KR20060108892A - 마이크로 어레이 기술을 이용한 시스플라틴에 내성을보이는 두경부암에 대한 항암증강제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이크로 어레이 기술을 이용하여 항암제인 시스플라틴에 내성을 보이는 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시킬 수 있는 항암증강제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항암증강제는 시스플라틴에 저항성을 갖게된 두경부암 세포의 성장을 억제하는 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 증강제를 시스플라틴에 내성을 갖는 두경부암 세포에 시스플라틴과 함께 복합 투여할 경우, 두경부암의 치료 효과를 증대시킬 수 있다.

시스플라틴, 두경부암, Butyrate Response Factor 1 (BRF1)

Description

마이크로 어레이 기술을 이용한 시스플라틴에 내성을 보이는 두경부암에 대한 항암증강제{Agents for increasing anti-cancer activity against cisplatin-resistant head and neck cancer using microarray}

도 1은 인간 두경부암세포 (HN)의 cisplatin에 의한 세포 생존률 (persent control)을 나타내는 결과이다.

도 2는 cisplatin 민감성 인간 두경부암세포(HN4)와 저항성 인간 두경부암세포(HN7)의 cisplatin유도 apoptosis를 보여주는 결과이다.

도 3은 cisplatin에 저항성을 나타내는 인간 두경부암세포에서 butyrate responsive factor 1 (BRF1)가 발현하지 않는다는 것을 보여주는 사진이다.

도 4는 BRF1 발현이 인간 두경부암세포의 cisplatin 민감성에 미치는 영향을 나타내는 결과이다.

도 5는 BRF1 발현이 인간 두경부암세포에서 caspase-3의 활성에 미치는 영향을 나타내는 결과이다.

도 6은 BRF1의 발현이 anti-apoptosis protein등에 미치는 영향을 나타내는 결과이다.

본 발명은 항암증강제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항암제인 시스플라틴에 내성을 보이는 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시킬 수 있는 항암증강제에 관한 것이다.

두경부암(Head and neck cancer)은 비강, 인두, 후두, 침샘, 갑상선 등의 조직에서 발생하는 암으로써, 세계적으로 발생빈도가 전 악성종양의 약 5％ 정도를 차지하고 있다. 세계적으로 두경부암의 발생빈도는 점차로 증가하고 있으며, 이러한 두경부암의 치료를 위해서 현재 임상에서 사용되고 있는 항암제 중 가장 강력한 항암제인 시스플라틴(시스플라틴)이 사용되고 있다.

시스플라틴은 두경부암 뿐만 아니라, 폐암, 유방암, 방광암, 위암, 자궁경부암, 골수종 등과 같은 다양한 종류의 암을 치료하는데 매우 효과적이라고 알려져 있다. 시스플라틴은 백금(platinum)을 함유한 중금속 화합물로서 백금 원자를 중심으로 2개의 염소 원자와 2개의 암모니아 분자가 cis-형으로 결합되어 있으며, DNA 가닥상의 인접한 2개의 구아닌(guanine)과 결합하여 인터스트랜드 크로스링크(interstrand crosslink)를 형성하여 DNA 합성을 억제한다. 즉, 암세포의 핵 내에 존재하는 DNA 이중나선 구조에 부착되어 DNA복제를 저해하여 암세포 성장 및 증식을 억제하고 암세포를 제거하여 항암효과를 나타낸다고 알려져 있다.

그러나, 시스플라틴이 다양한 종류의 암에 대하여 매우 효과적인 항암제이긴 하지만 최근 연구에 의하면 그 내성으로 인해 임상적인 문제가 증가하고 있다. 시스플라틴에 내성을 갖는 이유에 대해서는 여러 가지 가설이 있으나, 시스플라틴 유 입(시스플라틴 uptake)의 감소나 유출의 증가로 인해서 발생되거나(Andrew et al., Cancer Res., 2:35-43, 1990), 다양한 유전자들이 관여한다는 설이 일반적이다. 특히, MDR(multiple drug resistance)과 MRP(multidrug resistance associated protein)의 두 종류 단백질이 시스플라틴에 대한 내성에 관여하는 것으로 알려져 왔다(Taniguchi et al., Cancer Res., 56:4124-4129, 1996). 즉, 시스플라틴에 내성을 갖는 종양 세포에서는 MRP2 단백질의 발현이 증가하며, MRP2가 글루타티오닌-컨쥬게이티드 시스플라틴(glutathione-conjugated 시스플라틴)을 세포 밖으로 방출함으로써 세포의 시스플라틴에 대한 내성을 증가시키는 것으로 알려졌다. 그러나, MRP2를 발현하지 않는 암세포에서도 시스플라틴에 대한 내성이 있음이 보고되어 MRP2 이외의 다른 단백질도 시스플라틴 내성에 기여할 수 있음이 확인되었다(Chen et al., Exp. Cell Res., 240:312-320, 1998). 또한, c-ras, c-fos, c-abl, p53 및 p73 등의 유전자가 시스플라틴에 대한 내성과 관련이 있음이 보고된 바 있다.

따라서, 최근에는 시스플라틴에 대한 내성을 유도하는 암세포의 단백질 및 유전자를 이용하여 시스플라틴에 내성을 갖게된 암을 치료하려는 연구가 다양하게 진행되고 있다.

