KR20060011287A - 성장호르몬 유전자를 이용한 한우 육질 관련 유전적표지인자 - Google Patents

성장호르몬 유전자를 이용한 한우 육질 관련 유전적표지인자 Download PDF

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KR20060011287A
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조용민
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Abstract

본 발명은 성장호르몬 유전자를 이용한 한우 육질 관련 유전적 표지인자에 관한 것으로, 도체형질에 유의적인 성장호르몬 유전자의 변이부위를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 이를 이용한 PCR 증폭조건, 증폭산물을 제한효소 Msp I으로 절단하여 전기영동을 실시하고, 사진 및 이미지를 확보하여 유전자형을 결정하는 단계로 구성된다.
본 발명에서는 가축의 출생 후 모든 대사 작용에 영향을 미치는 성장호르몬(GH) 유전자에서 새로운 유전자 구조변이, 즉 단일염기다형성(SNP)를 발굴하고, 이러한 유전자 구조변이로 인하여 성장호르몬 단백질을 구성하는 아미노산중 아르기닌이 트립토판으로 변경됨을 확인하였으며, 유전자의 변이 및 아미노산의 변경이 한우의 표현 형질중 등지방두께에 유의적인 영향을 끼치고 있음을 통계분석에 의하여 밝혀냄으로써, 한우 개량을 위한 육종가 평가 및 개체의 선별시 활용이 가능하다.
성장호르몬, 유전자, 한우, 육질, 표지인자, PCR-RFLP

