KR20060034061A - 헴옥시게나제-1의 유도물질 또는 헴옥시게나제에 의해발생되는 일산화탄소 공급체를 함유하는 자가면역질환치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헴옥시게나아제-1 유도물질 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 T-세포 관련 질환인 자가면역질환을 치료 및 예방하기 위한 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 헴옥시게나아제-1 유도물질 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 항염증 및 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 상기 조성물은 헴옥시게나제-1에 의해 발생하는 일산화탄소가 IL-2의 생산을 저해시켜 T-세포의 증식을 억제함으로써 T-세포와 관련된 여러 가지 질환을 치료 및 예방할 수 있다.

헴옥시게나제-1, 일산화탄소, IL-2, T-세포, 자가면역질환, 류마티스 관절여염, 항염증 조성물, 항암용 조성물

Description

헴옥시게나제-1의 유도물질 또는 헴옥시게나제에 의해 발생되는 일산화탄소 공급체를 함유하는 자가면역질환 치료용 조성물{Pharmaceutical composition containing HO-1 inducer and CO donor to treat autoimmune disease }

도 1은 헴옥시게나제-1 부산물의 발생과정을 보여주는 모식도이다.

도 2는 헴옥시게나제-1이 T-세포 증식 억제에 있어서 미치는 영향을 보여준다.

도 3은 헴옥시게나제-1 부산물의 생체내의 역할을 보여주는 그림이다.

도 4는 일산화탄소가 CD4+ T-세포의 증식 억제에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.

도 5는 CD4+ T-세포의 증식에서 일산화탄소가 IL-2의 분비를 억제함을 보여주는 그래프이다.

도 6은 CD4+ T-세포에서 일산화탄소가 인산화된 ERK의 저해효과를 보여주는 그래프이다.

본 발명은 헴옥시게나아제-1 유도물질 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 T-세포 관련 질환인 자가면역질환을 치료 및 예방하기 위한 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 헴옥시게나아제-1 유도물질 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 상기 조성물은 헴옥시게나제-1에 의해 발생하는 일산화탄소가 IL-2의 생산을 저해시켜 T-세포의 증식을 억제함으로써 T-세포와 관련된 여러 가지 질환을 치료 및 예방할 수 있다.

인간의 적혈구의 수명은 약120일(생쥐는 60일)로 전적혈구의 약 0.8％가 매일 사라진다. 노후된 적혈구는 비장, 간장 및 골수의 세망내피계세포나 마크로파지에 먹힌다. 이때 헤모글로빈은 글로빈과 색소 부분인 헴으로 나누어지고 헴은 헴옥시게나제(heme oxygenase)에 의해 분해된다. 헴은 빌리베딘(biliverdin)과 일산화탄소로 분해되고 빌리베딘은 빌리베딘 리덕타제에 의해 빌리루빈(bilirubin)이 되며 담즙으로 배설된다는 이론이 1940년에 확립되었다. 헴이 붉은 색, 빌리베딘이 녹색, 빌리루빈이 노란색인 것으로부터 타박상으로부터 생기는 멍이 처음에는 붉고 점점 푸른색, 담황색으로 바뀌는 것도 헴의 분해로 색이 변하는 것을 반영하기 때문이라는 것을 알 수 있다.

면역체계의 교란은 자가면역질환을 야기하며, 이 질환은 인체 면역기능에 이상이 발생하는 것으로, 쉽게 설명하면 정상적인 상태에서는 우리 몸 속에서 세균과 같은 외부 물질에 대하여 몸을 방어하는 역할을 하는 면역계가 알 수 없는 이유로 우리 자신의 몸을 스스로 공격하기 때문에 발생하는 질환이다. 자가면역질환의 대 표적인 질환인 류마티스 관절염은 활막세포의 증식과 미세혈관의 손상, 모세혈관정맥주위의 T-세포의 침윤, T-세포에서 분비되는 사이토카인에 의해 활액막의 증식 및 염증반응 등을 나타낸다. 특히 T-세포 중 CD4+ T-세포를 이루고 있는 Th1 세포와 Th-2 세포의 불균형 분화에 의해 발생한다고 알려져 있다. 즉, Th-1세포가 Th-2세포보다 편향된다면, 생체에서 염증성 사이토카인을 대량 생산하기 때문에 만성염증을 유발하게 되고 결국 자가 면역질환에 이른다고 알려져 있다. 따라서, 자가면역질환을 일으키는 주 요인인 T-세포의 증식을 조절할 수 있다면 보다 강력한 자가면역 치료제를 개발할 수 있을 것이다.