그러나, 아직까지 시스플라틴에 내성을 보이는 두경부암에서 어떠한 유전자 또는 단백질이 시스플라틴 내성을 유도하는 지에 대한 연구 및 시스플라틴에 내성을 갖는 두경부암을 효과적으로 치료하는 방법에 대해서는 연구가 미흡한 편이다.

따라서, 본 발명에서는 두경부암에서 유래한 암세포주들 중 시스플라틴에 저항성을 보이는 세포와 시스플라틴에 민감함을 보이는 세포를 대상으로 시스플라틴 처리후의 유전자 발현 차이를 확인함으로써 시스플라틴 내성과 민감성에 관련된 유전자를 밝혀내고자 하였다. 본 발명에서는 시스플라틴 내성 및 민감성에 관여하는유전자를 선별하기 위해 cDNA 마이크로어레이를 수행하였다. 또한, 이러한 유전자들을 이용하여 시스플라틴에 내성을 갖게된 두경부암을 효과적으로 치료할 수 있는 방법을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 시스플라틴에 내성을 보이는 두경부암의 치료를 증대시킬 수 있는 항암증강제를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시스플라틴에 민감성을 갖는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자를 밝히고, 이 유전자의 발현을 증대시키는 발현 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시키는 항암증강제를 제공한다.

또한, 본 발명은 시스플라틴에 민감성을 갖는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 활성을 증가하는 증강제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시키는 항암증강제를 제공한다.

또한, 본 발명은 시스플라틴에 민감한 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자가 삽입된 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시키는 항암증강제를 제공한다.

또한, 본 발명은 시스플라틴에 내성 및 민감성을 가지는 두경부암 환자를 신속히 확인 할 수 있는 분석 시스템을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 시스플라틴에 민감성을 갖는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자와 이의 발현을 유도하는 항암증강제를 제공하는 것을 특징으로 한다.

상기에서 시스플라틴에 민감성을 갖는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자는 제한되지 않고 사용될 수 있으나, BRF1 (Genbank accession ＃: X79067, Dual-specificity protein phosphatase 7 (Genbank accession ＃: X93921), alpha-trehalase (Genbank accession ＃: AB000824), hisitidine decarboxylase (Genbank accession ＃: X54297), SSTR4 (Genbank accession ＃: D16826), DAP-kinase related protein 1 (Genbank accession ＃: AF052941), NSEP (Genbank accession ＃: M83234), DLK (Genbank accession ＃: U15979), BMP4 (Genbank accession ＃: M22490), BMP5 (Genbank accession ＃: M60314), Ikaros/LyF-1 homolog hIk-1 (Genbank accession ＃: U40462), EGFR (Genbank accession ＃: X00588), defender against cell death 1 protein (Genbank accession ＃: D15057), APOE (Genbank accession ＃: M12529), REELIN (Genbank accession ＃: U79716), PAX7 (Genbank accession ＃: Z35141), CASR (Genbank accession 2: U20759), mitocondrial aldehyde dehydrogenase (Genbank accession ＃: Y00109), MPZ(Genbank accession ＃: Z31718) , Enigma protein (Genbank accession ＃: L35240)로 이루어진 군에서 선택되는 유전자인 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명에서는 BRF1(Genbank accession ＃: X79067) 의 유전자를 사용하였다.

또한, 본 발명에서는 시스플라틴에 민감성을 갖는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자가 삽입된 벡터를 포함하는 항암증강제를 제공하는 것을 특징으로 한다.

상기에서 벡터는 당업계에서 사용되는 유전자 치료용 벡터라면 제한되지 않고 사용될 수 있으나, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 허피스바이러스 벡터 및 동물 발현 벡터(mammalian expression vector)로 이루어진 군에서 선택되어 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서는 동물 발현 벡터인 pcDNA3.1/Myc-His A 벡터(Invitrogen)를 사용하였다.

상기에서 벡터에 삽입되는 유전자는 시스플라틴에 민감성을 갖는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자라면 제한되지 않고 사용될 수 있으나, 특히 BRF1(Genbank accession ＃: X79067) 의 유전자인 것이 바람직하다.

한편, 본 발명에서는 시스플라틴에 민감성을 갖는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 활성을 증가하는 증강제를 함유하는 항암증강제를 제공하는 것을 특징으로 한다. 상기 증강제는 활성제(activator) 또한 경쟁적 활성제(agonist)일 수 있다.

상기에서 증강제는 시스플라틴에 민감성을 갖는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자에 의해 암호화되는 단백질에 대한 활성제 또는 경쟁적 활성제라면 제한되지 않고 사용될 수 있으나, BRF1 (Genbank accession ＃: X79067, Dual-specificity protein phosphatase 7 (Genbank accession ＃: X93921), alpha- trehalase (Genbank accession ＃: AB000824) , hisitidine decarboxylase (Genbank accession ＃: X54297), SSTR4 (Genbank accession ＃: D16826), DAP-kinase related protein 1 (Genbank accession ＃: AF052941), NSEP (Genbank accession ＃: M83234), DLK (Genbank accession ＃: U15979), BMP4 (Genbank accession ＃: M22490), BMP5 (Genbank accession ＃: M60314), Ikaros/LyF-1 homolog hIk-1 (Genbank accession ＃: U40462), EGFR (Genbank accession ＃: X00588), defender against cell death 1 protein (Genbank accession ＃: D15057), APOE (Genbank accession ＃: M12529), REELIN (Genbank accession ＃: U79716) , PAX7 (Genbank accession ＃: Z35141), CASR (Genbank accession ＃: U20759), mitocondrial aldehyde dehydrogenase (Genbank accession ＃: Y00109), MPZ (Genbank accession ＃: Z31718) , Enigma protein (Genbank accession ＃: L35240)로 이루어진 군에서 선택되는 유전자로부터 발현되는 단백질에 대한 활성제 또는 경쟁적 활성제인 것이 바람직하다.

