KR20060033923A - Ｒａ 항원성 펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인터페론-γ-유도가능 라이소좀성 티올 환원효소, 인테크린 베타-2, 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제, 유로키나제형 플라스미노겐 활성제, 면역글로불린 중쇄 V-III 영역(V_H26), DJ-1 단백질, 아포지질단백질 B-100, 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 8, 인터루킨-1 수용체, 피브로모듈린, GM-CSF/IL-3/IL-5 수용체, 소팅 넥신 3, 인터-α-트립신 억제제 중쇄 H4, 보체 C4, 보체 C3(α-사슬), 보체 C3(β-사슬), SH3 도메인-결합 글루탐산-풍부-유사 단백질 3, 인터루킨-4-유도 단백질 1, 헤모펙신, Hsc70-상호작용 단백질, 불변 사슬(Ii), 레티놀산 수용체 반응체 단백질 2, 피브로넥틴, 카텝신 B, 트리펩티딜-펩티다제 II, 레구메인, 혈소판 활성 인자 수용체, 폴리-알파-2,8-시알릴트랜스퍼라제, 및 ras-관련 단백질 Rab-11B에서 비롯되는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드를 제공한다. 또한 본 발명은 이러한 항원성 펩타이드 및 이들이 유도된 단백질을 미란성 및/또는 비미란성 RA에 대한 표지자로서 제공한다. 또한, 본 발명은 MHC 클래스 II 분자에 연결된 이러한 항원성 펩타이드는 물론 상기 항원성 펩타이드와 반응하는 항체, 상기 항원성 펩타이드를 암호화하는 핵산, 및 핵산 작제물 그리고 상기 항원성 펩타이드를 발현하는 숙주 세포 및 그 발현 방법을 제공한다. 본 발명의 항원성 펩타이드는 RA 진단에 있어서의 표지자 및 치료 요법에 있어서의 항-RA 백신으로서 사용될 수 있다.

Description

ＲＡ 항원성 펩타이드{RA ANTIGENIC PEPTIDES}

본 발명은 미란성(erosive) 및 비미란성(non-erosive) RA에 대한 후보 표지자인 천연 정제된(naturally-processed) RA 항원성 신규 펩타이드를 제공한다. 이들 항원성 펩타이드는 사람의 MHC 클래스 II HLA-DR 분자에 의해 제공된다. 또한, 본 발명은 MHC 클래스 II 분자에 연결된 이러한 항원성 펩타이드는 물론 상기 항원성 펩타이드와 반응하는 항체, 상기 항원성 펩타이드를 암호화하는 핵산, 및 핵산 작제물(construct) 그리고 상기 항원성 펩타이드를 발현하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 항원성 펩타이드 뿐만 아니라 이들 항원성 펩타이드가 유래된 폴리펩타이드는 RA 진단에 있어서의 표지자 및 치료 요법에 있어서의 항-RA 백신으로서 사용될 수 있다.

원래 만성 다발성 관절염이라 불리던 류마티스성 관절염(RA)은 전신성 자가 면역 질환으로 관절 염증 중에서도 가장 소모성 형태 중 하나이다(Feldmann, M. 외, Cell 85 (1996) 307-310; Dedhia, H.V. 및 DiBartolomeo, A., Critical care clinics 18 (2002) 841-854). 통상적으로 RA는 관절통, 관절의 변형 및 중증 관절 경직을 일으킨다. 또한 이 질환은 관절 이외에도 특히 "류마티스성 인자"(rheumatoid factor, RF)라 하는 자가 항체에 대한 양성 환자에게서 그 징후를 보인다(Mageed, R.A., in: van Venrooij, W.J & Maini, R.N. eds., Manual of biological markers of disease, Kluwer Academic Publishers (1996) 1-18). RA는 백인종에게서 아주 빈번하게 발생하면서 RA에 대한 감수성(susceptibility)은 유전 인자 및 환경 인자에 의해 영향을 받는다. 유전 인자 및 환경 인자 둘다 이러한 자가 면역 질환의 개시와 진행에 중대한 영향을 끼친다. 전 인구의 약 4% 정도는 RA에 대한 유전적 감수성이 높으나 이들 중 대략 20%(전 인구의 약 1% 정도)에게서는 아직까지는 특징이 없는 비유전 인자의 결과로서 RA가 발병한다. 그 밖에도 RA는 뚜렷하게 한쪽으로 치우치는 성비(sex ratio)를 나타낸다: RA가 발생할 위험은 남성보다 여성이 3배 이상 높으며, 이는 성 호르몬이 병인(pathogenesis)과 연관될 수도 있음을 나타낸다.

RA는 초기에는 느리게 진행된다. 전형적인 초기 단계 증상으로 손바닥에 땀이 나고 아침에 일어났을 때 손가락이 뻣뻣하고 좌우 대칭의 관절에 염증이 생긴다. 또한 관절 이외에서의 조직 병변의 징조를 나타내는 류마티스성 결절이 보일 수 있다. 단순화시킨 모델에서의 면역 체계는 건강한 조직에 대항하는 자가 항체를 생산한다. 이러한 자가 항체는 관절 내 관절 연골을 공격하여 염증을 일으키고 나중에는 파괴시킨다. 이러한 파괴로 인하여 면역 체계가 자극을 받으면 더욱 많은 자가 항체를 생산하게 된다. 또한, 종양 괴사 인자 알파(tumor necrosis-factor alpha, TNF-α)와 유사한 사이토카인을 생산하여 염증 반응을 더욱 증강시킨다 (Houssiau, F.A., Clin Rheumatol 14 Suppl 2 (1995) 10-13). 면역 체계의 부가적인 세포, 예컨대 대식 세포 및 T 세포의 침윤으로 인하여 활막이 팽윤하기 시작한다. 이러한 세포들은 부가적인 세포 사멸을 일으키고 관절 염증을 유발하는데 활발하게 연관되어 있다(Fox, D.A., Arthritis Rheum 40 (1997) 598-609; Choy, E.H. & Panayi, G.S., N Engl J Med 344 (2001) 907-916). 이러한 과정은 자가 항체 생산, 관절 염증 및 관절 파괴의 불합리한 순환과 닮은 모습이다.

일반적으로 RA는 만성적으로 진행하며 모든 RA 환자의 85-90%는 가벼운 내지는 온화한 질환의 발병 양상을 보인다. 10-15%의 환자만이 무용지물이 될 정도까지 관절 기능을 완전히 손상시키는 공격적 형태의 질환을 겪는다. 이러한 진전된 RA 상태의 환자들은 영구적인 관절 염증을 가지고 류마티스성 결절을 보인다. 이러한 환자들은 지독한 만성 통증으로 고통받으며 상기 염증은 중증의 손가락 강직 및 비가역적인 관절 변형 또는 탈구를 초래한다.

진단

질환에 대한 초기 치료적 개입이 관절 손상의 정도를 감소시킬 수 있다는 증거가 늘어나고 있다(Egsmose, C. 외, J Rheumatol 22 (1995) 2208-2213; Van der Heide, A. 외, Ann Intern Med 124 (1996) 699-707). 위험:이익 또는 비용:유효성 비가 좋을 때는 단지 질환 조절 항류마티스성 약제(disease-modifying antirheumatic drug, DMARD) 치료만이 올바른 치료법이기 때문에 질환 개시 후 이내 RA를 그밖의 형태의 관절염과 구별하는 것이 꼭 필요하다(Kirwan, J.R. & Quilty, B., Clin Exp Rheumatol 15 (1997) 15-25). 병력, 건강 진단 및 실험실 검 사에 근거하여 확립된 표준에 따라 진단한다. 미국 류마티스학회는 RA에 대한 객관적인 증거를 입수하는데 도움이 되도록 표준 카탈로그를 발행하였다(Arnett, F.C. 외, Arthritis Rheum 31 (1987) 315-324). 그러나 지금까지는 RA에 특이적으로 이용가능한 단일 검사는 없다. 몇몇 생물학적 및 생화학적 표지자, 예컨대 C-반응성 단백질(C-reactive protein, CRP), 적혈구 침강 속도(erythrocyte sedimentation rate, ESR), 항핵 항체(antinuclear antibody, ANA) 또는 RF가 RA 진단에 사용되고 있다. 그러나 이러한 표지자는 기타 염증 질환이나 자가 면역 질환에서도 나타나기 때문에 비특이적이다. 예를 들어 RF는 약 50%의 RA 환자 혈청에 존재하는 자가 항체이다. 동일한 자가 항체가 높은 수준으로 다른 염증 질환, 예컨대 쉐그렌(Sjogren) 증후군, 심내막염 또는 만성 간염에서도 발견될 수 있기 때문에 RA에 대한 진단 표지자로 사용하기에는 RF는 부적절하다. 상기 언급한 생화학적 및 생물학적 표지자는 그 자체로서의 진단 가치보다는 RA 환자의 치료 및 관리 뿐 아니라 질환의 활성 및 예후를 평가하는데 유용하다(Nakamura, R.M., J Clin Lab Anal 14 (2000) 305-313).

최근 초기 상태에서 자기 제한적 RA, 지속성 비미란성 RA 및 지속성 미란성 RA를 구별할 수 있는 임상 및 생화학적 양상들로 이루어진 표준 진단 세트가 개발되었다(Visser, H. 외, Arthritis Rheum 46 (2002) 357-365). 자기 제한적 관절염은 자연스럽게 완화되는 특징이 있다: 특정 기간 동안 환자를 검사할 때는 전혀 관절염 증상이 없었다. 미란성 관절염은 손 및/또는 발의 방사선 사진에서의 미란 존재 여부에 기초하여 진단되었다. 특히 환형 시트룰린화 펩타이드(cyclic citrullinated peptide)를 인식하는 항체 사용이 전망 있어 보이며, 미란성 RA의 초기 진단 및 예후에 있어 시트룰린화 항원의 중요한 역할이 제안되고 있다(Schellekens, G.A. 외, J Clin Invest 101 (1998) 273-281; Vincent, C. 외, J Rheumatol 25 (1998) 838-846). 미란성 RA의 초기 인식으로 인하여 DMARD를 사용한 초기 개입이 가능하게 됨으로써 보다 초기에 질환을 제어하고 질환의 극복을 앞당길 수 있게 될 것이다(Symmons, D.P.M. 외, J Rheumatol 25 (1998) 1072-1077; Anderson, J.J. 외, Arthritis Rheum 43 (2000) 22-29). 이와 마찬가지로 자기 제한적 관절염 및 비미란성 관절염을 초기에 인식함으로써 잠재적 독성 요법을 이용한 불필요한 치료를 예방할 수 있을 것이다(Fries, J.F. 외, Arthritis Rheum 36 (1993) 297-306).

치료

항-류마티스 치료는 매일의 일상 활동을 편안하게 할 수 있도록 하기 위해서 통증을 경감시키는데 그 목적이 있다. 지금까지 RA의 완치는 불가능하지만 질환의 진행을 느리게 하거나 또는 아예 멈추게 할 수는 있다. 개인차가 있으므로 각각의 환자들은 개별적인 치료법을 필요로 하고 앞서 언급한 바와 같은 초기 진단이 바람직하다. RA 치료는 복합적이며 물리 치료 및 방사선 치료는 물론 평생 약물 치료를 포함한다. RA 치료에 사용되는 DMARD(예컨대 메토트렉세이트, 설파살라진, 하이드록시클로로퀸, 레플루노마이드, 아자티오프린), 코르티손, 비스테로이드성 항염증 약제(non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID) 또는 전구 염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 TNF-α, IL-1β 또는 이들 각각의 수용체에 대한 단클론 성 항체는 기본적인 치료법에 속한다(http://rheuma-online.de). 이러한 약제 모두는 면역 반응을 억제시킴으로써 염증 반응의 억제자가 된다는 공통점이 있다. 이들의 주된 단점으로는 RA에 대한 특이성 부족, 역효과 및 RA 원인을 효과적으로 표적화하지 못함이 있다.

자가 면역성

자가 면역성은 특이적 적응(adaptive) 면역 반응이 자기 반응성 T 또는 B 세포의 발달에 의해 명백해진 자기 항원(자가 항원)에 대항하여 시작될 때 일어난다. 외래 항원에 대한 적응 면역 반응이 정상적으로 일어나면 그 결과 체내에서 항원이 제거된다. 그러나 적응 면역 반응이 자기 항원에 대항하여 전개될 때 그 항원은 대부분의 경우 체내에서 완전히 제거될 수 없고 지속(sustained) 면역 반응을 초래한다. 그 결과로서의 면역 작용 기전은 조직에 만성 염증 손상을 일으킨다. 자가 면역 질환에서의 조직 손상 매카니즘은 방어 면역 및 과민증에서 작동하는 매카니즘과 본질적으로 동일하다. 설령 무엇이 자가 면역을 유발하는지는 충분히 이해되지 않더라도 오늘날 자가 면역 질환을 유도하고 자가 항원성 표적을 선별한다고 여겨지는 몇몇 성과들이 가장 최근에 요약되었다(Marrack P. 외, Nat Med 7 (2001) 899-905).

자가 면역 질환은 각 개인의 특정 유전자의 특성 및 환경 인자에 의해 제어된다. 숙주 유전자는 적어도 3가지 수준에서 자가 면역에 대한 감수성에 영향을 미친다. 첫째, 일부 유전자는 면역 체계의 전반적인 반응성에 영향을 주고 따라서 특정 자가 면역 질환 또는 몇몇 상이한 형태의 자가 면역 질환에 쉽게 걸릴 수 있다. 둘째, 이렇게 바뀐 면역 반응성은 T 세포가 항원성 펩타이드를 인식하는데 영향을 주는 다른 유전자에 의해 특정한 자가 항원 및 조직에 집중된다. 세째, 게다가 그밖의 유전자는 예를 들어 자가 면역 공격을 시작하도록 되어 있는 면역 체계의 작용 세포 활성에 영향을 주는 것과 같이 표적 조직의 면역 공격을 조절하는 능력에 작용한다. 3가지 중 뒤의 2 세트 유전자는 어느 항원이 자가 면역의 표적이 되고 그 결과 어느 기관이 공격받고 어떠한 손상이 일어날 것인지를 보여준다.

또한, 환경적 시그널(signal)은 면역 체계의 전반적인 반응성, 항원 특이성 및 잠재 표적 조직의 상태에 영향을 미침으로써 3가지 인자가 동일 수준에서 면역 발달에 영향을 끼친다. 그리고 끝으로 유전 인자와 환경 인자 간에는 혼선의 여지가 있다.

주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC )

개체 연구, 유전자형 분석(genotyping) 및 분자 수준의 현대적 접근은 주조직 적합성 복합체에 의해 암호화된 특정 유전자가 RA의 발병에 상당히 높은 위험성을 가진다는데 이견이 없다(Stastny, P., Tissue Antigens 4 (1974) 571-579; Wordsworth, P. 외, PNAS 86 (1989) 10049-10053; Wordsworth, P. & Bell, J. Springer Semin Immunopathol 14 (1992) 59-78). 특히 몇몇 종족 내의 클래스 II MHC 대립 유전자 HLA - DRB1 ^* 0101, ^* 0401, ^* 0404 및 ^* 0405는 RA에 대한 감수성을 높인다(Reveille, J., Curr Opin Rheumatol 10 (1998)187-200). 예컨대 RF 양성 RA 환자의 90% 이상은 이러한 감수성 대립 유전자 중 1개를 가지고 있다. HLA 클래스 II 분자는 세포 내에서 항원성 펩타이드에 결합하여 CD4⁺ 헬퍼 T 림프구의 T 세포 수용체와 상호 작용하는 항원-제시 세포의 표면에 그 항원성 펩타이드를 제시하고 그로 인해 세포성 면역 반응을 일으키는 MHC-표면 단백질이다(Banchereau, J. & Steinman, R.M., Nature 392 (1998) 245-252). 활막성 조직 내 다수의 활성화된 CD4⁺ T 세포의 존재와 함께 특정 HLA 클래스 II 분자와 RA의 관련성은 질환-관련 HLA-DR 분자가 질환-관련(예컨대 활막성) 자가 항원을 제시하고 활막 T 세포를 자극 및 팽창시키고 그 후 염증 과정을 유발하는 질환 유도 모델을 뒷받침하고 있다(Striebich, C.C. 외, Immunol 161 (1998) 4428-4436).

MHC 클래스 II HLA-DR (간단히 DR) 단백질은 헤테로다이머로서 단백질 결합 그루브(protein binding groove) 내에서 펩타이드 항원에 결합하는 단형성(monomorphic) α-사슬과 극도의 다형성(polymorphic) β-사슬로 이루어져 있다. 이러한 그루브는 일반적으로 펩타이드의 1, 4, 6 및 9번 상대 위치에 측쇄를 허용하는 4개의 큰 포켓(pocket)을 갖는다(Stern, L.J. 외, Nature 368 (1994) 215-221). HLA 클래스 II 분자 간의 대립 유전자 변이형들로 인해 항원성 펩타이드에 결합하는 능력차가 생긴다. 이는 왜 HLA 대립 유전자가 서로 상이한 개체들이 분지(divergent) 항원성 펩타이드 레퍼토리를 가지고 이로 인해 면역 반응의 질적 차이를 초래하는지에 대한 근본 이유이다(Messaoudi, I. 외, Science 298 (2002) 1797-1800).

크기 면에서 클래스 II MHC 분자가 결합한 펩타이드(11-25개의 아미노산)는 일반적으로 클래스 I MHC 분자가 결합한 펩타이드(8-10개의 아미노산)보다 길고 이종성이 크다. 이러한 차이는 클래스 II 단백질의 펩타이드 결합 그루브가 개방형이고 펩타이드가 중간에 꽉 잡혀있는 동안 그 말단이 그루브로부터 여러 방식으로 팽창할 수 있기 때문에 일어나는 것이다(Jones, E.Y., Curr Opin Immunol 9 (1997) 75-79). 그 결과 클래스 II 분자는 "T 세포 에피토프(epitope)"라 불리는 공통 중심 서열(common core sequence)을 공유하나 그 길이는 서로 다른 중첩(overlapping) 펩타이드 세트에 통상적으로 결합한다.

다형성에 있어 차이를 나타내긴 하겠지만 RA-연결된 DRB1 대립 유전자에 의해 암호화된 DRβ 사슬 전부가 "공유 에피토프(shared epitope)"로 알려진 동일 또는 거의 동일한 아미노산을 67-74번 위치에 공유한다는 점을 10년보다 훨씬 이전에 인식하였다(Gregersen, P.K. 외, Arthritis Rheum 30 (1987) 1205-1213). 자가 항원에 대한 면역성이 RA의 중심 병인으로 간주되어 왔으므로 공유 에피토프는 적어도 2개의 상이한 매카니즘(첫째, 제시되는 동안 관련있는 자가 항원성 펩타이드를 선별하는 매카니즘, 및 둘째, 개체 발생 동안 적당한 자가 반응성 T 세포 특이성을 선별하는 매카니즘)에 의해, 각각의 DR 분자에 질환을 연계(disease linkage)시킬 수 있다는 가설이 세워졌다. 게다가 DR 분자의 3차원 구조로부터 공유 에피토프가 펩타이드 결합 그루브의 한쪽 면에 인접한(flanking) α-헬릭스의 중심에 위치함을 밝혀졌다(Stern, L.J. 외, Nature 368 (1994) 215-221). 따라서 전략상 이러한 공유 에피토프 영역은 결합 펩타이드 및 T 세포 수용체 모두와 상호작용할 수 있는 방향으로 위치하게 된다.

그러나 류마티즘학 연구에서 해결되지 않은 미스테리 중 하나는 사람에게서 RA의 발병 및 발달을 일으키는 주(主) 관절염 유발(arthritogenic) 항원 및 에피토프가 무엇인가 하는 문제이다. 특이성이 상이한 자가 항체가 환자의 혈청 및 활액에서 동정되긴 하였지만 연골이 분해되는 시기에 방출되는 항원이 병리 기전의 개시인 것인지 또는 그 항원은 단지 염증으로 인해 항원이 퍼진 것에 불과한 것인지는 종종 불분명하다(Corrigall, V.M. & Panayi G.S., Crit Rev Immunol 22 (2002) 281-293). 또한 관절을 포함한 인체에 전반적으로 항원이 존재하는 병리 매카니즘을 정의하는 것은 어렵지만 그 병리는 단독으로 또는 우세하게 관절에 표적화된다.

자가 항원

RA에서 가능한 자가 항원의 대다수는 오랜 만성 RA를 앓고 있는 환자의 혈청이나 다소 덜 빈번하게는 T 세포를 이용한 연구로부터 유래된다. DR 분자의 전후에서 제안되고 있는 가장 유력한 관절-특이 항원 중 하나는 제II형 콜라겐(type II collagen, CII)으로 이는 관절 연골 내에서 우세한 단백질이다. 항-CII 항체가 RA의 병인인지 아닌지 아직 명확하지 않긴 하나, CII에 대한 자가항체가 RA 환자의 혈청과 관절에서 고농도로 발견되었다(Banerjee, S. 외, Clin Exp Rheumatol 6 (373-380). Snowden 및 그 동료들은 CII에 대한 RA 환자의 말초 혈액 T 세포의 증식 반응이 항-CII 항체를 가진 환자에게서 대부분 주장됨을 보여주었다. 그러나 상기 반응은 단지 50%의 환자에게서만 나타났다(Snowden, N. 외, Rheumatology 40 (1997) 1210-1218). 마우스 모델에서 CII를 이용한 면역 반응 결과, 클래스 II MHC 대립 유전자 DRB1 ^* 0401 및 ^* 0101을 발현시킨 마우스에서 관절염이 유도되었다(Rosloniec, E.F. 외, J Exp Med 185 (1997) 1113-1122; Rosloniec, E.F. 외, J immunol 160 (1998) 2573-2578). ^* 0401 및 ^* 0101 형질 전환 마우스의 면역 에피토프는 사람 CII의 261-273 잔기에 있는 펩타이드에 국부화되었다(Fugger, L. 외, Eur J Immunol 26 (1996) 928-933). CII의 동일 에피토프는 RA 환자, 특히 초기 질환 단계의 T 세포 반응을 자극할 수 있었다. 활액 T 세포가 특히 반응을 잘 일으켰다(Kim, H.Y. 외, Arthritis Rheum 42 (1999) 2085-2093).

기타 연골 단백질이 RA 후보 항원으로 제안되고 있다 할지라도, DR4-결합 에피토프는 사람의 연골 당단백질 39(human cartilage glycoprotein 39, HCgp39)에 대해서만 단지 정의되어 왔다. 상기 단백질은 활막 세포 및 관절 연골 세포에서 분비되고 염증이 일어나는 동안 혈장과 관절에서 그 발현은 상향 조절(upregulate)된다(Vos, K. 외, Ann Rheum Dis 59 (2000) 544-548). HCgp39 처리시 CII의 경우와 유사하게 마우스에서 관절염이 유발된다. 또한 RA 환자의 말초 혈액 T 세포의 HCgp39 반응이 검출되었다(Verheijden, G.F. 외, Arthritis Rheum 40 (1997) 1115-1125). DR4 환자의 T 세포에 의해 인식되는 우성 에피토프는 263-275의 잔기에서 명백히 나타나며 천연 HCgp39로 면역 후의 DRB1 ^* 0401-형질 전환 마우스에서 발견된 면역우성(immunodominant) 에피토프와 동일하다(Cope, A.P. 외, Arthritis Rheum 42 (1999) 1497-1507). 특이적 질환은 아닐지라도 이러한 펩타이드에 대한 반응은 RA 환자의 질환 활성과 서로 연관이 있었다(Baeten, D. 외, Arthritis Rheum 43 (2000) 1233-1243). 그러나 HCgp39에 대한 항체는 비록 RA에서보다 낮은 농도이기는 하나 염증성 질환, 예컨대 염증성 장 질환 및 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE)를 앓고 있는 환자의 혈청에서도 검출되었다.

RA의 항원 특이적 T 세포를 따르는 시도로 가용성 펩타이드-DR4 테트라머성 복합체를 사용하여 DR4⁺ 환자에서 CII 또는 HCgp39와 반응하는 활막 CD4⁺ T 세포를 검출하였다(Kotzin, B.L. 외, PNAS 97 (2000) 291-296). CII-DR4 복합체는 CII 펩타이드-반응성 T 세포 하이브리도마에 특이적인 방법으로 결합하였지만 활막 CD4⁺ 세포가 검출가능한 분획으로 염색되지 않았다. 거의 비슷한 결과를 HCgp39-DR4 복합체를 사용하여 얻었으며 이는 RA 관절에 존재하는 주요 올리고클론성 CD4⁺ T 세포의 팽창은 전술한 우세한 CII 및 HCgp39 결정자에 대해 특이적이지 않음을 시사한다.

