KR20060075212A

KR20060075212A - 생리활성을 갖는 제주조릿대 추출물

Info

Publication number: KR20060075212A
Application number: KR1020040113958A
Authority: KR
Inventors: 김세재; 강신해; 최수연; 박수영; 정완석; 고희철; 진영준; 윤훈석
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2004-12-28
Filing date: 2004-12-28
Publication date: 2006-07-04

Abstract

본 발명은 생리활성을 갖는 제주조릿대 추출물에 관한 것이다.

본 발명의 제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai) 추출물은, 제주조릿대 잎을 음건하는 제1공정, 음건한 제주조릿대잎을 마쇄기로 갈아 미세분말로 만들고, 이 미세분말을 80 % 메탄올에 침적한 다음, 이 메탄올 침적물을 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 추출하고, 그 상층액을 회수하여 감압 농축한 후, 이 농축물을 물에 현탁시킨 후에 헥산 또는 에틸아세테이트로 2차 추출하여 생리활성을 가지는 제주조릿대 추출물을 제조하는 것으로 구성된다.

본 발명에 의해, 항산화 활성, 항염활성, 항암활성 등이 우수한 생리활성을 가지는 제주조릿대 추출물이 제공되며, 본 발명의 제주조릿대 추출물을 활성성분으로 포함하는 각종 질병의 치료 및 예방용 조성물이 제공된다.

제주조릿대, 추출, 생리활성, 항산화, 항염, 항암

Description

생리활성을 갖는 제주조릿대 추출물{SASA QUELPAERTENSIS EXTRACTS HAVING PHYSIOLOGICAL ACTIVITY}

도 1은 본 발명의 제주조릿대 추출물의 제조공정도

도 2는 본 발명의 제주조릿대 추출물에 대한 항산화 효과를 나타내는 그래프

A : 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) 유리기 소거활성

B : 수퍼옥사이드 유리기 소거활성

C : 일산화질소(nitric oxide, NO) 유리기 소거활성

도 3은 본 발명의 제주조릿대 추출물에 대한 크산틴산화효소 저해활성을 나타내는 그래프

도 4는 본 발명의 제주조릿대 추출물이 HepG2 세포에 미치는 효과를 나타내는 그래프

A : Lactate dehydrogenase(LDH) 해리활성

B : MTT 환원활성

도 5는 본 발명의 제주조릿대 추출물이 산화스트레스에 대한 HepG2 세포의 생존능에 미치는 효과를 나타내는 사진

도 6은 본 발명의 제주조릿대 추출물에 대한 HepG2 세포내에서의 ROS MTT 측 정실험결과를 나타내는 그래프

도 7은 본 발명의 제주조릿대 추출물에 대한 세포독성실험 결과를 나타내는 그래프

A : 세포생존율 B : NO 생성량

도 8은 본 발명의 제주조릿대 추출물에 대한 RAW 세포에서의 iNOS 와 COX-2발현의 저해정도를 나타내는 실험결과

A : RAW264.7 세포에서의 iNOS 와 COX-2 발현의 저해정도를 나타내는 웨스턴 블랏 결과

B : NO 생성량을 나타내는 그래프

도 9는 본 발명의 제주조릿대 추출물에 대한 HL-60 세포의 성장억제 실험결과를 나타내는 그래프

도 10은 본 발명의 제주조릿대 추출물에 대한 농도별 HL-60 세포의 성장억제 실험결과를 나타내는 그래프

도 11은 본 발명의 제주조릿대 추출물에 대한 HL-60 세포에서의 DNA 단편화 결과사진

도 12는 본 발명의 제주조릿대 추출물에 대한 HL-60 세포에서의 세포사멸 유도효과를 나타내는 사진

조릿대는 대나무 중에서 가장 작은 대나무로서 우리나라 중부이남 지방의 산에 빽빽하게 무리 지어 흔히 자란다.

조릿대는 동의보감, 본초강목, 신농본초경에 따르면 조릿대는 인삼을 훨씬 능가한다고 할만큼 놀라운 약성을 지닌 약초이며, 대나무 중에서 약성이 제일 강하여 조릿대 한 가지만 써서 당뇨병, 고혈압, 위염, 위궤양, 만성 간염, 암 등의 난치병이 완치된 경우가 적지 않다고 한다.

또한, 조릿대는 열을 내리고 독을 풀며, 가래를 없애고 소변을 잘 나오게 하며, 염증을 치료하고 암세포를 억제하는 등의 효과가 있다고 알려져 있다.

그 중, 제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai)는 한라산 일대에서만 제한적으로 분포하는 지역 고유종으로 분포지 내에서 대규모의 군락을 이루어 생육하고 있으며, 내륙 지방의 조릿대와는 형태상의 특징으로 구별된다.

제주조릿대는 자원 식물학적으로는 열매에 저장 전분을 많이 함유하고 있어, 제주 지방에서는 예로부터 식량 기근시의 중요한 구황식물로 활용되어 왔으며, 앞으로도 자원식물로서 활용 가능성이 높은 식물로 알려져 있다(Kim, C. H.: Ecotypic Variation of Sasa quelpaertensis Nakai According to the Environmental Gradient of Habitats, Journal of Natural Science of Pusan Women's University, Vol 2, 21~36, 1996).

