0.18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL; 2.4 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 여과물 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (5 mL)로 분쇄하였다. 침전을 원심분리에 의해 수집하여 Et₂0로 세척한 후 (5×5 mL), HPLC에 의해 분석하고 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하고 있는 분획을 동결건조하여 L74를 백색의 보풀이 선 고체로서 얻었다 (18.0 mg, 0.012 mmol). 수율 8 %.

실시예 III - 도 3A-E: L67 의 합성

요약: (3β,5β)-3-아미노-12-옥소콜란-24-오산 메틸 에스테르 A를 NaOH로 가수분해하여 상응하는 산 B를 생성하였고, 다음 단계로 Fmoc-글리신과 반응시켜 중간체 C를 생성하였다. 옥타펩티드 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ (BBN [7-14] [SEQ ID NO:1])로 기능화된 링크 아미드 수지를 차례로 C, 및 DOTA 트리-t-부틸 에스테르와 반응시켰다. 절단 및 시약 B로 탈보호한 후 미정제 생생물을 예비 HPLC에 의해 정제하여 L67을 얻었다. 전체 수율: 5.2 %.

A. (3β,5β)-3-아미노-12- 옥소콜란 -24-오산 (B)의 합성 (도 3A)

요약: NaOH (6.6 mL, 6.6 mmol) 1 M 용액을 MeOH (15 mL)중의 (3β,5β)-3-아미노-12-옥소콜란-24-오산 메틸 에스테르 A (2.1 g, 5.1 mmol) 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 45 ℃에서 3시간 동안 교반한 후, 혼합물을 25 mL로 농축한 후 H₂O (25 mL)과 1 M HCl (8 mL)을 첨가하였다. 침전된 고체를 여과하고, H₂O로 세척한 후 (2×30 mL), 진공 건조하여 B를 백색 고체로서 얻었다 (1.7 g, 4.4 mmol). 수율 88 %.

B. (3β,5β)-3-[[(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )아미노]아세틸]아미노-12- 옥소콜 란-24-오산 (C)의 합성 (도 3A)

트리부틸아민 (0.7 mL, 3.1 mmol)을 0 ℃에서 교반된 THF (25 mL)중의 N-a-Fmoc-글리신 (0.9 g, 3.1 mmol) 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 계속해서 이소부틸 클로로포름산염 (0.4 mL, 3.1 mmol)을 첨가하고, 10분 후에 DMF (30 mL)중의 트리부틸아민 (0.6 mL, 2.6 mmol)과 (3β,5β)-3-아미노-12-옥소콜란-24-오산 B (1.0 g, 2.6 mmol)의 현탁액을 1시간에 걸쳐 냉각된 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 그 혼합물을 가온하고 6시간 후에 용액을 40 mL로 농축한 후, H₂O (50 mL) 및 1 N HCl (10 mL)을 첨가하였다 (최종 pH: 1.5). 침전된 고체를 여과하고, H₂O로 세척한 후 (2×50 mL), 진공 건조하고 플래쉬 크로마토그래피에 의하여 정제하여 C를 백색 고체로서 얻었다 (1.1 g, 1.7 mmol). 수율 66 %.

C. L67 (N-[(3β,5β)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라 아자시클로도데스 -1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-12,24- 디옥소콜란 -24-일]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알라닐 -L-발릴-글리실-L- 히스티딜 -L-로이실-L-메티오닌아미드)의 합성 (도 3B 및 도 3F):

수지 D를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 (3β,5β)-3-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노]아세틸]아미노-12-옥소콜란-24-오산 C (0.80 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 트리스(1,1-디메틸에틸) 에스테르의 NaCl 부가물 (0.79 g; 1.2 mmol), HOBt (0.18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL; 2.4 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4.5시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (5 mL)로 분쇄하였다.

실시예 IV - 도 4A-H: L63 및 L64 의 합성

요약: (3β,5β,7a,12a)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산 메틸 에스테르 1b를 NaOH로 가수분해하여 중간체 2b를 얻었고, 다음 단계로 Fmoc-글리신과 반응시켜 3b를 얻었다. 옥타펩티드 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ (BBN [7-14] [SEQ ID NO:1])로 기능화된 링크 아미드 수지를 차례로 3b와 DOTA 트리-t-부틸 에스테르와 반응시켰다. 절단 및 시약 B로 탈보호한 후 미정제 생생물을 예비 HPLC에 의해 정제하여 L64를 얻었다. 동일한 과정을 출발 물질을 중간체 2a로부터 시작하여 반복하여 L63을 얻었다. 전체 수율: 각각 9와 4 %.

A. (3β,5β,7a,12a)-3-아미노-7,12- 디히드록시콜란 -24-오산, (2b)의 합성 (도 4A)

NaOH (130 mL, 0.13 mol)의 1 M 용액을 45 ℃로 가열된 MeOH (300 mL)중의 (3β,5β,7a,12a)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산 메틸 에스테르 1b (42.1 g, 0.10 mol) 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 그것을 45 ℃에서 3시간 동안 교반한 후, 혼합물을 150 mL로 농축하고 H₂O (350 mL)를 첨가하였다. CH₂Cl₂로 추출한 후 (2×100 mL), 수용액을 200 mL로 농축하고, 1 M HCl (150 mL)을 첨가하였다. 침전된 고체를 여과하고, H₂0로 세척한 후 (2×100 mL) 진공 건조하여 2b를 백색 고체로서 얻었다 (34.8 g, 0.08 mol). 수율 80 %.

B. (3β,5β,12a)-3-[[(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )아미노]아세틸]아미노-12- 히 드록시콜란-24-오산 (3a)의 합성 (도 4A)

트리부틸아민 (4.8 mL, 20.2 mmol)을 0 ℃에서 교반된 THF (120 mL)중의 N-a-Fmoc-글리신 (6.0 g, 20.2 mmol) 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 계속해서 이소부틸 클로로포름산염 (2.6 mL, 20.2 mmol)을 첨가하고, 10분 후에 DMF (120 mL)중의 트리부틸아민 (3.9 mL, 16.8 mmol)과 (3β,5β)-3-아미노-12-히드록시콜란-24-오산 2a (6.6 g, 16.8 mmol)의 현탁액을 1시간에 걸쳐 냉각된 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 그 혼합물을 가온하고 6시간 후에 용액을 150 mL로 농축한 후, H₂O (250 mL) 및 1 N HCl (40 mL)을 첨가하였다 (최종 pH: 1.5). 침전된 고체를 여과하고, H₂O로 세척한 후 (2×100 mL), 진공 건조하고 플래쉬 크로마토그래피에 의하여 정제하여 3a를 백색 고체로서 얻었다 (3.5 g, 5.2 mmol). 수율 31 %.

C. (3β,5β,7a,12a)-3-[[(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )아미노]아세틸]아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산 (3b)의 합성 (도 4A)

트리부틸아민 (3.2 mL, 13.5 mmol)을 0 ℃에서 교반된 THF (80 mL)중의 N-a-Fmoc-글리신 (4.0 g, 13.5 mmol) 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 계속해서 이소부틸 클로로포름산염 (1.7 mL, 13.5 mmol)을 첨가하고, 10분 후에 DMF (80 mL)중의 트리부틸아민 (2.6 mL, 11.2 mmol)과 (3β,5β,7a,12a)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산 3a (4.5 g, 11.2 mmol)의 현탁액을 1시간에 걸쳐 냉각된 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 그 혼합물을 가온하고 6시간 후에 용액을 120 mL로 농축한 후, H₂O (180 mL) 및 1 N HCl (30 mL)을 첨가하였다 (최종 pH: 1.5). 침전된 고체를 여과하 고, H₂O로 세척한 후 (2×100 mL), 진공 건조하고 플래쉬 크로마토그래피에 의하여 정제하여 3a를 백색 고체로서 얻었다 (1.9 g, 2.8 mmol). 수율 25 %.

또 다른 방법으로 (3β,5β,7a,12a)-3-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노]아세틸]아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산 (3b)를 다음과 같이 제조할 수 있다:

N-히드록시숙신이미드 (1.70 g, 14.77 mmol)와 DIC (1.87 g, 14.77 mmol)를 차례로 디클로로메탄 (15 mL)중의 Fmoc-Gly-OH (4.0 g, 13.45 mmol)의 교반된 용액에 첨가하고, 그 결과의 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 형성된 N,N'-디이소프로필우레아를 여과에 의해 제거하고, 고체를 에테르 (20 mL)로 세척하였다. 휘발성 물질을 제거하고 형성된 고체 Fmoc-Gly-숙신이미딜 에스테르를 에테르로 세척하였다 (3×20 mL). 그런 다음 Fmoc-Gly-숙신이미딜 에스테르를 건조 DMF (15 mL)에 재용해하고, 3-아미노데옥시콜산 (5.21 g, 12.78 mmol)을 투명한 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 후 물 (200 mL)을 첨가하고, 침전된 고체를 여과하고, 물로 세척한 후, 건조하고 실리카 겔 크로마토그래피 (TLC (실리카):(R_f0.50, 실리카겔, CH₂Cl₂/CH₃OH, 9:1)(용출제: CH₂Cl₂/CH₃OH (9:1))로 정제하여 (3β,5β,7a,12a)-3-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노]아세틸]아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산을 무색 고체로서 얻었다. 수율: 7.46 g (85 %).

D. L63 (N-[(3β,5β,12a)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테 트라아자시클로도데스 -1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-12-히드록시-24- 옥소콜란 -24-일]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알라닐 -L-발릴-글리실-L- 히스티딜 -L-로이실- L-메티오닌아미드)의 합성 (도 4B)

수지 A (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 (3β,5β,12a)-3-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노]아세틸]아미노-12-히드록시콜란-24-오산 3a (0.82 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 트리스(1,1-디메틸에틸) 에스테르의 NaCl 부가물 (0.79 g; 1.2 mmol), HOBt (0.18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL; 2.4 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (5 mL)로 처리한 후에 침전을 얻었다. 침전을 원심분리에 의해 수집하여 Et₂0로 세척한 후 (5×5 mL), HPLC에 의해 분석하고 정제하였다. 생성물을 함유하고 있는 분획을 동결건조하여 L63을 백색의 보풀이 선 고체로서 얻었다 (12.8 mg, 0.0073 mmol). 수율 9 %.

E. L64 (N-[(3β,5β,7a,12a)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10- 테트라아자시클로도데스 -1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-7,12-디히드 록시 -24- 옥소콜란 -24-일]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알라닐 -L-발릴-글리실-L- 히스 티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드)의 합성 (도 4C)

수지 A (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 (3β,5β,7a,12a)-3-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노]아세틸]아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산 3b (0.81 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 트리스(1,1-디메틸에틸) 에스테르의 NaCl 부가물 (0.79 g; 1.2 mmol), HOBt (0.18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL; 2.4 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (5 mL)로 분쇄하였다. 침전을 원심분리에 의해 수집하여 Et₂0로 세척하였다 (5×5 mL). 그런 다음 그것을 H₂0 (20 mL)에 녹이고, Na₂CO₃ (0.10 g, 0.70 mmol)을 첨가하고, 그 결과의 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 용액을 HPLC에 의해 정제하고, 생성물을 함유하고 있는 분획을 동결건조하여 L64를 백색의 보풀이 선 고체로서 얻었다 (3.6 mg, 0.0021 mmol). 수율 4 %.

실시예 V - 도 5A-E: L71 및 L72 의 합성

요약: 생성물은 두 단계로 얻었다. 첫 번째 단계는 상기에서 설명된 링크 아미드 수지 상에서 옥타펩티드 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ (BBN[7-14] [SEQ ID NO:1]) (적절한 측쇄 보호기 포함)의 고체상 합성이었다. 두 번째 단계는 상이한 링커와의 커플링 후 DOTA 트리-t-부틸 에스테르를 사용한 기능화였다. 절단 및 시약 B를 사용한 탈보호 후에 최종 생성물을 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 전체 수율은 3 내지 9 %였다.

A. 봄베신 [7-14] 기능화 및 절단 과정 (도 5A 및 5D)

수지 B (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 Fmoc-링커-OH (1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하였다. 그 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 트리스(1,1-디메틸에틸) 에스테르의 NaCl 부가물 C (0.79 g; 1.2 mmol), HOBt (0.18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL; 2.4 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔들어 주었다. 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 여과물을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 에테르 (5 mL)로 분쇄하였다. 침전을 원심분리에 의해 수집하여 에테르로 세척한 후 (5×5 mL), 분석용 HPLC에 의하여 분석하고 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하고 있는 분획을 동결건조하였다.

B. 생성물

1. L71 (4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데 스-1-일]아세틸]아미노]메틸]벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드)

생성물은 백색의 보풀이 선 고체로서 얻었다 (7.3 mg, 0.005 mmol). 수율 7.5 %.

2. L72 (트란스-4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]메틸]시클로헥실카르보닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드)

생성물은 백색의 보풀이 선 고체로서 얻었다 (7.0 mg, 0.005 mmol). 수율 4.8 %.

C. 트란스 -4-[[[(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )카르보닐]아미노] 메틸 ] 시클로헥산 카르복실산 (D) (도 5E)

1,4-디옥산 (40 mL)중의 N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐옥시)숙신이미드 (4.4 g, 14.0 mmol)의 용액을 10 % Na2CO3 (30 mL)중의 트란스-4-(아미노메틸)시클로헥산카르복실산 (2.0 g, 12.7 mmol) 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 그런 다음 혼합물을 1 N HCl (32 mL)로 최종 pH가 2가 될 때까지 처리하였다. 그 결과의 용액을 n-BuOH (100 mL)로 추출하고, 휘발성 물질을 제거한 후, 미정제 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 D를 백색 고체로서 얻었다 (1.6 g, 4.2 mmol). 수율 33 %.

실시예 VI - 도 6A-F: L75 및 L76 의 합성

요약: 두 개의 생성물은 링크 아미드 수지 상에서 옥타펩티드 Gln-Trp-Ala- Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ (BBN[7-14] [SEQ ID NO:1]) (A)를 두 개의 링커 E 및 H와 커플링한 후 DOTA 트리-t-부틸 에스테르로 기능화함으로써 제조하였다. 절단 및 시약 B를 사용한 탈보호 후에 최종 생성물을 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 전체 수율: 8.5 % (L75) 및 5.6 % (L76).

A. 2-[(1,3- 디히드로 -1,3- 디옥소 -2H- 이소인돌 -2-일) 메틸 ]벤조산 (C) (도 6A)

생성물은 문헌에 보고된 과정을 따라 합성하였다 (Bornstein, J; Drummon, P. E.; Bedell, S. F. Org Synth. Coll. Vol. IV 1963, 810-812).

B. 2-( 아미노메틸 )벤조산 (D) (도 6A)

메틸아민의 40 % 용액 (6.14 mL, 7.1 mmol)을 2-[(1,3-디히드로-1,3-디옥소-2H-이소인돌-2-일)메틸]벤조산 C (2 g, 7.1 mmol)에 첨가한 후 EtOH (30 mL)를 첨가하였다. 그것을 실온에서 5분 동안 교반한 후에 반응 혼합물을 50 ℃로 가열하였다. 2.5시간 후에 혼합물을 냉각시키고, 용매를 감압하에 증발시켰다. 미정제 생성물을 50 mL의 순수 에탄올에 현탁시키고, 그 현탁액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하고 EtOH로 세척하여 2-(아미노메틸)벤조산 D (0.87 g, 5.8 mmol)을 얻었다. 수율 81 %.

C. 2-[[[9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )카르보닐]아미노] 메틸 ]벤조산 (E) (도 6A)

생성물은 문헌에 보고된 과정을 따라 합성하였다 (Sun, J-H.; Deneker, W. F. Synth. Commun. 1998, 28, 4525-4530).

D. 4-( 아미노메틸 )-3- 니트로벤조산 (G) (도 6B)

4-(브로모메틸)-3-니트로벤조산 (3.2 g, 12.3 mmol)을 EtOH (300 mL)중의 8 % NH₃에 녹이고, 그 결과의 용액을 실온에서 교반하였다. 22시간 후에 용액을 증발시키고, 잔류물을 H₂O (70 mL)에 현탁시켰다. 현탁액을 15분 동안 교반하고 여과하였다. 수집한 고체를 H₂O (40 mL)에 현탁하고, 몇 방울의 25 % NH₄OH (pH 12)를 첨가함으로써 녹인 후, 용액의 pH를 6 N HCl을 첨가하여 6으로 조정하였다. 침전된 고체를 여과하고, 차례로 MeOH (3×5 mL), Et₂O (10 mL)로 세척하고, 진공건조하여 (1.3 kPa, P₂O₅) 4-(아미노메틸)-3-니트로벤조산을 담갈색 고체로서 얻었다 (1.65 g, 8.4 mmol). 수율 68 %.

E. 4-[[[(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )카르보닐]아미노] 메틸 ]-3- 니트로벤조산 (H) (도 6B)

4-(아미노메틸)-3-니트로벤조산 G (0.8 g, 4 mmol)를 10 %의 aq. Na₂CO₃ (25 mL) 및 1,4-디옥산 (10 mL)에 녹이고, 그 용액을 0 ℃로 냉각하였다. 1,4-디옥산 (10 mL)중의 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트 (Fmoc-Cl)(1.06 g, 4 mmol) 용액을 20분 동안 한 방울씩 첨가하였다. 0 내지 5 ℃에서 2시간 및 10 ℃에서 1시간 후에 반응 혼합물을 여과하고, 용액을 1 N HCl을 첨가함으로써 pH 5로 산성화하였다. 침전물을 여과하고, H₂0로 세척하고 (2×2 mL), 진공 건조하여 (1.3 kPa, P₂O₅) 4-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]메틸]-3-니트로벤조산을 백색 고체로서 얻었다 (1.6 g, 3.7 mmol). 수율 92 %.

F. L75 (N-[2-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로 도데스 -1-일]아세틸]아미노] 메틸 ] 벤조일 ]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알라닐 -L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드) (도 6C)

수지 A (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 2-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]메틸]벤조산, E (0.45 g, 1.2 mmol), N-히드록시벤조트리아졸 ( HOBt) (0.18 g, 1.2 mmol), N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC) (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 트리스(1,1-디메틸에틸) 에스테르의 NaCl 부가물 (DOTA 트리-t-부틸 에스테르) (0.79 g; 1.2 mmol), HOBt (0.18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL; 2.4 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플 라스크에서 4.5시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 여과물을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (20 mL)로 처리한 후에 침전을 얻었다. 그 결과의 침전을 원심분리에 의해 수집하여 Et₂0로 세척하여 (3×20 mL) L75를 백색의 고체로서 얻었다 (190 mg, 0.13 mmol). 수율 44 %.

G. L76 (N-[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로 도데스 -1-일]아세틸]아미노] 메틸 ]-3- 니트로벤조일 ]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드) (도 6D)

수지 A (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 4-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]메틸]-3-니트로벤조산, H (0.50 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). DOTA 트리-t-부틸 에스테르 (0.79 g; 1.2 mmol), HOBt (0.18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL; 2.4 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼 합물을 24시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4.5시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (20 mL)로 처리하였다. 그 침전을 원심분리에 의해 수집하여 Et₂0로 세척하여 (3×20 mL) 고체를 얻었고 (141 mg), 그것을 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제물의 37 mg을 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L76을 백색의 고체로서 얻었다 (108 mg, 7.2×10^-3 mmol). 수율 9 %.

실시예 VII - 도 7A-C: L124 의 합성

요약: 4-시아노페놀 A를 아세톤 중의 에틸 브로모아세테이트 및 K₂CO₃와 반응시켜서 중간체 B를 얻었고, 그것을 NaOH로 가수분해하여 상응하는 산 C를 얻었다. 계속해서 C를 EtOH/CHCl₃ 중에서 H₂와 PtO₂로 수소처리하여 상응하는 아미노산 D를 얻었고, 그것을 직접 FmocOSu로 보호하여 E를 얻었다. 옥타펩티드 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ (BBN [7-14] [SEQ ID NO:1])로 기능화된 링크 아미드 수지를 E와 반응시킨 후 DOTA 트리-t-부틸 에스테르와 반응시켰다. 절단 및 시약 B를 사용한 탈보호 후에 미정제물을 예비 HPLC로 정제하여 L124를 얻었다. 전체 수율: 1.3 %.

A. (4- 시아노페녹시 )아세트산 에틸 에스테르 (B)의 합성 (도 7A)

생성물을 문헌에 보고된 과정을 따라 합성하였다 (Archimbault, P.; LeClerc, G.; Strosberg, A. D.; Pietri-Rouxel, F. PCT Int. Appl. WO 980005, 1998).

B. (4-시아노페녹시)아세트산 (C)의 합성 (도 7A)

NaOH의 1 N 용액 (7.6 mL, 7.6 mmol)을 MeOH (15 mL)중의 (4-시아노페녹시)아세트산 에틸 에스테르 B (1.55 g, 7.6 mmol) 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 1시간 후에 그 용액을 1 N HCl (7.6 mL, 7.6 mmol)로 산성화하고, 증발시켰다. 잔류물을 물 (20 mL)에 취하고 CHCl₃로 추출하였다 (2×30 mL). 유기층을 증발시키고 미정제물을 플래쉬 크로마토그래피에 의하여 정제하여 (4-시아노페녹시)아세트산 C를 백색 고체로서 얻었다 (0.97 g, 5.5 mmol). 수율 72 %.

C. [4-[[[(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )카르보닐]아미노] 메틸 ] 페녹시 ]아세트산 (E)의 합성 (도 7A)

PtO₂ (150 mg)를 EtOH (147 mL) 및 CHCl₃ (3 mL)중의 (4-시아노페녹시)아세트산 C (1.05 g, 5.9 mmol)의 용액에 첨가하였다. 그 현탁액을 30시간 동안 수소 분위기 하에서 (355 kPa, 20 ℃) 교반하였다. 혼합물을 셀라이트R 패드를 통하여 여과하고, 용액을 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의하여 정제하여 산 D를 얻었고 (0.7 g), 그것을 H₂O (10 mL), MeCN (2 mL) 및 Et₃N (0.6 mL)에 0 ℃에서 녹인 후, MeCN (22 mL)중의 N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐옥시)숙신이미드 (1.3 g, 3.9 mmol)를 한 방울씩 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후 반응 혼합물을 여과하고 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 잔류물을 1 N HCl (10 mL)로 처리하고, 침전된 고체를 여과한 후, 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 [4-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]메틸]페녹시]아세트산 E를 백색 고체로서 얻었다 (0.56 g, 1.4 mmol). 전체 수율 24 %.

D. L124 (N-[[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클 로도데스 -1-일]아세틸]아미노] 메틸 ] 페녹시 ]아세틸]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드)의 합성 (도 7B)

수지 A (480 mg, 0.29 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 [4-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]메틸]페녹시]아세트산, E (480 mg, 1.19 mmol), N-히드록시벤조트리아졸 (HOBt) (182 mg, 1.19 mmol), N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC) (185 μL, 1.19 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 트리스(1,1-디메틸에틸) 에스테르의 NaCl 부가물 (750 mg, 1.19 mmol), HOBt (182 mg; 1.19 mmol), DIEA (404 μL; 2.36 mmol), DIC (185 μL, 1.19 mmol), 및 DMA (6 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 여과물을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (5 mL)로 처리하였다. 그 침전을 원심분리에 의해 수집하고 Et₂0로 세척하여 (5×5 mL) 고체를 얻었고 (148 mg), 그것을 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제물의 65 mg을 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L124를 백색의 고체로서 얻었다 (15 mg, 0.01 mmol). 수율 7.9 %.

