KR20060096522A - 인간 사이토크롬 ｐ450 2ｂ6 유전자의 변이 유전형 분석방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 사이토크롬 P450 2B6 유전자의 변이 유전형 분석방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 형질 특이적 DNA 중합효소 연쇄반응과 제한효소 절편길이 다형성 방법을 이용하여 인간 사이토크롬 P450 2B6 유전자의 변이 유전형인 CYP2B6*1/CYP2B6*6 유전형과 CYP2B6*4/CYP2B6*9 유전형을 구분하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 CYP2B6 유전자의 변이 유전형 분석방법은 DNA로부터 직접적으로 CYP2B6*1/CYP2B6*6 유전형과 CYP2B6*4/CYP2B6*9 유전형을 용이하게 구분할 수 있는 효과가 있다.
사이토크롬 P450 2B6, 변이 유전형
Description
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 피험자의 혈액으로부터 분리한 DNA를 주형으로 하여 CYP2B6 유전자의 엑손 4 영역과 엑손 5 영역을 PCR 증폭한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 형질 특이적 DNA 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.
M: 분자량 마커
1: CYP2B6*1/CYP2B6*1 유전형
2: CYP2B6*1/CYP2B6*4 유전형
3: CYP2B6*1/CYP2B6*9 유전형
4: 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 증폭산물
5: CYP2B6*4/CYP2B6*6 유전형
6: CYP2B6*6/CYP2B6*6 유전형
7: CYP2B6*6/CYP2B6*6 유전형
8: CYP2B6*6/CYP2B6*6 유전형
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 형질 특이적 PCR 산물을 제한효소 styI 으로 처리한 결과이다.
M: 분자량 마커
1: CYP2B6*1/CYP2B6*1 유전형
2: CYP2B6*1/CYP2B6*4 유전형
3: CYP2B6*4/CYP2B6*6 유전형
4: 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 증폭산물
5: 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 증폭산물
6: 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 증폭산물
본 발명은 인간 사이토크롬 P450 2B6 유전자의 변이 유전형 분석방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 형질 특이적 DNA 중합효소 연쇄반응과 제한효소 절편길이 다형성 방법을 이용하여 인간 사이토크롬 P450 2B6 유전자의 변이 유전형인 CYP2B6*1/CYP2B6*6 유전형과 CYP2B6*4/CYP2B6*9 유전형을 구분하는 방법에 관한 것이다.
인간 사이토크롬 P450은 약물, 발암원 및 독소와 같은 외래 화학물질과 스테로이드, 지방산 및 비타민과 같은 내부 기질의 산화를 촉진하는 헴단백질의 일원이 다(Nelson et al., Pharmacogenetics 6:1-42, 1996). 한편, 간을 포함하여 신장, 장관 및 폐와 같은 기관에서 다양한 사이토크롬 P450의 아형이 발견되었다.
이 중에서 인간 사이토크롬 P450 2B6(Cytochrome P450 2B6, 이하 "CYP2B6"라 함) 유전자는 19번째 크로모좀의 19q12와 19q13.2에 존재하며 9개의 엑손으로 이루어져 있다. 상기 CYP2B6는 인체에서 약물 대사와 독성물질의 대사에 관여하는 대사효소를 생산하는 유전자로서 임상치료의 목적으로 사용되는 약물 중 사이클로포스파마이드, 타목시펜, 디아제팜, 부프로피온, 에파비렌즈 등과 같은 중요한 약물을 포함한 다수의 약물들을 대사하는 것으로 알려져 있으며, 페노바르비탈, 리팜핀, 클로트리마졸 등을 포함한 여러 가지 물질에 의해 발현이 조절된다.
