KR20060006562A

KR20060006562A - 항암제의 전달체용 수용성 키토산 나노입자 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20060006562A
Application number: KR1020040055649A
Authority: KR
Inventors: 나재운; 정특래; 장미경; 정영일
Original assignee: 나재운; 정특래; 장미경
Priority date: 2004-07-16
Filing date: 2004-07-16
Publication date: 2006-01-19
Also published as: US7883723B2; KR100578382B1; US20060013885A1

Abstract

본 발명은 항암제의 전달체용 수용성 키토산 나노입자(water soluble chitosan nanoparticle; WSC-NP) 및 그 제조방법에 관한 것으로, 항암물질 전달체의 기본 구성물로 수용성 키토산을 사용하여, 수용성 키토산 그 자체의 아민기가 가지는 강한 양전하(+)로 인해 음전하(-)를 띤 DNA와 복합체를 형성함으로써 유전자 전달체(gene carrier)로서도 매우 우수하고, 또한 반응성이 높은 유리 아민기의 위치에 다른 기능성기(functional group)를 도입함으로써 목적하는 부위를 표적할 수 있는 기능을 부여함으로써 항암제의 효율적인 약물 전달체용 수용성 키토산 나노입자 및 그 제조방법을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따른 항암제의 전달체용 수용성 키토산 나노입자는 수용성 키토산의 반응성이 높은 유리 아민기의 위치에 친수성 및 소수성기를 각각 도입함으로써 항암제인 파클리탁셀를 용이하게 봉입할 수 있고, 이렇게 제조된 수용성 키토산 나노파클리탁셀은 동결건조 후 증류수에서의 재분산 능력이 매우 뛰어나고, 기존의 다른 항암제 전달체에 비해 종양 세포에 더 많이 축적될 수 있어 탁월한 항암효과를 나타낸다.

수용성 키토산, 나노입자, 항암제, 파클리탁셀.

Description

항암제의 전달체용 수용성 키토산 나노입자 및 그 제조방법{Water soluble chitosan nanoparticle for delivering a anticance agent and preparing method thereof}

도 1은 수용성 키토산의 MTT 시험 결과를 나타내는 그래프이고,

도 2는 수용성 키토산과 MEPG가 컨주게이트된 수용성 키토산의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 3은 친수성기로서 MPEG와 소수성기로서 콜레스테롤이 개질된 수용성 키토산의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 4 및 도 5는 TEM 및 AFM에 의해 본 발명에 따른 수용성 키토산 나노입자의 표면 형태를 각각 나타낸 것이고,

도 6은 파클리탁셀을 봉입하기 전(도 6(a))과 봉입한 후 (도 6(b))의 열분석 결과를 나타낸 것이고,

도 7은 HPLC에 의해 수용성 키토산 나노파클리탁셀에 봉입된 파클리탁셀과 표준 파클리탁셀의 정량분석 그래프이고,

도 8은 각 약물처리에 따른 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이고,

도 9는 마우스에 약물투여 후의 종양 성장을 나타내는 그래프이고,

도 10은 종양을 이식한 후 약물의 투여에 따른 마우스의 체중변화를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 항암제의 전달체용 수용성 키토산 나노입자(water soluble chitosan nanoparticle; WSC-NP) 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 항암물질 전달체의 기본 구성물로 수용성 키토산을 사용하여, 수용성 키토산 그 자체의 아민기가 가지는 강한 양전하(+)로 인해 음전하(-)를 띤 DNA와 복합체를 형성함으로써 유전자 전달체(gene carrier)로서도 매우 우수하고, 또한 반응성이 높은 유리 아민기의 위치에 다른 기능성기(functional group)를 도입함으로써 목적하는 부위를 표적할 수 있는 기능을 부여함으로써 항암제의 효율적인 약물 전달체용 수용성 키토산 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.

키토산은 글루코오스아민(glucosamine)의 피라노스(pyranose)단위체가 β-1,4 결합된 것으로서, 글루코오스아민 잔기가 5,000 개 이상 결합된 분자량이 100 만 이상이고 다가의 양이온을 가진 다당류(polysaccharide) 계열의 생체고분자물질로 게 껍질이나 새우와 같은 갑각류 및 오징어를 포함하는 수산계로부터 추출할 수 있으며, 그 분자 구조로 볼 때 다당류의 일종인 셀룰로오즈와 유사한 구조로서, 생 체 친화성이 우수하여 면역 반응시 거부 반응이 일어나지 않기 때문에 의약 산업에 응용되고 있고, 최근 미국의 FDA에서 식품으로서 인증을 받은 후, 키토산은 21세기의 중요한 생물산업 및 생체의료용 물질로 응용되고 있다.