요약하자면 몇가지 결과들이 RA가 CII 및 HCgp39와 관련이 있음을 강력하게 나타내고 있음에도 불구하고, 이들이 RA에 있어 중요한 항원이라는 증거는 불충분하다. CII 또는 HCgp39의 펩타이드가 그 후에 일어나는 활막 CD4⁺ T 세포의 자극 및 활성화와 함께 항원-제시 세포에 의한 클래스 II MHC-제한 방식에서 제시된다는 직접적인 증거는 여전히 부족하다. 랫트나 마우스의 면역에 의한 CII-유도성 관절염은 RA와는 많은 관점에서 다르므로 RA에 대한 이들의 알려지지 않은 상관관계가 동물 모델에서의 큰 문제점이다.

천연 정제된 MHC 클래스 II-관련 펩타이드

RA-특이적 자가 항체 및 T 세포를 동정하는 다른 방편의 전략은 MHC 클래스 II 분자에 결합되어 있는 천연 정제된 펩타이드 항원의 서열 분석에 따라 달라진다. 단클론성 항체의 도움이 있는 경우에는 RA에 대한 감수성이 있는 클래스 II MHC 분자는 동족(cognate) 세포로부터 정제될 수 있다. 작은 펩타이드 혼합물은 HPLC에 의해 분리될 수 있고 그 펩타이드 서열은 에드만(Edman) 시퀀싱이나 질량 분석법으로 측정될 수 있다. 펩타이드 정제와 시퀀싱 기술에는 한계가 있는 탓에 여태까지 펩타이드 서열은 배양된 B 세포주 또는 많은 조직에서 단리된 MHC 분자로부터 수득할 뿐이었고, 그 분석은 몇몇 다량의 펩타이드에 제한적이었다(Kropshofer 외, J.Exp.Med. 175 (1992) 1799-1803; Chicz, R.M. 외, J Exp Med 178 (1993) 27-47). 고분해능 미세모세관 HPLC 컬럼 및 보다 민감한 질량 분석기의 개발로 인하여 MHC-결합 펩타이드를 보다 효과적으로 분석할 수 있게 되었다(Dongre, A.R. 외, Eur J Immunol 31 (2001) 1485-1494; Engelhard, V.H. 외, Mol Immunol 39 (2002) 127-137).

본 발명에서는 변형 펩타이드의 단리 및 시퀀싱 기술을 사용하여 RA 환자에게서 유래한 혈청이나 활액으로 펄싱된(pulse) 자가(autologous) 수지상 세포(dendritic cell, DC)에서 유래한 HLA-DR4 분자의 펩타이드 항원 레퍼토리를 조사하였다. 상기 혁신적인 접근법의 주된 장점은 형질 전환 동물 모델이나 인공 B 세포주를 사용하는 대신, RA-관련 항원의 처리 및 제시에 있어 전문적인 사람의 DC를 사용한다는 것이다.

DC는 류마티스성 활액과 조직에 다량 분포하며, 순환하는 미성숙 전구 세포로부터 유래한다(Thomas, R. 외, J. Immunol 152 (1994) 2613-2623). DC는 다양한 부속(accessory) 분자와 함께 MHC 분자를 높은 수준으로 발현하는 가장 강력한 항원-제시 세포이다(Mellman, I. 외, Trends Cell Biol 8 (1998) 231-237). 최근 연구에서는 RA 활막 관절의 항원-제시 세포와 표현형이 유사한 사람의 체외(ex vivo) 분화된 DC와 대식 세포는 CII 및 HCgp39로부터 면역우성 에피토프를 생성하고 제지할 수 있음을 보여주었다(Tsark, E.C. 외, J Immunol 169 (2002) 6625-6633). DC는 CD4⁺ 헬퍼 T 세포를 준비시키고 효과적으로 세포 독성 CD8⁺ T 세포를 활성화시킬 수 있다(Ridge, T. 외, Nature 393 (1998) 474-478). 따라서 MHC 클래스 II 분자에 결합하고 DC에 의해 제시되는 펩타이드는 T 세포-유발 면역 반응을 수반하는 질환의 병인으로 중요한 역할을 한다.

따라서, RA에 대한 MHC 클래스 II 제한된 항원성 펩타이드에 대해서 잘 알지 못해서 생겨난 문제점은 천연 정제된 MHC 클래스 II 관련 RA 항원성 신규 펩타이드 및 이들이 유래된 폴리펩타이드를 RA의 표지자로서 제공함으로써 해결된다.

도 1은 조직 시료의 수지상 세포(DC)-매개성 분석의 다이어그램을 나타낸다. 가장 분화된(specialized) 항원-제시 세포(antigen-presenting cell, APC)인 수지상 세포(DC)는 항원 흡수 및 항원 진행 과정에 있어 최적의 조건 하에서 항원 원료 (예컨대 활액)와 접촉된다. 대조군으로 활액 항원 없이 동일한 조건 하에서 DC를 배양한다. DC가 성숙된 후, 항원-로딩된 MHC 클래스 II 분자를 정제하고 각 MHC 클래스 II-관련 항원성 펩타이드를 분리 및 동정한다.

도 2A는 RA 환자의 혈청으로 펄싱한 수지상 세포에서 단리된 MHC 클래스 II-관련 항원성 펩타이드의 ION-TRAP MS 기재 피크 크로마토그램을 나타낸다. 즉각적인 MS/MS 동정을 위해 이온 트랩 질량 분석기 내에 넣은 RP-C18-HPLC 컬럼에서 펩타이드를 직접 용출하였다. 수치는 각각의 시간에서 혼합물의 가장 우세한 펩타이드 피크의 체류 시간(위쪽 수치) 및 분자 질량(아래쪽 수치)을 나타낸다.

도 2B는 체류 시간 65.4분에서의 항원성 펩타이드의 ION-TRAP MS 스펙트럼을 나타낸다. 표시된 피크는 추가로 단편화하여 전하를 2배로 띤 인터-알파-트립신 억제제 ITIH4의 펩타이드 이온에 대응시켰다(표 3 참조).

도 2C는 m/z 997.1에서 전하를 2배로 띤 펩타이드의 ION-TRAP MS/MS 스펙트럼을 나타낸다. SEQUEST 알고리즘을 이용하여 사람의 단일(non-redundant) 데이터베이스에 대해서 모이온의 질량과 함께 단편 질량을 찾아보았다. 검색된 서열 MPKNVVFVIDKSGSMSGR(1문자 코드)은 인터-알파-트립신 억제제의 우성 에피토프 ITIH4(271-288)에 대응시켰다. 일련의 할당된 N-말단 B-이온 및 C-말단 Y-이온의 위치를 표시한다.

도 3은 HLA - DRB1 ^* 0401 대립 유전자에 대한 결합에 있어 시험된 후보 RA 항원의 차등있는 결합능을 요약한 것이다. 회색 박스 부분이 추정 HLA - DRB1 ^* 0401 결합 모티프이다. 친화력 측정으로서, 일정량의 바이오틴이 붙은 HA(307-319) 펩타이드의 결합을 경쟁을 통해 50%(IC₅₀)까지 감소시키기 위해 필요했던 펩타이드 농도를 측정하였다. 역수(1/IC₅₀)는 펩타이드 친화력과 직접적인 상호연관이 있다. 보고자로서 인플루엔자 혈구응집소의 바이오틴이 붙은 HA(307-319) 펩타이드가 본 연구에 포함되었다(Rothbard, J.B. 외, Cell 52 (1988) 515-523).

본 발명은 미란성 및 비미란성 RA에서 후보 RA 표지자인 천연 정제된 항원성 신규 펩타이드를 제공한다. 이들 항원성 펩타이드는 오랜 미란성 또는 비미란성 RA를 앓고 있는 환자에게서 유래한 혈청 또는 활액으로 펄싱된 수지상 세포로부터 유래한 사람의 MHC 클래스 II HLA-DR 분자에 의해 제시된다. 본 발명의 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드는, (a) 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 1 내지 39 및 서열번호 58 내지 102로 이루어진 군으로부터 선택된 상응 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하며, 인터페론-γ-유도가능 라이소좀성 티올 환원효소(reductase), 인테크린 베타-2, 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제, 유로키나제형 플라스미노겐 활성제, 면역글로불린 중쇄 V-III 영역(V_H26), DJ-1 단백질, 아포지질단백질 B-100, 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 8, 인터루킨-1 수용체, 피브로모듈린, GM-CSF/IL-3/IL-5 수용체, 소팅(sorting) 넥신 3, 인터-α-트립신 억제제 중쇄 H4, 보체 C4, 보체 C3(α-사슬), 보체 C3(β-사슬), SH3 도메인-결합 글루탐산-풍부-유사 단백질 3, 인터루킨-4-유도 단백질 1, 헤모펙신, Hsc70-상호작용 단백질, 불변 사슬(invariant chain, Ii), 레티놀산 수용체 반응체(responder) 단백질 2, 피브로넥틴, 카텝신 B, 트리펩티딜-펩티다제 II, 레구메인(legumain), 혈소판 활성 인자 수용체, 폴리-알파-2,8-시알릴트랜스퍼라제, 및 ras-관련 단백질 Rab-11B에서 비롯된다. 또한 본 발명은 이러한 항원성 펩타이드 및 이들이 유도된 단백질을 미란성 및/또는 비미란성 RA에 대한 표지자로서 제공한다. 또한, 본 발명은 MHC 클래스 II 분자에 연결된 이러한 항원성 펩타이드는 물론 상기 항원성 펩타이드와 반응하는 항체, 상기 항원성 펩타이드를 암호화하는 핵산, 및 핵산 작제물 그리고 상기 항원성 펩타이드를 발현하는 숙주 세포 및 그 발현 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 RA 항원성 펩타이드의 단리 및 동정 방법을 제공한다.

본 발명의 항원성 펩타이드는 MHC 분자와 관련되고 이 분자에 의해 제시되는 펩타이드로서 따라서 T 세포를 활성화 또는 내성화(tolerize)할 가능성을 가질 수 있다. 따라서 MHC 클래스 II 분자에 의해 제시되는 항원성 펩타이드는 MHC 클래스 II 관련 또는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드인 반면, MHC 클래스 I 분자에 의해 제시되는 항원성 펩타이드는 MHC 클래스 I 관련 또는 MHC 클래스 I 항원성 펩타이드이다.

체내 게놈 내에 암호화되어 있는 단백질 또는 항원-제시 세포(antigen-presenting cell, APC)에서 유래되는 펩타이드는 "자기-펩타이드(self-peptide)"로 지칭된다. 말초 림프 기관에 있는 DC에 의해 제시되는 자기-펩타이드의 주된 기능은 자기-단백질에 대한 T 세포 내성(tolerance)을 유도하는 것이라고 생각된다. 내성은 항원에 대하여 더 이상 반응하지 못하는 것이다; 자기 조직에서 그 항원이 나온 경우 그 내성을 자기 내성이라 한다.

개체 그 자체에서 유래한 항원을 "자기 항원(self antigen)" 또는 "자가 항원(autoantigen)"이라 한다. 자기 항원에 대해 대항하는 적응 면역 반응은 자가 면역 반응이라 한다. 이와 마찬가지로 자기 항원에 특이적인 적응 면역성을 자가 면역성이라 한다. 자가 반응성은 자기 항원에 대해 대항하는 면역 반응을 의미한다. RA는 아마도 자가 반응성 T 세포 및/또는 자가 반응성 항체의 연관에 기초한 자가 면역 반응에 의한 것이다. 그렇지만 면역원성 펩타이드는 세포 또는 호르몬 면역 반응을 일으키거나 이를 자극할 수 있는 항원성 펩타이드를 포함하며 이에 제한되지 않는다. 상기 펩타이드는 항체와 반응할 수도 있다.

박테리아, 바이러스 및 기타 침입자의 게놈 내에 암호화되어 있는 단백질에서 유래하고 자기 단백질과는 상이한 펩타이드는 "외래 항원성" 또는 "외래" 펩타이드라 한다. 이러한 펩타이드는 이들이 유래된 외래 단백질에 대항하는 T 세포 반응을 이끌어낼 수 있다.

RA 항원성 펩타이드는 자기 항원으로 작용하는 자기-펩타이드로 그 질환의 결과로서 자기 조직에 대항하는 잘못된 자가 반응성을 유발한다.

본 발명은 (a) 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 1 내지 39 및 서열번호 58 내지 102로 이루어진 군으로부터 선택된 상응 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드를 제공한다. 바람직하게는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드는 26개 미만의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 11개 내지 25개의 아미노산 길이를 갖는다. 가장 바람직한 본 발명의 항원성 펩타이드는 4개의 앵커(anchor) 아미노산을 포함하는 펩타이드 결합 모티프로 이루어진다.

또한 본 발명은 (a) 적어도 서열번호 49로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 상응 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 49로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드를 제공한다.

또한, (a) 적어도 서열번호 103으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 58 및 59에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 103으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 제공된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 104로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 60에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 104로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 제공된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 105로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 61에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 105로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 제공된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 106으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 62에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 106으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 제공된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 107로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 63에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 107로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 제공된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 50으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 5에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 50으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 제공된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 108로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 64 내지 67에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 108로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 제공된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 109로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 68에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 109로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 제공된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 110으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 69 및 70에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 110으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 제공된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 111로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 72에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 111로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 제공된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 112로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 73에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 112로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 제공된다.

본 발명의 MHC 클래스 II 관련 항원성 신규 펩타이드는 인터페론-γ-유도가능 라이소좀성 티올 환원효소(서열번호 1 내지 3), 인테크린 베타-2(서열번호 58 및 59), 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제(서열번호 60), 유로키나제형 플라스미노겐 활성제(서열번호 61), 면역글로불린 중쇄 V-III 영역(V_H26)(서열번호 62), DJ-1 단백질(서열번호 63), 아포지질단백질 B-100(서열번호 4 및 5), 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 8(서열번호 64 내지 67), 인터루킨-1 수용체(서열번호 68), 피브로모듈린(서열번호 69 및 70), GM-CSF/IL-3/IL-5 수용체(서열번호 71 및 72), 소팅 넥신 3(서열번호 73), 인터-α-트립신 억제제 중쇄 H4(서열번호 6 내지 12), 보체 C4(서열번호 13 내지 18), 보체 C3(α-사슬)(서열번호 19 내지 23, 74 및 75), 보체 C3(β-사슬)(서열번호 76 및 77), SH3 도메인-결합 글루탐산-풍부-유사 단백질 3(서열번호 24 내지 27), 인터루킨-4-유도 단백질 1(서열번호 28 내지 30), 헤모펙신(서열번호 31 내지 35 및 78), Hsc70-상호작용 단백질(서열번호 36 내지 39), 불변 사슬(Ii)(서열번호 79 내지 83), 레티놀산 수용체 반응체 단백질 2(서열번호 84 내지 86), 피브로넥틴(서열번호 87 내지 91), 카텝신 B(서열번호 92), 트리펩티딜-펩티다제 II(서열번호 93 및 94), 레구메인(서열번호 95), 혈소판 활성 인자 수용체(서열번호 96), 폴리-알파-2,8-시알릴트랜스퍼라제(서열번호 97), 및 ras-관련 단백질 Rab-11B(서열번호 98 내지 102)에서 비롯된다.

MHC 클래스 II 분자의 단일 펩타이드 결합 그루브의 길이는 약 25Å이나, 그 양 측면 모두가 개방되어 있다는 점에서 MHC 클래스 I 분자와 현저히 다르다(Stern LJ 외, Nature 1994; 368, 215-221). 따라서 사람의 MHC 클래스 II 분자에서 용출된 천연 정제된 항원성 펩타이드의 최소 길이는 약 11 잔기이며 최대 길이는 약 25 잔기이다 (Chicz RM 외, J Exp Med 1993; 178, 27-47).

MHC-펩타이드 상호작용의 안정성은 결합 그루브의 특이성 포켓과 펩타이드 상에 적절히 위치한 아미노산 측쇄 사이의 상보성 및 펩타이드 골격과 연관있는 12개 이상의 수소 결합에 의해 결정된다. 각각의 포켓에 꼭 들어맞는 펩타이드의 아미노산을 "앵커" 잔기라 명명한다. 대부분의 HLA-DR 대립 유전자와 관련하여 이러한 앵커는 상대 위치 P1, P4, P6 및 P9에 위치한다. 각각의 HLA-DR 대립 유전자 생성물이 안정성이 높은 결합을 가지도록 하는 상기 4개 위치에 있는 아미노산의 조합은 대립 유전자에 따라 변한다. 본원에서 펩타이드 결합 모티프는 4개의 앵커 아미노산을 포함하는 9개의 아미노산 서열로 정의된다. 본 발명의 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드의 펩타이드 결합 모티프는, 서열번호 49로 표시되는 인터페론-γ-유도가능 라이소좀성 티올 환원효소(서열번호 1 내지 3)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 103으로 표시되는 인테크린 베타-2(서열번호 58 및 59)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 104로 표시되는 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제(서열번호 60)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 105로 표시되는 유로키나제형 플라스미노겐 활성제(서열번호 61)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 106으로 표시되는 면역글로불린 중쇄 V-III 영역(V_H26)(서열번호 62)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 107로 표시되는 DJ-1 단백질(서열번호 63)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 50으로 표시되는 아포지질단백질 B-100(서열번호 4 및 5)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 108로 표시되는 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 8(서열번호 64 내지 67)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 109로 표시되는 인터루킨-1 수용체(서열번호 68)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 110으로 표시되는 피브로모듈린(서열번호 69 및 70)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 111로 표시되는 GM-CSF/IL-3/IL-5 수용체(서열번호 71 및 72)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 112로 표시되는 소팅 넥신 3(서열번호 73)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 51로 표시되는 인터-α-트립신 억제제 중쇄 H4(서열번호 6 내지 12)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 52로 표시되는 보체 C4(서열번호 13 내지 18)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 53으로 표시되는 보체 C3(α-사슬)(서열번호 19 내지 23, 74 및 75)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 113으로 표시되는 보체 C3(β-사슬)(서열번호 76 및 77)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 54로 표시되는 SH3 도메인-결합 글루탐산-풍부-유사 단백질 3(서열번호 24 내지 27)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 55로 표시되는 인터루킨-4-유도 단백질 1(서열번호 28 내지 30)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 56으로 표시되는 헤모펙신(서열번호 31 내지 35 및 78)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 57로 표시되는 Hsc70-상호작용 단백질(서열번호 36 내지 39)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 114로 표시되는 불변 사슬(Ii)(서열번호 79 내지 83)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 115로 표시되는 레티놀산 수용체 반응체 단백질 2(서열번호 84 내지 86)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 116으로 표시되는 피브로넥틴(서열번호 87 내지 91)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 117로 표시되는 카텝신 B(서열번호 92)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 118로 표시되는 트리펩티딜-펩티다제 II(서열번호 93 및 94)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 119로 표시되는 레구메인(서열번호 95)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 120으로 표시되는 혈소판 활성 인자 수용체(서열번호 96)에서 유래한 펩타이드, 서열번호 121로 표시되는 폴리-알파-2,8-시알릴트랜스퍼라제(서열번호 97)에서 유래한 펩타이드, 및 서열번호 122로 표시되는 Ras-관련 단백질 Rab-11B(서열번호 98 내지 102)에서 유래한 펩타이드이다.

또한 펩타이드 결합 모티프는 변형되지 않은 펩타이드 결합 모티프의 결합 능은 계속해서 가지면서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 변형이 생긴 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 변형된 펩타이드 결합 모티프는 변형되지 않은 펩타이드 결합 모티프의 4개의 앵커 아미노산 중에서 적어도 3개 이상을 포함한다. 아미노산의 변형은 후술하는 바와 같은 보존적 아미노산 치환일 수 있다.

부가 결합 에너지는 P1 앵커 앞과 P9 앵커 뒤에 있는 잔기와 연관있는 수소 결합에 의해 제공된다. 이에 따라서, 대부분의 천연 정제된 펩타이드에서 노나머성(nonameric) 중심 영역(P1-P9)은 3-4개의 잔기가 N- 및 C-말단에 인접해 있다. 따라서, 대다수 펩타이드들은 15-17-mer이다. 이보다 긴 펩타이드는 그루브에서 튀어나와 있어서 양 끝을 절단하는 엑소펩티다제의 접근이 가능해진다.

따라서 (a) 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 1 내지 39 및 서열번호 58 내지 102로 이루어진 군으로부터 선택된 상응 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드는 부가 결합 에너지를 제공하는 부가적인 N- 및 C-말단 인접 아미노산 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 본 발명의 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드의 상응하는 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합능은 서열번호 1 내지 39 및 서열번호 58 내지 102로 이루어진 군으로부터 선택된 상응하는 펩타이드의 IC₅₀ 값의 10분의 1 내지 10배이다. 펩타이드의 결합능은 표지된 보고자(reporter) 펩타이드의 결합을 50%까지 감소시키는데 필요한 농도를 결정함으로써 측정된다. 이 값을 IC₅₀이라 한다. 확립된 참고용 펩타이드 IC₅₀ 값의 10분의 1 내지 10배 사이의 IC₅₀ 값을 가지는 동안에는 본 발명의 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드는 관련된 HLA 클래스 II 분자에 대한 결합능을 유지한다.

펩타이드의 절단은 그 펩타이드 결합 그루브 내로의 결합 전후에 개개의 방식으로 일어나므로, 공통의 노나머성 중심 영역을 공유하는 몇몇의 절단(truncation) 변이형이 생겨나는 것이 MHC 클래스 II-결합 펩타이드의 공통된 특징이다. 중요한 것은 같은 에피토프의 C- 또는 N-말단 절단 변이형이 분지 T 세포 반응을 유발할 수 있음이 보여졌다는 점이다(Arnold 외, (2002) J.Immunol. 169, 739-749).

몇몇 파라미터는 상대적으로 많은 특정 에피토프의 절단 변이형, 예컨대 많고 완전한 관련 항원, 항원-관련 단백질, 많은 프로테아제, 이용가능한 프로테아제의 형태 및 경쟁적 항원 및/또는 펩타이드의 공급에 영향을 주는 것으로 파악될 수 있다. 항원 공급이 시료의 기원과 서로 관련이 있을 수 있는 큰 특성이므로, 에피토프의 특정 절단 변이형의 비가 진단 값이 될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 자연 발생하는 대응물(counterpart)(예컨대 돌연변이된 펩타이드 항원 등)이 없는 펩타이드이거나, 또는 조직 예컨대 췌장, 간, 비장, 난소, 정소, 근육, 관절 조직, 신경 조직, 위장 조직이나 체액 예컨대 혈액, 혈청, 활액 또는 뇨 내에 그 펩타이드를 천연 수반하는 성분으로부터 단리, 즉 분리 또는 정제된 펩타이드이다. 일반적으로 본 발명의 펩타이드를 포함하는 제조물이 적어도 상기 펩타이드 건조 중량 70% 이상, 단백질 30% 미만 및 자연스런 관련성이 있는 자연 발생적 유기 분자로 이루어진 경우에 그 펩타이드는 "단리된" 것으로 본다. 본 발명의 펩타이드 제조물은 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 99% 이상의 본 발명의 펩타이드 건조 중량으로 이루어지는 것이 좋다. 화학 합성된 펩타이드는 그 본질상 그 펩타이드를 자연적으로 수반하는 성분으로부터 분리되므로, 그 합성 펩타이드는 "단리된" 것이다.

또한 본 발명은 본 발명의 항원성 펩타이드의 유사체(analog)를 제공한다. 유사체란 용어는 결합능 IC₅₀과 면역 체계의 세포 및 항체에 의한 인식을 포함하여 이들 항원성 펩타이드의 기능적인 면을 보여주는 임의의 펩타이드를 포함한다. 유사체는 상응하는 참조용 펩타이드와 본질적으로 동일한 IC₅₀을 나타낸다. 또한 유사체란 용어는 그 펩타이드의 보존적 치환체 또는 화학적 유도체를 포함한다.

"유사체"란 용어는 본원에 기술된 바와 같은 펩타이드의 기능적인 면을 보여주고 하나 이상의 잔기가 기능적으로 비슷한 잔기로 보존적으로 치환된 본원에 기술된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 잔기 서열을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 보존적 치환의 예로는 하나의 비-극성(소수성) 잔기, 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 또다른 잔기로의 치환, 하나의 극성(친수성) 잔기의 또다른 잔기로의 치환, 예컨대 아르기닌과 라이신, 글루타민과 아스파라긴, 트레오닌과 세린 간의 치환, 하나의 염기성 잔기, 예컨대 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘의 또다른 잔기로의 치환, 또는 하나의 산성 잔기, 예컨대 아스파트산 또는 글루탐산의 또다른 잔기로의 치환 등이 있다.

