KR20060109494A - 자가면역 질환의 치료에 있어서 ｃｄ20의 검출 - Google Patents

Abstract

본 발명은 환자의 샘플에서 CD20이 검출되는 자가면역 질환의 치료에 관한 것이다.

CD20, 자가면역질환, CD20-양성 B 세포, CD20 길항제, CD20 항체.

Description

자가면역 질환의 치료에 있어서 ＣＤ20의 검출 {DETECTION OF CD20 IN THERAPY OF AUTOIMMUNE DISEASES}

본 출원은 2003년 12월 19일자로 출원한 가출원 제60/531,363호 (이 거명을 통해 전문이 본원에 포함됨)에 대한 35 USC §119 하의 우선권을 주장하는 비-가출원이다.

본 발명은 자가면역 질환을 앓는 환자로부터 얻은 샘플에서 CD20을 검출하는 자가면역 질환의 치료에 관한 것이다.

림프구는 다양한 유형의 백혈구 중 하나로, 혈액 생성 과정 중 골수에서 생성된다. 림프구에는 2가지 주요 집단이 있는데, B 림프구 (B 세포)와 T 림프구 (T 세포)가 그것이다. 본원에서 특히 관심이 있는 림프구는 B 세포이다.

B 세포는 골수에서 성숙하여, 골수를 떠나면서 세포 표면에서 항원-결합 항체를 발현시킨다. 면역반응을 겪지 않은 (naive) B 세포가 최초로 막-결합 항체에 특이적인 항원과 만났을 때, 이 세포는 빠르게 분열하기 시작해서 그 자손들이 기억 (memory) B 세포, 및 "플라즈마 세포"로 불리는 이펙터 (effector) 세포로 분화한다. 기억 B 세포는 수명이 보다 길어서 원조 모세포와 동일한 특이성을 갖는 막 -결합 항체를 지속적으로 발현시킨다. 플라즈마 세포는 막-결합 항체를 생성하지 않고, 대신에 분비될 수 있는 형태의 항체를 생성한다. 분비된 항체는 체액성 면역의 주요한 이펙터 분자이다.

CD20 항원 (인간 B-림프구-제한 분화 항원, Bp35로도 불림)은 전-B 림프구 및 성숙 B 림프구 상에 위치한 대략 35 kD의 분자량을 갖는 소수성 막횡단 단백질이다 (문헌 [Valentine et al . J. Biol . Chem . 264(19):11282-11287 (1989)]; 및 [Einfeld et al . EMBO J. 7(3):711-717 (1988)]). 이 항원은 또한 90％가 넘는 B 세포 비-호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphomas) (NHL)에서 발현되지만 (문헌 [Anderson et al . Blood 63(6):1424-1433 (1984)]), 조혈 줄기 세포, 전-B 세포, 정상 플라즈마 세포 또는 다른 정상 조직에서는 발견되지 않는다 (문헌 [Tedder et al. J. Immunol . 135(2): 973-979 (1985)]). CD20은 세포 주기 시작 및 분화에 대한 활성 과정에서 초기 단계(들)을 조절하고 (Tedder et al.의 상기 문헌), 칼슘 이온 채널로서 작용할 수 있다 (문헌 [Tedder et al . J. Cell . Biochem. 14D:195 (1990)]).

CD20이 B 세포 림프종에서 발현된다는 점에서, 이 항원은 그러한 림프종의 "표적화"를 위한 후보로서 작용할 수 있다. 본질적으로, 그러한 표적화는 하기와 같이 일반화될 수 있다: B 세포의 CD20 표면 항원에 대해 특이적인 항체를 환자에게 투여한다. 이들 항-CD20 항체는 (표면상으로) 정상 B 세포와 악성 B 세포 둘 모두의 CD20 항원에 특이적으로 결합하고; CD20 표면 항원에 결합한 항체는 신생물성 B 세포를 파괴하고 고갈시킬 수 있다. 부가적으로, 종양을 파괴할 수 있는 화 학 물질 또는 방사선 표지는 그러한 물질이 신생물성 B 세포로 특이적으로 "전달"되도록 항-CD20 항체에 접합될 수 있다. 접근 방법에 상관없이, 1차적 목적은 종양을 파괴하는 것이고; 특이적 접근 방법은 사용되는 특정 항-CD20 항체에 의해 결정될 수 있기 때문에, CD20 항원을 표적화 하기 위해 이용가능한 접근 방법은 상당히 다양할 수 있다.

리툭시맙 (rituximab) (리툭산® (RITUXAN®)) 항체는 유전공학적으로 조작된, CD20 항원에 대한 키메라 뮤린 (murine)/인간 단일클론 항체이다. 리툭시맙은 1998년 4월 7일자로 허여된 미국 특허 제5,736,137호 (Anderson et al.)에서 "C2B8"로 명명된 항체이다. 리툭산®은 재발성 또는 난치성인 저급 또는 여포성의 CD20-양성 B 세포 비-호지킨 림프종을 앓는 환자의 치료용으로 처방된다. 시험관내 작용 메카니즘 연구 결과, 리툭산®이 인간 보체에 결합하여, 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 통해 림프성 B 세포주를 분해시킨다는 것이 증명되었다 (문헌 [Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)]). 부가적으로, 이는 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 대한 분석에서 상당한 활성을 갖는다. 보다 최근에, 리툭산®은 다른 항-CD19 항체 및 항-CD20 항체와 다르게 삼중수소화 티미딘 혼입 분석법에서 항-증식 효과를 가지며 아폽토시스 (apoptosis)를 직접 유도하는 것으로 나타났다 (문헌 [Maloney et al . Blood 88(10):637a (1996)]). 리툭산®과 화학요법 및 독소 사이의 시너지 효과도 실험적으로 관찰되었다. 특히, 리툭산®은 약물-내성 인간 B 세포 림프종 세포주를 독소루비신, CDDP, VP-16, 디프테리아 독소 및 리신 (ricin)에 대해 민감해지게 만든다 (문헌 [Demidem et al . Cancer Chemotherapy ＆ Radiopharmaceuticals 12(3): 177-186 (1997)]). 생체내 전-임상 연구 결과, 리툭산®이 아마 보체 및 세포-매개 과정을 통해 사이노몰거스 원숭이 (cynomolgus monkey)의 말초 혈액, 림프절 및 골수로부터 B 세포를 고갈시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Reff et al . Blood 83(2):435-445 (1994)]).

CD20 항체에 관한 특허 및 특허 공개로는 미국 특허 제5,776,456호, 동 제5,736,137호, 동 제6,399,061호 및 동 제5,843,439호, 및 미국 특허출원 제US2002/0197255A1호, 동 제US2003/0021781A1호, 동 제US2003/0082172A1호, 동 제US2003/0095963A1호, 동 제US2003/0147885A1호 (Anderson et al.); 미국 특허 제6,455,043B1호 및 국제 특허 공개 제WO00/09160호 (Grillo-Lopez, A.); 국제 특허 공개 제WO00/27428호 (Grillo-Lopez and White); 동 제WO00/27433호 (Grillo-Lopez and Leonard); 동 제WO00/44788호 (Braslawsky et al.); 동 제WO01/10462호 (Rastetter, W.); 동 제WO01/10461호 (Rastetter and White); 동 제WO01/10460호 (White and Grillo-Lopez); 미국 출원 제US2002/0006404호 및 제WO02/04021호 (Hanna and Hariharan); 미국 출원 제US2002/0012665A1호 및 제WO01/74388호 (Hanna, N.); 미국 출원 제US2002/0058029A1호 (Hanna, N.); 동 제US2003/0103971A1호 (Hariharan and Hanna); 동 제US2002/0009444A1호 및 WO01/80884호 (Grillo-Lopez, A.); 제WO01/97858호 (White, C.); 미국 출원 제US2002/0128488A1호 및 제WO02/34790호 (Reff, M.); 제WO02/060955호 (Braslawsky et al.); 제WO02/096948호 (Braslawsky et al.); 제WO02/079255호 (Reff and Davies); 미국 특허 제6,171,586B1호 및 제W098/56418호 (Lam et al.); 제 W098/58964호 (Raju, S.); 제WO99/22764호 (Raju, S.); 제WO99/51642호, 미국 특허 제6,194,551B1호, 동 제6,242,195B1호, 동 제6,528,624B1호 및 동 제6,538,124호 (Idusogie et al.); 제WO00/42072호 (Presta, L.); 제WO00/67796호 (Curd et al.); 제WO01/03734호 (Grillo-Lopez et al.); 미국 출원 제US2002/0004587A1호 및 제WO01/77342호 (Miller and Presta); 미국 출원 제US2002/0197256호 (Grewal, I.); 동 제US2003/0157108A1호 (Presta, L.); 미국 특허 제6,090,365B1호, 동 제6,287,537B1호, 동 제6,015,542호, 동 제5,843,398호 및 동 제5,595,721호 (Kaminski et al.); 미국 특허 제5,500,362호, 동 제5,677,180호, 동 제5,721,108호 및 동 제6,120,767호 (Robinson et al.); 미국 특허 제6,410,391B1호 (Raubitschek et al.); 미국 특허 제6,224,866B1호 및 제WO00/20864호 (Barbera-Guillem, E.); 제WO01/13945호 (Barbera-Guillem, E.); 제WO00/67795호 (Goldenberg); 미국 출원 제US2003/01339301A1호 및 제WO00/74718호 (Goldenberg and Hansen); 제WO00/76542호 (Golay et al.); 제WO01/72333호 (Wolin and Rosenblatt); 미국 특허 제6,368,596B1호 (Ghetie et al.); 미국 출원 제US2002/0041847A1호 (Goldenberg, D.); 미국 출원 제US2003/0026801A1호 (Weiner and Hartmann); 제WO02/102312호 (Engleman, E.); 미국 특허 출원 제2003/0068664호 (Albitar et al.); 제WO03/002607호 (Leung, S.); 제WO03/049694호 및 제US2003/0185796A1호 (Wolin et al.); 제WO03/061694호 (Sing and Siegall); 제US2003/0219818A1호 (Bohen et al.); 제US2003/0219433A1호 및 제WO03/068821호 (Hansen et al.)이 있으며, 이들은 각각 이 거명을 통해 본원에 포함된다. 또한, 미국 특허 제5,849,898호 및 EP 출원 제330,191호 (Seed et al.); 미국 특허 제4,861,579호 및 제EP332,865A2호 (Meyer and Weiss); 미국 특허 제4,861,579호 (Meyer et al.) 및 제W095/03770호 (Bhat et al.)를 참조할 수 있다.

리툭시맙을 이용해 치료하는 것에 관한 간행물로는 문헌 [Perotta and Abuel "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab" Abstract #3360 Blood 10(1) (part 1-2): p. 88B (1998)]; [Stashi et al. "Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathic thrombocytopenic purpura" Blood 98(4): 952-957 (2001)]; [Matthews, R. "Medical Heretics" New Scientist (7 April, 2001)]; [Leandro et al. "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis 61: 833-888 (2002)]; [Leandro et al. "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response. Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001)]; [Leandro et al. "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus", Arthritis ＆ Rheumatism 46(1):2673-2677 (2002)]; [Edwards and Cambridge "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rhematology 40:205-211 (2001)]; [Edwards et al. "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem . Soc . Trans . 30(4):824-828 (2002)]; [Edwards et al. "Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002)]; [Levine and Pestronk "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology 52: 1701-1704 (1999)]; [DeVita et al. "Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis ＆ Rheum 46:2029-2033 (2002)]; [Hidashida et al. "Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis withrituximab." Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002]; [Tuscano, J. "Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002]가 있다.

문헌 [Sarwal et al . N. Eng J. Med . 349(2):125-138 (July 10, 2003)]은 DNA 마이크로어레이 프로파일링 (DNA microarray profiling)으로 확인한 급성 신장 동종이식 거부반응에서의 분자적 이질성을 보고하고 있다.