특히, 20,000 ∼ 100,000 이내의 특정 분자량의 범위를 가진 키토산은 강한 생리활성 기능을 띠고 있는 것으로 알려져 있기 때문에 건강 식품분야, 식ㆍ음료 분야, 화장품 분야, 보건위생 분야 및 의약품 분야에 대한 응용성을 기대할 수 있다.

그러나, 상술한 특장점을 갖는 키토산은 서로 이웃하는 분자간의 강한 수소결합으로 견고하게 결합되어 물에 녹지 않는 불용성 물질로서, 종래 이러한 키토산을 녹이기 위하여 젖산, 초산, 프로피온산, 포름산, 아스코르브산, 및 주석산을 포함하는 유기산 및 염산, 질산 및 황산으로 구성되는 무기산을 사용함으로 생체에 응용하는 데 제한을 주고 있다는 문제점을 가지고 있었는데, 본 발명자 등은 상기한 문제점을 획기적으로 해결한 수용성 키토산을 개발하여 한국특허출원제2001-0059282호 및 2001-0070052호로 출원하였다.

즉, 본 발명자 등이 출원한 상기 특허출원은 "1) 키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기인 트리알킬 아민으로 처리하고, 2) 상기 용액에 유기용매를 첨가하여 키토산 올리고당에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산이 트리알킬 아민 염의 형태로 제거된 키토산 올리고당을 회수하고, 3) 상기에서 산이 제거된 키토산 올리고당 용액을 무기산 처리 후, 활성화된 탄소/이온교환수지(activated carbon/ion exchange resin) 컬럼으로 정제하여 1,000 ∼100,000 달톤의 분자량을 가진 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 제조하는 방법"을 개시하고 있다.

한편, 1992년에 미국의 FDA에 승인을 받은 파클리탁셀(paclitaxel)은 기존의 항암제에 비해 항암 활성이 매우 우수하다는 장점을 가지고 있지만 소수성 (hydrophobicity)이 높기 때문에 물에 전혀 분산이 되지 않아 주사제용으로 사용하기 위해 크레모포어(cremophore) EL(폴리에톡시화 오일)(polyethoxylated oil)과 에탄올의 50:50 혼합물에 분산하기 때문에 인체내 심각한 부작용을 초래하였다.

이와 같이, 중요한 항암활성을 갖는 천연물질로 공지된 파클리탁셀이 물에 대한 용해도가 낮다는 문제점으로 인해, 이를 주사제로 하여 투여하는데 어려움이 있었으며, 따라서 이를 해결하여 주사 가능하게 만들기 위한 다양한 시스템이 제안되었는데, 예를 들어 생분해성이며 파클리탁셀에 대해 상당한 결합력을 갖는 사람 혈청 알부민(HSA)과 파클리탁셀을 배합하여 공지된 방법으로 초음파처리, 고압 균질화 및 미세유동화(microfluidization) 처리하여 주사가능한 에멀젼을 형성하는 방법이 제안되었다.

미국특허 제5,439,686호, 제5,498,421호, 제5,560,933호 및 WO 94/18954에서 비복스 파마슈티칼스사(VivoRx Pharmaceuticals, Inc.)는 10㎛미만의 평균 입자 크기(MPS)를 제공하는 초음파처리 기술을 사용하여 제조한 파클리탁셀 및 사람 혈청 알부민의 미립자로된 주사가능한 제제를 개시하고 있다. 그러나, 상기 특허들에 기술된 제조방법은 산업적 규모에서는 사용할 수 없으며, 게다가 이렇게 수득된 미립 자는 너무 큰 평균 입자 크기를 가져 환자에게 투여하기에 부적합하고 유용하지 않다는 단점이 있다.

따라서, 미국특허 제5,916,596, 제6,096,331호 및 WO 98/14174, WO 99/00113에서는 멸균 0.9% NaCl 수용액으로 평균 입자 크기가 0.2㎛미만인 동결건조된 분말을 재구성함으로써 수득된 파클리탁셀 및 사람 혈청 알부민의 멸균 나노에멀젼을 개시하고 있다. 상기 특허에 기술되어 있는 바와 같이, 고압 균질화를 사용하여 수득된 나노에멀젼은 평균 입자 크기가 시간에 따라 일정하고 나노입자 침전물이 생성되지 않아 안정성을 가진다고 기술하고 있다. 그러나 상기한 방법은 여전히 사람 혈청 알부민에 파클리탁셀을 현탁하여 주사가능한 제제를 제조함으로 여전히 산업적 규모에서는 사용할 수 없다는 단점이 있다.