그러나, 제주조릿대를 이용한 기능성 식품 개발은 타 지역의 조릿대류에서 보고된 기능성 식품과 달리 거의 미개척분야로 독자적인 기술 및 물질을 확보할 수 있을 것으로 예상되며, 새로운 물질의 확보는 기능성 식품의 개발 뿐만 아니라 나아가서는 의약품 산업으로도 그 응용성이 크므로 많은 연구가 필요한 실정이다.

한국공개특허공보 특2003-0092446(씨형 간염 활성억제를 갖는 조릿대 추출물을 포함하는 조성물)에는, 극성 및 비극성 용매 가용 조릿대 추출물하고, 그 조릿대 추출물을 포함하는 C형 간염의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.

한국등록특허공보 10-0417243(항염증 활성을 지닌 분죽 추출물을 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물)에는, 분죽(솜대) 조추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.

또, 한국공개특허공보 특2003-0021640(항산화 활성이 있는 맹종죽엽 추출물 및 그 제조방법)에는, 맹종죽엽을 에탄올 환류추출과 추출물의 에탄올 침전을 통한 고분자물질이 제거된 획분을 유기용매분획을 이용하여 활성물질을 정제한 항산화활성이 있는 맹종죽엽 추출물에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나, 상기와 같이 아직까지는 종래의 조릿대나 대나무 종류의 추출물에 비해 월등히 생리기능 활성이 우수한 제주조릿대 추출물에 대한 연구가 이루어지지 않고 있는 실정이다.

본 발명은 항산화 활성, 항염활성, 항암활성 등이 우수한 생리활성을 가지는 제주조릿대 추출물이 제공된다.

또한, 본 발명의 제주조릿대 추출물을 활성성분으로 포함하는 각종 질병의 치료 및 예방용 조성물이 제공된다.

본 발명의 제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai) 추출물은, 제주조릿대 잎을 음건하는 제1공정, 음건한 제주조릿대잎을 마쇄기로 갈아 미세분말로 만드는 제2공정, 제2공정의 미세분말을 80 % 메탄올에 침적하는 제3공정, 제3공정의 메탄올 침적물을 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 추출하는 제4공정, 제4공정의 추출액의 상층액을 회수하여 감압 농축하는 제5공정, 제5공정의 농축물을 물에 현탁시키는 제6공정, 제6공정의 현탁액을 헥산과 에틸아세테이트로 순차적으로 추출하여 각 분획의 추출액을 얻는 제7공정을 거쳐 생리활성을 가지는 제주조릿대 추출물을 제조하는 것으로 구성된다.

본 발명의 주 재료인 제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai)는 한라산 일대에서만 제한적으로 분포하는 지역 고유종으로 분포지 내에서 대규모의 군락을 이루어 생육하고 있으며, 내륙 지방의 조릿대와는 형태상의 특징으로 구별된다.

제주조릿대는 자원 식물학적으로는 열매에 저장 전분을 많이 함유하고 있어, 제주 지방에서는 예로부터 식량 기근시의 중요한 구황식물로 활용되어 왔으며, 앞으로도 자원식물로서 활용 가능성이 높은 식물로 알려져 있다.

본 발명은 이러한 제주조릿대를 이용하여 생리활성이 큰 추출물을 제조하고, 그 생리활성을 가진 제주조릿대 추출물을 활성성분으로 하는 치료용 및 예방용 조성물로서의 가능성을 모색하는 데 목적을 두고 연구를 하였다.

제주조릿대 잎을 80 % 메탄올로 추출하고 극성이 다른 4가지 용매(메탄올, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올)로 분획하여 DPPH에 의한 수소공여능 측정과 수퍼옥사이드 유리기의 소거활성, NO 생성 저해 활성, 크산틴산화효소 활성억제 효과 및 세포독성 등의 생리 활성을 측정하였다(도 2, 3).

그 결과, 제주조릿대의 분획물들 중 전반적으로 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높은 항산화 활성을 나타내었으며, 헥산 분획물에서도 비교적 높은 활성억제률을 보여주었다(도 4).

조릿대추출물을 사람의 간암세포주의 일종인 HepG2 세포주에 처리하여 세포의 생존능을 조사하였는데, 그 결과 조릿대 분획물들은 HepG2 세포주의 생존능에 커다란 영향을 주지 않는 것으로 나타났고 오히려 조릿대 추출물이 세포증식을 유도하는 경향을 보였다 또한 조릿대분획물의 세포독성 여부를 알아보기위해 lactate dehydrogenase(LDH)의 활성을 조사한 결과 H₂O₂에 의해 증가한 세포독성이 대체로 감소시키는 경향을 나타내었다(도 5).

그리고, HepG2 간암세포주를 과산화수소(Hydrogen peroxide) 처리후 세포내 활성산소물질(reactive oxygen species, ROS)의 함량변화를 측정하였는데, 실험결과 조릿대 분획물들은 HepG2세포에서 의미있는 ROS 소거능을 나타내지 않았으나 에 틸아세테이트와 헥산 분획물에서만 약간의 항산화 활성이 보였다(도 6).

제주조릿대 잎의 뮤린 대식세포주인 RAW264.7 세포로부터의 LPS 자극에 의한 NO의 형성억제 효과 및 iNOS의 발현, COX-2의 생성 및 활성저해 정도를 알아본 결과, 헥산 분획물과 에틸아세테이트 분획물에서 저농도로 처리시에도 NO의 생성량이 현저히 저해되었으며(도 7), iNOS와 COX-2의 단백질 발현도 저해됨을 확인할 수 있었다. 특히 에틸아세테이트 분획물에서가 그 억제 효과가 가장 강하게 나타났다(도 8).