또한 "보존적 치환"이란 용어는 유도되지 않은 아미노산을 대신해서 화학적으로 유도된 아미노산을 사용하는 것을 포함한다. "화학적 유도체"는 측면 작용기의 반응에 의해 화학적으로 유도된 하나 이상의 아미노산을 갖는 대상 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 유도 분자의 예로는 유리 아미노기가 유도되어 아민 하이드로클로라이드, p-톨루엔 설포닐기, 카보벤족시기, t-부틸옥시카보닐기, 클로로아세틸기, 아세틸기 또는 포르밀기를 형성하는 분자를 포함한다. 유리 가르복실기는 유도되어 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 그밖의 형태의 에스테르나 하이드라자이드를 형성할 수 있다. 유리 하이드록실기는 유도되어 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성할 수 있다. 히스티딘의 이미다졸 질소는 유도되어 N-im-벤질히스티딘을 형성할 수 있다. 또한 화학적 유도체로서 12개의 표준 아미노산 중의 자연 발생하는 아미노산 유도체를 하나 이상 함유하는 펩타이드나 단백질이 포함된다. 예를 들어 프롤린을 4-하이드록시프롤린으로 치환할 수 있고; 라이신을 5-하이드록시라이신으로 치환할 수 있고; 히스티딘을 3-메틸히스티딘으로 치환할 수 있고; 세린을 호모세린으로 치환할 수 있고; 그리고 라이신을 오르니틴이나 시트룰린으로 치환할 수 있다.

본 발명의 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드 및 이들이 유래된 단백질은 RA 진단에서의 표지자 및 치료 요법에 있어서의 항-RA 백신으로서 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 표지자(marker)라 함은 진단성 질환, 예컨대 RA를 앓고 있는 환자군에서 발현되며 대조군과 비교할 때 그 양이 유의적으로 증가하거나 또는 감소하는 생물 분자(biomolecule), 바람직하게는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다.

본 발명의 표지자는 질환에 대한 감수성을 예측하는, 예컨대 RA에 대한 민감성을 예측하는 예후 표지자로서, 질환의 진단, 예컨대 RA의 진단에 대한 진단 표지자로서, 다른 형태의 질환 사이를 구별하는, 예컨대 다른 형태의 RA 간을 구별하는 구별 진단 표지자로서, 질환 과정의 예측, 예컨대 RA의 예후에 대한 예후 표지자로서, 그리고 치료 양생법의 효능을 측정하는 반응 표지자, 예컨대 RA의 치료에서 반응 표지자로서 사용될 수 있다.

추가 실시양태에서는, (a) 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 1 내지 39 및 서열번호 58 내지 102로 이루어진 군으로부터 선택된 상응 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 미란성 및/또는 비미란성 RA에 대한 표지자로서 사용된다.

추가 실시양태에서는, (a) 적어도 서열번호 49로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 상응 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 49로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 비미란성 RA에 대한 표지자로서 사용된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 103으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 58 및 59에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 103으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 비미란성 RA에 대한 표지자로서 사용된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 104로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 60에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 104로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 비미란성 RA에 대한 표지자로서 사용된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 105로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 61에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 105로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 비미란성 RA에 대한 표지자로서 사용된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 106으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 62에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 106으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 비미란성 RA에 대한 표지자로서 사용된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 107로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 63에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 107로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 비미란성 RA에 대한 표지자로서 사용된다.

추가 실시양태에서는, (a) 적어도 서열번호 50으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 5에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 50으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 미란성 RA에 대한 표지자로서 사용된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 108로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 64 내지 67에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 108로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 미란성 RA에 대한 표지자로서 사용된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 109로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 68에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 109로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 미란성 RA에 대한 표지자로서 사용된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 110으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 69 및 70에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 110으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 미란성 RA에 대한 표지자로서 사용된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 111로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 72에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 111로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 미란성 RA에 대한 표지자로서 사용된다.

또한, (a) 적어도 서열번호 112로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 73에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 112로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 미란성 RA에 대한 표지자로서 사용된다.

추가 실시양태에서는, MHC 클래스 II 분자에 연결된 전술한 바와 같은 본 발명의 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 제공된다.

본 발명에 따른 공유 또는 비공유 결합된 펩타이드를 함유하는 클래스 II MHC 분자의 멀티머(multimer)(예컨대 다이머, 트라이머, 테트라머, 펜타머, 헥사머 또는 올리고머)는 검출가능한 표지(예컨대 형광성 부분(moiety), 방사성 핵종(radionuclide) 또는 정해진 파장의 빛을 흡수 또는 방출하는 생성물을 얻는 반응을 촉매하여 효소)와 결합(conjugate)하게 되면, 상기 복합체에 특이적이라 이에 결합할 수 있는 세포 표면 수용체를 가진 대상(예컨대 환자)으로부터 T 세포를 정량하는데 사용될 수 있다. 비교적 많은 수의 T 세포는 질환의 증상을 나타내고 T 세포가 질환에 대한 면역성에 관련이 있음을 나타내는 것으로 보인다. 또한 멀티머-결합 T 세포의 상대적인 수를 계속해서 모니터함으로써 질환의 진행 과정이나 치료 효능을 확립하는데 유용할 수 있다. 상기 검정법은 HIV-1-유래 또는 인플루엔자 바이러스-15 유래 펩타이드를 함유하는 클래스 I MHC 분자의 테트라머를 이용하여 개발되어 왔으며(Altman 외 (1996), Science 274:94-96; Ogg 외 (1998), Science 279:2103-21061), 상응하는 클래스 II MHC 멀티머도 비슷한 유용성을 가질 것으로 기대된다. 상기 복합체는 관심 펩타이드의 존재 하에 정제된 클래스 II MHC 분자를 화학적으로 교차-연결시킴시킴으로써 제조되거나 또는 하나로 정해진 펩타이드를 함유하는 클래스 II MHC 분자의 제조에 대해 이미 확립된 재조합 기술을 변형시킴으로써 제조될 수 있다(Kazono 외 (1994), Nature 369:151-154; Gauthier 외 (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:11828-118331). 상기 멀티머 중 클래스 II MHC 분자 모노머는 전장(full-length) 알파 사슬과 베타 사슬로 이루어진 천연 분자일 수 있다. 다른 방편으로, 이 모노머는 알파 및 베타 사슬의 세포외성 도메인 또는 펩타이드 결합 틈(cleft)의 "벽(wall)"과 "바닥(floor)"을 형성하는 알파 및 베타 사슬 도메인을 함유하는 분자일 수 있다.

또한 본 발명은 상술한 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드로 향하고 이와 반응하는 항체, 그 단편 또는 유도체에 관한 것이다. 항체 제조의 일반적인 방법은 널리 공지되어 있고 Kohler 및 Milstein, 1975, Nature 256, 494 또는 J.G.R. Hurrel, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press Inc., Boco Raron , FL (1982)에서 예를 통해 개시하고 있다. 항체는 다클론성 또는 바람직하게는 단클론성, 또는 F(ab')2, Fab, Fv 또는 scFv와 같은 항체 단편일 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 사람화된(humanized) 항체이거나(Merluzzi S. 외 (2000, Adv. Clin. Path., 4(2):77-85) 또는 사람의 항체일 수 있다(Aujame L. 외, Hum. Antibodies, (1997), 8(4):155-168).

또한 본 발명은 (a) 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 1 내지 39 및 서열번호 58 내지 102로 이루어진 군으로부터 선택된 상응 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접(flanking) 서열을 갖는 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 바람직한 핵산 분자는 DNA 분자이다.

또한 MHC 클래스 II 분자에 연결된 본 발명의 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자가 제공된다.

또한 본 발명은 상술한 바와 같은 핵산 분자를 포함하고 발현 벡터에 작동가능하게 연결된 재조합 핵산 작제물을 제공한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 발현 벡터는 항원성 펩타이드 또는 MHC 클래스 II 분자에 연결된 항원성 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 1개 이상의 발현 제어 요소를 포함한다. 재조합 발현 작제물는 DNA 작제물일 수 있다.

발현 제어 요소는 벡터 내에 삽입되어 본 발명의 항원성 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 제어하고 조절한다. 발현 제어 요소의 예로는 lac 시스템, 파아지 람다의 오퍼레이터(operator)와 프로모터(promoter) 영역, 효모 프로모터 및 폴리오마, 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 SV40에서 유래한 프로모터 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 부가적으로 바람직하거나 또는 필요한 작동 요소는 리더(leader) 서열, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 숙주계 내에서 핵산 서열의 적당한 전사 및 그에 따른 번역에 필요하거나 이에 바람직한 그밖의 임의 서열 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 당해 기술분야의 숙련가는 필요하거나 바람직한 발현 제어 요소의 알맞은 조합은 선택한 숙주계에 따라 달라진다는 점을 이해할 것이다. 또한 발현 벡터는 숙주계 내에서 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터의 전이 및 그에 따른 복제에 필요한 부가 요소를 함유해야 한다는 점도 이해할 것이다. 그러한 요소들로는 복제 기점(origin) 및 선별가능한 표지자 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 벡터가 종래의 방법을 사용하여 용이하게 작제되거나("DNA Isolation and Sequencing", Bruce A. Roe, Judy S. Crabtree and Akbar S. Khan, Published by John Wiley & Sons, 1996) 또는 상업적으로 입수가능하다는 점을 당해 기술분야의 숙련가는 이해할 것이다.

본 발명의 또다른 측면은 상술한 바와 같은 핵산 분자를 포함하고 발현 벡터에 작동가능하게 연결된 재조합 핵산 작제물이 삽입된 숙주 생물 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명에 포함된 핵산 작제물로 형질전환된 숙주 세포는 진핵 생물, 예컨대 동물, 식물, 곤충 및 효모 세포 및 원핵 생물, 예컨대 대장균(E.coli)을 포함한다. 핵산 서열을 운반하는 핵산 작제물을 세포 내로 도입하는 방법에는 미세 주입(microinjection)법, 전기 천공(electroporation)법, 형질 도입(transduction)법, 또는 DEAE-덱스트란을 이용한 형질 전환(transfection)법, 리포펙션(lipofection)법, 칼슘 포스페이트법 또는 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 그밖의 방법 등이 있으며(Sambrook 외 (1989) in "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York), 이에 제한되지 않는다.

바람직한 실시양태에서, 진핵 세포에서 기능하는 진핵 세포성 발현 벡터가 사용된다. 그러한 벡터의 예로는 레트로바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 파울 폭스 바이러스 벡터, 플라스미드, 또는 베큘로바이러스 전이 벡터 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 진핵 세포성 세포주는 COS 세포, CHO 세포, HeLa 세포, NIH/3T3 세포, 293 세포(ATCC#CRL15731), T2 세포, 수지상 세포, 단핵구 또는 엡스타인-15 바(Epstein-15 Barr) 바이러스 형질전환된 B 세포를 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항원성 펩타이드는 예를 들어 천연 원료(source)로부터의 추출(예컨대 MHC II 분자로부터의 용출); 펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산의 발현; 또는 화학 합성에 의해 수득될 수 있다. 천연 유래 원료와 상이한 세포계에서 생성된 펩타이드는 자연적으로 그 펩타이드를 수반하는 성분으로부터 분리될 것이기 때문에 "단리된" 것이다. 숙주 생물에 의해 발현된 재조합 펩타이드는 조질 용해물(lysate)로서 수득하거나 또는 당해 기술분야에 공지된 표준 단백질 정제 과정, 예컨대 분별(differential) 침전, 크기별 배제(size exclusion) 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 등전 집중, 겔 전기 영동, 친화력 크로마토그래피 및 면역 친화력 크로마토그래피 등에 따라 정제할 수 있다. 단리의 정도와 순도는 임의의 적절한 방법, 예컨대 질량 분석법이나 HPLC 분석법으로 측정할 수 있다. 본 펩타이드는 Merrifield, (1986) Science 232:341-347, 및 Barany와 Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds (N.Y., Academic Press), pp, 1-284 (1979)에 기재된 과정에 따라 합성하여 제조될 수 있다. 합성은 용액상이나 고체상에서 실행하거나 또는 자동화 합성기를 이용하여 실행할 수 있다(Stewart 및 Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Rockford III., Pierce Chemical Co. (1984)).

따라서, 본 발명은 또한 상기한 바와 같은 재조합 핵산 작제물을 함유하는 숙주 세포를 상기 펩타이드의 발현 조건 하에서 배양하는 단계 및 그 세포 또는 배양액으로부터 펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, (a) 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 1 내지 39 및 서열번호 58 내지 102로 이루어진 군으로부터 선택된 상응 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접(flanking) 서열을 갖는 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 추가 실시양태에서는, (a) 0.1㎍ 내지 5㎍의 MHC 클래스 II 분자를 포함하는 미성숙 수지상 세포를 제공하는 단계; (b) (a)의 세포를 혈청 또는 활액과 접촉시키고 TNF알파를 가하여 수지상 세포의 성숙을 유도하는 단계; (c) 세포의 가용화시키고 면역 침전이나 면역 친화성 크로마토그래피에 의한 항원성 펩타이드를 갖는 MHC 클래스 II 분자 복합체를 격리시키는 것을 포함하는 방법을 사용하여 상기 세포로부터 클래스 II MHC 분자-항원성 펩타이드 복합체를 단리하는 단계; (d) 항원성 펩타이드를 갖는 MHC 클래스 II 분자의 격리된 복합체를 한외여괴 튜브에서 물로 세척하는 단계; (e) 37℃에서 트리플루오로 아세트산 희석액을 가하여 MHC 클래스 II 분자로부터 관련 항원성 펩타이드를 용출시키는 단계; 및 (f) 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법에 의해 단리된 펩타이드를 분리, 검출 및 동정하는 단계를 포함하는, 펨토몰 양으로 존재하는 MHC 클래스 II 관련 RA 항원성 펩타이드의 단리 및 동정 방법이 제공된다. 또한 상기 (f) 단계에서의 액체 크로마토그래피는 펩타이드의 용출 단계에 앞서 대부분의 오염체를 용출시키기에 충분한 부피를 가하여 역상 물질로부터 나오는 첫번째 선형 용출 단계를 포함한다. 또한 본 방법은 추가로 (g) 다중 데이터세트에 걸쳐 상대적인 데이터 분석을 수행하도록 개발된 데이터베이스와 소프트웨어를 포함하는 방법을 사용하여 상기 동정된 펩타이드를 분석하는 단계를 포함한다.

예컨대 MHC 클래스 II 분자 100ng을 수득하는데 필요한 조직 또는 체액의 양은 MHC 클래스 II를 발현하는 세포의 숫자와 MHC 클래스 II 분자의 발현 비율에 달려 있다: 예컨대 100ng의 MHC 클래스 II는 약 2×10⁵ 성숙 DC 또는 약 50ml 혈액에서 수득할 수 있는 약 5×10⁷ 말초 혈액 단핵 세포 또는 5 내지 10×10⁶ 말초 혈액 단핵구와 등가(equivalent)이다.

세포나 조직으로부터 클래스 II MHC 분자-항원성 펩타이드 복합체를 정제하기 위해서는 세포막이나 조직막을 가용화시켜야만 한다. 당해 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 동결-해동 순환 및 세제의 사용 및 이들의 조합으로 세포를 용해(lysis)시킬 수 있다. 세제, 바람직하게는 TX-100, NP40, n-옥틸글루코사이드, 쯔비터제(Zwittergent), 루브롤(Lubrol), CHAPS, 가장 바람직하게는 TX-100 또는 쯔비터제(Zwittergent) 3-12를 사용하여 가용화하는 것이 바람직한 용해 방법이다. 원심분리를 통해 가용화된 수용체-펩타이드 복합체를 함유하는 세포 용해액으로부터 세포 파편(debris)과 핵을 제거하여야 한다. 따라서, 항원성 펩타이드와 클래스 II MHC 분자의 복합체는 세제를 이용한 가용화를 포함하는 방법을 통해 세포에서 단리된다.

또한, MHC 클래스 II 분자-펩타이드 복합체는 면역 침전 또는 면역 친화력 크로마토그래피를 포함하는 방법을 통해 세포 용해액으로부터 정제된다. 면역 침전이나 면역 친화력 크로마토그래피에는 MHC 클래스 II 분자에 특이적이면서도 이들 방법에 적합한 항체가 이용된다. 특이 항체로는 단클론성 항체가 바람직하며, 이들 항체는 공유 또는 비공유적으로 예컨대 단백질 A를 통해, 세파로스 또는 아가로스 비드(bead)와 같은 비드에 커플링된다. 종래 기술에서 사용되었던 광범위한 항-HLA 항체 패널 중에서 선별된 패널은 다음을 포함한다: 항-HLA-DR 항체: L243, TU36, DA6.147, 바람직하게는 L243; 항-HLA-DQ 항체: SPVL3, TU22, TU169, 바람직하게는 TU22 및 TU169; 항-HLA-DP 항체 B7/21 및 항-HLA-A,B,C 항체 W6/32 및 B9.12.

상이한 MHC 클래스 II 분자에 대해 특이적인 단클론성 항체는 상업적으로 구입하거나(예컨대 Pharmingen, Dianova) 또는 단백질 A- 또는 단백질 C- 친화력 크로마토그래피를 사용하여 각각의 하이브리도마 세포의 상등액으로부터 정제할 수 있다. 정제된 단클론성 항체는 당해 기술분야에 공지된 여러 방법을 통해 커플링될 수 있으며, 이 때 CNBr-활성화 세파로스와 항체 아미노기의 공유 커플링이 바람직하다.

MHC 분자의 면역 단리(immunoisolation)는 몇 시간 동안의 회전하에 세포 용해물과 항체-비드를 함께 항온 배양하거나 또는 미세-컬럼을 통해 세포 용해물을 펌프(pump)하여 크로마토그래피함으로써 수행될 수 있다. 항체-비드는 에펜도르프 튜브나 미세 컬럼 내에서 세척할 수 있다. 면역 침전의 효율은 변성 MHC 분자를 인식하는 항체(항-HLA-DR알파: 1B5; 항-HLA 클래스 I: HC10 또는 HCA2)를 이용한 웨스턴 블럿팅과 SDS-PAGE로 분석될 수 있다.

격리된 MHC 클래스 II 분자-펩타이드 복합체는 용출하기 전에 물이나 저염 완충액으로 세척하여 잔여 세제 오염체가 제거되도록 한다. 저염 완충액으로는 0.5-10mM 농도 범위, 바람직하게는 0.5mM 농도의 Tris, 포스페이트 또는 아세테이트 완충액을 사용할 수 있다. 보다 바람직한 실시양태에서는 MHC 클래스 II 분자-펩타이드 복합체를 일반적으로 HPLC 분석에 사용하는 초순수(ultrapure water)(시퀀싱 등급), 바람직하게는 MERCK에서 구입한 초순수(시퀀싱 등급)로 세척한다. 세척 단계는 한외 여과를 통해 수행할 수 있다. 한외 여과는 컷-오프가 30kD, 20kD, 10kD 또는 5kD, 바람직하게는 30kD이고 튜브 부피가 0.5-10ml인 한외 여과 튜브("Ultrafree" 튜브; Millipore)에서 이루어질 수 있다. 수용체-펩타이드 복합체를 운반하는 비드 부피의 10배 내지 20배의 부피, 바람직하게는 그 비드의 15배의 부피로, 4회 내지 12회, 바람직하게는 6회 내지 10회 반복하여 한외 여과 튜브 내에서 세척할 수 있다. 용출된 펩타이드는 같은 한외 여과 튜브를 이용하여 남아있는 MHC 클래스 II 분자로부터 분리될 수 있다. 그런 다음 용출된 펩타이드는 동결 건조될 수 있다.

MHC 클래스 II 분자에서 펩타이드를 용출함으로써 잠재 항원 원료에서 유래한 천연 정제된 펩타이드와 세포내 또는 세포외 기원의 폴리펩타이드에서 유래한 천연 정제된 펩타이드의 복합체 혼합물이 얻어진다. 오로지 용출 단계를 거친 펩타이드만을 분리하여 서열 분석에 이용수 있다.

본 발명의 방법에서의 항원성 펩타이드는 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법, 바람직하게는 산 희석액, 예컨대 아세토니트릴 희석액(Jardetzky TS 외, Nature 1991 353, 326-329), 아세트산 희석액 및 가열(Rudensky AY 외, Nature 1991, 353, 622-626; Chicz RM 외, Nature 1992, 358, 764-768) 또는 37℃에서의 트리플루오로 아세트산 희석액(Kropshofer H 외, J Exp Med 1992, 175, 1799-1803)을 이용한 방법에 따라 용출될 수 있다. 트리플루오로 아세트산 희석액을 이용하여 37℃에서 펩타이드를 용출시키는 것이 가장 바람직하다.

그런 다음, 단리된 항원성 펩타이드는 분리, 검출 및 동정된다. 검출하게 되면 분리된 항원성 펩타이드 혼합물 내 개별 펩타이드의 아미노산 서열은 펨토몰 양으로 존재하는 펩타이드를 검출하고 시퀀싱하는데 적당한 방법을 통해 밝혀진다. 동정하게 되면 그 항원성 펩타이드가 어떤 폴리펩타이드나 단백질에서 유래하는지 그리고 이들 단백질이나 폴리펩타이드 내에서 어떤 서열을 구성하는지가 확립된다.

첫번째 단계에서 용출된 펩타이드의 복합체 혼합물은 여러가지 크로마토그래피 방법, 예컨대 역상, 음이온 교환, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 이들의 조합 중 한가지 방법에 따라 분리될 수 있다. 바람직하기는 C18-역상 크로마토그래피나 MudPit라 알려진 역상/양이온 교환 2차원 HPLC(Washburn MP 외, Nat Biotechnol., (2001), 19, 242-247)를 사용하여 분리하는 것이 바람직하다.

분리는 질량 분석기의 나노 유체 전자 분무(nano-flow electrospray) 원료에 연결되거나 MALDI 분석 플레이트 상에 분획물을 떨어뜨리는 미세-분획 장치에 연결된 용융(fused)-실리카 미세-모세관 컬럼을 사용한 HPLC 방식으로 행하여진다.

액체 크로마토그래피는 강이온 교환 물질과 소수성 역상 물질의 사용을 통한 펩타이드 분획을 포함한다. 이온 교환 및 역상 물질로부터 펩타이드를 용출시키기 위해서는 염을 사용한 용출 및 유기 용매, 예컨대 아세토니트릴을 사용한 용출을 포함하여 차례로 다른 용출 프로그램이 가동된다. 역상 물질로부터의 용출은 길이와 기울기가 다른 몇 단계의 선형 구배에서 수행된다. 분획될 시료 내의 오염은 그 오염체가 용출하는 경우 질량 분석기에서 펩타이드 피크(peak) 검출과 경합하게 되는 그러한 임의의 오염일 수있다. 따라서, 오염체가 동시에 용출되는 것을 막기 위해서는 펩타이드 용출 단계 이전에 충분한 부피의 용매를 가하여 오염체를 용출시켜야만 한다. 액체 크로마토그래피에 사용되는 컬럼에 따라 달라지긴 하겠지만 펩타이드 용출 단계에 앞서 오염체를 용출시키기에 충분한 용매 부피는 컬럼 부피의 100배 내지 200배일 수 있다.

여러가지 질량 분석 기술이 적합한데, 바람직하게는 MALDI-공급후 붕괴(post source decay, PSD) MS 또는 전자 분무 이온화 텐덤 질량 분석법(electrospray ionization tandem mass spectrometry, ESI-MS)이 좋으며, 가장 바람직하게는 이온-트랩(ion-trap) ESI-MS가 좋다.

각기 펩타이드의 서열은 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 펩타이드를 단편화(fragmentation)시키고 알고리즘, 예컨대 MASCOT 또는 SEQUEST를 이용하여 그 단편 스펙트럼을 컴퓨터로 해석하여 서열을 분석한다. 두 컴퓨터 알고리즘 모두 실험적 및 이론적 텐덤 질량 스펙트럼의 상호-상관관계(cross-correlation)를 분석하기 위해 단백질과 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스를 이용한다. 이로서 처리율(through-put)이 높은 자동화 서열 분석이 가능하게 된다.

본 발명의 단리 및 동정된 항원성 펩타이드는 MHC 결합 모티프, MHC 결합능 및/또는 T 세포 인식을 통해 확인될 수 있다.

MHC 결합 모티프

특정 MHC 분자와 관련된 펩타이드(대립 유전자 변이형)는 결합 모티프라고 칭해지는 공통의 구조적 특성을 가지는데, 이는 MHC 분자와 안정한 복합체를 형성하는데 꼭 필요한 구조이다. MHC 클래스 I 분자에서 용출된 펩타이드 리간드는 8-11개의 아미노산으로 비교적 짧다. 또한, 펩타이드의 2개 또는 3개의 측쇄가 결합에 관여한다. 각기 아미노산 측쇄의 위치는 HLA 대립 유전자에 의하여 변하며, "앵커" 잔기라고 하는 이들 중 2개는 아주 종종 2번과 9번 위치에 위치한다. 특정 앵커의 위치와 관련하여, 단지 1개 또는 2개의 아미노산, 예컨대 HLA-A2의 경우 2번 위치에서의 류신 또는 발린 V이 앵커 아미노산으로서 정상 기능을 수행할 수 있다.

MHC 클래스 II 분자의 펩타이드 길이는 11개 내지 25개 아미노산 범위 내에서 변하는데, 이는 펩타이드 결합 그루브의 양 끝이 개방되어 있어 이보다 긴 펩타이드가 결합할 수 있기 때문이다. 대부분의 HLA 클래스 II 분자는 노나머성 중심 영역에 있는 상대 위치 P1, P4, P6 및 P9에 앵커 잔기를 4개까지 수용한다. 그러나 이러한 중심 영역은 펩타이드의 N-말단으로부터의 거리가 변할 수 있다. 대부분의 경우 2-4 N-말단 잔기가 중심 영역 앞에 있다. 따라서 P1 앵커 잔기는 대부분의 HLA 클래스 II 관련 펩타이드에서 3, 4 또는 5번 위치에 있다. HLA-DR 클래스 II 분자에서 용출된 펩타이드는 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 류신, 이소류신 또는 발린으로 나타나는 커다란 소수성 P1 앵커를 공유한다.