CYP2B6의 활성은 개인간의 차이가 나는 것으로 알려져 있는데, 이러한 원인 중 하나는 CYP2B6 유전자의 유전적 다형성에 기인한다. 현재 CYP2B6 유전자에서는 많은 변이유전자가 보고 되었다. 예를 들면, CYP2B6*2 (64C>T), CYP2B6*3 (777C>A), CYP2B6*4 (785A>G), CYP2B6*5 (1459C>T), CYP2B6*6 (516G>T,785A>G), CYP2B6*7 (516G>T, 785A>G, 1459C>T), CYP2B6*8(415A>G), CYP2B6*9 (516G>T) 등이 알려져 있다(Lang et al., Pharmacogenetics 11:399-415, 2001; http://www.imm.ki.se /CYPalleles/)(표 1).
[표 1]
CYP2B6 유전자의 변이 유전자
| 대립 형질 | 단백질 | 핵산 변이 | 아미노산 치환 |
| CYP2B6*1a | CYP2B6.1a | None | None |
| CYP2B6*2 | CYP2B6.2 | 64C>T | Arg22Cys |
| CYP2B6*3 | CYP2B6.3 | 777C>A | Ser259Arg |
| CYP2B6*4 | CYP2B6.4 | 785A>G | Lys262Arg |
| CYP2B6*5 | CYP2B6.5 | 1459C>T | Arg487Cys |
| CYP2B6*6 | CYP2B6.6 | 516G>T; 785A>G | Gln172His; Lys262Arg |
| CYP2B6*7 | CYP2B6.7 | 516G>T; 785A>G; 1459C>T | Gln172His; Lys262Arg; Arg487Cys |
| CYP2B6*8 | CYP2B6.8 | 415A>G | Lys139Glu |
| CYP2B6*9 | CYP2B6.9 | 516G>T | Gln172His |
a:야생형(wild-type)
상기 변이들 중에서 516G>T, 785A>G 돌연변이는 빈도가 높은 변이로서 CYP2B6*4, CYP2B6*6 등의 유전형의 기능성과 연관이 있는 것으로 생각되고 있다.
한국인 집단에서 516G>T, 785A>G 돌연변이의 빈도를 조사하였을 때, 다수의 한국인에서 516G>T, 785A>G의 두 변이가 두 개의 염색체 중 하나는 변이형, 다른 하나는 야생형으로 나타나는 것이 관찰되었다. 이러한 피험자의 경우, 절대적인 유전형의 조합이 CYP2B6*1/CYP2B6*6나 CYP2B6*4/CYP2B6*9의 두 가지 가능성이 있다. 전자의 경우 516G>T 변이 및 785A>G 변이가 동일한 염색체상에 존재하는 경우이고, 후자의 경우는 두 변이가 서로 다른 염색체 상에 존재하는 경우이다. 현재 유전자 역학 조사를 통해 CYP2B6의 기능성 변이유전자가 하나씩 규명되고 있고, 연구 결과들은 서로 다른 변이유전자에서는 기능성이 차이가 있을 수 있음을 시사하고 있다. 따라서 이 두 가지 변이와 관련하여 CYP2B6*1/CYP2B6*6 유전형과 CYP2B6*4/CYP2B6*9 유전형을 구분할 필요가 있다. 상기 두 가지의 유전형을 구분하는 방법으로는 종래에 말초혈액 임파구로부터 RNA를 분리한 후 역전사과정을 거쳐 cDNA를 제조하고 이를 주형으로 하여 DNA 중합효소 연쇄반응을 한 후, 반응 산 물을 정제하여 전장 염기 서열 분석을 하는 방법만이 알려져 있다. 그러나, 상기와 같은 방법은 시간적, 경제적, 인력적인 소요가 많다.