실시예 VIII - 도 8A-C: L125 의 합성

요약: 4-(브로모메틸)-3-메톡시벤조산 메틸 에스테르 A를 DMF 중의 NaN₃와 반응시켜서 중간체 아지드 B를 얻었고, 그것을 Ph₃P 및 H₂O로 환훤시켜서 아민 C를 얻었다. C를 NaOH로 가수분해하여 산 D를 얻었고, 그것을 FmocOSu로 직접 보호하여 E를 얻었다. 옥타펩티드 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ (BBN[7-14] [SEQ ID NO:1])로 기능화된 링크 아미드 수지를 E와 반응시킨 후 DOTA 트리-t-부틸 에스테르와 반응시켰다. 절단 및 시약 B를 사용한 탈보호 후에 미정제물을 예비 HPLC로 정제하여 L125를 얻었다. 전체 수율: 0.2 %.

A. 4-( 아지도메틸 )-3- 메톡시벤조산 메틸 에스테르 (B)의 합성 (도 8A)

DMF (90 mL)중의 4-(브로모메틸)-3-메톡시벤조산 메틸 에스테르 (8 g, 31 mmol)와 NaN₃ (2 g, 31 mmol)의 용액을 밤새 실온에서 교반하였다. 휘발성 물질을 진공하에 제거하고, 미정제 생성물을 EtOAc (50 mL)에 녹였다. 그 용액을 물로 세척하고 (2×50 mL) 건조시켰다. 휘발성 물질을 증발시켜서 4-(아지도메틸)-3-메톡시벤조산 메틸 에스테르 (6.68 g, 30 mmol)를 얻었다. 수율 97 %.

B. 4-( 아미노메틸 )-3- 메톡시벤조산 메틸 에스테르 (C) (도 8A)

트리페닐포스핀 (6.06 g, 23 mmol)을 THF (50 mL)중의 (4-아지도메틸)-3-메톡시벤조산 메틸 에스테르 B (5 g, 22 mmol) 용액에 첨가하고, 수소 발생과 백색 고체 형성을 관찰하였다. 혼합물을 질소 하에서 실온에서 교반하였다. 24시간 후에 더 많은 트리페닐포스핀 (0.6 g, 2.3 mmol)을 첨가하였다. 24시간 후에 아지드를 소모하였고 H₂O (10 mL)을 첨가하였다. 4시간 후에 백색 고체는 소멸되었다. 혼합물을 45 ℃에서 3시간 동안 가열하고, 밤새 실온에서 교반하였다. 용액을 건고상태로 증발시키고, 미정제물을 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 4-(아미노메틸)-3-메톡시벤조산 메틸 에스테르 C (1.2 g, 6.1 mmol)를 얻었다. 수율 28 %.

C. 4-[[[(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )카르보닐]아미노] 메틸 ]-3- 메톡시벤조산 (E) (도 8A)

1 N의 NaOH 용액 (6.15 mL, 6.14 mmol)을 40 ℃로 가열된 MeOH (25 mL)중의 4-(아미노메틸)-3-메톡시벤조산 메틸 에스테르 C (1.2 g, 6.14 mmol)의 용액에 첨가하였다. 45 ℃에서 8시간 동안 교반한 후에 그 용액을 밤새 실온에서 교반하였 다. 그 현탁액을 30시간 동안 수소 분위기 하에서 (355 kPa, 20 ℃) 교반하였다. 1 N의 NaOH 용액 (0.6 mL, 0.6 mmol)을 첨가하고 그 혼합물을 40 ℃에서 4시간 동안 가열하였다. 용액을 농축하고, 1 N HCl로 산성화한 후 (8 mL, 8 mmol), EtOAc로 추출한 다음 (2×10 mL), 수성층을 15 mL로 농축하였다. 이 용액 (pH 4.5)을 0 ℃로 냉각하고 Et₃N (936 μL, 6.75 mmol)을 첨가하였다 (pH 11). MeCN (30 mL)중의 N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐옥시)숙신이미드 (3.04 g, 9 mmol)를 한 방울씩 첨가하였고 (최종 pH 9), 백색 고체가 침전되었다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후 고체를 여과하고, 1 N HCl (15 mL)에 현탁시킨 다음, 현탁액을 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과하여 4-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]메틸]-3-메톡시벤조산 E를 백색 고체로서 얻었다 (275 mg, 0.7 mmol).

여과물을 진공하에 증발시키고, 그 결과의 백색 잔류물을 1 N HCl (20 mL)에 현탁시키고 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과하고 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 더 많은 산 E를 얻었다 (198 mg, 0.5 mmol). 전체 수율 20 %.

D. L125 (N-[[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클 로도데스 -1-일]아세틸]아미노] 메틸 ]-3- 메톡시벤조일 ]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드) (도 8B)

수지 A (410 mg, 0.24 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거 하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 4-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]메틸]-3-메톡시벤조산, E (398 mg, 0.98 mmol), HOBt (151 mg, 0.98 mmol), DIC (154 μL, 0.98 mmol) 및 DMA (6 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (6 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (6 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 트리스(1,1-디메틸에틸) 에스테르의 NaCl 부가물 (618 mg, 0.98 mmol), HOBt (151 mg; 0.98 mmol), DIC (154 μL, 0.98 mmol), DIEA (333 μL; 1.96 mmol), 및 DMA (6 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 여과물을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (5 mL)로 분쇄하였다. 그 결과의 침전을 원심분리에 의해 수집하여 Et₂0로 세척하고 (5×5 mL), 그것을 HPLC에 의해 분석하고 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L125 (도 8C)를 백색의 고체로서 얻었다 (15.8 mg, 0.011 mmol). 수율 4.4 %.

실시예 IX - 도 9A-9D: L146 , L233 , L234 , 및 L235 의 합성

요약: 생성물들은 링크 아미드 수지 상에서 옥타펩티드 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ (BBN[7-14](A)로부터 출발하여 여러 단계로 제조하였다. 최종 절단 및 시약 B를 사용한 탈보호 후에 미정제물을 예비 HPLC에 의해 정제하여 L146, L233, L234 및 L235를 얻었다. 전체 수율: 각각 10 %, 11 %, 4.5 %, 5.7 %.

A. 3-[[[(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )카르보닐]아미노]아세틸] 아미노벤조산 , B (도 9A)

THF (20 mL)중의 3-아미노벤조산 (0.5 g, 3.8 mmol) 및 N-에틸디이소프로필아민 (DIEA)(0.64 mL, 3.8 mmol)을 THF (10 mL) 및 CH₂Cl₂ (10 mL)중의 Fmoc-글리신 클로라이드 (1.2 g, 4.0 mmol)(3)의 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 실온에서 24시간 후에 1 M HCl (50 mL)을 첨가하였다 (최종 pH 1.5). 침전을 여과하고, H₂O로 세척한 후 (2×100 mL), 진공 건조하고 CHCl₃/CH₃OH(1:1)로부터 결정화하여 B를 백색 고체로서 얻었다 (0.7 g, 1.6 mmol). 수율 43 %.

B. N-[3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노] 벤조일 ]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알라닐 -L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드, L233 (도 9D)

수지 A (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다.

현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 3-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]아세틸]아미노벤조산, B (0.50 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 6시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). DOTA 트리-t-부틸 에스테르의 NaCl₂ 부가물 (0.79 g, 1.2 mmol)(5), HOBt (0.18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL; 2.4 mmol), 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4.5시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (20 mL)로 처리하였다. 침전을 원심분리에 의해 수집하고 Et₂0로 세척하여 (3×20 mL) 고체 (152 mg)를 얻었고, 그것을 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제물의 일정량 (50 mg)을 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L233을 백색의 고체로서 얻었다 (17.0 mg, 11.3×10^-3 mmol). 수율 11 %.

C. N-[4-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데 스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노] 페닐아세틸 ]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알라닐 -L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드, L146 (도 9D)

수지 A (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 여과하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 Fmoc-4-아미노페닐아세트산 (0.45 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 6시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 여과하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 여과한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 여과하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). Fmoc-글리신 (0.36 g, 1.2 mmol), HATU (0.46 g, 1.2 mmol) 및 DIEA (0.40 mL; 2.4 mmol)을 15분 동안 DMA (7 mL)중에서 교반한 후, 그 용액을 수지에 첨가하고, 그 혼합물을 2시간 동안 실온에서 흔들어 준 다음, 용액을 여과한 후 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). DOTA 트리-t-부틸 에스테르의 NaCl 부가물 (0.79 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), DIEA (0.40 mL; 2.4 mmol), 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 여과한 후 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4.5시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (20 mL)로 처리하여 침전을 얻었다. 침전을 원심분리에 의해 수집하고 Et₂0로 세척하여 (3×20 mL) 고체 (203 mg)를 얻었고, 그것을 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제물의 일정량 (50 mg)을 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L146을 백색의 고체로서 얻었다 (11.2 mg, 7.4×10^-3 mmol). 수율 10 %.

D. 6-[[[(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )카르보닐]아미노]아세틸] 아미노나프토산 ,C (도 9B)

THF (20 mL)중의 6-아미노나프토산 (500 mg, 2.41 mmol) 및 DIEA (410 μL, 2.41 mmol)을 CH₂Cl₂/THF 1:1 (10 mL)중의 Fmoc-글리신 클로라이드 (760 mg, 2.41 mmol)의 용액에 한 방울씩 첨가하고, 실온에서 교반하였다. 24시간 후에 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 0.5 N HCl (50 mL)에 넣어 1시간 동안 교반하였다. 침전된 백색 고체를 여과하고, 건조시켰다. 백색 침전을 메탄올 (30 mL)에 현탁시키고, 5분 동안 끓인 후 여과하여 생성물 C를 얻었다 (690 mg, 1.48 mmol). 수율 62 %.

E. N-[6-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노] 나프토일 ]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알라 닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드, L234

수지 A (500 mg, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고 체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 여과하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 6-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]아세틸]아미노나프토산 C (560 mg, 1.2 mmol), HOBt (184 mg, 1.2 mmol), DIC (187 μL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 6시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (6 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 여과한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). DOTA 트리-t-부틸 에스테르의 NaCl 부가물 (757 mg, 1.2 mmol), HOBt (184 mg, 1.2 mmol), DIC (187 μL, 1.2 mmol), DIEA (537 μL; 2.4 mmol), 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 플라스크에서 흔들고, 용액을 여과한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4.5시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (20 mL)로 처리하여 침전을 얻었다. 침전을 원심분리에 의해 수집하고 Et₂0로 세척하여 (3×20 mL) 고체 (144 mg)를 얻었고, 그것을 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제물의 일정량 (54 mg)을 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L234를 백색의 고체로서 얻었다 (8 mg, 5.1×10^-3 mmol). 수율 4.5 %.

F. 4-[[[[(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )카르보닐]아미노]아세틸] 메틸아미노 ]벤조산, D (도 9C)

THF (20 mL)중의 4-N-메틸아미노나프토산 (500 mg, 3.3 mmol) 및 DIEA (562 μL, 3.3 mmol)을 CH₂Cl₂/THF 1:1 (10 mL)중의 Fmoc-글리신 클로라이드 (1.04 g, 3.3 mmol)의 용액에 첨가하고, 실온에서 교반하였다. 24시간 후에 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 0.5 N HCl (30 mL)에 넣어 3시간 동안 0 ℃에서 교반하였다. 침전된 백색 고체를 여과하고, 건조시켰다. 미정제물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 D를 얻었다 (350 mg, 0.81 mmol). 수율 25 %.

G. N-[4-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸] 메틸아미노 ] 벤조일 ]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알 라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드, L235 (도 9D)

수지 A (500 mg, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 여과하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 4-[[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]아세틸]-N-메틸]아미노-벤조산 D (510 mg, 1.2 mmol), HOBt (184 mg, 1.2 mmol), DIC (187 μL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 6시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔 들고, 용액을 여과한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). DOTA 트리-t-부틸 에스테르의 NaCl 부가물 (757 mg, 1.2 mmol), HOBt (184 mg, 1.2 mmol), DIC (187 μL, 1.2 mmol), DIEA (537 μL; 2.4 mmol), 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 플라스크에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4.5시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (20 mL)로 처리하여 침전을 얻었다. 침전을 원심분리에 의해 수집하고 Et₂0로 세척하여 (3×20 mL) 고체 (126 mg)를 얻었고, 그것을 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제물의 일부 (53 mg)를 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L235를 백색의 고체로서 얻었다 (11 mg, 7.2×10^-3 mmol). 수율 5.7 %.

실시예 X - 도 10A-B: L237 의 합성

요약: 1-포르밀-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 (A)을 선택적으로 벤질 클로로포르메이트로 pH 3에서 보호하여 B를 얻었고, 그것을 t-부틸 브로모아세테이트로 알킬화한 다음 히드록실아민 염산염으로 탈보호하여 D를 얻었다. P(OtBu)3 및 파라포름알데히드와의 반응으로 E를 얻었고, 그것을 수소화에 의해 탈보호하고 벤질 브로모아세테이트로 알킬화하여 G를 얻었고, 최종적으로 H로 수소화하였다. 옥 타펩티드 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ (BBN[7-14] [SEQ ID NO:1])로 기능화된 링크 아미드 수지를 차례로 Fmoc-4-아미노벤조산, Fmoc-글리신 및 H와 반응시켰다. 절단 및 시약 B를 사용한 탈보호 후에 미정제물을 예비 HPLC에 의해 정제하여 L237을 얻었다. 전체 수율 0.21 %.

A. 7- 포르밀 -1,4,7,10- 테트라아자시클로도데칸 -1- 카르복실산 페닐메틸 에스테르 디히드로클로라이드 , B (도 10A)

1-포르밀-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 A (14 g, 69.9 mmol)를 H₂O (100 mL) 및 12 N HCl (11 mL)에 pH가 3이 될 때까지 녹인 후, 1,4-디옥산 (220 mL)을 첨가하였다. 1,4-디옥산 (15 mL)중의 벤질 클로로포르메이트 (13.8 g, 77 mmol) 용액을 3.5시간 안에 서서히 한 방울씩 첨가하는데, 이때 반응 혼합물에 2 N NaOH (68.4 mL)를 pHstat 장치를 사용하여 계속 첨가함으로써 pH를 3으로 유지하였다. 첨가가 끝났을 때 반응물을 1시간 동안 교반한 후 n-헥산으로 세척하고 (4×100 mL), Pr₂O로 세척하였다 (4×100 mL). 수성층을 10 N HaOH (6.1 mL)를 첨가하여 pH 13으로 만들고, CHCl₃로 추출하였다 (4×100 mL). 유기층을 식염수로 세척하고 (100 mL), 건조시킨 후 (Na₂SO₄), 여과하고 증발시켰다. 유상 잔류물을 아세톤 (200 mL)에 녹이고, 6 N HCl (26 mL)을 첨가하였다. 침전된 고체를 여과하고, 아세톤으로 세척한 다음 (2×50 mL), 진공 건조하여 화합물 B를 백색 결정성 고체로서 얻었다 (23.6 g, 58 mmol). TNDBF 83 %.

B. 4-( 페닐메톡시 )카르보닐-1,4,7,10- 테트라아자시클로도데칸 -1,7- 디아세트 산 비스(1,1-디메틸에틸)에스테르 , D (도 10A)

H₂O (450 mL) 및 1 N NaOH (74 mL, 74 mmol)중의 B (14.4 g, 35.3 mmol)의 용액을 20분 동안 교반한 후, CHCl₃로 세척하였다 (4×200 mL). 유기층을 증발시켜서 유상 잔류물 (123 g)을 얻었고, 그것을 CH₃CN (180 mL) 및 N-에틸디이소프로필아민 (DIEA)(15 mL, 88.25 mmol)에 녹였다. CH₃CN (15 mL)중의 t-부틸 브로모아세테이트 (16.8 g, 86.1 mmol) 용액을 앞의 용액에 2.5 시간에 걸쳐 한 방울씩 첨가하였다. 실온에서 20시간 후에 용매를 증발시키고, 유상 잔류물을 CH₃Cl (150 mL)에 녹인 후 H₂O로 세척하였다 (5×100 mL). 유기층을 건조시키고 (Na₂SO₄), 여과한 후, 건고 상태로 증발시켜서 C를 노란색 오일로서 얻었다. 미정제 C (22 g)를 EtOH (250 mL)에 녹이고, NH₂OHㆍHCl (2.93 g, 42.2 mmol)을 첨가한 후, 용액을 환류 온도로 가열하였다. 48시간 후에 용매를 증발시키고 잔류물을 CH₂Cl₂ (250 mL)에 녹인 다음, H₂O로 세척한 후 (3×250 mL), 식염수로 세척하였다 (3×250 mL). 유기층을 건조시키고 (Na₂SO₄), 여과한 후 증발시켰다. 유상 잔류물 (18.85 g)을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 수집하여 증발시켜서 유리질의 백색 고체 (17.62 g)를 얻었고, 그것을 H₂O (600 mL) 및 1 N NaOH (90 mL, 90 mmol)에 녹인 다음 CHCl₃로 추출하였다 (3×250 mL). 유기층을 건조시키고 (Na₂SO₄), 건고 상태로 증발시켜서 D를 얻었다 (16.6 g, 31 mmol). 수율 88 %.

C. 4-( 페닐메톡시 )-카르보닐-10-[[비스(1,1- 디메틸에톡시 ) 포스피닐 ] 메틸 ]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,7-디아세트산 비스 (1,1-디메틸에틸) 에스테르, E (도 10A)

화합물 D (13.87 g, 26 mmol), P(OtBu)₃ (7.6 g, 28.6 mmol)(10) 및 파라포름알데히드 (0.9 g, 30 mmol)의 혼합물을 60 ℃에서 가열하였다. 16시간 후에 더 많은 P(OtBu)₃ (1 g, 3.76 mmol) 및 파라포름알데히드 (0.1 g, 3.33 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 60 ℃에서 다시 20시간 동안 가열한 후 80 ℃에서 진공하에 가열하여 휘발성 불순물을 제거하였다. 미정제물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 E (9.33 g, 8 mmol)를 오일로서 얻었다. 수율 31 %.

D. 7-[[비스(1,1- 디메틸에톡시 ) 포스피닐 ] 메틸 ]-1,4,7,10- 테트라아자시클로도 데칸-1,4,10-트리아세트산 1- 페닐메틸 -4,10- 비스 (1,1-디메틸에틸) 에스테르, G (도 10A)

CH₃OH (160 mL)중의 E (6.5 g, 5.53 mml)의 용액에 5 % Pd/C (1 g, 0.52 mmol)를 첨가하고, 그 혼합물을 수소 분위기하에서 및 실온에서 교반하였다. 4시간 후 (165 mL, 6.7 mmol의 H₂ 사용), 혼합물을 밀리포어^R 필터 (FT 0.45 ㎛)를 통하여 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켰다. 미정제 생성물 (5.9 g)을 플래쉬 크로마토 그래피에 의하여 정제하여 F (4.2 g)를 오일로서 얻었다. 벤질 브로모아세테이트 (1.9 g, 8.3 mmol)를 CH₃CN (8 mL)에 녹이고, 1시간에 걸쳐서 CH₃CN (40 mL) 및 DIEA (1.5 mL, 8.72 mmol) 중의 F (4.2 g) 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 실온에서 36시간 후에 용매를 증발시키고, 잔류물 (5.76 g)을 CHCl₃ (100 mL)에 녹인 다음 H₂O (2×100 mL) 및 식염수로 (2×70 mL) 세척하였다. 유기층을 건조시키고 (Na₂SO₄), 여과한 후 증발시켰다. 미정제 생성물 (5.5 g)을 플래쉬 크로마토그래피에 의하여 2회 정제하고, 분획을 수집하여 건고상태로 증발시켜서 G (1.12 g, 1.48 mmol)를 오일로서 얻었다. 수율 27 %.

E. 7-[[비스(1,1- 디메틸에톡시 ) 포스피닐 ] 메틸 ]-1,4,7,10- 테트라아자시클로도 데칸-1,4,10-트리아세트산 4,10- 비스 (1,1-디메틸에틸) 에스테르, H (도 10A)

5 % Pd/C (0.2 g, 0.087 mmol)를 CH3OH (27 mL)중의 G (1.12 g, 1.48 mmol) 용액에 첨가하고, 그 혼합물을 수소 분위기 하에서 및 실온에서 교반하였다. 2시간 후 165 mL, 6.7 mmol의 H₂ 사용), 혼합물을 밀리포어^R 필터 (FT 0.45 ㎛)를 통하여 여과하고, 용액을 건고상태로 증발시켜서 H를 담황색 오일로서 얻었다 (0.94 g, 1.41 mmol). 수율 97 %.

F. N-[4-[[[[[4,10-비스(카르복시메틸)-7-(디히드록시포스피닐)메틸-1,4,7,10- 테트라아자시클로도데스 -1-일]아세틸]아미노]아세틸] 메틸아미노 ] 벤조일 ]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알라닐 -L-발릴-글리실-L- 히스티딜 -L-로이실-L-메티오닌 아미드, L237 (도 10B)

수지 A (330 mg, 0.20 mmol)를 DMA (5 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (5 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×5 mL). 수지에 F-moc-아미노벤조산 (290 mg, 0.80 mmol), HOBt (120 mg, 0.80 mmol), DIC (130 μL, 0.80 mmol) 및 DMA (5 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×5 mL). 그런 다음 수지를 DMA (5 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 여과한 후 새로운 DMA (5 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×5 mL). Fmoc-글리신 (240 mg, 0.8 mmol), HATU (310 mg, 0.8 mmol) 및 DIEA (260 μL, 1.6 mmol)을 DMA (5 mL)중에서 15분 동안 교반한 후, 그 용액을 수지에 첨가하고, 그 혼합물을 2시간 동안 실온에서 흔들어 준 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×5 mL). 그런 다음 수지를 DMA (5 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 여과한 후 새로운 DMA (5 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×5 mL). H (532 mg, 0.80 mmol), HOBt (120 mg, 0.80 mmol), DIC (130 μL, 0.80 mmol), DIEA (260 μL; 1.6 mmol), 및 DMA (5 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 플라스크에서 40시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×5 mL), CH₂Cl₂ (5×5 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (20 mL)로 처리하여 침전을 얻었다. 침전을 원심분리에 의해 수집하고 Et₂0로 세척하여 (3×20 mL) 고체를 얻었고 (90 mg), 그것을 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제물의 일정량 (50 mg)을 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L237을 백색의 고체로서 얻었다 (6 mg, 3.9×10^-3 mmol). 수율 3.5 %.

실시예 XI - 도 11A-B: L238 및 L239 의 합성

요약: 생성물들은 링크 아미드 수지 상에서 옥타펩티드 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ (BBN[7-14](A)로부터 출발하여 여러 단계로 제조하였다. 절단 및 시약 B를 사용한 탈보호 후에 미정제물을 예비 HPLC에 의해 정제하여 L238과 L239를 얻었다. 전체 수율: 각각 14 % 및 9 %.

