KR20060101051A - 티로신 페놀리아제의 고속 스크리닝 방법 및 이에 의해스크리닝된 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 티로신 페놀리아제의 고속 스크리닝 방법 및 이에 의해 스크리닝된 변이체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 티로신을 미세 결정의 형태를 갖도록 제조하고 이를 미생물 배지에 첨가하여 불투명 평판 배지를 만든 후, 미생물 생장에 따라서 콜로니 주변에 형성되는 투명환의 크기를 관찰함으로써 티로신 페놀리아제 효소 활성을 가지는 미생물을 선발하는 방법 및 상기 방법에 의해 선발된 티로신 페놀리아제의 돌연변이체에 대한 것이다.

본 발명의 티로신 페놀리아제의 고속 스크리닝 방법을 이용하게 되면, 대량 라이브러리로부터 효소 활성을 고속으로 탐색할 수 있게 되어, 티로신 페놀리아제를 합성하는 미생물을 스크리닝할 수 있으며, 또한, 티로신 페놀리아제의 효소 변이체 라이브러리에서 활성이 개선된 변이 효소를 분리하는데 유용하게 이용될 수 있어, 티로신 페놀리아제의 방향성 분자진화(directed molecular evolution) 연구 및 효소 개량에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 티로신 페놀리아제 돌 연변이체는 기존의 티로신 페놀리아제에 비해 활성이 월등히 뛰어나므로, 산업적으로 유용하다.

티로신 페놀리아제, 방향성 분자진화, 고속탐색, 미세결정, 티로신

Description

티로신 페놀리아제의 고속 스크리닝 방법 및 이에 의해 스크리닝된 변이체{Method for Screening Tyrosin Phenol-lyase and Mutants Screened Thereby}

도 1은 티로신 페놀리아제(tyrosine phenol-lyase: 이하 TPL로 명명함)에 의한 티로신(L-Tyrosine) 및 엘-도파(L-DOPA)의 합성반응을 나타낸 화학식이다.

도 2는 불투명 평판 배지의 제조를 위하여 사용되는 니들 형태의 티로신(A)과 일반적인 컬럼 형태의 티로신 결정(B)을 비교한 현미경 사진이다.

도 3은 니들 형태(A) 및 컬럼 형태(B)의 티로신 결정에 TPL을 가한 후, 효소 작용에 의해 티로신 결정이 분해되는 과정을 관찰한 현미경 사진이다.

도 4는 TPL 유전자를 발현하는 대장균을 티로신 평판 배지에서 배양할 때 콜로니 주변으로 투명환이 형성되는 것을 나타낸 사진이다. (A)는 TPL 활성 균주의 스트리리크 주변에서 투명 부위가 형성된 것을 나타낸 것이고, (B)는 단일 콜로니 주변에 투명환이 형성된 것을 나타낸 것이다.

도 5는 방향성 분자진화의 수행을 위해서 씨트로박터 프룬디 유래의 TPL 유전자에 포함되어 있는 제한효소부위를 제거하는 과정을 나타낸 그림이다.

도 6은 플라스미드 벡터 pHCEIIB(바이오리더스, 한국)에 TPL을 코드하는 유전자를 도입하여 제조한 발현 플라스미드의 유전자 지도이다.

도 7은 Error-prone PCR기법에 의하여 TPL 유전자 변이 라이브러리를 제조하고, 고속 스크리닝을 통해 효소의 개량 과정을 나타낸 개략도이다.

도 8(A)는 미세 티로신 평판 배지로부터 투명환의 크기를 측정한 사진이고, 도 8(B)는 페놀 정량을 통해 측정한 TPL 활성과 투명환의 크기와의 연관을 분석한 그래프이다.

도 9는 미세 티로신 평판 배지에서 배양하면서 투명환을 관찰하여 활성이 개선된 변이효소를 분리하는 과정을 나타낸 사진이다.

도 10은 씨트로박터 프룬디 TPL과 본 발명의 방법에 의하여 활성이 개량된 TPL01, TPL02의 반응시간에 따른 티로신 변환율을 나타낸 그래프이다.

도 11a는 씨트로박터 프룬디 TPL, TPL01, TPL02 유전자를 구성하는 염기서열 및 아미노산 변이를 비교하여 나타낸 그림이고, 11b는 씨트로박터 프룬디 TPL, TPL01, TPL02의 전체 염기서열이고, 도 11c는 동일 유전자의 발현에 의하여 제조되는 단백질의 전체 아미노산 서열이다.