앵커 잔기의 위치와 정확한 형태는 빈번하게 생겨나는 HLA 클래스 II 대립 유전자 생성물 대부분에서 알려져 있는 펩타이드 결합 모티프의 구성요소가 된다. 펩타이드 서열에서 모티프의 타당성 검증(validation)을 가능하게 하는 컴퓨터 알고리즘은 백시놈(vaccinome)에서 입수할 수 있는 "테피토프(Tepitope)"이다.

MHC 결합능

본 발명의 방법에 의해 동정된 펩타이드는 당해 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 단리된 MHC 클래스 II 분자와 본 발명의 방법으로 동정된 펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 가진 합성 펩타이드를 사용하여 적당한 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 그 능력에 대해 시험될 수 있다(Kropshofer H 외, J.Exp.Med. 1992; 175, 1799-1803; Vogt AB 외, J.Immunol. 1994; 153, 1665-1673; Sloan VS 외, Nature 1995; 375, 802-806). 다른 방편으로, MHC 클래스 II 발현 세포주와 바이오틴이 붙은(biotinylated) 펩타이드를 이용한 세포 결합 검정을 사용하여 동정된 에피토프를 검증할 수 있다 (Arndt SO 외, EMBO J., 2000; 19, 1241-1251).

상기 검정 모두에서, 펩타이드의 상대 결합능은 표지된 보고자(reporter) 펩타이드의 결합을 50%까지 감소시키는데 필요한 농도를 결정함으로써 측정된다. 이 값을 IC₅₀이라 한다. 관련된 HLA 클래스 II 분자에 대한 합당한 친화력으로 결합하는 펩타이드는 확립된 참고용 펩타이드 IC₅₀ 값의 10배를 넘지 않는 IC₅₀ 값을 가진다.

또한 동일한 결합 검정을 사용하여 다른 클래스 II MHC 분자, 즉 본 발명의 방법을 이용하여 용출된 것 외의 클래스 II MHC 분자와 결합하는 펩타이드 능력을 시험할 수 있다. 상기 펩타이드를 이용한 본 발명의 진단 방법 및 상기 펩타이드 또는 이들이 유래한 펩타이드를 이용한 본 발명의 치료 방법은 다른 클래스 II MHC 분자를 발현하는 대상에 적용될 수 있다.

T 세포 인식

에피토프의 검증 과정은 CD4+ T 세포 개체를 활성화시키는 능력에 대해 본 발명의 방법에 의해 동정된 펩타이드를 시험하는 것과 관련이 있을 수 있다. 본 발명에서 동정된 펩타이드와 동일하거나 또는 본 발명에서 동정된 펩타이드의 중첩군(nested group)에서 유래한 중심 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 합성한다. 그런 다음, CD4+ T 세포를 활성화시키는 합성 펩타이드의 능력을 (a) 관심사인 MHC 클래스 II 분자를 발현하고 그 질환에 대한 증상을 적어도 한가지 이상 나타내는 대상을 시험하고; (b) 관심사인 MHC 클래스 II 분자를 발현하고 그 질환의 증상을 나타내지 않는 대상을 대조하여 시험한다. 부가적인 대조 대상은 그 질환의 증상은 가지면서 관심사인 MHC 클래스 II 분자는 발현하지 않는 대상일 수 있다.

일부 질환(예컨대 자가 면역 성분이 있는 질환)에서의 (b)에서 기술한 대조 대상의 CD4+ T 세포에서가 아닌 시험 대상의 CD4+ T 세포에서의 반응성은 관련 펩타이드가 관련 질환을 개시, 진행 또는 악화시킬 수 있는 CD4+ T 세포를 활성화시키는 에피토프임을 확인시켜주는 증거를 제공한다. 그밖의 질환(예컨대 자가 면역 성분 없는 감염성 질환이나 암)에서의 앞서 기술한 바와 비슷한 양상의 반응성 및 비반응성은 관련 펩타이드가 질환에 대한 면역성을 매개하거나 또는 적어도 그 질환의 증상 완화를 매개하는 CD4+ T 세포를 활성화시키는 에피토프임을 나타내고 있다.

CD4+ T 세포 반응은 당해 기술분야에 공지된 여러가지 시험관내(in vitro) 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 전체 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 후보 합성 펩타이드와 함께 그리고 없이 배양하고 그 증식 반응을 예컨대 [³H]-티미딘을 그 DNA 내로 삽입(incorporation)시켜 측정할 수 있다. 검정에 앞서 PBMC에서 CD4+ T 세포를 제거하거나 또는 T 세포 상의 CD4+ 분자에 결합하는 억제 항체를 가하여 CD4+ 분자의 증식을 억제함으로써 증식 T 세포가 CD4+ T 세포임을 시험할 수 있다. 모든 경우에서, CD4+ T 세포가 증식 세포인 경우에만 증식 반응이 오로지 저해된다. 다른 방편으로 PBMC로부터 CD4+ T 세포를 정제하여 적당한 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 APC의 존재 하에 펩타이드에 대한 증식 반응을 시험할 수 있다. 상기 APC는 B-림프구, 단핵구, 대식 세포, 또는 수지상 세포 또는 전체 PBMC일 수 있다. 또한 APC는 B-림프구, 단핵구, 대식 세포, 또는 수지상 세포에서 유래한 불멸(immortalized) 세포주일 수 있다. APC는 관심사인 MHC 클래스 II 분자를 발현하거나 또는 상기 분자를 암호화하는 형질 전환된 폴리뉴클레오타이드를 내생적으로(endogenous) 발현할 수 있다. 모든 경우 APC는 검정에 앞서 예컨대 전리 방사선(ionizing radiation)이나 미토마이신-C로 처리함으로써 비-증식성이 되게 할 수 있다.

세포 증식을 측정하는 다른 방편으로서 CD4+ T 세포에 의한 사이토카인의 생성을 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지된 방법으로 측정할 수 있다. 사이토카인은 인터루킨-2(interleukin-2, IL-2), 인터페론-감마(interferon-gamma, IFN-gamma), 인터루킨-4(IL-4), TNF-알파, 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-12(IL-12) 또는 TGF-베타 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 이들을 측정하는 검정으로는 ELISA, 및 시험 시료의 존재 하에 관련 사이토카인에 반응하는 세포에 대해 반응성(예컨대 증식성)을 시험하는 생물 검정 등이 있다.

다른 방편으로, 세포내 면역 형광 염색 및 유세포 분류기(flow cytometry)를 이용하여 CD4+ 림프구에 의한 사이토카인의 생성을 직접 눈으로 볼 수 있다.

또한 본 발명의 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드를 RA의 진단에 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 추가 실시양태는 본 발명에 따른 항원성 펩타이드의 RA에 대한 표지자로서의 용도이다.

바람직하게는 (a) 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 1 내지 39 및 서열번호 58 내지 102로 이루어진 군으로부터 선택된 상응 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접(flanking) 서열을 갖는 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드가 RA에 대한 표지자로서 사용된다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 항원성 펩타이드는 치료 양생법의 효능을 찾아내는 반응 표지자로서 사용될 수 있다. 항원성 펩타이드의 본질적인 기준값을 결정한 다음 정해진 치료제를 투여하고 이어서 그 항원성 펩타이드의 수준을 모니터할 수 있는데, 그 항원성 펩타이드 수준의 변화가 바로 치료 효능을 표시한다.

또한 질환, 예컨대 RA의 특정 단계 또는 특정상에서만 발견되는 항원성 펩타이드는 단계-특이적 표지자로서 사용될 수 있다. 본질적으로, 특정 질환 단계에 연결되어 있는 항원성 펩타이드의 수준을 규칙적으로 모니터함으로 인해 그 질환의 단계 및 그 진행 상황에 대한 정보가 제공된다.

또한 본 발명은 RA 항원성 펩타이드가 유래한 폴리펩타이드의 질환, 바람직하게는 RA, 특히 미란성 대 비미란성 RA의 진단 및 모니터링에 대한 표지자로서의 용도를 포함한다. 각각의 단백질을 사용하는 근거는, DC가 대부분의 조직에 존재하면서 특이적 수용체 및 분화된 세포내 이입작용(endocytotic) 매카니즘(예컨대 거대 음세포 작용(macropinocytosis))을 통해 외인성(exogenous) 항원을 포획하고 이어서 처리된 항원을 MHC 클래스 II 분자 상의 펩타이드로서 제시한다는 점이다. 이전의 연구들은 MHC 클래스 II 분자에서 발견된 펩타이드 에피토프, 예컨대 RA 항원성 펩타이드의 빈도가 대부분의 경우에 있어 이러한 특정 펩타이드가 유래하는 단백질이 많음을 반영한다는 것을 보여주고 있다. 따라서, RA 항원성 펩타이드 뿐만 아니라 그 상응하는 단백질도 RA에 대한 표지자로서 작용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가 실시양태에서는 인터페론-감마-유도가능 라이소좀성 티올 환원효소(서열번호 40), 인테크린 베타-2(서열번호 123), 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제(서열번호 124), 유로키나제형 플라스미노겐 활성제(서열번호 125), 면역글로불린 중쇄 V-III 영역(V_H26)(서열번호 126), DJ-1 단백질(서열번호 127), 아포지질단백질 B-100(서열번호 41), 26S 프로테아좀 비-ATP아제 조절 서브유닛 8(서열번호 128), 인터루킨-1 수용체(서열번호 129), 피브로모듈린(서열번호 130), GM-CSF/IL-3/IL-5 수용체(서열번호 131), 소팅 넥신 3(서열번호 132), 인터-α-트립신 억제제 중쇄 H4(서열번호 42), 보체 C4(서열번호 43), 보체 C3(서열번호 44), SH3 도메인-결합 글루탐산-풍부-유사 단백질 3(서열번호 45), 인터루킨-4-유도 단백질 1(서열번호 46), 헤모펙신(서열번호 47), Hsc70-상호작용 단백질(서열번호 48), 불변 사슬(Ii)(서열번호 133), 레티놀산 수용체 반응체 단백질 2(서열번호 134), 피브로넥틴(서열번호 135), 카텝신 B(서열번호 136), 트리펩티딜-펩티다제 II(서열번호 137), 레구메인(서열번호 138), 혈소판 활성 인자 수용체(서열번호 139), 폴리-알파-2,8-시알릴트랜스퍼라제(서열번호 140), 및 ras-관련 단백질 Rab-11B(서열번호 141)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 RA에 대한 표지자로서의 용도가 제공된다. 바람직하게는, 상기 폴리펩타이드는 미란성 RA에 대한 표지자로서 사용된다. 또한 비미란성 RA에 대한 표지자로서 폴리펩타이드를 사용하는 것도 바람직하다. 특히 인터루킨-4-유도 단백질 1(서열번호 46)의 RA에 대한 표지자로서의 용도가 바람직하다. Fig1 폴리펩타이드는 지금까지 RA에 대한 표지자로서 알려진 바가 없으며 RA에 대한 중요한 후보 표지자로서 간주된다.

RA에 대한 폴리펩타이드 또는 펩타이드 표지자의 조성물 및/또는 발현물을 효소 결합 면역흡착 측정법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 웨스턴 블럿, 면역 침전법 및 면역 형광법 등을 포함한 여러가지 방법으로 시험함으로써 RA를 진단할 수 있다. 개체에서 채취한 시험 시료에 대해서 본 발명의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 조성물의 변화 및/또는 발현물의 변화가 존재하는지를 평가한다. 예를 들어 폴리펩타이드 또는 펩타이드 발현물의 변화는 양적 폴리펩타이드 발현물(예컨대 생성된 폴리펩타이드의 양)의 변화일 수 있고; 폴리펩타이드 조성물의 변화는 질적 폴리펩타이드 발현물(예컨대 돌연변이 폴리펩타이드 발현물 또는 상이한 스플라이싱(splicing) 변이형 발현물)의 변화일 수 있다.

또한 상기 두 변화(질적 및 양적)가 존재할 수 있다. 본원에서 사용된 바의 폴리펩타이드 발현물 또는 조성물의 "변화"는 대조 시료 내의 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 발현물이나 조성물과 대비해 볼 때 시험 시료 내의 발현물이나 조성물의 변화를 언급한다. 대조 시료는 시험 시료에 상응하는 시료(예컨대 동일한 세포 형태에서 유래)로서 RA에 걸리지 않은 개체에서 나온 것이다. 대조 시료와 비교해서 시험 시료 내의 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 발현물 또는 조성물의 변화는 RA 또는 RA에 대한 감수성을 나타낸다. 본 발명의 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 발현물 또는 조성물을 시험하는 여러가지 방법으로는 분광법, 비색법, 전기영동법, 등전 집중법(isoelectric focusing), 및 면역측정법(예컨대, David 외, 미국특허 제 4,376,110호) 예컨대 면역 블럿팅(Current Protocols in Molecular Biology, 특히 10장 참조) 등을 이용할 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체(예컨대 상술한 바와 같다), 바람직하게는 검출가능한 표지가 붙은 항체를 사용할 수 있다. 순수한(intact) 항체 또는 그 단편(예컨대 Fab 또는 F(ab')₂)을 사용할 수 있다. 프로브나 항체와 관련하여 "표지된(labeled)"이란 용어는 검출가능한 물질을 프로브나 항체에 커플링(즉 물리적 연결)함에 의한 프로브나 항체의 직접 표지는 물론 직접 표지된 또다른 반응자(reagent)와의 반응성에 의한 프로브나 항체의 간접 표지를 포함하는 것으로 한다. 간접 표지의 예로는 형광 표지된 2차 항체를 이용한 1차 항체의 검출과 형광 표지된 스트렙타비딘으로 검출할 수 있는 바이오틴을 붙인 DNA 프로브의 말단 표지 등이 있다.

본 발명의 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 상기 기술한 바와 같은 항체를 사용하는 웨스턴 블럿팅 분석으로 시험 시료 내의 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 수준이나 양을 측정하고 이를 대조 시료 내의 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 수준이나 양과 비교할 수 있다. 시험 시료 내의 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 동종 또는 이종 면역 검정법으로 측정하는 것이 바람직하다. 대조 시료 내 폴리펩타이드의 수준이나 양에 비해 통계적으로 그 차이가 유의적일 정도로 높거나 낮은 시험 시료 내 폴리펩타이드의 수준이나 양은 폴리펩타이드 발현물의 변화를 나타낼 뿐 아니라 RA 또는 RA에 대한 감수성을 진단할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드와 반응하는 항체를 포함하는 진단용 조성물에 관한 것이다.

추가 실시양태에서 본 발명의 항원성 펩타이드 또는 이들이 유래한 단백질은 질환, 바람직하게는 RA를 예방 및 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 일 측면은 동정된 하나 이상의 항원성 펩타이드를 사용하여 RA, 바람직하게는 미란성 및/또는 비미란성 RA에 대항하도록 환자에게 예방 접종하는 치료 목적에 있다. 예방 접종 동안 항원성 펩타이드는 환자에게 항원-특이적 T 세포 내성을 유도하고 궁극적으로 질환이 퇴화하거나 또는 질환 진행이 약화되도록 한다.

미래의 임상 시험에서 특이 면역 내성을 유도할 가망이 있는 전략은 DNA 내성 백신을 사용하는 것이다. 자가 항원을 단독으로 암호화하는 DNA 내성 백신은 T 세포 증식 반응을 감소시키는 것으로 나타났으며(Ruiz, P. 외, J Immunol 162(1999) 3336-3341), 또한 자가 항원을 공동 전달하는(co-delivering) DNA 내성 백신+IL-4도 보호 T_H2 반응을 유도하였다(Garren, H. 외, Immunity 15 (2001) 15-22). 개발 중에 있는 비-폴리뉴클레오타이드-특이 내성 치료법의 예로는 단백질 항원, 천연 정제된 펩타이드, 변형된 펩타이드 리간드, 기타 생물 분자, 예컨대 DNA, 또는 번역후 변형을 함유하는 단백질 및 펩타이드, 및 "경구 내성(oral tolerance)"을 유도하도록 입을 통해 전달되는 항원 등이 있다(reviewed in: Robinson, W.H. 외, Clin Immunol 103 (2002) 7-12). 내성 치료법과 관련하여 잠재적인 역효과는 자가 면역성이 발전하는 문제이다.

이 때문에 관련 RA 항원성 펩타이드는 그 펩타이드가 MHC 분자와 결합하고 T 세포의 말초 내성을 유발하기에 충분한 양으로 환자에게 직접 투여될 수 있다.

다른 방편으로, 본 발명의 항원성 펩타이드는 DC에 기초한 백신 생성에 사용될 수 있다. 이런 경우 환자의 단핵구에서 유래한 자가 DC는 관련 펩타이드 및 관련 펩타이드 서열을 함유하는 재조합 단백질과 펄싱될 수 있다.

따라서 본 발명은 (a) 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 1 내지 39 및 서열번호 58 내지 102로 이루어진 군으로부터 선택된 상응 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접(flanking) 서열을 갖는 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드, 상기 항원성 펩타이드와 반응하는 항체, 또는 서열번호 40 내지 48 및 서열번호 123 내지 141로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 포함하고 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 항원성 펩타이드는 특이적 림프구를 내성화시키기에 충분한 양으로 존재하여야 한다. 상기 양은 사용된 펩타이드, 투여 방법, 치료될 질환의 중증도 및 환자의 일반적 상태에 따라 달라질 것이며, 예를 들어 펩타이드를 수지상 세포 상에 놓는(load) 경우에는 대개 1 내지 50mg/ml의 범위이다.

허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체는 시험관내(in vitro) 연구를 위한 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline) 및 체내(in vivo) 적용을 위한 생리적 식염수(physiological salt solution)일 수 있다.

본원에서 "예방접종(vaccination)"은 능동 면역, 즉 환자에게 직접적으로 체내(in vivo) 면역 내성을 일으키는 펩타이드의 체내 투여 및 수동 면역, 즉 시험관내(in vitro) CD4+ T 림프구를 내성화시키거나 또는 자가 또는 동종(allogeneic) 수지상 세포를 자극하는 펩타이드의 사용을 모두 의미한다.

또한 본 발명은 특히 실시예를 참조로 하여 실질적으로 본원에 기술된 항원성 펩타이드, 항체, 핵산, 숙주 세포, 방법, 조성물 및 용도를 제공한다.

본 발명은 일반적으로 기술되어 있으며, 달리 특정하지 않는 제한이 아닌 단지 예시를 위하여 본원에 포함된 실시예를 참조로 하여 도면과 관련하여 보다 잘 이해될 것이다.

하기 실시예는 하기에서 기재하고 있는 같이, 도 1에 요약된 방법론에 기초하고 있으며, 본원에 기재된 도면과 함께 예시하고 있다. 실시예에 언급된 상업적으로 구입할 수 있는 시약들은 별다른 지시가 없는 한 제조업자의 지시 사항에 따라 사용하였다.

본 발명의 방법론

수지상 세포 및 배양

후술한 바와 같은 단핵구에서 분화되었던 사람의 수지상 세포를 이용하여 본 연구를 수행하였다. 단핵구는 사람의 말초 혈액으로부터 정제하였다. 혈액은 일배체형(haplotype)이 다음과 같은 건강한 공여자로부터 채취하였다: (1) HLA -DRB1 ^* 0401, ^* 03011, (2) HLA - DRB1 ^* 0401, ^* 0304, (3) HLA - DRB1 ^* 0401, ^* 1301, (4) HLA - DRB1 ^* 0401, ^* 0701, HLA - DRB1 ^* 0401, ^* 0407.

모든 세포는 1mM 피루베이트, 2mM 글루탐산 및 10% 열불활성화 소태아혈청(Gibco BRL, Rockville, MD)을 보충한 RPMI 1640 배지(줄여서 RPMI)에서 배양하였다.

말초 혈액 단핵 세포( PBMC )의 단리

말초 혈액은 독일 만하임 소재의 혈액 은행에서 건강한 공여자의 표준 백혈구연층(buffy coat) 조제물로서 입수하였다. 헤파린(200 I.U./ml 혈액, Liquemine, Roche)을 사용하여 응고를 방지하였다.원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 30분간 800g(실온)로 LSM^®(1.077-1.080g/ml; ICN, Aurora, OH)에서 원심분리하여 단리하였다. PBMC를 계면상(interphase)에서 수집하고 20mM Hepes를 함유하는 RPMI로 2회 세척하였다(15분간 500g, 5분간 300g). 적혈구를 제거하기 위해서 PBMC를 37℃에서 3분 동안 ALT 완충액(140mM 암모늄 클로라이드, 20mM Tris, pH 7.2)으로 처리하였다. PBMC를 20mM Hepes를 함유하는 RPMI로 2회 세척하였다(5분간 200g).

말초 혈액 단핵구로부터 수지상 세포의 생성

제조업자의 프로토콜에 따라 항-CD14 자석 비드(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)를 이용한 양성 소팅(sorting)으로 단핵구를 PBMC에서 단리하였다. 단핵구는 1% 불필수 아미노산(Gibco, BRL, Rockville, MD), 50ng/ml 사람의 재조합 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage-colony stimulating factor, GM- CSF; S.A. 1.1×10⁷U/mg)(Leucomax; Novartis, Basel Switzerland) 및 3ng/ml 사람의 재조합 IL-4(S.A. 2.9×10⁴U/㎍)(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 보충한 RPMI에서 배양하였다. 단핵구를 6-웰 플레이트(Costar)에 0.3×10⁶/ml로 5일간 시딩(seeding)하여 미성숙 수지상 세포를 수득하였다.

단핵구-유래 미성숙 수지상 세포의 특성은 유세포 분류 분석을 통해 일상적으로 모니터하였고 다음과 같은 표현형(phenotype)을 나타내는 세포는 적합하다고 평가하였다: CD1a(고), CD3(음성), CD14(저), CD19(음성), CD56(음성), CD80(저), CD83(음성), CD86(저) 및 HLA-DR(고). 반대로 성숭 수지상 세포(하기 참조)가 나타내는 표현형은 다음과 같다: CD1a(저), CD80(고), CD83(고), CD86(고) 및 HLA-DR(고). CD1a, CD3, CD14, CD19, CD56, CD80, CD83, CD86 뿐 아니라 각각의 아이소타입(isotype) 대조군은 Pharmingen(San Diego, CA)에서 구입하였다.

수지상 세포의 혈청 또는 활액에의 노출

혈청과 활액에 ¹³⁷Cs(70TBq) 방사선을 30분간 조사하였다. 혈청- 또는 활액-유래 항원을 수지상 세포에 주입하기 위해서, 6×10⁶개의 미성숙 수지상 세포를 1ml 혈청이나 0.6ml 활액으로 펄싱하였다. 동시에 10ng/ml 사람의 재조합 종양 괴사 인자 알파(TNFα; S.A. 1.1×10⁵U/㎍)를 가하여 수지상 세포의 성숙을 유도하였다. 6×10⁶개의 미성숙 수지상 세포에 TNFα만을 가하고 항온 배양하여 대조군으로 사용 하였다.

24시간 배양한 후, 300g에서 10분간 원심분리하여 성숙 수지상 세포를 수거(harvest)하였다. PBS로 세포를 세척하고 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 400g에서 3분간 원심분리하여 그 상등액을 완전 제거한 다음 세포를 -70℃에서 동결건조하였다.

항- HLA 클래스 II 비드의 생성

항-HLA-DR 단클론성 항체(mAb) L243(ATCC, Manassas, VA)는 각각의 마우스 하이브리도마 세포주를 배양함으로써 제조하였다. mAb L243은 단백질A 세파로스(Pharmacia, Uppsala, Sweden)을 이용하여 정제한 후 제조업자 프로토콜에 따라 최종 농도 2.5mg/ml가 되도록 CNBr-활성화 세파로스 비드(Pharmacia)에 고정화시켰다. L243 비드는 0.1% 쯔비터제(Zwittergent) 3-12(Calbiochem, La Jolla, CA)를 함유한 PBS에 보관하였다.

HLA -DR- 펩타이드 복합체의 나노-스케일 정제

수지상 세포의 동결 펠렛(pellet)을 10배 부피의 차가운(ice-cold) 용해 완충액(1% Triton-X-100, 20mM Tris, pH 7.8, 5mM MgCl₂, 프로테아제 저해제 키모스타틴, 펩스타틴, PMSF 및 류펩틴(Roche, Mannheim, Germany) 함유)에 현탁시키고 수평 진탕기(shaker)에서 4℃, 1000rpm에서 1시간 동안 용해시켰다. 10000g, 4℃에서 10분간 원심분리로 세포 파편과 핵을 제거하여 세포 용해액이 맑아지도록 하였다. 용해액을 L243 비드(100㎕ 세포 용해액 당 5-10㎕ L243 비드)와 함께 수평 진탕기에서 4℃, 1000rpm에서 2시간 동안 공동 항온 배양(co-incubate)하였다. 1000g, 4 ℃에서 1시간 동안 원심분리하여 L243 비드에 결합한 면역 침전된 HLA-DR-펩타이드 복합체를 침전(sediment)시킨 후 PBS 중의 0.1% 쯔비터제 3-12(Calbiochem) 500㎕로 4차례 세척하였다.