상기와 같은 항암증강제는 항암제와 복합 투여시 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시킬 수 있으며, 본 발명에서는 상기 항암증강제와 시스플라틴을 포함하는 두경부암 치료제를 제공한다.

본 발명에 따른 항암증강제는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함함으로써 각종 제형의 형태로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료를 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및 안정화제를 혼합하여 사용할 수 있으며 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제를 사용할 수 있다.

본 발명의 항암증강제의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트포키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼(wafer)등의 형태로 제조할 수 있으며 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 항암증강제는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러경로를 통하여 투여될 수 있다. 사람의 경우 통상적인 1일 투여량은 체중 1kg당 1 내지 1,000㎎, 바람직하게는 10 내지 100㎎의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서 두경부암 환자들의 시스플레틴 내성 및 민감성 확인을 신속하게 수행하기 위하여 관련 유전자로부터 만들어진 단백질에 대한 항체 또는 해당 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 이용할수 있다. 이러한 관점으로서, 본 발명은 두경부암 세포에서의 시스플레틴 내성 및 민감성 유전자에 의해 만들어지는 단백질에 대한 항체 또는 해당 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하여, 유전자 및 단백질의 발현 증가 여부를 진단하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 일반적으로 두경부암 세포에서 시스플레틴 내성 및 만감성을 주는 유전자가 있다는 것을 발견하였다 (표1, 표2). 이와 관련하여, 두경부암 환자로 부터 채취된 체액(예, 혈청, 혈장, 뇨, 활액 또는 척수액 또는 특정 세포 또는 조직(예, 골수)에서, 시스플레틴 내성 및 민감성을 주는 유전자의 발현이나 단백질의 발현이 유의적으로 검출될 수 있는 것으로 믿어진다. 따라서, 본 발명은 (a) 사람의 세포, 조직 또는 체액에서 시스플레틴 내성 및 민감성 유전자 발현 수준을 검정하고, (b) 시스플레틴 내성 및 민감성 유전자 발현 수준을 표준 유전자 발현 수준과 비교함을 포함하여 시스플레틴 내성을 모니터링하는 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 특정 양태는 시스플레틴 내성 및 민감성 단백질에 대한 항체 또는 이 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 시스플레틴 내성을 탐지하기 위한 방법 및 진단 키트를 제공한다. 이 방법은 (a) 생물학적 샘플을 단백질에 대한 항체와 접촉시키고 (b) 단백질에 대한 항체와 샘플중의 단백질이 융합된 결합체의 존재를 샘플중에서 탐지함으로써 생물학적 샘플중의 병원체 감염을 검출함을 포함한다. 다른 양태로서, 본 발명의 방법은 (a) 생물학적 샘플을 단백질 을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 반응시키고 (b) 생물학적 샘플중에서 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 반응하는 시스플레틴 내성 및 민감성 발현 유전자 또는 이의 단편을 검출함을 포함한다. 적합한 생물학적 샘플로서는 혈청, 혈장, 뇨, 활액 또는 척수액 또는 특정 세포 또는 조직(예, 골수)가 포함된다. 한 가지 양태로서, 진단 키트는 본 발명의 시스플레틴 내성 및 민감성 폴리펩타이드에 대한 항체 또는 시스플레틴 내성 및 민감성 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 혼합물을 검출 시약과 배합하여 포함한다.

또한, 본 발명의 특정 양태는 (a) 환자로부터 생물학적 샘플을 채취하고, (b) 샘플을 두 개 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (올리고뉴클레오타이드 프라이머중 적어도 하나는 시스플레틴 내성 및 민감성 유전자)와 중합효소 연쇄 반응으로 접촉시키며, (c) 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 존재하에 증폭하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 샘플중에서 검출함을 포함하는 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명의 특정 양태는 (a) 환자로부터 생물학적 샘플을 채취하고, (b) 본 발명의 시스플레틴 내성 및 민감성을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 탐침과 샘플을 접촉시키며, (c) 올리고뉴클레오타이드 탐침과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 샘플중에서 검출함을 포함하여 환자에게서 시스플레틴 내성 및 민감성을 측정하는 방법을 제공한다. 한 가지 양태로서, 올리고뉴클레오타이드 탐침은 시스플레틴 내성및 민감성을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이와 하이브리드화하는 서열중 약 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.