본 발명은 티로신 페놀리아제의 고속 스크리닝 방법 및 이에 의해 스크리닝된 변이체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 티로신을 미세 결정의 형태를 갖도록 제조하고 이를 미생물 배지에 첨가하여 불투명 평판 배지를 만든 후, 미생물 생장에 따라서 콜로니 주변에 형성되는 투명환의 크기를 관찰함으로써 티로신 페놀리아제 효소 활성을 가지는 미생물을 선발하는 방법 및 상기 방법에 의해 선발된 티로 신 페놀리아제의 돌연변이체에 대한 것이다.

TPL은 티로신을 페놀과 피루브산으로 가수분해하는 α,β-제거반응(α,β-elimination), 같은 기질로부터 페놀과 세린을 생성하는 β-교환반응(β-replacement) 등의 다양한 반응을 촉매하며(Enei et al., Agri. Biol. Chem. 36:1869, 1972), 특히 티로신(Tyrosine), 엘-도파(L-DOPA) 등 방향족 아미노산 및 유도체를 가역적으로 분해 또는 합성하는 기능을 하는 효소이다(Enei et al., Agr. Biol. Chem. 37: 493, 1973)(도 1). TPL은 특히 대표적인 파킨슨병 치료제인 엘-도파, 바세도우씨 병의 치료제인 티로신의 생물학적 합성을 위한 산업용 생물 촉매로 이용되며, 이는 티로신을 유도 물질로 첨가한 배지에서 배양한 씨트로박터 프룬디(Citrobacter freundii), 어위니아 허비콜라(Erwinia herbicola)등의 장내 미생물과 심비오박테리움 퇴비(Symbiobacterium toebii) 등의 고온성 미생물 배양액에서 흔히 발견된다.

최근 방향성 분자 진화(directed molecular evolution)를 탐구하는 학문이 발달하게 되면서, 상기한 바와 같이 산업용 생물 촉매로 유용한 TPL의 방향성 분자 진화를 탐구하는 연구는 중요하게 자리잡고 있다.

방향성 분자 진화란, 자연계에서 오랜 시간에 걸쳐 일어나는 진화 과정을 모방하여 연구실 공간에서 단시간에 그 진화 과정을 이루어 내는 것을 말한다. 방향성 분자 진화를 위해서는 먼저 효소변이체 라이브러리를 생성시키고, 고속 탐색을 통하여 성질이 향상된 효소변이체를 찾는 과정을 반복하여 물리적ㆍ생화학적 성질이 개선된 변이체를 선발하여야 한다.

효소변이체 라이브러리를 생성시키는 것은 목적 효소의 돌연변이를 유발시킴으로써 다양한 염기서열 변이체로 이루어진 집합군을 형성하는 것이며, 염기서열이 다른 다양한 성질의 효소군을 확보하기 위한 것이다. 효소의 방향성 분자진화는 열안정성, 유기용매에서의 안정성, 기질특이성과 기질에 대한 활성, 광학 이성질체에 대한 선택성 등 여러 가지 방향으로 진행될 수 있다. 이러한 라이브러리 생성 기술은 계속 발전되고 있으며 변이유발 PCR(error-prone PCR)(Cadwell and Joyce, Mutagenic PCR, Cold Spring Harbor Laboratory), 화학적 변이유발, UV의 조사, 돌연변이 유발 숙주세포의 이용 등과 같은 무작위적 변이(random mutagenesis)법과 DNA 셔플링(DNA shuffling)과 같이 재조합을 통한 변이를 유발한는 조합적 변이(combinatorial mutagenesis) 등 많은 방법이 있다(Kuchner and Arnold, Trends Biotech., 15:523, 1997). 또한 손쉽게 효소 라이브러리를 제조하기 위한 키트가 상업적으로도 제품화되어 있어 연구자들이 목적에 맞게 이용할 수 있다.

효소변이체 라이브러리를 통하여 유전자의 다양성을 획득한 다음에는 원하는 성질을 가지는 변이를 탐색하는 기술이 필요하다. 일반적으로 라이브러리의 탐색기술은 항생제에 대한 저항성, 영양요구균주의 상보성에 기인한 성장여부에 의한 탐색, 한천 배지상에서 투명환의 생성, 형광물질의 발현, 유색발현에 의한 고체상의 선별, 로봇틱 시스템으로 자동화가 가능하고 소량으로 활성차이를 민감하게 인식할 수 있는 웰플레이트(wellplate)방법이 있다(Olsen et al., Curr. Opin. Biotechnol., 11(4):331, 2000).