HLA-DR-펩타이드 복합체의 소모 효율은 항-HLA-DRα-특이 mAb 1B5를 이용한 웨스턴 블럿팅으로 면역 침전 전후의 각 세포 용해액과 비드 분주액(aliquot)을 분석함으로써 모니터링하였다(Adams, T.E. 외, Immunology 50 (1983) 613-624).

HLA -DR-관련 펩타이드의 용출

L243 비드에 결합된 HLA-DR-펩타이드 복합체를 100㎕ H₂O(HPLC-등급; Merck, Darmstadt, Germany)에 재현탁하고, 한외여과 튜브(Ultrafree MC, 30kD 컷-오프(Millipore, Bedford, MA)로 옮긴 다음, 실온에서 1-2분 동안 10000g로 원심분리하면서 100㎕ H₂O(HPLC-등급)로 10회 세척하였다. 결합 펩타이드를 용출하기 위해 H₂O(HPLC-등급)에 용해된 0.1% 트리플루오로아세트산(Fluka, Buchs, Switzerland) 60㎕을 가하고 37℃에서 30분 항온 배양하였다. 용출된 펩타이드는 실온에서 3분간 10000g로 원심분리하여 새 에펜도르프 튜브에 모은 후 Speed-Vac™ 진공 원심분리기에서 즉시 동결건조시켰다.

2차원의 나노유체 ( nanoflow ) LC 에 의한 분획(fractionation)

복합체 펩타이드 혼합물의 시퀀싱을 높은 처리율로 수행하기 위해서, 액체 크로마토그래피 분획법에 이은 질량 분석에 의한 서열 결정법에 기초한 MudPTT(multidimensional protein identification technology)를 사용하였다 (Washburn, M.P. 외, Nat Biotechnol 19 (2001), 242-247).

이 때문에, HLA 분자로부터 용출된 펩타이드의 동결건조물을 5% (v/v) 아세토니트릴(ACN), 0.5% (v/v) 아세트산, 0.012% (v/v) 헵타플루오로 부티르산(HFBA) 및 1% (v/v) 포름산을 함유하는 완충액에 현탁시켰다. 펩타이드 혼합물을 모델 P-2000 레이저 풀러(Sutter Instrument Co., Novato, CA)에 의해 만들어진 용융-실리카 미세모세관 컬럼(100㎛ i.d.×375㎛)에 분획시켰다. 미세컬럼에는 3㎛/C18 역상 물질(C18-ACE 3㎛[ProntoSIL 120-3-C18 ACE-EPS, Leonberg, Germany])을 채우고 이어서 5㎛ 양이온 교환 물질(Partisphere SCX; Whatman, Clifton, USA)을 3cm 높이로 채웠다.

LC Packings UltiMate HPLC(LC Packings, San Francisco, USA) 상에서 완전 자동화된 8 단계의 구배 분리를 수행하였으며, 이 때 사용된 완충액은 다음과 같다: 5% ACN/0.012% HFBA/0.5% 아세트산(완충액 A), 80% ACN/0.012% HFBA/0.5% 아세트산(완충액 B), 250mM 암모늄 아세테이트/5% ACN/0.012% HFBA/0.5% 아세트산(완충액 C), 및 1.5M 암모늄 아세테이트/5% ACN/0.012% HFBA/0.5% 아세트산(완충액 D). 116분간의 첫 단계는 0% 내지 40% 완충액 B의 75분 구배와 그 뒤를 이은 40% 내지 80% 완충액 B의 10분 구배, 80% 완충액 B의 6분 유지 및 100% 완충액 A의 10분 평형 단계로 이루어졌다. 다음의 다섯 단계(각 146분)는 하기 프로파일과 같은 특징이 있다: 100% 완충액 A 5분, 0% 내지 x% 완충액 C의 5분 구배, 100% 완충액 A 5분, 0% 내지 10% 완충액 B의 30분 구배, 10% 내지 35% 완충액 B의 55분 구배, 35% 내지 50% 완충액 B의 20분 구배, 50% 내지 80% 완충액 B의 10분 구배, 80% 완충액 B의 6분 유지, 및 100% 완충액 A의 10분 평형 단계. 단계 2-6에서 완충액 C의 백분율(x)는 다음과 같다: 20, 40, 60, 80, 및 90%. 역상 물질로부터의 첫번째 선형 용출 단계인 0% 내지 10% 완충액 B의 30분 구배는 큰 오염체(m/z=945)의 용출로부터 펩타이드의 용출을 충분히 분리시키기 위해서 꼭 필요한 단계였으며, 그렇지 않은 경우에는 더욱 친수성인 펩타이드 피크의 손실을 초래하게 된다. 단계 7은 하기 프로파일로 이루어졌다: 100% 완충액 A 5분, 100% 완충액 C 20분, 0% 내지 10% 완충액 B의 5분 구배, 10% 내지 35% 완충액 B의 35분 구배, 35% 내지 50% 완충액 B의 50분 구배, 50% 내지 80% 완충액 B의 10분 구배, 80% 완충액 B의 5분 유지, 및 100% 완충액 A의 10분 평형 단계. 단계 8은 완충액 C 대신 완충액 D를 사용하는 것을 제외하고는 단계 7과 동일하였다.

이온 트랩(trap) MS/MS 질량 분석

HPLC 컬럼을 나노-LC 전자 분무 이온화 원료가 장착된 이온 트랩 질량 분석기+Finnigan LCQ Deca XP(Thermo Finnigan, San Jose, USA)에 직접 커플링하였다. MS/MS 방식에서의 질량 분석을 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다. SEQUEST 알고리즘에 의해 펩타이드를 동정하였다(미국 특허 제6,017,693호 및 제5,538,897호).

MALDI - TOF 질량 분석

AnchorChip 플레이트 상에 떨어뜨린 펩타이드를 매트릭스(5mg/ml; α-시아노-4-하이드록시-신남산(Merck, Darmstadt, Germany), 50% 아세토니트릴, 0.1% 트리플루오로아세트산)와 공동 결정화(co-cristallize)시켰다. 전체 펩타이드 레퍼토리 를 정성 분석하기 위해서, 시료를 Ultraflex™ MADLI-TOF 질량 분석기(Bruker, Bremen, Germany) 상에서 제조업자의 프로토콜에 따라 분석하였다.

SEQUEST 에 의한 서열 동정 및 구별 데이터 분석

MS/MS 단편화 데이터는 소프트웨어 SEQUEST(Thermo Finnigan, San Jose, USA)로 분석하였다. 공개 데이터베이스 Swiss-Prot 및 TrEMBL에 기초하여 만들어진 자체(in-house) 단백질 데이터베이스로부터, SEQUEST는 컴퓨터 상에서 생성된 이론상의 스펙트럼과 시험으로 얻은 스펙트럼 간의 유사성의 정도를 측정하고 모이온(parent ion)의 분자 질량(mass)에 상응하는 모든 펩타이드 서열에 대해 각 스펙트럼을 추출하였다. 점수가 높은(top-scoring) 후보 서열만을 목록으로 만들었다.

SEQUEST 분석을 통해 얻은 펩타이드 서열 및 질량 정확도, 점수 파라미터 및 펩타이드 기원에 대한 여러 정보를 적절하게 디자인한 관련서 있는 데이터베이스에 저장하고 추가 처리하였다. SEQUEST 점수를 만족하는 뚜렷한 서열만의 저장을 보장하기 위해서 일정한 제한을 강화하였다. 가장 중요한 두가지 제한은 다음과 같다: (i) 정해진 어떤 값보다 높은 상호 상관관계 계수(cross correlation coefficient, CC)를 갖는 서열만을 유지하는 것, 및 (ii) 남아 있는 서열들로부터 미리 정의된 델타 상호 상관관계 계수(ΔCC)를 갖는 서열을 유지하는 것. 각 기준에서 선택된 최소값은 SEQUEST 결과 해석시의 경험에 기초한 것이다.

데이터세트는 특정 스펙트럼 세트에서 나온 데이터의 합으로 정의하였다. 데이터 및 소프트웨어의 디자인은 단일 데이터세트에 대한 물음 뿐 아니라 다중 데이터세트의 비교도 가능하게 하였다. 그러한 데이터베이스와 소프트웨어의 디자인으 로 인해 SEQUEST는 제공하지 못하는 비교에 의한(comparative) 시료 분석을 할 수 있다. 예를 들어, 단일 데이터세트에 있음직한 물음은 저장된 스펙트럼 중의 점수 분포, 부가 서열 길이 변이형 또는 공통 서브서열의 존재, 또는 펩타이드 서열의 단백질 기원에 대한 정보를 제공할 수 있다. 에피토프가 같은 절단 변이형이 생기는 것은 클래스 II MHC-결합 펩타이드의 일반적인 특성이므로, 데이터세트 내 길이 변이형의 존재는 스펙트럼 세트 내에 에피토프가 존재한다는 것을 부가적으로 강력히 뒷받침해준다.

다중 데이터세트 분석에서 가장 중요한 특징은 정해진 기준에 맞는 공통의 서열 서브세트를 추출할 수 있는 가능성이 있다는 것이다. 상기 기준은 예컨대 수집된 데이터세트 중의 모든 서열(임의의 다른 서열과 공통된 하나 이상의 서열을 가졌던 서열이 선별되었다) 내에서의 서열 유사성에 기초하고 있다. 서로 다른 데이터세트를 넘어선 비교는 차별적인 접근(RA 시료 대비 대조 시료)을 가능하게 하고 따라서 후보 RA 표지자 펩타이드의 조사를 최적화한다.

서열 간의 유사성 점수는 표준 문자열-비교(string-comparison) 알고리즘인 소프트웨어 루틴(routine)에 따라 계산하였다. 이어서, 이러한 점수를 사용하여 잘 확립된 알고리즘(계층 클러스팅, UPGMA)을 기초로 부가적으로 개발된 소프트웨어 루틴을 사용하여 잘 분리된 클러스터 내에 밀접하게 관련있는 서열(공통 서브서열을 공유하는 서열)을 그룹화하였다.

그런 다음 상이한 데이터세트를 넘어 밀접하게 관련된 서열을 동정하기 위해서 일반화된 클러스터(cluster)(예컨대 펩타이드 절단 변이종의 클러스터)를 사용 하였다.

전반적으로 데이터 평가 소프트웨어는 신속하고 재현가능하게 다음을 수행할 수 있는 능력을 제공하였다:

- SEQUEST에 의해 생성된 서열 결과물(output)로부터 신뢰성 높은 경험 기준에 맞는 서열을 선별하는 능력.

- 항상 사용할 수 있는 탐사 과정(discovery process)을 위해 적절하게 디자인된 데이터베이스 내에 데이터를 저장하는 능력.

- 각 저장된 데이터세트 중의 서열 내용에 대한 정보를 추출하는 능력. 이 정보는 정해진 데이터세트 내에서 개별 서열의 중요성을 평가하는데 있어 중요하고 그 결과 다중 데이터세트를 넘어서도 이를 평가하는데 있어 중요하다.

- 다중 데이터세트 비교에 의하여 차별적인 접근(즉 하나의 시료 중 사실상의 서열 내용 대비 나머지 시료 간의 연구)을 달성하는 도구(tool)을 제공하는 능력.

HLA -DR 분자의 정제

HLA-DR 분자를 앞서 기재한 바에 따라(Kropshofer H. 외, PNAS 92 (1995) 8313-8317), 항-DR 단클론성 항체 L243을 사용하여, 친화력 크로마토그래피에 의해, 10¹⁰ EBV-형질전환된 B 세포주 또는 T2-형질전환체에서 정제하였다.

시험관내 ( in vitro ) 펩타이드 결합 검정

HA(307-319), PKYVKQNTLKLAT는 HLA-DR4 분자에 잘 결합하는 인플루엔자 바이러스 혈구응집소(haemagglutinin)의 면역우성 에피토프로 시험관내(in vitro) 펩타 이드 결합 검정에서 보고자 펩타이드로 사용하였다(Rothbard, J.B. 외, Cell (1988) 52:515-523).

세제-가용화된 HLA-DR4 분자(200nM)를 정제한 후 바이오틴을 붙인 HA(307-319) 펩타이드(200nM) 및 그 양에 차이를 둔(graded amount) 경쟁자(competitor) 펩타이드(100nM-10μM)와 함께 결합 완충액(50nM 나트륨 포스페이트, 50mM 나트륨 시트레이트, pH 4.8, 0.1% 쯔비터제 3-12)에서 총 부피 50㎕로 하여 37℃, 24시간 동안 공동 배양하였다. 경쟁자 펩타이드는 본 연구에서 동정된 후보 RA 항원에서 유래하였고 합성 펩타이드 형태로 Medprobe(Lund, Sweden)에서 구입하였다.

그런 다음, 3×10㎕를 0.05% Tween-20과 1% BSA를 함유한 PBS에 10배 희석한 후, 밤새 항-DR 단클론성 항체 L243으로 코팅시킨 마이크로티터플레이트(microtiterplate)(Nalge Nunc)에서 2시간 동안 항온 배양하였다. 그 후에 제조업자의 프로토콜에 따라 시료를 0.1㎍/ml EU-표지된 스트렙타비딘(Wallay Oy, Turku, Finland)과 함께 45분 동안 항온 배양을 진행하였다. PBS 중의 0.05% Tween-20으로 격렬하게 세척한 후, 시간-분해 형광분석기(VICTOR 1420, Wallac/Perkin Elmer Life Sciences)를 통해 유로퓸(Europium)의 형광도를 측정하여 바이오틴이 붙은 HA 펩타이드와 HLA-DR4 분자의 결합을 정량하였다(Arndt, S.O. 외, EMBO J. 19 (2000) 1241-1251).

실시예 1

본 실시예에서는 비미란성 RA를 앓고 있는 환자의 혈청 및 활액에서 유래한 신규한 HLA-DR-관련 펩타이드 표지자를 동정하기 위해서 도 1에 언급된 기술을 사 용하였다.

6×10⁶개의 미성숙 수지상 세포를 비미란성 RA 환자의 혈청(5개 시료) 1ml 또는 활액(2개 시료) 0.6ml로 펄싱하고 100ng/ml TNFα의 존재 하에 24시간 배양하였다. 대조군으로는 6×10⁶개의 수지상 세포를 혈청을 가하지 않고 PBS 1ml만을 가한 채 TNFα(10ng/ml)의 존재 하에 배양하였다. 부가 실험으로는 2명의 건강한 사람 혈청 1ml로 6×10⁶개의 수지상 세포를 펄싱하여 TNFα(10ng/ml)의 존재 하에 24시간 배양하였다.

수지상 세포는 세척제 TX-100으로 용해하고 mAb L243을 사용하여 HLA-DR 분자를 단리하였다. HLA-DR-관련 펩타이드는 0.1% TFA로 용출시키고 처리율이 높은 2D-LC-MS/MS 기술로 분석하였다. 펩타이드의 동정은 SEQUEST 알고리즘을 이용해 수행하였다. SEQUEST 분석에서 유래한 펩타이드 서열 및 이에 수반하는 질량 측정 정도에 대한 정보, 점수 파라미터 및 펩타이드 기원을 데이터베이스에 저장하고 추가로 처리하였다.

펄싱되지 않은 DC(대조군 1) 및 건강한 사람의 혈청으로 펄싱된 DC(대조군 2)에서 동정된 펩타이드 서열과 비미란성 RA 환자의 혈청으로 펄싱된 DC에서 동정된 펩타이드 서열과 비교하였다. RA-특이 서열 중에서 5개의 비미란성 RA 시료 중 3개 이상에서 재차 생겨났던 펩타이드만을 추가적인 평가를 위해 선별하였다.

각 혈청 시료에서는 대충 600±150개의 개별 펩타이드 서열(상호 상관관계 계수 CC>3.0 및 ΔCC>0.15)이 동정되었다. 활막 시료에서는 개별 펩타이드 서열의 수가 혈청보다는 좀 작았다(400±30개). RA 시료에서 발견된 대략 80-85%의 펩타이드는 대조 시료에서도 동정되었으며, 이는 분석의 높은 재현가능성을 보여준다. 대부분의 경우에 동일한 에피토프의 몇몇 길이 변이형이 동정되었으며, 이는 클래스 II MHC-결합 항원의 전형적인 특징이자 본 결과의 정당성을 뒷받침해주는 점이다(Jones, E.Y., Curr Opin Immunol 9 (1997) 75-79). 동정된 몇몇 펩타이드 또는 단백질이 MHC 클래스 II 분자와 관련해서 이미 기술된 바 있다는 사실은 본 데이터의 우수성을 부가적으로 확실하게 해준다: Hsp70, 엔돌라제, 아넥신 II, 카텝신 C 또는 콜라겐 II 등의 보편적인 단백질 뿐 아니라 MHC 분자(HLA-A, -B, -C, -E, -G 및 β₂-마이크로글로불린) 및 CLIP에서 유래한 에피토프(Chicz, R.M. 외, J Exp Med 178 (1993) 27-47; Sinigaglia, F. 및 Hammer, J., Curr Opin Immunol 6 (1994) 52-56; Arnold-Schild, D. 외, J Immunol 162 (1999) 3757-3760; Vogt, A.B. 및 Kropshofer, H., Trends Biochem Sci 4 (1999) 150-154)가 빈번히 검출되었다.

RA-특이 펩타이드 서열은 TEPITOPE 소프트웨어를 이용한 RA 감수성 대립 유전자 DRB1 ^* 0401에 대한 결합과 관련하여 한층 더 확인되었다(Hammer, J. 외, Adv Immunol 66 (1997) 67-100). 이 소프트웨어는 T 세포 에피토프의 정량적 및 정성적 예상 수단을 제공한다.

본 연구의 결과는 한가지 예외를 제외하고는 비미란성 RA 시료에서만 생겨나는 에피토프로 이루어진다(표 1).

인터페론-γ-유도가능 라이소좀성 티올 환원효소

혈청 및 활막에서 채취한 7개의 비미란성 RA 시료 중 3개에서 동정되었던 가장 흥미로운 에피토프는 인터페론-감마-유도가능 라이소좀성 티올 환원효소(interferon-gamma-inducible lysosomal thiol reductase, GILT)에서 유래한 것이다: 서열번호 3의 아미노산을 가진 16-mer GILT(192-207)(표 1). 3개의 다른 시료에서 나온 추가 길이 변이형은 이 에피토프의 상관성을 뒷받침한다(표 1): 14-mer GILT(192-205; 서열번호 1) 및 17-mer GILT(192-208; 서열번호 2).

가장 짧은 길이 변이형인 GILT(192-205)에서 볼 때, 에피토프는 RA 감수성 대립 유전자 DRB1 ^* 0401에 대한 결합과 관련해서 적당한 정도의 결합 모티프를 함유한다: 196M은 P1 앵커로, 199M은 P4 앵커로, 201A는 P6 앵커로 작용한다. TEPITOPE 점수에 따르면, 이 에피토프는 1%의 결합 점수(역치값)를 가지며, 이 점수는 강한 DRB1 ^* 0401 결합자로 알려진 인플루엔자 혈구응집소(307-319)에서 유래한 에피토프의 결합 점수와 비슷한 정도이다(표 1)(Rothbard, J.B. 외, Cell 52 (1988) 515-523).

GILT는 항원-제시 세포, 예컨대 수지상 세포, 대식 세포 및 B 세포에서 구조적으로 발현되며, 다이설파이드 결합을 효소적으로 감소시킴으로써 MHC 클래스 II-함유 구획(MHC class II-containing compartment, MIIC)에 있는 세포내 항원의 풀림(unfolding)을 촉진시킨다(Phan, U.T. 외, J Biol Chem 275 (2000) 25907-25914). B 세포의 경우 HLA-DR 분자에 대한 GILT의 직접적인 결합이 보고된 바 있다(Arunachalam, B. 외, J Immunol 160 (1998) 5797-5806). GILT의 좀 더 긴 두번째 에피토프가 HLA-DR3 분자에 결합한다고 밝혀졌다: 아미노산 서열이 SPLQALDFFGNGPPVNYKTGNL인 22-mer GILT(38-59)(Chicz, R.M. 외, J Exp Med 178 (1993) 27-47).

GILT(192-207) 외에도, 같은 단백질의 또다른 에피토프가 몇몇 RA 시료와 대조 시료에서 동정되었다: 아미노산 서열이 QPPHEYVPWVTVNGKPLE인 GILT(210-227). 이 에피토프는 기타 3개의 길이 변이형을 수반한다: 16-mer GILT(210-225), 17-mer GILT(210-226) 및 19-mer GILT(210-228).

그 명칭에서 나타난 바와 같이, GILT 발현은 여러 형태의 세포, 예컨대 대식 세포, 내피 세포 및 섬유아세포에서 전구 염증성 사이토카인 인터페론 감마(interferon-gamma, IFN-γ)에 의해 유도될 수 있다(Luster, A.D. 외, J Biol Chem 263 (1988) 12036-12043). IFN-γ가 RA 환자의 염증성 관절에 존재한다고 알려져 있음에 따라, GILT는 활막 및 혈청에서 과발현될 수 있고 따라서 외인성 항원으로서 DC에 의해 흡수될 수 있다. 대조 시료에도 존재하는 그밖의 GILT 에피토프는 DC에 의해 발현되는 외인성 GILT에서 유래될 수 있다. 다른 방편으로, GILT 진행 과정 및 DC에 의한 GILT-유래 에피토프의 제시가 RA-관련 물질과 접촉하면서 어찌어찌 변형되는 경우에는 GILT(192-207) 및 GILT(210-227) 모두 외인성 GILT에서 유래될 수 있다.

합성 GILT(192-205) 에피토프와 정제된 HLA-DR4 분자를 이용한 시험관내(in vitro) 결합 검정을 통해, 이미 상세히 설명한 바 있는 인터페론-감마-유도가능 라이소좀성 티올 환원효소 GILT(192-205)의 동정된 에피토프를 한층 분석하였다(도 3): 펩타이드는 바이러스성 HA(307-319) 펩타이드와 대비해서 높은 친화력으로 HLA-DR4와의 결합을 나타내었으며, 이는 TEPITOPE 점수와 일치하였다.

인테크린 베타-2

혈청 및 활액에서 채취한 7개의 비미란성 RA 중 2개에서 동정되었고 인테그린의 베타 유닛(ITB2)에서 유래한 에피토프의 존재를 밝혀지는 분석이 이루어졌다: 아미노산 서열이 NIQPIFAVTSRMVKTYE인 17-mer ITB2(315-331; 서열번호 58)(표 1). 하나의 길이 변이형이 발견되었다: 동정된 에피토프의 정당성을 뒷받침해주는 19-mer ITB2(313-331; 서열번호 59)(표 1).

펩타이드 서열은 P1 및 P4 앵커로서 각각 작용하는 316I 및 319I를 갖는 보통 정도의 HLA - DRB1 ^* 0401 결합 모티프를 함유한다(TEPITOPE 결합 점수: 2%).

인테그린은 배형성(embryogenesis), 상처 치료, 면역 반응 및 세포 부착에 있어 중요 역할을 담당하는 세포 표면 수용체 계통이다. ITB2는 세포내 및 혈관 부착 분자(intercellular 및 vascular adhesion molecules, ICAM 및 VCAM)에 대한 헤테로다이머 수용체로 백혈구에서 오로지 발현된다. ICAM 및 VCAM은 체액성 및 세포-매개성 면역 반응에서 중심적 기능을 가지는 면역글로불린 계통에 속하는 구성원이다. 많은 사이토카인, 예컨대 인터페론-γ, IL-1 및 TNFα는 RA 같은 염증성 질환에서 상향 조절되며, 내피 세포의 표면 상에서 ICAM의 발현을 유도한다. ICAM-1 및 VCAM-1은 RA 환자의 활막 조직에서 골관절염 환자에 비해 다량 발현된다고 알려졌다(Furuzawa-Carballeda, J. 외, Scand J Immunol 50 (1999) 215-222).

ITB2 및 기타 인테그린이 ICAM에 결합하면 백혈구가 그 표적 조직, 예컨대 염증 부위 내로 침윤하게 된다. 비-부착성 모드나 순환 모드에서 작용하기 위해서 백혈구는 구조적으로 낮은 리간드-결합능을 갖는 ITB2 및 기타 인테그린을 발현한다. ITB2/ICAM-1 상호작용은 염증, 자가 면역 질환 및 암에 접근하는 중요한 전략적 표적이 되며(Yusuf-Makagiansar, H. 외, Med Res Rev 22 (2002) 146-167), 따라서 이러한 연구 내용은 RA에 대한 후보 표지자로서 동정된 ITB2 에피토프의 정당성을 적극 뒷받침한다.