본 발명은 자가면역 질환을 앓는 환자로부터 얻은 샘플에 CD20의 존재함을 기초로 환자가 치료를 받도록 선택될 수 있다는 인식에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은

(a) 환자로부터 얻은 샘플에서 CD20을 검출하는 단계; 및

(b) 샘플에서 CD20이 검출된 경우, 환자에게 자가면역 질환을 치료하기 위한 유효량의 CD20 길항제를 투여하는 단계

를 포함하는, 환자에서 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

I. 정의

본원에서 "자가면역 질환"은 자신의 조직으로 발생하여 그에 대항하는 질환 또는 장애이다. 자가면역 질환 또는 장애의 예로는 관절염 (류머티스성 관절염, 아동 류머티스성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염), 건선, 피부염, 다발근육염/피부근육염, 독성 표피 괴사용해, 전신성 경피증 및 경화증, 염증성 장질환과 관련된 반응, 크론병, 궤양성 대장염, 호흡곤란 증후군, 성인 호흡곤란 증후군 (ARDS), 수막염, 뇌염, 포도막염, 대장염, 사구체신염, 알레르기 상태, 습진, 천식, T 세포의 침윤과 관련된 상태 및 만성 염증성 반응, 아테롬성 동맥경화증, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 연소성 발병 당뇨병, 다발성 경화증, 알레르기성 뇌척수염, 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연성 과민증과 관련된 면역반응, 결핵, 유육종증 (sarcoidosis), 베게너 육아종증 (Wegener's granulomatosis)을 비롯한 육아종증, 과립세포 감소증, 혈관염 (ANCA를 포함), 재생불량성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 빈혈 (Diamond Blackfan anemia), 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA)을 비롯한 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 순수 적혈구 무형성증 (PRCA), 인자 VIII 결핍증, A형 혈우병, 자가면역성 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 누출과 관련된 질환, 중추신경계 (CNS) 염증성 장애, 다발성 장기 손상 증후군, 중증근무력증 (myasathenia gravis), 항원-항체 복합체 매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트병 (Bechet disease), 캐슬맨 증후군 (Castleman's syndrome), 굿파스튜어 증후군 (Goodpasture's syndrome), 람버트-이튼 근무력증 증후군 (Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome), 레이노 증후군 (Reynaud's syndrome), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 스티븐스-존슨 증후군 (Stevens-Johnson syndrome), 수포성 유천포창, 천포창, 자가면역 다발성내분비병증, 신장병증, IgM 다발성신경병증 또는 IgM 매개 신경병증, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 혈전 저혈소판혈증 자색반병 (TTP), 자가면역성 혈소판감소증, 자가면역성 고환염 및 난소염을 비롯한 고환 및 난소의 자가면역 질환, 원발성 갑상선기능저하증, 자가면역 갑상선염을 비롯한 자가면역성 내분비 질환, 만성 갑상선염 (하시모또 갑상선염 (Hashimoto's Thyroiditis)), 아급성 갑상선염, 특발성 갑상선 기능저하증, 애디슨병 (Addison's disease), 그레이브스병 (Grave's disease), 자가면역성 다분비선 증후군 (또는 다선 내분비병증 증후군), 인슐린-의존성 진성 당뇨병 (IDDM)으로도 불리는 I형 당뇨병 및 시한 증후군 (Sheehan's syndrome), 자가면역성 간염, 림프양 간질 폐렴 (HIV에 의한), 폐쇄세기관지염 (비-이식성) 대 비특이적 간질 폐렴 (NSIP), 귈레인-바레 증후군 (Guillain-Barre' syndrome), 대혈관 혈관염 (류머티스성 다발성 근육통 및 거대 세포 (다까야스(Takayasu's)) 동맥염을 포함함), 중혈관 혈관염 (가와사끼병 (Kawasaki's disease) 및 결절성 다발동맥염을 포함함), 강직성 척추염, 버거스병 (Berger's disease) (IgA 신장병증), 급속 진행성 사구체신염, 원발성 담즙성 간경변증, 비열대 스프루 (Celiac sprue) (글루텐 장병증), 크라이오글로불린혈증 (cryoglobulinemia), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 관상동맥 질환 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

"B-세포"는 골수 내에서 성숙하는 림프구이며, 그 예로는 면역반응을 겪지 않은 B 세포, 기억 B 세포, 또는 이펙터 B 세포 (플라즈마 세포)가 있다. 본원의 B-세포는 정상 또는 비-악성 B-세포일 수 있다.

"CD20" 항원은 말초 혈액 또는 림프성 기관으로부터 얻은 B 세포 중 90％가 넘는 세포의 표면에서 발견되는 약 35 kDa의 비-글리코실화 인단백질이다. CD20은 전-B 세포 발생 단계의 초기에 발현되어, 플라즈마 세포 분화시까지 남아있는다. CD20은 정상 B 세포 및 악성 B 세포 모두에 존재한다. 문헌상의 CD20의 다른 이름으로는 "B-림프구-제한 항원" 및 "Bp35"가 있다. CD20 항원은, 예를 들어 문헌 [Clark et al . PNAS ( USA ) 82:1766 (1985)]에 기술되어 있다.

"CD20 검출"은 샘플이 CD20을 포함하는지를 측정하는 것을 의미한다. 일반적으로, CD20 단백질을 검출하는 것 뿐만 아니라 CD20 핵산을 검출하는 것 또한 본원에서 상기 어구의 의미에 포함된다.

본원에서 "CD20 핵산"은 CD20 단백질의 적어도 일부분을 코딩하는 DNA 및 mRNA를 비롯한 핵산, 및(또는) 그의 상보성 핵산을 의미한다.

"CD20-양성 B 세포"는 일반적으로 그 세포 표면에서 CD20을 발현시키는 B 세포이다.

"병원성" 세포는 질환 또는 비정상을 야기하고, 발병된 조직 또는 세포 내 또는 주변에 존재할 수 있는 세포이다.

"길항제"는 B 세포 상의 CD20에 결합시 포유동물에서 B 세포를 파괴하거나 고갈시키고(거나) 하나 이상의 B 세포 기능을 방해 (예를 들어, B 세포에 의해 도출된 체액성 반응을 감소시키거나 예방함으로써)하는 분자이다. 길항제는 바람직하게는 그것으로 치료된 포유동물에서 B 세포를 고갈시킬 수 있다 (즉, 순환하는 B 세포의 수준을 감소시킴). 그러한 고갈은 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및(또는) 보체 의존성 세포독성 (CDC), B 세포 증식의 억제 및(또는) B 세포 사멸 유도 (예를 들어, 아폽토시스를 통해) 등의 다양한 메커니즘을 통해 달성될 수 있다. 본 발명의 범위 내에 포함되는 길항제로는 CD20에 결합하며, 임의로 세포독성제와 접합되거나 융합된 항체, 합성 또는 천연 서열 펩티드, 및 소분자 길항제가 있다. 바람직한 길항제는 항체를 포함한다.

"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현시키는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 내츄럴 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포에 결합한 항체를 인식하여, 후속적으로 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 의미한다. 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시키는데 반해, ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현시킨다. 조혈 세포 상에서 FcR의 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet,Annu . Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)]의 464 페이지 상의 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 조사하기 위해서는, 예컨대 미국 특허 제5,500,362호 또는 동 제5,821,337호에 기술된 것과 같은 시험관내 ADCC 분석법이 수행될 수 있다. 그러한 분석법에 유용한 이펙터 세포로는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 내츄럴 킬러 (NK) 세포가 있다. 별법으로 또는 부가적으로는, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS(USA) 95: 652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 조사될 수도 있다.

"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현시키고, 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이 세포는 적어도 FcγRIII를 발현시키고, ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 내츄럴 킬러 (NK) 세포, 단핵세포, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있으며, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다.

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이고, 그 예로는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위 집단 (이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 달리 스플라이싱된 (alternatively spliced) 형태를 포함함)의 수용체가 있다. FcγRII 수용체로는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")가 있으며, 이들은 세포질 도메인에서 주로 다른, 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체인 FcγRIIA는 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프 (ITAM)를 세포질 도메인에 함유한다. 억제 수용체인 FcγRIIB는 면역수용체 티로신-기반의 억제 모티프 (ITIM)를 세포질 도메인에 함유한다 (문헌 [Daёron, Anne . Rev . Immunol . 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu . Rev . Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al ., J. Lab. Clin . Med . 126: 330-41 (1995)]에서 검토된 바 있다. 앞으로 확인하게 될 FcR을 비롯한 다른 FcR도 본원에서 사용된 용어 "FcR"에 포함된다. 이 용어는 모체의 IgG를 태아로 수송하는 역할을 하는 신생아의 수용체인 FcRn을 또한 포함한다 (문헌 [Guyer et al ., J. Immunol . 117:587 (1976)] 및 [Kim et al ., J. Immunol . 24: 249 (1994)]).

"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적을 분해시키는 분자의 능력을 의미한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예를 들어, 항체)에 결합함으로써 시작된다. 보체 활성화를 조사하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al ., J. Immunol . Methods 202: 163 (1996)]에 기술된 바와 같은 CDC 분석법을 수행할 수 있다.

"성장 억제성" 길항제는 이 길항제가 결합한 항원을 발현시키는 세포의 증식을 방지하거나 감소시키는 것이다. 예를 들어, 이 길항제는 시험관내 및(또는) 생체내에서 B 세포의 증식을 방지하거나 감소시킬 수 있다.

"아폽토시스를 유도하는" 길항제는 표준 아폽토시스 분석법 (예컨대, 안넥신 V의 결합, DNA 파쇄, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 파쇄 및(또는) 막 소낭 (아폽토시스 바디 (apoptotic body)로 불림)의 형성)에 의해 측정시 프로그램된 세포 사멸, 예를 들어 B 세포의 사멸을 유도하는 것이다.

본원에서 사용된 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 단일클론 항체, 다클론 항체, 2개 이상의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이성 항체), 및 항체 단편 (단, 원하는 생물학적 활성을 보이는 경우에 한함)을 포괄한다.

"항체 단편"은 온전한 항체의 일부분을 포함하며, 바람직하게는 그 항체의 항원 결합 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디 (diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체가 있다.

본원의 목적상, "온전한 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인과 Fc 영역을 포함하는 것이다.

"천연 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합으로 중쇄에 연결되어 있으며, 디설파이드 연결의 수는 면역글로불린 이소형 (isotype)이 다른 중쇄들 사이에서 달라진다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄 내부의 디설파이드 다리를 갖는다. 각 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_H)을 갖고, 그 뒤쪽에 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_L)을 갖고, 다른 쪽 말단에는 불변 도메인을 갖는데, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄의 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄와 중쇄의 가변 도메인의 경계면 (interface)을 형성하는 것으로 생각된다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 사이에서 서열이 매우 다르고, 각 특정 항체의 자신의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 고르게 분포하지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 도메인 모두에서 초가변 (hypervariable) 영역으로 불리는 3개의 세그먼트 (segment)에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분을 프레임워크 영역 (FR)이라 칭한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은, β-쉬트 (sheet) 구조를 연결하는 (어떤 경우는 β-쉬트 구조의 부분을 형성함) 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 주로 β-쉬트 입체구조를 채택한 4개의 FR을 각각 포함한다. 각 쇄에서의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 가깝게 유지되고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al ., Sequences of Protens of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는데 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능 (예컨대, 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 항체가 관여하는 것)을 나타낸다.

항체를 파파인 (papain)으로 분해하면, 각각 1개의 항원-결합 부위가 있는 2개의 동일한 항원-결합 단편 ("Fab" 단편이라 불림), 및 나머지 "Fc" 단편 (이름이 용이하게 결정화되는 능력을 반영함)이 생성된다. 펩신으로 처리하면, 2개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')₂ 단편이 수득된다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소의 항체 단편이다. 이러한 영역은 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인이 단단한 비-공유 결합에 의해 연결되어 이루어진 이량체로 구성된다. 이 입체구조에서는 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면에서 항체-결합 부위를 형성한다. 총괄하여, 6개의 초가변 영역이 항체에게 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 1개의 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 반)만으로도 항원을 인식하여 거기에 결합하는 능력을 나타내지만, 이 경우의 친화도는 전체 결합 부위보다 낮다.

Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1) 을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 비롯하여, 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 추가되어 있다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기가 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 Fab'를 의미한다. F(ab')₂ 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 1쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.

임의의 척추동물 종으로부터 유래한 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 명백히 구별되는 2가지 유형 (카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불림) 중 하나에 할당될 수 있다.

중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 부류로 할당될 수 있다. 온전한 항체의 5가지 주요 부류 (IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)가 있으며, 이들 중 몇몇은 하위 부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 세분될 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ으로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린이 지니는 서브유닛 구조 및 3-차원 입체구조는 널리 공지되어 있다.

"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하는데, 이때 이들 도메인은 단일 폴리펩티드쇄로 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성할 수 있게 하는, V_H와 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커 (linker)를 추가로 포함한다. scFv의 고찰을 위해서는 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.

용어 "디아바디"는 동일한 폴리펩티드쇄 (V_H-V_L)에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 의미한다. 동일한 쇄에서 2개의 도메인 사이의 페어링이 발생하지 않을 만큼 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 쇄의 상보적 도메인과 페어링하여 2개의 항원-결합 부위를 형성시킨다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세히 기술되어 있다.

본원에서 사용되는 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동질성인 항체 집단으로부터 얻은 항체, 즉 단일클론 항체가 생성되는 동안 야기되는 가능한 변이체 (그러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재함)를 제외하고는 집단을 구성하는 개별 항체가 동일하고(거나) 동일한 에피토프에 결합하는 것을 의미한다.

전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와는 달리, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대한 것이다. 특이성에 더해서, 단일클론 항체는 다른 면역글로불린으로 오염되지 않는다는 점에서 이점을 갖는다. 수식어 "단일클론"은 항체가 실질적으로 동질성인 항체 집단으로부터 얻어졌다는 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법으로 항체를 생성해야하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 문헌 [Kohler et al ., Nature, 256: 495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조하거나, 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조할 수 있다. "단일클론 항체"는 또한 예를 들어, 문헌 [Clackson et al ., Nature, 352: 624-628 (1991)] 및 [Marks et al ., J. Mol . Biol., 222: 581-597(1991)]에 개시된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.

본원의 단일클론 항체는, 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래하거나 특정 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 동질성이며, 상기 쇄(들)의 나머지 부분이 다른 종으로부터 유래하거나 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 동질성인 "키메라" 항체 (면역글로불린), 및 그러한 항체의 단편 (단, 원하는 생물학적 활성을 보이는 경우에 한함)을 특별히 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호; 문헌 [Morrison et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855(1984)]). 본원에서 관심있는 키메라 항체로는 인간을 제외한 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이 (Old World Monkey), 예컨대 개코원숭이, 붉은털 원숭이 또는 사이노몰거스 원숭이)로부터 유래한 가변 도메인 항원-결합 서열, 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체가 있다 (미국 특허 제5,693,780호).