따라서, 본 발명자 등은 상술한 바와 같이 생체 친화성이 우수하여 면역 반응시 거부 반응을 일으키지 않아 의약 산업에 유용하게 응용될 수 있는 키토산을 항암제인 파클리탁셀의 전달체로 이용할 수 있는 방법에 대해 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 상기 종래의 문제점을 해결하기 위하여 유리 아민기를 가지고 있으면서도 물에 대한 용해도가 높은 수용성 키토산을 항암제인 파클리탁셀의 전달체로 이용할 수 있는 수용성 키토산 나노입자 및 그 제조방법을 제공하기 위한 것이 다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명은 항암물질 전달체의 기본 구성물로 수용성 키토산을 사용하여, 수용성 키토산 그 자체의 아민기가 가지는 강한 양전하(+)로 인해 음전하(-)를 띤 DNA와 복합체를 형성함으로써 유전자 전달체(gene carrier)로서도 매우 우수하고, 또한 반응성이 높은 유리 아민기의 위치에 다른 기능성기(functional group)를 도입함으로써 목적하는 부위를 표적할 수 있는 기능을 부여함으로써 항암제의 효율적인 약물 전달체용 수용성 키토산 나노입자 및 그 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.

본 발명은 수용성 키토산(Water soluble chitosan; WSC)의 사슬에 소수성기로서 콜레스테롤(cholesterol)과 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜){Methoxy poly(ethylene glycol); MPEG}를 도입하여 구성된 항암제의 전달체용 수용성 키토산 나노입자(water soluble chitosan nanoparticle; WSC-NP)를 제공한다.

상기 본 발명의 구성에 따라 도입된 콜레스테롤은 운반하고자 하는 소수성 약물인 파클리탁셀(paclitaxel)을 봉입하고, MPEG은 상기 콜레스테롤의 용해성을 증가시키고 혈액내 장시간 순환과 망피세포계(Reticuloendothelial system, RES)와 대식세포(macrophagy) 등의 공격으로부터 나노입자를 보호하는 작용을 한다.

또한 본 발명은 ;

1) 수용성 키토산에 MPEG를 부가하여 아마이드(amide)결합을 형성하고 부생성물인 p-니트로 페닐 기를 제거하는 단계; 및

2) 상기 단계의 반응액에 콜레스테롤을 부가하여 수용성 키토산의 유리 아민기와 콜레스테릴 클로로포름에이트(cholesteryl chloroformate)와의 또 다른 아마이드 결합을 형성시키는 단계로 구성되는 소수성 핵(hydrophobic core)을 가진 항암제의 전달체용 수용성 키토산 나노입자의 제조방법을 제공한다.

상기 1)단계에서 생성된 부생성물인 p-니트로 페닐 기는 얼음물(ice water)로 투석하면서 제거한 후, 남아있는 부생성물은 무수 에탄올로 정제함으로써 완전히 제거할 수 있다.

본 발명에 따라 유리 아민을 가진 수용성 키토산을 이용하여 효율적인 항암 치료를 효과를 갖는 수용성 키토산 나노파클리탁셀의 제조는 먼저 수용성 키토산의 유리 아민기에 친수성기로서 MPEG와 소수성기로서 콜레스테롤을 결합함으로써 제조한 수용성 키토산 나노입자에 파클리탁셀을 효율적으로 봉입하여 물에 대한 재분산성이 높은 수용성 키토산 나노파클리탁셀을 제조할 수 있다.

보다 상세히 설명하면, 상기 수용성 키토산 나노파클리탁셀의 제조는 다음과 같다. 1단계에서는 수용성 키토산에 MPEG를 부가하여 아마이드(amide)결합을 형성하고, 부생성물인 p-니트로 페닐 기를 얼음물로 약 48시간 동안 투석하면서 제거하 고, 남아있는 부생성물은 무수 에탄올로 정제함으로써 완전히 제거한다. 다음 2단계에서는 상기 반응액에 콜레스테롤을 부가하여 수용성 키토산의 유리 아미기와 콜레스테롤과 아마이드 결합을 형성하면서 소수성 핵(hydrophobic core)을 가진 수용성 키토산 나노입자를 제조한다[화학식 1 참고]. 다음으로, 상기 반응액에 항암제를 부가하여 항암제가 상기 수용성 키토산 나노입자의 소수성기인 콜레스테롤에 봉입되게 하여 수용성 키토산 나노파클리탁셀을 제조할 수 있다.

본 발명의 항암제의 전달체로 사용된 WSC는 반응성이 높은 유리 아민기를 가지고 있기 때문에 항암제를 봉입하여 전달체로 사용되기에 적당하다.