현재까지 개발된 TPL 변이체의 탐색 및 선별 방법으로는 96-웰플레이트 기반으로 활용될 수 있는 것으로써 효소반응을 통하여 생산물을 생성시키고 이를 발색시약을 통해 발색량이 높은 변이체를 찾는 방법이 알려져 있다. 효소반응에는 기 질로서 티로신을 사용하고 TPL의 효소반응에 의해 페놀이 생성이 된다. 여기서 생성된 페놀은 발색시약(0.1N NaOH, 0.6% 아미노안티피린, 0.6% 과설폰칼륨)을 통하여 발색반응 즉, 페롤과 4-아미노안티피린의 결합반응이 이루어지며 적색의 발색이 나타나게 된다(Arnold and Georgiou, Directed Enzyme Evolution, Humana Press).

그러나 웰플레이트 발색에 의한 방법은 소량의 샘플로 미량의 활성이라도 민감하게 분석할 수 있다는 장점 있는 반면, 고체 상의 탐색 방법에 비해 많은 시간과 비용, 에너지를 소모하고, 특히 고가의 장비를 필요로 하는 단점이 있으므로(Olsen et al., Curr. Opin. Biotechnol., 11(4):331, 2000), 수만개의 클론을 신속하게 탐색할 수 있는 고속 탐색방법으로는 부적절하다.

따라서, 당업계에서는 파키슨병 치료제로서 주목받고 있는 고부가가치 의약용 아미노산인 엘-도파 및 바세도우씨 병의 치료제인 티로신을 고효율로 합성 및 생산하는 TPL의 방향성 진화 탐구에 반복적으로 적용할 수 있고, 효소 개량에 유용하게 사용될 수 있는 새로운 탐색 방법의 개발이 절실히 요구되고 있었다.

이에, 본 발명자들은 티로신 및 유도체의 합성에 이용되는 산업용 효소인 TPL을 합성하는 미생물의 스크리닝 및 방향성 진화 탐구에 반복적으로 적용할 수 있고, 효소 개량에 유용하게 사용될 수 있는 새로운 방법을 연구하기 위해 예의 노력한 결과, TPL을 탐색하는 새로운 고속 스크리닝 방법 및 이 기술을 이용한 TPL의 활성 개량법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.

결국 본 발명의 주된 목적은 TPL의 고속 스크리닝 방법, 이를 이용한 TPL의 활성 개량법 및 상기 방법에 의해 선발된 TPL 변이체를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 티로신을 산성 DMSO(dimethylsulfoxide)가 포함된 용액에 녹여 고농도 티로신 시약을 제조하는 단계; (b) 상기 티로신 시약을 미생물 배양 배지에 첨가하고 급속하게 냉각시켜서 미세 결정의 티로신 침전을 함유하는 불투명 평판 배지를 제조하는 단계; 및 (c) 상 기 평판 배지에 미생물 샘플을 도말한 다음, 미생물의 생장에 따라서 콜로니 주변에 형성되는 투명환의 크기를 관찰함으로써 TPL 활성을 가지는 미생물을 선발하는 단계를 포함하는 TPL의 고속 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물 샘플이라함은 산업적으로 유용한 효소인 TPL 활성을 가지는 미생물을 스크리닝하기 위해 준비된 장내 미생물 및 고온성 미생물 등의 모든 종류의 미생물일 수 있으며, 또한, TPL 활성을 가지는 미생물을 분리하기 위해 준비된 토양, 연못, 하천, 온천, 해수, 폐수 등에서 유래한 시료일 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 미생물 샘플은 정상 TPL을 주형으로한, 변이 유발 PCR(error-prone PCR)법을 이용해 얻어진 효소 변이체 라이브러리로 형질전환된 대장균인 것을 특징으로 할 수 있다. 이 방법은 활성이 개선된 변이 효소를 분리하는데 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 3의 티로신 페놀리아제를 코딩하는 유전자에서 6번째 염기가 T(티민)에서 A(아데닌)으로 치환된 것을 특징으로 하는 TPL 변이체를 코딩하는 유전자와 이 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 3의 티로신 페놀리아제를 코딩하는 유전자에서 277번째 염기와 983번째 염기가 A(아데닌)에서 G(구아닌)으로 치환된 것을 특징으로 하는 TPL 변이체를 코딩하는 유전자와 이 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 도입하여 수득되는 형질전환된 미생물을 제공하며, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, “벡터 (vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드 (plasmid)” 및 “벡터 (vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다.

본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli JM109, E. coli DH5α, E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli B, E. coli B21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)등이 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다. 또한, 효모 및 곰팡이와 같은 진핵세포를 숙주로 사용하는 것도 가능하다.