Description

성장호르몬 유전자를 이용한 한우 육질 관련 유전적 표지인자{Genetic Marker of Bovine Growth Hormone Gene for the Meat Quality in Hanwoo}
도1은 소 성장호르몬 유전자의 엑손 5번에서의 단일염기 다형과 그로 인한 아미노산 아르기닌이 다른 아미노산인 트립토판으로의 변경을 나타낸 도면
도2는 본 발명에서 증폭된 PCR 산물들의 제한효소 단편 다형성을 나타내는 사진
도3은 본 발명에서 검출된 제한효소 단편 다형성의 유전자형의 멘델식 유전양상을 나타내는 사진
본 발명은 성장호르몬 유전자를 이용한 한우 육질 관련 유전적 표지인자에 관한 것으로, 도체형질에 유의적인 성장호르몬 유전자의 변이부위를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 이를 이용한 PCR 증폭조건, 증폭산물을 제한효소 Msp I으로 절단하여 전기영동을 실시하고, 사진 및 이미지를 확보하여 유전자형을 결정하는 단계 로 구성된다.
본 발명에서는 가축의 출생 후 모든 대사 작용에 영향을 미치는 성장호르몬(GH) 유전자에서 새로운 유전자 구조변이, 즉 단일염기다형성(SNP)를 발굴하고, 이러한 유전자 구조변이로 인하여 성장호르몬 단백질을 구성하는 아미노산중 아르기닌이 트립토판으로 변경됨을 확인하였으며, 유전자의 변이 및 아미노산의 변경이 한우의 표현 형질중 등지방두께에 유의적인 영향을 끼치고 있음을 통계분석에 의하여 밝혀냄으로써, 한우 개량을 위한 육종가 평가 및 개체의 선별시 활용이 가능하다.
성장호르몬은 동물의 출생 후 성장에 관여하고, 단백질의 동화, 지질의 대사, 당 대사 및 각종 전해질의 대사에 작용하며, 또한 유선 발달 및 비유에도 깊이 관여함으로서 동물에 있어서는 가장 중요한 효소 중 하나이다. 재조합 DNA기술에 의한 소 성장호르몬단백질을 생산하여, 어린 송아지 시기, 비유기의 어미소 등에 주사 및 사료 첨가제 등의 형태로 가축 개체에 투여하여 빠른 성장 및 체중 증가, 비유량 증가 등의 목적으로 여러 국가의 회사에서 특허화된 제품을 생산하여 시판하고 있는 실정이다. 그러나 재조합 성장호르몬 사용에 의한 축산식품의 안전성 및 인체 유해 가능성 등에 대해 유럽 및 미국의 견해가 첨예하게 대립하고 있으며, 소비자 또한 이들 제품으로 생산된 축산물에 대해 인식이 매우 저조한 실정이다. 그러나 가축 개체의 생산능력 차이를 유전자 자체에서 찾아내어 활용하게 되면 인위적으로 조작된 재조합 DNA나 재조합 단백질에 기인하지 않으므로 인체 유해 가능성, 축산식품의 안전성 등에 이론이 없을 것이다. 이에 Chikuni 등 및 Zhang 등은 소 성장 호르몬 유전자의 127번째 아미노산의 코돈중 첫번째 DNA염기가 cytosine(C)에서 guanine(G)으로 치환(substitution)되어 Leucine (CTG)에서 Valine (GTG)로 대체된다고 각기 보고하였으며, 이 유전자좌위(locus)에 대해 젖소(dairy cattle)의 유생산량, 유단백질, 유지량 및 육우의 육종가 등의 경제형질에 관련되어지는 유전적 표지인자(genetic marker)로서의 가능성을 보고하였다.
미국특허 제5,374,523호에는 소 성장호르몬 유전자의 다형성을 이용한 젖소 산유량 관련 유전적 표지인자가 개시되어 있는데, 소 성장호르몬을 코딩하는 127번째 아미노산이 루이신에서 발린으로 변경되어지는 부위의 다형성을 특허화하고 있다.
상기 아미노산은 비극성(nonpolar, aliphatic group) 그룹에 속하는 것이지만, 이 유전적 표지인자를 한우 등에 적용하여 보았을 때, 도체형질들과 유의적인 결과를 얻지 못하였다.
따라서, 본 발명에서는 한우의 도체형질을 지배하는 유전적 자질을 예측하고 판정하는 유전적 표지인자를 개발하여 조기 선발 및 개체 평가의 정확성을 기하여 한우 개량 등에 제공하고자, 한우의 경제형질(성장율, 육량, 육질 등)에 관련된 유전적 표지인자를 발굴하고 한우 개체들의 정확한 유전적 자질을 판단하는 것을 목적으로 한다.
이하, 본 발명의 구성에 대해 설명한다.
본 발명은 도체형질에 유의적인 성장호르몬 유전자의 변이부위를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 이를 이용한 PCR 증폭조건, 증폭산물을 제한효소 Msp I으로 절단하여 전기영동을 실시하고, 사진 및 이미지를 확보하여 유전자형을 결정하는 단계로 구성된다.
본 발명에서는, 한우의 성장호르몬 유전자에서 새로운 단일염기다형현상(SNP; Single Nucleotide Polymorphism)을 발굴하기 위하여, Gordon 등(1983)이 발표한 bovine Growth Hormone(bGH) gene의 염기서열(GenBank Accession No. M57764)을 근거로 올리고 프라이머 분석 소프트웨어(OLIGO Primer Analysis Software Version 5.0, 미국 National Biosciences, Inc.)을 이용하여 여러 쌍의 PCR 프라이머를 고안 제작하였고, 부모가 각기 다른 한우 16두에서 PCR 증폭산물을 각각 확보하여, DNA 염기서열들을 결정하였다. 그중에서 여러 SNP를 발굴하였으며, 특히 본 발명에서의 SNP는 exon 5번내에 존재하며, 도1에서와 같이 166번째 코돈(codon)을 구성하는 DNA중 C가 T로의 변이로 인한 아미노산의 변경(아르기닌이 트립토판으로)을 초래하는 것이었으며, 이 SNP는 특정제한효소에 의해 절단이 가능하여 PCR-RFLP 방법으로 한우 개체별 유전자형을 결정하였고, 결정된 성장호르몬 유전자형과 도체형질과의 관련성을 분석하여 유의적인 유전적 표지인자를 개발한 것이다.