자가면역질환의 대표적인 질환인 류마티스 관절염의 치료제는 1970년대부터 개발되기 시작하여 유기 합성적인 방법으로 혹은 천연생리 활성물질을 이용하여 다양한 방법으로 널리 알려지고 있다. 이러한 유기 합성으로 만들어진 약재들 중 하나인 NSAID(None-steroidal anti-inflammatory agent)등이 널리 사용되고 있지만, 이러한 약재들의 큰 문제점은 위장관 출혈, 항응고 작용 및 수분저류 등의 부작용이 심하게 따른다는 것이다. 또한 스테로이드 제제는 단기간 사용에는 효과적이나, 장기간 사용시 체중증가, 반월형 안면, 뼈 및 피부의 얇아짐, 여드름 녹내장, 고혈압, 당뇨질환, 감염 및 위궤양을 유발하여 장기간 사용이 어려운 실정이다.

특히, 관절염 유발에 관여하는 면역활성 조절 및 염증매개인자인 사이토카인에는 IL-2, IL-6 및 TNF-α 등이 있다. 이러한 사이토카인들은 다양한 세포들을 활성화시키며, 유해산소 및 NO 등의 생성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

따라서, 자가면역질환과 관련한 IL-2의 경우 헴옥시게나제-1의 유도물질이나 헴옥시게나제-1으로부터 발생하는 일산화탄소의 공여체를 면역 질환의 국소 부위에 주사하거나 경구 투여를 통해 T-세포의 증식을 억제함으로써 면역과민 반응을 효과적이고 부작용이 없으면서, 실용성이 높은 치료제로 개발할 수 있다.

그러나, 헴옥시게나제-1의 유도물질이나 헴옥시게나제-1으로부터 발생하는 일산화탄소의 공여체는 생체내의 면역반응에 있어서 효과분자로서의 역할에 대해서는 많이 연구된 반면 면역반응의 조절분자로써 T-세포를 매개로 한 자가면역질환에서의 역할에 관한 연구는 많이 이루어지지 않은 실정이다.

이전에 본 발명자들은 이미 인간의 면역세포인 Jurkat T-세포가 헴옥시게나제-1을 발현한다고 보고한바 있다. 또한 본 발명자들은 계속된 연구를 통해 상기 헴옥시게나제-1이 면역반응조절에 있어서 아주 중요한 역할을 하며, 헴옥시게나제-1을 과도하게 발현하는 CD4+ T-세포인 경우 낮은 증식의 경향을 보이고 있음을 발견하였다.

이에 헴옥시게나제-1을 통한 메카니즘을 계속 연구한 결과, 헴옥시게나제-1을 통해 발생하는 3가지 부산물 중 일산화탄소(CO)가 cGMP 경로와는 독립적으로 대표적인 염증 사이토카인인 IL-2의 발현을 억제하고, CD4+ T-세포 증식을 억제함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 헴옥시게나아제-1 유도물질 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 T-세포 관련 질환인 자가면역질환을 치료 및 예방하 기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 헴옥시게나아제-1 유도물질 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 면역 억제제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 헴옥시게나아제-1 유도물질 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하는 T-세포 관련 질환인 자가면역질환을 치료 및 예방하기 위한 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 헴옥시게나아제-1 유도물질 또는 일산화탄소 공급체의 신규한 용도를 제공하는 것으로서, 외부에서 공급된 일산화탄소의 공급체가 생체내에서 T-세포의 증식을 억제시키고 염증 사이토카인인 IL-2의 분비를 억제시켜 면역과민반응을 감소시키며 면역세포를 정상적인 상태로 전환시킬 수 있기 때문에, T-세포를 매개로 하는 자가면역질환을 치료할 수 있는 치료제 조성물을 제공하는 것이다.

면역체계의 교란은 자가면역질환을 비롯한 알러지성 면역질환을 야기하는데,자가면역질환, 예를 들면, 류마티스 관절염, 다발성 경화증 및 건성 등은 CD4+ T-세포 중 Th1 세포가 과대하게 분화하여, INF-γ, IL-1 및 IL-2와 같은 사이토카인이 과량 분비되어 편향된 면역체제를 이루기 때문인 것으로 알려져 있다.

특히, 본 발명에 의한 치료제 조성물은 류마티스 관절염의 치료에 유용하다. 따라서 본 발명에 의한 자가 면역질환 치료용 조성물은 헴옥시게나제-1 유도물질 또는 일산화탄소 공급체(donor)를 함유함을 특징으로 한다. 본 발명에서 헴옥시게나제-1의 유도물질은 CoPP(Cobalt protoporphyrin)이며, 일산화탄소의 공급체는 RuCO(Ruthenium carbone monoxide) 등이 있다.