이에 본 발명자들은 CYP2B6*1/CYP2B6*6 유전형과 CYP2B6*4/CYP2B6*9 유전형을 구분할 수 있는 방법을 연구하던 중 형질 특이적 DNA 중합효소 연쇄반응과 제한효소 절편길이 다형성 방법을 이용하여 DNA로부터 직접적으로 CYP2B6*1/CYP2B6*6 유전형과 CYP2B6*4/CYP2B6*9 유전형을 용이하게 구분함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 효율적으로 CYP2B6 유전자의 변이 유전형을 분석하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 인간 CYP2B6(Cytochrome P450 2B6) 유전자에 516G>T 변이와 785A>G 변이가 존재하며 이형접합형으로 판정된 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 DNA를 CYP2B6 유전자의 엑손 4 영역과 엑손 5 영역을 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 PCR 증폭산물을 CYP2B6 유전자의 516번째 염기가 야생형인 경우에만 증폭될 수 있도록 고안된 형질 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 수득된 PCR 증폭산물을 styI 효소와 반응시키는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계의 반응산물을 아가로스 젤에서 전기영동한 다음 산물의 길이를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 CYP2B6 유전자의 변이 유전형 분석 방법CYP2B6 유전자의 변이 유전형 분석방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명에 따른 CYP2B6 유전자의 변이 유전형 분석방법은 유전형 조합이 CYP2B6*1/CYP2B6*6인 경우와 CYP2B6*4/CYP2B6*9인 경우를 구분할 수 있는 방법이다. 상기에서 유전형 조합이 CYP2B6*1/CYP2B6*6인 경우 하나의 염색체는 야생형과 동일하고 다른 하나의 염색체 상에는 516번 염기인 G가 T로 치환된 변이(이하 516G>T 변이라 함)와 785번 염기인 A가 G로 치환된 변이(이하, 785A>G 변이라 함)가 존재한다. 유전형 조합이 CYP2B6*4/CYP2B6*9인 경우에는 하나의 염색체 상에 785A>G 변이가 존재하고 다른 하나의 염색체 상에 516G>T 변이가 존재한다.
보다 구체적으로 본 발명에 따른 분석방법은 516G>T 변이와 785A>G 변이가 존재하는 이형접합형 DNA를 시료로 하여 1) 516번 염기가 야생형(G)인 경우에만 DNA 시료가 증폭되도록 고안한 형질 특이적 프라이머로 형질 특이적 DNA 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR이라 함)을 수행하고,
2) 상기 증폭산물을 785번 야생형 염기인 A를 선택적으로 인식하여 절단할 수 있는 제한효소와 반응시키는 것을 특징으로 하는 제한효소 절편길이 다형성 방법을 순차적으로 수행하는 것을 특징으로 한다.
상기에서 형질 특이적 DNA 중합효소 연쇄반응을 수행하여 증폭된 산물은 다음 중 하나일 수 있다. 즉, 516G>T 변이 및 785A>G 변이가 동일한 하나의 염색체 상에 존재하는 유전형인 CYP2B6*1/CYP2B6*6의 경우 상기에서 증폭된 DNA는 상기 516G>T 변이 및 785A>G 변이가 존재하지 않는 야생형과 동일한 다른 하나의 염색체의 증폭 산물이거나 또는 상기 두 염기의 변이가 서로 다른 염색체 상에 존재하는 유전형인 CYP2B6*4/CYP2B6*9의 경우 상기에서 증폭된 DNA는 516G>T 변이는 존재하지 않으며 785A>G 변이만이 존재하는 하나의 염색체가 증폭된 산물일 것으로 추정될 수 있다.
따라서, 상기 형질 특이적 DNA 중합효소 연쇄반응 결과 증폭된 산물이 유전형이 CYP2B6*1/CYP2B6*6의 경우에 생성될 수 있는 516번 염기와 785번 염기에 모두 변이가 일어나지 않은 야생형과 동일한 염색체인지 아니면 유전형이 CYP2B6*4/CYP2B6*9의 경우에 생성될 수 있는 785번 염기의 변이가 존재하는 염색체인지를 구별함으로써 CYP2B6 유전자의 변이 유전형인 CYP2B6*1/CYP2B6*6와 CYP2B6*4/CYP2B6*9을 구분할 수 있다.