즉, 소 성장호르몬 유전자의 166번째 아미노산을 암호하는 코돈인 CGG가 TGG로 치환된 것을 인식 가능하도록 하는 DNA표지인자 판별 방법이 특징으로. 여기에 는 Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis, heteroduplex analysis, single strand conformational polymorphism (SSCP), denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), temperature gradient gel electrophoresis (TGGE)가 해당된다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다.
[실시예 1]
Gordon 등(1983)이 발표한 한우성장호르몬(bGH) 유전자의 염기서열(GenBank Accession No. M57764)을 근거로 하기 표 1에서와 같이 프라이머 한 쌍을 고안 합성하여 사용하였다.
소 성장호르몬 유전자의 프라이머 염기서열
Primer Name primer sequence
Forward primer 5'-GGG CAG ATC CTC AAG CAG A-3'(서열목록1)
Reverse primer 5'-CTG AGC TAT GAG TGT CCT ATG AGT-3'(서열목록2)
Genomic DNA의 분리 추출은 샘브로크 (J. Sambrook) 등의 문헌 (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989)의 제9.16∼9.19항에 기재된 방법을 근거로 하여 한우 109두의 혈액으로부터 수행하였다. PCR 반응을 위해 5 ㎕의 PCR reaction buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.3; 500 mM KCl; 15 mM MgCl2), 4 ㎕의 2.5 mM of each dNTPs, 1 ㎕의 10 pmole of each primer, ∼100 ng의 genomic DNA, 0.5 U의 Taq DNA polymerase (Promega, USA)를 넣고 최종 부피가 50 ㎕되게 조정하였다. PCR 수행은 PTC-200 (MJ Research, Inc.)의 peltier thermal cycler를 이용하여, 94℃에서 5분, 60℃에서 1분, 72℃에서 2분으로 1회 실시한 후, 94℃ 1분, 62℃ 1분, 72℃ 2분간씩 총 30회를 실시하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 더 반응시켰다. PCR이 끝난 후 5㎕의 PCR 증폭산물을 1%의 agarose gel을 이용하여 증폭여부를 확인하였다.
한우 개체별 유전자형 결정은 PCR-RFLP 방법을 이용하였는데, 개체별 PCR 증폭산물에서 10 ㎕씩을 각각 취하여 제한효소 Msp I (Promega)으로 37℃에서 증폭산물을 완전히 절단반응시켰다. 절단된 DNA단편을 확인하기 위해 5% polyacrylamide gel 또는 2.5% agarose gel을 이용하여 전기영동을 실시하였고, EtBr 염색법으로 DNA밴드를 검출하여 각 개체의 유전자형을 판정하였다.
[서열목록 3]
2165 gggcag atcctcaagc aga cctatga caaatttgac acaaacatgc gcagtgacga
Forward primer (서열목록1)
2221 cgcgctgctc aagaactacg gtctgctctc ctgcttc c/t gg aaggacctgc ataagacgga
2281 gacgtacctg agggtcatga agtgccgccg cttcggggag gccagctgtg ccttctagtt
2341 gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc
2401 ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt
2461 ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca
2521 ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg gtacccaggt gctgaagaat tgacccggtt
2581 cctcctgggc cagaaagaag caggcacatc cccttctctg tgacacaccc tgtccacgcc
2641 cctggttctt agttccagcc cc actcatag gacactcata gctcag 2686
Reverse primer (서열목록 2)
서열의 특징 :
GenBank Accession Number ; M57764
Locus ; BOVGHGH
명칭 ; 한우 성장호르몬 유전자의 엑손 5(Exon 5 of the bovine growth hormone gene)
존재위치 ; 2165..2686(상기 M57764의 DNA염기서열 기준)
명칭 ; 변이부분(SNP)
존재위치 ; 2258(치환 c →t)
한우 개체별 유전자형의 판정은 제한효소 Msp I에 의한 절단되는 유전자형은 AA형으로 도2에서의 lane 1, 3, 및 4에서처럼 318, 111 및 93 bp 크기의 단편들로 분리되고, Msp I에 의해 절단되지 않는 유전자형은 BB형으로 도2의 lane 7에서와 같이 411 및 111 bp의 단편들로 분리된다. 그리고 이들의 헤테로형인 AB형은 도2의 lane 2, 5 및 6에서 보는 바와 같이, AA형 및 BB형의 절단단편인 411, 318, 111 및 93 bp가 모두 검출된다. 그리고 이들 유전자형이 부모로부터 자식으로 유전되는 양식을 따르는지를 확인하기 위하여 전형매 2가계 및 반형매 8가계를 이용하여 유전 양상을 조사해 본 결과 멘델식의 유전 법칙에서 벗어나지 않음을 확인하였다(도3)