한편, 본 발명에 의한 일산화탄소는 외부에서 생체내로 공급되어야 한다. 왜냐하면, 생체내에서 생성되는 일산화탄소는 세포내에서 사이토카인의 자극에 의해 생성된 것으로서, 비록 면역질환을 유발하는 T-세포의 증식을 억제하는 기능을 가지기도 하지만, 그 일산화탄소 생성과정에서 조직을 손상시키는 질환을 유발하게 되기 때문이다. 그러나 외부의 일산화탄소 공급체에 의하여 공급된 일산화탄소는 T-세포에 의한 사이토카인과는 상관없이 발생된 것이기 때문에 조직의 손상과는 무관하게 작용할 수 있기 때문이다.

도 1에서 보여지는 바와 같이, 헴옥시게나제(Heme oxygenase)는 헤모글로빈을 비롯한 햄(Heme) 단백질의 보결분자족인 햄을 담즙색소(bilibverdin, bilirubin), 일산화탄소(CO) 및 환원철(Fe²⁺⁺)로 분해한다.

상기 헴옥시게나제는 최소한 3가지의 동질효소(HO-1, HO-2 및 HO-3)가 있음이 보고되어 있으며, 그 중에서 헴옥시게나제-1은 중금속, 내독소(endotoxin), 자외선, 열충격(heat shock), 활성산소 및 저산소 상태 등과 같은 각종 스트레스원에 의해 세포내에서 유도 발현되는 효소이다.

본 발명에 의한 헴옥시게나제-1은 동물모델에서 자가면역질환에서 나타나는 과도한 CD4+ T-세포의 증식을 억제한다. 마찬가지로 헴옥시게나제-1의 부산물인 일 산화탄소 역시 IL-2의 발현 및 CD4+ T-세포 증식을 억제한다.

본 발명에 의한 헴옥시게나제-1의 생성물인 빌리루빈(bilirubin)과 일산화탄소는 강력한 항산화, 항염증 및 세포증식억제 효과가 있다.

빌리루빈(bilirubin)은 강력한 라디칼 보조 작용을 통한 항염증 효능을 가진다.

헴옥시게나제-1에 의해 유도되는 일산화탄소는 염증 사이토카인인 IL-2의 발현을 억제시켜 주며, 면역질환에서 발생하는 CD4+ T-세포 증식을 억제한다.

또한 본 발명에 의한 일산화탄소는 CD4+ T-세포의 증식을 활성화하는 자극원인 항-CD3+항-CD28으로 반응시켰을 때 활성화된 T-세포의 증식을 억제하고, T-세포의 세포주기를 차단하여 cGMP 경로와 독립적으로 CD4+ T-세포 증식을 억제시킨다.

상기 일산화탄소는 T-세포증식 인자인 인터루킨-2(IL-2) 분비를 억제하여 헴옥시게나제-1과 같이 세포증식을 억제한다. 이와 같은 매카니즘을 통해 세포 밖에서 신호조절 키나아제 경로(ERK-1/2 경로)에서 선택적으로 세포증식을 저해한다는 사실을 알 수 있고, 이러한 사실을 전제로 헴옥시게나제-1/CO는 세포 밖의 신호조절 키나아제(ERK-1/2)의 활성을 저해함으로써 T-세포의 증식과 IL-2의 분비를 억제할 수 있음을 알 수 있다.

따라서, 헴옥시게나제-1(헴옥시게나제-1)의 발현과 이 효소에 의해 생산되는 일산화탄소는 자가면역질환을 일으키는 CD4+ T-세포 증식을 억제시킨다. 이러한 CD4+ T-세포 증식을 억제하고 동시에 내피세포 증식을 활성화하여 생체내의 면역세포들을 정상화시킴으로써 자가면역질병인 류마티스 관절염이나, 장기이식의 부작용 이 없으며, 효능을 최대한 높일 수 있다.