이에 상기 785번 염기의 변이 여부를 확인하기 위하여 상기 형질 특이적 DNA 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭된 산물을 대상으로 제한효소 절편길이 다형성 방법을 수행한다.
즉, 상기 형질 특이적 DNA 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭된 산물을 785번 염기가 야생형(A)인 경우에는 절단되나 변이형(G)인 경우에는 절단되지 않는 제한효소인 styI과 반응시킨 다음 아가로스 젤에서 전기영동하여 제한효소에 의해 절단된 절편의 길이를 확인함으로써 염색체 상에 785A>G 변이의 존재 여부를 확인할 수 있다.
전기영동결과, styI 효소에 의해 절단된 절편이 존재하는 경우 그 유전형은 CYP2B6*1/CYP2B6*6로 결정할 수 있으며 상기 제한 효소에 의해 절단되지 않는 경우에는 그 유전형을 CYP2B6*4/CYP2B6*9으로 결정할 수 있다.
본 발명의 분석방법은 (a) 인간 CYP2B6(Cytochrome P450 2B6) 유전자에 516G>T 변이와 785A>G 변이가 존재하며 이형접합형으로 판정된 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 DNA를 CYP2B6 유전자의 엑손 4 영역과 엑손 5 영역을 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 PCR 증폭산물을 CYP2B6 유전자의 516번째 염기가 야생 형인 경우에만 증폭될 수 있도록 고안된 형질 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 수득된 PCR 증폭산물을 styI 효소와 반응시키는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계의 반응산물을 아가로스 젤에서 전기영동한 다음 산물의 길이를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (a) 단계에서 생물학적 시료는 피험자의 혈액, 피부 세포, 점막 세포 및 모발일 수 있다. 바람직하게는 혈액일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 (a) 단계의 채취된 시료로부터 DNA를 추출하는 방법은 특별히 한정되지 않으며 당업계에 공지된 기술 또는 시판되고 있는 추출용 키트를 사용할 수 있다. 예를 들면, DNA 추출용 키트는 Qiagen, Inc.(미국 캘리포니아) 및 Stratagene(미국 캘리포니아)에서 구입할 수 있다.
상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계의 DNA를 주형으로 하여 516G>T 변이가 존재하는 인간 CYP2B6 유전자의 엑손 4 영역과 785A>G 변이가 존재하는 엑손 5 영역을 PCR 증폭하는 단계이다. 상기 인간 CYP2B6 유전자의 엑손 4 영역과 엑손 5 영역의 PCR 증폭은 공지된 CYP2B6 유전자 서열(GenBank accession no. NT_011109, 서열번호 1)로부터 상기 영역을 증폭할 수 있는 프라이머를 디자인하고 이를 이용하여 수 행할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머를 사용할 수 있다. PCR 반응 조건으로는 특별히 한정되지는 않으나 바람직하게는 94 ℃에서 1분간 반응시킨 다음, 98 ℃ 10초, 58.3 ℃ 30초, 72 ℃ 3 분 조건으로 30 사이클을 반응시키고, 최종적으로 72 ℃에서 7분간 두어 반응을 종료한다.
상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계의 증폭산물을 주형으로 하여 형질 특이적 DNA 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계이다. 보다 구체적으로 CYP2B6 유전자의 516번째 염기가 야생형인 경우에만 증폭될 수 있도록 고안된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행한다. 바람직하게는 상기 프라이머로는 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시된 것을 사용할 수 있다. PCR 반응 조건으로는 특별히 한정되지는 않으나 바람직하게는, 94 ℃ 1분간 반응시킨 다음, 94 ℃ 20초, 70 ℃ 7 분, 72 ℃ 3 분 조건으로 20 사이클을 반응시키고 최종적으로 72 ℃ 7분을 두어 반응을 종료한다.