원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 형질 전환된 미생물을 배양하는 것을 특징으로하는 TPL의 제조방법을 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 고농도의 티로신 시약을 제조하는 단계

DMSO(dimethylsulfoxide)와 2N 염산(HCl)을 혼합한 친수성 공용매(cosolvent)에 난용성 티로신을 첨가하고, 지속적으로 교반하여 400mM 이상의 농도까지 녹여, 물에 대한 용해도의 약 100배에 이르는 고농도 티로신 시약을 제조하였다. 본 발명에 있어서, 상기 DMSO는 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide)의 약자로, 무색·무취의 흡습성 액체로서 녹는점은 18.9℃이고 끓는점은 189℃ 이며, 여러가지 유기 물질을 녹이는 용해 보조제로 사용된다. 고농도 티로신을 함유하는 용액의 조성은 L-티로신(시그마, #T3754, 미국) 7.24g, DMSO(준세이, #20010-0305, 일본) 75mℓ, 2N 염산(준세이, #35535-0350, 일본) 25mℓ 이었고, 티로신 결정이 모두 용해될 때까지 계속 교반 하였다. 결과적으로 400mM의 고농도 티로신 시약을 제조하였고 물에 녹인 것과 비교한 농도 차이는 약 100배였고, 미세 티로신 결정 및 평판 배지 제조에 사용하기 전에 0.2μm 주사기 필터를 이용하여 멸균하였다.

실시예 2: 미세 티로신 결정을 포함하는 불투명 평판 배지의 제조

대장균(Escherichia coli)의 배양에 일반적으로 이용되는 루니아-버타니 한천배지(LB배지, 효모액기스 5g/ℓ, 트립톤 10g/ℓ 및 소금 5g/ℓ)를 멸균하여 열 중탕에 존치하여 55℃가 되도록 온도를 조절한 후, 1/20 부피의 고농도 티로신 시약을 가하여 최종농도가 20mM이 되도록 하였다. 동시에 거품이 생기지 않도록 교반하면서 온도를 55℃에서 45℃로 급속하게 감소시키고 미세한 티로신결정이 배지에서 대량 발생하도록 하였다.

원래 티로신 결정은 컬럼(column)형태 였으나 본 발명으로 인해 생성된 티로신 결정은 니들(needle)형태로서 도2의 (A)에 나타낸 바와 같이, 같은 양에서도 넓 은 표면적이 형성되므로 티로신이 분해되는 경우 빠르게 가용화 될 수 있었다.

또한 니들 형태의 결정이 불규칙하게 흩어져 있어, 빛의 산란에 의하여 낮은 농도에서도 불투명한 특징이 있었다. 특히 개별 입자의 크기 및 무게가 컬럼 형태에 비하여 현저히 작으므로 배지 중에서 가라않지 않고 균질한 현탁 상태로 유지되면서 불투명한 평판 배지를 형성하게 되는 특징이 있었다(도 2).

실시예 3: TPL에 의한 티로신의 분해 관찰

컬럼형 티로신과 본 발명의 니들형 티로신이 TPL작용에 의하여 분해 및 가용화되는 현상을 관찰하기 위하여 슬라이드글라스 위에 티로신 입자를 올려놓고 TPL 효소액을 가한 후, 매 30분마다 각 결정의 상태를 관찰하였다(도 3). 그 결과, 도3에 나타낸 바와 같이, 니들 형태의 티로신은 컬럼 형태 티로신의 분해속도보다 현저히 빠르며, 1시간 이후에는 니들형 결정 모양이 완전히 사라지는 것을 알 수 있었다. 이에 비하여 컬럼형 티로신 입자는 장시간 후에도 결정이 녹지 않고 계속 유지되어 효소반응에 의한 가용화가 매우 어렵다는 것을 확인 할 수 있었다.

이는 효소 반응시 물리적인 입자 형태가 효소반응 속도에 영향을 미치는 것으로 본 발명으로 생성된 티로신 결정이 고활성의 TPL 효소를 보유한 미생물을 고속 스크리닝하는데 효과적으로 이용될 수 있음을 보여주고 있다.