본 발명에 기재된 상기 자가면역질환은 장기이식 거부, 뇌척수염, 대장염 및 류마티스 관절염 등을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은 상기 헴옥시게나제-1 유도물질 또는 일산화탄소 공여체를 유효성분으로 함유함을 그 특징으로 하고 있으며, 그 투여량은 체중 1kg 당 5∼10mg 정도가 투여되도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 조성물을 제형화하는 방법은 특별히 한정되지 않으나, 경구투여용으로 구강용 또는 주사약제가 가능하며, 식품 첨가물로도 사용할 수 있다.헴옥시게나제-1 유도물질이나 일산화탄소의 공급체를 포함하는 자가 면역질환 치료제로써 제형은 주사제, 구강 투여형 약제로써 과립형이 있으며, 한편 그 투여량은 공급체의 종류, 약제의 활성, 환자의 상태, 환자의 체격등에 따라 달라지지만, 투여되는 양는 하루에 체중 1kg당 1∼10mg 정도가 적당하며, 바람직하게는 5~10mg으로서, 그 분야의 전문가라면, 약제 조성물의 활성 및 환자의 상태에 따라 쉽게 투여량을 결정할수 있다. 또한 약물 운반 시스템으로 잘 알려진 벡터에 본 발명에 의한 헴옥시게나제-1 유도물질 또는 일산화탄소 공여체를 클로닝하여 사용할 수도 있다.

보다 구체적으로는 본 발명의 조성물은 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나, 사용하기 전에 무균, 발열물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태가 되어 경구용 제형, 피하주사, 정맥주사, 근육주사 등의 비경구형 제형으로 제형화할 수 있다.

경구용 제형의 경우, 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 부형제를 이용하여 공지의 방법으로, 예를 들면, 정제, 트로키제, 함당정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산가능 가루 혹은 입자, 유화액, 연질 혹은 경질 캡슐, 시럽, 일릭서와 같은 형태로 제제화되며, 이는 단위 투여량 형태 및 다용량 용기에 담아서 완성품을 제조할 수 있다.

경구용 제형 중, 정제는 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘, 인산나트륨 등의 불활성 희석제; 옥수수, 녹말, 알긴산 등의 입자화제; 붕해제; 녹말, 젤라틴, 아카시아 등의 결합제; 스테아르산마그네슘(magnesium stearate), 스테아르산, 탈크 등의 윤활제와 같이, 정제의 제조에 사용 가능한 부형제와 섞여진 상태로 제조될 수 있다. 정제는 코팅되지 않은 상태로 사용하거나, 위장관내의 흡수와 정제의 분해를 저해하기 위해 코팅하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 글리세릴모노스테아레이트와 글리세릴디스테아레이트 등의 시간 저해 물질을 적용해도 좋다. 경질캅셀은 본 발명의 화합물을 탄산칼슘, 인산칼슘, 카올린 등의 불활성 고체 희석제에 섞은 것이고, 연질캅셀은 물이나 혼합이 가능한 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol), PEGs(polyethylene glycol), 에탄올 등의 용매와 땅콩기름, 액상 파라핀, 올리브 오일등의 기름 용매에 활성성분을 섞은 것이다.

수용성 현탁제는 수용성 현탁제 제조에 적당한 부형제와 활성 성분을 함께 혼합한 것으로, 부형제로는, 예를 들면, 나트륨카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시-프로필메틸셀룰로오스, 알긴산나트륨, 폴리비닐-피롤리돈, 트래 거캔스검(gum tragacanth), 아카시아검(gum acacia) 등의 현탁화제; 폴리옥시에틸렌스테아레이트와 같은 지방산과 알킬렌 옥사이드를 축합한 화합물들; 헵타데카에틸렌옥시세탄올(heptadecaethyleneoxycetanol)과 같이 긴 지방산에 알킬렌 옥사이드를 축합한 화합물들; 폴리옥시에틸렌소르비톨모노올레이트와 같이 무수헥시톨(hexitol anhydride)과 지방산에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌 옥사이드와 축합한 화합물들; 습윤제; 또는 분산화제 등이 있다. 수용성 현탁제는 방부제, 착색제, 향신료, 감미료 등을 함유한다.

유성 현탁제는 올리브유, 세사미유(sesami oil) 등의 식물성 오일 또는 액상 파라핀 같은 광물성 오일에 활성 성분을 현탁시킨 것으로, 예를 들어 비즈왁스, 경화 파라핀, 세틸 알코올 등의 농후제(thickening agent)를 함유한다. 또한, 방부제, 착색제, 향신료, 감미료 등을 함유하는데, 이러한 조성은 비타민 C 같은 항산화제를 가하여 보존할 수 있다.

분산성의 파우더와 입자는 분산화제, 습윤제, 현탁화제, 보존제 등을 넣어 함께 혼합한 상태로 활성 성분을 가지고 있다. 적절한 분산화제, 습윤제나 현탁화제는 앞서 이미 언급한 것을 예로 들 수 있다. 부가적인 부형제는, 예를 들어, 감미료, 향신료, 착색제 등이 있다.