A. N,N- 디메틸글리실 -L-세릴-[S-[( 아세틸아미노 ) 메틸 ]]-L- 시스테이닐 -글리실-4- 아미노벤조일 -L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알라닐 -L-발릴-글리실-L- 히스티딜 -L-로이실-L-메티오닌아미드, L238 (도 11A)

수지 A (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거 하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 F-moc-아미노벤조산 (0.43 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 여과한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). Fmoc-글리신 (0.36 g, 1.2 mmol), HATU (0.46 g, 1.2 mmol) 및 N-에틸디이소프로필아민 (0.40 mL, 2.4 mmol)을 DMA (7 mL)중에서 15분 동안 교반한 후, 그 용액을 수지에 첨가하고, 그 혼합물을 2시간 동안 실온에서 흔들어 준 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). N-a-Fmoc-S-아세트아미도메틸-L-시스테인 (0.50 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), DIEA (0.19 mL; 1.2 mmol), 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 플라스크에서 3시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). N-a-Fmoc-O-t-부틸-L-세린 (0.46 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), DIEA (0.19 mL; 1.2 mmol), 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하고, 그 혼합물을 플라스크에서 3시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). N,N-디메틸글리신 (0.12 g, 1.2 mmol), HATU (0.46 g, 1.2 mmol) 및 N-에틸디이소프로필아민 (0.40 mL, 2.4 mmol)을 DMA (7 mL)중에서 15분 동안 교반한 후, 그 용액을 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 2시간 동안 실온에서 흔들어 준 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4.5시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (20 mL)로 처리하여 침전을 얻었다. 침전을 원심분리에 의해 수집하고 Et₂0로 세척하여 (3×20 mL) 고체를 얻었고 (169 mg), 그것을 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제물의 일정량 (60 mg)을 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L238을 백색의 고체로서 얻었다 (22.0 mg, 0.015 mmol). 수율 14 %.

B. N,N-디메틸글리실-L-세릴-[S-[(아세틸아미노)메틸]]-L-시스테이닐-글리실-(3β,5β,7a,12a)-3-아미노-7,12-디히드록시-24- 옥소콜란 -24-일-L- 글루타미닐 -L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드, L239 (도 11B)

수지 A (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 (3β,5β,7a,12a)-3-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노]아세틸]아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산 B (0.82 g, 1.2 mmol)(7), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 여과한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). N-a-Fmoc-S-아세트아미도메틸-L-시스테인 (0.50 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하고, 그 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). N-a-Fmoc-O-t-부틸-L-세린 (0.46 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하고, 그 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). N,N-디메틸글리신 (0.12 g, 1.2 mmol), HATU (0.46 g, 1.2 mmol) 및 N-에틸디이소프로필아민 (0.40 mL, 2.4 mmol)을 DMA (7 mL)중에서 15분 동안 교반한 후, 그 용액을 수지에 첨가하였다.

수지 A (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 (3β,5β,7a,12a)-3-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노]아세틸]아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산 B (0.82 g, 1.2 mmol)(7), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 여과한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). N-a-Fmoc-S-아세트아미도메틸-L-시스테인 (0.50 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하고, 그 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴 린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). N-a-Fmoc-O-t-부틸-L-세린 (0.46 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하고, 그 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). N,N-디메틸글리신 (0.12 g, 1.2 mmol), HATU (0.46 g, 1.2 mmol) 및 N-에틸디이소프로필아민 (0.40 mL, 2.4 mmol)을 DMA (7 mL)중에서 15분 동안 교반한 후, 그 용액을 수지에 첨가하였다.

실시예 XII - 도 12A-F: L240 , L241 , L242 의 합성

요약: 생성물들은 링크 아미드 수지 상에서 옥타펩티드 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ (BBN[7-14](A)로부터 출발하여 여러 단계로 제조하였다. 절단 및 시약 B를 사용한 탈보호 후에 미정제물을 예비 HPLC에 의해 정제하여 L240, L241, 및 L242를 얻었다. 전체 수율: 각각 7.4, 3.2, 1.3 %.

A. 4-[[[(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )카르보닐]아미노]아세틸]아미노-3- 메톡시 벤조산 A (도 12A)

THF (20 mL)중의 4-아미노-3-메톡시벤조산 (1.0 g, 5.9 mmol) 및 N-에틸디이 소프로필아민 (1.02 mL, 5.9 mmol) 용액을 CH₂Cl₂/THF 1:1 (20 mL)중의 Fmoc-글리실클로라이드 (1.88 g, 5.9 mmol) 용액에 한 방울씩 첨가하고 실온에서 N₂하에 교반하였다. 3시간 후에 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 0.5 N HCl (50 mL)에 녹이고, 1시간 동안 0 ℃에서 교반한 후 여과하고, CHCl₃/헥산 1:4 (75 mL)용액에 현탁하였다. 그 현탁액을 여과하여 화합물 A를 백색 고체로서 얻었다 (1.02 g, 2.28 mmol). 수율 39 %.

B. N-[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10--테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]글리실]아미노]-3- 메톡시벤조일 ]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알라닐 -L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드, L240

수지 A (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 4-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]아세틸]아미노-3-메톡시벤조산 A (0.50 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 5시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 여과한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 트리스(1,1-디메틸에틸) 에스테르의 NaCl 부가물 (0.79 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), N-에틸디이소프로필아민 (0.40 mL; 2.4 mmol), 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4.5시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (20 mL)로 처리하여 침전을 얻었다. 그 침전을 원심분리에 의해 수집하고 Et₂0로 세척하여 (5×20 mL) 고체를 얻었고 (152 mg), 그것을 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제 생성물의 일부 (52 mg)를 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L240을 백색 고체로서 얻었다 (12.0 mg, 7.8×10^-3 mmol). 수율 7.4 %.

C. 4-아미노-3- 클로로벤조산 C (도 12B)

1 N NaOH (11 mL, 11 mmol)를 MeOH (20 mL)중의 메틸 4-아미노-3-클로로벤조에이트 (2 g, 10.8 mmol) 용액에 45 ℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 45 ℃에서 5시간 동안, 그리고 실온에서 밤새 교반하였다. 더 많은 양의 1 N NaOH (5 mL, 5 mmol)를 첨가하고, 반응물을 45 ℃에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 농축한 후에 1 N HCl (6 mL)을 첨가하였다. 고체 침전을 여과하고, 건조시켜서 4-아미노-3-클로로벤조산 C를 고체로서 얻었다 (1.75 g, 10.2 mmol). 수율 94.6 %.

D. 4-[[[(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )카르보닐]아미노]아세틸]아미노-3- 클로로 벤조산 D (도 12B)

THF (50 mL)중의 4-아미노-3-클로로벤조산 (1.5 g, 8.75 mmol) 및 N-에틸디이소프로필아민 (1.46 mL, 8.75 mmol) 용액을 CH₂Cl₂/THF 1:1 (30 mL)중의 Fmoc-글리실클로라이드 (2.76 g, 8.75 mmol) 용액에 한 방울씩 첨가하고 실온에서 N₂하에 교반하였다. 3시간 후에 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 0.5 N HCl (50 mL)에 녹이고, 여과한 후 건조시켰다. 백색 고체를 MeOH (30 mL)에 현탁하고, 1시간 동안 교반한 후, 여과하고 건조시켜서 4-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]아세틸]아미노-3-클로로벤조산을 얻었다 (2.95 g, 6.5 mmol). 수율 75 %.

E. N-[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10--테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]글리실]아미노]-3- 클로로벤조일 ]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알라 닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드, L241 (도 12E)

수지 A (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 4-[[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노]아세틸]아미노-3-클로로벤조산 D (0.54 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 5시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 여과한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 트리스(1,1-디메틸에틸) 에스테르의 NaCl 부가물 (0.79 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), N-에틸디이소프로필아민 (0.40 mL; 2.4 mmol), 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 40시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4.5시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (20 mL)로 처리하여 침전을 얻었다. 그 침전을 원심분리에 의해 수집하고 Et₂0로 세척하여 (5×20 mL) 고체를 얻었고 (151 mg), 그것을 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제 생성물의 일부 (56 mg)를 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L241을 백색 고체로서 얻었다 (5.6 mg, 3.6×10^-3 mmol). 수율 3.2 %.

F. 4-[[[(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )카르보닐]아미노]아세틸]아미노-3- 메틸벤 조산 E (도 12C)

THF (30 mL)중의 4-아미노-3-메틸벤조산 (0.81 g, 5.35 mmol) 및 N-에틸디이소프로필아민 (0.9 mL, 5.35 mmol) 용액을 CH₂Cl₂/THF 1:1 (20 mL)중의 Fmoc-글리실 클로라이드 (1.69 g, 5.35 mmol) 용액에 한 방울씩 첨가하고 실온에서 N₂하에 교반하였다. 3시간 후에 용매를 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 0.5 N HCl (50 mL)에 녹이고, 3시간 동안 0 ℃에서 교반한 후 여과하고 건조시켰다. 백색 고체를 MeOH (50 mL)에 현탁하고, 1시간 동안 교반한 후, 여과하고 건조시켜서 화합물 E를 얻었다 (1.69 g, 3.9 mmol). 수율 73 %.

G. N-[4-[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10--테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]글리실]아미노]-3- 메틸벤조일 ]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알라닐 -L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드, L242 (도 12F)

수지 A (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 4-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노]아세틸]아미노-3-메틸벤조산 E (0.52 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 5시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 여과한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 트리스(1,1-디메틸에 틸) 에스테르의 NaCl 부가물 (0.76 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), N-에틸디이소프로필아민 (0.40 mL; 2.4 mmol), 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 40시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4.5시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (20 mL)로 처리하여 침전을 얻었다. 그 침전을 원심분리에 의해 수집하고 Et₂0로 세척하여 (5×20 mL) 고체를 얻었고 (134 mg), 그것을 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제 생성물의 일부 (103 mg)를 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L242를 백색 고체로서 얻었다 (4.5 mg, 2.9×10^-3 mmol). 수율 1.3 %.

실시예 XIII - 도 13A-C: L244 의 합성

요약: 생성물은 링크 아미드 수지 상에서 옥타펩티드 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ (BBN[7-14])로부터 출발하여 여러 단계로 제조하였다. DOTA 트리-t-부틸 에스테르를 사용하는 최종 커플링 단계는 절단 및 시약 B를 사용한 링커-BBN[7-14]의 탈보호 후에 용액상에서 수행하였다. 미정제물을 예비 HPLC에 의해 정제하여 L244를 얻었다. 전체 수율: 0.4 %.

A. N,N'-( 이미노디 -2,1- 에탄디일 ) 비스 [2,2,2- 트리플루오로아세트아미드 ],A (도 13A)

트리플루오로아세트산 에틸 에스테르 (50 g, 0.35 mmol)를 0 ℃의 THF (180 mL)중의 디에틸렌트리아민 (18 g, 0.175 mmol) 용액에 1시간에 걸쳐 한 방울씩 첨가하였다. 실온에서 20시간이 지난 후, 혼합물을 증발시켜서 유상 잔류물을 얻었다 (54 g). 그 오일을 Et₂O (50 mL)로부터 결정화하고, 여과한 후, 저온 Et₂O로 세척한 후 (2×30 mL), 건조시켜서 A를 백색 고체로서 얻었다 (46 g, 0.156 mmol). 수율 89 %.

B. 4-[N,N'-비스[2-( 트리플루오로아세틸 ) 아미노에틸 ]아미노]-4- 옥소부탄산 , B (도 13A)

숙신산 무수물 (0.34 g, 3.4 mmol)을 실온에서 THF (5 mL)중의 A (1 g, 3.4 mmol) 용액에 첨가하였다. 28시간 후에 미정제물을 농축하고, 그 잔류물 (1.59 g)을 EtOAc로 세척한 후 (2×10 mL) 1 N HCl로 세척하였다 (2×15 mL). 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과한 후 증발시켜서 유상 잔류물을 얻었고 (1.3 g), 그것을 플래쉬 크로마토그래피(5)에 의해 정제하여 B를 오일로서 얻었다 (0.85 g, 2.15 mmol). 수율 63 %.

C. 4-[N,N'-비스[2-[(9-H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )카르보닐] 아미노에틸 ]아미노]-4-옥소부탄산, D (도 13A)

숙신산 무수물 (2 g, 20 mmol)을 실온에서 THF (25 mL)중의 A (5 g, 16.94 mmol) 용액에 첨가하였다. 28시간 후에 미정제물을 농축하고, 그 잔류물 (7 g)을 에틸 아세테이트 (100 mL)로 세척한 후 1 N HCl로 세척하였다 (2×50 mL). 유기층 을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과한 후 증발시켜서 미정제 B를 유상 잔류물로서 얻었다 (6.53 g). EtOH (35 mL)중의 미정제 B (5 g)의 현탁액에 2 N NaOH (25 mL)를 첨가하고 1시간 동안 실온에 놓아두어 완전 용액을 얻었다. 1,4-디옥산 (30 mL)중의 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트 (6.54 g, 25.3 mmol) 용액을 10 % aq.Na₂CO₃ (30 mL)중의 C의 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 실온에서 20시간 후에 젤라틴성 현탁액이 얻어졌고, 그것을 여과하여 백색 고체 (3.5 g)와 황색 용액을 얻었다. 용액을 증발시키고, 남아있는 수용액을 H₂O (150 mL)로 희석한 다음 EtOAc (70 mL)로 추출하였다. 새로운 EtOAc (200 mL)를 수성층에 첨가하여 얻어진 현탁액을 0 ℃로 냉각하고, 농축 HCl을 사용하여 pH 2로 산성화하였다. 유기층을 pH가 중성이 될 때까지 H₂O로 세척하고 (5×200 mL), 건조시켜서 유리질의 고체를 얻었다 (6.16 g). 화합물을 끓고 있는 n-헥산 (60 mL)에 1시간 동안 현탁하고, 여과하여 D를 백색 고체로서 얻었다 (5.53 g, 8.54 mmol). 전체 수율 50 %.

D. N-[4-[[4-[비스[2-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10--테트라아자 시클로도데스 -1-일]아세틸]아미노]에틸]아미노-1,4- 디옥소부틸 ]아미노] 벤조일 ]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알라닐 -L-발릴-글리실-L- 히스티딜 -L-로이실-L-메티오닌아미드, L244 (도 13B)

수지 A (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 제거 하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 4-[N,N'-비스[2-[(9H-플루오렌-9-일 메톡시)카르보닐]아미노에틸]아미노]-4-옥소 부탄산 (777.3 mg, 1.2 mmol), HOBt (184 mg, 1.2 mmol), DIC (187 μL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 40시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 여과한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하고 (2×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척한 후, 수지를 시약 B(25 mL)가 들어있는 플라스크에서 4.5시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (20 mL)로 처리하여 침전을 얻었다. 침전을 원심분리에 의해 수집하고 Et₂0로 세척하여 (5×20 mL) F를 백색 고체로서 얻었다 (140 mg). DOTA 트리-t-부틸 에스테르 (112 mg, 0.178 mmol), HATU (70 mg, 0.178 mmol) 및 DIEA (60 μL; 0.356 mmol)를 DMA (3 mL)와 CH2Cl2 (2 mL)중의 F (50 mg, 0.0445 mmol)용액에 첨가하고, 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 그 미정제물을 증발시켜서 부피를 줄이고 (1 mL) 시약 B (25 mL)와 함께 4.5시간 동안 흔들어 주었다. 용매를 증발시킨 후 잔류물을 Et₂O (20 mL)로 처리하여 침전을 얻었다. 침전을 원심분리에 의해 수집하고 Et₂0로 세척하여 (5×20 mL) 베이지색 고체 (132 mg)를 얻었고, 그것을 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제물의 일부 (100 mg)를 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L244 (도 13C)를 백색의 고체로서 얻었다 (3.5 mg, 1.84×10^-3 mmol). 수율 0.8 %.

실시예 XIV - XLII 에 대한 일반적인 과정: L201 - L228

A. 수동 커플링

6.0 당량의 적절하게 보호된 아미노산을 각각 6.0 당량의 HOBt와 DIC로 처리하고 반응 용기 외부에서 활성화시켰다. NMP중의 이 활성화된 카르복실산을 아민을 함유하는 수지로 옮겨서 반응을 4 내지 6시간 동안 수행한 후 수지를 제거하고 세척하였다.

B. Fmoc - Gly -OH의 4- 아미노벤조산 및 아미노비페닐카르복실산 아미드에 대한 특이한 커플링:

Fmoc-Gly-OH (10.0 당량)를 NMP (아미노산의 g 당 중량으로 사용됨, 10 mL)중의 HATU (10.0 당량) 및 DIEA (20.0 당량)로 처리하고, 그 용액을 10 내지 15분 동안 실온에서 교반한 후 아민이 로딩된 수지가 들어있는 용기에 옮겼다. 용액의 부피를 수지의 g 당 15.0 ml로 만들었다. 커플링은 20시간 동안 실온에서 계속하였고, 수지를 모든 반응물로부터 제거하였다. 이 과정을 한 번 더 반복한 다음 NMP로 세척한 후, 다음 단계로 이동하였다.

C. D03A 모노아미드의 제조:

8.0 당량의 DOTA 모노산을 NMP에 녹이고 8.0 당량의 HBTU 및 16.0 당량의 DIEA로 처리하였다. 이 용액을 15분 동안 실온에서 교반한 후 수지 상의 아민에 옮 기고 커플링을 24시간 동안 RT에서 계속하였다. 그런 다음 수지를 제거하고, 세척한 후 펩티드를 절단하고 정제하였다.

D. 수지로부터의 미정제 펩티드의 절단 및 정제:

수지를 시약 B (15.0 ml/g)에 현탁하고 4시간 동안 RT에서 흔들어주었다. 수지를 제거하고 2×5 mL의 시약 B로 다시 세척한 후 이전의 여과물과 조합하였다. 그런 다음 여과물을 감압하에 페이스트/액체로 RT에서 농축하고 25.0 mL의 무수 에테르 (사용된 수지 매 g 당)로 분쇄하였다. 그런 다음 현탁액을 원심분리하고 에테르 층을 따라버렸다. 이 과정을 2회 반복하고, 에테르로 세척한 후 얻어진 무색의 침전을 예비 HPLC에 의하여 정제하였다.

실시예 XIV - 도 21: L201 의 합성

0.5 g의 Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-M-수지 (0.4 mmol/g, 0.5g, 0.2 mmol) (수지 A)를 사용하였다. 아미노산 단위의 나머지는 (1R)-1-(비스{2-[비스(카르복시메틸)아미노]에틸}아미노)프로판-3-카르복실산-1-카르복실-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 (L201)을 제조하기 위한 일반 과정에서 설명된 바와 같이 첨가하였다. 수율: 17.0 mg (5.4 %).

실시예 XV - 도 22A 및 22B: L202 의 합성

A. 4- Fmoc - 히드라지노벤조산 (도 22A):

ANF (100 ml)중의 4-히드라지노벤조산 (5.0 g, 32.9 mmol)의 용액을 탄산 세슘 (21.5 g, 66.0 mmol)으로 처리하였다. THF (25 mL)중의 Fmoc-Cl (9.1 g, 35.0 mmol)을 상기 용액에 1시간에 걸쳐 교반하면서 한 방울씩 첨가하였다. 첨가 후 그 용액을 4시간 더 교반하고 반응 혼합물을 약 75 mL로 농축한 다음 에테르로 추출하였다 (2×100 mL). 에테르 층을 버리고 수성층을 2 N HCl로 산성화하였다. 분리된 고체를 여과하고, 물로 세척한 후 (5×100 mL) 아세토니트릴로부터 재결정하여 생성물 (화합물 B)를 무색 고체로서 얻었다. 수율: 11.0 g (89 %).

¹H NMR (DMSO-d₆): d 4.5 (m, 1H, Ar-CH ₂ -CH), 4.45 (m, 2H, Ar-CH ₂ ), 6.6 (bs, 1H, Ar-H), 7.4-7.9 (m, 9, Ar-H 및 Ar-CH ₂ ), 8.3 (s, 2H, Ar-H), 9.6 (s, 2H, Ar-H). M. S.- m/z 373.2[M-H].

0.5 g의 Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-M-수지 (0.4 mmol/g, 0.5g, 0.2 mmol) (수지 A)를 사용하였다. 아미노산 단위는 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-4-히드라지노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 (L202)를 제조하기 위한 화합물 B를 포함하여 일반 과정에서 설명된 것과 같이 첨가하였다.

실시예 XVI - 도 23A 및 23B: L203 의 합성

A. 4- Boc - 아미노벤조일 벤조에이트 화합물 B의 제조 (도 23A):

건조 아세토니트릴 (10.0 mL)중의 4-boc-아미노벤조산 (0.95 g, 4.0 mmol)의 현탁액을 분말 탄산 세슘 (1.3 g, 4.0 mmol)으로 처리하고, 질소 하에서 격렬하게 교반하였다. 거기에 벤질 브로마이드 (0.75 g, 4.4 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물 을 20시간 동안 질소하에서 환류하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 빙냉수 (200 mL)에 붓고, 분리된 고체를 여과한 후, 물로 세척하였다 (5×50 mL). 미정제 물질을 수성 메탄올로부터 재결정하여 생성물을 무색 고체로서 얻었다 (화합물 B). 수율: 0.8 g (61 %). ¹H NMR (CDCl₃): d 1.5 (s, 9H, 삼차 메틸), 5.4 (s, 2H, Ar-CH ₂ ), 7.4 (m, 7H, Ar-H) 및 8.0 (m, 2H, Ar-H). M. S. -m/z 326.1[M+H].

B. 4- 아미노벤질 벤조에이트 화합물 C (도 23A):

4-Boc-아미노벤질 벤조에이트 (0.8 g, 2.5 mmol)를 TFA (25 중량 %)를 함유하는 DCM (20 mL)에 녹이고 2시간 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 100.0 g의 얼음 조각에 붓고 포화 중탄산 나트륨 용액으로 pH가 약 8.5에 도달할 때까지 중화시켰다. 유기층을 분리하고, 수성층을 DCM으로 추출한 다음 (3×20 mL) 모든 유기층을 조합하였다. 그런 다음 DCM 층을 1×50 mL의 포화 중탄산 나트륨, 물 (2×50 mL)로 세척하고, 건조시켰다 (황산 나트륨). 용매를 제거함으로써 무색 고체 (화합물 C)를 얻었고, 그것을 다음 단계에서 추가의 정제 과정 없이 사용하였다. 수율: 0.51 g (91 %). ¹H NMR (CDCl₃): d 5.3 (s, 2H, Ar-CH ₂ ), 6.6 (d, 2H, Ar-H, j=1.0 Hz), 7.4 (m, 5H, Ar-H, J=1.0 Hz) 및 7.9 (d, 2H, Ar-H, J=1.0 Hz).