실시예 4: 티로신 평판 배지에서 TPL활성에 의한 투명환 형성

씨트로박터 프룬디(Citrobacter freundii) 또는 심비오박테리움 퇴비(Symbiobacterium toebii) 유래 TPL 유전자을 함유하는 pTrc99a 벡터(파마시아사, 스웨덴)를 제조한 다음 대장균 DH5α에 도입하였다. 상기 형질 전환된 대장균 DH5α를 티로신 평판 배지에 도말한 후, 37℃에서 투명환 형성을 관찰하였다. 그 결과, TPL 활성 균주의 스트릭크(streak) 주변에서 투명 부위가 형성되었고, 단일 콜로니 주변에서 투명환이 형성되었다(도 4).

실시예 5: 유전자 라이브러리 제조

본 발명의 티로신 평판 배지를 이용한 TPL 활성의 분석은 생물 촉매의 활성 개량을 위한 방향성 분자 진화 요소의 기술로 개발 되었다. 효소 변이체 라이브러리를 제조에는 GenemorphII Random Mutagenesis Kit (스트라타진, 미국)의 변이 유발 PCR(error-prone PCR)을 이용하였다.

주형으로는 아미노산 배열을 유지하면서 제한효소 Nde I의 작용부위를 제거한 Citrobacter freundii 유래 TPL(TPL△Nde I)을 사용하였고(도 5), 정방향 프라이머(서열번호 1: 5'-CTC AAG ACC CGT TTA GAG GCC C), 역방향 프라이머(서열번호 2: 5'-ATG CGT CCG GCG TAG AGG AT)를 사용하였다(도 6, 도 7). 변이 유발 PCR은, 95℃에서 2분간 불활성화, 95℃에서 30초간 불활성화, 55℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 2분간 DNA 합성반응의 절차를 30회 반복하여 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 DNA합성반응을 수행하는 과정으로 수행하였다. 정제된 PCR 산물과 항시적 발현벡터 pHCEIIB (바이오리더스, 한국)에 Nde I과 Hind III를 순차적으로 처리하였고, shrimp alkaline phosphatase (로쉬, 미국)로 탈인산화시켜서 사용하였다. 준비된 도입 DNA와 벡터는 몰비 4:1이 되게 섞은 후 T4 DNA 라이게이즈 (다까라, 일본)를 넣어 4℃에서 24시간 반응시킨 후, 정제하여 도 6의 벡터를 제조 하였다.

유전자를 도입하기 위한 세포(competent cell)의 제조는 고품질의 라이브러리를 안정적으로 유지하기 위하여 매우 중요한 과정으로서 항시 새로운 세포를 제조하여 사용하였으며 다음의 과정을 따랐다. 먼저 대장균 JM83의 단일 콜로니를 4mℓ의 LB 배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양하였고, 200mℓ LB 배지에 0.5%(v/v) 접종하여 37℃에서 진탕 배양 하였다. 약 3 시간 후 배양액의 OD₆₀₀가 0.5~0.6이 되면 얼음에 박아 20분간 정치하고, 미리 차갑게 식힌 원심분리 용기에 배양액을 넣은 후 원심 분리하였다(5,000xg, 20분, 4℃). 상층액을 완전히 제거한 세포에 차가운 물을 가하여 현탁시키고 원심분리하여 균체를 다시 모으고, 차가운 10% 글리세롤을 가하여 다시 현탁 시킨 후 원심분리 하였다. 위에서 얻은 세포에 10% 글리세롤을 가하여 균체농도(OD₆₀₀)가 100이 되게 한 후 50㎕씩 분주하여 사용하였다.

일렉트로포레이션(electroporation)은 상기 준비한 세포에 DNA를 섞어서 전기충격(18kV/cm, 25㎌)을 가한 후 SOC배지 1㎖를 첨가하여 37℃에서 130rpm으로 1 시간 배양하여 수행하였다.

이상의 유전자 라이브러리 제조 과정은 반복된 연구를 기초로 최적화된 것이며 이후 분자진화연구에서 라이브러리 제조의 기반기술로 활용되고 있다 (도 7). 제조된 변이 유발 PCR 라이브러리의 품질 평가는 형질 전환체 회수액을 다양한 배율로 희석하고 50㎍/㎖ 앰피실린(ampicillin)을 함유하는 LB 고체배지에 도말하여 37℃에서 16 h 배양한 후 콜로니수를 측정하는 방법에 의해 수행하였다.

계산을 통하여 확인된 총 라이브러리의 크기는 약 32,000개 였으며, 이 중 10개의 콜로니를 무작위로 선별하여 콜로니 PCR을 수행한 결과, 대부분 TPL 유전자를 함유하는 양질의 라이브러리로 확인되었다.