또한, 전골수성 백혈병 세포주인 HL-60 세포를 이용하여 제주조릿대 잎 추출물과 용매분획물이 HL-60 세포의 성장을 억제하는지 조사하고, 그 증식 억제작용이 세포사멸 유도에 의한 것인지 알아본 결과, 에틸아세테이트 분획물에서 세포 증식에 대한 억제율이 가장 높게 나타났으며(도 9, 10), 세포사멸(apoptosis) 유도에 의하여 나타나는 DNA단편화 현상도 가장 잘 관찰되었다(도 11). 또한 에틸아세테이트 분획물 25 ㎍/㎖으로 처리시 세포의 크기가 축소되며, 핵의 모양이 불규칙하고 부분적인 핵의 응집현상을 관찰할 수 있었으며, sub-G1 hypodiploid 세포가 증가됨을 확인할 수가 있었다(도 12).

이하, 본 발명의 제주조릿대 추출물에 대하여 실시예와 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 생리활성을 가지는 제주조릿대 추출물 제조

제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai)는 2004년 4월경 제주 교래리(물찻오 름) 지역에서 채집하여 신엽만을 준비하였다.

제주조릿대 잎 1.5 ㎏을 음건한 다음 마쇄기로 갈아 미세분말로 만들었다.

준비한 제주조릿대잎 분말을 80 % 메탄올에 침적하고 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 추출하였다.

이 추출액의 상층액을 회수하여 감압 농축하였다.

농축한 메탄올 추출물을 물에 현탁시킨 후에 헥산과 에틸아세테이트로 순차적으로 추출하여 본 발명의 제주조릿대 추출물을 제조하였다.

<실험예 1> 본 발명의 제주조릿대 추출물에 대한 항산화 활성실험

항산화 물질의 가장 특징적인 기작은 유리기와 반응하는 것으로 유리기 소거 작용은 자유 유리기(free radical)에 전자를 공여하여 식물 중의 항산화 효과나 인체에서 노화를 억제하는 척도로 사용된다.

DPPH는 안정한 유리기로 cysteine, glutathione과 같은 함유황 아미노산과 ascorbic acid, aromatic amine(ρ-phenylenediamine, ρ-aminophenol) 등에 의해 환원되어 탈색되므로 항산화 물질의 항산화능 측정에 많이 이용되고 있다(Blois, M. S. 1958. Antioxidant determination by the use a stable free radical. Nature 26: 1199-1200 ).

따라서, 다음과 같이 본 발명의 제주조릿대 추출물에 대한 항산화 활성실험을 하였다.

1. 실험재료준비

제주조릿대 잎 1.5 ㎏를 음건한 다음 마쇄기로 갈아 미세말로 하여 각각의 미세말 시료를 80 % 메탄올에 침적하고 초음파를 이용하여 1시간씩 3회 추출하였으며, 그 후 상층액을 회수하여 감압 농축하여 메탄올 추출물 64.07 g를 얻었다. 그리고 농축한 잎의 메탄올 추출물 60 g을 증류수 1 ℓ에 현탁시킨 후에 헥산(1 ℓ × 3), 에틸아세테이트(1 ℓ× 3), 부탄올(1 ℓ × 3)로 각각 추출하여 각각의 분획물을 진공 건조하여 헥산 4.36 g, 에틸아세테이트 3.6 g, 부탄올 23.67 g, 물 층 19.07 g를 얻어 실험에 사용하였다.

2. 전자공여능 측정

전자공여능(electron donating ability) 측정은 Blosis 방법(Blois, M. S. 1958. Antioxidant determination by the use a stable free radical. Nature 26: 1199-1200)에 의한 DPPH 유리기 소거법에 따라 측정하였다.

즉, 메탄올에 녹인 시료의 각각의 농도를 96 well plate에 100 ㎕씩 분주하고 0.4 mM DPPH용액을 동량 첨가하여 실온에서 10 분간 방치한 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였는데, 대조군으로는 부틸하이드록시아니솔(butylated hydroxy anisole ; BHA) 및 트롤록스(trolox)를 사용하였다.

DPPH 유리기 소거활성은 아래의 식으로부터 산출하였고 DPPH의 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC₅₀)로 표시하였으며, 각 시료는 3 회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.

[DPPH radical 소거활성(%) = (A_control - A_sampl)/A_control × 100]

* A_sample는 시료를 첨가한 반응액의 흡광도임.

* A_control는 시료대신 메탄올을 첨가한 반응액의 흡광도임.

상기와 같이 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)의 자유유리기 소거활성으로 제주조릿대 잎 추출물 및 분획물 시료의 항산화 활성을 측정한 결과, 에틸아세테이트와 부탄올 분획물에서 다른 용매 분획물에 비해 비교적 높은 라디칼 소거 활성을 나타냈으며, 그 중 에틸아세테이트 분획물에서 제일 높은 라디칼 소거 활성을 보여주었다(도 2).

3. NO 유리기 소거활성 측정실험

NO는 활성질소종으로서 세포독성이 강하며 다량의 NO가 생성되면 nitrosation, ntration과 같은 간접적 효과 및 산화반응을 야기하여 유해한 효과를 나타내게 된다.