포스파티딜이노시톨 -4,5- 비스포스페이트 3- 키나제

보통의 HLA - DRB1 ^* 0401 결합 모티프를 갖는 또다른 에피토프는 2개의 비미란성 혈청 시료에서 동정되었다: 포스파티딜이노시톨 3-키나제(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)에서 유래된 아미노산 서열이 NKVFGEDSVGVIFKNGD인 17-mer PI3K(792-808; 서열번호 60). 이 펩타이드에서 794V는 소수성 P1 앵커로 작용하고, 797E는 음전하를 띤 P4 앵커로서, 799S는 전형적인 DR4-P6 앵커로 작용한다(TEPITOPE 결합 점수: 3%).

PI3K는 여러 종류의 세포 형태에서 보편적으로 발현되며, 지질을 인산화시키는데, 특히 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트를 탁월하게 인산화시킨다. 본 단백질은 생존 인자 수용체, 예컨대 성장 인자, 사이토카인, 및 인테그린에 대한 주(主) 시그널 도입자로서 알려진 바 있다(reviewed by Toker, A 및 Cantley, L., Nature 387 (1997) 673-676). 또한 PI3K는 여러가지 미생물 생성물(이를 병원체-관련 분자 양상(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)이라 총칭한다)을 인 식하는 Toll-유사 수용체(TLR)의 시그널 경로상에서 중요한 역할을 수행한다(Fukao, T. 및 Koyasu, S., Trends Immunol 24 (2003) 358-363). 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)(내독소)와 같은 PAMP에 의해 TLR을 통해 자극하게 되면 다양한 사이토카인, 예컨대 TLR-매개성 Th1 반응의 주(主) 사이토카인인 IL-12의 생성이 유발된다. PI3K는 TLR-매개성 IL-12 생성의 내인성 억제자이며 Th1의 과도한 분극(polarization)을 제한한다고 알려져 있다. 따라서 PI3K는 숙주에 해가 되는 선천성 면역성이 장기간 활성화되는 것을 막을 수 있도록 선천성 면역 반응의 음성 조절자라는 주장이 있었다. RA에 대한 자가 면역 반응이 Th1 사이토카인에 달려 있다는 것은 궁극적으로 PI3K와 RA를 연관시킨다. 설령 RA의 발달과 일관된 연관성이 있는 특이 병원체는 없다 해도, 초기 반응이 외래 반응에 의해 유도되고 이어서 자기-억제 자가 면역 반응으로 발달하는 2 단계로 RA가 진행한다고 짐작되고 있다(Klinman, D., Arthritis Rheum 48 (2003) 590-593).

유로키나제형 플라스미노겐 활성제

미란성 RA 시료에서만 발견된 또다른 에피토프는 유로키나제형 플라스미노겐 활성제(urokinase-type plasminogen activator, uPA)에서 유도된다: 아미노산 서열이 YPEQLKMTVVKLISHR인 16-mer uPA(328-343; 서열번호 61)(표 1). HLA - DRB1 ^* 0401 결합과 관련해서, 상기 서열은 보통 정도의 결합 모티프를 나타낸다: 332L, 335T 및 337V는 추정적으로 각각 P1, P4 및 P6 앵커로 작용한다(TEPITOPE 결합 점수 2%).

플라스미노겐 활성제(PA)는 플라스미노겐에서 플라스민을 생성하는 아주 특 이적인 세린 프로테아제이다. 포유류에서 두 종류의 PA, 즉 유로키나제형(uPA)와 조직형(tPA)이 동정된 바 있다. PA의 활성은 천연 억제제(PAI)에 의해 제어된다. 플라스민은 TGFβ 등의 사이토카인을 유도함으로써 염증성 반응에 관여하며, 연골 및 피브린 분해에 관여한다. 관절염에서 uPA의 합성 및 활성이 증강한다는 점과 함께 류마티스성 관절에서 응고가 일어난다는 증거로 인하여 PA/플라스민 체계가 관절염의 임상적 중증도와 관련이 있다는 가설이 나오게 되었다(reviewed by Busso, N. 및 Hamilton, J.A., Arthritis Rheum 46 (2002) 2268-2279). 시험관내(in vitro) 연구에 근거하여, RA 환자의 염증성 관절, 특히 단핵구와 활막 섬유아세포에 존재하는 몇몇 세포 형태가 있으며, 이들은 PA 및 PAI를 발현할 수 있고 그 결과 생체내(in vivo) 수준에 기여한다. PA(즉 uPA)의 활성은 사이토카인, 예컨대 RA 환자의 혈청 및 활액에서 고도로 상향 조절되는 것으로 알려져 있는 IL-1 및 TNFα 등의 사이토카인에 의해 자극을 받는다. 이런 류의 증거는 uPA(328-343)가 RA에 대한 추정 펩타이드 표지자임을 나타낸다.

면역글로불린 중쇄 V-III 영역( V _H 26 )

HLA - DRB1 ^* 0401 결합에 대하여 매우 강한 결합 모티프를 나타내는 동정된 에피토프 중 하나는 면역글로불린 중쇄의 V_H26 유전자 단편에서 유래한 것이다: 아미노산 서열이 KNTLYLQMNSLRAEDT인 16-mer V_H26(95-110; 서열번호 62)(표 1). 높은 TEPITOPE 결합 점수(1%)는 아주 강력한 P1 앵커로서 작용하는 99Y, 보통 정도의 P4 앵커로서 작용하는 102M, 및 전형적인 HLA-DR4 P6 앵커로서 작용하는 104S에 의해 구체화된다.

면역글로불린(immunglobulin, Ig)은 항원 결합을 일으키고 예컨대 동위 원소-특이적 Fc 수용체에 결합함에 의해서 부가적인 면역 반응을 자극한다. 흥미롭게도, 사람의 V_H26 유전자 단편은 결합력이 높은(high-avidity) 활막 류마티스성 인자를 암호화한다고 여겨지며 따라서 RA 진행에 영향을 끼치는 것으로 여겨진다(Wong, A 외, Autoimmunity 20 (1995) 191-199). 동정된 에피토프 V_H26(95-110)가 혈청 검사에서 양성 반응을 보인 2명의 RA 환자의 혈청에서 발견되었다는 점(표 1)은 상기 관찰 내용과 상호 연관이 있다.

DJ-1 단백질

계속된 연구를 통해서 두 개의 비미란성 RA 시료에서 DJ-1이라 명명된 단백질에서 유래한 에피토프의 존재를 밝혀내었다: 아미노산 서열이 NGGHYTYSENRVEKDG인 16-mer DJ-1(135-150; 서열번호 63)(표 1). TEPITOPE 점수(scoring)에 따르면, 이 펩타이드는 P1 앵커로서 작용하는 139Y, P4 앵커로서 작용하는 142S 및 P6 앵커로서 작용할 가능성 있는 144N를 갖는 다소 약한 HLA - DRB1 ^* 0401 결합 모티프를 함유한다(결합 득점: 8%).

DJ-1은 원시 세균(Archaea)에서 진정 세균(Eukarya)에 이르기까지 진화적으로 골고루 분포되어 있는 ThiJ/PfpI 단백질 계통에 속한다. ThiJ/PfpI 단백질은 제I형 글루타민 아미도트랜스퍼라제 도메인과 구조적으로 관련이 있는 보존된 ThiJ 도메인을 공유한다(Lee, S.J. 외, J Biol Chem 25 (2003) Epub ahead of print).

DJ-1은 정소에서 우위적으로 다량 발현되고 그밖의 조직에서는 적당히 발현되는 단백질로, 처음에는 ras와 협력하여 마우스 NIH3T3 세포를 형질 전환시키는 신규한 종양 유전자(oncogene) 후보물질로서 동정되었다. 그러는 동안 파킨슨 질환과의 강력한 상관 관계와 정자 수정(sperm fertilization) 등 DJ-1의 부가적인 생리학적 역할이 밝혀지게 되었다. DJ-1은 복합적인 기능을 가지는 것으로 보인다 - 여기서는 RA와 DJ-1의 관련성에 대해 나타내고 있다.

실시예 2

본 실시예에서는 실시예 1에서 상세히 기재한 바와 동일한 기술을 사용하였다. 이 경우에는 미란성 RA에 특이적인 후보 표지자를 동정하기 위해서 미란성 RA로 진단된 환자의 혈청(6개 시료)과 활액(2개 시료)을 사용하였다.

미란성 RA 시료에서 발견된 펩타이드 서열을 펄싱되지 않은 DC(대조군 1) 및 건강한 사람의 혈청으로 펄싱된 DC(대조군 2)에서 동정된 서열과 비교해 보았다. RA-특이 서열 중에서 6개의 미란성 RA 시료 중 적어도 3개 이상에서 재차 생겨났던 펩타이드만을 추가 평가를 위해서 선별하였다.

본 연구에서는 한가지 예외는 별개로 하고 미란성 RA 시료에서만 생겨났던 하나의 에피토프를 알게 되었다.

아포지질단백질 B-100

미란성 RA 혈청(8개의 미란성 RA 시료 중 4개)에서 주로 발견되었던 에피토프는 아포지질단백질(apolipoprotein) B-100에서 유래한 것이다: 서열번호 4의 아미노산 서열을 가진 16-mer ApoB(2877-2892)(표 2). 또한 동일 에피토프의 길이 변 이체가 동정되었다(표 2): 17-mer ApoB(2877-2893; 서열번호 5). 다음과 같은 DRB1 ^* 0401 결합 모티프가 예상될 수 있다: P1 앵커로 작용하는 2881L, P4 앵커로 작용하는 2884D, 및 P6 앵커로 작용하는 2886N(결합 전수 3%).

초기 EBV-B 세포 연구에서는 본원에 기술된 에피토프와 일부 겹치는(overlap) 에피토프 ApoB(2885-2900)가 HLA-DR4에서 밝혀졌다(Chicz, R.M. 외, J Exp Med 178 (1993) 27-47).

아포지질단백질 B-100은 과저밀도 지질단백질(very low-density lipoprotein, VLDL) 및 저밀도 지질단백질(LDL)의 구성체로 ApoB/E/ 수용체에 의해 LDL 입자의 흡수 및 세포 결합을 인식하는 시그널로 작용한다(Yang, C.Y. 외, Nature 323 (1986) 738-742). 흥미롭게도, 새롭게 RA 진단을 받은 환자의 경우 HDL 콜레스테롤에 대한 LDL 콜레스테롤의 비가 늘어나는 것이 관찰되었다(Park, Y.B. 외, J Rheumatol 26 (1999) 1701-1704). 능동 RA의 역(adverse) 지질 프로파일은 지질 감소 제제를 사용하지 않고 DMARD로 RA 환자를 치료하면서 향상될 수 있었다(Park, Y.B. 외, Am J Med 113 (2002) 188-193). 만성 염증성 질환, 예컨대 RA를 앓고 있는 환자의 심혈관 사망률이 증가한다는 기록 때문에(Symmons, D.P. 외, J Rheumatol 25 (1998) 1072-1077), RA에서의 국소 염증은 혈액 내 지질 수준의 변경을 초래하고, 그로 인해 죽상 경화증의 위험이 높아지게 된다는 제안이 있었다. 지질단백질 대사의 성분이 RA가 진행되는 동안 일어나는 면역 반응에 의해 단지 영향을 받을 뿐인 것인지 또는 병인으로서 우연한(casual) 것인지에 의문에는 아직 답 변할 수 없다. 그러나 RA 환자의 역 지질 프로파일에서 관찰된 내용은 혈청-유래 RA 후보 표지자로서 제시된 ApoB 에피토프의 정당성을 뒷받침하기에 충분하다.

ApoB(2877-2893)가 아닌 길이 변이형 ApoB(2877-2892)가 2개의 건강한 대조군 시료에서 동정되었다(표 2). 아포지질단백질 B는 전체 혈장 단백질의 1%를 구성하고 있으므로, 건강한 대조 시료에 ApoB 에피토프가 존재한다는 것은 놀랄만한 일은 아니다. 이러한 결과는 길이 변이형 ApoB(2877-2893; 서열번호 5)만이 미란성 RA에 특이적임을 나타내고 있다.

26S 프로테아좀 비- ATP 아제 조절 서브유닛 8

혈청과 활막으로부터의 대부분의 미란성 RA 시료에서 아주 빈번하게 동정된 에피토프는 26S 프로테오좀의 조절 서브유닛 8(PSMD8)에서 유래한 것이다: 아미노산 서열이 GPNNYYSFASQQQKP인 15-mer PSMD8(218-232; 서열번호 64)(표 2). 3종의 부가적인 길이 변이형도 동정되었다: 16-mer PSMD8(218-233; 서열번호 65), 17-mer PSMD8(218-234; 서열번호 66) 및 18-mer PSMD8(218-234; 서열번호 67)(표 2). 길이 변이형의 존재는 동정된 에피토프의 클래스 II MHC-유래 항원성 펩타이드로서의 정당성을 뒷받침해준다. 펩타이드는 DRB1 ^* 0401 결합에 대하여 보통 정도의 결합 모티프를 나타낸다(TEPITOPE 결합 점수: 3%). HLA-DR4에 대한 결합은 합성 PSMD8(218-233) 펩타이드와 정제된 HLA-DR4 분자를 이용한 시험관내(in vitro) 결합 검정에서 확인할 수 있었다. 보고자 펩타이드 HA(308-319)에 대항하는 PSMD8의 IC₅₀ 값에 따르면, PSMD8(218-233; 서열번호 65)는 보통 정도의 친화력으로 HLA-DR4에 결합하 며, 이는 TEPITOPE로 예상한 결과와 같다. 15-mer PSMD8(218-232; 서열번호 64)가 펄싱되지 않은 대조 시료에서 한번 동정되었다.

프로테오좀은 세포질에서 만들어지는 단백질 풀(pool)의 약 1%를 차지하며 유비퀴놀이 붙은(ubiquitinated) 단백질의 ATP-의존적 분해와 연관이 있다. 또한 프로테오좀은 세포 사이클을 제어하고 MHC 클래스 II 제한 항원을 생성하기 위해서 몇몇 전사 인자(즉 핵 인자-κB)의 진행 과정의 원인으로 작용한다. 상기 프로테오좀의 조절 유닛은 선별적인 단백질 분해에 있어 중요하다. 특히 비-ATP아제 조절 유닛 8은 효모 세포 사이클의 필수 조절자인 세포 분열 제어 단백질 28(cell division control protein 28, Cdc28)을 활성화시키는데 있어 필수적이라고 알려져 있다.

서로 상이한 전신 자가 면역 질환, 예컨대 RA를 앓거 있는 환자로부터 채취한 혈청 시료에서 순환하는 프로테오좀(circulating proteasome, cProteasome)의 수준이 강하게 증가하였다는 점이 중요하다(Egerer, K. 외, J Reumatol 29 (2002) 2045-2052). 중증의 RA를 앓고 있는 환자의 C-반응성 단백질의 농도와 cProteasome 및 질환 활성의 정도 간에는 밀접한 상관 관계가 있는 것으로 보인다. cProteasome은 그 후에 일어나는 면역 반응을 유발하여 항원-유발 매카니즘을 나타낸다는 논의가 있다. 방출된 프로테아좀 항원의 농도는 자가 면역 질환 내 세포 손상의 정도를 반영하는 것으로 여겨진다. 이러한 조사 결과로부터 Egerer과 그의 동료들은 cProteasome이 자가 면역 과정에서 질환의 중증도에 대한 신규한 표지자를 의미할 수 있다는 결론을 도출하였다. 에피토프 PSMD8(218-232; 서열번호 64)가 대부분 미 란성 RA 시료에서 동정되었으므로 본 분석은 위와 같은 결론을 충분히 뒷받침한다.

인터루킨-1 수용체

미란성 RA에 대한 또다른 후보 표지자는 아미노산 서열이 EKLWFVPAKVEDSGHY인 펩타이드 IL-1R(79-94; 서열번호 68)을 통해 2개의 미란성 혈청 시료에서 동정된 인터루킨-1 수용체(Interleukin-1 receptor, IL-1R)이다(표 2). IL-1R(79-94; 서열번호 68)은 P1 앵커로 작용하는 83F, P4 앵커로 작용하는 86A, P6 앵커로 작용하는 88V를 가지며, RA 감수성 대립 유전자 DRB1 ^* 0401에 대해 강한 결합 모티프를 함유한다(TEPITOPE 결합 점수: 1%). 시험관내(in vitro) 결합 검정에서 합성 펩타이드는 HA(309-319)와 비슷한 정도로 높은 친화력으로 HLA-DR4에 대한 결합을 보였다(도 3).

인터루킨-1(IL-1)은 전구 염증성 사이토카인으로 여러 감염성 면역 반응은 물론 RA 및 기타 염증성 질환에서 나타난다(Dinarello, C., Blood 87 (1996) 2095-2147). IL-1은 세포 증식을 유발하거나 단백질 합성을 증식시키는 시그널 도입자(transducer)로서 작용하는 각각의 수용체에 결합한다. IL-1 생성의 증가가 RA 환자에게서 관찰된 바 있으며 이는 그 임상 증상(manifestation)의 중추적 역할을 한다(Dayer, J.M., Rheumatology 42 (2003) ii3-ii19). IL-1은 대식 세포와 T- 및 B- 림프구의 활성화를 통해 RA에 있어 주(主) 매개자로서 간주된다. 또한, IL-1은 세포 부착 분자, 기타 사이토카인 및 케모카인의 발현을 유도하여 염증을 일으킨다. 또한 IL-1은 매트릭스 메탈로프로테이나제(metalloproteinase)의 생성을 자극하여 RA에 있어 뼈와 연골을 파괴시키는 주축으로 작용한다. 따라서, IL-1/IL-1R 복합체는 항염증성 치료 요법에 대한 첫번째 부류의 표적이 된다. RA 환자의 치료를 위해 사람의 재조합 IL-1 수용체 길항물질(IL-1RA)의 사용이 승인된 바 있다.

피브로모듈린

3개의 미란성 RA 시료에서 분비 매트릭스 단백질인 피브로모듈린(fibromodulin, FM)에서 유래한 에피토프가 발견되었다: 아미노산 서열이 LRELHLDHNQISR인 13-mer FM(178-190; 서열번호 70)(표 2). 또한 14-mer FM(177-190; 서열번호 69)가 동정되었으며, 이는 펄싱되지 않은 대조 실험에서도 한번 발견되었다. 본 에피토프는 센 DRB1 ^* 0401 결합 모티프를 나타내며 181L은 P1 앵커로, 184D는 P4 앵커로, 186N은 P6 앵커로 작용한다(TEPITOPE 결합 점수 1%).

피브로모듈린은 작은 크기의 류신-풍부 프로테오글리칸(small leucine-rich proteoglycan, SLRP) 계통에 속하는 것으로 TGFβ와 콜라겐 및 기타 세포외 매트릭스 분자와 결합한다. 시험관내(in vitro) 실험에서 SLRP는 발생(development), 조직 복구 및 전이(metastasis)의 필수 과정인 콜라겐의 피브릴 형성(fibrillogenesis)을 조절하는 것으로 나타났다. SLRP의 생체내(in vivo) 기능을 보다 잘 이해하기 위해서, SLRP-결핍 마우스를 만들었고 이것은 대부분의 경우 우선적 원인이 비정상적인 콜라겐의 피브릴 형성에 있는 질환(예컨대 골다공증 및 골관절염)의 광범위한 어레이(array) 개발로 이어졌다(Ameye, L. 및 Young, M.F., Glycobiology 12 (2002) 107R-116R). 콜라겐의 형성과 분해는 RA 환자의 염증성 골 절에서 많이 증가하므로, 피브로모듈린의 수준이 증가할 것으로 파악될 수 있다. 이와 일치하여 고려될 사실은 동정된 FM 에피토프가 원래 발견되었던 시료는 활막 기원의 RA 시료(4개의 활막 시료 중 3개)라는 점이다.

GM- CSF /IL-3/IL-5 수용체

미란성 RA 환자 시료 8개 중 5개에서 다중 사이토카인 수용체 CYRB의 β-사슬이 동정되었다: 아미노산 서열이 ETMKMRYEHIDHTFE인 15-mer CYRB(359-373; 서열번호 71) 및 그 길이 변이체인 17-mer CYRB(359-375; 서열번호 72)(표 2). 시험관내(in vitro) 결합 검정에서 합성 CYRB(359-375) 펩타이드는 보통의 친화력으로 HLA-DR4 분자에 결합하는 것으로 나타났다(도 3). 이는 DRB1*0401 결합과 관련해 보통의 펩타이드 결합 모티프를 예상했던 TEPITOPE 결과와 일치하는 것이다(결합 점수: 3%). 본 에피토프는 단 1명의 건강한 사람 혈청에서만 동정되었으므로, RA 시료에서는 분명 지나치다 싶게 나타났다.

GM-CSF/IL-3/IL-5 수용체는 제I형 막 단백질로 조혈 체계 전반에 걸쳐 차등적으로 발현된다(reviewed by Geijsen, N. 외, Cytokine Growth Factor Rev 12 (2001) 19-25). 그 리간드인 IL-3과 GM-CSF는 CD4+ T 세포에 의해 분비되고 골수의 전구(progenitor) 세포에서 유래한 수지상 세포의 형성을 자극하는 중요한 요소이다. 면역 반응의 개시 및 진행에서 수지상 세포의 중요한 역할은, 이들이 자가 항원을 DC가 원시(naive) T 세포를 만나 준비시키는(prime) 침윤 림프절(draining lymph node)로 운반함으로써 자가 면역 염증성 장애, 예컨대 RA의 진행에 있어 핵심 역할을 담당하고 있음을 시사한다. GM-CSF의 활성은 RA에서의 전구 염증성 효과 와 연괸이 있으며, 이는 동정된 수용체 에피토프 CYRB(359-373; 서열번호 71)가 RA 진단에 대한 추정적인 후보 펩타이드 표지자임을 뒷받침해준다.

소팅 넥신 3

미란성 RA에 대한 표시로 보이는 또다른 에피토프는 소팅 넥신 3(sorting nexin 3, SNX3이라 하는 단백질에서 유래된다: 아미노산 서열이 HMFLQDEIIDKSYTPS인 16-mer SNX3(142-157; 서열번호 73)(표 2). 이 에피토프에서의 144F, 147D 및 149I는 RA 감수성 대립 유전자 DRB1 ^* 0401의 펩타이드-결합 그루브 내에서 각각 P1, P4 및 P6 앵커로서 작용할 수 있다(TEPITOPE 결합 점수: 2%).

소팅 넥신은 공통의 인지질-바인딩 모티프를 공유하는 여러 형태의 세포성 수송(trafficking) 단백질이다(reviewed by Worby, C.A. & Dixon, J.E., Nat Rev Mol Cell Biol 3 (2002) 919-31). 이러한 단백질의 특이 인지질에 결합하는 능력과 단백질-단백질 복합체를 형성하는 성향은 이들 단백질이 막 수송과 단백질 분류(sorting)과 연관되어 있음을 나타낸다. 특히 소팅 넥신 3은 세포질과 엔도좀(endosome)에 존재하며 초기 엔도좀에서 재순화 엔도좀까지의 막 수송에 연관된 것으로 여겨진다. 소팅 넥신 3이 RA에서 중요한 역할, 예컨대 항원 제시 경로에 영향을 미치는 역할을 하는지 어떤지는 아직 알려지지 않고 있다. 본 연구에서 동정된 에피토프 SNX3(142-157: 서열번호 73)는 소팅 넥신과 자가 면역성 간의 관련성을 시사한다.

실시예 3

본 실시예에서는 실시예 1 및 2에서 비미란성 및 미란성 RA 시료로부터 동정된 모든 펩타이드 서열을 두가지 RA에 대한 상관성 있는 공통의 표지자를 찾기 위해 사용하였다. RA-특이 서열을 대조 시료(펄싱되지 않은 DC 및 2명의 건강한 사람의 혈청으로 펄싱된 DC)의 펩타이드 서열과 한번 더 비교하였고 15개의 RA 시료 (미란성 및 비미란성 RA) 중 적어도 3개 이상에서 재차 생겨났던 펩타이드만을 추가 평가를 위해서 선별하였다.

인터 -알파-트립신 억제제 중쇄 H4

11개의 혈청 시료(미란성 및 비미란성 RA) 중 10개에서 인터-알파-트립신 억제제의 중쇄 H4에서 유래한 에피토프가 발생하였다: 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 ITIH4(271-287). 상기와 같은 ITIH4 에피토프의 주된 길이 변이형은 별개로 하고, 동일한 ITIH4 에피토프에서 6종의 길이 변이형이 동정되었다(표 3): 19-mer ITIH4(271-289; 서열번호 6), 18-mer ITIH4(271-288; 서열번호 7), 16-mer ITIH4(274-289; 서열번호 12), 15-mer ITIH4(273-287; 서열번호 10), 15-mer ITIH4(274-288; 서열번호 11) 및 14-mer ITIH4(274-287; 서열번호 9).