전체 돌연변이 라이브러리의 회수는 LB-Amp 평판 배지 (150x20㎜)에 균체 농도가 약 5,000개가 되게 도말하고 37℃에서 6시간 배양한 후 시료를 30℃로 옮겨 다시 12시간을 더 배양하여 얻었으며, 생성된 콜로니는 10㎖의 보존용액(storage buffer)으로 현탁하여 회수하였다. 보존용액은 2XTY (15㎖), 50% 글리세롤 (9㎖), 20% 포도당 (3㎖), 및 멸균수 (3㎖)를 섞어 제조하였다. 위 시료는 다시 원심분리 (5000xg, 15 min, 4℃)하여 수득하고 보존용액를 첨가하여 최종 OD₆₀₀가 100~200이 되게 현탁한 후 시료를 400㎕씩 분주하여 -70℃에 보관하였으며, 일부는 DNA를 분리하여 -20℃에 보관하였다.

변이 유발 PCR에 의한 유전자 변이의 비율 및 선형 분포를 조사하기 위하여 라이브러리로부터 10개의 콜로니를 무작위로 취하여 DNA 배열을 분석한 결과, 돌연변이 비율은 1.377kb 당 2~6염기로서 1kb당 1~2개 아미노산의 변화가 일어날 것으로 예측되었다. 유전자 변이가 일어난 위치도 일부 구간에 편향되지 않고 전체 유전자에서 고르게 분포되어 나타났다.

실시예 6: 투명환의 크기와 TPL활성의 비례관계

TPL 변이체 라이브러리를 실시예 2의 방법으로 제조한 티로신 평판 배지에 도말하여 96개의 활성 보유 균주를 선발하였다. 이와같이 수집된 96개의 콜로니를 사용하여 투명환의 크기와 TPL활성을 조사하였다. 투명환의 크기는 접종 24시간 후에 평판 배지의 후면을 촬영한 후 바이오래드 이미지분석기를 이용하여 개별 콜 로니로부터 투명환의 크기를 측정하여 조사하였다(도 8(A)).

TPL의 활성측정은 96-웰플레이트에서 다음과 같이 수행되었다. 먼저 LB-앰피실린 배지에서 16시간동안 배양한 세포액 60㎕를 취하여 원심분리 하여 세포를 모으고, 트리스완충액(pH8.0)으로 1회 세척하고, Cellytic B(시그마, 미국)를 첨가하여 세포를 용해시켜서 효소액을 제조하였다. 여기에 동량의 기질용액(2mM 티로신, 20uM 피리독살-5-포스페이트, 트리스완충액(pH8.0)을 첨가하고 37℃에서 15분 동안 효소반응을 진행하였다. 효소 활성에 의하여 생성된 페놀량의 분석은 4-아미노안티피린(aminoantypyrine)에 의한 발색을 이용하였다. 이 과정은 효소 반응액을 원심분리하여 세포 조각을 제거하고 상등액에 동량의 0.1N NaOH를 가하고 0.6% 4-아미노안티피린, 0.6% 과술폰산 칼륨(potassium persulfonate)를 가하고 10분간 정치한 후, Microplate reader(바이오래드사)로 490nm의 흡수파장을 측정하였다.

도 8(B)의 가로축은 발색반응으로 측정된 효소 활성을 나타내었고 세로축은 투명환의 면적을 나타내었다. 도 8(B)에 나타난 바와 같이, 각 콜로니들의 투명환 크기와 실제로 측정한 활성은 비례적인 상관관계가 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7: 개량 TPL의 선발 및 변이된 유전 정보의 분석

실시예 5에서 구축된 약 3만 여개의 라이브러리를 대량의 콜로니를 스크리닝하기 위한 대형 평판 배지(24cm x 24cm, 에스피엘, 한국)에 도말하고 37℃에서 24시간동안 배양하면서 투명환을 관찰하여 600개의 양성 클론을 1차 선발하였다(도 9).

1차로 얻어진 양성 클론에 대하여 투명환의 크기 및 실시예 6에서 사용된 활성 정량을 통하여 기존의 TPL보다 활성이 50%이상 증가된 두개의 변이체를 최종적으로 획득하였다. 획득된 고활성 변이체는 각각 TPL01 및 TPL02라 명명하였고, 이들 변이체 유전자의 염기서열과 그 아미노산 서열의 변이, 이에 따른 티로신 분해 활성의 증가는 하기 표 1에 나타내었다. (도 10, 도 11)

명칭	유전자 염기서열 변이	아미노산 변이	**상대활성
*TPL	없음	없음	1배
TPL01	T6A	N2K	2.5배
TPL02	A277G, A983G	I93V, K328R	1.5배