특히, 대식세포가 활성화 되면서 생성되는 NO는 주위조직에 세포독성을 나타내는 것으로 유명한데, NO의 반감기는 6~10초로 대단히 짧아 실질적으로 직접 검출하여 연구하는데 어려움이 많으므로 대부분의 NO 연구는 NOS 발현 유무나 NO의 안 정화된 부산물인 nitrite, nitrate를 측정하여 간접적으로 이루어지고 있다고 알려져 있다.

본 실험에서는 자연적으로 산화질소(nitric oxide)을 생성하는 물질인 sodium nitroprusside (SNP)를 사용하여 시료의 nitric oxide 소거 활성을 측정하였다(Green L. C., Wagner D. A., Glogowski J., Skipper P. L., Wishnok J. S., Tannenbaum S. R., Analysis of nitrate, nitrite, and (15N)nitrate in biological fluidsAnal. Biochem., 126, 131-136 (1982). : Marcocci L., Maguire J. J., Droy-Lefaix M. T., Packer L., The nitric oxide-scavenging properties of Ginkgo biloba extract EGb 761, Biochem.Biophys. Res. Commun., 201, 748-755 (1994)).

10 mM SNP 용액 200 ㎕에 시료를 농도별로 첨가하고 25 ℃에서 3 시간 동안 반응시켰다.

반응이 끝난 후 반응액과 동일한 양의 Griess시약 [2.5 % (v/v) phosphoric acid에서 1 % (w/v) sulfanilamide와 0.1 % (w/v) naphylethylenediamine]을 첨가하였다.

실온에서 10 분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염(nitrite)의 양으로 산화질소 소거활성을 산출하였다.

NO 소거활성은 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도 (IC₅₀)로 표시하였다.

본 발명의 제주조릿대 추출물의 NO 생성 저해 활성 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서와 같이 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높은 NO 생성 저해 활성을 나타냈으며 헥산 분획물에서도 다소 높은 활성을 보여주었다.

NO 생성 저해 활성이 가장 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물의 IC₅₀ 값은 76.4 ㎍/㎖로 나타났다.

4. 크산틴산화효소 억제 및 수퍼옥사이드 유리기 소거 활성 측정실험

크산틴산화효소(Xanthine oxidase)는 산화적 환경에서 xanthine dehydrogenase로부터 생성된다.

Xanthine oxidase는 hypoxanthine을 산화시켜 최종적으로 요산(uric acid)과 산소를 생성하며 산소유리기와 수소과산화기가 이 산소로부터 발생하게 된다.

요산의 축적은 고요산혈증과 통풍을 유발하는 것으로 알려져 있으므로 요산 형성의 억제제가 이들 질환을 위한 치료 물질로서 유용할 것이다.

게다가, 크산틴산화효소에 의해 생성된 산소유리기는 세포의 손상을 초래한다고 알려져 있다.

그러므로, 산소 유리기를 소거할 수 있는 물질 또한 산화적 손상의 예방에 유용할 것이다.

따라서, 본 실험에서는 제주조릿대 추출물의 크산틴산화효소(xanthine oxidase) 저해효과를 알아보았다.

Xanthine/xanthime oxidase에 의한 요산 생성은 290 nm에서 증가된 흡광도에 의해 측정하였고 수퍼옥사이드의 양은 nitroblue tetrazolium (NBT) 환원방법에 의해 측정하였다(Cheng, Z. J., S. C. Kuo, S. C. Chan, F. N. Ko, and C. M. Teng. 1998. Antioxidant properties of butein isolated from Dalbergia odorifera. Biochim. Biophys. Acta, 1392: 291-299.).

반응액은 각 시료의 여러 농도와 0.5 mM xanthine와 1 mM EDTA를 200 mM phosphate buffer (pH 7.5) 100 ㎕에서 준비하였고, 50 mU/ml xanthine oxidase를 첨가하여 uric acid의 생성을 유도하였다.

본 발명의 제주조릿대 추출물 및 분획물 시료의 크산틴산화효소 활성 억제에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.

크산틴산화효소(Xanthine oxidase) 억제활성은 각각 생성된 요산(uric acid)의 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC₅₀)로 표시하였다.

에틸아세테이트 분획물이 가장 높은 크산틴 산화효소 활성 억제을 나타냈으며 헥산 분획물에서도 비교적 높은 활성억제률을 보여주었다.

크산틴산화효소 활성 억제가 가장 좋았던 에틸아세테이트 분획물의 IC₅₀ 값은 77.2 ㎍/㎖로 나타났으며, 크산틴산화효소 활성 억제에 대한 이들의 활성 순서는 DPPH 유리기 소거 활성 순서와는 달리 에틸아세테이트 > 헥산 > 부탄올 순이었다.

또한, 본 발명의 제조조릿대 추출물에 대하여 수퍼옥사이드 유리기 소거활성에 대해 측정을 하였다.

정상적인 oxidative phosphylation의 과정동안 소모되는 전체 산소의 0.4 ~ 4 % 정도는 자유라디칼 수퍼옥사이드(free radical superoxide (·O₂ ^-)로 전환되며 생성된 ·O₂ ^-는 다른 활성산소물질(reactive oxygen species ; ROS)로 전환되어 직접적 또는 간접적으로 세포손상을 유발하는 것으로 알려져 있다.