비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 바람직한 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체) (예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 또는 인간을 제외한 영장류)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 교체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 예에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개량하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든 하나 이상의 (전형적으로, 2개의) 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 그것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 상기 언급한 FR 치환을 제외하고 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로 적어도 일부분의 면역글로불린 불변 영역, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역을 또한 포함할 것이다. 보다 상세한 설명을 위해 문헌 [Jones et al ., Nature 321:522-525(1986)]; [Riechmann et al ., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr . Op. Struct . Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.

본원에서 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 일으키는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 및 중쇄 가변 도메인의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)]) 및(또는) "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)])를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 이외에 가변 도메인 잔기이다.

CD20 항원에 결합하는 항체의 예로는, 지금은 "리툭시맙" ("리툭산®")으로 불리는 "C2B8" (이 거명을 통해 명백히 본원에 포함되는 미국 특허 제5,736,137호); "Y2B8" 또는 "이브리투모맙 튜세탄 (Ibritumomab Tiuxetan)" 제발린® (ZEVALIN®)으로 명명된 이트륨-[90]-표지된 2B8 뮤린 항체 (이 거명을 통해 명백히 본원에 포함되는 미국 특허 제5,736,137호); "토시투모맙 (Tositumomab)"으로도 불리는 뮤린 IgG2a "B1" (임의로 ¹³¹I로 표지되어 "¹³¹I-B1" 항체 (요오드 I131 토시투모맙, 벡사르™ (BEXXAR™))를 생성함) (이 거명을 통해 명백히 본원에 포함되는 미국 특허 제5,595,721호); 뮤린 단일클론 항체 "1F5" (문헌 [Press et al. Blood 69(2):584-591 (1987)]) 및 "프레임워크 패치된 (framework patched)" 또는 인간화 1F5 (WO03/002607, Leung, S.; ATCC 기탁번호 HB-96450); 뮤린 2H7 및 키메라 2H7 항체 (이 거명을 통해 명백히 본원에 포함되는 미국 특허 제5,677,180호); 인간화 2H7; huMax-CD20 (Genmab, Denmark); AME-133 (Applied Molecular Evolution); 및 단일클론 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2 (국제 백혈구 타이핑 워크샵 (International Leucocyte Typing Workshop)에서 입수할 수 있음) (문헌 [Valentine et al., Leucocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)]).

본원에서 사용된 용어 "리툭시맙" 또는 "리툭산®"은 CD20에 결합하는 능력을 보유하는 그의 단편을 포함하여 유전공학적으로 조작된 CD20 항원에 대한 키메라 뮤린/인간 단일클론 항체를 의미하며, 이는 이 거명을 통해 본원에 포함되는 미국 특허 제5,736,137호에서 "C2B8"로 지칭되었다.

순수하게 본원의 목적상, "인간화 2H7"은 하기 가변 경쇄 서열 및 가변 중쇄 서열을 포함하는 온전한 항체 또는 항체 단편을 의미한다:

<가변 경쇄 서열>

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (서열 1)

<가변 중쇄 서열>

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (서열 2)

인간화 2H7 항체가 온전한 항체인 경우, 바람직하게는 경쇄 아미노산 서열인

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열 3); 및 중쇄 아미노산 서열인 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNG DTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 4)를 포함한다.

"단리된" 길항제는 동정된 후에 본래 환경의 성분으로부터 분리 및(또는) 회수된 것이다. 이 본래의 환경의 오염 성분은 길항제의 진단 또는 치료적 용도를 방해하고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있는 물질이다. 바람직한 실시양태에서, 길항제는 (1) 로우리법 (Lowry method)으로 측정시 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과의 길항제로 정제되거나, (2) 회전 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (3) 쿠마시 블루 (Coomassie blue), 또는 바람직하게는 실버 (silver) 염색을 사용한 환원 또는 비환원 조건 하의 SDS-PAGE에 의해 동질성을 확인할 정도로 정제될 것이다. 단리된 길항제는 길항제의 본래 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 제자리 (in situ) 길항제를 포함한다. 그러나 통상적으로, 단리된 길항제는 하나 이상의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.

본원에서의 "환자"는 인간 환자이다.

"치료"는 치유적 치료 및 예방 또는 사전 방지적 조치를 모두 의미한다. 치료가 필요한 대상체로는 이미 장애가 생긴 대상체 뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 대상체도 포함된다. 따라서, 포유동물은 장애를 갖는 것으로 진단되거나, 또는 장애에 대한 소양이 있거나 장애에 걸리기 쉬울 수 있다.

"유효량"이란 표현은 당해 장애를 예방, 개선 또는 치료하는데 효과적인 길항제의 양을 의미한다.

부가적 요법을 위해 본원에서 사용되는 용어 "면역억제제"는 본원에서 치료되는 포유동물의 면역계를 억제하거나 감추는 작용을 하는 물질을 의미한다. 이는 사이토카인 생성을 억제하거나, 자가-항원의 발현을 하향조절 또는 억제하거나, 또는 MHC 항원을 감추는 물질을 포함할 것이다. 그러한 면역억제제의 예로는 2-아미노-6-아릴-5-치환 피리미딘 (이 거명을 통해 그 개시 내용이 본원에 포함되는 미국 특허 제4,665,077호 참조); 비스테로이드 소염제 (NSAID); 아자티오프린 (azathioprine); 시클로포스파미드 (cyclophosphamide); 브로모크립틴 (bromocryptine); 다나졸 (danazol); 답손 (dapsone); 글루타르알데히드 (미국 특허 제4,120,649호에 기술된 바와 같이 MHC 항원을 감춤); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 항체; 시클로스포린 A; 글루코코르티코스테로이드와 같은 스테로이드, 예를 들어 프레드니손 (prednisone), 메틸프레드니솔론 (methylprednisolone) 및 덱사메타손 (dexamethasone); 메토트렉세이트 (경구 또는 피하 투여); 히드록시크로로퀸 (hydroxycloroquine); 술파살라진 (sulfasalazine); 레플루노마이드 (leflunomide); 항-인터페론-γ, -β 또는 -α 항체, 항-종양 괴사 인자-α 항체 (인플릭시맙 (infliximab) 또는 아달리무맙 (adalimumab)), 항-TNFα 이뮤노어헤신 (immunoahesin) (에타너셉트 (etanercept)), 항-종양 괴사 인자-β 항체, 항-인터루킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체를 비롯한 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 길항제; 항-CD11a 및 항-CD18 항체를 비롯한 항-LFA-1 항체; 항-L3T4 항체; 이종 항-림프구 글로불린; 판 (pan)-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 함유하는 가용성 펩티드 (WO90/08187; 1990년 7월 26일 공개됨); 스트렙토키나제 (streptokinase); TGF-β; 스트렙토도르나제(streptodornase); 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린 (deoxyspergualin); 라파마이신; T-세포 수용체 (Cohen et al., 미국 특허 제5,114,721호); T-세포 수용체 단편 (문헌 [Offner et al., Science, 251:430-432 (1991)]; WO90/11294; [Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)]; 및 WO91/01133); 및 T1OB9와 같은 T 세포 수용체 항체 (EP 340,109)가 있다.

본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 방지하고(거나) 세포의 파괴를 야기하는 물질을 의미한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 소분자 독소 또는 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 유래의 효소 활성 독소와 같은 독소, 또는 이들의 단편을 포함하는 것이다.

"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예컨대 티오테파 (thiotepa) 및 시클로스포스파미드 (cyclosphosphamide) (시톡산™ (CYTOXAN™)); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판 (piposulfan); 아지리딘, 예컨대 벤조도파 (benzodopa), 카르보쿠온 (carboquone), 메투레도파 (meturedopa) 및 우레도파 (uredopa); 알트레트아민 (altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아미드 (triethylenethiophosphaoramide) 및 트리메틸올로멜라민을 비롯한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민 (methylamelamine); 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실 (chlorambucil), 클로르나파진 (chlornaphazine), 콜로포스파미드 (cholophosphamide), 에스트라무스틴 (estramustine), 이포스파미드 (ifosfamide), 메클로레타민 (mechlorethamine), 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란 (melphalan), 노벰비친 (novembichin), 페네스테린 (phenesterine), 프레드니무스틴 (prednimustine), 트로포스파미드 (trofosfamide), 우라실 머스타드; 니트로스우레아 (nitrosurea), 예컨대 카르무스틴 (carmustine), 클로로조토신 (chlorozotocin), 포테무스틴 (fotemustine), 로무스틴 (lomustine), 니무스틴 (nimustine), 라니무스틴 (ranimustine); 항생제, 예컨대 아클라시노마이신 (aclacinomysin), 악티노마이신 (actinomycin), 아우트라마이신 (authramycin), 아자세린 (azaserine), 블레오마이신 (bleomycin), 칵티노마이신 (cactinomycin), 칼리케아미신 (calicheamicin), 카라비신 (carabicin), 카르미노마이신 (carminomycin), 카르지노필린 (carzinophilin), 크로모마이신 (chromomycin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 데토루비신 (detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신 (esorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 마르셀로마이신 (marcellomycin), 미토마이신 (mitomycin), 미코페놀산 (mycophenolic acid), 노갈라마이신 (nogalamycin), 올리보마이신 (olivomycin), 페플로마이신 (peplomycin), 포트피로마이신 (potfiromycin), 푸로마이신 (puromycin), 켈라마이신 (quelamycin), 로도루비신 (rodorubicin), 스트렙토니그린 (streptonigrin), 스트렙토조신 (streptozocin), 투베르시딘 (tubercidin), 우베니멕스 (ubenimex), 지노스타틴 (zinostatin), 조루비신 (zorubicin); 항-대사산물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU) ; 엽산 (folic acid) 유사체, 예컨대 데놉테린 (denopterin), 메토트렉세이트, 프테롭테린 (pteropterin), 트리메트렉세이트 (trimetrexate); 푸린 유사체, 예컨대 플루다라빈 (fludarabine), 6-머캅토푸린, 티아미프린 (thiamiprine), 티오구아닌 (thioguanine); 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈 (ancitabine), 아자시티딘 (azacitidine), 6-아자우리딘 (azauridine), 카르모푸르 (carmofur), 시타라빈 (cytarabine), 디데옥시우리딘 (dideoxyuridine), 독시플루리딘 (doxifluridine), 에노시타빈 (enocitabine), 플록수리딘 (floxuridine), 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론 (calusterone), 드로모스타놀론 프로피오네이트 (dromostanolone propionate), 에피티오스타놀 (epitiostanol), 메피티오스탄 (mepitiostane), 테스토락톤 (testolactone); 항-부신제, 예컨대 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 미토탄 (mitotane), 트리로스탄 (trilostane); 엽산 공급 물질, 예컨대 프롤린산 (frolinic acid); 아세글라톤 (aceglatone); 알도포스파미드 (aldophosphamide) 글리코시드; 아미노레불린산 (aminolevulinic acid); 암사크린 (amsacrine); 베스트라부실 (bestrabucil); 비산트렌 (bisantrene); 에다트락세이트 (edatraxate); 데포파민 (defofamine); 데메콜신 (demecolcine); 디아지쿠온 (diaziquone); 엘포르니틴 (elfornithine); 엘립티늄 (elliptinium) 아세테이트; 에토글루시드 (etoglucid); 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난 (lentinan); 로니다민 (lonidamine); 미토구아존 (mitoguazone); 미톡산트론 (mitoxantrone); 모피다몰 (mopidamol); 니트라크린 (nitracrine); 펜토스타틴 (pentostatin); 페나메트 (phenamet); 피라루비신 (pirarubicin); 포도필린산 (podophyllinic acid); 2-에틸히드라지드; 프로카르바진 (procarbazine); PSK®; 라족산 (razoxane); 시조피란 (sizofiran); 스피로게르마늄 (spirogermanium); 테누아존산 (tenuazonic acid); 트리아지쿠온 (triaziquone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신 (vindesine); 다카르바진 (dacarbazine); 만노무스틴 (mannomustine); 미토브로니톨 (mitobronitol); 미토락톨 (mitolactol); 피포브로만 (pipobroman); 가시토신 (gacytosine); 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드 (taxoid), 예를 들어 파클리탁셀 (paclitaxel) (탁솔® (TAXOL®; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) 및 독세탁셀 (doxetaxel) (탁소테레® (TAXOTERE®; Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실 (chlorambucil); 겜시타빈 (gemcitabine); 6-티오구아닌; 머캅토푸린 (mercaptopurine); 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 (cisplatin) 및 카르보플라틴 (carboplatin); 빈블라스틴 (vinblastine); 백금; 에토포시드 (etoposide) (VP-16); 이포스파미드 (ifosfamide); 미토마이신 C; 미톡산트론 (mitoxantrone); 빈크리스틴 (vincristine); 비노렐빈 (vinorelbine); 나벨빈 (navelbine); 노반트론 (novantrone); 테니포시드 (teniposide); 다우노마이신 (daunomycin); 아미놉테린 (aminopterin); 크셀로다 (xeloda); 이반드로네이트 (ibandronate); CPT-11; 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라마이신 (esperamicin); 카페시타빈 (capecitabine); 및 상기 화학요법제의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 있다. 또한 이 정의는 종양에서 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대, 예를 들어 타목시펜 (tamoxifen), 랄록시펜 (raloxifene), 아로마타제 (aromatase) 억제성 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜 (trioxifene), 케옥시펜 (keoxifene), LY117018, 오나프리스톤 (onapristone) 및 토레미펜 (toremifene) (파레스톤 (Fareston))을 비롯한 항-에스트로겐제; 및 항-안드로겐제, 예컨대 플루타미드 (flutamide), 니루타미드 (nilutamide), 비칼루타미드 (bicalutamide), 류프롤리드 (leuprolide) 및 고세렐린 (goserelin), 및 상기 항-호르몬제의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.