한우의 유전자형 분석은 혈통기록 및 표현형질 기록을 보유한 109두를 이용하여 통계처리하였다. 모델식은 아래에 제시된 것과 같이 SAS General Linear Models Procedure에 의한 최소자승법 (Least Squares Method)으로 분석을 실시하였다.
Yijkl = μ+ Sirei + Fedj + Gk + b1MON+ eijkl
여기서 Yijkl : 관찰치(observed value), μ: 전체평균, Sirei : 종모우 효과 (fixed effect로 고려), Fedj : 사료급여효과(j=제한, 자유) Gk : 유전자형 효과(k=AA, AB, BB), b1 : 종료월령에 대한 회귀계수, MON : 종료월령의 공변이, eijkl : 임의오차(random error)
한우 성장호르몬유전자형에 따른 도체형질별 최소자승평균과 표준편차를 하기 표2에 나타낸다.
유전자형 도체 형질
등지방 두께 근내 지방도 도체중 육량
AA 0.87±0.05b 3.49±0.19 348.17±6,06 2.17±0.06
AB 1.18±0.09a 3.96±0.33 352.14±10.41 2.25±0.11
BB 1.21±0.09a 4.01±0.36 361.71±9.87 2.31±0.09
a, b : 다른 표기사이에는 유의적인 차이가 인정됨(p<0.05).
상기 표2에서 알 수 있는 바와 같이, 등지방두께, 근내지방도, 도체중 및 육량에서 모두 AA형에서 BB형으로 갈수록 평균치가 높게 분석되어 졌고, 그 중에서 등지방두께에서 이 유전자형은 유의적인 결과를 나타내었다 (p<0.05). 그러므로 한우에 있어서 육질 개량과 우수 송아지 및 종축의 선발을 위해서 이 유전자형을 유전적 표지인자로 사용 가능함을 보여 준다.
상기와 같이, 본 발명에 따르면, 가축의 출생 후 모든 대사 작용에 영향을 미치는 성장호르몬(GH) 유전자에서 새로운 유전자 구조변이, 즉 단일염기다형성(SNP)를 발굴하고, 이러한 유전자 구조변이로 인하여 성장호르몬 단백질을 구성하는 아미노산중 아르기닌이 트립토판으로 변경됨을 확인하여, 유전자의 변이 및 아미노산의 변경이 한우의 표현 형질중 등지방두께에 유의적인 영향을 끼치고 있음을 통계분석에 의하여 밝혀냄으로써, 한우 개량을 위한 육종가 평가 및 개체의 선별시 활용이 가능하여, 관련 분야에의 이용 및 응용이 기대된다 하겠다.
<110> Rural Development Administration <120> Genetic Marker of Bovine Growth Hormone Gene for the Meat Quality in Hanwoo <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 gggcagatcc tcaagcaga 19 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 actcatagga cactcatagc tcag 24 <210> 3 <211> 479 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon 5 of the bovine growth hormone gene <400> 3 cctatgacaa atttgacaca aacatgcgca gtgacgacgc gctgctcaag aactacggtc 60 tgctctcctg cttctggaag gacctgcata agacggagac gtacctgagg gtcatgaagt 120 gccgccgctt cggggaggcc agctgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc 180 tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat 240 gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg 300 caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc 360 tctatgggta cccaggtgct gaagaattga cccggttcct cctgggccag aaagaagcag 420 gcacatcccc ttctctgtga cacaccctgt ccacgcccct ggttcttagt tccagcccc 479

Claims (2)

  1. 도체형질에 유의적인 성장호르몬 유전자의 변이부위를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 이를 이용한 PCR 증폭조건, 증폭산물을 제한효소 Msp I으로 절단하여 전기영동을 실시하고, 사진 및 이미지를 확보하여 유전자형을 결정하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 성장호르몬 유전자를 이용한 한우 육질 관련 유전적 표지인자
  2. 제1항에 있어서,
    소 성장호르몬 유전자의 166번째 아미노산을 암호하는 코돈인 CGG가 TGG로 치환된 것을 인식 가능하도록 하는 것을 특징으로 하는 성장호르몬 유전자를 이용한 한우 육질 관련 유전적 표지인자
KR1020040060041A 2004-07-30 2004-07-30 성장호르몬 유전자를 이용한 한우 육질 관련 유전적표지인자 KR20060011287A (ko)

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