가장 짧은 길이 변이형인 ITIH4(274-287)에서 볼 때, 이 에피토프는 RA 감수성 대립 유전자 DRB1 ^* 0404에 대해 가장 센 결합 모티프를 함유한다: 277F는 P1 앵커로 작용하고, 280D는 P4 앵커로, 282S는 P6 앵커로 작용한다(결합 점수: 1%).

ITIH4는 히알루론산(hyaluronic acid, HA)에 결합하고 급성기(acute phase) 반응에 관여한다고 보여지는 혈청 프로테아제 억제제군인 인터-알파-억제제(IαI) 계통에 속한다(Salier, J.P. 외, Biochemical Journal 315 (1996) 1-9).

HA는 신체의 모든 조직, 특히 성긴(loose) 결합 조직, 예컨대 관절액에서 발견되는 다당류이다(Evered, D. 및 Whelan, J. eds., The Biology of Hyaluronan, John Wiley & Sons (1989)). HA는 연골 및 프로테오글리칸과 응집체를 형성함으로써 세포외 매트릭스를 안정하게 하는 그밖의 조직에서 중요한 구조적 기능을 가진다. 또한 세포 표면 단백질, 예컨대 CD44 및 ICAM-1에 대한 결합을 통해 세포 활성을 조절함으로써 중요한 생물학적 기능을 수행한다(Knudson, C.B. 및 Knudson, W., FASEB J 7 (1993) 1233-1241; Hall, C.L. 외, J Cell Biol 126 (1994) 575-588). RA는 관절액과 혈청에서의 총 HA의 커다란 증가를 동반하는데, 이는 순환하는 HA가 류마티스성 관절에서 비롯됨을 시사하고 있다(Engstrom-Laurent, A. 외, Scand J Clin Lab Invest 45 (1985) 497-504).

HA와 몇몇 IαI 계통 구성원의 복합체는 RA 환자의 활액에서 다량으로 관찰되었다(Jessen, T.E. 외, Biological Chemistry Hoppe-Seyler 375 (1994) 521-526). IαI-HA 복합체의 염증 반응에서의 역할은 백혈구의 활성화 및 공격을 매개하는 CD44-HA 상호작용을 변형시키는데 있다(Isacke, C.M. 및 Yarwood, H., Int J Biochem Cell Biol 34 (2002) 718-721). 또한, RA 환자의 활액은 항염증성 당단백질이자 HA-결합 단백질의 히알라드헤린(hyaladherin) 계통에 속하는 TSG-6을 높은 수준으로 함유한다(Wisniewski, H.G. 외, J Immunol 151 (1993) 6593-6601). TSG-6과 IαI 계통 구성원의 복합체는 염증성 관련 효소 활성의 중심 분자인 플라스민의 활성을 억제한다(Wisniewski, H.G. 외, J Immunol 156 (1996) 1609-1615). 몇몇 급 성기 혈장 단백질, 즉 SG-6과 IαI 계통 구성원에 의한 플라스민 활성의 조절이 염증이 생긴 골절의 활액 내 HA, TSG-6 및 IαI 계통 구성원의 함량이 높은 RA에서 중요한 역할을 함을 입증할 수 있다.

동일 에피토프의 다수의 길이 변이형 및 강력한 HLA-DR4 결합 모티프의 동정과 더불어, 상기 내용들은 혈청-유래 RA 후보 표지자로서 제시된 ITIH4 에피토프의 정당성을 설득력있게 뒷받침하고 있다.

보체 C4

시험된 11개의 RA 혈청(미란성 및 비미란성) 중 8개에서 보체 C4에서 유래한 또다른 우성 에피토프가 동정되었다: 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 15-mer C4(1697-1711)(표 3). 동일한 에피토프의 부가적인 길이 변이형 5종이 발견되었다(표 3): 12-mer C4(1697-1708; 서열번호 18), 13-mer C4(1698-1710; 서열번호 17), 14-mer C4(1697-1710; 서열번호 15), 16-mer C4(1697-1712; 서열번호 14) 및 18-mer C4(1697-1714; 서열번호 18). 또한, 제시된 에피토프는 아주 센 DRB1 ^* 0401 결합 모티프를 나타낸다: P1 앵커로서 1700Y, P2 앵커로서 1704D, P6 앵커로서 1706N이 작용한다(결합 점수: 1%).

혈장 단백질 질량의 대략 0.5%를 차지하는 C4는 보체 체계의 중심 경로를 유발시키는데 있어 아주 중요한 역할을 수행한다. 이 단백질은 단쇄 전구물질로 합성되어 분비되기 전에 효소에 의해 쪼개어져서 동일하지 않은 α-, β-, 및 γ-사슬의 트라이머를 형성한다. 동정된 에피토프 C4(1697-1711)는 C4 γ-사슬의 C-말단에 아주 가까이 위치한다. 또한 C4 α-사슬은 활성화된 C1에 의해 단백 분해되어, 국부 염증 반응 과정을 매개하는 C4a 아나필라톡신(anaphylatoxin)을 형성한다(Moon, K.E. 외, J Biol Chem 256 (1981) 8685-8692).

일반적으로, 보체 연쇄반응(cascade)은 염증성 반응의 유도 및 진행과 연관이 있고, 여러가지 병원성 제제, 예컨대 박테리아, 바이러스 및 기타 항원에 대항하는 주된 방어 체계이다(Morgan, B.P., Methods Mol Biol 150 (2000) 1-13). 그러나 부적절하게 활성화되면 조직 손상을 초래할 수 있고 질환의 징후가 겉으로 드러날 수 있다(Speth, C. 외, Wien Klin Wochenschr 111 (1999) 378-391).

보체 체계의 활성화는 RA의 병인으로 반복적으로 나타나는데, 이는 RA 환자의 혈장, 활액 및 활막 조직 내에 C4 및 C4a 등 보체 대사물의 수준이 늘어남을 보여주는 연구에 근거한 것이다(Neumann, E. 외, Arthritis Rheum 46 (2002) 934-945). 또한 마우스의 콜라겐-유도 관절염(collagen-induced arthritis, CIA)의 특징은 보체 활성화 생성물이 존재한다는 점이다(Linton, S.M. 및 Morgan, B.P., Mol Immunol 36 (1999) 905-914). CIA는 항-C5 단클론성 항체 치료 후에 예방되거나(Wang, Y. 외, PNAS 92 (19950 8955-8959), 또는 유전자 치료법으로 전달된 가용성 CR1(보체 체계의 억제자)으로 치료된 후에 예방된다(Dreja, H. 외, Arthritis Rheum 43 (2000) 1698-1709). 어쩌면 관절 내 보체 인자의 활성화는 다양한 면역 복합체의 존재로 인해 유도되고 감염성 제제와 사이토카인에 의한 선천성 면역 체계를 자극하면 RA가 개시된다는 가설이 세워졌다(Friese, M.A. 외, Clin Exp Immunol 121 (2000) 406-414).

제시된 6종의 C4 에피토프 중 15-mer와 18-mer 에피토프 2종은 건강한 대조 시료에서도 동정되었으며(표 3), 이는 상기 C4 에피토프 중 몇가지 길이 변이형만이 RA-특이적 항원성 펩타이드, 즉 서열 번호 14, 15, 17, 및 18의 항원성 펩타이드임을 나타낸다.

보체 C3

미란성 및 비미란성 RA 시료에서 발견된 또다른 에피토프는 보체 C3(알파-사슬)에서 유래한 것이다: 서열번호 21의 아미노산을 갖는 14-mer C3(1431-1444)(표 3). 혈청에서는 동일 에피토프의 길이 변이형 6종이 부가적으로 동정되었다(표 3): 13-mer C3(1431-1443; 서열번호 23), 14-mer C3(1429-1442; 서열번호 74), 15-mer C3(1431-1445; 서열번호 22), 15-mer C3(1429-1443; 서열번호 20), 17-mer C3(1427-1443; 서열번호 75) 및 19-mer C3(1426-1444; 서열번호 19). 가장 짧은 길이 변이형 C3(1431-1443)에서 볼 때, DRB1 ^* 0401 결합 모티프가 가정될 수 있다: 1434Y는 P1 앵커로, 1437D는 P4 앵커로, 1439A는 P6 앵커로 작용한다.

미란성 및 비미란성 RA 시료에서는 보체 C3(베타-사슬)에서 유래한 에피토프가 추가로 발견되었다: 서열번호 76의 아미노산을 갖는 19-mer C3(157-175)(표 3). 혈청에서는 동일 에피토프의 길이 변이형 1종이 부가적으로 동정되었다(표 3): 20-mer C3(157-176; 서열번호 77).

혈장 단백질 질량의 1-2% 정도를 차지하는 보체 C3는 보체 체계의 활성화에 있어 중심적 역할을 수행하며 급성기 단백질 계통에 속한다. C3 전환효소 (convertase)에 의한 C3a 아나필라톡신 및 C3b로의 진행 과정은 고전적인 보체 경로 및 그의 대안 경로 모두에 있어 중심이 되는 단계이다(Barrington, R. 외, Immunol Rev 180 (2001) 5-15). 활성화된 후, C3b는 반응성 티올에스테르를 통해 세포 표면 탄수화물 또는 면역 응집체에 공유 결합한다(Isaac, L. 및 Isenman, D.E., J Biol Chem 267 (1992) 10062-10069), 동정된 에피토프 C3(143-1444)는 C3b의 C-말단에 위치한다.

보체 에피토프 C4(1697-1711)에서 이미 논의한 바와 같이, RA의 병인에 있어 보체 연쇄반응의 성분이 중요한 역할을 한다는 증거가 늘어나고 있다. 보체 C3 및 C4에서 유래한 2개의 주요 에피토프를 RA 환자의 혈청에서 동정한 바 있는 본 연구의 결과는, 활성화된 보체 체계와 RA의 병인 간에 밀접한 관련이 있음을 분명히 나타내고 있다. 이러한 일치된 내용은 혈청-유래 후보 RA 표지자로서 제시된 C3/C4 에피토프의 정당성에 대한 강한 논거가 된다.

SH3 도메인-결합 글루탐산-풍부-유사 단백질 3

RA 환자 혈청에서 아주 빈번하게 보여지는(미란성 및 비미란성 RA 시료 11개 중 6개) 또다른 에피토프는 SH3 도메인-결합 글루탐산-풍부-유사 단백질 3(SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein 3, SH3BGRL3)이다: 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 SH3BGRL3(15-26). 동일 에피토프에 대해 3종의 길이 변이형이 동정되었다(표 3): 14-mer SH3BGRL3(13-26; 서열번호 26), 14-mer SH3BGRL3(15-28; 서열번호 27), 및 16-mer SH3BGRL3(13-28; 서열번호 24). DRB1 ^* 0401 결합 모티프는 다음과 같다: P1 앵커로 작용하는 17I, P4 앵커로 작용하는 20Q, 및 P6 앵커로 작용하는 22S.

SH3BGRL3는 10kD의 작은 단백질로 SH3BGR 계통에 속한다. 이 단백질의 정확한 기능은 아직 밝혀진 바 없지만 글루타레독신(glutaredoxin)의 생물학적 활성을 조절하는 역할이 추정된다(Mazzocco, M. 외, Biochem Biophys Res Commun 285 (2001) 540-545). 여지껏 SH3BGRL3는 RA와의 관계에서 기술된 바가 없다.

흥미롭게도, 분석을 통해 같은 단백질에서 RA 시료 및 대조 시료 모두에서 다량 존재하는 두번째 에피토프를 밝혀내었다: 아미노산 서열이 DGKRIQYQLVDISQDN인 16-mer SH3BGRL3(29-44). 또한 동일 에피토프의 여러 길이 변이형이 대부분의 시료에서 발견되었다. 가장 짧은 길이 변이형 SH3BGRL3(31-42)에서 볼 때, 이 에피토프는 SH3BGRL3(15-26)과 비교해서 거의 유사한 DRB1 ^* 0401 앵커 잔기를 함유한다: P1 앵커로 작용하는 33I, P4 앵커로 작용하는 36Q, 및 P6 앵커로 작용하는 38V(결합 점수 -2). 거의 비슷한 결합 점수는 이러한 유사성을 반영한다.

이러한 두번째 SH3BGRL3 에피토프의 존재는 SH3BGRL3(15-26) 에피토프의 정당성을 뒷받침하는데, 이는 두 펩타이드 모두 같은 단백질에서 유래하지만 이들 중 단 하나의 에피토프 SH3BGRL3(15-26)만이 RA-특이적 반응에서 생성되는 것으로 보이기 때문이다. 비슷한 관찰 내용에 대해서 실시예 1의 GILT에서 이미 기재한 바 있다.

또한 4종의 SH3BGRL3 길이 변이형 중에서 가장 긴 변이형인 SH3BGRL3(13-28) 은 건강한 대조 시료에서 동정되었다(표 3). 그러나, 이러한 특정 길이 변이형은 단 한번 발견되었을 뿐이며, 이는 RA에서 SH3BGRL3가 유의적으로 풍부함을 나타낸다.

인터루킨-4(IL-4) 유도 단백질 1

조사했던 모든 활액(미란성 및 비미란성 RA)과 11개의 혈청(미란성 및 비미란성 RA) 중 8개에서, 사람의 IL-4 유도 단백질(Fig1)의 동족체(homolog)에서 유래한 1개의 아주 우세한 에피토프가 동정되었다: 서열번호 28의 아미노산을 갖는 Fig1(293-309)(표 3). 또한 이 에피토프의 정당성은 몇몇 시료에서 부가적으로 존재하는 길이 변이형에 의해 뒷받침된다(표 3): 16-mer Fig1(293-308; 서열번호 30) 및 19-mer Fig1(293-311; 서열번호 29). 또한 아미노산 서열은 전형적인 DRB1 ^* 0401 결합 모티프를 나타낸다: P1 앵커로 작용하는 299V, P4 앵커로 작용하는 302E, 및 P6 앵커로 작용하는 304S(결합 점수 1%).

동일 에피토프의 2종의 길이 변이형인 Fig1(293-308)과 Fig1(293-309)은 1개의 펄싱되지 않은 시료와 1개의 건강한 대조 시료에서도 동정되었다(표 1). 그러나, Fig1 에피토프가 거의 모든 RA 시료에는 존재하고 시험했던 모든 대조 시료에는 존재하지 않았다는 것으로부터 RA에는 Fig1이 풍부함을 분명히 알 수 있다.

사람의 fig1 유전자는 IL-4 자극된 B 세포 배양액에서 처음으로 동정되었다(Chu, C.C. 및 Paul, W.E., PNAS 94 (1997) 2507-2512). 사람의 fig1은 자가 면역 질환, 예컨대 SLE, 관절염, 다발성 경화증, 및 인슐린-의존성 당뇨병에 대한 감수 성과 연관 있는 것으로 이전에 동정되었던 영역인 염색체의 19q13.3-19q13.4에 존재한다(Becker K.G. 외, PNAS 95 (1998) 9979-9984). 그 유전자의 발현이 면역 조직으로 극히 제한되어 있고 그 조절이 면역 반응의 주(主) 조절자인 IL-4에 의존적이기 때문에, 따라서 fig1은 자가 면역 질환 감수성에 대한 후보자로 눈길을 끈다(Chavan, S.S. 외, Biochem Biophys Acta 1576 (2002) 70-80). HLA-DR4 제한된 Fig1 에피토프의 제시로 인해 Fig1 단백질이 만들어지고 어쩌면 RA의 질환 진행과 연관되어 있음을 처음으로 알게 되었다. Fig1 폴리펩타이드는 여지껏 RA에 대한 표지자로서 알려지지 않았으며, RA에 대한 중요한 후보 표지자로서 간주된다.

헤모펙신

혈청 시료(11개 시료 중 10개)와 활막 시료(4개 시료 중 2개)(미란성 및 비미란성 RA)에서 빈번하게 동정되었던 또다른 RA 후보 표지자는 헤모펙신(hemopexin, HPX)에서 유래한 것이다: 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 HPX(351-367)(표 3). 본 에피토프의 정당성을 뒷받침해 주는 몇몇 길이 변이형이 발견되었다(표 3): 13-mer HPX(351-363; 서열번호 33), 14-mer HPX(350-363; 서열번호 34), 15-mer HPX(351-365; 서열번호 35), 18-mer HPX(351-368; 서열번호 31), 및 18-mer HPX(350-367; 서열번호 78). 또한 에피토프는 아주 센 DRB1 ^* 0401 결합 모티프를 함유한다: P1 앵커로 작용하는 355I, P4 앵커로 작용하는 358D, 및 P6 앵커로 작용하는 360V(결합 점수 1%).

동일 에피토프의 2종의 길이 변이형인 HPX(351-367; 서열번호 32)와 HPX(351-365; 서열번호 35)는 건강한 대조 시료에서도 동정되었으며(표 3), 이는 단지 몇가지 길이 변이형만이 RA에 대해 특이적인 항원성 펩타이드, 즉 서열 번호 31, 33, 34, 및 78의 항원성 펩타이드임을 나타낸다.

HPX는 60kD의 혈장 당단백질로 헴(heme)에 대한 결합 친화력이 높다(Muller-Eberhard, U., Methods Enzymol 163 (1988) 536-565). 이는 주로 간에서 발현되며, 그 합성이 염증 상황을 유도하는 급성기 단백질에 속한다. RA는 만성 염증성 자가 면역 질환으로 C-반응성 단백질과 혈청 아밀로이드 A 등 몇가지 급성기 단백질이 다량 존재하는 것으로 보고되고 있다(Nakamura, R., J Clin Lab Anal 14 (2000) 305-313). HPX는 RA로 고통 받는 환자에게서 상향 조절되는 사이토카인 IL-1과 IL-6과 반응한다(Feldmann, M. 및 Maini, R.N., Rheumatology 38, Suppl 2 (1999) 3-7).

HPX는 혈장에서 헴을 수송하는 주된 비히클(vehicle)로, 기본적으로 헴-매개된 산화적 스트레스를 막고 헴-결합된 철이 손실되는 것을 방지하는 역할을 한다(Tolosano, E. 및 Altruda, F., DNA Cell Biol 21 (2002) 297-306). HPX는 세포내 항산화제 예컨대 헴 옥시게나제(oxygenase), 메탈로티오네인 및 페리틴의 발현을 유도함으로써 산화적 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있다. 메탈로티오네인은 세포질 단백질로 특히 활막 섬유아세포에서 발현된다(Backman, J.T. 외, Virchows Arch 433 (1998) 153-160). RA 환자의 활막 조직에 산화적 스트레스가 존재한다는 뚜렷한 실험상의 증거가 있다(reviewed in: Schett, G. 외, Arthritis Res 3 (2000) 80-86). 또한 HPX는 사람의 T 림프구의 증식을 증진시키는 것으로 보고되고 있다(Smith, A. 외, Exp Cell Res 232 (1997) 246-254). 이러한 연구로 인해 HPX가 RA 환자의 혈청과 활막에서 상향 조절되는 단백질에 속하는 것으로 여겨지게 되고 따라서 이는 RA-특이 후보 표지자로서 HPX(351-367)의 상관성에 대한 근본이 되는 이유를 제공하고 있다.

Hsc70 -상호작용 단백질

혈청 시료(11개의 미란성 및 비미란성 RA 시료 중 4개)에서 대부분 동정되었고 또한 스트레스 반응과 관련이 있는 에피토프는 Hsc70-상호작용 단백질(Hsc70-interacting protein) Hip에서 유래한 것이다: 서열번호 38의 아미노산을 가진 Hip(83-98)(표 3). 이 에피토프의 2종의 길이 변이형이 동정되었다(표 3): 18-mer Hip(83-100; 서열번호 36) 및 15-mer Hip(84-98; 서열번호 39). 부가의 길이 변이형은 1개의 미란성 활막 시료에서 발견되었다(표 3): 15-mer Hip(85-99; 서열번호 37). 가장 짧은 길이 변이형 Hip(84-98)에서 볼 때, 보통 점수인 8%의 DRB1 ^* 0401 결합 모티프를 가정할 수 있다: P1 앵커로 작용하는 89I, P4 앵커로 작용하는 92D, 및 P6 앵커로 작용하는 94D.

진핵 세포의 세포질에서 Hip 및 Hop 단백질은 Hsc70 샤프론(chaperone) 활성을 조절하기 위해서 Hsc70과 관련한다(Frydman, J. 및 Hohfeld, J., Trends Biochem Sci 22 (1997) 87-92). 42kD의 Hip 단백질은 Hsc70의 ATP아제 도메인과 결합한다. Hip는 Hsc70과 하류(downstream) 샤프론 체계의 효율적인 협동에 대한 분자적 기재를 제공하면서 샤프론-기질 복합체의 반감기를 증가시킬 수 있을 것이라 고 추정되어졌다. Hsc70과 Hsc90은 시험관내(in vitro) 단백질 접힘(folding) 현상이 일어나는 동안 서로 돕는 것으로 알려져 있으며(Jakob, U. 및 Buchner, J., Trends Biochem Sci 19 (1994) 205-211; Freeman, B.C. 및 Morimoto, R.I., EMBO J 15 (1996) 2969-2979), 열 변성에서 역할을 담당한다고 알려져 있다(Schneider, C. 외, PNAS 93 (1996) 14536-14541). 스트레스-적응과 Hsc70 및 Hsc90과의 관련성은 RA 환자의 활막 조직에서 열 쇼크 단백질의 유도 등의 스트레스 반응과 Hip를 연결짓는다(reviewed in: Schett, G. 외, Arthritis Res 3 (2001) 80-86).

ITIH4 , C4 , C3 , SH3BGRL3 , Fig1 , HPX 및 HIP의 결합 성질

전술한 항원성 펩타이드인 ITIH4, C4, C3, SH3BGRL3, Fig1, HPX 및 HIP의 HLA-DR4 분자에 대한 결합 성질을 추가적으로 알아보기 위해서, 시험관내(in vitro) 결합 검정을 수행하였다(도 3): IC50 펩타이드에 따르면 보고자 펩타이드 HA(309-317), 합성 펩타이드 ITIH4(274-287), SH3BGRL3(13-26), 및 Fig1(293-309)는 높은 친화력으로 HLA-DR4와 결합한다(도 3). 합성 펩타이드 C4(1696-1709)와 HPX(351-365)는 HLA-DR4에 대해 보통 정도로 결합하는 것으로 측정되었다. 합성 펩타이드 C3(1431-1444)는 HLA-DR4에 약하게 결합하였으며 이는 TEPITOPE 점수(9%)와 일치한다. Hip(84-98) 펩타이드에 대해서는 결합이 보이지 않았다(데이터 무).

불변 사슬(Ii)

미란성 및 비미란성 RA을 나타내는 것으로 보이는 후보 표지자 펩타이드 중에서 HLA-DR-관련 불변 사슬(invariant chain, Ii)에서 유래한 에피토프이다: 아미노산 서열이 ATPLLMQALPMGALP인 15-mer Ii(110-124; 서열번호 83)(표 3). 또한 4종 의 길이 변이형이 동정되었다: 16-mer Ii(109-124; 서열번호 81), 17-mer Ii(109-125; 서열번호 80), 18-mer Ii(109-126; 서열번호 79) 및 21-mer Ii(109-129; 서열번호 82)(표 3). 길이 변이형이 존재한다는 것은 동정된 펩타이드 서열에 대해 확신을 가지게 해주며, 이는 P1 앵커로 작용하는 114L, P4 앵커로서 117A, 및 P6 앵커로서 119P를 가지며 보통의 DRB1 ^* 0401 결합 모티프를 나타낸다(TEPITOPE 결합 점수: 5%). 에피토프는 2개의 미란성 RA 시료와 3개의 비미란성 RA 시료에서 동정되었다. 2개의 Ii 길이 변이형은 펄싱되지 않은 시료 1개와 건강한 사람의 시료 2개에서도 발견되었다.

MHC 클래스 II 분자의 펩타이드 로딩(loading)은 클래스 II 경로에서 불변 사슬 Ii와 HLA-DM이라는 2개의 부속 분자의 조절을 받는다(reviewed by Bakke, O. 및 Nordeng T.W., Immunol Rev 172 (1999) 171-187 및 Kropshofer, H. 외, Immunol Today 18 (1997) 77-82). Ii 트라이머는 소포체(endoplasmic reticulum, ER)에서 초기의(nascent) MHC 클래스 II 분자에 결합하여 펩타이드-결합 그루브를 차단하면서 클래스 II 분자를 안정화시키고 ER에 존재하는 리간드의 결합을 방지한다. 클래스 II/Ii 복합체는 골지체를 통해 엔도좀으로 운반되며, Ii는 엔도좀에서 포개진(nested) 클래스 II-관련 Ii 펩타이드(class II-associated Ii peptide, CLIP) 세트로 분해된다(degrade). CLIP의 방출로 인해 엔도좀성 펩타이드가 세포 표면의 T 세포 수용체에 제시되는 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있게 된다. 흥미롭게도, CLIP와 RA-관련 HLA-DR 대립 유전자의 상호작용의 감소가 기재되어 있으며(Patil, N.S. 외, J Immunol 167 (2001) 7157-7168), 이는 상호작용의 감소가 RA 내 자가 면역성의 병리생리학에 도움이 됨을 나타낸다.