C. 4-(2- 클로로아세틸 ) 아미노벤질 벤조에이트 화합물 D (도 23A):

아민 (0.51 g, 2.2 mmol)을 건조 디메틸아세트아미드 (5.0 mL)에 녹이고 얼음에 냉각시켰다. 염화 클로로아세틸 (0.28 g, 2.5 mmol)을 주사바늘을 통해 한 방 울씩 첨가하고, 그 용액을 실온이 되도록 놓아두었다가 2시간 동안 교반하였다. 추가로, 2.5 mmol의 염화 클로로아세틸을 첨가하고 교반을 2시간 동안 계속하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 빙냉수 (100 mL)에 부었다. 침전된 고체를 여과하고, 물로 세척한 후, 헥산/에테르로부터 재결정하여 무색 고체 (화합물 D)를 얻었다. ¹H NMR (CDCl₃): d 4.25 (s, 2H, CH ₂ -Cl), 5.4 (s, 2H, Ar-H), 7.4 (m, 5H, Ar-H), 7.6 (d, 2H, Ar-H), 8.2 (d, 2H, Ar-H) 및 8.4 (s, 1H, -CONH).

tert-부틸 2-{1,4,7,10-테트라아자-7,10-비스{[(tert-부틸)옥시카르보닐]메틸}-4-[(N-{4-[벤질옥시카르보닐]페닐}카바모일]시클로도데실}아세테이트, 화합물 E (도 23A):

DO3A-트리-t-부틸 에스테르.HCl (5.24 g, 9.5 mmol)을 30.0 mL의 건조 아세토니트릴에 현탁하고, 무수 탄산 칼륨 (2.76 g, 20 mmol)을 첨가한 후 30분 동안 교반하였다. 그런 다음 건조 아세토니트릴 (20.0 mL)중의 클로로아세트아미드 D (2.8 g, 9.2 mmol)를 상기 혼합물에 10분에 걸쳐 한 방울씩 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 용액을 여과하고, 감압하에 페이스트로 농축하였다. 페이스트를 약 200.0 mL의 물에 녹이고, 5×50 mL의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 조합하여 물로 세척하고 (2×100 mL) 건조시켰다 (황산 나트륨). 용액을 여과하고 감압하에 증발시켜서 페이스트로 만든 다음, 페이스트를 플래쉬 실리카 겔 (600.0 g)상에서 크로마토그래피하였다. DCM중의 5 % 메탄올을 사용한 용출로 생성물을 용출하였다. TLC상에서 동종성인 것으로 나타난 모든 분획을 모아서 증발 시켜 무색 검을 얻었다. 그 검을 이소프로필에테르 및 DCM으로부터 재결정하여 화합물 E를 제조하였다. 수율: 4.1 g (55 %). ¹H NMR (CDCl₃): d 1.5 (s, 27H, 메틸), 2.0-3.75 (m, 24H, NCH ₂ s), 5.25 (d, 2H, Ar-CH ₂ ), 7.3 (m, 5H, Ar-H), 7.8 (d, 2H, Ar-H) 및 7.95 (d, 2H, Ar-H). M. S. -m/z 804.3 [M+H].

D. 화합물 F를 제조하기 위한 상기 산 E의 환원 (도 23A):

상기로부터의 벤질 에스테르 E (1.0 g, 1.24 mmol)를 메탄올-물 혼합물 (10.0 mL, 95:5)에 녹이고, 탄소 상의 팔라듐 (10 %, 0.2 g)을 첨가하였다. 그 용액을 파르 장치를 사용하여 50.0 psi에서 8시간 동안 수소화하였다. 용액을 여과하여 촉매를 제거하고, 감압하에 농축하여 무색의 보풀이 선 고체 F를 얻었다. 그것을 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 직접 사용하였다. MS: m/z 714.3[M+Na].

E. L203 의 제조 (도 23B)

상기 산 F를 상술된 표준 커플링 과정을 사용하여 상기로부터 수지 [H-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-M-수지] 수지 A 및 F 상에서 아미드에 커플시켰다. 0.5 g (0.2 mmol)의 수지로 31.5 mg의 최종 정제된 펩티드 (10.9 %) N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 (L203)(도 23B)을 제조하였다.

실시예 XVII - 도 24: L204 의 합성

Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-M-수지 (0.5g, 0.2 mmol) (수지 A)를 사용 하였다. Fmoc-Gly-OH를 표준 커플링 조건을 사용하는 상기 과정 (도 23A)으로부터 F보다 앞에 로딩하였다. 수율: N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-4-아미노벤조일-글리실-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 (L204)(도 24) 24.5 mg (8.16 %).

실시예 XVIII - 도 25: L205 의 합성

Fmoc-6-아미노니코틴산을 문헌에서 설명된 바와 같이 제조하고 ("Synthesis of diacylhydrazine compiounds for therapeutic use." Hoelzemann, G.; Goodman, S. (Merck Patent G. m. b.H.., Germany). Ger. Offen. 2000, 16 pp.CODEN: GWXXBX DE 19831710 A120000120), 미리 로딩되어 있는 Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-M-수지 (0.5g, 0.2 mmol) (수지 A)와 커플시킨 다음 상기와 같이 다른 아미노기와 커플시켜서 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-4-아미노벤조일-글리실-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 (L205)를 제조하였다. 수율: 1.28 mg (0.4 %).

실시예 XIX - 도 26A 및 26B: L206 의 합성

A. 4'- Fmoc -아미노-3'- 메틸비페닐 -4- 카르복실산 B:

아미노산 (0.41 g, 1.8 mmol)을 10.0 mL의 물 중의 탄산 세슘 (0.98 g, 3.0 mmol) 용액에 녹였다. ("Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin" Mao, H. et al J. Am. Chem. Soc. , 2001,123 (43), 10429-10435 참조). 이 용액을 얼음조에서 냉각시키고, THF (10.0 mL)중의 Fmoc-Cl (0.52 g, 2.0 mmol) 용액을 격렬하게 교반하면서 한 방울씩 첨가하였다. 완료가 끝나면 반응 혼합물을 RT에서 20시간 동안 교반하였다. 그런 다음 용액을 2 N HCl로 산성화하였다. 침전된 고체를 여과하고 물로 세척한 후 (3×20 mL) 공기 건조하였다. 미정제 고체를 아세토니트릴로부터 재결정하여 무색의 보풀이 선 고체 B를 얻었다 (도 26A). 수율: 0.66 g (75 %). ¹H NMR (DMS0-d₆): d 2.2 (s, Ar-Me), 4.25 (t, 1H, Ar-CH, j=5Hz), 4.5 (d, 2H, O-CH2, j=5.0 Hz), 7.1 (bs,1H, CONH), 7.4-8.0 (m, 8H, Ar-H) 및 9.75 (bs, 1H, -COOH). M. S.: m/z 472.0 [M-H].

상기로부터의 산 B를 표준 커플링 조건을 사용하여 Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-M-수지 (0.2 g, 0.08 mmol) 수지 A와 커플링하였다. 추가의 기들을 상기와 같이 첨가하여 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-[4'-아미노-2'-메틸비페닐-4-카르복실]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 (L206)를 제조하였다. 수율: 30.5 mg (24 %).

실시예 XX - 도 27A-B: L207 의 합성

3'-Fmoc-아미노-비페닐-3-카르복실산을 상술된 과정을 사용하여 상응하는 아민으로부터 제조하였다 ("Synthesis of 3'-methyl-4-'-nitrobiphenylcarboxylic acids by the reaction of 3-methyl-4-nitrobenzenenediazonium acetate with methyl benzoate", Boyland, E. and Gorrod, J., J. Chem. Soc., Abstracts (1962), 2209-11 참조). 0.7 g의 아민으로 0.81 g의 Fmoc-유도체 (58 %)(화합물 B, 도 27A)를 얻었다. ¹H NMR (DMS0-d₆): d 4.3 (t, 1H, Ar-CH), 4.5 (d, 2H, O-CH ₂ ),7.25-8.25 (m, 16H, Ar-H) 및 9.9 (s, 1H, -COOH). M. S.-m/z 434 [M-H].

Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-M-수지 (0.2 g, 0.08 mmol) 수지 A를 상기 산 B 및 상기와 같은 추가의 기 (도 27B)에 커플링하였다. 29.0 mg의 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-[3'-아미노-비페닐-3-카르복실]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 (L207)를 제조하였다 (23 %).

실시예 XXI - 도 28: L208 의 합성

Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-M-수지 (0.2 g, 0.08 mmol) 수지 A를 블록제거하고 커플링제로서 HATU를 사용하여 테레프탈산에 커플링하였다. 그 결과 수지상의 산을 DIC 및 NHS로 활성화한 후 에틸렌디아민에 커플링하였다. 최종적으로 DOTA-모노산을 수지상의 아민에 커플링하였다. N-[(3β,5β,12α)-3-[[[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]아세틸]아미노]-[1,2-디아미노에틸-테레프탈릴]-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 (L208)를 17.5 mg (14 %)의 수율로 제조하였다.

실시예 XXII - 도 29A-B: L209 의 합성

A. Boc - Glu (G- OBn )-G- OBn :

Boc-글루탐산 (5.0 g, 20.2 mmol)을 THF (50 mL)에 녹이고 얼음조에서 0 ℃로 냉각시켰다. 거기에 HATU (15.61 g, 41.0 mmol)를 첨가한 후 DIEA (6.5 g, 50.0 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 30분 동안 교반하였다. 글리신의 벤질 에스테르 [8.45 g, 50 mmol, 벤질 글리신 염산염을 탄산 나트륨으로 중화하고, DCM으로 추출한 후 용매를 제거함으로써 제조됨]를 THF (25.0 mL)중에 담아 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 실온이 되도록 방치하고 RT에서 20시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 물질을 감압하에 제거하였다. 잔류물을 포화 탄산 나트륨 용액 (100 mL)으로 처리하고 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3×100 mL). 유기층을 조합하여 1 N HCl로 (2×100 mL) 및 물로 (2×100 mL) 세척하고 건조시켰다 (황산 나트륨). 용액을 여과하고 용매를 감압하에 제거하여 페이스트를 만들어서 그것을 플래쉬 실리카 겔 (500.0 g) 상에서 크로마토그래피하였다. DCM중의 2 % 메탄올을 사용하여 용출함으로써 생성물을 무색 페이스트로서 얻었다 (화합물 B, 도 29A). TNDBF: 8.5 g (74.5 %). ¹H NMR (CDCl₃): d 1.4 (s, 9H, -CH ₃ s), 2.0-2.5 (m, 4H, -CH-CH ₂ 및 CO-CH), 4.2 (m, 5H, N-CH ₂ -CO), 5.15 (s, 4H, Ar-CH ₂ ), 5.45 (bs,1 H, Boc-NH), 7.3 (m, 10H, Ar-H) 및 7.6 (2bs, 2H, CONH). M.S.-m/z 564.1[M+H]. 분석 HPLC 보유 시간 - 8.29 분 ( > 97% 순도, 15분 이상 20-65% B).

B. H- Glu (G- OBn )-G- OBn :

상기로부터의 전체적으로 보호된 글루탐산 유도체 (1.7 g, 3.2 mmol) B를 DCM/TFA (4:1, 20 mL)에 녹이고, 출발 물질이 TLC 상에서 없어질 때까지 (2시간) 교반하였다. 반응 혼합물을 빙냉-포화 중탄산 나트륨 용액 (200 mL)에 붓고 유기 층을 분리한 다음, 수성층을 2×50 mL의 DCM으로 추출하여 유기층을 조합하였다. DCM 층을 포화 중탄산 나트륨 (2×100 mL), 물 (2×100 mL)로 세척하고, 건조시켰다 (황산 나트륨). 용액을 여과하고, 감압하에 증발시키고, 잔류물을 진공 건조하여 유리질의 화합물 C (도 29A)를 얻었고, 그것을 더 이상 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다. 수율: 0.72 g (95 %). M.S.-m/z 442.2[M+H].

C. ( DOTA -트리-t-부틸)- Glu -(G- OBn )-G- OBn :

무수 DCM (10.0 mL)중의 상기에서 얻어진 아민 C (1.33 g, 3 mmol)를 DOTA-트리-t-부틸 에스테르의 활성화된 용액 (2.27 g, 3.6 mmol을 HBTU (1.36 g, 3.6 mmol) 및 DIEA (1.04 g, 8 mmol)로 처리한 다음 30분 동안 RT에서 25 mL의 건조 DCM중에서 교반하였다]에 첨가하고 RT에서 20시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 200 mL의 DCM으로 희석하고, 포화 탄산 나트륨으로 세척한 다음 (2×150 mL) 건조시켰다 (황산 나트륨). 용액을 여과하고 용매를 감압하게 제거하여 갈색 페이스트를 얻었다. 미정제 생성물을 플래쉬 실리카 겔 (500.0 g)상에서 크로마토그래피하였다. DCM 중의 2 % 메탄올로 용출함으로써 생성물을 무색 검으로서 얻었다 (화합물 D, 도 29A). 수율: 1.7 g (56.8 %). ¹H NMR (CDCl₃): d 1.3 및 1.4 (2s, 9H, 각각이 염기 및 DOTA의 나트륨 부가물로부터 온 3개의 메틸), 2.0-3.5 (m, 20H, N-CH ₂s 및-CH-CH ₂ 및 CO-CH ₂ ), 3.75-4.5 (m, 13H, N-CH ₂ -CO), 5.2 (m, 4H, Ar-CH ₂ ) 및 7.25 (m, 10H, Ar-H). M.S. m/z -1018.3 [M+Na] 및 996.5 [M+H] 및 546.3 [M+Na+H] /2. HPLC-보유 시간: 11.24 분 ( > 90%, 30분 이상 20-80% B).

D. ( DOTA -트리-t-부틸)- Glu - (G-OH)-G-OH:

상기에서 얻어진 비스 벤질 에스테르 (0.2 g, 0.2 mmol) D를 메탄올-물 (20 mL, 9:1)에 녹이고 50 psi에서 10 % Pd/C 촉매 (0.4 g, 50 중량 %)의 존재하에 수소화하였다. 출발 물질이 HPLC 및 TLC 상에서 나타나지 않게 된 후에 (4시간), 용액을 여과하여 촉매를 제거하고, 용매를 감압하에 제거한 후, 잔류물을 고진공하에서 약 20시간 동안 건조시켜서 (<0.1 mm) 생성물을 무색 발포체로서 얻었다 (화합물 E, 도 29A). 수율: 0.12 g (74.5 %). ¹H NMR (DMS0-d₆): d 1.3 및 1.4 (2s, 9H DOTA의 염기 및 나트륨 부가물의 메틸에 상응함), 1.8-4.7 (m, 33H, NCH ₂ s, COCH ₂ 및 CH-CH ₂ 및 NH-CH-CO), 8.1, 8.2 및 .4 (3bs, NHCO). M.S.:m/z -816. 3[M+H] 및 838.3 [M+Na]. HPLC 보유 시간: 3.52 분 (30분 이상 20-80% B, >95 % 순수).

E. H-8-아미노-3,6- 디옥사옥타노일 -8-아미노-3,6- 디옥사옥타노일 - Gln -Trp-Ala-Val- Gly -His-Leu-Met- NH ₂ :

Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-수지 (0.5 g, 0.2 mmol) A를 블록제거하고 차례로 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산에 2회 커플링하고 예비 HPLC에 의해 정제하여 상기 탈보호된 펩티드 (화합물 E, 도 29B)를 얻었다. 수율: 91.0 mg (37 %).

HPLC 보유 시간: 8.98 분(>95 % 순도, 10분 이상 10 내지 40 % B).

M. S.: m/z-1230.6[M+H], 615.9[M+2H]/2.

F. 상기에서 얻어진 비스 -산 E와 아민 F의 용액상 커플링 (도 29B):

비스-산 (13.5 mg, 0.0166 mmol) E를 100 μL의 건조 아세토니트릴에 녹이고 NHS (4.0 mg, 0.035 mmol) 및 DIC (5.05 mg, 0.04 mmol)로 처리한 다음 24시간 동안 RT에서 교반하였다. 상기 활성화된 산에 유리 아민 F (51.0 mg, 0.41 mmol)[TFA 염으로부터 포화 중탄산 나트륨으로의 처리와 이어서 용액을 동결 건조하여 보풀이 선 고체로서의 아민을 생성함으로써 제조됨]을 첨가한 후, 100 μL의 NMP를 첨가하고, 40시간 동안 RT에서 교반을 계속하였다. 용액을 무수 에테르 (10 mL)로 희석하고 침전을 원심분리에 의하여 수집하여 2×10 mL의 무수 에테르로 다시 세척하였다. 그런 다음 미정제 고체를 예비 HPLC에 의하여 정제하여 생성물을 무색의 보풀이 선 고체 (L209, 도 29B)로서 얻었다. 수율: 7.5 mg, 14.7 %.

실시예 XXIII - 도 30A-B: L210 의 합성

A. H-8- 아미노옥타노일 -8- 아미노옥타노일 - Gln -Trp-Ala-Val- Gly -His-Leu-Met- NH ₂ :

이 화합물은 또한 화합물 F (도 29B)의 경우와 정확히 동일한 방법으로 제조하되 단 1-아미노옥탄산을 사용하고 아민 (화합물 B, 도 30A)을 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 수율: 95.0 mg (38.9 %). HPLC 보유 시간: 7.49분 (>95 % 순도; 10.0분 이상 10-40 % B). M. S.:m/z -1222.7 [M+H], 611.8 [M+2H]/2.

(DOTA-트리-t-부틸)-Glu-(G-OH)-G-OH (0.0163 g, 0.02 mmol)를 L209의 경우 에서와 같이 100 μL의 아세토니트릴 중에서 그것의 비스-NHS 에스테르로 전환시키고 유리 염기, 화합물 B (60.0 mg, 0.05 mmol)로 100 μL의 NMP중에서 처리한 다음, 40시간 동안 반응을 계속한 후 상기와 같이 정제하여 L210 (도 30B)을 11.0 mg(18 %)의 수율로 제조하였다.

실시예 XXIV - 도 31: L211 의 합성

표준 프로토콜을 사용하여 0.2 g의 Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-수지 (0.08 mmol)로부터 제조하였다. N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 (L211)를 4.7 mg (3.7 %)의 수율로 제조하였다 (도 31).

실시예 XXV - 도 32: L212 의 합성

표준 프로토콜에 의해 링크 아미드 Novagel 수지 (0.47 mmol/g, 0.2 g, 0.094 mmol)로부터 수지에 서열을 만들어감으로써 제조하였다. N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 (L212)를 25.0 mg (17.7 %)의 수율로 제조하였다 (도 32).

실시예 XXVI - 도 33: L213 의 합성

Fmoc-Met-2-클로로트리틸 클로라이드 수지 (NovaBioChem, 0.78 mmol/g, 0.26 g, 0.2 mmol)로부터 제조하고 서열의 나머지는 표준 방법을 사용하여 제조하였다. N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌 (L213)을 49.05 mg (16.4 %)의 수율로 제조하였다 (도 33).

실시예 XXVII - 도 34: L214 의 합성

표준 프로토콜을 사용하여 Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-수지 (0.2 g, 0.08 mmol) A를 사용하여 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-D-페닐알라닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 L214를 제조하였다. 생성물의 수율은 8.5 mg (6.4 %)이었다 (도 34).

실시예 XXVIII - 도 35: L215 의 합성

Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-수지 (0.2 g, 0.08 mmol) A를 사용하여 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-아르기닐-L-로이실-글리실-L-아스파라기닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 L215를 제조하였다. 9.2 mg (5.5 %)을 얻었다 (도 35).

실시예 XXVIX - 도 36: L216 의 합성

Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-수지 (0.2 g, 0.08 mmol) A를 사용하 여 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-아르기닐-L-티로시닐-글리실-L-아스파라기닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 L216을 제조하였다. 25.0 mg (14.7 %)을 얻었다 (도 36).

실시예 XXX - 도 37: L217 의 합성

Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-수지 A (0.2 g, 0.08 mmol)를 사용하여 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-라이실-L-티로시닐-글리실-L-아스파라기닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드 L217을 제조하였다. 58.0 mg (34.7 %)을 얻었다 (도 37).

실시예 XXXI - 도 38: L218 의 합성

Fmoc-Q(Trt)-W(Boc)-A-V-G-H(Trt)-L-M-수지 A (0.2 g, 0.08 mmol)를 사용하였다. Fmoc-Lys(ivDde)를 사용하여 라이신을 도입하였다. 선형 서열이 완성된 후에 라이신의 보호기를 DMF 중의 10 % 히드라진을 사용하여 제거하였다 (2×10 mL; 각각 10분 후 세척함). 그런 다음 아미노산의 나머지를 필요한 서열을 완성하기 위해 설명된 "일반" 단원의 과정을 사용하여 도입하였다. 도 38의 L218을 40.0 mg (23.2 %)의 수율로 얻었다.

실시예 XXXII - 도 39: L219 의 합성

4-술파밀부티릴 AM Novagel 수지를 사용하였다 (1.1mmol/g, 0.5 g, 0.55 mmol). 첫 번째 아미노산을 이 수지위에 -20 ℃에서 20시간 동안 로딩하였다. 서열의 나머지는 정상 커플링 과정을 사용하여 완성하였다. 세척 후 수지를 20.0 당량의 요오도아세토니트릴 및 10.0 당량의 DIEA로 20시간 동안 알킬화하였다. 그런 다음 수지의 액체를 제거하고 세척한 후 5.0 mL의 THF중의 2.0 당량의 펜틸아민으로 20시간 동안 절단하였다. 수지를 5.0 mL의 THF로 2회 세척하고 모든 여과물을 조합하였다. 그런 다음 THF를 감압하에 증발시키고 잔류물을 10.0 mL의 시약 B로 블록제거하고, N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-D-페닐알라닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-아미노펜틸, L219를 상기에서 설명된 바와 같이 정제하였다. 28.0 mg (2.8 %)을 얻었다 (도 39).

실시예 XXXIII - 도 40: L220 의 합성

NovaSyn TGR (0.25 mmol/g, 0.15 g, 0.05 mmol) 수지 A를 사용하여 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-D-알라닐-L-히스티딜-L-로이실-메티오닌아미드, L220을 제조하였다. 31.5 mg (41.4 %)을 얻었다 (도 40).

실시예 XXXIV - 도 41: L221 의 합성

NovaSyn TGR (0.25 mmol/g, 0.15 g, 0.05 mmol) 수지 A를 사용하여 N-[(3 β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-D-페닐알라닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-로이신아미드, L221을 제조하였다. 28.0 mg (34.3 %)을 얻었다 (도 41).

실시예 XXXV - 도 42: L222 의 합성

NovaSyn TGR (0.25 mmol/g, 0.15 g, 0.05 mmol) 수지 A를 사용하여 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-D-티로시닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-베타알라닐-L-히스티딜-L-페닐알라닐-L-노르로이신아미드, L222를 제조하였다. 34.0 mg (40.0 %)을 얻었다 (도 42).

실시예 XXXVI - 도 43: L223 의 합성

NovaSyn TGR (0.25 mmol/g, 0.15 g, 0.05 mmol) 수지 A를 사용하여 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-페닐알라닐-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-베타알라닐-L-히스티딜-L-페닐알라닐-L-노르로이신아미드, L223을 제조하였다. 31.2 mg (37.1 %)을 얻었다 (도 43).

실시예 XXXVII - 도 44: L224 의 합성

NovaSyn TGR (0.25 mmol/g, 0.15 g, 0.05 mmol) 수지 A를 사용하여 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐- 글리실-L-히스티딜-L-페닐알라닐-L-로이신아미드, L224를 제조하였다. 30.0 mg (42.2 %)을 얻었다 (도 44).

실시예 XXXVIII - 도 45: L225 의 합성

NovaSyn TGR (0.25 mmol/g, 0.15 g, 0.05 mmol) 수지 A를 사용하여 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-로이실-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-세리닐-L-페닐알라닐-L-메티오닌아미드, L225를 제조하였다. 15.0 mg (20.4 %)을 얻었다 (도 45).