상기 (e) 단계는 상기 (d) 단계에서 증폭된 산물을 제한효소 styI과 반응시키는 단계이다. 바람직하게는 상기 (e) 단계에서 효소반응은 37 ℃에서 2 시간 동안 수행한다.
상기 (f) 단계는 상기 (e) 단계에서 효소반응이 완료된 산물을 아가로스 젤에서 전기영동하여 산물의 길이를 확인하는 단계이다. 즉, 785A>G 변이가 존재하지 않는 경우에는 상기 제한효소 styI에 의해 (d) 단계에서 증폭된 산물이 절단되 어 전기영동결과 171bp 길이의 산물이 검출되며 785A>G 변이가 존재하는 경우에는 상기 제한효소 styI에 의해 (d) 단계에서 증폭된 산물이 절단되지 않아 전기영동결과 171bp 길이의 산물 대신 208bp 길이의 산물이 검출된다. 따라서, 본 발명에 따른 분석방법에 의하면 CYP2B6 유전자의 변이 유전형인 CYP2B6*1/CYP2B6*6와 CYP2B6*4/CYP2B6*9을 용이하게 구분할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
CYP2B6 유전자의 엑손 4 영역과 엑손 5 영역의 증폭
CYP2B6 유전자에서 516G>T, 785A>G의 두 변이가 존재하는 이형접합형의 피험자로부터 전혈을 분리하였다. 게놈 DNA 분리 키트(Qiagen)를 사용하여 상기 전혈로부터 DNA를 분리하였다. 상기 DNA를 주형으로 하고 하기의 프라이머를 사용하여 CYP2B6 유전자의 엑손 4 영역과 엑손 5 영역을 PCR 증폭하였다.
CYP2B6-4F (서열번호 2)
5'-GGTCTGCCCATCTATAAAC-3'
CYP2B6-5R (서열번호 3)
5'-CTCCCTCTGTCTTTCATTCTG-3'
PCR 반응조건으로는 94 ℃에서 1분간 반응시켜 두 가닥의 DNA를 분리하고, 98 ℃ 10초, 58.3 ℃ 30초, 72 ℃ 3 분 조건으로 30 사이클을 반응시켰으며, 최종적으로 72 ℃에서 7분간 두어 반응을 종료하였다. 반응이 잘 되었는지 확인하기 위해 반응산물을 아가로스 젤에서 전기영동을 한 후 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 자외선 아래에서 2977bp 크기의 산물이 생성되는 것을 확인하였다(도 1).
<실시예 2>
형질 특이적 DNA 중합효소 연쇄반응
상기 실시예 1에서 수득된 산물을 10분의 1로 희석하고 이를 주형으로 하여 CYP2B6 유전자의 516번째 염기가 야생형(G)인 경우에만 증폭되도록 고안된 하기의 형질 특이적 서열번호 4의 프라이머와 서열번호 5의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다.
CYP2B6-A516G (서열번호 4)
5'-ACCCCACCTTCCTCTTCCAG-3'
CYP2B6-5RII (서열번호 5)
5'-TTCCATGTGGAGCAGGTAGG-3'
PCR 반응 조건으로는 94 ℃ 1분간 반응시킨 다음, 94 ℃ 20초, 70 ℃ 7 분, 72 ℃ 3 분 조건으로 20 사이클을 반응시키고 최종적으로 72 ℃ 7분을 두어 반응을 종료하였다. 상기 반응산물을 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 이때 대조군으로는 유전형이 각각 CYP2B6*6/CYP2B6*6, CYP2B6*1/CYP2B6*1, CYP2B6*1/CYP2B6*4, CYP2B6*1/CYP2B6*9 및 CYP2B6*4/CYP2B6*6으로 밝혀진 DNA 시료를 사용하였다.