정상적으로는 ·O₂ ^-는 내인성 항산화 방어기전에 의해 superoxide dismutase (SOD)에 의해 빠르게 과산화수소로 전환된다(Korycka-Dahl M, Richardson T, Hicks CL. Superoxide dismutase activity in bovine milk serum. J. Food Prot. 42: 867-871 (1979)).

그러나, 이 내인성 항산화 방어체계가 세포내 산화-환원 균형을 유지하는데에 문제가 생길 경우 결과적으로 산화스트레스가 일어나게 되며, 이 산화스트레스는 직접적으로 세포내 거대분자의 손상을 일으키거나 세포손상을 일으키는데 중요한 역할을 한다.

수퍼옥사이드(Superoxide) 소거활성은 위 반응액에 0.5 mM NBT를 첨가하여 반응 시켰다.

수퍼옥사이드(superoxide) 유리기 소거활성은 생성된 수퍼옥사이드의 흡광도가 50 % 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC₅₀)로 표시하였다.

수퍼옥사이드 라디칼 소거활성에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.

즉, 에틸아세테이트 분획물이 가장 높은 수퍼옥사이드 유리기 소거활성을 나타냈으며, 헥산 분획물에서도 비교적 높은 수퍼옥사이드 유리기 소거활성을 보여주었다.

수퍼옥사이드 유리기 소거활성이 가장 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물의 IC₅₀ 값은 107.8 ㎍/㎖로 나타났으며, 이들의 활성은 Xanthine oxidase 활성 억제 결과 유사한 에틸아세테이트 > 헥산 > 부탄올 순이었다.

<실험예 2> 본 발명의 제주조릿대 추출물이 HepG2 세포의 생존능에 미치는 효과를 실험

제주조릿대 추출물이 HepG2 세포의 생존능에 미치는 효과를 실험하기 위해 사람의 간암세포주의 일종인 HepG2 세포주에 처리하여 세포의 생존능을 조사하였다.

본 실험에서는 HepG2 세포를 영양결핍배지(serum-free midium)에서 24 시간동안 배양한 후에 조릿대 추출물을 농도군(12.5, 25, 50, 100, 500, 1000 ㎍/㎖)에 따라 1 시간동안 전처리하고 그 다음으로 H₂O₂ (1 mM)를 24시간 처리한 후에 세포 생존능의 변화를 조사하였다.

세포는 100 U/㎖ 페니실린(penicillin), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (streptomycin), 10 % 우태아혈청(fetal bovine serum)이 포함된 Dulbecco's minimal essential medium(D-MEM)을 사용하여 5 % CO₂와 37 ℃가 유지되는 배양기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3 ~ 4일에 한번씩 시행하였다.

2. MTT assay

MTT assay는 세포의 mitochondria의 활성을 측정하여 간접적으로 세포의 생존여부를 측정하는 방법이다. 세포 배양후 배양액을 제거하고 200 ㎕ 의 MTT reagent (Sigma)를 섞어 37 ℃에서 30 분 내지 1 시간정도 반응시킨 후 반응액을 제거하고 200 ㎕의 이소프로파놀(isopropanol)을 첨가하여 발색반응을 유도하고 흡광도는 570 nm에서 측정하였다.

3. LDH cytotoxicity detection

LDH는 대부분의 세포에 존재하는 stable cytoplasmic enzyme으로서 원형질막이 손상을 입으면 세포배양액으로 방출된다.

따라서, 손상을 입은 세포가 방출하는 LDH 활성을 측정하는 간편하고 간단한 비색분석법이다.

본 실험에서는 LDH cytotocixity detection kit(Takara)를 사용하여 492㎚에서 활성을 측정하였다.

4. H33342 염색

세포의 생존이나 세포사멸의 여부를 조사하기 위해 세포내 DNA에 특이적으로 결합하는 형광색소인 H33342(Sigma)를 배양중인 세포에 넣고 37 ℃에서 30 분간 배양후 CoolSNAP-Pro color digital camera가 장착된 형광현미경하에서 관찰하였다.

세포핵의 응축정도와 apoptotic body의 형성여부를 관찰하여 세포의 생존 또는 세포사멸의 지표로 사용하였다.

5. 실험결과

본 실험의 결과 조릿대 분획물들은 HepG2 세포주의 생존능에 커다란 영향을 주지 않는 것으로 나타났고, 오히려 조릿대 추출물이 세포증식을 유도하는 경향을 보였다(도 4, 도 5).

또한, 조릿대분획물의 세포독성 여부를 알아보기위해 LDH의 해리활성을 조사한 결과 H₂O₂에 의해 증가한 세포독성이 대체로 감소시키는 경향을 나타내었다.

그러나, MTT assay 결과는 단순히 세포의 생존여부의 지표이므로 세포의 죽음형태가 세포괴사(necrosis)인지 아니면 세포사멸(apoptosis)인 지를 구분하기위해 H33342 염색방법으로 검증하였다(도 5).

각각의 조릿대 분획물들은 H₂O₂ 에 의해 유도되는 세포사멸 현상을 농도 의존적으로 억제하는 결과를 얻었다.

결론적으로 H33342 염색결과는 MTT assay의 결과와 유사한 결과를 보여주고 있으며, 조릿대 분획물이 농도의존적으로 H₂O₂에 의해 유도되는 세포사멸현상을 억 제할 수 있는 것으로 나타났다.