실시예 XXXIX - 도 46: L226 의 합성

NovaSyn TGR (0.25 mmol/g, 0.15 g, 0.05 mmol) 수지 A를 사용하여 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-히스티딜-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드, L226을 제조하였다. 40.0 mg (52.9 %)을 얻었다 (도 46).

실시예 XL - 도 47: L227 의 합성

NovaSyn TGR (0.25 mmol/g, 0.15 g, 0.05 mmol) 수지 A를 사용하여 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-로이실-L-트립토필-L-알라닐-L-트레오닐-글리실-L-히스티딜-L-페닐알라닐-L-메티오닌아미드, L227을 제조하였다. 28.0 mg (36.7 %)을 얻었다 (도 47).

실시예 XLI - 도 48: L228 의 합성

NovaSyn TGR (0.25 mmol/g, 0.15 g, 0.05 mmol) 수지 A를 사용하여 N-[(3β,5β,12α)-3-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]아세틸]아미노]-글리실-4-아미노벤조일-L-글루타미닐-L-트립토필-L-알라닐-L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-페닐알라닐-L-메티오닌아미드, L228을 제조하였다. 26.0 mg (33.8 %)을 얻었다 (도 48).

실시예 XLII - 추가의 GRP 화합물의 합성

A. 4,4'- 아미노메틸비페닐카르복실산 (B2) 및 3,3'- 아미노메틸비페닐카르복 실산 (B3)의 제조를 위한 일반 과정:

1. 메틸 - 히드록시메틸비페닐카르복실레이트 :

시판중인 (Aldrich Chemical Co.) 4-히드록시메틸페닐보르산 또는 3-히드록시메틸페닐보르산 (1.0 g, 6.58 mmol)을 이소프로판올 (10 mL) 및 2 M 탄산 나트륨 (16 mL)과 함께 용액이 균질하게 될 때까지 교반하였다. 그 용액을 통해 질소를 통과시킴으로써 용액의 가스를 제거한 후, 고체 메틸-3-브로모벤조에이트, 또는 메틸-4-브로모벤조에이트 (1.35 g, 6.3 mmol)와 이어서 Pd(O) 촉매 {[(C₆H₅)₃P]₄Pd; 0.023 g, 0.003 mmol}로 처리하였다. 반응 혼합물을 질소 하에 출발 브로모벤조에이트가 TLC 분석에 의해 소모된 것으로 측정될 때까지 환류온도에서 유지하였다고 (2시간). 그런 다음 반응 혼합물을 250 mL의 물로 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3×50 mL). 유기층을 조합하여 포화 중탄산 나트륨 용액으로 세척하고 (2×50 mL) 건조시켰다 (Na₂SO₄). 용매를 감압하에 제거하고 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 (100 g)상에서 크로마토그래피하였다. 헥산 중의 40 % 에틸 아세테이트로 용출함으로서 생성물을 고체 또는 오일로서 얻었다.

수율:

B2-0.45g (31%); m. p. - 170-171 ℃.

B3-0.69 g (62%); 오일.

¹H NMR(CDCl₃) d B2-3.94 (s, 3H,-COOCH₃), 4.73 (s, 2H, -CH₂-Ph), 7.475 (d, 2H, J=5Hz), 7.6 (d, 2H, J=10 Hz), 7.65 (d, 2H, J=5Hz) 및 8.09 (d,2H, J=10 Hz).

M. S.-m/e -243.0 [M+H]

B3-3.94 (s, 3H,-COOCH₃), 4.76 (s, 2H, -CH₂-Ph), 7. 50 (m, 4H), 7.62 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 8.00 (s, 1H) 및 8.27 (s, 1H).

M.S.-m/e -243.2[M+H]

2. 아지도메틸비페닐 카르복실레이트 :

건조 디클로로메탄 (10 mL)중의 상기 비페닐 알코올 (2.0 mmol)을 얼음으로 냉각시키고 디페닐포스포릴 아지드 (2.2 mol) 및 DBU (2.0 mmol)로 처리하고 질소 하에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다 (2×25 mL). 유기층을 조합하여 계속해서 0.5 M 시트르산 용액 (2×25 mL), 물 (2×25 mL)로 세척하고, 건조시켰다 (Na₂SO₄). 요액을 여과하고 감압하에 증발시켜서 미정제 생성물을 얻었다. 4,4'-이성질체를 헥산/에테르로부터 결정화하고, 3,3'-이성질체를 이소프로필 에테르로 분쇄하여 모든 불순물을 제거하였고; 생성물을 TLC 분석에 의해 균질한 것으로 측정하였고, 추가의 정제를 하지 않았다.

수율:

메틸-4-아지도메틸-4-비페닐카르복실레이트- 0.245 g (46 %); m.p.-106-108 ℃.

메틸-3-아지도메틸-3-비페닐카르복실레이트- 0.36 g (59 %, 오일).

¹H NMR(CDCl₃) d - 4,4'-이성질체- 3.95 (s, 3H, -COOCH₃), 4.41 (s, 2H, -CH₂N₃), 7.42 (d, 2H, J=5 Hz), 7.66 (m, 4H) 및 8.11 (d, 2H, J=5 Hz) 3,3'-이성질체- 3.94 (s, 3H, -COOCH₃), 4.41 (s, 2H, -CH₂N₃), 7.26-7.6 (m, 5H), 7.76 (d, 1H, J=10 Hz), 8.02 (d, 1 H, J=5 Hz) 및 8.27 (s, 1H).

3. 비페닐카르복실레이트의 메틸 에스테르의 가수분해:

약 4ml의 메틸 에스테르를 20 mL의 2 M 수산화 리튬 용액으로 처리하고 용액이 균질하게 될 때까지 교반하였다 (20 내지 24시간). 수성층을 50 mL의 에테르로 2회 세척하고, 유기층을 버렸다. 수성층을 0.5 M의 시트르산으로 산성화하고, 침전된 고체를 여과한 후 건조시켰다. 다른 정제과정은 필요하지 않았고, 산을 다음 단계에 사용하였다.

수율:

4,4'-이성질체 - 0.87 g의 메틸 에스테르로 0.754 g의 산 (86.6 %): m.p.- 205-210 ℃.

3,3'-이성질체 - 0.48 g의 메틸 에스테르로 0.34 g의 산 (63.6 %): m.p.- 102-105 ℃.

¹H NMR(DMSO-d₆) d: 4,4'-이성질체- 4.52 (s, 2H, -CH₂N₃), 7.50 (d, 2H, J=5 Hz), 7.9 (m, 4H), 및 8.03 (d, 2H, J=10 Hz) 3,3'-이성질체- 4.54 (s, 2H, -CH₂N₃), 7.4 (d, 1H, J=10 Hz), 7.5-7.7 (m, 4H), 7.92 (ABq, 2H) 및 8.19 (s,1H).

4. 아지드의 아민으로의 환원:

이 과정은 고체상에서 수행하였고, 아민은 분리되지 않았다. 아지도카르복실산을 표준 펩티드 커플링 프로토콜을 사용하여 수지 위에 로딩하였다. 세척후에 아지드를 함유하고 있는 수지를 THF/물 (95:5)중의 20 당량의 트리페닐포스핀과 함께 24시간 동안 흔들어주었다. 그 용액을 포지티브 질소 압력하에 제거하고, 표준 세척 과정에 의해 세척하였다. 그 결과의 아민을 다음 단계 커플링에 사용하였다.

5. (3β,5β,7α,12α)-3-[{(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )아미노]아세틸}아미노-7,12- 디히드록시콜란 -24-오산:

트리부틸아민 (3.2 mL, 13.5 mmol)을 0 ℃에서 교반된 THF (80 mL)중의 Fmoc-글리신 (4.0 g, 13.5 mmol) 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 이소부틸클로로포르메이트 (1.7 mL, 13.5 mmol)를 계속해서 첨가하고, 10분 후에 DMF (80 mL)중의 트리부틸아민 (2.6 mL, 11.2 mmol) 및 (3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산 (4.5 g, 11.2 mmol)의 현탁액을 1시간에 걸쳐 냉각된 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 그 혼합물을 주변 온도로 가온되도록 놓아두고, 6시간 후 용액을 120 mL로 농축한 다음 물 (180 mL) 및 1 N HCl (30 mL)을 첨가하였다 (최종 pH 1.5). 침전된 고체를 여과하고, 물로 세척한 후 (2×100 mL), 진공 건조하고 플래쉬 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 클로로포름/메탄올 (8:2)로 용출하여 생성물을 무색 고체로서 얻었다.

수율: 1.9 g (25 %). TLC: R_f 0.30 (CHCl₃/MeOH/NH₄OH-6:3:1).

화합물의 시험관내 및 생체내 시험

실시예 XLIII : PC3 셀라인에서 GRP 수용체에 대한 시험관내 결합 분석 - 도 14A-B

잠재적인 유도 화합물을 확인하기 위하여 GRP-R에 대한 친화력이 높은 화합물을 확인하는 시험관내 분석법을 사용하였다. 사람 전립선암으로부터 유도된 PC3 셀라인이 세포 표면에서 GRP-R을 다량 발현하는 것으로 알려져 있기 때문에, 96-웰 플레이트 포맷의 방사성 리간드 결합 분석을 전개하였고, 이 분석이 GRP-R 포지티브 PC3 세포에 대한 ¹²⁵I-BBN의 결합과 본 발명의 화합물이 이 결합을 억제하는 능력을 측정할 수 있음을 확증하였다. 이 분석법을 사용하여 RP527 리간드인 D03A- 모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂ (대조표준) 및 GRP-R에 대한 ¹²⁵I-BBN의 결합을 억제하 는 본 발명의 화합물을 측정하였다. (RP527 = N,N-디메틸글리신-Ser-Cys (Acm)-Gly-5-아미노펜탄산-BBN (7-14) [SEQ.ID.NO:1], MS = 1442.6 및 IC50 - 0.84; Van de Wiele C, Dumont F et al., Technetium-99m RP527, a GRP analogue for visualization of GRP receptor-expressing malignancies: a feasibility study. Eur. J. Nucl. Med. 27; 1694-1699 (2000)). D03A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂는 또한 DO3A-모노아미드-8-아미노-옥탄산-BBN(7-14)[SQE.ID.NO:1]로서도 언급되며, MS값이 1467.0이다. DO3A 모노아미드-아미노옥타닐-BBN[7-14].

방사성 리간드 결합 플레이트 분석법은 BBN 및 BBN 유사체 (시판되는 BBN 및 L1을 포함함)에 대해 정당성이 확인되었고, 또한 ^{99 m}Tc RP527을 방사성 리간드로서 사용하는 것도 확인되었다.

A. 재료 및 방법:

1. 세포 배양:

PC3 (사람 전립선암 셀라인)을 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션으로부터 얻어서 RPMI 1640 (ATCC)에 넣어 조직 배양 플라스크 (Corning)에서 배양하였다. 이 성장 배지에는 10 % 열 비활성화 FBS (Hyclone, SH30070.03), 10 mM의 HEPES (GibcoBRL, 15630-080), 및 페닐실린-스트렙토마이신의 최종 농도 (100 유니트/mL)를 위해 항생물질/항사상균제 (GibcoBRL, 15240-062), 및 펀지조운(fungizone)(0.25 ㎍/mL)이 첨가되어 있다. 모든 배양을 5 % CO₂/95 % 공기를 포함한 습도 조절된 대기 중에서 37 ℃에서 유지하였고, 표시된 경우에는 0.05 % 트립신/EDTA (GibcoBRL 25300-054) 를 사용하여 통과하였다. 실험용 세포는 2.0×10⁴/웰의 농도로 96-웰 화이트/클리어 바닥 미소적정 플레이트 (Falcon Optilux-1) 또는 96 웰 블랙/클리어 콜라겐 I 셀웨어 플레이트 (Beckton Dickinson Biocoat)에서 플레이트하였다. 플레이트를 플레이팅 후 제 1일 또는 제 2일에 결합 연구에 사용하였다.

2. 결합 완충제 :

20 mM의 HEPES, 0.1 %의 BSA (w/v), 0.5 mM의 PMSF (AEBSF), 박시트라신 (50 mg/500 ml), pH 7.4가 포함된 RPMI 1640 (ATCC). ¹²⁵I-BBN (담체 없음, 2200 Ci/mmol)은 Perkin-Elmer로부터 받았다.

B. PC3 세포에서 GRP -R에 대한 ¹²⁵ I- BBN 을 사용한 경합 분석:

96-웰 플레이트 분석법을 사용하여 사람 GRP-R에 대한 ¹²⁵I-BBN의 결합을 억제하는 본 발명의 다양한 화합물의 IC₅₀을 측정하였다. 다음의 일반 과정을 사용하였다:

시험된 모든 화합물을 결합 완충제에 녹이고 또한 결합 완충제로 적절한 희석을 수행하였다. 분석을 위한 PC3 세포 (사람 전립선암 셀라인)를 2.0×10⁴/웰의 농도로 96-웰 화이트/클리어 바닥 미소적정 플레이트 (Falcon Optilux-1) 또는 96 웰 블랙/클리어 콜라겐 I 셀웨어 플레이트 (Beckton Dickinson Biocoat)에서 플레이트하였다. 플레이트를 플레이팅 후 제 1일 또는 제 2일에 결합 연구에 사용하였다. 플레이트를 분석 전에 집밀도에 대하여 (>90 % 집밀도) 체크하였다. 분석을 위 해서 RP527 또는 DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂ 리간드 (대조표준), 또는 1.25×10^-9 M 내지 5×10^-9 M 범위의 농도의 본 발명의 화합물을 ¹²⁵I-BBN (25,000 cpm/웰)과 함께 인큐베이션하였다. 이들 연구는 웰당 75 ㎕의 분석 부피로 수행하였다. 각 데이터 포인트에 대하여 세 개 한 벌의 웰을 사용하였다. 적절한 용액이 첨가된 후에 플레이트를 1시간 동안 4 ℃에서 인큐베이션하여 리간드-수용체 복합체의 내부화를 방지하였다. 인큐베이션은 200 ㎕의 빙냉 인큐베이션 완충제를 첨가함으로써 종료하였다. 플레이트를 5회 세척하고 압지 건조하였다. 방사능을 LKB CompuGamma 카운터 또는 미소적정 신틸레이션 카운터를 사용하여 검출하였다.

RP527 (대조표준) 및 본 발명의 화합물인 L70에 대한 경합 결합 곡선을 도 14A-B에 도시한다. 이들 데이터는 RP527 대조표준의 IC50이 2.5 nM이고, 본 발명의 화합물인 L70의 IC50이 5 nM임을 보여준다. DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂ 대조표의 IC50은 5 nM이었다. 본 발명의 화합물들에 대한 IC50 값은 상기 표 1-3에 열거되어 있으며, 그것은 본 발명의 화합물들이 대조표준과 필적할 만하며, 따라서 생체내에서 수용체를 내포하고 있는 세포에 의해 흡수될 수 있을 정도로 수용체에 대한 충분한 친화력을 가지고 있는 것으로 예상할 수 있다.

C. 내부화 & 유출 분석:

이들 연구는 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 혈청 단백질을 제거하기 위하여, PC3 세포를 ¹²⁵I-BBN, ¹⁷⁷Lu-DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂ 또는 본 발명의 방사성 표지된 화합물과 함께 40분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션은 200 ㎕의 빙-냉 결합 완충제를 첨가함으로써 종료하였다. 플레이트를 결합 완충제로 2회 세척하였다. 표면-결합된 방사성 리간드를 제거하기 위하여 세포를 0.2 M의 아세트산 (식염수중의), pH 2.8과 함께 2분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 원심분리하고 산 세척 배지를 수집하여 내부화되지 않은 방사능의 양을 측정하였다. 세포를 수집하여 내부화된 ¹²⁵I-BBN의 양을 측정하였고, 모든 샘플을 감마 카운터로 분석하였다. 내부화 분석에 대한 데이터를 다양한 시간점에서 얻어진 카운트를 최종 시간점 (T40분)에서 얻어진 카운트와 비교함으로써 표준화하였다.

유출 연구를 위해서는 PC3 세포를 ¹²⁵I-BBN 또는 방사성 표지된 본 발명의 화합물로 40분 동안 37 ℃에서 로딩한 후에 미결합 물질을 여과하고, 내부화 %를 상기와 같이 측정하였다. 그런 다음 세포를 결합 완충제에 37 ℃에서 3시간까지 현탁하였다. 0.5, 1, 2, 또는 3시간째에 초기 로딩 수준에 비교하여 내부화된 잔류량을 상기와 같이 측정하고, 하기 표 5에 기록된 % 유출을 계산하는 데 사용하였다.

이들 데이터는 본 발명의 화합물이 PC3 세포에 의해 대조표준과 유사한 정도로 내부화되고 보유됨을 나타낸다.

실시예 XLIV - Tc - 표지된 GRP 화합물의 제조

표 6에서 확인된 본 발명의 화합물의 펩티드 용액을 0.1 % 수성 TFA 중의 1 mg/mL 농도로 제조하였다. 염화 주석 용액을 1 N HCl에 SnCl₂ㆍ2H₂O (20 mg/mL)을 녹임으로써 제조하였다. 20 ㎍의 SnCl₂ㆍ2H₂O/100 μL를 함유하는 글루콘산 주석 용액을, SnCl₂ 용액의 일정액 (10 μL)을 물에 13 mg의 글루콘산 나트륨을 녹임으로써 제조한 글루콘산 나트륨 용액에 첨가함으로써 제조하였다. 히드록시프로필 감마 시클로덱스트린 [HP-γ-CD] 용액을 50 mg의 HP-γ-CD를 1 mL의 물에 녹임으로써 제조하였다.

아래에 표시된 ^{99 m}Tc 표지된 화합물을 미표지 화합물 (20 ㎍)의 20 μL 용액, 50 μL의 HP-γ-CD 용액, 100 μL의 Sn-글루콘산염 용액 및 20 내지 50 μL의 ^99mTc 퍼테크네테이트 (5 내지 8 mCi, Syncor)를 혼합함으로써 제조하였다. 최종 부피는 200 μL 정도였고, 최종 pH는 4.5 내지 5였다. 반응 혼합물을 100 ℃에서 15 내지 20분 동안 가열한 후, 역상 HPLC에 의하여 방사성 화학 순도 (RCP)에 대하여 측정하였다. 원하는 생성물 피크를 HPLC에 의하여 분리하고, 5 mg/mL의 아스코르브산, 16 mg/mL의 HP-γ-CD 및 50 mM의 포스페이트 완충제, pH 4.5를 함유하는 안정제 완충액에 수집하고, 아세토니트릴을 제거하기 위해 속도 진공을 사용하여 농축하였다. 분석 및 정제를 위해 사용된 HPLC 시스템은 다음과 같았다: C18 Vydac 칼럼, 4.6×250 mm, 수성상: 물 중의 0.1 % TFA, 유기상: 아세토니트릴 중의 0.085 % TFA. 유속: 1 mL/분. 각각의 펩티드의 특성에 따라 20 % 내지 25 %의 아세토니트릴/0.085 % TFA에서의 이소크라틱 (isocratic) 용출을 사용하였다.

표지화 결과를 하기 표 6에 요약한다.

실시예 XLV - 세포 결합 및 생체내 분포 연구를 위한 ¹⁷⁷ Lu - L64 의 제조

이 화합물은 10 ㎍의 L64 리간드 (물 중의 1 mg/ml 용액, 10 μL), 100 μL의 아세트산 암모늄 완충액 (0.2 M, pH 5.2) 및 0.05 N HCl (MURR)중의 ~1-2 mCi의 ¹⁷⁷LuCl₃를 90 ℃에서 15분 동안 인큐베이션함으로써 합성하였다. 유리 ¹⁷⁷Lu를 물 중의 1 % Na₂EDTAㆍH₂O (Aldrich) 용액 20 μL를 첨가함으로써 제거하였다. 그 결과의 방사성 화학 순도 (RCP)는 ~95 %였다. 방사성 표지된 생성물을 미표지 리간드 및 다른 불순물로부터 HPLC에 의하여, PMC 기본 C8 칼럼 [4.6×150 mm]을 사용하여, 칼럼 온도는 30 ℃로, 유속은 1 mL/분으로 하고, 30분에 걸쳐 68 % A/32 % B 내지 66 % A/34 % B의 구배 (A는 시트르산염 완충액 (0.02 M, pH 3.0)이고, B는 80 % CH₃CN/20 % CH₃OH이다)로 분리하였다. 분리된 화합물의 RCP는 거의 100 %였고, HPLC 보유 시간은 23.4분이었다.

생체내 분포 및 세포 결합 연구를 위한 샘플을, 원하는 HPLC 피크를 1000 μL의 시트르산염 완충액 (0.05 M, pH 5.3, 1 % 아스코르브산, 및 0.1 % HSA 함유)에 넣음으로써 제조하였다. 수집된 용출액 중의 유기 용출물을 30분 동안 원심분리함으로써 제거하였다. 세포 결합 연구를 위해, 정제된 샘플을 시험관내 연구를 시작하고 30분 이내에 세포-결합 배지로 1.5 μCi/mL로 희석하였다. 생체내 분포 연구를 위해서는, 샘플을 생체내 연구를 시작하고 30분 이내에 최종 농도가 50 μCi/mL이 되도록 시트르산염 완충액 (0.05 M, pH 5.3, 1 % 아스코르브산, 및 0.1 % HSA 함유)으로 희석하였다.

실시예 XLVI - 방사성 치료 연구를 위한 ¹⁷⁷ Lu - L64 의 제조

이 화합물은 70 ㎍의 L64 리간드 (물 중의 1 mg/ml 용액, 70 μL), 200 μL의 아세트산 암모늄 완충액 (0.2 M, pH 5.2) 및 0.05 N HCl (MURR)중의 ~30-40 mCi의 ¹⁷⁷LuCl₃를 85 ℃에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 합성하였다. 실온으로 냉각한 후에 유리 ¹⁷⁷Lu를 물 중의 1 % Na₂EDTAㆍH₂O (Aldrich) 용액 20 μL를 첨가함으로써 제거하였다. 그 결과의 방사성 화학 순도 (RCP)는 ~95 %였다. 방사성 표지된 생성물을 미표지 리간드 및 다른 불순물로부터 HPLC에 의하여, 1 mL/분의 유속으로 물로, 50 % 아세토니트릴/물 및 1 g/L의 아세트산 암모늄 수용액의 순서로 용출하는 300VHP 음이온 교환 칼럼 (7.5×50 mm)(Vydac)을 사용하여 분리하였다. 원하는 화합물은 50 %의 CH₃CN으로 칼럼으로부터 용출되었고, 5 %의 아스코르브산, 0.2 %의 HSA 및 0.9 % (v:v)의 벤질 알코올을 함유하는 약 1 mL의 시트르산염 완충액 (0.05 M, pH 5.3)과 혼합하였다. 분리된 분획의 유기 부분을 40분 동안의 스핀 진공에 의하여 제거하였고, 농축된 용액 (~ 20-25 mCi)을 생체내 연구를 시작하고 30분 이내에 5 %의 아스코르브산, 0.2 %의 HSA 및 0.9 % (v:v)의 벤질 알코올을 함유하는 시트르산염 완충액 (0.05 M, pH 5.3)을 사용하여 7.5 mCi/mL의 농도로 조정하였다. 그 결과의 화합물의 RVP는 >95 %였다.