본 발명의 시스플레틴 내성 및 민감성 유전자, 특히 표1, 표2에 표시되는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적인 프로브 또는 프라이머는 6개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 24개 이상의 뉴클레오타이드를 갖는다. 본 발명의 프로브 또는 프라이머는 표준 혼성화법을 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

시스플레틴 내성 및 민감성 단백질을 코딩하는 cDNA는 PCR 프라이머를 디자인하거나 핵산 서열을 증폭시키는데 사용될 수 있다. PCR법은 당업자의 숙련가에 의해 통상적으로 수행되고, 진단학에서 그의 용도는 공지 및 허용되어 있다. PCS법의 수행 방법은 문헌 ['PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications', lunis, M.A., et al. Eds. Academic Press, Inc. 캘리포니아주 샌디에고 소재(1990)]에 개시되어 있다. PCR법의 응용은 문헌 ['Polymerase Chain Reaction', Erlich, H.A., et al., Eds. Cold Spring Harbor Press, 뉴욕주 콜드 스프링 하버 소재 (1989)]에 개시되어 있다. 일부 간단한 규칙으로 효율적인 프라이머를 디자인한다. 통상의 프라이머는 50％ 내지 60％ G+C조성을 갖는 18개 내지 28개의 뉴클레오티드이다. 전체 프라이머는 바람직하게는 혼성화될 서열과 상보적인 것이 바람직하다. 바람직하게, 프라이머는 100 bp 내지 2000 bP의 PCR 생성물을 생성한다. 그러나, 50 bp 내지 10 kb 이상의 PCR 생성물을 생성할 수도 있다.

PCR법은 핵산 분자에 존재하는 서열을 혼성화하는 5' 및 3' 프라이머를 제공함으로써, 뉴클레오타이드서열의 다중 카피수를 신속히 생성하는 것을 가능하게 하고, 상보적인 DNA 가닥을 생성하기 위하여 유리된 뉴클레오타이드를 지닌 프라이머간에 뉴클레오티드 서열에 대한 상보성인 염기 중에 충전되는 유리 뉴클레오타이드 및 효소를 추가로 제공한다. 효소는 프라이머에 인접한 상보성 서열 중에 삽입된다. 5' 프라이머 및 3' 프라이머 모두가 핵산의 동일한 단편의 상보성 가닥 상에서 뉴클레오타이드 서열에 대해 혼성화되는 경우에, 특정 이중 가닥 생성물의 지수적 증폭이 일어난다. 단일 프라이머만이 핵산 분자에 혼성화되는 경우, 선형 증폭은 가변적 길이의 단일 가닥 생성물을 생성한다.

본 발명은 시스플레틴 내성 및 민감성 단백질의 작용을 증가시키는 촉진제와 그 작용을 억제 내지 감소시키는 억제제를 제공한다.

억제제에는 시스플레틴 내성 단백질의 활성을 억제 내지 저해하는 물질과 그 발현을 억제 내지 저해하는 물질이 모두 포함된다. 한 태양으로서 본 발명의 억제제로는 본 발명의 스트레스 단백질과 결합하고 그럼으로써 그의 활성을 억제하거나 소멸시키는 작은 유기 분자, 펩타이드, 플리펩타이드 및 항체가 포함된다.

본 발명의 시스플레틴 내성 단백질의 발현 억제제에는 시스플레틴 내성 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 물질이 포함된다.

본 발명은 시스플레틴 내성 및 민감성 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고 이를 발현하는 세포를 임의 화합물과 접촉시키고, 상기 시스플레틴 내성 및 민감성 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 감소 및 증가시키는 화합물을 선별하는 것을 포함하여, 상기 시스플레틴 내성 및 민감성 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제 또는 증가하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 유전자 발현의 과다를 측정하는 방법은 공지되어 있다. 상기에서 의미하는 "유전자 발현" 이란 시스플레틴 내성 및 민감성 단백질을 코드하는 유전자가 mRNA로 전사되거나 그 전사물로부터 단백질이 생성되는 것을 말한다. 따라서, 유전자 발현의 과다는 시스플레틴 내성 및 민감성 단백질의 양을 측정하거나, 시스플레틴 내성 및 민감성 단백질 유전자 전사물의 양을 측정하므로서 수행될 수 있다. 시스플레틴 내성 및 민감성 단백질의 양을 측정하는 방법의 예로는 시스플레틴 내성 및 민감성 단백질에 특이적인 항체를 사용하는 면역검증법이 있다. 면역검증법으로는 RIA, ELISA, 도트 볼롯, 웨스턴 블롯, 샌드위치 검증법 등이 사용될 수 있다. 시스플레틴 내성 및 민감성 유 전자 전사물의 양을 측정하는 방법의 예로는 노던 블롯을 들 수 있다. 본 발명 시스플레틴 내성 및 민감성 유전자의 발현을 측정하기 위하여 리포터 유전자 시스템을 사용할 수 있다. 대표적인 리포터 유전자의 예로는 형광 단백질, 루시퍼라제 및 베타 글루코로니다제를 코딩하는 유전자가 있다.

또한 본 발명은 시스플레틴 내성 및 민감성 단백질을 임의 화합물과 접촉시키고, 상기 스트레스 단백질의 활성을 저해 또는 증가하는 화합물을 선별하는 것을 포함하여, 상기 시스플레틴 내성 및 민감성 단백질의 활성을 억제 또는 증가하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 시스플레틴 내성 및 민감성 단백질의 활성을 측정하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 시스플레틴 내성 및 민감성 단백질의 활성을 저해하는 화합물 또는 활성을 증가하는 화합물의 스크리닝을 효율적으로 수행하기 위하여 이미 존재하거나, 혹은 천연물에서 추출한 화합물, 또는 이들의 유도체를 대상으로 대량약효 검색 (High Throughtput Screening, HTS)을 수행하여 본 발명의 억제제를 초고속으로 스크리닝할 수 있는 방법이 공지되어 있다(Devlin, J.P Eds. High Throughput Screening; Marcel Dekker; New Your, 1997). 당업자는 또한, 단기간에 본 발명 단백질의 억제제를 대량으로 확보하기 위하여 공지된 조합화학기술 (combinatorial chemistry technology)을 사용할 수 있다. 본 발명의 억제제는 또한 상기 스트레스 단백질의 구조를 분석하고, 적합한 억제물질을 컴퓨터상의 사이버 공간에서 합성하며, 사이버 상에서 제시된 생체시스템을 이용하여 약효를 검색한후 활성 예상물질을 도출하고 합성하는 공지의 사이버 검색기술 (Virtual screenig technology)을 이용하여 디자인 할 수 있다.