유중수형 유화액은 올리브유 같은 식물성 기름 또는 액상 파라핀 같은 광물성 오일을 유상으로 하고, 대두레시틴(soy bean lecithin) 등의 자연산 인지질, 소르비탄모노올레이트와 같은 무수헤시톨이나 지방산의 에스테르에서 유래된 것, 리옥시에틸렌소르비톨모노올레이트와 같이 무수헥시톨(hexitol anhydride)과 지방산 에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌 옥사이드와 축합한 화합물들을 유화제로하여 활성성분을 유화시킨 것 등이 있다.

시럽과 일릭서는 글리세롤, 프로필렌글리콜, 소르비톨, 슈크로스 등의 감미료와 함께 활성성분을 혼합하여 제조될 수 있다.

비경구형 제형은 멸균된 주사 가능 용액 혹은 무독성의 사용가능한 희석제나 용매, 예를들어 1,3-부탄디올 등의 용매에 활성성분을 현탁시킨 현탁액으로 제제화하여 주사할 수 있다. 사용 가능한 부형제나 용매중에는 물, 링거액 그리고 등장성 식염수 용액이 있다. 또한, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 같은 공용매를 사용할 수 있다. 또한, 멸균된 비휘발성 오일을 관습적으로 용매 혹은 현탁 용매로 사용할 수 있다. 이런 목적으로 섞는 무자극, 비휘발성 오일(bland fixed oil)은 합성 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 사용한다. 또한, 올레인산과 같은 지방산을 주사제 마련에 사용할 수 있다. 좌제 형태는 약물을 상온에서는 고체였다가 직장내의 온도에서는 액체가 되어 직장내에서 녹아 약물을 방출하게 하는 적절한 무자극성 부형제, 예를 들면, 코코아버터, 폴리에틸렌글리콜과 혼합하여, 제제화한 후, 직장에 투여할 수 있다.

이하, 실시예에 의해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명의 범위가 이에 의해서 한정되는 것은 아니다. 하기에서 모든 실험은 최소한 3번 이상 반복하였으며, 유의성 검증은 스튜던트 t-검사법[Student's t-test; Microcal Origin version 5.0 software (Microcal Software, USA)]에 의해 실시하였고, 유의 성의 한계는 p<0.05로 하였다.

RPMI-1640 배지 및 2mM L-글루타민, 1% 비필수 아미노산, 1% 피루베이트, 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신은 Life Techologies에서 구입하였으며, 우태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS) 및 항생제는 Gibco/RBL사에서 구입하였다. 항-CD3(Clone, UCHT1)와 항-CD28(Clone CD28.2)의 항체는 각각 Immunotec(Westbrook, ME)과 PharMingen(San Diego, CA)에서 구입하였으며, 인산이 붙은 p-ERK -1/2의 항체는 Cell signaling Technology (Beverly, MA)에서, ERK-1/2의 항체는 Santa Cruze(Santa Cruze CA)에서 얻었다. 코발트 프로토포르피린(Cobalt protoporphyrin; CoPP)은 Promega(Madison, WI)에서 구입하였으며, 트리카보닐디클로로루테늄(Ⅱ)다이머(tricarbonyldichlororuthenium(Ⅱ)dimer; RuCO)는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 항-헴옥시게나제-1과 항-α-액틴 항체는 Santa Cruze에서 구입하였다. 재조합 IL-2 중화항체는 R&D 시스템(Minneapolis, MN)에서 구입하였다.

모든 시약류와 조직배양에 사용된 배양액은 측색계 LAL 검사(colorimetric Limulus amoebocyte lysate assay)(측정한도, 10 pg/㎖ Whittaker Bioproducts)를 수행하여 내독소 함량을 측정하였다. 그 결과, 이들 시약 및 배양액은 내독소를 전혀 함유하지 않았다. 조직배양 플레이트와 직경 100mm 페트리접시는 넌크사(Nunc, Inc., USA))로부터 구입하여 사용하였다.

[실시예 1] 혈액으로부터 분리한 CD4+ T-세포 및 CD8+ T-세포 배양

건강한 기부자로부터 피를 뽑아 PBMCs(Pheripheral Blood Monolayer Cells)을 Picol-Paque 밀도 구배에 의해서 분리하였고, HBSS가 포함된 버퍼로 3번 씻어낸 다음, MACS 음성 고갈 시스템(MACS negative depletion system; Milteny Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 CD4+ T-세포를 분리하였으며, CD8+ T-세포는 음성 CD8+ T-세포 분리 키트(Milteny Biotec)에 의해 분리하여 Jurkat T-세포와 함께 항생제 및 항균제로서 100 U/㎖의 페니실린 G 및 100 U/㎖의 스트렙토마이신 및 10% 열처리 우태아 혈청(heat inactivated FBS)을 첨가한 완전한 RPMI 1640 배지에서 5% CO₂의 습한 대기, 37℃의 조건으로 배양하였다.