용어 "사이토카인"은 세포간 매개체로서 다른 세포에 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 포괄적 용어이다. 그러한 사이토카인의 예로는 림포카인, 모노카인 및 종래의 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토카인에는 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴렉신; 프로릴렉신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체형성 호르몬 (LH); 간 성장인자; 섬유아세포 성장인자; 프로락틴; 태반성 락토겐 (placental lactogen); 종양 괴사인자-α 및 -β; 뮬러-억제 물질 (mullerian-inhibiting substance); 마우스 고나도트로핀-결합 펩티드; 인히빈 (inhibin); 액티빈 (activin); 혈관 내피세포 성장인자; 인테그린 (integrin); 트롬보포이에틴 (thrombopoietin) (TPO); 신경 성장인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-성장인자; 형질전환 성장인자 (TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린-유사 성장인자-I 및 -II; 에리스로포이에틴 (erythropoietin) (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β; 및 LIF 및 키트 리간드 (KL)를 비롯한 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에 사용된 용어 사이토카인은 천연 공급원으로부터의 단백질 또는 재조합 세포 배양액으로부터의 단백질, 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.

본 출원에서 사용된 용어 "프로드러그"는 모 약물에 비해 종양 세포에 세포독성이 적고, 효소에 의해 활성화되거나 보다 활성이 큰 모 형태로 전환될 수 있는 제약상 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 의미한다. 예를 들어, 문헌 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy "Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)] 및 [Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]을 참조한다. 본 발명의 프로드러그로는 포스페이트-함유 프로드러그, 티오포스페이트-함유 프로드러그, 술페이트-함유 프로드러그, 펩티드-함유 프로드러그, D-아미노산-변형 프로드러그, 글리코실화 프로드러그, β-락탐-함유 프로드러그, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 프로드러그 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 프로드러그, 보다 활성이 높은 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 5-플루오로시토신 및 다른 5-플로오로우리딘 프로드러그가 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 사용하기 위한 프로드러그 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 상기 기술한 화학요법제가 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

"B 세포 악성종양"은 B 세포와 관련된 악성종양이다. 그 예로는 림프구 우세 호지킨병 (lymphocyte predominant Hodgkin's disease: LPHD)을 비롯한 호지킨병; 비-호지킨 림프종 (NHL); 여포 중심 세포 (FCC) 림프종; 급성 림프구성 백혈병 (ALL); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 털세포 (hairy cell) 백혈병; 형질세포양 (plasmacytoid) 림프성 림프종; 외투 세포 (mantle cell) 림프종; AIDS 또는 HIV-관련 림프종; 다발성 골수종; 중추신경계 (CNS) 림프종; 이식 후 림프세포증식성 장애 (post-transplant lymphoproliferative disorder (PTLD)); 발덴슈트롬 거대글로불린혈증 (Waldenstrom's macroglobulinemia) (림프형질세포성 림프종); 점막-관련 림프조직 (MALT) 림프종; 및 경계부 (marginal zone) 림프종/백혈병이 있다.

비-호지킨 림프종(NHL)으로는 저급/여포성 NHL, 재발성 또는 난치성 NHL, 전-선 저급 (front line low grade) NHL, 단계 III/IV NHL, 화학용법 내성 NHL, 소림프성 (SL) NHL, 중급/여포성 NHL, 중급 미만성 (intermediate grade diffuse) NHL, 미만성 대세포 림프종, 공격성 NHL (공격성 전-선 NHL 및 공격성 재발성 NHL를 포함), 자가 줄기 세포 이식 후의 NHL 재발 또는 자가 줄기 세포 이식에 대한 난치성 NHL, 고급 면역모세포성 NHL, 고급 모림프구성 NHL, 고급 소 비-절단 세포 NHL, 벌키 (bulky) 질환 NHL 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

II. CD20 검출

본 발명은 환자의 샘플에서 CD20이 검출되는 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법에 따라, 생물학적 샘플을 환자로부터 얻고, 샘플에 CD20 (단백질, DNA, RNA)이 존재하는지 측정하기 위한 검사를 수행한다. 바람직하게는, (병원성) CD20-양성 B 세포의 존재가 측정되지만, 세포-유리 항원, 예를 들어 순환 CD20 또는 그 단편의 검출도 고려된다. CD20이 검출된 경우, 환자는 CD20 길항제로 치료하기에 적합하다고 결정된다.

CD20은 면역조직화학법 (IHC), 면역염색법, 형광 활성화 세포분류법 (FACS), 면역침강법, 웨스턴 블랏팅, 형광 제자리 혼성화 (fluorescent in situ hybridization) (FISH), DNA 마이크로어레이 등을 비롯한 다양한 수단에 의해 검출될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, CD20 단백질의 존재는 적합한 조사 형식, 바람직하게는 면역조직화학법으로 항체 또는 이에 결합한 다른 리간드를 사용하여 측정된다. 그러나, 본 발명은 시험된 샘플에서 CD20의 DNA 및 RNA를 비롯한 CD20 핵산을, 예를 들어 유전자 프로파일링, FISH 또는 다른 방법으로 분석함으로써 CD20의 상향조절 또는 CD20 생성량 증가를 결정하는 것을 특히 고려한다.

C2B8, 2B8, B1, 1F5, 2H7, 휴맥스 (huMax)-CD20, AME-133, L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2, 아브캄 리미티드 (Abcam Ltd)에서 시판되는 항체 (마우스 단일클론 MEM-97, 마우스 단일클론 L26, 염소 다클론 MS4A1, 마우스 단일클론 BCA-B/20) 등을 비롯하여 CD20에 결합하는 다양한 항체가 CD20 항원을 검출하는데 이용될 수 있다.

본원에서 시험된 생물학적 샘플은 관심있는 자가면역 질환에 의해 결정된다. 시험하기로 선택된 자가면역 질환의 대표적 샘플로는 하기 나열된 것 등이 있다.

류머티스성 관절염 - 활막 생검체 및(또는) 활액

루푸스 - 림프절 (예를 들어, 편도 림프절), 골수 생검체, 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)

궤양성 대장염 또는 염증성 장질환 - 내시경 샘플

자가면역 질환의 피부 발현 - 펀치 생검체 (punch biopsy), 말초혈액 단핵 세포 (PBMC), 림프절.

샘플을 냉동시키고(거나), 새로이 제조하고(거나), 고정시키고(거나) (예를 들어, 포르말린으로 고정시킴), 원심분리하고(거나), 임베딩 (예를 들어, 파라핀 임베딩) 시킬 수 있다.

가장 널리 쓰이는 면역조직화학법의 절차는 1차 항체와 인큐베이션하기 전에 포름알데히드 또는 다른 가교 고정액을 사용하여 세포 또는 조직을 고정시키는 단계를 이용하는 것이다. 고정은 조직 형태를 유지하고, 조직 항원의 분해를 방지하기 위해 사용될 수 있다. 고정은 절개된 조직 조각 (예를 들어, 인간 생검체)을 고정액에 침지시킴으로써 수행될 수 있다. 불충분하거나 과도한 고정은 조직의 면역반응성을 감소시키거나 제거할 수 있으므로, 고정 조건을 최적화시키는 것이 바람직하다. 불충분한 고정을 바로잡는 가장 쉬운 방법은 면역조직화학 염색 전에 조직 절단부를 슬라이드 상에서 후-고정시키는 것이다. 과도하게 고정된 조직에서 항원을 회수하기 위해, 프로테아제-유도 에피토프 회복법 (protease-induced epitope retrieval (PIER)) 또는 열-유도 에피토프 회복법 (heat-induced epitope retrieval (HIER)) 기술이 권장된다. HIER은 마이크로파 오븐, 압력솥, 야채 찜기, 오토클레이브 또는 항온 수조를 사용하여 수행될 수 있다. 조직을 고정시킨 후, 이들은 파라핀에 임베딩되거나 OCT 화합물로 덮인 후에 추가의 절단을 위해 냉동될 수 있다. 파라핀-임베딩 조직은 실온에서 마이크로톰을 사용하여 자를 수 있는 반면, 냉동된 조직은 0℃ 미만에서 저온유지장치 (cryostat)를 이용하여 자를 수 있다. 항원 면역반응성은 파라핀-임베딩 조직에서보다 냉동된 상태에서 더 잘 보존됨이 밝혀졌다 (문헌 [Larsson, L., Immunocytochemistry: Theory and Practice, CRC Press, Boca Raton, Florida (1988)]; 및 [Frost, A. et al . Appl . Immufzohistochem . Mol . Morphol. 8:236 (2000)]).

검출 방법이 면역조직화학법인 경우, 샘플은 제조자의 지시에 따라 CD20에 결합하는 "1차 항체"에 노출될 수 있다. 세척 후, 샘플은 일반적으로 검출가능한 표지 (예컨대, 비오틴 등)와 접합된 "2차 항체"에 노출된다. 추가의 세척 단계 후, 표지는 널리 공지된 절차에 따라 검출될 수 있다.

CD20이 샘플에 존재하는 것으로 밝혀진 경우, 샘플을 제공한 환자는 본원에 개시된 바와 같은 CD20 길항제로 치료하기 위한 후보로 결정된다. CD20 길항제의 생성 방법에 대한 설명은 하기에 나와 있다.

III. 길항제의 제조

본 발명의 제조 방법 및 물품은 CD20에 결합하는 길항제를 사용하거나 포함한다. 따라서, 그러한 길항제를 제조하는 방법이 본원에 기술될 것이다.

길항제의 생성 또는 스크리닝을 위해 사용되는 CD20 항원은 예를 들어, 바람직한 에피토프를 함유하는 CD20의 가용성 형태 또는 그의 일부일 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 세포 표면에 CD20을 발현시키는 세포는 길항제(들)를 생성하거나 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 길항제를 생성하는데 유용한 CD20의 다른 형태는 당업자에게 명백할 것이다.

바람직한 길항제는 항체이지만, 항체가 아닌 길항제도 본원에서 고려된다. 예를 들어, 길항제는 세포독성제 (예컨대, 본원에 기술된 것들)와 임의로 융합되거나 접합된 소분자 길항제를 포함할 수 있다. 본원에서 관심있는 CD20 항원에 결합하는 소분자를 확인하기 위해 소분자의 라이브러리를 CD20 항원에 대해 스크리닝할 수 있다. 소분자는 추가로 길항제 특성에 대해 스크리닝되고(거나), 세포독성제와 접합될 수 있다.

길항제는 또한 추론적 디자인에 의해, 또는 파지 디스플레이에 의해 생성된 펩티드일 수 있다 (예를 들어, 1998년 8월 13일자로 공개된 WO98/35036 참조). 한 실시양태에서, 선택된 분자는 "CDR 모방체", 즉 항체의 CDR에 기초하여 디자인된 항체 유사체일 수 있다. 그러한 펩티드는 그 자체로 길항성일 수 있으나, 그 펩티드는 임의로 세포독성제와 융합되어 펩티드의 길항제 특성을 부가하거나 강화시킬 수 있다.

하기 설명은 본 발명에 따라 사용되는 항체 길항제의 제조 기술을 예시적으로 보여줄 것이다.

(i) 다클론 항체

다클론 항체는 관련 항원 및 면역보강제를 다수회 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사함으로써 동물에서 바람직하게 생성된다. 관련 항원을 면역화될 종에서 면역원성인 단백질 (예를 들어, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 2관능성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통해 접합됨), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂, 또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R¹은 상이한 알킬기임)을 사용하는 대두 트립신 억제제)에 접합시키는 것이 유용할 수 있다.

동물은, 예를 들어 단백질 또는 접합체 100 ㎍ 또는 5 ㎍ (각각 토끼 또는 마우스에 대해)을 3배 부피의 프로인드 완전 면역보강제 (Freund's complete adjuvant)와 합하여, 다양한 부위에서 피내로 용액을 주사함으로써 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화된다. 한 달 후, 프로인드 완전 면역보강제 중의 펩티드 또는 접합체 (원래 양의 1/5 내지 1/10)를 다양한 부위에 피하주사로 동물에게 추가접종 (boosting)한다. 7 내지 14일 후, 동물의 피를 뽑고, 혈청을 항체 역가에 대해 조사한다. 역가가 정체 상태에 이를 때까지 동물에게 추가접종한다. 바람직하게는, 동일한 항원의 접합체이지만, 상이한 단백질과 접합되고(거나) 상이한 가교 시약을 통해 접합된 접합체를 동물에게 추가접종한다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양액에서 단백질 융합으로 제조될 수 있다. 또한, 응집제 (예컨대, 알룸 (alum))가 면역 반응을 강화시키는데 적합하게 사용된다.

(ii) 단일클론 항체

단일클론 항체는 실질적으로 동질성인 항체 집단으로부터 얻은 항체, 즉 단일클론 항체가 생성되는 동안 야기되는 가능한 변이체 (그러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재함)를 제외하고는 집단을 구성하는 개별 항체가 동일하고(거나) 동일한 에피토프에 결합하는 것을 의미한다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 서로 다른 항체들의 혼합물 또는 다클론 항체들의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타낸다.