실험 결과, 유전형이 CYP2B6*6/CYP2B6*6인 경우 두 염색체의 516번 염기가 모두 변이되었기 때문에 증폭되지 않음을 확인할 수 있었다. 반면, 유전형이 CYP2B6*1/CYP2B6*1와 CYP2B6*1/CYP2B6*4인 경우에는 516번 염기가 야생형이기 때문에 DNA가 증폭됨을 확인할 수 있었고 유전형이 CYP2B6*1/CYP2B6*9와 CYP2B6*4/CYP2B6*6인 경우 한 개의 염색체의 516번 염기가 변이되어 있으나 다른 한 개는 변이되지 않아 DNA가 증폭됨을 확인할 수 있었다. 한편, 상기 실시예 1의 DNA 시료를 증폭한 결과, 2476bp 길이의 산물이 생성되는 것을 확인하였다(도 2).
<실시예 3>
sty
I효소를 이용한 CYP2B6 유전자의 변이 유전형 구분
상기 실시예 2에서 수득된 증폭산물에 styI 효소를 첨가하여 37 ℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 전기영동이 완료된 후 에티듐 브로마이드로 염색하여 최종적으로 확인하였다.
실험 결과, 실시예 2의 DNA 시료의 경우 유전형이 CYP2B6*1/CYP2B6*1인 야생형과 동일한 패턴으로 나타났다. 즉, 상기 PCR 증폭산물을 styI 효소로 처리하는 경우 785번 염기인 A(야생형)가 절단되어 171bp 길이의 단편이 생성됨을 확인할 수 있었다. 반면, 한 개의 염색체 만이 변이형인 CYP2B6*1/CYP2B6*4와 두 개의 염색체가 모두 변이형인 CYP2B6*4/CYP2B6*6인 경우 785번째 염기인 G(변이형)가 절단되지 않아 208bp 길이의 단편이 생성됨을 확인할 수 있었다(도 3).
따라서, 상기 실시예 2의 DNA 시료의 염색체에는 785번 염기의 변이가 존재하지 않음을 확인할 수 있었으며 이로부터 상기 DNA 시료의 유전형은 CYP2B6*1/CYP2B6*6임을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 CYP2B6 유전자의 변이 유전형 분석방법은 형질 특이적 DNA 중합효소 연쇄반응과 제한효소 절편길이 다형성 방법을 이용하여 DNA로부터 직접적으로 CYP2B6*1/CYP2B6*6 유전형과 CYP2B6*4/CYP2B6*9 유전형을 용이하게 구분할 수 있는 효과가 있다.
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ccatggagct cagcgtcctc ctcttccttg cactcctcac aggactcttg ctactcctgg 60
ttcagcgcca ccctaacacc catgaccgcc tcccaccagg gccccgccct ctgccccttt 120
tgggaaacct tctgcagatg gatagaagag gcctactcaa atcctttctg aggttccgag 180
agaaatatgg ggacgtcttc acggtacacc tgggaccgag gcccgtggtc atgctgtgtg 240
gagtagaggc catacgggag gcccttgtgg acaaggctga ggccttctct ggccggggaa 300
aaatcgccat ggtcgaccca ttcttccggg gatatggtgt gatctttgcc aatggaaacc 360
gctggaaggt gcttcggcga ttctctgtga ccactatgag ggacttcggg atgggaaagc 420
ggagtgtgga ggagcggact caggaggagg ctcagtgtct gatagaggag cttcggaaat 480
ccaagggggc cctcatggac gccaccttcc tcttccattc cattaccgcc aacatcatct 540
gctccatcgt ctttggaaaa cgattccact accaagatca agagttcctg aagatgctga 600
acttgttcta ccagactttt tcactcatca gctctgtatt cggccagctg tttgagctct 660
tctctggctt cttgaaatac tttcctgggg cacacaggca agtttacaaa aacccgcagg 720
aaatcaatgc ttacattggc cacagtgtgg agaagcaccg tgaaaccctg gaccccagcg 780
cccccaggga cctcatcgac acctacctgc tccacatgga aaaagagaaa tccaacgcac 840
acagtgaatt cagccaccag aacctcaacc tcaacacgct ctcgctcttc tttgctggca 900
ctgagaccac cagcaccact ctccgctacg gcttcctgct catgctcaaa taccctcatg 960
ttgcagagag agtctacagg gagattgaac aggtgattgg cccacatcgc cctccagagc 1020
ttcatgaccg agccaaaatg ccatacacag aggcagtcat ctatgagatt cagagatttt 1080
ccgaccttct ccccatgggt gtgccccaca ttgtcaccca acacaccagc ttccgagggt 1140
acatcatccc caaggacaca gaagtatttc tcatcctgag cactgctctc catgacccac 1200