[실시예 2] 분리된 핵산의 세포에의 감염

헴옥시게나제-1을 지속적으로 발현시킬 수 있는 유전자(CA-MEK1)를 pcDNA3의 벡터에 도입하여, Jurkat T-세포(5×10⁶)에 Gene Pulser(Miltenyi Biotec, Auburn CA)로 270V, 950μF의 환경에서 전기충격을 가한 다음 10㎍의 유전자를 세포 안으로 도입하여 복제하였다. 그 후에 Jurkat T-세포와 함께 항생제 및 항균제로서 100 U/㎖의 페니실린 G 및 100 U/㎖의 스트렙토마이신을 처리하고, 10% 열처리 우태아 혈청(heat inactivated FBS) 및 G418(1.25mg/ml)을 첨가한 RPMI 1640 배지에서 5% CO₂의 습한 대기, 37℃의 조건으로 48시간동안 배양하였다.

[실시예 3] 일산화탄소의 노출

T-세포에 일산화탄소(200ppm) 농도로 노출시키기 위해, 1% CO와 5% CO₂가 섞인 것과 섞이지 않은 농축된 공기를 스테인리스 실린더를 이용하여 섞이게 하여 세포배양 챔버(Chamber)에 배양한 다음, 200ppm의 일산화탄소가 섞인 5% CO₂의 조건과 일산화탄소가 섞이지 않은 5% CO₂ 조건에서 세포를 배양하였다.

[실시예 4] 웨스턴 블랏 분석

세포는 10mM HEPES, 10mM KCI, 1mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride) 및 0.2mM EDTA(pH 7.4)이 함유되어 있는 세포용해제를 첨가하고 15분간 얼음 위에서 방치한 다음 다운스 호모게나이저(Dounce homogenizer)를 이용하여 60 스트로크(strokes)로 세포를 마쇄하고 50mM HEPES 및 250mM KCI(pH 7.4)이 포함되어 있는 용액을 첨가하였다. 핵과 마쇄되지 않은 세포덩어리를 제거하기 위해서 4℃에서 500G로 5분간 원심분리하였다. 세포 추출액의 단백질량은 블레드포드 방법에 따라 정량하고 20㎍을 10% SDS-PAGE로 분리한 다음 전달 용액(transfer solution; 20% 메탄올, 25mM 트리스(Tris), 192mM 글리신, pH 8.3)을 이용해 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 분리된 단백질을 전사시켰다. 비 특이반응을 제거하기 위하여 5% 비지방 탈지유(skim milk)가 함유된 TTBS로 4℃에서 2시간 이상 충분히 흔들면서 방치하였다. 그 후 TBS로 3회 세척하고 항-헴옥시게나제 항체(1:1,000), 항-ERK-1/2 (1:1000) 및 항-pERK-1/2(1:1000)를 주입하여 3시간동안 실온에서 반응시킨 후 충분히 세척하고 서양 고추냉이로부터 분리한 효소인 퍼옥시다제(Horse radish peroxidase)가 부착된 항염소 IgG(1 : 100)을 각각 주입한 다음 1 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 대조군으로는 항-α-액틴 항체를 이용하여 수행하였다. 막은 TBS로 충분히 세척하고 통상적인 ECL방법으로 1-2시간동안 발색시켰다.

[시험예 1] T-세포에 증식 억제에 있어 헴옥시게나제-1의 영향

순수한 CD4+ T-세포 및 Jukat T-세포에 항생제 및 항균제로서 100 U/㎖의 페니실린 G 및 100 U/㎖의 스트렙토마이신을 처리하고, 10% 열처리 우태아 혈청(heat inactivated FBS)을 첨가한 완전한 RPMI 1640 배지에서 5% CO₂의 습한 대기, 37℃의 조건으로 배양하였다.

건강한 기부자로부터 피를 뽑아 PBMCs(Pheripheral Blood Monolayer Cells)을 분리하였고, 여기서 분리한 CD4+ T-세포와 인간의 림프구인 Jurkat T-세포를 가지고 헴옥시게나제-1에 미치는 영향을 관찰하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 2에서와 같이 헴옥시게나제-1의 유도물질인 CoPP(20μM)를 처리한 결과, PBMCs 및 CD4+ T-세포는 헴옥시게나제-1의 발현이 증가하였으며, Jurkat-T 세포의 경우 헴옥시게나제-1 유전자를 벡터에 헴옥시게나제-1 유전자를 집어넣어 발현시켰을 때 헴옥시게나제-1의 발현 또한 증가함을 알 수 있었다.