<실험예 3> 세포내에서의 ROS 측정실험

1. 실험방법

본 발명의 제주조릿대 분획물들을 다양한 농도군(12.5, 50, 100, 500 ㎍/㎖)에 따라 처리하여 분획물의 항산화 활성(anitoxidant activity)을 검증하였다.

먼저 HepG2 간암세포주를 영양결핍배지에서 24 시간동안 배양한 후에 각각의 분획물들을 1시간동안 전처리하고 그 다음으로 H₂O₂(1 mM)를 처리하였다.

과산화수소(Hydrogen peroxide) 처리후 15분 후에 세포내 활성산소물질 (reactive oxygen species, ROS)의 함량변화를 측정하였다.

형광표지인자인 H₂DCFDA (2'-7'-dichlorofluoresin diacetate)를 사용하여 세포내에 과산화수소(hydrogen peroxide)가 있을 경우에 발광하는 형광의 세기를 ROS의 지표로 간주하였다.

2. 실험결과

실험결과 조릿대 분획물들은 HepG2세포에서 의미있는 ROS 소거능을 나타내지 않았다(도 6).

에틸아세테이트와 헥산분획물에서만 약간의 항산화 활성이 보였다.

<실험예 4> 본 발명의 제주조릿대 추출물에 대한 항염활성 실험

내독소로 잘 알려진 LPS는 그람음성균의 세포외막에 존재하며, RAW264.7와 같은 마크로파지(macrophage) 또는 모노사이트(monocyte)에서 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 염증매개성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

또한, 이러한 염증매개 물질의 형성은 포스포리파아제(phospholipase) A2의 활성으로 인해 아라키도산(arachidonic acid)이 프로스타글라딘(prostagladin)으로 바뀌는 과정 및 NO형성 과정으로 이어지게 된다고 알려져 있다.

NO는 산화질소합성효소(NO synthas ; NOS)에 의해 엘아르기닌(L-arginine)으로부터 생성되는 무기유리체로 면역반응, 세포소성, 신경전달계 및 혈관이완 등 여러 가지 생물학적인 과정에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 농도에 따라 세포 기능유지에 중요한 작용을 하기도 하고 세포독성을 일으키기도 한다고 알려져 있다.

NO를 생산하는 NOS는 세포내에 존재하여 칼슘이나 칼모둘린(calmodulin)에 의존적인 형태인 구성형 산화질소합성효소(constitutive NOS; cNOS)와 칼슘에 비의존적으로 대식세포나 혈관내피세포가 활성화되거나 지질다당류(lipopolysaccharide ; LPS)와 같은 세균의 내독소나 여러 가지 사이토킨(cytokine)에 의해 유도되는 형태인 유도형 산화질소합성효소(inducible NOS; iNOS)의 형태가 있다.

LPS 자극에 의해 발현된 iNOS는 많은 양의 NO를 생성하게 되며 이에 의한 세포독성은 염증반응, 세포의 돌연변이 및 종양 발생 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다.

염증반응과 관련된 조직 손상에서 NO와 iNOS의 발현이 증가되어 있음이 보고되어 있다.

이에 본 실험에서는 제주조릿대 잎의 뮤린 대식세포주인 RAW264.7 세포로부터의 LPS 자극에 의한 NO의 형성억제 효과 및 iNOS의 발현, COX-2의 생성 및 활성저해 정도를 알아보았다.

1. 세포배양

마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포는 KCLB(Korean Cell Line Bank)로 부터 분양 받아 100 units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신과 10 % 우태혈청(fetal bovine serum;FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3 ∼ 4일에 한번씩 시행하였다.

지질다당류(LPS. E. coli serotype 0111:B4)는 Sigma로부터 구입하여 실험에 사용하였다.

2. 세포독성 실험

1) MTT assay

RAW264.7 세포를 1.0 ×10⁵ cells/㎖의 농도로 48 well plate의 각 well에 넣고 24시간 배양 후, 시료를 농도별로 첨가하였다.

이를 24 시간 배양한 다음, MTT 100 ㎍을 첨가하고 3 시간 동안 더 배양하였 다.

배지를 제거한 다음, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide ; DMSO, Sigma) 150 ㎕를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 포마즌(formazan) 침전물을 용해시킨 후 분광광도계(microplate reader)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 성장억제정도를 조사하였다.

2) LDH cytotoxicity detection

본 실험에서는 RAW264.7 세포를 1.0 × 10⁵ cells/㎖의 농도로 48 well plate의 각 well에 넣고 24 시간 동안 배양 후, 시료를 농도별로 첨가하여 세포배양이 끝난 후 LDH의 유출을 측정하여 세포의 손상정도를 조사하였다.

LDH cytotoxicity detection kit(Takara)를 사용하여 492 ㎚에서 활성을 측정하였다.

3. NO 생성 억제률 검색

RAW264.7 세포를 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.0 × 10⁵cells/㎖로 조절한 후 48 well plate 에 접종하고, 시험물질과 LPS (1㎍/㎖)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다.

생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하였다.

세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess시약 [1 % (w/v) sulfanilamide, 0.1 % (w/v) naphylethylenediamine in 2.5 % (v/v) phosphoric acid] 100 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10 분동안 반응시킨 후 530 nm에서 흡광도를 측정하였다.

생성된 NO의 양은 sodium nitrite(NaNO₂)를 standard로 비교하였다.