실시예 XLVII - ¹¹¹ In- L64 의 제조:

이 화합물은 10 ㎍의 L64 리간드 (0.01 N HCl중의 2 mg/ml 용액, 5 μL), 60 μL의 에탄올, 0.05 N HCl (80 μL)중의 1.12 mCi의 ¹¹¹InCl₃ 및 155 μL의 아세트산 나트륨 완충액 (0.5 M, pH 4.5)을 85 ℃에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 합성하였다. 유리 ¹¹¹In을 물 중의 1 % Na₂EDTAㆍH₂O (Aldrich) 용액 20 μL를 첨가함으로써 제거하였다. 그 결과의 방사성 화학 순도 (RCP)는 87 %였다. 방사성 표지된 생성물을 미표지 리간드 및 다른 불순물로부터 HPLC에 의하여, Vydac C18 칼럼 [4.6×250 mm]을 사용하여, 칼럼 온도는 50 ℃로, 유속은 1.5 mL/분으로 하고, 20분에 걸쳐 75 % A/25 % B 내지 65 % A/35 % B의 구배 (A는 물 중의 0.1 % TFA이고, B는 아세토니트릴 중의 0.085 % TFA이다)로 분리하였다. 이 시스템으로 ¹¹¹In-L64에 대한 보유 시간은 15.7분이었다. 분리된 화합물의 RCP는 96.7 %였다.

실시예 XLVIII - ¹⁷⁷ Lu - DO3A - 모노아미드 - Aoc - QWAVGHLM - NH ₂ (대조표준)의 제조

펩티드의 스톡 용액을 DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂ 리간드 (US 출원 공개 번호 2002/0054855 및 WO 02/87673에 기재되어 있는 바와 같이 제조됨)를 0.01 N HCl에 1 mg/mL의 농도로 녹임으로써 제조하였다. ¹⁷⁷Lu-DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂를 다음의 시약을 아래에 제시된 순서대로 혼합함으로써 제조하였다:

0.2 M NH4OAc, pH 6.8 -------------- 100 μL

펩티드 스톡, 1 mg/mL/0.01 N HCl --- 5 μL

¹⁷⁷LuCl₃ (MURR)/0.05 M HCl ----------- 1.2 μL (1.4 mCi)

반응 혼합물을 85 ℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그것을 수조에서 실온으로 냉각시킨 후 20 μL의 1 % EDTA 용액 및 20 μL의 EtOH를 첨가하였다. 화합물을 1 mL/분의 유속 및 21 내지 25 % B의 구배 (A는 0.1 % TFA/H₂0이고 B는 0.1 % TFA/CH₃CN이다)로 20분에 걸쳐 용출하는 C18 칼럼 (VYDAC Cat #218TP54)을 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다. ¹⁷⁷Lu-DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂는 97.1 % 수율 (RCP)로 형성되었고, 보유 시간은 이 시스템에서 ~16.1분이었다.

실시예 XLIX - 177 Lu - L53 의 제조

이 화합물은 ¹⁷⁷Lu-DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂에 대하여 설명된 바와 같이 제조하였다. 화합물을 1 mL/분의 유속 및 30 내지 34 % B의 구배 (A는 0.1 % TFA/H₂0이고 B는 0.1 % TFA/CH₃CN이다)로 20분에 걸쳐 용출하는 C18 칼럼 (VYDAC Cat #218TP54)을 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다. 형성된 ¹⁷⁷Lu-L63의 RCP는 97.8 %였고, 보유 시간은 이 시스템에서 ~14.2분이었다.

실시예 L - 세포 결합 및 생체내분포 연구를 위한 177 Lu - L70 의 제조

이 화합물은 상술된 과정을 따라 제조하되, 단 L70 (실시예 II의 리간드)으로 대체하였다. 정제는 YMC 기본 C8 칼럼 (4.6×150 mm)을 사용하여, 30 ℃의 칼럼 온도 및 1 mL/분의 유속을 사용하고, 40분에 걸쳐 80 % A/20 % B 내지 75 % A/25 % B의 구배 (A는 시트르산염 완충액 (0.02 M, pH 4.5)이고, B는 80 %의 CH₃CN/20 %의 CH₃OH이다)로 수행하였다. 분리된 화합물의 RCP는 거의 100 %였고, HPLC 보유 시간은 25.4분이었다.

실시예 LI - 방사성 치료 연구를 위한 177 Lu - L70 의 제조

이 화합물은 L64에 대해 상기에서 설명한 것과 같이 제조하였다.

실시예 LII - 세포 결합 및 생체내 분포 연구를 위한 111In- L70 의 제조

이 화합물은 10 ㎍의 L70 리간드 (0.01 N HCl중의 1 mg/ml 용액, 10 μL), 180 μL의 아세트산 암모늄 완충액 (0.2 M, pH 5.3), 0.05 N HCl중의 1.1 mCi의 ¹¹¹InCl₃ (61 μL, Mallinckrodt) 및 50 μL의 식염수를 85 ℃에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 합성하였다. 유리 ¹¹¹In을 물 중의 1 % Na₂EDTAㆍH₂O (Aldrich) 용액 20 μL를 첨가함으로써 제거하였다. 그 결과의 방사성 화학 순도 (RCP)는 86 %였다. 방사성 표지된 생성물을 미표지 리간드 및 다른 불순물로부터 HPLC에 의하여, Vydac 강력 음이온 교환 칼럼 [7.5×50 mm]에 연결된 Waters XTerra C18 카트리지를 사용하여, 30 ℃의 칼럼 온도와 1 mL/분의 유속을 사용하고, 하기 표에 열거한 구배 (A는 물 중의 0.1 mM NaOH, pH 10.0이고, B는 물 중의 1g/L의 아세트산 암모늄, pH 6.7이며, C는 아세토니트릴이다)를 사용하여 분리하였다. 이 시스템에서 ¹¹¹In-L70에 대한 보유 시간은 15분인 한편, L70 리간드에 대한 보유 시간은 27 내지 28분이었다. 분리된 화합물의 RCP는 96 %였다.

생체내 분포 및 세포 결합 연구를 위한 샘플을, 원하는 HPLC 피크를 500 μL의 시트르산염 완충액 (0.05 M, pH 5.3, 5 % 아스코르브산, 1 mg/mL의 L-메티오닌 및 0.2 % HSA 함유)에 넣음으로써 제조하였다. 수집된 용출액 중의 유기 용출물을 30분 동안 원심분리함으로써 제거하였다. 세포 결합 연구를 위해, 정제되고 농축된 샘플을 시험관내 연구를 시작하고 30분 이내에 사용하였다. 생체내 분포 연구를 위해서는, 샘플을 생체내 연구를 시작하고 30분 이내에 최종 농도가 10 μCi/mL이 되도록 시트르산염 완충액 (0.05 M, pH 5.3, 5 % 아스코르브산 나트륨 및 0.2 % HSA 함유)으로 희석하였다.

실시예 LIII - 생체내 약물학 연구

A. 흔적량 생체내 분포:

저용량의 약물학 연구 (예컨대 생체내 분포 연구)를 아래에 표시된 본 발명의 화합물을 사용하여 이종이식된, PC3 종양-내포 누드 마우스 ([Ncr]-Foxn1<nu>)에서 수행하였다. 모든 연구에서 마우스들에게 100 μL의 177Lu-표지된 시험 화합물을 200 μCi/kg의 농도로, 정맥내로, 그룹 (n=3-4)당 1 및 24시간의 잔류 시간으로 투여하였다. 조직을 LKB 1282 CompuGamma 카운터에서 적절한 표준을 사용하여 분석하였다.

L64와 L70의 주사 후 혈액, 간 및 신장에서의 방사능의 분포가 대조 화합물인 DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂의 그것과 유사한 한편, 종양의 흡수는 L64와 L70 둘 다에 대해 1 및 24시간째에 훨씬 더 높았다. L63은 또한 혈액과 간의 수치가 초기에 증가되었음에도 불구하고 높은 종양 흡수를 나타낸다. GRP 수용체를 가지고 있는 것으로 알려져 있는 정상 기관인 마우스 췌장에서의 흡수는 대조 화합물인 DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂보다 L64, L70 및 L63에 대해 훨씬 더 높다.

실시예 LIV - 수용체 하위타입 특이성

현재 알려져 있는 GRP 수용체 패밀리의 포유류 구성원은 4가지이다 GRP-선호 수용체 (GRP-R), 뉴로메딘-B 선호 수용체 (NMB-R), 봄베신 수용체 하위타입 3 (BB3-R) 및 봄베신 수용체 하위타입 4 (BB4-R). ¹⁷⁷Lu-L70의 수용체 하위타입 특이성을 조사하였다. 그 결과는 ¹⁷⁷Lu-L70이 특이하게 GRP-R 및 NMB-R에 결합하며, BB3-R에 대한 친화력은 거의 없음을 나타낸다.

L70의 루테늄 복합체 (¹⁷⁷Lu-L70)(상술된 것과 같이 제조됨)의 하위타입 특이성은 문헌에 기재된 과정을 사용하여 시험관내 수용체 자동방사선 사진(Reubi et al., "Bombesin Receptor Subtypes in Human Cancers: Detection with the Universal Radioligand ¹²⁵I-[D-Tyr⁶, beta-Ala, Phe^l3, Nle¹⁴]", Clin. Cancer Res. 8: 1139-1146 (2002)), 및 이전에는 GRP 수용체의 유일한 하위타입을 발현하는 것으로 공지되었던 조직 샘플, 뿐만 아니라 정상 췌장 및 결장을 포함하여 비-신생 조직과 만성 췌장염 (하기 표 8A에 표시됨)에 의하여 측정하였다. 사람 회장 암양종 조직을 NMB-R, GRP-R에 대한 사람 전립선 암종 및 BB3-R 하위타입 수용체에 대한 사람 기관지 암양종에 대한 공급원으로서 사용하였다. 비교를 위해 수용체 자동방사선 사진을 또한 다른 봄베신 방사성 리간드, 예컨대 125I-Tyr4-봄베신 또는 인접한 조직 단면상에서 세 개의 모든 GRP-R의 하위세트에 결합하는 보편적 리간드로 알려져 있는 화합물, ¹²⁵I-[D-Tyr⁶, beta-Ala, Phe^l3, Nle¹⁴]-BBN(6-14)으로 수행하였다. (추가의 논의는 문헌 참조: Fleischmann et al., "Bombesin Receptors in Distinct Tissue Compartments of Human Pancreatic Diseases," Lab. Invest. 80: 1807-1817 (2000); Markwalder et al., "Gastin-Releasing Peptide Receptors in the Human Prostate: Relation to Neoplastic Transformation," Cancer Res. 59: 1152-1159 (1999); Gugger et al., "GRP Receptors in Non-Neoplastic and Neoplastic Human Breast," Am. J. Pathol. 155: 2067-2076 (1999)).

상기 표 8A에서 알 수 있듯이, 수립된 방사성 리간드를 사용하여 확인된, 모든 GRP-R-발현 종양, 예컨대 전립선암, 유방암 및 신장 세포 암종은 또한 시험관내에서 ¹⁷⁷Lu-L70으로 가시화되었다. 보다 나은 민감성 때문에 GRP-R 수준이 낮은 선택된 종양은 ¹²⁵I-Tyr⁴-BBN으로가 아니라 ¹⁷⁷Lu-L70으로 확인할 수 있었다. 역으로 BB3 종양 중 어느 것도 ¹⁷⁷Lu-L70으로 확인할 수 없었다. 상기 표 8A에 열거된 다양한 유형의 종양에서 수용체 발현의 자연적 발생에 대해서는, 시험한 경우들이 소수는 선택된 네가티브 대조표준이긴 하지만 대부분의 경우 수용체-포지티브로서 선택되었기 때문에 어떠한 결론도 내려서는 안된다. 정상적인 사람 췌장은 ¹⁷⁷Lu-L70으로 표지되지 않는 한편, 마우스 췌장은 동일한 조건하에서 강력하게 표지된다. 정상 췌장이 매우 빠르게 분해될 수 있는 조직이고 누구든지 완전하게 수용체를 포함한 단백질 분해를 배제할 수 없지만, 사람 췌장 데이터가 실제로는 네가티브라는 것을 시사하는 인자들은 유사한 조건 하에서의 마우스 췌장의 포지티드 대조표준과 조사된 사람 췌장의 질에 대한 포지티브 대조표준을 나타내는, 각각의 사람 췌장샘에서 발견되는 강하게 표지된 BB3를 포함한다. 나아가 병리학적으로 변질된 췌장 조직 (만성 췌장염)에서 GRP-R의 검출은 GRP-R이 존재하는 경우 이 조직에서 선택된 실험적 조건하에서 확인될 수 있음을 시사한다. 실제로 ¹⁷⁷Lu-L70은 만성 췌장염에서 이들 GRP-R을 ¹²⁵I-TyR⁴-BBN보다 큰 민감성으로 확인한다. 췌장암 중 어느 것도 측정할 수 있을 정도의 양으로 GRP-R을 가지고 있지 않지만 몇몇 결장 암종은 ¹⁷⁷Lu-L70으로 측정된, 저밀도의 불균일하게 분포된 GRP 수용체를 나타냈다 (표 8A).

상기 표 8B에서 알 수 있는 것과 같이, 저온 표지된 ¹⁷⁷Lu-L70은 사람 조직에서 발현된 사람 GRP 및 NMB 수용체에 대해 매우 높은 친화력을 나타낸 반면, BB3 수용체에 대해서는 낮은 친화력만을 나타냈다. 이들 실험은 방사성 트레이서로서 ¹²⁵I-[D-Tyr⁶, β-Ala¹¹, Phe^l3, Nle¹⁴]-BBN(6-14)를 사용하였다. ¹⁷⁷Lu-표지된 L70을 방사성 트레이서로서 사용하면 상기 언급된 데이터를 확인하고 확대시킬 수 있다. 모든 GRP-R-발현 사람 암은 ¹⁷⁷Lu-L70으로 매우 강력하게 표지되었다. 실제로 모든 NMB-R-포지티브 종양에 대해서도 동일하였다. 역으로 BB3을 가지는 종양은 가시화되지 않았다. ¹⁷⁷Lu-L70의 민감성은 ¹²⁵I-TyR⁴-BBN 또는 ¹²⁵I-표지된 보편적 봄베신 유사의 민감성보다 더 좋은 것처럼 보인다. 그러므로 저밀도의 GRP-R을 발현하는 몇몇 종양은 ¹⁷⁷Lu-L70으로 쉽게 확인할 수 있는 반면, 그것들은 ¹²⁵I-TyR⁴-BBN으로는 확인되지 않는다. ¹⁷⁷Lu-L70의 결합 특징은 또한 비-신생 조직에서는 확인할 수 없었다. 마우스 췌장은 대조표준으로서 매우 높은 밀도의 GRP-R을 발현하는 것으로 밝혀진 반면, 정상 사람 췌장 포도상선 (acini)은 GRP-R이 없었다. 그러나 만성 췌장염 상태에서 GRP-R은, 문헌에서 이미 보고된 바와 같이, 포도상선에서 (Fleischmann et al., "Bombesin Receptors in Distinct Tissue Compartments of Human Pancreatic Diseases," Lab. Invest. 80:1807-1817 (2000)), 및 조직에서 ¹²⁵I-TyR⁴-BBN을 사용해서라기보다는 ¹⁷⁷Lu-L70을 사용함으로써 더 좋은 민감성을 가지고 있는 것으로 확인될 수 있었다. 역으로 BB3-발현 샘(islet)들은 ¹⁷⁷Lu-L70으로는 검출할 수 없었던 한편, 그것들은 문헌에서 보고된 바와 같이 보편적 리간드로 강력하게 표지되었다 (Fleischmann et al., "Bombesin Receptors in Distinct Tissue Compartments of Human Pancreatic Diseases," Lab. Invest. 80:1807-1817 (2000)). 소수의 결장 암종이 매우 낮은 밀도로 및 불균일하게 분포된 GRP-R을 가지고 있는 한편, 정상적인 결장 평활근은 고밀도의 GRP-R을 나타냈다.

표 8A 및 8B의 결과는 Lu 표지된 L70 유도체가 주로 GRP-R을 발현하는 사람 전립선 암종에 대해 잘 결합할 것으로 기대된다는 것을 시사한다. 표의 결과는 또한 Lu 표지된 L70 유도체가 정상적인 사람 췌장 (주로 BB3-R 수용체를 발현한다), 또는 주로 BB3-R 수용체 하위타입을 발현하는 암에 잘 결합할 것으로 예상되지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 LV - 방사성 치료 연구

A. 효능 연구:

방사성 치료 연구는 PC3 종양-내포 누드 마우스 모델을 사용하여 수행하였다. 단기 효능 연구에서 본 발명의 177Lu 표지된 화합물, L64, L70, L63 및 처리 대조 화합물 DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂를 미처리 대조군과 비교하였다 (n=12, 30일까지 각 처리 군에 대하여; n=36, 31일까지의 모아진 미처리 대조군에 대하여). 모든 효능 연구에 대해 마우스들에게 100 μL의 본 발명의 177Lu-표지된 화합물을 30 mCi/kg의 농도로 멸균 조건하에서 i.v. 또는 s.c로 투여하였다. 실험 마우스들을 연구 기간 동안 장벽 환경에 가두어 놓았다. 체중 및 종양 크기 (캘리퍼 측정에 의한)를 각 마우스에 대해 일주일에 3회씩 연구 기간 동안 수집하였다. 초기 종결에 대한 기준은 사망; 20 % 또는 그 이상의 총 체중 (TBW)의 손실; 2 cm³ 또는 그것보다 큰 종양 크기를 포함하였다. 단기 효능 연구 결과는 도 15A에 도시한다. 이들 결과는 L70, L64 또는 L63으로 처리된 동물이 처리를 받지 않은 대조 동물들 및 동일한 양의 DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂ 대조표준을 받은 동물들보다 월등한 생존 증가를 나타낸 것을 보여준다.

장기간 효능 연구는 전과 같은 양의 L64 및 L70을 사용하여 수행하였지만, 화합물에 대해 더 많은 동물 (n=46)을 사용하였고, 120일까지 기간이 연장되었다. 장기간 효능 연구 결과는 도 15B에 도시된다. 이전과 같은 동일한 대조표준과 관련하여 (n=36), L64 및 L70 처리는 둘 다 생존율이 상당히 증가되었으며 (p<0.0001), 비록 통계학적으로 상호간에 상이하지는 않더라도 (p<0.067) L70이 L64보다 더 좋았다.

실시예 LVI - 절편 커플링을 사용한 L64 및 L70 의 대체 제조

화합물 L64 및 L70은 일반적으로 A 내지 D로 표시되는 중간체 집합을 사용하여 제조할 수 있는데 (도 19), 그것들은 고체 및 용액상 펩티드 합성법 분야에 공지된 표준 방법에 의해 제조된다 (Synthetic Peptides-A User's Guide 1992, Grant, G., Ed. WH. Freeman Co., NY, Chap 3 and Chap 4 pp. 77-258; Chan, W. C. and White, P. D. Basic Procedures in Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical Approach 2002, Chan, W. C. and White, P. D. Eds Oxford University Press, New York, Chap. 3 pp 41-76; Barlos, K and Gatos, G. Convergent Peptide Synthesis in Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical Approach 2002, Chan, W. C. and White, P. D. Eds Oxford University Press, New York, Chap. 9 pp. 216-228).

이들 방법은 Aloc, Boc, Fmoc 또는 벤질옥시카르보닐-기저 펩티드 합성 스트래티지 또는 고체상 또는 용액상에서의 그런 방법들의 적절하게 선택된 조합을 포함한다. 주어진 단계에 대해 사용될 중간체는 분자 내의 각 위치에 대해 적절한 보호기의 선택을 토대로 선택되며, 보호기는 도 1에 도시된 기의 목록으로부터 선택될 수 있다. 당업자들은 또한 펩티드 합성 방법과 부합할 수 있는, 대체 보호기로 구성된 중간체들이 사용될 수 있고, 상기에 제시한 보호기에 대한 열거된 선택사항들은 예시적인 것으로서 포괄적이 아니며, 그러한 대체 방안도 당해 기술 분야에 잘 알려져 있음을 인지할 것이다.

이것은 단순히 도 20에 예시된 것으로서, 접근법을 개략적으로 설명한 것이다. L64의 합성에서 C1 대신에 중간체 C2를 치환함으로써 동일한 합성 전략이 제공될 때 L70이 얻어진다.

실시예 LVII - 도 49A 및 49B: L69 의 합성

요약: (3β,5β,7a,12a)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산 A를 Fmoc-Cl과 반응시켜서 중간체 B를 얻었다. 옥타펩티드 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ (BBN [7-14])(A)로 기능화된 링크 아미드 수지를 차례로 B, Fmoc-8-아미노-3, 6-디옥사옥탄산 및 DOTA 트리-t-부틸 에스테르와 반응시켰다. 절단 및 시약 B를 사용한 탈보호 후에 미정제 생성물을 예비 HPLC에 의해 정제하여 L230을 얻었다. 전체 수율: 4.2 %.

A. (3β,5β,7a,12a)-3-(9H- 플루오렌 -9- 일메톡시 )아미노-7,12- 디히드록시콜 란-24-오산 B (도 49A)

1,4-디옥산 (18 mL)중의 9-플루오레닐메톡시카르보닐 클로라이드 (1.4 g, 5.4 mmol) 용액을, 0 ℃에서 교반된 10 % aq. Na₂CO₃ (30 mL) 및 1,4-디옥산 (18 mL)중의 (3β,5β,7a,12a)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산 A (2.0 g, 4.9 mmol) 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 그것을 실온에서 6시간 동안 교반한 후 H₂0 (100 mL)을 첨가하고, 수성층을 Et₂O로 세척한 후 (2×90 mL) 2 M HCl (15 mL)을 첨가하였다 (최종 pH 1.5). 침전된 고체를 여과하고, H₂0로 세척한 후 (3×100 mL), 진공 건조한 후, 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 B를 백색 고체로서 얻었다 (2.2 g, 3.5 mmol). 수율 71 %.

B. N-[(3β,5β,7a,12a)-3-[[[2-[2-[[[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10- 테트라아자시클로도데스 -1-일]아세틸]아미노] 에톡시 ] 에톡시 ]아세틸]아미노]-7,12-디히드록시-24- 옥소콜란 -24-일]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알라닐 -L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드, L69 (도 49B)

수지 A (0.5 g, 0.3 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 여과한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 여과하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 (3β,5β,7a,12a)-3-(9H-플루오렌-9-일메톡시)아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산 B (0.75 g, 1.2 mmol), N-히드록시벤조트이라졸 (HOBt) (0.18 g, 1.2 mmol), N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC) (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하고, 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 (0.79 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 여과한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 여과하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 트리스(1,1-디메틸에틸) 에스테르의 NaCl 부가물 (0.79 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g; 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol), N-에틸디이소프로필아민 (0.40 mL; 2.4 mmol), 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔들고, 여과한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B (25 mL)(2)가 들어있는 플라스크에서 4.5시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (20 mL)로 처리하여 침전을 얻었다. 그 침전을 원심분리에 의해 수집하고 Et₂0로 세척하여 (3×20 mL) 고체를 얻었고 (248 mg), 그것을 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제 생성물의 일부 (50 mg)를 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L69를 백색 고체로서 얻었다 (6.5 mg, 3.5×10^-3 mmol)(도 49B). 수율 5.8 %.