예를 들어, 단일클론 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조하거나, 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호)으로 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적합한 숙주 동물 (예컨대, 햄스터)을 상기 기술된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 림프구는 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제 (예컨대, 폴리에틸렌 글리콜)를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press,1986)]).

이와 같이 생성된 하이브리도마 세포를 시딩하여, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양용 배지에서 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT 또는 HPRT)) 효소가 없는 경우, 하이브리도마 배양용 배지는 전형적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는 물질인 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 함유할 것이다.

바람직한 골수종 세포는, 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생성 세포에 의해 항체를 적합하게 높은 수준으로 생성하게 해주고, 배지 (예컨대, HAT 배지)에 민감한 세포이다. 이들 중, 바람직한 골수종 세포주는 예컨대, 살크 인스티튜트 세포분배센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA)에서 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양에서 유래한 것과 같은 뮤린 골수종 세포주, 및 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA)에서 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 잡종골수종 세포주는 또한 인간 단일클론 항체의 제조용으로 기술되어 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).

하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 항원에 대한 단일클론 항체의 생성에 대해 조사한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 조사 (예컨대, 방사면역검증법 (radioimmunoassay: RIA) 또는 효소-연결 면역흡수법 (enzyme-linked immunoabsorbent assay: ELISA))로 결정된다.

단일클론 항체의 결합 친화도는 예를 들어, 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)]의 스캐차드 (Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다.

하이브리도마 세포가 바람직한 특이성, 친화도 및(또는) 활성을 갖는 항체를 생성하는 것으로 확인된 후에, 이 클론을 제한 희석 절차로 서브클로닝하여, 표준 방법으로 성장시킬 수 있다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적합한 배양 배지로는 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 있다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로 생체내에서 성장시킬 수 있다.

상기 서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체는, 적합하게는 종래의 면역글로불린 정제 절차, 예컨대 단백질 A-세파로스 (Sepharose), 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리된다.

단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 종래의 절차 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)를 이용해서 용이하게 분리하고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 단리된 후에, DNA는 발현 벡터 내에 위치할 수 있고, 이 벡터는 이후에 숙주 세포 (예컨대, 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포, 또는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포)로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서의 단일클론 항체 합성을 달성할 수 있다. 항체를 코딩하는 DNA를 박테리아에서 재조합 발현시키는 것에 대한 고찰 문헌으로는 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993)] 및 [Plueckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)]이 있다.

추가의 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al ., Nature, 348: 552-554 (1990)]에 개재된 기술을 이용하여 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]은 각각 파지 라이브러리를 이용한 뮤린 및 인간 항체의 단리에 대해 기술하고 있다. 후속 간행물들은 쇄 셔플링 (chain shuffling)에 의해 높은 친화도 (nM 범위)의 인간 항체 제조에 대해 기술하고 있고 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)]), 또한 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합에 대해 기술하고 있다 (문헌 [Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)]). 따라서, 이 기술들은 단일클론 항체를 단리하기 위한 종래의 단일클론 항체 하이브리도마 기술에 대해 존립가능한 대안이다.

DNA는 또한 예를 들어, 동질성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 (미국 특허 제4,816,567호; 문헌 [Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 개질될 수 있다.

전형적으로 그러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인을 치환시키거나, 또는 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인을 치환시킴으로써, 소정의 항원에 대해 특이성을 갖는 한 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성한다.

(iii) 인간화 항체

비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 전형적으로 "임포트 (import)" 가변 도메인으로부터 얻은 "임포트" 잔기로 불리운다. 인간화는 초가변 영역 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 및 동료 (Winter and co-workers)의 방법에 따라 수행될 수 있다 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]). 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 실질적으로 온전한 인간 가변 도메인의 일부가 비-인간 종의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 제4,816,567호). 실제로는, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

인간화 항체를 제조하는데 사용되는 인간 가변 도메인의 경쇄 및 중쇄 둘 다의 선택은 항원성을 감소시키는데 있어서 매우 중요하다. 소위 "가장-적합한 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열과 가장 관련성이 높은 인간 서열을 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로 수용한다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)]; [Chothia et al.,J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)]). 다른 방법은, 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역의 특정 하위집단에 속하는 모든 인간 항체의 컨센서스 (consensus) 서열로부터 유래한 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 동일한 프레임워크가 몇몇의 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)]).

또한, 항체가 항원과의 높은 친화력 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 유지한 채로 인간화되는 것도 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따르면, 인간화 항체는 모 서열 및 다양한 개념상의 인간화 생성물을 이들의 3차원 모델을 이용하여 분석하는 과정으로 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 공공연히 입수할 수 있고, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체구조를 도시하여 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램도 입수가능하다. 이들 디스플레이의 정밀검사는 후보 면역글로불린 서열이 기능함에 있어 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방법으로 FR 잔기를 수용자 및 임포트 서열로부터 선택하여 조합함으로써 바람직한 항체 특징 (예컨대, 표적 항원(들)에 대한 친화도가 증가함)이 달성될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는 작용에 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다.

(iv) 인간 항체

인간화에 대한 대안으로, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화시, 내생 면역글로불린을 생성하지 않으면서 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성하는 것이 가능한 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 만드는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포주 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자의 동형접합성 (homozygous) 결실이 내생 항체 생성의 완전한 억제를 야기한다는 것이 기술되어 있다. 그러한 생식세포주 돌연변이 마우스에 인간 생식세포주 면역글로불린 유전자 어레이 (array)를 전달하면, 항원 투여시 인간 항체의 생성을 야기할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 및 미국 특허 제5,591,669호, 동 제5,589,369호 및 동 제5,545,807호를 참조한다.

별법으로, 파지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al ., Nature 348: 552-553 (1990)])은 면역화되지 않은 공여자의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 필라멘트성 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 부차적 코트 단백질 유전자로 프레임에 맞게 (in-frame) 클로닝되어, 파지 입자의 표면상에서 기능성 항체 단편으로 디스플레이된다. 필라멘트성 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 또한 그러한 특성을 보이는 항체를 코딩하는 유전자의 선별을 야기한다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성 중 몇 가지를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 형식으로 수행될 수 있는데, 이에 대한 고찰을 위해서는 예를 들어, 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)]을 참조한다. V-유전자 세그먼트의 다양한 공급원이 파지 디스플레이를 위해 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352 : 624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장에서 유래한 V 유전자의 작은 무작위 조합형 라이브러리로부터 매우 다양한 항-옥사졸론 항체를 단리하였다. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 구성하고, 매우 다양한 항원 (자가-항원을 포함)에 대한 항체를 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)] 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라 단리할 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 동 제5,573,905호를 참조한다.

인간 항체는 또한 시험관내에서 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다 (미국 특허 제5,567,610호 및 동 제5,229,275호).

(v) 항체 단편

항체 단편을 제조하는 다양한 기술이 개발되었다. 관습적으로는, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질분해성 분해에 의해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 언급한 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되어, 화학적 커플링에 의해 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]). 다른 접근법에 따르면, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양액으로부터 직접 단리할 수 있다. 항체 단편을 제조하는 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호를 참조한다. 항체 단편은 또한, 예를 들어 미국 특허 제5,641,870호에 기술된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 그러한 선형 항체 단편은 단일특이성이거나 이중특이성이다.

(vi) 이중특이성 항체

이중특이성 항체는 2개 이상의 다른 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 대표적인 이중특이성 항체는 CD20 항원의 2개의 다른 에피토프에 결합할 수 있다. 그러한 항체 중 다른 것은 CD20에 결합할 수 있고, 추가로 2차 B 세포 표면 마커에 결합한다. 별법으로, 항-CD20 결합 아암 (arm)은 백혈구 상의 촉발 분자 (예컨대, T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2 또는 CD3)), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR) (예컨대, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16))에 결합하는 아암과 조합되어, B 세포에 대한 세포 방어 메커니즘에 집중할 수 있다. 이중특이성 항체는 또한 B 세포에 세포독성제를 위치하게 하는데 사용될 수 있다. 이들 항체는 CD20-결합 아암, 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린 (saporin), 항-인터페론-α, 빈카 (vinca) 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐 (hapten))에 결합하는 아암을 갖는다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')₂ 이중특이성 항체)로서 제조될 수 있다.

이중특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이성 항체의 관습적 제조는 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현 (coexpression)에 기초한다 (문헌 [Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 조합으로 인하여, 이들 하이브리도마 (쿼드로마 (quadroma))는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물로 제조되고, 이들 중 하나만이 정확한 이중특이성 구조를 갖는다. 일반적으로 친화 크로마토그래피 단계로 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 귀찮으며, 생성물의 수득률도 낮다. 유사한 절차가 WO93/08829, 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

다른 접근법에 따르면, 바람직한 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열과 융합된다. 바람직하게는, 적어도 힌지의 일부, CH2, 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 융합된다. 경쇄 결합에 필수적인 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)이 하나 이상의 융합체에 존재하도록 하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 별개의 발현 벡터로 삽입되어, 적합한 숙주 유기체로 동시-형질감염된다. 이는, 구성에 사용된 3개의 폴리펩티드쇄의 동일하지 않은 비율이 최적 수득률을 제공하는 경우, 실시양태에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 상당한 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 2개 이상의 폴리펩티드쇄의 발현이 높은 수득율을 야기하거나 비율이 특별히 중요하지 않은 경우, 하나의 발현 벡터에 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드쇄에 대한 코딩 서열을 삽입하는 것도 가능하다.

이러한 접근법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이성 항체는 한 아암에 있는 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 (hybrid) 면역글로불린 중쇄, 및 다른 아암에 있는 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이성 분자의 한쪽 반에서만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 분리의 쉬운 방법을 제공하기 때문에, 이 비대칭 구조가 원치않는 면역글로불린쇄 조합으로부터 바람직한 이중특이성 화합물의 분리를 촉진한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 접근은 WO94/04690에 개시되어 있다. 이중특이성 항체의 생성에 대한 추가의 상세한 설명은 예를 들어, 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)]을 참조한다.

미국 특허 제5,731,168호에 기술된 다른 접근법에 따르면, 1쌍의 항체 사이의 경계면을 조작하여, 재조합 세포 배양액으로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화시킬 수 있다. 바람직한 경계면은 항체 불변 도메인의 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 경계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 측쇄(들)과 동일하거나 유사한 크기의 보상성 "공동 (cavity)"은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 치환시킴으로써 제2 항체 분자의 경계면에 생성된다. 이는 다른 원치않은 최종-생성물 (예컨대, 동종이량체)보다 이종이량체의 수득률을 증가시키는 메커니즘을 제공한다.

이중특이성 항체로는 가교 또는 "이종접합" 항체가 있다. 예를 들어, 이종 접합 항체 중 한 항체는 아비딘과 커플링되고 다른 항체는 비오틴과 커플링될 수 있다. 그러한 항체는 예를 들어, 면역계 세포를 원치않는 세포로 표적화시키고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염의 치료용인 것으로 제안된 바 있다 (WO91/00360, WO92/200373, 및 EP03089). 이종접합 항체는 임의의 편리한 가교법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교제는 당업계에 널리 공지되어 있고, 많은 가교 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 기술되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이성 항체를 생성하는 기술은 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]은 온전한 항체가 단백질분해에 의해 절단되어 F(ab')₂ 단편을 생성하는 절차를 기술하고 있다. 이들 단편은 디티올 복합체 형성제인 아비산나트륨의 존재 하에 환원되어, 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지한다. 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체 중 하나는 이어서 머캅토에틸아민으로 환원되어 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이성 항체를 생성한다. 생성된 이중특이성 항체는 효소의 선택적 고정화 (immobilization)를 위한 제제로서 사용될 수 있다.

재조합 세포 배양액으로부터 직접 이중특이성 항체 단편을 제조하고 단리하는 다양한 기술도 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 류신 지퍼를 이용하여 제조된다 (문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]). 포스 (Fos) 및 준 (Jun) 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합으로 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성하고, 이어서 재산화시켜 항체 이종이량체를 형성하였다. 이 방법은 또한 항체 동종이량체의 제조에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기술된 "디아바디" 기술은 이중특이성 항체 단편을 제조하는 다른 방법을 제공하였다. 그 단편은 동일한 쇄에서 2개의 도메인 사이에 페어링이 일어나지 않을 만큼 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 V_H 및 V_L 도메인은 다른 단편의 상보성 V_L 및 V_H 도메인과 쌍을 이룸으로써, 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 이용하여 이중특이성 항체 단편을 제조하는 다른 전략도 또한 보고되어 있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)]을 참조한다.

2가 이상의 항체도 고려된다. 예를 들어, 삼중특이성 항체가 제조될 수 있다 (문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991)]).

IV. 길항제의 접합체 및 다른 변형

본원의 방법에서 사용되거나 제조 물품 중에 포함되는 길항제는 임의로 세포독성제와 접합될 수 있다.

그러한 길항제-세포독성제 접합체의 생성에서 유용한 화학요법제는 상기 기술되었다.

길항제와 1종 이상의 소분자 독소 (예컨대, 칼리케아미신 (calicheamicin), 마이탄신 (maytansine) (미국 특허 제5,208,020호), 트리코텐 (trichothene), 및 CC1065)의 접합체도 본원에서 고려된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 길항제는 하나 이상의 마이탄신 분자와 접합된다 (예를 들어, 길항제 분자 하나당 마이탄신 분자 약 1 내지 약 10개). 마이탄신은 예를 들어, May-SS-Me로 전환될 수 있고, May-SS-Me는 May-SH3로 환원되어, 변형된 길항제와 반응함으로써 마이탄시노이드-길항제 접합체를 생성할 수 있다 (문헌 [Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)]).