4. Western blot analysis

RAW264.7 세포(1.0 ×10⁵ cells/㎖)에 제주 조릿대의 추출물 및 분획물을 농도별로 각각 처리 후 세포를 수집하였다.

세포를 2 ∼ 3 회 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척 후 1 ㎖의 lysis buffer을 첨가, 30분 ∼ 1시간동안 lysis 시킨후 12,000 rpm에서 20 분간 원심하여 세포막 성분 등을 제거하였다.

단백질 농도는 BSA (Bovine serum albumin)을 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다.

30 ∼ 50 ㎍의 lysate를 8 ∼ 12 % mini gel SDS-PAGE(Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)로 변성 분리하여, 이를 PVDF membrane(BIO-RAD)에 200 mA로 2 시간 동안 transfer하였다.

그리고 membrane의 blocking은 5 % skim milk가 함유된 TTBS (TBS + 0.1% Tween 20) 용액에서 상온에서 2 시간동안 실시하였다.

iNOS의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS (1: 1000) (CALBIOCHEM)을 COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2 (1: 1000) (Cell Signaling)을 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2 시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다.

2차 항체로는 HRP (Horse Radish Peroxidase)가 결합된 anti-mouse 또는 anti-rabbit IgG(Amersham Co.)를 1: 5000으로 희석하여 상온에서 30 분 간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL 기질(Amersham Co.)과 1∼3분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.

5. 실험결과

본 발명의 제주조릿대 추출물에 대한 항염활성 실험결과, 제주조릿대 잎의 메탄올 추출물의 RAW264.7 에서의 세포독성은 실험에 사용된 농도에서는 거의 세포독성을 나타내지 않았지만, 에틸아세테이트와 헥산 분획물을 고농도로 처리시에는 다소 독성을 나타내었다(도 7).

이에 NO 생성 억제 효과를 세포독성이 나타나지 않는 농도로 처리하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂ ^- 의 형태로 측정하였다.

그 결과, LPS단독 처리군에서는 NO가 과량 생성되는 것을 확인할 수 있었으며, 제주조릿대 잎의 추출물 및 분획물을 같이 처리시 농도 의존적으로 그 생성량이 감소됨을 확인할 수 있었으며, 특히 헥산 분획물과 에틸아세테이트 분획물에서 저농도로 처리시에도 NO의 생성량이 현저히 저해됨을 볼 수 있었다(도 7 ).

LPS (1 ㎍/㎖)를 사용하여 RAW264.7 세포에서 iNOS와 COX-2의 생성을 유도한 후 제주 조릿대 잎에 의한 저해 정도를 Western blot를 통해 알아 보았다.

그 결과 에틸아세테이트 분획물과 헥산 분획물에서 iNOS의 단백질 발현이 현저히 저해되는 것을 확인할 수 있었으며(도 8), iNOS의 단백질 발현 억제 결과와 마찬가지로 현저히 COX-2의 단백질 발현도 저해됨을 확인할 수 있었다(도 8).

특히, 에틸아세테이트 분획물에서가 그 억제 효과가 가장 강하게 나타났다.

<실험예 5> 본 발명의 제주조릿대 추출물에 대한 항암활성 실험

1. 세포배양

급성 전골수성 백혈병 환자에서 유래한 HL-60 세포주를 한국 세포주 은행(KCLB)으로부터 분양 받아 100 units/㎖의 penicillin-streptomycin(GIBCO)과 10 %의 fetal bovine serum(FBS, GIBCO)가 함유된 RPMI 1640 배지(GIBCO)를 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3 ~ 4일에 한번씩 시행하였다.

2. 세포의 대사활성 측정

제주조릿대의 HL-60 세포에 대한 증식억제는 세포의 대사활성을 측정하여 알아보았다.

HL-60 세포 (2.5 × 10⁵/㎖)를 96 well plate의 각 well에 넣고, 시료를 농도별로 첨가하였다.

이를 4 일간 배양한 다음, 3-(4,5-dimehtylthiazol)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma) 100 ㎍을 첨가하고 4 시간 동안 더 배양하였다.

Plate를 1,000 rpm에서 10 분간 원심분리하고 조심스럽게 배지를 제거한 다음, dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma) 150 ㎕를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 formazan 침전물을 용해시킨 후 microplate reader(BIO-TEK INSTRUMENIS. INC)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3. Analysis for DNA fragmentation

HL-60 세포 (3.5 ×10⁵/㎖)에 제주조릿대의 추출물 및 용매 분획물을 처리한 다음 48 시간 동안 배양하였다.

세포를 수집한 후 Promega Wizard^®Genomic DNA Purification Kit를 사용하여 DNA를 분리하였다.

분리한 DNA를 1.5 % agarose gel에서 30 분(100 V)동안 전기영동을 한 다음 ethidium bromide로 염색하고 UV transilluminator하에서 DNA단편화 현상을 관찰하였다.

4. 핵의 형태학적 변화(Morphological changes) 측정

세포사멸의 형태학적 특징 중의 하나인 핵의 변화를 관찰하기 위해 HL-60 세포 (3.5 × 10⁵/㎖)에 제주조릿대의 용매 분획물을 처리한 다음 48 시간 동안 배양하여 DNA 특이적으로 결합하는 생체 형광 염색액인 H33342를 사용하여 DNA를 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다.

5. 세포주기 분석(Cell cycle analysis)

HL-60 세포 (3.5 × 10⁵/㎖)에 제주조릿대 분획물을 처리하여 48 시간 동안 배양한 후, HL-60 세포를 수확하여 PBS로 세척하였다.