실시예 LVIII - 도 50: L144 의 합성

요약: 옥타펩티드 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ (BBN [7-14])(A)로 기능화된 링크 아미드 수지를 4-[2-히드록시-3-[4,7,10-트리스[2-(1,1-디메틸에톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]프로폭시]벤조산과 반응시켰다. 절단 및 시약 B (2)를 사용한 탈보호 후에 미정제 생성물을 예비 HPLC에 의해 정제하여 L144를 얻었다. 전체 수율: 12 %.

A. N-[4-[2-히드록시-3-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자 시클로도데스 -1-일] 프로폭시 ] 벤조일 ]-L- 글루타미닐 -L- 트립토필 -L- 알라닐 -L-발릴-글리실-L-히스티딜-L-로이실-L-메티오닌아미드, L144 (도 50)

수지 A (0.4 g, 0.24 mmol)를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린이 들어있는 고체상 펩티드 합성 용기중에서 10분 동안 흔들고, 용액을 여과한 후, 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하였다. 현탁액을 20분 동안 교반한 후, 용액을 여과하고, 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 수지에 4-[2-히드록시-3-[4,7,10-트리스[2-(1,1-디메틸에톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데스-1-일]프로폭시]벤조산 B (0.5 g, 0.7 mmol), HOBt (0.11 g, 0.7 mmol), DIC (0.11 mL, 0.7 mmol) N-에틸디이소프로필아민 (0.24 mL, 1.4 mmol) 및 DMA (7 mL)를 첨가하였다. 그 혼합물을 24시간 동안 실온에서 흔든 다음, 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). 그런 다음 수지를 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린과 함께 10분 동안 흔들고, 용액을 제거한 후 새로운 DMA (7 mL)중의 50 % 모르폴린을 첨가하고, 혼합물을 다시 20분 동안 흔들어 주었다. 용액을 제거하고 수지를 DMA로 세척하였다 (5×7 mL). Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 (0.79 g, 1.2 mmol), HOBt (0.18 g, 1.2 mmol), DIC (0.19 mL, 1.2 mmol) 및 DMA (7 mL)를 수지에 첨가하였다. 그 혼합물을 3시간 동안 실온에서 흔들고, 용액을 제거한 후 수지를 DMA (5×7 mL), CH₂Cl₂ (5×7 mL)로 세척하고 진공건조하였다. 수지를 시약 B (25 mL)(2)가 들어있는 플라스크에서 4.5시간 동안 흔들어 주었다. 수지를 여과하고, 용액을 감압하에 증발시켜서 유상 미정제물을 얻었고, 그것을 Et₂O (20 mL)로 처리하여 침전을 얻었다. 그 침전을 원심분리에 의해 수집하고 Et₂0로 세척하여 (3×20 mL) 고체를 얻었고 (240 mg), 그것을 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제 생성물의 일부 (60 mg)를 예비 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 L144를 백색 고체로서 얻었다 (10.5 mg, 7.2×10^-3 mmol). 수율 12 %.

실시예 LIX - L300 및 ¹⁷⁷ Lu - L300 의 제조

0.2 g의 링크 아미드 Novagel 수지 (0.63 mmol/g, 0.126 mmol)로부터 L300 (0.033 g, 17 %)을 예비 칼럼 크로마토그래피 후에 얻었다. 보유 시간은 6.66분이었다. 분자식은 C₇₂H₉₉N₁₉O₁₈이다. 계산된 분자량은 1518.71이고, 관측값은 1519.6이다. 서열은 D03A-Gly-Abz4-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Leu-NH₂이다. L300의 구조는 도 51에 도시된다.

L300 (13.9 μL의 0.2 M pH 4.8의 아세트산 나트륨 완충액 중의 13.9 ㎍)을 150 μL의 0.2 M pH 4.8의 아세트산 나트륨 완충액 및 4 μL의 ¹⁷⁷LuCl₃ (1.136 mCi, Missouri Research Reactor)과 혼합하였다. 100 ℃에서 10분 후에 방사성 화학 순도 (RCP)는 95 %였다. 생성물을 Vydac C18 펩티드 칼럼 (4.6×250 mm, 5 ㎛ 기공 크기) 상에서, 물 중의 0.1 %의 TFA (A) 및 아세토니트릴 중의 0.085 % TFA (B)의 수성/유기 구배를 사용하고 1 mL/분의 유속으로 용출하여 정제하였다. 다음의 구배를 사용하였다: 30분 동안 이소크라틱 22 % B, 5분 내에 60 % B, 5분 동안 60 % B를 유지. 18.8분의 보유 시간으로 용출된 화합물을, HSA를 정상 식염수와 주사용 아스코르브산의 9:1 혼합물에 첨가함으로써 제조하여 놓은 0.8 %의 사람 혈청 알부민 용액 1 mL에 수집하였다. 아세토니트릴을 스피드 진공 (Savant)을 사용하여 제거하였다. 정제 후에 화합물의 RCP는 100 %였다.

실시예 LX - GRP 수용체 하위타입에 대한 링커 특이성의 특성확인

두 개의 셀라인, 즉 NMB-R을 발현하는 설치류 글리오블라스토마(gliobalstoma) 셀라인인 C6과, GRP-R을 발현하는 사람 전립선암 셀라인인 PC3을 이 분석에서 사용하였다. 각 수용체 하위타입 (NMB-R 및 GRP-R)에 대한 다양한 미표지 화합물의 친화력을, C6 및 PC3 세포에서 그것의 상응하는 수용체에 대한 ¹²⁵I-NMB 또는 ¹²⁵I-BBN의 결합과 경합하는 그것의 능력을 측정함으로써 간접적으로 측정하였다.

A. 재료 및 방법:

1. 세포 배양:

ATCC (CCL-107)로부터 얻은 C6 세포를 2 mM의 L-글루타민, 1.5 g/L의 중탄산 나트륨, 15 %의 말 혈청 및 2.5 %의 FBS가 첨가되어 있는 F12K 배지 (ATCC)에서 배양하였다. 분석을 위한 세포는 48 웰 폴리-라이신 코팅 플레이트 (Beckton Dickinson Biocoat)에 9.6×10⁴/웰의 농도로 플레이트하였다. PC3를 ATCC (CRL-1435)로부터 얻어서 2 mM의 L-글루타민, 1.5 g/L의 중탄산 나트륨, 10 mM의 HEPES 및 10 %의 FBS가 첨가되어 있는 RPMI 1640 (ATCC)에서 배양하였다. 두 배양물을 5 %의 CO₂/95 % 공기를 포함한 습도 조절 분위기에서 37 ℃에서 유지하였다. 분석을 위한 PC3 세포를 96-웰 화이트/클리어 바닥 플레이트 (Falcon Optilux-I)에 2.0×10⁴ 세포/웰의 농도로 플레이트하였다. 플레이트를 플레이팅 후 2일째에 분석을 위해 사용하였다.

2. 결합 완충제 , 및 방사성- 리간드 :

25 mM의 HEPES, 0.2 %의 BSA 분획 V, 1.0 mM의 AEBSF (CAS #3087-99-7) 및 0.1 %의 Bacitracin (CAS # 1405-87-4), pH 7.4가 첨가되어 있는 RPMI 1640 (ATCC).

특별 주문한 ¹²⁵I-[Tyr⁰] NMB, > 2.0 Ci/μmole (Amersham Life Science)[¹²⁵ I-NMB] 및 시판중인 ¹²⁵I-[Tyr⁴]BBN, >2.0Ci/μmole (Perkin Elmer Life Science)[¹²⁵I-BBN]을 방사성 리간드로서 사용하였다.

B. 시험관내 분석:

48-웰 플레이트 분석 시스템 (C6 연구에 대해)을 사용하여 경합 실험을 ¹²⁵I-NMB를 사용하여 수행하였다. 모든 PC3 연구는 실시예 XLIII에서 설명한 바와 같이 ¹²⁵I-BBN을 사용하여 수행하였다. 분석을 위한 화합물의 선택은 링커 하위타입을 토대로 하였다. 그 결과를 하기 표 9에 나타낸다.

연구로부터 얻어진 결합 매개변수들을 GraphPad Prism으로 단일-부위 경합 비-선형 회귀 분석을 사용하여 분석하였다. C6 세포에서 NMB-R에 대한 다양한 화합물의 상대적인 친화력을 시판중인 [Tyr⁴]-BBN 및 [Tyr⁰]-NMB를 사용하여 얻어진 것과 비교하였다. NMB-R 플러스 GRP-R 선호 화합물과 GRP-R 선호 화합물을 구별하기 위하여, 각 화합물에 대하여 얻어진 IC₅₀ 값을 C6 세포 상에서 ¹²⁵I-NMB를 사용하여 [Tyr⁰]-NMB로부터 얻어진 값과 비교하였다. 두 부류의 화합물 사이의 컷 오프 지점은 [Tyr⁴]-BBN의 IC₅₀×10으로 하였다. 시험한 화합물 중에서 8개의 화합물이 우선적으로 GRP-R에 결합한 반면 (하기 표 10에 제시됨), 32개의 화합물은 GRP-R 및 NMB-R에 유사한 친화력으로 결합하였고, 둘 다 NMB-R에 대한 선호성을 나타냈다.

상기의 결과를 토대로 여러 결과를 관찰하였다. 수용체 결합 영역 (BBN_{7 -14} 또는 BBN_{8 -14})은 단독으로 GRP-R 또는 NMB-R에 어떠한 선호성도 나타내지 않았다. 킬레이터 단독으로 수용체 결합 영역에 첨가되어도 GRP-R 또는 NMB-R (DO3A-모노아미드-QWAVGHLM-NH₂)에 대한 펩티드의 친화력에 기여하지 않았다. 링커를 통하여 펩티드에 킬레이터가 커플링되어도 수용체에 대한 펩티드의 친화력에는 기여하지 못하였다. 그러나 링커의 유형에 따라 이 친화력은 이중적인 것으로부터 (NMB-R과 GRP-R 두 가지에 대한 선호성) GRP-R에 이르기까지 (GRP-R을 선호함) 다양하였다.

링커로서 시험한 ω-아미노알칸산 (¹⁷⁵Lu-DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂및 DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHL-Nle-NH₂의 8-아미노옥탄산, DO3A-모노아미드-Apa3-QWAVGHLM-NH₂의 3-아미노프로피온산 및 DO3A-모노아미드-Abu4-QWAVGHLM-NH₂의 4-아미노부탄산)은 펩티드에 GRP-R 및 NMB-R 두 가지에 대한 이중 친화력을 부여하였다. ¹⁷⁵Lu-DOTA-Aoc-QWAVGHLM-NH₂에서 'Met'를 'Nle'로 대체하는 것은 펩티드의 이런 이중 친화력을 변화시키지 않았다.

콜산 함유 링커 (L64의 3-아미노콜산, L63의 3-아미노-12-히드록시콜란산 및 L67의 3-아미노-12-케토콜란산은 펩티드에 GRP-R 및 NMB-R 두 가지에 대한 이중 친화력을 부여하였다. 시클로알킬 및 방향족 치환된 알라닌 함유 링커 (DO3A-모노아미드-Cha-Cha-QWAVGHLM-NH₂의 3-시클로헥실알라닌, DO3A-모노아미드-Cha-Nal1-QWAVGHLM-NH₂의 1-나프틸알라닌, DO3A-모노아미드-Nal1-Bpa4-QWAVGHLM-NH₂의 4-벤조일페닐알라닌, 및 DO3A-모노아미드-Nal1-Bip-QWAVGHLM-NH₂의 비페닐알라닌)는 펩티드에 GRP-R에 대한 선택적 친화력을 부여하였다. 4-(2-아미노에틸피페라진)-1 만을 함유하는 링커 또한 펩티드에 GRP-R 선택성을 부여하였다 (L89).

G-4-아미노 벤조산 링커를 NMB 서열에 도입하는 것은 화합물에 그것의 고유한 NMB-R 친화력 외에 GRP-R에 대한 친화력을 부여하는 결과를 낳았다 (L227 대 GNLWATGHFM-NH₂). 링커 주변에서 Gly의 위치를 변동시키는 것은 L70의 친화력을 그것의 이중 친화력으로부터 NMB-R에 대한 선택적 친화력으로 변화시키는 결과를 초래하였다. (L204). L70에서 4-아미노벤조산의 3-메톡시 치환은 이중 친화력으로부터 GRP-R에 대한 선택적 친화력으로 변화시켰다.

선행 데이터로부터 링커가 수용체 하위타입 특이성에 상당한 영향을 미친다는 것이 명백하다. 세 그룹의 화합물을 확인할 수 있다:

◈ GRP -R에서 활성인 화합물

이들 화합물은 시험관내에서 및 생체내에서 진단 목적으로 사용될 수 있는 이 수용체에 대해 특이한 정보를 제공한다. 이들 화합물이 치료용 방사성 핵종으로 방사성 표지될 때 치료는 오직 이 수용체를 함유하는 조직에서 수행될 수 있으며, NMB-R을 함유하는 것들은 간과한다.

◈ NMB -R에서 활성인 화합물

이들 화합물은 시험관내에서 및 생체내에서 진단 목적으로 사용될 수 있는 이 수용체에 대해 특이한 정보를 제공한다. 이들 화합물이 치료용 방사성 핵종으로 방사성 표지될 때 치료는 오직 이 수용체를 함유하는 조직에서 수행될 수 있으며, GRP-R을 함유하는 것들은 간과한다.

◈ GRP -R과 NMB -R에서 모두 활성인 화합물

이들 화합물은 시험관내에서 및 생체내에서 진단 목적으로 사용될 수 있는 이들 두 수용체 하위타입의 조합된 존재에 대한 특이한 정보를 제공한다. 두 가지 수용체를 모두 표적화하는 것은 특이성의 견지에서 시험의 민감성을 증대시킬 수 있다. 이들 화합물이 치료용 방사성 핵종으로 방사성 표지될 때, 치료는 이들 수용체를 함유하는 조직에서 수행될 수 있으며, 원하는 조직에 전달되는 용량을 증가시킬 수 있다.

실시예 LXI - 사람 전립선 암 ( PC3 ) 세포에서 GRP -R에 대하여 125I- BBN 을 사용한 변형된 봄베신 ( BBN ) 유사체의 경합 연구

BBN^{7 -14} 유사체에서 특정 아미노산을 대체하는 효과를 측정하기 위하여, 표적화 부분에서 변형된 펩티드를 제조하였고, 사람 전립선 암 (PC3) 세포에서 GRP-R에 대한 경합 결합에 대하여 분석하였다. 이들 펩티드는 모두 금속 킬레이트화 부분 (DOTA-Gly-Abz4-)에 포합된 공통적인 링커를 가지고 있다. 결합 데이터 (IC₅₀, nM)는 하기 표 13에 나타낸다.

A. 재료 및 방법:

1. 세포 배양:

PC3 셀라인을 ATCC (CRL-1435)로부터 얻어서 2 mM의 L-글루타민, 1.5 g/L의 중탄산 나트륨, 10 mM의 HEPES 및 10 %의 FBS가 첨가되어 있는 RPMI 1640 (ATCC)에서 배양하였다. 배양물을 5 %의 CO₂/95 % 공기를 포함한 습도 조절 분위기에서 37 ℃에서 유지하였다. 분석을 위한 PC3 세포를 96-웰 화이트/클리어 바닥 플레이트 (Falcon Optilux-I)에 2.0×10⁴ 세포/웰의 농도로 플레이트하였다. 플레이트를 플레이팅 후 2일째에 분석을 위해 사용하였다.

2. 결합 완충제 :

25 mM의 HEPES, 0.2 %의 BSA 분획 V, 1.0 mM의 AEBSF (CAS #3087-99-7) 및 0.1 %의 Bacitracin (CAS # 1405-87-4), pH 7.4가 첨가되어 있는 RPMI 1640 (ATCC).

3. ¹²⁵ I- Tyr ⁴ -봄베신[ ¹²⁵ I- BBN ]

¹²⁵I-BBN (Cat # NEX258)을 Perkin Elmer Life Science로부터 얻었다.

C. 시험관내 분석:

PC3 세포에서 GRP-R에 대한 ¹²⁵I-BBN을 사용한 경합 분석:

시험한 모든 화합물을 결합 완충제에 녹이고, 적절한 희석을 또한 결합 완충제로 수행하였다. 분석을 위한 PC3 세포를 96-웰 블랙/클리어 콜라겐 I 셀웨어 플레이트 (Beckton Dickinson Biocoat)에 2.0×10⁴ 세포/웰의 농도로 심었다. 플레이트를 플레이팅 후 2일째에 분석을 위해 사용하였다. 플레이트를 분석 전에 집밀도에 대해 체크하였다 (>90 % 집밀도). 경합 분석을 위해 1.25×10^-9 M 내지 500×10^-9M 범위의 농도의 N,N-디메틸글리실-Ser-Cys(Acm)-Gly-Ava5-QWAVGHLM-NH₂ (대조표준) 또는 다른 경합자를 ¹²⁵I-BBN (25,000 cpm/웰)과 함께 인ㅋ베이션하였다. 연구는 웰 당 75 ㎕의 분석 부피로 수행하였다. 3개 한 벌의 웰을 각 데이터 포인트에 대해 사용하였다. 적절한 용액을 첨가한 후, 플레이트를 1시간 동안 4 ℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션은 200 μL의 빙-냉 인큐베이션 완충액을 첨가함으로써 종료하였다. 플레이트를 5회 세척하고 바닥을 건조시켰다. 방사능을 LKB CompuGamma 카운터 또는 미소플레이트 신틸레이션 카운터를 사용하여 검출하였다. ¹²⁵I-BBN의 결합된 방사능을 경합자의 억제 농도에 대하여 도표화하고, ¹²⁵I-BBN 결합이 50 % 억제되는 농도 (IC₅₀)를 결합 곡선으로부터 구하였다.

결과/결론: 표적화 부분에서 변형된 다양한 펩티드의 결합 결과를 분석한 결과는 다음과 같다:

뉴로메딘 유사체 (GNLWATGHFM-NH₂, yGNLWATGHFM-NH₂)는 DO3A-모노아미드-G-Abz4에 포합되었을 때 (L227)를 제외하면 GRP-R에 대하여 경합할 수 없었다. 그러나 그것들은 효과적인 NMB 경합자이다. 이것은 QWAVGHLM-NH₂, DO3A-모노아미드-QWAVGHLM-NH₂ & L70에서 반영되는 바와 같이 봄베신 서열의 아미노 말단의 유도화에 대한 필요조건이다. 히스티딘의 대체 (L225)는 GRP-R에서의 경합을 감소시킨다.

L70에서 두 개의 링커 성분을 L204로 역전시키면 NMB 하위타입을 선호하려는 하위타입 특이성을 변화시킨다. 봄베신 서열에서 L¹³F 치환은 GRP-R 특이성을 유지한다 (L228).

여기서 알 수 있는 것처럼, L228에서 F¹³M¹⁴의 F¹³L¹⁴ 치환은 GRP-R에서 높은 친화력을 가지는 화합물 (L300)을 생성한다. 메티오닌의 제거는 그것이 산화되기 쉽기 때문에 유익하다. 이 장점은 만약 L¹³F 치환이 또한 수행되지 않는다면 발생하지 않는다 (L221). V^{10 의} 제거는 L224에서 알 수 있는 것과 같이 결합의 완전한 손실을 유발하였다.

표 16에서 알 수 있는 바와 같이, 다양한 치환은 BBN^{2 -6} 영역에서 일어난다 (L214-L217, L226).

예상했던 것처럼 표 17로부터의 결과는 보편적 아고니스트 (L222 & L223)가 약 50 nM 수준에서 적당히 잘 경합하는 것을 보여준다.

실시예 LXI - ¹⁷⁵ Lu - L70 및 ¹⁷⁵ Lu - DO3A - 모노아미드 - Aoc - QWAVGHLM - NH ₂ 의 NMR 구조 비교

이 NMR 연구의 목적은 Lu-L70의 완전한 구조적 특성확인을 제공하고 그것을 ¹⁷⁵Lu-DOTA-Aoc-QWAVGHLM (L70)의 구조와 비교하는 것이고, ^{1 75}Lu-DOTA-Aoc-QWAVGHLM의 두 가지 봄베신 유사체는 킬레이트화 기와 표적화 펩티드 사이의 링커만이 다르다. L70에는 글리실-4-아미노벤조일기가 있는 반면, ^{1 75}Lu-DOTA-Aoc-QWAVGHLM에는 8-아미노옥타노일기가 있다. 그러나 이들 두 화합물의 생물학적 데이터는 현격한 차이가 있다. 이 차이를 설명하기 위해 상세한 NMR 연구를 수행하였다.

A. 실험

1. 재료

5 mg의 ¹⁷⁵Lu-DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂를 225 μL의 DMSO-d₆ (Aldrich 100 % 원자 % D)에 녹였다.

5 mg의 ¹⁷⁵Lu-L70을 225 μL의 DMSO-d₆ (Aldrich 100 % 원자 % D)에 녹였다.

2. NMR 데이터의 획득

모든 NMR 실험을 3 mm의 광-밴드 역 (z-축 구배) 프로브가 장착된 Varian Inova-500 Fourier Transform NMR 분광기 상에서 수행하였다. 화학적 이동은 양자에 대해서는 2.50 ppm에서, 및 ¹³C에 대해서는 40.19 ppm에서 DMSO-d₆의 잔류 CH 피크를 참조로 하였다. 샘플 온도는 Varian 디지털 온도 제어기로 조절하였다. 데이터를 Sun Blade 2000 Unix 컴퓨터상에서 NMRPipe, VNMR, PROSA, 및 VNMRJ 소프트웨어를 사용하여 처리하였고 Linux 컴퓨터상에서 NMRView 및 SPARKY 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 펩티드의 모델링을 Linux 컴퓨터상에서 CYANA 소프트웨어를 사용하여 수행하였고, 추가로 Compaq Deskpro Workstation 상에서 MOLMOL 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

B. 결과 및 결론

¹⁷⁵Lu-L70의 양자 화학적 이동을 다음과 같이 정하였다: 1D 스펙트럼에서의 메틸 영역의 빠른 검사 (0.5 내지 2.5 ppm)로 2.02 ppm에서 메티오닌의 메틸 피크로서의 예리한 단일체의 확인이 가능하였다. TOSCSY 스펙트럼의 동일한 영역에서 4.32 ppm에서의 유일한 하나의 피크에 관련된 1.16 ppm에서의 화학적 이동은 그것이 알라닌에 속한 것임을 나타낸다. 1.98 및 4.12 ppm에서의 두 피크에 상관되는 0.84 및 0.85 ppm에서의 메틸 피크는 발린에 속하는 것이어야 한다. 1.60, 1.48 및 4.23 ppm에서의 피크들에 상관되는 0.84 및 0.88 ppm에서의 나머지 메틸 피크는 로이신에 속하는 것이다. 이들 화학적 이동 및 다른 아미노산의 화학적 이동은 또한 "핑거프린트" 영역 (Wuthrich, K. "NMR of Proteins and Nucleic Acids," John Wiley & Sons, 1986) - TOCSY 스펙트럼의 골격 NH-aH 영역에 존재한다 (도 52 참조). 아미노산의 스핀 시스템에 속하는 모든 화학적 이동은 그 자치로 수직으로 일렬배열될 것이다. 스펙트럼을 조심스럽게 조사한 후에 모든 와악적 이동을 정하였다. 화학적 이동을 추가로 COSY (도 53 참조) 및 NOESY (도 54 참조)와 같은 다른 스펙트럼을 개괄함으로써 증명하였다. 양자 화학적 이동을 지정한 후에 그것들의 탄소 화학적 이동을 gHSQC 스펙트럼을 통해 확인하였고 (도 55), 나아가 gHMBC (도 56) 및 gHSQCTOCSY (도 57) 스펙트럼을 개괄함으로써 증명하였다. Lu-L70의 화학적 이동을 표 19에 열거한다 (원자 번호는 도 60을 참조한다).