별법으로, 길항제는 하나 이상의 칼리케아미신 분자와 접합된다. 항생제의 칼리케아미신류는 피코몰농도 이하의 농도에서 이중-가닥 DNA에 절단부 (break)를 형성할 수 있다. 본원에서 사용되는 칼리케아미신의 구조적 유사체로는 γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-아세틸-γ₁ ^I, PSAG 및 θ^I ₁가 있으나, 이에 제한되지는 않는다 (문헌 [Hinman et al . Cancer Research 53: 3336-3342 (1993)] 및 [Lode et al . Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)]).

사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 (diphtheria) A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 엑소톡신 (exotoxin) A 쇄 (슈도모나스 에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터의), 리신 A 쇄, 아브린 (abrin) A 쇄, 모데신 (modeccin) A 쇄, 알파-사르신 (sarcin), 알류리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 (dianthin) 단백질, 피토라카 어메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신 (curcin), 크로틴 (crotin), 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌 (gelonin), 미토겔린 (mitogellin), 레스트릭토신 (restrictocin), 페노마이신 (phenomycin), 에노마이신 (enomycin) 및 트리코테세네스 (tricothecenes)가 있다. 예를 들어, 1993년 10월 28일자로 공개된 WO93/21232를 참조한다.

본 발명은 추가로 핵용해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 데옥시리보뉴클레아제 (DNase)와 같은 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제)과 접합된 길항제를 고려한다.

다양한 방사성 동위원소가 방사성접합 길항제의 생성에 사용될 수 있다. 그 예로는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², 및 Lu의 방사성 동위원소가 있다.

길항제와 세포독성제의 접합체는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드를 길항제에 접합시키는 대표적 킬레이트화제이다 (WO94/11026 참조). 링커는 세포에서 세포독성 물질의 방출을 촉진하는 "절단가능 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 디술파이드-함유 링커 (문헌 [Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)])가 사용될 수 있다.

별법으로, 길항제 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질이 예를 들어, 재조합 기술 또는 펩티드 합성으로 제조될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 길항제는 종양 예비표적화 (pretargeting)에서 이용하기 위해 "수용체" (예컨대, 스트렙타비딘)에 접합될 수 있고, 여기서 상기 길항제-수용체 접합체가 환자에게 투여된 후에 제거제를 이용하여 순환으로부터 결합하지 않은 접합체를 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여할 수 있다.

본 발명의 길항제는 또한, 프로드러그를 활성 항-암제로 전환시키는 프로드러그-활성화 효소와 접합될 수 있다 (예를 들어, 펩티드 화합요법제, WO81/01145 참조). 예를 들어, WO88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호를 참조한다.

그러한 접합체의 효소 성분은 프로드러그가 더욱 활성이 높은 세포독성 형태로 전환되도록 하는 방식으로 프로드러그에 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다.

본 발명의 방법에서 유용한 효소로는 포스페이트-함유 프로드러그를 유리 약물로 전환하는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 술페이트-함유 프로드러그를 유리 약물로 전환하는데 유용한 아릴술파타제; 비-독성 5-플루오로시토신을 항암제인 5-플루오로우라실로 전환하는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 프로드러그를 유리 약물로 전환하는데 유용한 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제 (serratia protease), 써모리신 (thermolysin), 서브틸리신 (subtilisin), 카르복시펩티다제 (carboxypeptidase) 및 카텝신 (cathepsin) (예컨대, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환기를 함유하는 프로드러그를 전환하는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화 프로드러그를 유리 약물로 전환하는데 유용한 탄수화물-절단 효소 (예컨대, β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제(neuraminidase)); β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소에서 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 유도체화된 약물을 각각 유리 약물로 전환하는데 유용한 페니실린 아미다제 (예컨대, 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제)가 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 별법으로, 당업계에 "아브자임 (abzyme)"으로도 공지된, 효소 활성을 갖는 항체가 본 발명의 프로드러그를 유리 활성 약물로 전환시키는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Massey, Nature 328: 457-458 (1987)] 참조). 길항제-아브자임 접합체는 아브자임을 종양 세포 집단으로 전달하는 것에 대해 본원에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.

본 발명의 효소는 당업계에 널리 공지된 기술에 의해, 예컨대 상기 언급된 헤테로 2관능성 가교 시약을 사용하여 길항제에 공유결합될 수 있다. 별법으로, 적어도 본 발명의 효소의 기능적 활성 부분에 연결된, 적어도 본 발명의 길항제의 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은 당업계에 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Neuberger et al ., Nature , 312: 604-608 (1984)] 참조).

길항제의 다른 변형도 본원에서 고려된다. 예를 들어, 길항제는 다양한 비단백질성 중합체 중 하나, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체에 연결될 수 있다. 하나 이상의 PEG 분자에 연결된 항체 단편 (예컨대, Fab')가 본 발명의 특히 바람직한 실시양태이다.

본원에 개시된 길항제는 또한 리포좀으로 제제화될 수 있다. 길항제를 함유하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법으로 제조할 수 있는데, 예컨대 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)]; 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호; 및 1997년 10월 23일자로 공개된 WO97/38731에 기술되어 있다. 강화된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포좀은, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법 (reverse phase evaporation method)으로 생성될 수 있다. 바람직한 직경을 갖는 리포좀을 수득하기 위해, 리포좀을 정해진 공극 크기의 여과기를 통해 분출시킨다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 문헌 [Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)]에 기술된 바와 같이 디설파이드 교환반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 화학요법제는 임의로 리포좀 내에 함유될 수 있다 (문헌 [Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)] 참조).

본원에 기술된 단백질 또는 펩티드 길항제의 아미노산 서열 변형이 고려된다. 예를 들어, 길항제의 결합 친화도 및(또는) 다른 생물학적 특성을 향상시키는 것은 바람직할 수 있다. 길항제의 아미노산 서열 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 길항제 핵산에 도입시키거나, 또는 펩티드 합성으로 제조될 수 있다. 그러한 변형으로는, 예를 들어 길항제의 아미노산 서열 내의 잔기를 결실 및(또는) 삽입 및(또는) 치환시키는 것이 있다. 결실, 삽입 및 치환을 임의로 조합하여 최종 구조물에 도달하며, 단 최종 구조물이 원하는 특성을 가져야만 한다. 아미노산 변화는 예컨대, 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같이 길항제의 번역 후 과정을 또한 변화시킬 수 있다.

돌연변이유발을 위해 바람직한 위치인 길항제의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발 (alanine scanning mutagenesis)"이라 불리며, 이는 문헌 [Cunningham and Wells Science, 244: 1081-1085(1989)]에 기술되어 있다. 여기서, 소정의 잔기 또는 일군의 표적 잔기를 확인하고 (예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu과 같이 하전된 잔기), 이를 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 미친다. 이어서, 치환에 기능적으로 민감하다고 증명된 아미노산 위치를, 치환 부위에 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로서 개량시킨다. 이와 같이, 아미노산 서열 변이를 도입시키는 부위는 미리 결정되는 반면, 돌연변이 그 자체의 성질은 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하여, 발현된 길항제 변이체를 원하는 활성에 대해 스크리닝한다.

아미노산 서열 삽입으로는 아미노- 및(또는) 카르복실-말단 융합 (길이 범위가 1개의 잔기에서부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지임), 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 있다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 길항제, 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 길항제가 있다. 길항제 분자의 다른 삽입 변이체로는 길항제의 N- 또는 C-말단에 효소, 또는 길항제의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드를 융합시키는 것이 있다.

또 다른 변이체 유형은 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 길항제 분자 내에 상이한 잔기로 대체된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 항체 길항제의 치환적 돌연변이유발에 가장 관심이 가는 부위로는 초가변 영역이 있지만, FR 변경 또한 고려된다. 보존성 치환은 "바람직한 치환"이라는 제목하에 표 1에 제시되어 있다. 그러한 치환이 생물학적 활성을 변화시키는 경우, "예시적 치환"으로 명명되거나, 아미노산 부류에 대해 하기에 추가로 설명된 더욱 실질적인 변화를 도입하여 생성물을 스크리닝할 수 있다.

길항제의 생물학적 특성에서의 실질적인 변형은 (a) 치환 구역에서 폴리펩티드 골격 구조, 예를 들어 쉬트 또는 나선형 입체구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는데 그 영향이 상당히 다른 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄의 특성에 기초하여 하기 군으로 나뉜다:

(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향성: trp, tyr, phe.

비-보존성 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.

길항제의 적합한 입체구조를 유지하는 것에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 또한 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 비정상적인 가교를 방지할 수 있다. 역으로, 시스테인 결합(들)을 길항제에 부가하여 안정성을 개선시킬 수 있다 (특히, 길항제가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).

특히 바람직한 유형의 치환 변이체는 모 항체의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 생성된 변이체(들)은, 이들을 생성하는 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 그러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 이용한 친화도 성숙이다. 간단하게, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6-7 부위)를 돌연변이화시켜 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성한다. 이에 따라 생성된 항체 변이체는 각 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물과의 융합체로서, 필라멘트성 파지 입자로부터 1:1 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 이들의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 확인하는 것이 유리할 수 있다. 그러한 접촉 잔기 및 근접 잔기는 본원에서 논의된 기술에 따른 치환에 대한 후보일 수 있다. 일단 그러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널 (panel)을 본원에 기술된 바와 같이 스크리닝하여, 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가의 개발을 위해 선택할 수 있다.

다른 유형의 길항제의 아미노산 변이체는 길항제의 본래 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 그러한 변경으로는 길항제에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실, 및(또는) 길항제에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가가 있다.

폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결이거나 O-연결이다. N-연결은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착시키는 것을 의미한다. 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)인 트리펩티드 서열은 탄수화물 잔기의 아스파라긴 측쇄로의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드에 이들 트리펩티드 서열 중 하나가 존재하면 잠재적 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결 글리코실화는 당류인 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나가 히드록시아미노산 (가장 흔한 것은 세린 또는 트레오닌이지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신도 사용될 수 있음)에 부착되는 것을 의미한다.

글리코실화 부위를 길항제에 부가하는 것은 하나 이상의 상기 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 수행된다 (N-연결 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변경은 또한, 본래 길항제의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가하거나 치환시킴으로써 수행될 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우).

항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 푸코오스 (fucose)가 부착되지 않은 성숙한 탄수화물 구조를 갖는 항체는 미국 특허출원 제US2003/0157108A1호 (Presta, L.)에 기술되어 있다. 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물에 양분하는 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)이 있는 항체는 WO03/011878 (Jean-Mairet et al.) 및 미국 특허 제6,602,684호 (Umana et al.)에 언급되어 있다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드에 하나 이상의 갈락토스 잔기가 있는 항체는 WO97/30087 (Patel et al.)에 보고되어 있다. 또한, 항체의 Fc 영역에 부착된 변경된 탄수화물이 있는 항체에 관해서는 WO98/58964 (Raju, S.) 및 WO99/22764 (Raju, S.)를 참조한다.

길항제의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조된다. 이러한 방법으로는 천연 공급원으로부터의 단리 (자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 초기에 제조된 변이체 또는 비-변이체 형태인 길항제의 카세트 (cassette) 돌연변이유발에 의한 제조가 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 길항제를 이펙터 기능에 대해 변형시키는 것 (예를 들어, 길항제의 항원-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및(또는) 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 강화시키도록)이 바람직할 수 있다. 이는 항체 길항제의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 시스테인 잔기(들)을 Fc 영역에 도입시킴으로써 이 영역에 쇄간 디설파이드 결합이 형성되게 할 수 있다. 이에 따라 생성된 동종이량체 항체는 내재화 용량이 개선되고(거나) 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)이 증가될 수 있다. 문헌 [Caron et al ., J. Exp Med . 176: 1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)]을 참조한다. 강화된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체 항체는 또한 문헌 [Wolff et al . Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기술된 헤테로 2관능성 가교제를 사용하여 제조될 수 있다. 별법으로, 항체는 2중의 Fc 영역을 가져서, 보체 용해 및 ADCC 능력을 강화할 수 있는 것으로 조작될 수 있다. 문헌 [Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)]. WO00/42072 (Presta, L.)는 항체가 Fc 영역에 아미노산 치환을 포함하는 경우, 인간 이펙터 세포의 존재 하에 개선된 ADCC 기능을 갖는 항체에 대해 기술하고 있다.

변경된 C1q 결합 및(또는) 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖는 항체는 WO99/51642, 미국 특허 제6,194,551B1호, 미국 특허 제6,242,195B1호, 미국 특허 제6,528,624B1호 및 미국 특허 제6,538,124호 (Idusogie et al.)에 기술되어 있다. 이 항체는 Fc 영역의 아미노산 위치 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 및(또는) 334 중 하나 이상에 아미노산 치환을 포함한다.

길항제의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 구조 (salvage) 수용체 결합 에피토프가 길항제 (특히, 항체 단편)에 혼입될 수 있는데, 이는 예를 들어, 미국 특허 제5,739,277호에 기술되어 있다. 본원에서 사용되는 용어 "구조 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자 (예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 혈청 반감기를 증가시키는, IgG 분자의 Fc 영역에 있는 에피토프를 의미한다. Fc 영역이 치환되고 혈청 반감기가 증가된 항체는 또한 WO00/42072 (Presta, L.)에 기술되어 있다.