* Nde I 제한효소 작용부위를 제거한 씨트로박터 프룬디 TPL

** 효소작용에 의한 페놀 정량법으로 분석한 효소 활성 값

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의 된다고 할 것이다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 상기 TPL의 고속 스크리닝 방법을 통해 선발된, 기존 TPL의 활성에 비하여 월등히 그 효과가 우수한, TPL 돌연변이체를 제공하므로 파킨슨병 치료제인 엘-도파 및 바세도우씨 병의 치료제인 티로신 등을 산업적으로 생산하는 생물 촉매로 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른, TPL 고속 스크리닝 방법을 이용하게 되면, 대량 라이브러리로부터 효소 활성을 고속 스크리닝할 수 있게 되어, TPL을 합성하는 미생물을 스크리닝할 수 있으며, 또한, TPL의 효소 변이체 라이브러리에서 활성이 개선된 변이 효소를 분리하는데 유용하게 이용될 수 있어, TPL의 방향성 분자진화(directed molecular evolution)연구에서 유용하게 사용될 수 있다.

<110> BIOLEADERS CORPORATION KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Method for Screening Tyrosin Phenol-lyase and Mutants Screened Thereby <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctcaagaccc gtttagaggc cc 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 atgcgtccgg cgtagaggat 20 <210> 3 <211> 1371 <212> DNA <213> Citrobacter freundii <400> 3 atgaattatc cggcagaacc cttccgtatt aaaagcgttg aaactgtatc tatgatcccg 60 cgtgatgaac gcctcaagaa aatgcaggaa gcgggttaca atactttcct gttaaattcg 120 aaagatattt atattgacct gctgacagac agtggcacta acgcaatgag cgacaagcag 180 tgggccggaa tgatgatggg tgatgaagcg tacgcgggca gcgaaaactt ctatcatctg 240 gaaagaaccg tgcaggaact gttcggcttt aaacatattg ttccgactca ccaggggcgt 300 ggcgcagaaa acctgttatc gcagttggct attaaacctg ggcaatatgt tgccgggaat 360 atgtatttca ccaccacccg ttatcaccag gaaaaaaatg gtgcggtgtt tgtcgatatc 420 gttcgtgacg aagcgcacga tgccggtctg aatattgcgt ttaaaggtga tatcgatctt 480 aaaaaattac aaaagctgat tgatgaaaaa ggcgcagaaa atattgcgta tatctgcctg 540 gcggtgacgg ttaacctcgc aggtgggcag ccggtctcga tggccaacat gcgtgcggtg 600 cgtgaactga cagaagcgca cggcattaaa gtgttctacg acgccacccg ttgcgtggaa 660 aacgcctact ttatcaaaga gcaagagcag ggctttgaga acaagagcat cgccgagatc 720 gtgcatgaga tgttcagcta cgccgacggt tgtaccatga gtggtaaaaa agactgtctg 780 gtgaacatcg gcggtttcct gtgcatgaac gatgacgaaa tgttctcttc tgccaaagag 840 ttagtcgtgg tctacgaagg gatgccatct tacggcggcc tggccggacg tgatatggaa 900 gccatggcga ttggcctgcg cgaagccatg caatacgaat atattgagca ccgcgtgaag 960 caggttcgct acctgggcga taagctgaaa gccgctggcg taccgattgt tgaaccggta 1020 ggcggtcacg cggtattcct cgatgcgcgt cgcttctgcg agcatctgac gcaggacgag 1080 ttcccggcgc aaagcctggc ggcgagcatt tatgtggaaa ctggtgtgcg cagtatggaa 1140 cgcggaataa tctctgcagg ccgtaataac gtgaccggtg aacaccacag accgaaactg 1200 gaaaccgtgc gtctgactat tccacgccgc gtttatacct acgcgcacat ggatgtcgta 1260 gctgacggta ttattaaact ttaccagcac aaagaagata ttcgcgggct gaagtttatt 1320 tacgagccga agcagttgcg tttctttact gcacgctttg actatatcta a 1371 <210> 4 <211> 456 <212> PRT <213> Citrobacter freundii <400> 4 Met Asn Tyr Pro Ala Glu Pro Phe Arg Ile Lys Ser Val Glu Thr Val 1 5 10 15 Ser Met Ile Pro Arg Asp Glu Arg Leu Lys Lys Met Gln Glu Ala Gly 20 25 30 Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Asn Ser Lys Asp Ile Tyr Ile Asp Leu Leu 35 40 45 Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gln Trp Ala Gly Met 50 55 60 Met Met Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ser Glu Asn Phe Tyr His Leu 65 70 75 80 Glu Arg Thr Val Gln Glu Leu Phe Gly Phe Lys His Ile Val Pro Thr 85 90 95 His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Asn Leu Leu Ser Gln Leu Ala Ile Lys 100 105 110 Pro Gly Gln Tyr Val Ala Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg Tyr 115 120 125 His Gln Glu Lys Asn Gly Ala Val Phe Val Asp Ile Val Arg Asp Glu 130 135 140 Ala His Asp Ala Gly Leu Asn Ile Ala Phe Lys Gly Asp Ile Asp Leu 145 150 155 160 Lys Lys Leu Gln Lys Leu Ile Asp Glu Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala 165 170 175 Tyr Ile Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Gly Gln Pro Val 180 185 190 Ser Met Ala Asn Met Arg Ala Val Arg Glu Leu Thr Glu Ala His Gly 195 200 205 Ile Lys Val Phe Tyr Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Asn Ala Tyr Phe 210 215 220 Ile Lys Glu Gln Glu Gln Gly Phe Glu Asn Lys Ser Ile Ala Glu Ile 225 230 235 240 Val His Glu Met Phe Ser Tyr Ala Asp Gly Cys Thr Met Ser Gly Lys 245 250 255 Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Cys Met Asn Asp Asp 260 265 270 Glu Met Phe Ser Ser Ala Lys Glu Leu Val Val Val Tyr Glu Gly Met 275 280 285 Pro Ser Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala Met Ala Ile 290 295 300 Gly Leu Arg Glu Ala Met Gln Tyr Glu Tyr Ile Glu His Arg Val Lys 305 310 315 320 Gln Val Arg Tyr Leu Gly Asp Lys Leu Lys Ala Ala Gly Val Pro Ile 325 330 335 Val Glu Pro Val Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala Arg Arg Phe 340 345 350 Cys Glu His Leu Thr Gln Asp Glu Phe Pro Ala Gln Ser Leu Ala Ala 355 360 365 Ser Ile Tyr Val Glu Thr Gly Val Arg Ser Met Glu Arg Gly Ile Ile 370 375 380 Ser Ala Gly Arg Asn Asn Val Thr Gly Glu His His Arg Pro Lys Leu 385 390 395 400 Glu Thr Val Arg Leu Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr Tyr Ala His 405 410 415 Met Asp Val Val Ala Asp Gly Ile Ile Lys Leu Tyr Gln His Lys Glu 420 425 430 Asp Ile Arg Gly Leu Lys Phe Ile Tyr Glu Pro Lys Gln Leu Arg Phe 435 440 445 Phe Thr Ala Arg Phe Asp Tyr Ile 450 455