actactttga aaaaccagac gccttcaatc ctgaccactt tctggatgcc aatggggcac 1260
tgaaaaagac tgaagctttt atccccttct ccttagggaa gcggatttgt cttggtgaag 1320
gcatcgcccg tgcggaattg ttcctcttct tcaccaccat cctccagaac ttctccatgg 1380
ccagccccgt ggccccagaa gacatcgatc tgacacccca ggagtgtggt gtgggcaaaa 1440
tacccccaac ataccagatc cgcttcctgc cccgctgaag gggctgaggg aagggggtca 1500
aaggattcca gggtcattca 1520
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
ggtctgccca tctataaac 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
ttccatgtgg agcaggtagg t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
accccacctt cctcttccag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
ttccatgtgg agcaggtagg 20
Claims (4)
- (a) 인간 CYP2B6(Cytochrome P450 2B6) 유전자에 516G>T 변이와 785A>G 변이가 존재하며 이형접합형으로 판정된 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;(b) 상기 (a) 단계의 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;(c) 상기 (b) 단계의 DNA를 CYP2B6 유전자의 엑손 4 영역과 엑손 5 영역을 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계;(d) 상기 (c) 단계의 PCR 증폭산물을 CYP2B6 유전자의 516번째 염기가 야생형인 경우에만 증폭될 수 있도록 고안된 형질 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계;(e) 상기 (d) 단계에서 수득된 PCR 증폭산물을 styI 효소와 반응시키는 단계; 및(f) 상기 (e) 단계의 반응산물을 아가로스 젤에서 전기영동한 다음 산물의 길이를 확인하는 단계를 포함하는 인간 CYP2B6 유전자의 변이 유전형 분석 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 프라이머가 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 프라이머가 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (f) 단계에서 전기영동결과 검출된 산물 중 171bp 길이의 산물이 존재하는 경우 유전형을 CYP2B6*1/CYP2B6*6로 판정하고 208bp 길이의 산물이 존재하는 경우에는 CYP2B6*4/CYP2B6*9으로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020050017111A KR100658178B1 (ko) | 2005-03-02 | 2005-03-02 | 인간 사이토크롬 ｐ450 2ｂ6 유전자의 변이 유전형 분석방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020050017111A KR100658178B1 (ko) | 2005-03-02 | 2005-03-02 | 인간 사이토크롬 ｐ450 2ｂ6 유전자의 변이 유전형 분석방법 |
Publications (2)
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| KR100658178B1 KR100658178B1 (ko) | 2006-12-14 |
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ID=37624024
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Country Status (1)
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|---|---|---|---|---|
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| KR100528625B1 (ko) | 2004-03-29 | 2005-11-15 | 학교법인 인제학원 | 시토크롬 ｐ450 2ｊ2 단백질의 기능이상과 관련된 표지인자로서의 유전자 |
| KR100528627B1 (ko) | 2004-03-29 | 2005-11-15 | 학교법인 인제학원 | 시토크롬 ｐ450 3ａ7 단백질의 기능이상과 관련된 표지인자로서의 유전자 |
-
2005
- 2005-03-02 KR KR1020050017111A patent/KR100658178B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100658178B1 (ko) | 2006-12-14 |
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