본 발명의 스크리닝을 위하여 NSP 단백질, 항체 및 그들의 단편, DNA, RNA 및 그 단편들이 고체 지지체에 결합된 칩을 사용할 수 있다. 본 발명의 스크리닝을 위하여 바람직하게는 단백질 어레이 또는 핵산 어레이를 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

＜실시예 1＞

두경부암 세포에서 시스플라틴 민감성 관련 유전자의 탐색

1-1) 세포 배양

본 발명에서 사용된 두경부암 세포주들(head and neck cancer cell line)은 아산 의학 센터(Asan Medical Center)에서 분양 받아 사용하였다. 각 세포는 10％FBS(fetal bovine serum) , 스트렙토마이신-젠타마이신(streptomycin-gentamycin, 50㎎/ℓ and 80㎎/ℓ, GIBCO BRL, USA)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, GIBCO BRL, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5％ CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

1-2) 시스플라틴 처리 후 두경부암 세포의 생존률 분석

여러 가지 두경부암 세포주(HN-2, HN-3, HN-4, HN-7)를 대상으로 하여 시스플라틴을 농도별로 처리한 후, 세포 성장 억제율을 조사하였다.

각각의 세포들을 1×트립신/EDTA로 수확 후 96 웬 플레이트에 각 웰 마다 100㎕씩 세포(1 ×10⁵ 세포/웰)를 분주하였고, 37℃, 5％ CO₂의 조건 하에서 세포가 부착할 때까지 4시간동안 배양하였다. 상기 각 웰에 시스플라틴을 농도별로 처리한 후, 전체 부피가 200㎕가 되도록 DMEM 배지를 첨가하였고, 12시간 동안 배양하였다. 이후, MTT(3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, 5㎎/ml in PBS)용액을 처리하고 4시간 동안 37℃, 5％ CO₂의 조건 하에서 배양하였다. 400g(Clinical centrifuge, Jouan GR 4,11)에서 10분 동안 원심분리한 후, 실린지 니들(syringe needle)로 상층액을 제거하였다. 0.04N HCI-이소프로판올(HCI-isopropanol)을 100㎕씩 첨가하여 침전물을 녹인 후, 490nm에서 ELISA 리더기로 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 시스플라틴의 농도에 따라 4개의 세포주는 각기 다른 민감도를 나타냈다. 즉, 가장 저항성이 있는 HN-7 세포의 IC₅₀은 가장 민감한 HN-4 세포의 IC₅₀ 보다 약 10배나 높게 나타내었다.

1-3) 시스플라틴 처리 후 세포 고사 정도 확인

상기 실시예 1-2)에서 시스플라틴에 대해 감수성을 보이는 HN-4와 내성을 보이는 HN-7을 선택하여 시스플라틴을 40μM씩 처리한 후, 세포고사(아포토시스) 정도를 확인하기 위하여 DNA fragmentation 어세이를 수행하였다.

플레이트에 상기 두 세포주를 분주하고, 24시간 후 시스플라틴을 40μM씩 처리하였으며, 각각 12, 24, 36, 48시간 동안 배양시켰다. 시간대별로 약 3 ×10⁶ 개의 세포를 모은 후 PBS로 세척한 다음 70％ 에탄올로 고정시켰다. 세포를 원심분리하여 모은 후 50㎕의 포스페이트-시트레이트 완충용액(phosphate-citrate buffer, 86mM Na₂HPO₄, 6.7mM citric acid)에 현탁 시킨 다음 상온에서 30분간 반응시켰다. 페놀-클로로포름(Phenol-Chloroform, 1:1)으로 추출한 후, 2.5배의 에탄올을 사용하여 침전 시켰다. 침전물을 RNase가 100㎍/㎖의 농도로 들어있는 TE 완충용액에 녹인 후 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 2％ 아가로스 겔에 전기영동을 수행하여 DNA fragmentation을 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 도시된 바와 같이, HN-4 세포는 시스플라틴을 처리한 5시간 이후에 아포토시스가 시작되는 것이 관찰되었으며, 처리후 12시간 때까지 전체 세포의 62％ 이상이 죽는 현상을 보였다. 그렇지만 HN-7 세포에서는 시스플라틴 처리후 12시간 이 지나도 세포가 죽지 않음을 확인 할 수 있었다.

1-4) 유전자 발현 분석

HN-4 세포와 HN-7 세포에 시스플라틴을 처리했을 때의 유전자 발현 차이를 분석하기 위해서 cDNA 마이크로어레이(cDNA microarray)를 수행하였다.