각각의 T-세포에 증식인자인 CD3/CD28 항체와 CoPP(20μM)를 처리하고 [³H]TdR로 표지하여 세포의 증식을 측정한 결과, 마찬가지로 대조군에 비해 세포증식이 억제되었음을 알 수 있었다. 각 실험은 3번 반복 실행하였으며, 결과는 평균값±표준편차로 나타내었다(*, P<0.01).

[시험예 2] CD4+ T-세포에서 일산화탄소의 증식 억제 효과

T-세포의 활성화 및 증식정도를 측정하기 위하여, CD4+ T-세포에 T-세포 증식인자인 CD3/CD28 항체를 12시간동안 처리하고, 헴옥시게나제-1의 유도물질(유도물질)인 CoPP(20μM)와 함께 처리한 군과 처리하지 않은 군을 4일 동안 배양한 후 Hb(80μM)을 처리한 것과 처리하지 않은 군을 비교하였다. 마찬가지로 CD4+ T-세포에 T-세포의 증식인자인 CD3/CD28 항체를 12시간동안 처리하되, CO 도너(donor)인 RuCO를 같이 1h동안 처리한 군과 처리하지 않은 대조군에 IL-2(50U/ml)을 처리하여, [³H]TdR(Amersham Pharmacia Biotec NJ)로 16시간동안 표지하여 세포의 증식을 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4A에서는 CD4+ T-세포에 헴옥시게나제-1의 부산물인 CO 가스(200ppm), 빌리루빈(20μM) 및 Fe²⁺(20μM)를 각각 한시간씩 처리한 결과, 빌리루빈(20μM) 및 Fe²⁺(20μM)을 처리한 군에서는 대조군과 비슷한 증식율을 보였으나, CO 가스(200ppm)를 처리한 군은 낮은 증식율을 보였다.

도 5B에서는 CD4+ T-세포에 CO 도너인 RuCO를 1h동안 처리하고 CO와 결합하 는 Hb(Hemoglobin) 화합물 80μM을 처리한 결과, 처리하지 않은 것보다 세포 증식율이 높아졌음을 알 수 있었다.

상기 결과를 통해 CO가 세포 증식율에 영향을 준다는 것을 알 수 있었다.

이와 마찬가지로 도 5C에서도 CD4+ T-세포에 12시간동안 T-세포에 증식인자인 CD3/CD28 항체를 처리하고 헴옥시게나제-1의 유도물질인 CoPP(20μM)와 처리한 군과 처리하지 않은 군을 4일 동안 배양한 후, [³H]TdR로 표지하여 세포의 증식을 측정한 결과, Hb(80μM)을 같이 처리한 군은 대조군과 비슷한 증식율을 보였으나, Hb(80μM)를 처리하지 않은 군은 낮은 증식율을 보였음을 알 수 있었다.

결론적으로 CO는 헴옥시게나제-1으로부터 생성되며, CD4+ T-세포의 증식을 억제한다는 사실을 보여주었다. 각 실험은 3번 반복 실행하였으며, 결과는 평균값±표준편차로 나타내었다(*, P<0.01).

[시험예 3] CD4+ T-세포에서 일산화탄소가 IL-2의 분비를 억제효과

T-세포증식 인자인 인터루킨-2(IL-2)의 양을 측정하기 위하여, CD4+ T-세포에 헴옥시게나제-1의 부산물인 CO 가스(200ppm) 빌리루빈(20μM) 및 Fe²⁺(20μM)를 각각 한시간씩 처리한 후 IL-2의 양을 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 6A에서 IL-2가 빌리루빈(20μM), Fe²⁺(20μM)을 처리한 군에서는 대조군과 비슷한 양을 보였으나, CO 가스(200ppm)를 처리한 군은 낮은 양을 보였다.

도 6B에서도 CD4+ T-세포에 T-세포에 증식인자인 CD3/CD28 항체를 12시간동안 처리하고 헴옥시게나제-1의 유도물질인 CoPP(20μM)와 함께 처리한 군과 처리하지 않은 군을 4일 동안 배양한 후 IL-2의 양을 측정한 결과 Hb(80μM)을 같이 처리한 군은 대조군과 비슷한 양을 보였으나, Hb(80μM)를 처리하지 않은 군은 IL-2가 적게 분비되었음을 알 수 있었다.