3개 이상의 (바람직하게는 4개) 기능성 항원 결합 부위를 갖도록 조작된 항체 또한 고려된다 (미국 특허출원 제US2002/0004587A1호, Miller et al.).

V. 제약 제제

본 발명에 따라 사용되는 길항제의 치료 제제는 바람직한 순도의 길항제를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써, 저장을 위해 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 제조된다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 그 예로는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜 (catechol); 레소르시놀 (resorcinol); 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개의 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코오스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 (trehalose) 또는 소르비톨; 염-형성 대응-이온 (salt-forming counter-ion), 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및(또는) 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈™ (TWEEN™), 플루로닉스™ (PLURONICS™) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 있다.

대표적 항-CD20 항체 제제는 이 거명으로 본원에 분명히 포함되는 WO98/56418에 기술되어 있다. 이 공보는 2-8℃에서의 최소 저장 수명이 2년인, 40 mg/mL 리툭시맙, 25 mM 아세테이트, 150 mM 트레할로스, 0.9％ 벤질 알코올, 0.02％ 폴리소르베이트 20 (pH 5.0)을 포함하는 액체 다중투여량 제제에 대해 기술하고 있다. 관심있는 다른 항-CD20 제제는 9.0 mg/mL 염화나트륨, 7.35 mg/mL 시트르산나트륨 2수화물, 0.7 mg/mL 폴리소르베이트 80 및 멸균 주사용수 (pH 6.5) 중에 10 mg/mL 리툭시맙을 포함한다.

피하 투여용으로 적합한 동결건조 제제는 미국 특허 제6,267,958호 (Andya et al.)에 기술되어 있다. 그러한 동결건조 제제는 적합한 희석제를 사용하여 높은 단백질 농도로 재구성하고, 재구성된 제제는 본원에서 치료되어야 할 포유동물에게 피하 투여될 수 있다.

본원에서, 제제는 치료되는 특정 징후에 대해 필요에 따라 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 해로운 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 또한 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포독성제, 화학요법제, 사이토카인 또는 면역억제제 (예를 들어, T 세포 상에 작용하는 것, 예컨대 시클로스포린 또는 T 세포에 결합하는 항체, 예를 들어 LFA-1에 결합하는 것)를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 다른 보조제의 유효량은 제제에 존재하는 길항제의 양, 질환 또는 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 기술한 다른 인자에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원의 상기에 사용된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나, 또는 여태까지 사용된 투여량의 약 1 내지 99％로 사용된다.

활성 성분은 또한 예를 들어, 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)에 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼으로 포획될 수 있다. 그러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

지속적-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속적-방출 제제의 적합한 예로는 길항제를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투성 매트릭스가 있는데, 이때 매트릭스는 성형된 입자 (예를 들어, 필름) 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속적-방출 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 루프론 데포™ (LUPRON DEPOT™) (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능 마이크로스피어)와 같은 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 있다.

생체내 투여를 위해 사용되는 제제는 살균되어야 한다. 이는 살균된 여과막을 통해 여과시킴으로써 용이하게 달성된다.

VI. 길항제로 치료

다양한 자가면역 질환이 고려되고, 잠재적 징후의 포괄적 목록은 정의 분획에서 상기 제공되었지만, 바람직한 징후로는 류머티스성 관절염, 루푸스, 궤양성 대장염 또는 염증성 장질환, 또는 피부 증상 (예컨대, 건선 또는 천포창) 및 자가면역 질환의 피부 발현이 있다. 본원에서 치료되는 환자는 바람직하게는 B-세포 악성종양을 앓지 않는다.

CD20 항원에 결합하는 길항제를 포함하는 조성물은 우수한 의료 실무에 따른 방식으로 제제화되어 투약 및 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려되는 인자로는, 치료되는 특정 질환 또는 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별적 환자의 임상 조건, 질환 또는 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 실무자에게 공지된 다른 인자가 있다. 투여되는 길항제의 유효량은 그러한 고려사항에 따라 달라질 것이다.

일반적으로 제안되는 바로는, 1회 투여량 당 비경구적으로 투여되는 길항제의 유효량은 환자 신체 1 m² 당 약 20 mg 내지 약 10,000 mg의 범위 (1회 이상 투여)일 것이다. 온전한 항체에 대한 IV 투여 요법의 예로는 375 mg/m² (주당 4회); 1000 mg씩 2회 (예를 들어, 1일째 및 15일째); 또는 1 그램씩 3회가 있다.

그러나, 상기 언급한 바와 같이, 이들 제안된 길항제의 양은 주로 치료 재량에 맡긴다. 적당한 투여량 및 스케줄의 선택에서 중요한 인자는 상기 제시된 바와 같이 얻어진 결과이다. 예를 들어, 상대적으로 높은 투여량은 진행성 및 급성 질환의 치료를 위해 초기에 필요할 수 있다. 질환 또는 장애에 따라 가장 효능있는 결과를 얻기 위해, 길항제는 질환 또는 장애의 최초 징후, 진단, 출현 또는 발생과 가능한 근접하여 투여되거나, 또는 질환 또는 장애가 완화되는 동안 투여된다.

길항제는 비경구, 국소, 피하, 복막내, 폐내, 비강내 및(또는) 병변내 투여를 비롯한 임의의 적합한 수단으로 투여된다. 비경구 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내 또는 피하 투여가 있다. 경막내 투여 또한 고려된다. 또한, 길항제는 예를 들어, 길항제의 감소되는 투여량으로 펄스 주입 (pulse infusion)에 의해 적합하게 투여될 수 있다. 바람직하게는 정맥내 주사로 투여된다.

본원의 길항제와 함께 다른 화합물, 예컨대 세포독성제, 화학요법제, 면역억제제 및(또는) 사이토카인이 투여될 수 있다. 예를 들어, CD20 길항제는 글루코르티코이드/프레드니손/메틸프레드니손 (글루코코르티코이드), 정맥내 면역글로불린 (감마 글로불린), 텔레코발토테라피 (telecobalthotherapy), 혈장사혈 (plasmapheresis), 레보티록신 (levothyroxine), 시클로스포린 A, 소마타스타틴 유사체, 사이토카인 길항제, 항-대사산물, 면역억제제, 세포독성제 (예를 들어 클로람부실 (chlorambucil), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 아자티오프린 (azathioprine)), 안와 방사선치료, 안와 감압, 재활 수술, 방사성 요오드, 갑상선 절제술 등과 병용될 수 있다. 병용 투여로는 개별 제제 또는 단일 제약 제제를 사용한 공동투여, 및 소정 순서로의 연속적 투여가 있으며, 여기서 두 (또는 모든) 활성제가 동시에 이들의 생물학적 활성을 발휘하는 동안 소정의 간격이 있는 것이 바람직하다.

환자에게 단백질 길항제를 투여하는 것 이외에, 본 발명은 유전자 요법에 의한 길항제의 투여를 고려한다. 길항제를 코딩하는 핵산의 그러한 투여는 "유효량의 길항제 투여"라는 표현에 포함된다. 예를 들어, 세포내 항체를 생성하는 유전자 요법의 용도에 관한, 1996년 3월 14일자로 공개된 WO96/07321를 참조한다.

환자의 세포로 핵산 (임의로, 벡터에 함유됨)을 도입시키는 두 가지 주요한 접근법 (생체내 및 생체외)이 있다. 생체내 전달의 경우, 핵산은 환자에게 직접 주사되며, 일반적으로 길항제가 필요한 부위에 직접 주사한다. 생체외 치료의 경우, 환자의 세포를 꺼내어, 이들 단리된 세포로 핵산을 주입하고, 변형된 세포를 직접 또는, 예를 들어 환자에게 이식될 다공성 막에 캡슐화시켜 환자에게 투여한다 (예를 들어, 미국 특허 제4,892,538호 및 동 제5,283,187호 참조). 핵산을 생존 세포로 도입하는데 다양한 기술을 이용할 수 있다. 이 기술은 핵산이 시험관내에서 배양된 세포로 전달되는지, 또는 의도된 숙주의 세포로 생체내 전달되는지의 여부에 따라 달라진다. 시험관내에서 핵산을 포유동물 세포로 전달하는데 적합한 기술로는 리포좀의 사용, 전기 천공법, 미세주입 (microinjection), 세포융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 방법 등이 있다. 유전자의 생체외 전달을 위해 통상적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.

현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술로는 바이러스 벡터를 사용한 형질감염 (예컨대, 아데노바이러스, I형 단순 포진 바이러스 (Herpes simplex I virus), 또는 아데노-관련 바이러스) 및 지질-기재 시스템 (유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어, DOTMA, DOPE 및 DC-Cho1임)이 있다. 어떤 상황에서는, 표적 세포를 표적화하는 물질 (예컨대, 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등)과 함께 핵산 공급원을 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀을 사용하는 경우, 내포작용 (endocytosis)과 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질을, 예를 들어 특정 세포 유형에 주성이 있는 (tropic) 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내부화되는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 자리지정 (localization)을 표적화하고 세포내 반감기를 증진시키는 단백질을 표적화하고(거나) 이들의 흡수 촉진을 위해 사용할 수 있다. 수용체-매개 내포작용의 기술은 예를 들어, 문헌 [Wu et al ., J. Biol . Chem. 262:4429-4432 (1987)]; 및 [Wagner et al ., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)]에 기술되어 있다. 현재 공지된 유전자 제조 및 유전자 요법의 프로토콜에 대한 고찰은 문헌 [Anderson et al ., Science 256 : 808-813 (1992)]을 참조한다. 또한, WO93/25673 및 그에 인용된 문헌들도 참조한다.

VII. 제조 물품

본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 기술된 질환 또는 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기, 및 이 용기 상에 있거나 이 용기에 부착된 표지 또는 패키지 삽입물이 있다. 적합한 용기로는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 등이 있다. 용기는 다양한 물질 (예컨대, 유리 또는 플라스틱)로 형성될 수 있다. 용기는 선택된 질환 또는 상태의 치료에 효과적인 조성물을 보유하거나 함유하고, 살균 진입구 (예를 들어, 용기는 정맥주사 용액 백, 또는 피하주사용 바늘로 뚫을 수 있는 스탑퍼 (stopper)가 있는 바이알일 수 있음)를 가질 수 있다. 조성물에서 하나 이상의 활성제가 CD20에 결합하는 길항제이다. 표지 또는 패키지 삽입물은, 조성물이 자가면역 질환을 앓는 환자로부터 얻은 샘플에서 CD20이 검출되는 자가면역 질환의 치료에 사용될 것을 지시한다. 제조 물품은 제약상 허용되는 희석 완충제, 예컨대 정균성 (bacteriostatic) 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거 (Ringer) 용액 및 포도당 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조 물품은 다른 완충제, 희석제, 여과기, 바늘 및 시린지를 비롯하여 상업적 견지 및 사용자의 견지에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 추가적 상세한 설명은 하기 비-제한적인 실시예에 의해 예증된다. 본 명세서에 언급된 모든 인용문헌의 개시 내용은 그 거명으로써 명백히 본원에 포함된다.

실시예 1

류머티스성 관절염

환자의 동의하에 류머티스성 관절염 (RA) 환자에게서 활액 생검체 및(또는) 활액의 샘플을 얻었다. 널리 공지된 절차에 따라, 세포를 냉동시키거나 고정하고, 활액을 원심분리하였다. 샘플에 병원성 CD20-양성 B 세포의 존재 여부는 제조자의 지시에 따라 CD20 항체 (예컨대, CD20에 결합하는 L26 (Abcam Ltd.))를 사용하는 면역조직화학법 (IHC)으로 검사하였다. CD20-양성 B 세포가 검출된 경우, 환자를 리툭시맙 (제넨테크에서 판매함) 또는 인간화 2H7 (상기 참조)로, 375 mg/m²씩 주 4회, 1000 mg씩 2회 (1일째 및 15일째), 또는 1 그램씩 3회로부터 선택된 투여법을 이용하여 치료하였다.

또한, MTX (경구 (p.o.) 또는 비경구 투여로 10-25 mg/주)를 메틸프레드니솔론 100 mg (정맥내 주사, 30분)으로 이루어진 코르티코스테로이드 투여법과 함께 동시에 환자에게 투여한 후, CD20 항체 및 프레드니손 (2-7일째에는 60 mg 경구 투여, 8-14일째에는 30 mg 경구 투여, 16일째까지 기준선 투여량으로 복귀)을 주입할 수 있다. 또한, 단일 투여량 또는 분할된 1일 투여량으로 투여되는 폴레이트 (5 mg/주)를 환자에게 투여할 수 있다. 환자는 임의로, 치료 기간 전반에 걸쳐 임의 의 배경 코르티코스테로이드 (≤lO mg/d의 프레드니손 또는 등가물)를 지속적으로 투여받았다.

1차적 종점은 그룹간의 차이를 비교하는 코크란-만텔-핸첼 (Cochran-Mantel-Haenszel: CMH) 시험 (류머티스성 인자 및 영역에 대해 조정됨)을 이용하여 24주째에 ACR20 반응이 있는 환자의 비율일 수 있다.

잠재적인 2차적 종점으로는 하기와 같은 것들이 있다:

1. 24주째에 ACR50 및 70 반응이 있는 환자 비율. 이들은 1차적 종점에 대해 특정된 바와 같이 분석될 수 있다.