HN-4와 HN-7 세포에 시스플라틴 40㎛을 처리한 후, 12 시간 동안 배양하였고, 각각 세포의 총 RNA를 추출하였다. RNA로부터 cDNA를 합성한 후, 이 DNA를 프로브로 이용하여 클론테크(Clontech)사의 Atlas cDNA expression arrays kit(CLONTECH, USA)를 프로토콜에 준하여 cDNA 마이크로어레이 실험을 수행하였다.

그 결과, 3,528개의 유전자중 43개의 유전자들이 HN4-array 및 HN7-array 사이에서 hybridization intensity의 총 차이가2배 이상이었다. 43개의 유전자 중에서 19개의 유전자가 real-time PCR 분석에서 2배 이상의 차이를 보였다. 즉, 하기 표 1에 제시된 유전자들은 시스플라틴에 민감성이 있는 HN-4 세포에서 발현이 증가되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 하기 표 2에 제시된 유전자들은 시스플라틴에 내성이 있는 HN-7 세포에서 발현이 증가되었음을 확인할 수 있었다.

[표 1]

[표 2]

1-5) RT-PCR

상기 실시예 1-5)에서 얻은 결과를 확인하기 위해서 각 세포의 cDNA를 주형으로 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. Guanidium thiocyanate-acid phenol-chloroform 방법(Chomczynski et al., 1987)을 사용하여 총 RNA를 추출하였고, 각 유전자에 대한 프라이머는 프로메가(Promega)에서 구입하여 사용하였다.

단일층(monolayer)으로 자란 HN-4와 HN-7 세포에 시스플라틴을 처리한 세포를 배양하였다. 12시간 후에 배지를 제거하고 PBS(Phosphate buffered saline)로 세척한 후 변성 용액(Denaturing solution, 4M guanidium thiocyanate, 0.5％ SDS, 25mM sodium citrate pH7.0, 0.1M 2-mercaptoehanol)을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 세포의 침전물에 소디움 아세테이트(sodium acetate, pH4.0)를 0.2M이 되도록 첨가한 후, 변성 용액과 동량의 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 (phenol-chloform-isoamyl alcohol, 25:24:1)을 첨가하였고, 원심분리 후 상층액을 취하였다. 99％ 에탄올로 RNA를 침전시킨 후 DEPC 용액(diethylpyrocarbonete treated water)으로 녹였다.

PCR(Polymerase Chain Reaction)을 위한 cDNA는 SUPER-SCRIPT TMⅡ RNase H-Reverse Transcriptase(Invitrogen, USA)를 사용하여 합성하였다. 키트를 이용한 cDNA 합성은 GIBCOBRL사의 프로토콜(Cat No.18064-014)에 준하여 수행하였다. 실험 과정은 다음과 같았다. 튜브에 총 RNA 2㎍, 올리고-(dT)₁₅ (500㎍/㎖) 1㎕ 그리고, 증류수 10㎕를 넣고 섞은 후, 70℃에서 10분간 변성(denaturation)시켰다. 여기에 4㎕의 5 × First Strand Buffer[250mM Tris-HCI(pH8.3 at room temperature), 375mM KCI, 15mM MgC12], 2㎕ 0.1M DTT 그리고, 1㎕ 10mM dNTP 혼합물을 첨가하여 잘 섞은 후 42℃에서 50분간 반응시켰다. 반응 후 70℃에서 15분간 열 불활성화(heat-inactivation)시켰다. 그리고 RNase H(2unit)를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. PCR은 95℃, 15분(1 사이클); 그리고 94℃, 30초; 50℃, 30초; 72℃, 30초(30사이클)의 조건으로 수행하였다.

상기 RT-PCR결과, 도 3에 도시된 바와 같이, cDNA 마이크로어레이에서 얻은 결과와 동일한 결과를 확인할 수 있었다. 즉, HN-4 및 HN-3와 같이 시스플라틴에 대해 민감한 세포주가 HN-2 및 HN-7과 같이 시스플라틴에 대해 저항성이 있는 세포주보다 상대적으로 높은 양의 BRF1 발현을 나타냈으며, 이것은 두경부암 세포주의 시스플라틴에 대한 민감도와 BRF1의 발현이 관련이 있다는 것을 보여준다.

＜실시예 2＞

(2-1)시스플라틴에 민감한 세포에서 발현이 증대되는 유전자를 이용한 암 세포 성장 억제 효과

상기 실시예 1-5) 및 1-6)에서 확인된 바와 같이, 시스플라틴에 민감한 두경부암 세포주에서 발현이 증대된 유전자인 BRF1을 이용하여 암 세포 성장 억제 효과를 측정하였다.

상기 유전자를 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 cDNA 라이브러리를 이용하여 실시예 1-5에서와 같은 방법으로 증폭하였다. 증폭된 유전자를 pcDNA3.1/Myc-His A 벡터에 삽입하였고, 시스플라틴에 내성을 갖는 두경부암 세포주인 HN-7을 대상으로 상기 유전자가 도입된 벡터를 시스플라틴과 함께 복합 투여하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 시스플라틴과 BRF1유전자를 함께 투여한 경우, 시스플라틴을 단독으로 투여하였을 때보다 아포토시스 (apoptosis)가 증가하였음을 확인할 수 있었다.