레티놀산 수용체 반응체 단백질 2

11개의 혈청 시료(미란성 및 비미란성 RA) 중 4개에서 레티놀산 수용체 반응체 단백질 2(retinoic acid receptor responder protein 2, RARRES2)에서 유래한 에피토프를 동정하였다: 아미노산 서열이 HPPVQWAFQETSVESAVDTPFP인 22-mer RARRES2(40-61; 서열번호 86)(표 3). 에피토프의 C-말단부에서 2종의 길이 변이형이 동정되었다: 23-mer RARRES2(40-62; 서열번호 84) 및 24-mer RARRES2(40-63; 서열번호 85)(표 3). 이 에피토프는 보통의 DRB1 ^* 0401 결합 모티프를 나타내며 여기서는 45W가 P1 앵커로, 48Q가 P4 앵커로, 50T가 P6 앵커로 작용한다(TEPITOPE 결합 점수: 3%).

RARRES2는 18.6kD의 작은 단백질로 대개는 내피와 표피에서 발현된다. 발현은 호르몬에 의존하는 것처럼 보이며 피부의 레티놀산과 몇몇 골수-유래 기질 세포(stromal cell)의 몇가지 골영양(osteotrophic) 호르몬에 반응하는 것으로 동정되었다(Nagpal, S. 외, J Invest Dermatol 109 (1997) 91-95 및 Adams, A.E. 외, J Cell Biochem 74 (1999) 587-595). RARRES2의 기능은 많이 알려져 있지 않고 RA와의 관련성, 예컨대 손상된 파골세포 생성(osteoclastogenesis)을 통한 RA와의 관련성을 상상할 수 있다.

피브로넥틴

4개의 활액 시료(미란성 및 비미란성 RA) 중 오로지 3개에서만 발견된 또다른 HLA-DR4 관련 펩타이드는 혈액의 혈장과 세포외성 매트릭스에 많은 당단백질인 피브로넥틴(fibronectin, Fn)에서 유래된다: 아미노산 서열이 IYLYTLNDNARSSPV인 15-mer Fn(1881-1895; 서열번호 90)(표 3). 이 에피토프는 아주 좋은 DRB1 ^* 0401 결합자인 것처럼 보이며 이는 소수성 P1 앵커로서 작용하는 1885Y, P4 앵커로서 1888N 및 P6 앵커로서 1890N를 포함한다(TEPITOPE 결합 점수:1%). 4종의 길이 변이형이 부가적으로 동정되었다: 16-mer Fn(1881-1896; 서열번호 91), 16-mer Fn(1880-1895; 서열번호 88), 17-mer Fn(1881-1897; 서열번호 89) 및 17-mer Fn(1880-1896; 서열번호 87)(이들은 동정된 Fn 에피토프의 정당성을 강력 뒷받침해 준다(표 3)).

피브로넥틴은 세포 부착(adhesion), 세포 운동성 및 식작용 증진(opsonization)에 있어 중요한 역할을 담당한다. 이것은 콜라겐과 피브린에 결합하고 콜라겐 섬유(fibril)에 대한 섬유아세포의 부착을 매개한다. 피브로넥틴은 RA 환자와 골관절염 환자의 활막층(synovial lining layer)에서 강하게 발현하고 질환 골절의 증식과 서로 관련이 있다. 활막 기원 시료에만 있는 에피토프 Fn(1881-185)의 동정은 이러한 조사 결과와 일치하며 아주 풍부한 피브로넥틴이 자가 면역성에서 어떤 역할을 할지 추정할 수 있다.

카텝신 B

15개의 RA 시료(미란성 및 비미란성 RA) 중 3개에서 카텝신 B(Cathepsin, CatB)에서 비롯하는 에피토프가 나타났다: 아미노산 서열이 YNSYSVSNSEKDIMA인 15-mer CatB(227-241; 서열번호 92)(표 3). 상기 펩타이드는 보통 정도의 DRB1 ^* 0401 결합 모티프를 나타내며 이는 소수성 P1 앵커로 작용하는 230Y와 추정 P4 및 P6 앵커로 작용하는 세린 잔기를 233번과 235번 위치에 가진다(TEPITOPE 결합 점수: 6%).

카텝신 B는 티올 펩티다제로 단백질, 예컨대 콜라겐의 재생(turnover) 및 세포성 분해에 관여한다고 여겨지고 있다. 이것은 백혈구 등 서로 다른 세포 형태의 라이소좀에 위치한다. 염증과 질환에 있어 카텝신 B는 골관절염에서의 연골 파괴와 RA 및 암에서의 병리 단백질 분해(proteolysis)에 관여한다(Cunnane, G. 외, Arthritis Rheum 4 (2001) 1744-1753). 카텝신 B 및 다른 라이소좀성 펩티다제의 효소 활성은 에피토프 CatB(227-241)의 추정 RA 표지자 펩타이드로서의 정당성을 뒷받침하는 RA 진행과 상호 연관이 있다(Sohar, N. 외, Biol Chem 383 (2002) 865-869).

트리펩티딜 - 펩티다제 II

15개의 RA 시료(미란성 및 비미란성 RA) 중 3개에서 발견된 또다른 펩티다제-유래 에피토프는 트리펩티딜-펩티다제 II(tripeptidyl-peptidase II, TPP2)에서 유래한 것이다: 아미노산 서열이 AGSLTLSKTELGKKA인 15-mer TPP2(970-984; 서열번호 93)(표 3). 또한 길이 변이형 TPP2(970-985; 서열번호 94)가 동정되었다. 펩티다제 에피토프는 전형적인 DRB1 ^* 0401 결합 모티프를 함유하며 이는 각각 P1, P4, 및 P6 앵커로 작용하는 973L, 976S 및 978T를 갖는다(TEPITOPE 결합 점수: 3%).

트리펩티딜-펩티다제 II도 라이소좀성 단백질 분해와 관련있다는 점에서 카텝신 B와 유사하다. RA 내에서 에피토프 TPP2(970-984)의 동정은 염증 및 RA에서 TPP2가 손상된 단백질의 분해에 관련되어 있음을 처음으로 보여주는 것이다.

레구메인

레구메인(legumain, LGMN)은 이번 조사에서 밝혀진 3종의 펩티다제 중의 마지막이다. 아미노산 서열이 VPKDYTGEDVTPQN인 동정된 에피토프 LGMN(99-112; 서열번호 95)(표 3)은 전형적인 HLA 대립 유전자 DRB1 ^* 0401 결합 모티프를 나타내며, 여기서 103Y는 P1 앵커로 작용하며, 106E는 P4 앵커로, 108V는 P6 앵커로 작용한다(TEPITOPE 결합 점수: 1%)

레구메인은 항원-제시 세포, 예컨대 수지상 세포의 엔도좀성 및 라이소좀성 분획에서 생겨난다(Schwarz, G. 외, Biol Chem 383 (2002) 1813-1816). 이것은 아스파라지닐 결합의 가수분해에 엄격한 특이성을 가지며 박테리아성 항원의 MHC 클래스 II 제시 과정에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Manoury, B. 외, Nature 396 (1998) 695-699). 레구메인이 RA 등의 자가 면역 질환에 관여하는지는 아직 알려지지 않은 상태이나, 3종의 라이소좀성 펩티다제가 GILT 및 26S 프로테오좀과 함께 본 연구에서 동정되었다는 점은 항원의 진행 과정을 촉진하는 단백질 분해 절차가 RA 내에서 유의적으로 바뀌었음을 시사하고 있다.

혈소판 활성 인자 수용체

7개의 혈청 RA 시료(미란성 및 비미란성 RA) 중 3개에서 동정된 에피토프는 혈소판 활성 인자의 수용체(platelet activating factor, receptor, PAFR)에서 유래한 것이다: 아미노산 서열이 DSKFHQAINDAHQ인 13-mer PAFR(264-276; 서열번호 96)(표 3). TEPITOPE 점수(3%)에 따르면, 이 에피토프는 P1 앵커로서 267F, P4 앵커로서 270A, P6 앵커로서 272N을 가진 보통 정도의 DRB1 ^* 0401 결합 모티프를 함유한다(표 3).

혈소판 활성 인자(PAF)은 전구 염증성 지질 매개체로, 여러 형태의 세포 표면의 G-단백질 커플링된 막 통과(transmembrane) 수용체에 결합한다. 수용체 결합에 의해 PAF는 세포의 운동성, 평활근의 수축, 및 사이토카인의 합성과 방출을 포함하는 다면적(pleiotrophic) 작용을 도입한다(transduce)(reviewed by Honda, Z. 외, J Biochem 131 (2002) 773-779). PAFR(-/-) 마우스에 대한 약물학적 연구 및 확립을 통해 알레르기, 염증, 신경 기능, 생식, 및 죽상 경화증 등을 포함한 여러 부분에서 PAF가 작용하고 있음이 나타나고 있다. 흥미롭게도 PAF는 RA 환자의 활액에서 높은 수준으로 발견되었고 류마티스성 활막염에서 빈번하게 보여지던 신생혈관 형성(neoangiogenesis)을 유도한다고 알려졌다(Lupia, E. 외, Eur J Immunol 26 (1996) 1690-1694). 이런 종류의 증거는 에피토프 PAFR(264-276)가 RA-관련 표지자 펩타이드라는 확신을 더해주고 있다.

폴리 -알파-2,8- 시알릴트랜스퍼라제

11개의 혈청 시료(미란성 및 비미란성 RA) 중 3개에서 발견된 또다른 에피토프는 포리시알릴트랜스퍼라제(polysialyltransferase, PST)에서 비롯된 것으로: 아 미노산 서열이 MPLEFKTLNVLHNRG인 15-mer PST(333-347; 서열번호 97)(표 3), DRB1 ^* 0401 결합에 대해 보통의 결합 모티프를 보인다(TEPITOPE 점수: 3%). 337F가 P1 앵커로 작용하며, 340L은 P4 앵커로, 342V는 P6 앵커로 작용한다.

폴리시알산은 선형 호모폴리머(homopolymer)인 α-2,8-연결된 시알산 잔기로 이루어진 탄수화물이다. 글리칸(glycan)은 신경 세포 부착 분자(N-CAM)에 주로 부착되어 있고 N-CAM의 부착 성질을 조절함으로써 신경 세포의 다수 형성(morphogenic) 과정에 관련이 있다. 막 단백질 폴리시알릴트랜스퍼라제는 시알산 잔기의 중축합(polycondensation) 반응을 촉매하고 태아의 두뇌, 폐 및 간에서, 성인의 심장, 비장 및 흉선에서 다량 발현되며, 말초 혈액 백혈구에서는 다소 적은 정도로 발현된다(Nakayama, J. 외, Proc Natl Acad Sci 92 (1995) 7031-7035). 높은 수준의 PST가 전이암 환자 혈청에서 관찰된 바 있으며 효소 활성의 증가는 류마티스성 관절염과도 연관이 있었다(Berge, P.G. 외, Klin Wochenschr 60 (1982) 445-449). 몇몇 RA 시료에서 에피토프 PST(333-347)의 동정은 이러한 관찰 내용과 일치하며 RA에서 PST의 추정적 역할을 뒷받침해 준다.

Ras -관련 단백질 Rab -11B

RA 시료 분석에서 나타난 마지막 에피토프는 Ras-관련 단백질 Rab-11B에서 유래한다: 아미노산 서열이 RSIQVDGKTIKAQ인 13-mer Rab-11B(51-63; 서열번호 102)(표 3, 상기 펩타이드 서열은 TEPITOPE 소프트웨어를 이용함으로써 RA 감수성 대립 유전자 DRB1 ^* 0301에 대한 결합에 대해 정당함을 보여준다(Hammer, J. 외, Adv Immunol 66 (1997) 67-100)). 이 에피토프 및 4종의 부가적인 길이 변이형(14-mer Rab-11B(50-63; 서열번호 100), 15-mer Rab-11B(49-63; 서열번호 98), 17-mer Rab-11B(49-65; 서열번호 101) 및 18-mer Rab-11B(49-66; 서열번호 99))은 3개의 미란성 RA 시료와 2개의 비미란성 RA 시료에서 발견되었다(표 3). 15-mer Rab-11B(49-63)은 12개의 대조 시료 중 1개에서도 동정되었다.

Rab 단백질은 세포내 유입(endocytic) 및 세포외 유출(exocytic) 경로를 따라 일어나는 막 수송에서 중요한 역할을 담당하는 작은 GTP아제이다. Rab-11B는 흡수된(internalized) 트랜스페린을 재활용(recycling) 구획에서 원형질 막까지 운반하는데 꼭 필요한 것으로 추정된다. 또한 Rab-11B는 래트 파골세포에서 동정되었고 골 흡수(resorption)에서 부가적인 역할을 한다. 에피토프 Rab-11B(51-63)는 RA 진행에서 Rab-11B의 역할을 하는지 처음으로 보여주고 있다.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> RA antigenic peptides <130> 21796 <160> 57 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Asp Arg Gly Met Gln Leu Met His Ala Asn Ala Gln Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Asp Arg Gly Met Gln Leu Met His Ala Asn Ala Gln Arg Thr Asp 1 5 10 15 Ala <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Asp Arg Gly Met Gln Leu Met His Ala Asn Ala Gln Arg Thr Asp 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ile Asn Asn Gln Leu Thr Leu Asp Ser Asn Thr Lys Tyr Phe His Lys 1 5 10 15 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ile Asn Asn Gln Leu Thr Leu Asp Ser Asn Thr Lys Tyr Phe His Lys 1 5 10 15 Leu <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Pro Lys Asn Val Val Phe Val Ile Asp Lys Ser Gly Ser Met Ser 1 5 10 15 Gly Arg Lys <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Pro Lys Asn Val Val Phe Val Ile Asp Lys Ser Gly Ser Met Ser 1 5 10 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Thr 145 150 155 160 20 Val Pro Asp Ser Ala Gly Ser Gly Asn Val Thr Arg Cys Phe Glu His 165 170 175 Tyr Glu Lys Gly Ser Val Pro Val Leu Ile Ile His Ile Phe Ile Val 25 180 185 190 30 Phe Ser Phe Phe Leu Val Phe Leu Ile Ile Leu Phe Cys Asn Leu Val 195 200 205 Ile Ile Arg Thr Leu Leu Met Gln Pro Val Gln Gln Gln Arg Asn Ala 210 215 220 35 Glu Val Lys Arg Arg Ala Leu Trp Met Val Cys Thr Val Leu Ala Val 225 230 235 240 40 Phe Ile Ile Cys Phe Val Pro His His Val Val Gln Leu Pro Trp Thr 245 250 255 Leu Ala Glu Leu Gly Phe Gln Asp Ser Lys Phe His Gln Ala Ile Asn 45 260 265 270 50 Asp Ala His Gln Val Thr Leu Cys Leu Leu Ser Thr Asn Cys Val Leu 275 280 285 Asp Pro Val Ile Tyr Cys Phe Leu Thr Lys Lys Phe Arg Lys His Leu 290 295 300 55 Thr Glu Lys Phe Tyr Ser Met Arg Ser Ser Arg Lys Cys Ser Arg Ala 305 310 315 320 60 Thr Thr Asp Thr Val Thr Glu Val Val Val Pro Phe Asn Gln Ile Pro 325 330 335 Gly Asn Ser Leu Lys Asn 65 340 <210> 140 <211> 359 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <308> Swissprot/Q92187 5 <309> 1997-11-01 <313> (1)..(359) <400> 140 10 Met Arg Ser Ile Arg Lys Arg Trp Thr Ile Cys Thr Ile ser Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ile Phe Tyr Lys Thr Lys Glu Ile Ala Arg Thr Glu Glu His Gln 15 20 25 30 20 Glu Thr Gln Leu Ile Gly Asp Gly Glu Leu Ser Leu Ser Arg Ser Leu 35 40 45 Val Asn Ser Ser Asp Lys Ile Ile Arg Lys Ala Gly Ser Ser Ile Phe 50 55 60 25 Gln His Asn Val Glu Gly Trp Lys Ile Asn Ser Ser Leu Val Leu Glu 65 70 75 80 30 Ile Arg Lys Asn Ile Leu Arg Phe Leu Asp Ala Glu Arg Asp Val Ser 85 90 95 Val Val Lys Ser Ser Phe Lys Pro Gly Asp Val Ile His Tyr Val Leu 35 100 105 110 40 Asp Arg Arg Arg Thr Leu Asn Ile Ser His Asp Leu His Ser Leu Leu 115 120 125 Pro Glu Val Ser Pro Met Lys Asn Arg Arg Phe Lys Thr Cys Ala Val 130 135 140 45 Val Gly Asn Ser Gly Ile Leu Leu Asp Ser Glu Cys Gly Lys Glu Ile 145 150 155 160 50 Asp Ser His Asn Phe Val Ile Arg Cys Asn Leu Ala Pro Val Val Glu 165 170 175 Phe Ala Ala Asp Val Gly Thr Lys Ser Asp Phe Ile Thr Met Asn Pro 55 180 185 190 60 Ser Val Val Gln Arg Ala Phe Gly Gly Phe Arg Asn Glu Ser Asp Arg 195 200 205 Glu Lys Phe Val His Arg Leu Ser Met Leu Asn Asp Ser Val Leu Trp 210 215 220 65 Ile Pro Ala Phe Met Val Lys Gly Gly Glu Lys His Val Glu Trp Val 225 230 235 240 245 250 255 Ser Leu Arg Leu Ile His Ala Val Arg Gly Tyr Trp Leu Thr Asn Lys 5 260 265 270 10 Val Pro Ile Lys Arg Pro Ser Thr Gly Leu Leu Met Tyr Thr Leu Ala 275 280 285 Thr Arg Phe Cys Asp Glu Ile His Leu Tyr Gly Phe Trp Pro Phe. Pro 290 295 300 15 Lys Asp Leu Asn Gly Lys Ala Val Lys Tyr His Tyr Tyr Asp Asp Leu 305 310 315 320 20 Lys Tyr Arg Tyr Phe Ser Asn Ala Ser Pro His Arg Met Pro Leu Glu 325 330 335 Phe Lys Thr Leu Asn Val Leu His Asn Arg Gly Ala Leu Lys Leu Thr 25 340 345 350 30 Thr Gly Lys Cys Val Lys Gln 355 <210> 141 <211> 218 <212> PRT 35 <213> Homo sapiens <300> <308> swissprot/Q15907 <309> 1998-07-15 40 <313> (1)..(218) <400> 141 Met Gly Thr Arg Asp Asp Glu Tyr Asp Tyr Leu Phe Lys Val Val Leu 45 1 5 10 15 50 Ile Gly Asp Ser Gly Val Gly Lys Ser Asn Leu Leu Ser Arg Phe Thr 20 25 30 Arg Asn Glu Phe Asn Leu Glu Ser Lys Ser Thr Ile Gly Val Glu Phe 35 40 45 55 Ala Thr Arg Ser Ile Gln Val Asp Gly Lys Thr Ile Lys Ala Gln Ile 50 55 60 60 Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Arg Tyr Arg Ala Ile Thr Ser Ala Tyr 65 70 75 80 Tyr Arg Gly Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Tyr Asp Ile Ala Lys His 65 8 5 90 9 5 70 Leu Thr Tyr Glu Asn Val Glu Arg Trp Leu Lys Glu Leu Arg Asp His 100 105 110 PCT/EP2004/008609 104 Ala Asp Ser Asn Ile Val Ile Met Leu Val Gly Asn Lys Ser Asp Leu 115 120 125 5 Arg His Leu Arg Ala Val Pro Thr Asp Glu Ala Arg Ala Phe Ala Glu 130 135 140 10 Lys Asn Asn Leu Ser Phe Ile Glu Thr Ser Ala Leu Asp Ser Thr Asn 145 150 155 160 Val Glu Glu Ala Phe Lys Asn Ile Leu Thr Glu Ile Tyr Arg Ile Val 15 165 170 175 20 Ser Gln Lys Gln Ile Ala Asp Arg Ala Ala His Asp Glu Ser Pro Gly 180 185 190 Asn Asn Val Val Asp Ile Ser Val Pro Pro Thr Thr Asp Gly Gln Lys 195 200 205 25 Pro Asn Lys Leu Gln Cys Cys Gln Asn Leu 210 215

Claims (29)

1. (a) 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는

   (b) 서열번호 1 내지 39 및 서열번호 58 내지 102로 이루어진 군으로부터 선택된 상응 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접(flanking) 서열을 갖는 적어도 서열번호 49 내지 57 및 서열번호 103 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드.
2. (a) 적어도 서열번호 49로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는

   (b) 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 상응 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 49로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드.
3. (a) 적어도 서열번호 103으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는

   (b) 서열번호 58 및 59에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 103으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드.
4. (a) 적어도 서열번호 104로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는

   (b) 서열번호 60에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 104로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드.
5. (a) 적어도 서열번호 105로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는

   (b) 서열번호 61에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 105로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드.
6. (a) 적어도 서열번호 106으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는

   (b) 서열번호 62에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 106으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드.
7. (a) 적어도 서열번호 107로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는

   (b) 서열번호 63에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 107로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드.
8. (a) 적어도 서열번호 50으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는

   (b) 서열번호 5에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 50으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드.
9. (a) 적어도 서열번호 108로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는

   (b) 서열번호 64 내지 67에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 108로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드.
10. (a) 적어도 서열번호 109로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는

    (b) 서열번호 68에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 109로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드.
11. (a) 적어도 서열번호 110으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는

    (b) 서열번호 69 및 70에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 110으로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드.
12. (a) 적어도 서열번호 111로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는

    (b) 서열번호 72에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 111로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드.
13. (a) 적어도 서열번호 112로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열, 또는

    (b) 서열번호 73에 상응하는 서열의 부가적인 N- 및 C-말단 인접 서열을 갖는 적어도 서열번호 112로 표시되는 펩타이드 결합 모티프의 아미노산 서열을 포함하는 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드.
14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,

    MHC 클래스 II 분자에 연결된 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드.
15. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드와 반응하는 항체.
16. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
17. 발현 벡터에 작동가능하게 연결된 제 16 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 작제물.
18. 제 17 항에 따른 핵산 작제물을 함유하는 숙주 세포.
19. 펩타이드의 발현 조건 하에서 제 18 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 그 세포 또는 배양액으로부터 펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드의 제조 방법.
20. (a) 0.1㎍ 내지 5㎍의 MHC 클래스 II 분자를 포함하는 미성숙 수지상 세포를 제공하는 단계;

    (b) (a)의 세포를 혈청 또는 활액과 접촉시키고 TNF알파를 가하여 수지상 세포의 성숙을 유도하는 단계;

    (c) 세포의 가용화시키고 면역 침전이나 면역 친화성 크로마토그래피에 의한 항원성 펩타이드를 갖는 MHC 클래스 II 분자 복합체를 격리시키는 것을 포함하는 방법을 사용하여 상기 세포로부터 클래스 II MHC 분자-항원성 펩타이드 복합체를 단리 하는 단계;

    (d) 항원성 펩타이드를 갖는 MHC 클래스 II 분자의 격리된 복합체를 한외여괴 튜브에서 물로 세척하는 단계;

    (e) 37℃에서 트리플루오로 아세트산 희석액을 가하여 MHC 클래스 II 분자로부터 관련 항원성 펩타이드를 용출시키는 단계; 및

    (f) 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법에 의해 단리된 펩타이드를 분리, 검출 및 동정하는 단계

    를 포함하는, 펨토몰 양으로 존재하는 MHC 클래스 II 관련 RA 항원성 펩타이드의 단리 및 동정 방법.
21. 제 20 항에 있어서,

    상기 (f) 단계에서의 액체 크로마토그래피가 펩타이드의 용출 단계에 앞서 오염체를 용출시키기에 충분한 부피를 가하여 역상 물질로부터 나오는 첫번째 선형 용출 단계를 포함하는 방법.
22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,

    추가로 (g) 다중 데이터세트에 걸쳐 상대적인 데이터 분석을 수행하도록 개발된 데이터베이스와 소프트웨어를 포함하는 방법을 사용하여 상기 동정된 펩타이드를 분석하는 단계를 포함하는 방법.
23. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드, 제 15 항에 따른 항체, 또는 서열번호 40 내지 48 및 서열번호 123 내지 141로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 선택적으로 포함하는 약학적 조성물.
24. 제 15 항에 따른 항체를 포함하는 진단용 조성물.
25. 미란성 및/또는 비미란성 RA에 대한 표지자인 제 1 항에 따른 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드의 용도.
26. 비미란성 RA에 대한 표지자인 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드의 용도.
27. 미란성 RA에 대한 표지자인 제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 MHC 클래스 II 항원성 펩타이드의 용도.
28. RA, 바람직하게는 미란성 및/또는 비미란성 RA에 대한 표지자로서 서열번호 40 내지 48 및 서열번호 123 내지 141로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드의 용도.
29. 특히 실시예를 참조로 하여 실질적으로 본원에 기술된 항원성 펩타이드, 항체, 핵산, 숙주 세포, 방법, 조성물 및 용도.

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