HL-60 세포를 -20 ℃에서 70 % 에탄올로 30 분동안 고정시킨 후, PBS로 세척하고, RNase A를 처리한 다음에 propidium iodide (PI, Sigma)로 염색하고, Flow Cytometer로 세포주기를 분석하였다.

6. 실험결과

1) 제주조릿대 추출물의 HL-60세포 성장 억제실험결과

제주조릿대 잎의 메탄올 추출물 및 용매분획물의 HL-60 세포의 성장에 대한 효과는 테트라졸리움염(tetrazolium salt)의 하나인 MTT를 사용하여 MTT의 환원에 의해 생성되는 포마즌(formazan)의 흡광도로 측정하였다.

제주조릿대 잎의 80 % 메탄올 추출물을 100 ㎍/㎖의 농도 처리시 약 33.73 %의 세포증식 억제효과를 보였으며, 헥산 분획물에 의하여 79.45 %, 에틸아세테이트 분획물에 의하여 90.07 %, 부탄올 분획물에 의하여 39.41 %의 HL-60 세포 증식 억제 효과를 확인하였다(도 9).

그 중, 억제 효과가 가장 좋은 에틸아세테이트 분획물을 여러 농도로 처리하였을 때, 16.25 ㎍/㎖ 농도에서 44.05 %, 32.5 ㎍/㎖ 농도에서 63.08 %, 65 ㎍/㎖농도에서 71.95 %과 125 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 약 90 % 이상의 세포 성장 억제 효과를 보였다(도 10).

이때, 에틸아세테이트 분획물의 IC₅₀ 값은 23.68 ㎍/㎖로 나타났다.

2) 제주조릿대 추출물의 HL-60세포 세포사멸 유도효과

제주조릿대 잎 추출물에 의한 HL-60 세포 증식억제 작용이 세포사멸(apoptosis) 유도에 의한 것인지 그 기전을 알아보기 위하여, 세포사멸 유 도에 의하여 나타나는 DNA 단편화 현상을 전기영동으로 관찰하였다.

제주조릿대 잎의 용매 분획물을 HL-60 세포에 48 시간동안 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 헥산 및 에틸아세테이트 분획물을 처리시 HL-60 세포에서 DNA단편화 현상을 가장 잘 확인할 수 있었다(도 11).

이에 에틸아세테이트 분획물에서 얻은 추출물(25 ㎍/㎖)을 갖고 세포사멸이 일어난 세포에서 볼 수 있는 가장 특징적인 변화인 형태학적 관찰을 실시하였다.

그 결과, 정상세포들의 핵들의 형태는 정상적인 둥근형태이나 에틸아세테이트 추출물이 처리된 세포에서는 세포의 크기가 축소되며, 핵의 모양이 불규칙하고 부분적인 핵의 응집현상을 관찰할 수 있었다(도 12).

세포사멸(Apoptosis) 기전에 대하여는 확실하게 증명된 바는 없지만 세포질내 칼슘치가 증가되어 칼슘의존성 내부절단효소(endonuclease)가 활성화되어 핵내 DNA 분절이 일어나며, 트랜스글루타미나제(transglutaminase)가 활성화되어 세포질내 단백질의 교차결합(cross-linking)이 일어나면서 세포질 농축이 일어나고 수액이 세포밖으로 빠져나가면서 고사체(apoptotic bodies)를 형성하는 것으로 알려져 있다.

또한, 제주조릿대 잎 추출물에 의한 세포사멸 유도에 의하여 Sub-G1 hypodiploid 세포가 증가하는지 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 PI를 처리하여 유세포분석기로 분석하였다.

제주조릿대 잎의 에틸아세테이트 분획물을 25 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 48시간 동안 배양 후 측정한 결과, sub-G1 hypodiploid 세포가 증가되는 됨을 확인할 수가 있었다(도 12).

본 발명에 의해, 항산화 활성, 항염활성, 항암활성 등이 우수한 생리활성을 가지는 제주조릿대 추출물이 제공된다.

Claims

조릿대추출물의 제조방법에 있어서,

제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai) 잎을 음건하는 제1공정,

음건한 제주조릿대잎을 마쇄기로 갈아 미세분말로 만드는 제2공정,

제2공정의 미세분말을 80 % 메탄올에 침적하는 제3공정,

제3공정의 메탄올 침적물을 초음파를 이용하여 1 시간씩 3 회 추출하는 제4공정,

제4공정의 메탄올 침적물의 상층액을 회수하여 감압 농축하는 제5공정,

제5공정의 농축물을 물에 현탁시키는 제6공정,

제6공정의 현탁액을 유기용매로 2차 추출하는 제7공정을 거쳐 제주조릿대 추출물을 제조하는 것으로 구성된,

생리활성을 가지는 제주조릿대 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,

제7공정의 2차추출물 제조시, 제6공정의 현탁액에 헥산과 에틸아세테이트로 순차적으로 추출하는 것이 특징인,

생리활성을 가지는 제주조릿대 추출물의 제조방법.
제1항 또는 제2항의 방법에 의해 제조된,

생리활성을 가지는 제주조릿대 추출물.
제3항의 제주조릿대 추출물에 있어서,

항산화활성과 항염활성과 항암활성을 나타내는 것이 특징인,

제주조릿대 추출물.