BRF1의 활성저해가 HN-4 세포에서의 시스플라틴에 대한 민감성에 영향을 주는지의 여부를 확인하기 위하여 BRF1에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다. 시스플라틴에 민감성을 갖는 두경부암 세포주에서 발현이 증대된 유전자인 BRF1의 cDNA 클론 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드(서열번호 3)를 제작하였다. 상기 뉴클레오티드 제작은 문헌(Stec et al., J. Am. Chem. Soc., 106:6077-6079, 1984)에 설명된 방법에 따라 포스포로아미다이트법(phosphoroamidite method)과 자동화된 합성기(모델 380-B, Applied Biosystems, Inc., 미국 캘리포니아주 포스터 시티)를 이용하여 수행되었다.

시스플라틴에 민감성을 갖는 두경부암 세포주인 HN-4을 대상으로 상기 제작된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 시스플라틴과 함께 동시에 복합 투여하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 시스플라틴을 단독으로 투여하였을 때보다 암세포의 고사가 현저히 감소되었음을 확인할 수 있었다.

즉, BRF1의 과대발현이 두경부암 세포주의 시스플라틴에 대한 민감성을 증진시킨다는 것을 확인 할수 있었다.

＜실시예 3＞

BRF1 발현이 caspase-3 activity 에 미치는 영향

시스플라틴에 민감한 HN4 및 시스플라틴에 저항성이 있는 HN7 세포 사이에는 caspase-3 activity에 있어서 확연한 차이가 있었다. 시스플라틴을 처리한 HN7에서는 caspase-3 activity가 거의 증가하지 않은 반면, HN4 세포에 시스플라틴을 처리하자 caspase-3 activity가 2.1배 증가하였다 (도 5).

시스플라틴에 민감한 HN4 세포에 caspase-3 inhibitor인 Ac-DEVD-CHO를 처리하면 시스플라틴에 의해 유도되는 아포토시스 (apoptosis)가 감소하였다. 이것을 HN4 세포에서의 시스플라틴에 의해 유도되는 아포토시스 (apoptosis) 에 있어서 caspase-3 activity가 필요하다는 사실을 말해준다.

BRF1의 발현이 caspase-3 activity와 관련이 있는지의 여부를 확인하기 위해, HN7/BRF1 세포 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 처리한 HN4 세포에 각각 시스플라틴을 처리한 후 caspase-3 activity를 분석하였다.

HN7/BRF1 세포의 caspase-3 activity가 HN-7 세포에 비해 1.6배까지 증가한 반면, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 처리한 HN-4 세포는 HN-4 세포에 비해서 53％까지 감소하였다 (도 5). 즉, BRF1의 발현으로 인해 caspase-3 activity가 증가함과 동시에 시스플라틴에 의해 유도되는 아포토시스 (apoptosis)가 증가하였음을 알 수 있다.

＜실시예 4＞

BRF1 발현이 cIAP2 에 미치는 영향

BRF1의 발현이 항 아포토시스 (anti-apoptotic) 유전자의 mRNA 분해를 조절하는지를 알아보기 위해, 두경부암 세포주 에서 Bcl-2, Bcl-xL, XIAP, cIAP1, cIAP2, NAIP, 및 Survivin과 같은 항 아포토시스 (anti-apoptotic)의 mRNA 양을 RT-PCR로 분석하였다.

또한 Bak, Bax, Bid, 및 Bik과 같이 Bcl-2 family 중 항 아포토시스(anti-apoptotic) 유전자로 알려진 또 다른 유전자에 대해서도 분석하였다. 시험했던 유 전자 중 cIAP2의 발현이 BRF1의 발현 level과 관련이 있는 것으로 나타났다(도 6). HN-4 세포에서의 cIAP2 발현 양이 HN-7 세포와 비교할 때, 20％ 까지 현저하게 감소하였다.

BRF1의 발현이 cIAP2의 발현양과 직접적으로 관련이 있는지를 알아보기 위해, HN7/BRFl 세포 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 처리한 HN-4 세포에서의 cIAP2 mRNA 양을 분석하였다. HN-7 및 HN7/pcDNA 세포 사이의 cIAP2 mRNA 양의 변화는 없었다. 그렇지만 HN7/BRF1의 cIAP2 mRNA 양은 HN7에 비해 44％까지 감소하였다.

또한 HN-4 세포에서안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 BRF1의 발현을 억제시키자 HN-7의cIAP2 mRNA 양은 HN7에 비해 90％까지 증가하였다 (도 6). 본 결과로 부터 BRF1의 발현이 cIAP2 mRNA 양을 감소시켰고, 그로 인해 caspase-3 activity 및 cisplatin에 의해 유도되는 아포토시스 (apoptosis)를 증가시켰음을 알 수 있다.

본 발명에 따른 항암증강제는 시스플라틴에 저항성을 갖게된 두경부암 세포의 성장을 억제하는 효과를 갖는다. 따라서, 시스플라틴에 내성을 보이는 두경부암에 시스플라틴과 함께 복합 투여할 경우 두경부암의 치료 효과를 증대시킬 수 있다.