Claims (10)

1. 하기 단계를 포함하는 티로신 페놀리아제(TPL)의 고속 스크리닝 방법:

   (a) 티로신을 산성 DMSO(dimethylsulfoxide)가 포함된 용액에 녹여 고농도 티로신 시약을 제조하는 단계;

   (b) 상기 티로신 시약을 미생물 배양 배지에 첨가하고 급속하게 냉각시켜서 미세 결정의 티로신 침전을 함유하는 불투명 평판 배지를 제조하는 단계; 및

   (c) 상기 평판 배지에 미생물 샘플을 도말한 다음, 미생물의 생장에 따라서 콜로니 주변에 형성되는 투명환의 크기를 관찰함으로써 TPL 활성을 가지는 미생물을 선발하는 단계.
2. 제1항에 있어서, (c) 단계의 미생물 샘플은 정상 TPL을 주형으로한, 변이 유발 PCR(error-prone PCR)법을 이용해 얻어진 효소 변이체 라이브러리로 형질전환된 대장균인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 서열번호 3의 티로신 페놀리아제를 코딩하는 유전자에서 6번째 염기가 T(티민)에서 A(아데닌)으로 치환된 것을 특징으로 하는 TPL 변이체를 코딩하는 유전자.
4. 제3항의 TPL 변이체 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
5. 서열번호 3의 티로신 페놀리아제를 코딩하는 유전자에서 277번째 염기와 983번째 염기가 A(아데닌)에서 G(구아닌)으로 치환된 것을 특징으로 하는 TPL 변이체를 코딩하는 유전자.
6. 제5항의 TPL 변이체 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
7. 제3항 또는 제5항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
8. 제7항의 재조합 벡터를 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 숙주세포에 도입하여 수득되는 형질전환된 미생물.
9. 제8항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
10. 제9항의 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 TPL의 제조방법.

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