2. 스크리닝에서부터 24주째까지의 질환 활성 점수 (DAS) 변화. 이들은 기준선 DAS, 류머티스성 인자, 모델에 대한 치료를 기준으로 ANOVA 모델을 이용하여 조사될 수 있다.

3. 24주째에서의 카테고리별 DAS 반응자 (EULAR 반응). 이들은 류머티스성 인자에 대해 조정된 CMH 시험을 이용하여 조사될 수 있다.

4. 스크리닝에서부터의 ACR 코어 세트 (SJC, TJC, 환자 및 의사의 총체적 평가, HAQ, 통증, CRP, 및 ESR) 변화. 이들 파라미터에 대한 기술 통계학 (descriptive statistics)이 보고될 수 있다.

5. 스크리닝에서부터의 SF-36 변화. 8 도메인 점수, 및 정신 및 신체 성분 점수에 대해 기술 통계학이 보고될 수 있다. 또한, 정신 및 신체 성분 점수는 추가로 카테고리화되고 분석될 수 있다.

6. 변형된 샤프 방사선 총점수 (Sharp radiographic total score), 침식 점 수 및 관절공간 협소화 점수에서의 변화. 이들은 경우에 따라 연속 또는 카테고리별 방법론을 이용하여 분석될 수 있다.

조사 종점 및 분석법은 하기를 포함한다:

ACR (20/50/70 및 ACR n), 및 8, 12, 16, 20, 24주째 및 그 이상에 걸친 DAS 반응의 변화는, 경우에 따라 2원 또는 연속 반복 측정 모델을 이용하여 조사될 것이다. 침식성 진행이 없는 환자의 비율을 비롯한 조사 방사선 분석은 24주째 및 그 이상에서 조사될 수 있다.

추가로 조사 종점 (예를 들어, 완전한 임상 반응, 질환이 없는 기간)은 연장된 관찰 기간의 부분으로서 설명적으로 분석될 것이다.

스크린으로부터의 FACIT-F 피로 변화는 기술 통계학으로 분석될 것이다.

CD20-양성 B-세포를 갖는 환자에서 CD20 항체를 사용한 RA 치료법은 상기 언급한 임의의 하나 이상의 종점에 따라 이로운 임상 반응을 야기할 것이다.

실시예 2

루푸스

루푸스는 다수의 상이한 기관에서 특이적으로 발현되는 공통적인 만성 재발성 이질성 질환이다. 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)는 자가 면역성 및 자가항체의 생성에 특징이 있다. 현재 사용되는 요법 (프레드니손, 미코페놀레이트 모페틸 (Mycophenolate Mofetil), CNI, 시톡산)은 종종 효과적이지만, 실질적인 사망을 야기할 수 있고, 비특이적이다.

림프절 (예를 들어, 편도선) 또는 골수 생검체, 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 환자의 동의하에 루푸스 환자로부터 얻었다. 세포는 병리학자에게 널리 공지된 기술에 따라 냉동되거나 고정될 수 있다. 생검체 샘플 또는 PBMC에서 병원성 CD20-양성 B 세포의 존재 여부는 예를 들어, 실시예 1에 기술된 바와 같은 IHC 분석법을 이용하여 검출하였다. CD20-양성 B 세포가 검출된 경우, 환자를 리툭시맙 또는 인간화 2H7로, 375 mg/m²씩 주 4회, 1000 mg씩 2회 (1일째 및 15일째), 또는 1 그램씩 3회로부터 선택된 투여법을 이용하여 치료하였다. 항체는 임의로, 예컨대 1종 이상의 면역억제제, 메토트렉세이트, 프레드니손, 시톡산, 미코페놀레이트 모페틸 (CellCept), 시클로포스파미드, 아자티오프린, 히드록시클로로퀸, CNI, 항-CD4 항체, 항-CD5 항체, 항-CD40L 항체, 인간 재조합 DNase, TNF 억제제 (인플릭시맙 (Infliximab), 에타너셉트 (Etanercept)), LJP-394, 항-C5a 항체, 항-IL-10 항체, BlyS 억제제, CTLA-4Ig, LL2IgG, 림포스타트 (Lymphostat)-B, 플라케닐 (Plaquenil) 등의 추가의 약물(들)과 병용될 수 있다.

CD20-양성 B-세포를 갖는 루푸스 환자의 치료법은 임의의 하나 이상의 질환 활성 인덱스, 예를 들어 전신성 홍반성 루푸스 질환 활성 인덱스 (SLDAI), 영국제도 루푸스 평가 그룹 (BILAG)의 총체적 점수, 전신성 루푸스 활성 측정치 (SLAM) 등에서의 개선을 야기할 것이다 (문헌 [Strand et al . J. Rheumatol 26: 490-497 (1999)]).

실시예 3

궤양성 대장염 또는 염증성 장질환

미국에는 결장에서 점막 염증의 재발성 에피소드를 앓는 궤양성 대장염 (UC) 환자가 500,000명으로 추정된다. 임상 징후로는 직장 출혈, 빈번한 장 운동 및 전신성 징후, 예컨대 발열, 체중 감소 및 빈혈이 있다 (문헌 [Podolsky, D. NEJM 347: 417-429 (2002)]). 경증 UC를 앓는 환자의 징후로는 직장항문염, 직장 S상 결장염, 원위부 대장염, 간헐성 직장 출혈, 점액성 배변, 약한 설사, 복부 통증이 있다. 질환의 중증도가 중간 정도인 환자는 좌측 대장염, 빈번한 묽은 혈변 (10회/일), 사상균 (mold) 빈혈, 저급 발열 및 영양분 유지 복부 통증을 비롯한 징후를 경험할 수 있다. 중증 질환을 앓는 UC 환자에서 관찰되는 징후로는 범발성 대장염, 하루에 10회 초과의 배변, 중증 경련, 고열, 수혈이 필요한 출혈, 체중 감소, 독성 거대결장 및 천공 (치사율 50％ 연관)이 있다.

대부분의 의사는 UC의 관리에 단계적 치료 알고리즘을 이용한다. 제1 라인의 치료는 일반적으로 경구 및(또는) 국소적 5-ASA를 포함한다. 제2 라인의 치료는 경구 및(또는) 국소적 스테로이드를 포함하나, 최초 스테로이드 사용자의 50％가 1년 이내에 의존성 또는 재발성이 된다. 제3 라인의 치료는 면역억제제 (예를 들어, 아자티오프린, 6 머캅토퓨린, 시클로스포린)를 투여함으로써 달성된다. 최종적으로, 제4 라인의 치료는 수술 (전대장 절제술)이다.

림프양 응집체에 존재하는 B 세포는 활성 UC의 조직 절단면에서 나타났다 (문헌 [Onuma et al . Clin Exp . Immunol. 121: 466-471 (2000)]). 증가된 IgG, IgM 및 IgA, 및 증가된 플라즈마 세포도 UC 환자에서 나타났다 (문헌 [MacDermott et al. Gastroenterology 81: 844 (1981)]).

중등도 내지 중증인 궤양성 대장염 또는 염증성 장질환 (IBD)을 앓는 환자로부터의 샘플을 내시경 검사 (예를 들어, 결장경검사, 대장경검사 등)를 통해 얻었다. 샘플에서 병원성 CD20-양성 B 세포는 실시예 1에서 사용된 분석법으로 검출하였다. CD20-양성 B 세포가 검출된 경우, 환자를 리툭시맙 또는 인간화 2H7로, 375 mg/m²씩 주 4회, 1000 mg씩 2회 (1일째 및 15일째), 또는 1 그램씩 3회로부터 선택된 투여법을 이용하여 치료하였다. CD20 항체 이외에, 환자는 경구 및(또는) 국소적 5-ASA, 경구 및(또는) 국소적 스테로이드, 하나 이상의 면역억제제 (예를 들어, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 시클로스포린), MLN-02, 항생제, 메살라민 (mesalamine), 프레드니손, TNF-억제제 (예를 들어, 레미케이드 (Remicade), 인플릭시맙), 코르티손 크림, 히드로코르티손 관장제, 술파살라진, 알살라진, 발살라지드, 메틸프레드니솔론, 히드로코르티손, ACTH, 정맥주사용 코르티코스테로이드, 겔텍스 (GelTex), 비실리주맙 (Visilizumab), OPC-6535, CBP 1011, 탈리도미드, ISIS 2302, BXT-51072, 레피퍼민 (Repifermin) (KGF-2), RPD-58, 안테그렌 (Antegren), FK-506, 레비프 (Rebif), 나탈리주맙 (Natalizumab) 등으로 추가로 치료될 수 있다.

상기 CD20-양성 B-세포를 갖는 환자의 치료법은 대상 기능성 평가, 배변 횟수, 직장 출혈 및(또는) 의사의 총체적 평가, 및 바람직하게는 대조군과 비교하여 중등도 내지 중증 UC 환자에서의 완화에 의해 측정시, 궤양성 대장염 또는 IBD의 징후를 개선시킬 것이다.

실시예 4

자가면역 질환의 피부 상태 또는 피부 발현

펀치 생검체 샘플, PBMC, 또는 림프절 샘플을 건선 또는 천포창과 같은 피부 상태의 환자, 및(또는) 자가면역 질환의 피부 발현 (예를 들어, 류머티스성 관절염, 루푸스 또는 혈관염)을 보이는 환자로부터 얻었다. 실시예 1의 IHC 분석법을 이용하여 샘플에서 CD20-양성 B 세포를 검출하였다. CD20-양성 B 세포가 검출된 경우, 환자를 리툭시맙 또는 인간화 2H7로, 375 mg/m²씩 주 4회, 1000 mg씩 2회 (1일째 및 15일째), 또는 1 그램씩 3회로부터 선택된 투여법을 이용하여 치료하였다. CD20 항체 요법은 임의로, 당해 상태를 치료하는데 사용되는 1종 이상의 다른 약물, 예컨대 CD11a 항체 (랍티바™ (Raptiva™)), 면역억제제 등과 병용된다. CD20-양성 B 세포를 갖는 환자의 치료는 치료되는 상태의 징후를 개선할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. BRUNETTA, PAUL G. <120> DETECTION OF CD20 IN THERAPY OF AUTOIMMUNE DISEASES <130> P2061R1 PCT <140> PCT/US2004/040949 <141> 2004-12-07 <150> US 60/531,363 <151> 2003-12-19 <160> 4 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized. <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30 Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 80 85 90 Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 95 100 105 Lys Arg <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized. <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 50 55 60 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser 95 100 105 Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120 Ser Ser <210> 3 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized. <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30 Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 80 85 90 Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 95 100 105 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 110 115 120 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 125 130 135 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 140 145 150 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 155 160 165 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 170 175 180 Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 185 190 195 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 200 205 210 Gly Glu Cys <210> 4 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized. <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 50 55 60 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser 95 100 105 Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 125 130 135 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 140 145 150 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 155 160 165 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 170 175 180 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 185 190 195 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 200 205 210 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 215 220 225 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 320 325 330 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 335 340 345 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 350 355 360 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 365 370 375 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 380 385 390 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 395 400 405 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 410 415 420 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 425 430 435 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 440 445 450 Gly Lys

Claims (19)

1. (a) 환자로부터 얻은 샘플에서 CD20을 검출하는 단계; 및

   (b) CD20이 샘플에서 검출된 경우, 환자에게 자가면역 질환을 치료하기 위한 유효량의 CD20 길항제를 투여하는 단계

   를 포함하는, 환자에서 자가면역 질환을 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 길항제가 항체를 포함하는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 항체가 세포독성제와 접합되어 있지 않은 것인 방법.
4. 제2항에 있어서, 항체가 리툭시맙 (rituximab)을 포함하는 것인 방법.
5. 제2항에 있어서, 항체가 인간화 2H7을 포함하는 것인 방법.
6. 제2항에 있어서, 항체가 세포독성제와 접합되어 있는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 환자가 류마티스성 관절염을 앓는 환자인 방법.
8. 제7항에 있어서, 샘플이 활막 생검체 (synovial biopsy) 또는 활액으로부터 얻어진 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 환자가 루푸스를 앓는 환자인 방법.
10. 제9항에 있어서, 샘플이 림프절 생검체, 골수 생검체 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 얻어진 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 환자가 궤양성 대장염 또는 염증성 장질환 (IBD)을 앓는 환자인 방법.
12. 제11항에 있어서, 샘플이 내시경 검사 샘플인 방법.
13. 제1항에 있어서, 환자가 피부 질환 또는 자가면역 질환의 피부 발현을 앓는 환자인 방법.
14. 제13항에 있어서, 질환이 건선, 천포창, 류머티스성 관절염, 루푸스 및 혈관염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
15. 제13항에 있어서, 샘플이 펀치 생검체 (punch biopsy) 샘플, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 림프절 샘플인 방법.
16. 제1항에 있어서, 길항제를 포유동물에게 투여하는 것으로 본질적으로 구성되는 방법.
17. 제1항에 있어서, CD20 단백질이 단계 (a)에서 검출되는 방법.
18. 제1항에 있어서, CD20 핵산이 단계 (a)에서 검출되는 방법.
19. (a) 환자로부터 얻은 샘플에서 CD20-양성 B 세포를 검출하는 단계; 및

    (b) CD20-양성 B 세포가 샘플에서 검출된 경우, 환자에게 자가면역 질환을 치료하기 위한 유효량의 CD20 항체를 투여하는 단계

    를 포함하는, 환자에서 자가면역 질환을 치료하는 방법.