<110> RNA Inc. <120> Agents for increasing anti-cancer activity against cisplatin-resistant head and neck cancer using Butyrate Response Factor 1 (BRF1)} <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> human <400> 1 ggattcatga ccaccaccct c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> human <400> 2 ctcgaggtca tctgagatgg a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 3 tggtggtcat cctgtgcgtt 20

Claims (16)

1. 시스플라틴에 민감한 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자가 삽입된 벡터를 함유하는 것을 특징으로 하는 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시키는 항암증강제.
2. 제 1항에 있어서, 상기 유전자는 BRF1 (Genbank accession ＃: X79067, Dual-specificity protein phosphatase 7 (Genbank accession ＃: X93921), alpha-trehalase (Genbank accession ＃: AB000824), hisitidine decarboxylase (Genbank accession ＃: X54297), SSTR4 (Genbank accession ＃: D16826), DAP-kinase related protein 1 (Genbank accession ＃: AF052941), NSEP (Genbank accession ＃: M83234), DLK (Genbank accession ＃: U15979), BMP4 (Genbank accession ＃: M22490), BMP5 (Genbank accession ＃: M60314), Ikaros/LyF-1 homolog hⅠk-1 (Genbank accession ＃: U40462), EGFR (Genbank accession ＃: X00588), defender against cell death 1 protein (Genbank accession ＃: D15057), APOE (Genbank accession ＃: M12529) , REELIN (Genbank accession ＃: U79716), PAX7 (Genbank accession ＃: Z35141), CASR (Genbank accession ＃: U20759), mitocondrial aldehyde dehydrogenase (Genbank accession ＃: Y00109), MPZ(Genbank accession ＃: Z31718), Enigma protein (Genbank accession ＃: L35240)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항암증강제.
3. 제 2항에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 허피스바이러스 벡터 및 동물 발현 벡터(mammalian expression vector)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항암증강제.
4. 시스플라틴에 민감성을 갖는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 발현 또는 활성을 증가하는 증강제를 포함하는 것을 특징으로 하는 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시키는 항암증강제.
5. 제 1항 내지 제 4항에 있어서, 시스플라틴에 민감성을 갖는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자가 BRF1인 것을 특징으로 하는 항암증강제.
6. 시스플라틴에 내성을 갖는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시키는 항암증강제.
7. 제 6항에 있어서 상기 유전자는 GSTPi (Genbank accession ＃: X08058), MLH1(Genbank accession ＃: U07418), HSP22 (Genbank accession ＃: X54079), Homo sapiens mRNA for beta 2-microglobulin (Genbank accession ＃: AB021288), RANBP1(Genbank accession ＃: D38076), TMSB4X (Genbank accession ＃: M17733), IL2RA(Genbank accession ＃: X01402), CFL1 (Genbank accession ＃: X95404) KSR1(Genbank accession ＃: U43586), cytochrome c oxidase polypeptide Vic (Genbank accession ＃: X13238), RPL9 (Genbank accession ＃:U09953), Ems1 oncogene(Genbank accession ＃: M98343), ATPase subunit G (Genbank accession ＃: AF092124), PTMA (Genbank accession ＃: M26708), CTSH (Genbank accession ＃:X07549), IL1B (Genbank accession ＃:K02770), GALBP (Genbank accession ＃:M35368), FRA1 (Genbank accession ＃:X16707), HSP90A (Genbank accession ＃:X07270), MGST1 (Genbank accession ＃:J03746), ITGB4 (Genbank accession ＃:X51841), ITGAL (Genbank accession ＃:X13227), H2A (Genbank accession ＃:Ll9779)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항암증강제.
8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 항암증강제와 시스플라틴을 포함하는 두경부암 치료제.
9. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 단백질의 발현차이를 진단하기 위한 조성물
10. (a) 생물학적 샘플을 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 반응시키고 (b) 생물학적 샘플중에서 상기 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화 반응하는 핵산분자를 검출함을 포함하여 생물학적 샘플에서 단백질의 발현 증가 및 감소를 진단하는 방법.
11. (a) 생물학적 샘플에서 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검정하고 (b) 검정된 상기 유전자의 발현 수준을 표준유전자 발현 수준과 비교함을 포함하여, 단백질의 발현 증감을 측정하여 진단하는 방법.
12. (a) 동물 세포에서 제1항 내지 제2항중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검정하고, (b) 피검 물질을 동일한 정상의 동물 세포에 처리한 다음 검정된 상기 유전자의 발현 수준을 검정하며, (c) (a)에서 검정된 유전자의 발현 수준을 (b)에서 검정된 유전자의 발현 수준과 비교하여 (a)에서 검정된 유전자의 발현 수준이 (b)에서 검정된 유전자의 발현 수준 보다 낮은 경우 피검 물질을 활성제로 결정함을 포함하여, 유전자의 발현에 대한 활성제를 스크리닝하는 방법.
13. (a) 동물 세포에서 제6항 내지 제7항중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검정하고, (b) 피검 물질을 동일한 정상의 동물 세포에 처리한 다음 검정된 상기 유전자의 발현 수준을 검정하며, (c) (a)에서 검정된 유전자의 발현 수준을 (b)에서 검정된 유전자의 발현 수준과 비교하여 (a)에서 검정된 유전자의 발현 수준이 (b)에서 검정된 유전자의 발현 수준 보다 높은 경우 피검 물질을 억제제로 결정함을 포함하여, 유전자의 발현에 대한 억제제를 스크리닝하는 방법.
14. 제1항 내지 제6항의 단백질 또는 그 활성 단편과 고체 지지체(solid support)를 포함하는 단백질 어레이.
15. 제1항 내지 제6항의 항체 또는 그 활성 단편과 고체 지지체를 포함하는 단백질 어레이.
16. 제1항 내지 제6항의 핵산분자와 고체 지지체 (solid support)를 포함하는 핵산 어레이.

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