흥미롭게도, ¹⁷⁵Lu-L70의 TOCSY 스펙트럼에서 NH 양자의 14.15 ppm에서의 화학적 이동은 히스티딘 고리의 다른 두 개의 피크, 및 또한 물 분자와의 강력한 상관관계를 보여준다. 이 물 분자는 자유롭게 교환하지 못하고 명백히 NMR 타임프레임에서 볼 수 있다. 히스티딘의 어떤 양자가 더 강하게 물 분자와 반응하는 지를 알아보기 위하여 선택적인 호모-탈커플링 실험을 ¹⁷⁵Lu-L70에 대하여 15 ℃에서 수행하였다. 물 피크가 선택적으로 낮은 힘으로 포화되었을 때 히스티딘의 14.16 및 14.23 ppm에서의 NH 피크의 세기는 극적으로 감소된 한편, 7.32 및 8.90 ppm에서의 히스티딘의 나머지 두 개의 피크의 세기는 부분적으로 감소되었다 (도 58). NMR 시간 스케일에 대한 물 양자의 관찰은 확신을 강화시킨다.

¹⁷⁵Lu-L70의 물 분자를 사용하여 제안된 화학적 구조는 도 62에서 볼 수 있다. 물 분자는 배위된 산소에 의해 설명된 사각 평면을 캡핑함으로써 9번째 배위 부위를 차지한다. 이것은 다른 관례를 갖는다. Na[Lu(DOTA)H₂O]ㆍ4H₂O에서 Lu의 9번째 부위에서 물의 배위결합은 문헌에서 알 수 있었던 것처럼 x-선 구조에서 관찰되었다 (Aime et al, Inorg. Chim. Acta 1996, 246, 423-429).

대조적으로 ¹⁷⁵Lu-DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂의 TOCSY 스펙트럼에서 NH 양자의 화학적 이동은 단지 히스티딘 고리의 다른 두 개의 피크와 강한 상관관계를 보이지만, 물 분자와는 그렇지 않다 (도 59). 이것은 ¹⁷⁵Lu-DO3A-모노아미드-Aoc-QWAVGHLM-NH₂에서 175Lu 및 His-NH 둘 다에 동시에 배위결합하는 물 분자는 없다는 것을 시사한다. 그러므로 두 분자 사이의 차이는 상당하다. ¹⁷⁵Lu-L70에서 펩티드의 2차 구조는 결합된 물 분자에 의해 안정되며, 이것은 증가된 생체내 안정성의 원인이 될 수 있다.

본원의 화합물은 당해 기술 분야에 공지되어 있는 다른 GRP 수용체 표적화 펩티드 포합체와 비교하여 개선된 약물 동력학 특성을 가짐으로써, 본 발명의 링커를 함유하는 화합물은 혈류에 더 오랫동안 보유되고, 그로써 공지의 선행 화합물보다 더 긴 반감기를 갖는다. 더 긴 반감기는 그것이 진단용 영상화에 유용하고, 특히 치료 용도로 유용한 더 좋은 종양 표적화를 가능하게 하기 때문에 의료적으로 유익하며, 그때 암세포 및 종양은 더 많은 양의 방사성 표지된 펩티드를 받게 된다. 따라서 치료 효과가 개선된다. 또한 본 발명의 화합물은 개선된 조직 수용체 특이성을 가지므로 암치료 등에 효과적이다.

Claims (27)

1. 다음의 화합물들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물:

   D03A-모노아미드-Gly-(3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산-QWAVaHLM NH₂;

   DO3A-모노아미드-Gly-(3β,5β,7α,12α)-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산-f-QWAVGHLM-NH₂;

   DO3A-모노아미드-Gly-(3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산-f-WAVGHLL NH₂;

   D03A-모노아미드-Gly-(3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산-f-QWAVGHL NH-펜틸;

   DO3A-모노아미드-Gly-(3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산-y-QWAV-Bala-H-F-Nle-NH₂;

   D03A-모노아미드-Gly-(3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산-f-QWAV-Bala-H-F-Nle-NH₂;

   D03A-모노아미드-Gly-(3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산-QWAVGHFL-NH₂;

   D03A-모노아미드-Gly-(3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산-QWAVGNMeH-L-M-NH₂;

   D03A-모노아미드-Gly-(3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산-LWAVGSF-M-NH₂;

   D03A-모노아미드-Gly-(3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산-HWAVGHLM-NH₂;

   D03A-모노아미드-Gly-(3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산-LWAGHFM-NH₂;

   D03A-모노아미드-Gly-(3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산-QWAVGHFM-NH₂;

   D03A-모노아미드-Gly-(3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산-QRLGNQWAVGHLM-NH₂;

   D03A-모노아미드-Gly-(3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산-QRYGNQWAVGHLM-NH₂;

   D03A-모노아미드-Gly-(3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산-QKYGNQWAVGHLM-NH₂;

   Pglu-Q-Lys(DO3A-모노아미드)-Gly-(3β,5β,7α,12α)-3-아미노-7,12-디히드 록시콜란-24-오산-LGNQWAVGHLM-NH₂;

   D03A-모노아미드-Gly-3-아미노-3-데옥시콜산-QRLGNQWAVGHLM-NH₂;

   D03A-모노아미드-Gly-3-아미노-3-데옥시콜산-QRYGNQWAVGHLM-NH₂;

   D03A-모노아미드-Gly-3-아미노-3-데옥시콜산-QKYGNQWAVGHLM-NH₂; 및

   Pglu-Q-Lys(D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산)-LGNQWAVGHLM-NH₂.
2. 다음의 화합물들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물:

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-QWAVGHFL-NH₂;

   D03A-모노아미드-4-아미노메틸벤조산-L-1-나프틸알라닌-QWAVGHLM-NH₂; 및

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-QWAVGNMeHisLM-NH₂;
3. 다음 일반식으로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물:

   M-N-O-P-G

   상기 식에서, M은 임의로 방사성 핵종과 복합체를 형성하는 DO3A이고;

   N은 0, 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이며;

   O는 알파 또는 비-알파 아미노산이고;

   P는 0, 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이며;

   G는 GRP 수용체 표적화 펩티드이고,

   상기에서 N, O 또는 P중 최소한 하나는 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산이고;

   상기 GRP 수용체 표적화 펩티드는 QWAVGHLM-NH₂, QWAVGNMeHLM-NH₂, QWAVGHFL-NH₂, LWATGSFM-NH₂, 및 QWAVaHLM-NH₂로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
4. 일반식: M-N-O-P-G로 표시되는 화합물:

   상기 식에서 M은 임의로 방사성 핵종과 복합체를 형성하는 DO3A이고,

   N은 0, 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이며;

   O는 알파 또는 비-알파 아미노산이고;

   P는 0, 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이며;

   G는 GRP 수용체 표적화 펩티드이고,

   상기에서 N, O 또는 P중 최소한 하나는 (3β,5β,12α)-3-아미노-12-히드록시콜란-24-오산이며; 상기 GRP 수용체 표적화 펩티드는 QWAVGHLM-NH₂, QWAVGNMeHLM-NH₂, QWAVGHFL-NH₂, LWATGSFM-NH₂, 및 QWAVaHLM-NH₂로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
5. 일반식: M-N-O-P-G로 표시되는 화합물:

   상기 식에서 M은 임의로 방사성 핵종과 복합체를 형성하는 DO3A이고,

   N은 0, 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이며;

   O는 알파 또는 비-알파 아미노산이고;

   P는 0, 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이며;

   G는 GRP 수용체 표적화 펩티드이고,

   상기에서 N, O 또는 P중 최소한 하나는 4-아미노벤조산이며,

   상기 GRP 수용체 표적화 펩티드는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물: QWAVGHLM-NH₂, QWAVGNMeHLM-NH₂, QWAVGHFL-NH₂, LWATGSFM-NH₂, QWAVaHLM-NH₂, Nme-QWAVGHLM-NH₂, Q-Ψ[CSNH]WAVGHLM-NH₂, Q-Ψ[CH2NH]-WAVGHLM-NH₂, Q-Ψ[CH=CH]WAVGHLM-NH₂, a-MeQWAVGHLM-NH₂, QNme-WAVGHLM-NH₂, QW-Ψ [CSNH]-AVGHLM-NH₂, QW-Ψ[CH2NH]-AVGHLM-NH₂, QW-Ψ[CH=CH]-AVGHLM-NH₂, Q-a-Me-WAVGHLM-NH₂, QW-Nme-AVGHLM-NH₂, QWA=Ψ[CSNH]-VGHLM-NH₂, QWA-Ψ[CH2NH]-VGHLM-NH₂, QW-Aib-VGHLM-NH₂, QWAV-Sar-HLM-NH₂, QWAVG-Ψ[CSNH]-HLM-NH₂, QWAVG-Ψ[CH=CH]-HLM-NH₂, QWAV-Dala-HLM-NH₂, QWAVG-Nme-His-LM-NH₂, QWAVG-H-Ψ[CSNH]-L-M-NH₂, QWAVG-H-Ψ[CH2NH]-LM-NH₂, QWAVGH-Ψ[CH=CH]-LM-NH₂, QWAVG-a-Me-HLM-NH₂, QWAVGH-Nme-LM-NH₂, QWAVGH-a-MeLM-NH₂, QWAVGHF-L-NH₂ 및 QWAVGHLM-NH₂.
6. 다음의 화합물들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화 합물:

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-QWAVaHLM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-fQWAVGHLM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-fQWAVGHLL-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-fQWAVGHL-NH-펜틸,

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-yQWAV-Bala-HFNle-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-fQWAV-Bala-HFNIe-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-QWAVGHFL-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-QWAVGNMeHisLM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-LWAVGSFM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-HWAVGHLM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-LWATGHFM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-QWAVGHFM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-QRLGNQWAVGHLM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-QRYGNQWAVGHLM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산-QKYGNQWAVGHLM-NH₂,

   Pglu-Q-Lys(D03A-모노아미드-G-4-아미노벤조산)-LGNQWAVGHLM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산-QWAVaHLM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산-fQWAVGHLM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산-fQWAVGHLL-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산-fQWAVGHL-NH-펜틸,

   D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산-yQWAV-Bala-HFNle-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산-fQWAV-Bala-HFNle-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산-QWAVGHFL-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산-QWAVGNMeHLM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산-LWAVGSFM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산-HWAVGHLM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산-LWATGHFM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산-QWAVGHFM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산-QRLGNQWAVGlyHLM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산-QRYGNQWAVGHLM-NH₂,

   D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산-QKYGNQWAVGHLM-NH₂, 및

   Pglu-Q-Lys(D03A-모노아미드-G-3-아미노-3-데옥시콜산)-LGNQWAVGHLM-NH₂.
7. 일반식: M-N-O-P-G로 표시되는 화합물:

   상기 식에서 M은 임의로 방사성 핵종과 복합체를 형성하는 DO3A이고,

   N은 0, 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이며;

   O는 알파 또는 비-알파 아미노산이고;

   P는 0, 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이며;

   G는 GRP 수용체 표적화 펩티드이고,

   상기에서 N, O 또는 P중 최소한 하나는 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 또는 (3β,5β,12α)-3-아미노-12-히드록시콜란-24-오산이며,

   상기 G는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물: Nme-QWAVGHLM-NH₂, Q-Ψ[CSNH]WAVGHLM-NH₂, Q-Ψ[CH2NH]-WAVGHLM-NH₂, Q-Ψ[CH=CH]WAVGHLM-NH₂, α-MeQWAVGHLM-NH₂, QNme-WAVGHLM-NH₂, QW-Ψ [CSNH]-AVGHLM-NH₂, QW-Ψ[CH2NH]-AVGHLM-NH₂, QW-Ψ[CH=CH]-AVGHLM-NH₂, Q-α-Me-WAVGHLM-NH₂, QW-Nme-AVGHLM-NH₂, QWA=Ψ[CSNH]-VGHLM-NH₂, QWA-Ψ[CH2NH]-VGHLM-NH₂, QW-Aib-VGHLM-NH₂, QWAV-Sar-HLM-NH₂, QWAVG-Ψ[CSNH]-HLM-NH₂, QWAVG-Ψ[CH=CH]-HLM-NH₂, QWAV-Dala-HLM-NH₂, QWAVG-Nme-His-LM-NH₂, QWAVG-H-Ψ[CSNH]-L-M-NH₂, QWAVG-H-Ψ[CH2NH]-LM-NH₂, QWAVGH-Ψ[CH=CH]-LM-NH₂, QWAVG-α-Me-HLM-NH₂, QWAVGH-Nme- LM-NH₂, QWAVGH-α-MeLM-NH₂, QWAVGHF-L-NH₂ 및 QWAVGHLM-NH₂.
8. 가스트린 방출 펩티드 수용체 (GRP-R) 및 뉴로메딘-B 수용체 (NMB-R)를 표적화하는 방법으로서,

   상기 방법은 다음 일반식의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

   M-N-O-P-G

   상기 식에서, M은 임의로 방사성 핵종과 복합체를 형성하는 광학 표지 또는 금속 킬레이터이고,

   N은 0, 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이며;

   O는 알파 또는 비-알파 아미노산이고;

   P는 0, 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이며;

   G는 GRP 수용체 표적화 펩티드이고,

   상기에서 N, O 또는 P중 최소한 하나는 비-알파 아미노산이다.
9. 제 8항에 있어서, 상기 N, O 또는 P 중 최소한 하나는 고리기가 포함된 비-알파 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 N은 Gly이고, O는 4-아미노벤조산이며, P는 0인 것을 특징으로 하는 방법.
11. GRP-R 및 NMB-R을 표적화하는 방법으로서,

    상기 방법이 다음 일반식의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

    M-N-O-P-G

    상기 식에서, M은 임의로 방사성 핵종과 복합체를 형성하는 광학 표지 또는 금속 킬레이터이고,

    N은 0, 알파 아미노산, 치환된 담즙산 또는 다른 연결기이며,

    O는 알파 아미노산 또는 치환된 담즙산이고,

    P는 0, 알파 아미노산, 치환된 담즙산 또는 다른 연결기이고,

    G는 GRP 수용체 표적화 펩티드이며,

    상기 N, O 또는 P 중 최소한 하나는 치환된 담즙산이다.
12. 제 11항에 있어서, 상기 N이 Gly이고, O는 (3β,5β,12α)-3-아미노-7,12-디히드록시콜란-24-오산이며, P는 0인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 8항, 9항 또는 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GRP 수용체 표적화 펩티드가 다음의 화합물들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:

    Nme-QWAVGHLM-NH₂, Q-Ψ[CSNH]WAVGHLM-NH₂, Q-Ψ[CH2NH]-WAVGHLM-NH₂, Q-Ψ[CH=CH]WAVGHLM-NH₂, α-MeQWAVGHLM-NH₂, QNme-WAVGHLM-NH₂, QW-Ψ [CSNH]-AVGHLM-NH₂, QW-Ψ[CH2NH]-AVGHLM-NH₂, QW-Ψ[CH=CH]-AVGHLM-NH₂, Q-α-Me-WAVGHLM-NH₂, QW-Nme-AVGHLM-NH₂, QWA=Ψ[CSNH]-VGHLM-NH₂, QWA-Ψ[CH2NH]-VGHLM-NH₂, QW-Aib-VGHLM-NH₂, QWAV-Sar-HLM-NH₂, QWAVG-Ψ[CSNH]-HLM-NH₂, QWAVG-Ψ[CH=CH]-HLM-NH₂, QWAV-Dala-HLM-NH₂, QWAVG-Nme-His-LM-NH₂, QWAVG-H-Ψ[CSNH]-L-M-NH₂, QWAVG-H-Ψ[CH2NH]-LM-NH₂, QWAVGH-Ψ[CH=CH]-LM-NH₂, QWAVG-α-Me-HLM-NH₂, QWAVGH-Nme-LM-NH₂, 및 QWAVGH-α-MeLM-NH₂.
14. 제 1항 내지 7항 중 어느 한 항의 화합물의 생체내 활성을 개선시키는 방법으로서,

    상기 방법이 GRP 수용체 표적화 펩티드를 변형시켜서 상기 펩티드의 단백질 가수분해적 절단을 감소시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 14항에 있어서, 상기 변형된 GRP-R 표적화 펩티드가 아고니스트인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1항 내지 7항 중 어느 한 항의 가스트린 방출 펩티드 (GRP) 유사체의 단 백질 가수분해적 절단을 감소시키는 방법으로서,

    상기 방법이 GRP-R 표적화 부분의 펩티드 결합을 변형시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 상기 변형된 GRP-R 표적화 펩티드가 아고니스트인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 아고니스트인 가스트린 방출 펩티드 수용체 (GRP-R) 표적화 부분을 가지는 가스트린 방출 펩티드 (GRP) 유사체의 단백질 가수분해적 절단을 감소시키는 방법으로서,

    상기 방법이 GRP-R 표적화 부분의 펩티드 결합을 변형시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 14항, 16항 또는 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GRP-R 표적화 부분이 다음의 화합물들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:

    Nme-QWAVGHLM-NH₂, Q-Ψ[CSNH]WAVGHLM-NH₂, Q-Ψ[CH2NH]-WAVGHLM-NH₂, Q-Ψ[CH=CH]WAVGHLM-NH₂, α-MeQWAVGHLM-NH₂, QNme-WAVGHLM-NH₂, QW-Ψ [CSNH]-AVGHLM-NH₂, QW-Ψ[CH2NH]-AVGHLM-NH₂, QW-Ψ[CH=CH]-AVGHLM-NH₂, Q-α-Me-WAVGHLM-NH₂, QW-Nme-AVGHLM-NH₂, QWA=Ψ[CSNH]-VGHLM-NH₂, QWA-Ψ[CH2NH]-VGHLM-NH₂, QW- Aib-VGHLM-NH₂, QWAV-Sar-HLM-NH₂, QWAVG-Ψ[CSNH]-HLM-NH₂, QWAVG-Ψ[CH=CH]-HLM-NH₂, QWAV-Dala-HLM-NH₂, QWAVG-Nme-His-LM-NH₂, QWAVG-H-Ψ[CSNH]-L-M-NH₂, QWAVG-H-Ψ[CH2NH]-LM-NH₂, QWAVGH-Ψ[CH=CH]-LM-NH₂, QWAVG-α-Me-HLM-NH₂, QWAVGH-Nme-LM-NH₂, 및 QWAVGH-α-MeLM-NH₂.
20. 제 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 G가 GRP 수용체 표적화 펩티드이고, 변형되어 단백질 가수분해적 절단이 감소되는 것을 특징으로 하는 화합물.
21. 방사성 핵종 및 GRP-R 표적화 펩티드와 임의로 복합체를 형성하는 광학 표지 또는 금속 킬레이터를 포함하는 화합물에 GRP-R 및/또는 NMB-R에 대한 특이성을 부여하는 방법으로서,

    상기 방법이 그러한 화합물에 다음 일반식을 가지는 링커를 포함시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

    N-O-P

    상기 식에서, N은 0, 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이고;

    O는 알파 또는 비-알파 아미노산이며;

    P는 0, 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이고;

    상기 N, O 또는 P중 최소한 하나는 비-알파 아미노산이다.
22. 방사성 핵종 및 GRP-R 표적화 펩티드와 임의로 복합체를 형성하는 광학 표지 또는 금속 킬레이터를 포함하는 화합물에 GRP-R 및/또는 NMB-R에 대한 특이성을 부여하는 방법으로서,

    상기 방법이 그러한 화합물에 다음 일반식을 가지는 링커를 포함시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

    N-O-P

    상기 식에서, N은 0, 알파 아미노산, 치환된 담즙산 또는 다른 연결기이며,

    O는 알파 아미노산 또는 치환된 담즙산이고,

    P는 0, 알파 아미노산, 치환된 담즙산 또는 다른 연결기이며,

    상기 N, O 또는 P 중 최소한 하나는 치환된 담즙산이다.
23. 방사성 핵종 및 GRP-R 표적화 펩티드와 임의로 복합체를 형성하는 광학 표지 또는 금속 킬레이터를 포함하는 화합물에 GRP-R 및/또는 NMB-R에 대한 특이성을 부여하는 방법으로서,

    상기 방법이 그러한 화합물에 다음 일반식을 가지는 링커를 포함시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

    N-O-P

    상기 식에서, N은 0, 알파 아미노산, 고리기를 가지는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이고;

    O는 알파 아미노산 또는 고리기를 가지는 비-알파 아미노산이며;

    P는 0, 알파 아미노산, 고리기를 가지는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이고;

    상기 N, O 또는 P 중 최소한 하나는 고리기를 가지는 비-알파 아미노산이다.
24. 방사성 핵종 및 GRP-R 표적화 펩티드와 임의로 복합체를 형성하는 광학 표지 또는 금속 킬레이터를 포함하는 화합물의 생체내 활성을 개선시키는 방법으로서,

    상기 방법이 그러한 화합물에 다음 일반식의 링커를 포함시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

    N-O-P

    상기 식에서, N은 0, 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이고;

    O는 알파 또는 비-알파 아미노산이며;

    P는 0, 알파 또는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이고;

    상기 N, O 또는 P중 최소한 하나는 비-알파 아미노산이다.
25. 방사성 핵종 및 GRP-R 표적화 펩티드와 임의로 복합체를 형성하는 광학 표지 또는 금속 킬레이터를 포함하는 화합물의 생체내 활성을 개선시키는 방법으로서,

    상기 방법이 그러한 화합물에 다음 일반식의 링커를 포함시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

    N-O-P

    상기 식에서, N은 0, 알파 아미노산, 치환된 담즙산 또는 다른 연결기이며,

    O는 알파 아미노산 또는 치환된 담즙산이고,

    P는 0, 알파 아미노산, 치환된 담즙산 또는 다른 연결기이며,

    상기 N, O 또는 P 중 최소한 하나는 치환된 담즙산이다.
26. 방사성 핵종 및 GRP-R 표적화 펩티드와 임의로 복합체를 형성하는 광학 표지 또는 금속 킬레이터를 포함하는 화합물의 생체내 활성을 개선시키는 방법으로서,

    상기 방법이 그러한 화합물에 다음 일반식의 링커를 포함시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

    N-O-P

    상기 식에서, N은 0, 알파 아미노산, 고리기를 가지는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이고;

    O는 알파 아미노산 또는 고리기를 가지는 비-알파 아미노산이며;

    P는 0, 알파 아미노산, 고리기를 가지는 비-알파 아미노산 또는 다른 연결기이고;

    상기 N, O 또는 P 중 최소한 하나는 고리기를 가지는 비-알파 아미노산이다.
27. 다음의 구조식을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물:

    

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