마찬가지로 도 5C에서는 CD4+ T-세포에 T-세포에 증식인자인 CD3/CD28 항체를 12시간동안 처리하되 CO 도너인 RuCO를 같이 1h동안 처리한 군과 처리하지 않은 대조군에 IL-2(50U/ml)을 처리한 군과 처리하지 않은 군을 4일 동안 배양한 후 [³H]TdR로 표지하여 세포의 증식을 측정한 결과, IL-2를 처리하지 않은 군의 증식이 억제되었고 IL-2를 처리한 군은 세포증식이 대조군과 비슷함에 따라 IL-2가 세포증식에 관련되어 있음을 알 수 있었다.

상기의 결과로 CO가 IL-2의 분비를 억제하여 세포증식을 억제함을 알 수 있었다. 각 실험은 3번 반복 실행하였으며, 결과는 평균값±표준편차로 나타내었다(*, P<0.01).

[시험예 4] CD4+ T-세포에서 인산화된 ERK에서 일산화탄소의 저해 효과

MEK의 캐스캐이드로부터 활성화된 인산화 ERK-1/2의 대사를 통하여 IL-2의 분비가 촉진되는데, CD4+ T-세포에 CO 도너인 RuCO를 같이 1시간동안 처리한 후 5분과 10분 동안 T-세포에 증식인자인 CD3/CD28 항체를 처리하여 세포를 분쇄하여 웨스턴 블랏을 통해 인산화된 ERK 1/2의 단백질 발현 양을 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

활성화되지 않은 ERK 1/2에서는 일정하게 발현이 되었으나 활성화된 인산화 ERK 1/2에서는 CO 도너인 RuCO를 처리하지 않은 군보다 처리한 군에서 인산화된 ERK 1/2가 발현량이 감소되었다.

특히 도 6A에서 보듯이 인산화된 ERK-2의 발현량이 현저히 줄었음을 보여주었다. 도 6B에서는 T-세포에 증식인자인 CD3/CD28 항체를 모두 처리하고 IL-2를 처리한 군과 처리하지 않은 군을 4일 동안 배양하여 CO 도너인 RuCO, ERK 저해제(U012 20μM)를 1시간 동안 처리한 후 [³H]TdR로 표지하여 세포의 증식을 측정한 결과, ERK 저해제(U012 20μM)만 처리했을 경우, 세포증식이 억제되었으며, ERK 저해제(U012 20μM)와 IL-2를 처리하였을 경우, 세포증식이 대조군과 비슷하였다. CO 도너인 RuCO만 처리했을 경우, 마찬가지로 세포증식이 억제되었으며, ERK 저해제(U012 20μM)와 RuCO를 처리했을 경우, 마찬가지로 세포증식이 억제되었다.

상기 결과를 전제로 ERK 경로가 T-세포의 증식을 억제하는 일산화탄소(CO)와 밀접하게 관련되었음을 알 수 있었다. 각 실험은 3번 반복 실행하였으며, 결과는 평균값±표준편차로 나타내었다(*, P<0.01).

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서는 헴옥시게나제-1(헴옥시게나제-1) 의 발현 및 이 효소에 의해 생산되는 일산화탄소가 자가면역질환을 일으키는 CD4+ T-세포의 증식을 억제하였으며, 동시에 면역세포를 정상화시킴으로써 면역과민반응을 효과적으로 억제할 수 있었다. 특히, T-세포가 매개인 류마티스 관절염이나 장기이식시 발생되는 과민 반응 또한 CD4+ T-세포의 증식을 억제함으로써 T-세포와 관련된 여러 가지 질환을 치료 및 예방하기 위한 조성물로서 사용이 가능함을 알 수 있었다.

Claims (5)

1. 헴옥시게나아제-1 유도물질 또는 일산화탄소 공급체를 유효성분으로 함유하며 CD4+ T-세포에 기인하는 자가면역질환 치료용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 자가면역질환은 장기이식 거부, 뇌척수염, 대장염 및 류마티스 관절염으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 헴옥시게나제-1 유도물질 또는 일산화탄소 공급체의 투여량은 각각 체중 1kg당 10mg인 것을 특징으로 하여 염증 사이토카인인 IL-2의 생산을 저해시킴으로써 T-세포의 증식을 억제하는 T-세포 억제용 조성물임을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 헴옥시게나제-1 유도물질은 CoPP(Cobalt protoporphyrin)임을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 일산화탄소 공급체는 RuCO(Ruthenium Carbon Monoxide)임을 특징으로 하는 조성물.

Images