또한, 본 발명에 따른 수용성 키토산 나노입자의 제조과정은 PBS(pH 7.0 ~ 8.0) 용액내에서 온화한 조건으로 이루어지므로 인체에 해로운 유기용매를 사용한 제조 방법에 비해 훨씬 안전하며 또한 간단한 제조공정으로 제조할 수 있다는 장점을 가지고 있다.

공지된 바와 같이 저분자량의 약물에 비해 고분자 약물(polymeric drug)은 EPR(enhanced permeability and retention effect)에 의해 정상세포에서 보다 종양 세포에 더 많이 축적될 수 있듯이 본 발명에 따라 수용성 키토산을 이용하여 제조한 수용성 키토산 나노 입자 또한 기존의 다른 항암제 전달체에 비해 종양 세포에 더 많이 축적됨으로 탁월한 항암효과를 나타내며, 또한 암 세포는 주위의 정상세포에 비해 약간 산성을 띠고 있으므로 pKa가 6.5정도 되는 수용성 키토산은 약간 산성에서 더 안정화된다는 특성을 가지고 있으므로 정상세포에 비해 표적성을 부여할 수 있으므로 암 세포에 나노입자가 더 축적될 수 있다는 이점을 가진다.

또한, 본 발명에 따라 파클리탁셀이 합입된 수용성 키토산 나노파클리탁셀(WSC-NPT)은 천연고분자물질인 수용성 키토산을 중심으로 한 고분자의 여러 가지 장점으로 인해 동결건조 후 증류수에서의 재분산 능력이 매우 뛰어나다는 특징을 가진다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 자세히 설명하지만, 본 발명 이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

수용성 키토산 나노입자의 제조

분자량과 탈아세틸화도가 각각 18K 달톤(dalton)과 87%인 수용성 키토산을 키토라이프사(KITTOLIFE Co. Ltd.)로부터 공급받아서 사용하였으며, 친수성기로서 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) (MPEG)은 시그마사(Sigma Co.)에서 구입하여 사용하였다. 소수성기로서 콜레스테릴 클로로포름에이트와 투석 튜브(dialysis tube) (MWCO 12,000)는 알드릭사(Aldrich Co.)와 스펙트럼사(Spectrum Co.)로부터 각각 구입하여 사용하였다. 그 외 시약은 특급시약을 정제없이 사용하였다.

수용성 키토산 나노입자의 제조는 다음과 같이 2단계로 진행하였다. 1단계에서는 상기 수용성 키토산 0.1g을 15ml의 PBS(pH 7.0 ~ 8.0)에 녹인 후 약1시간 동안 교반한 다음, 상기 MPEG 0.5g을 10ml의 PBS(pH 8.0)에 녹인 용액을 상기 수용성 키토산 반응용액에 천천히 떨어뜨리면서 교반한다. 2시간 후 반응물은 MWCO 12000으로 48시간동안 얼음물로 투석하여 맑은 상층액의 생성물과 침전층의 부생성물을 형성시키고 이것은 분리하여 맑은 상층액은 동결건조하였다.

상기 1단계에서 동결건조한 흰색의 생성물을 PBS(pH 7.0 ~ 8.0) 15ml에 녹인 후 1시간정도 교반한다. 그리고 상기 콜레스테릴 클로로포름에이트를 키토산의 글루코즈 아민 단위체 10개당 1.0개의 비에 따라 DMF(anhydrous) 1 ~ 2ml에 녹인 후 이 용액을 상기 용액에 천천히 떨어뜨리면서 약 2시간 정도 교반한다. 반응 종료후 증류수에 대해 24시간 정도 투석한 다음 10000rpm에서 10분정도 원심분리한 후 0.45 ㎛의 실린지 필터(syringe filter)로 여과한 후 동결건조함으로써 백색의 최종생성물인 수용성 키토산 나노입자를 얻었다.

<실시예 2>

콜레스테릴 클로로포름에이트를 키토산의 글루코즈 아민 단위체 10개당 1.5개의 비로 하는 외에 상기 실시예 1과 동일하게 하여 수용성 키토산 나노입자를 얻었다.

<실시예 3>

콜레스테릴 클로로포름에이트를 키토산의 글루코즈 아민 단위체 10개당 1.8개의 비로 하는 외에 상기 실시예 1과 동일하게 하여 수용성 키토산 나노입자를 얻었다.

<실시예 4>

수용성 키토산 나노파클리탁셀의 제조

상기 실시예 1에 따라 제조된 수용성 키토산 나노입자 25 mg을 PBS(pH 7.4) 10 ml에 분산한 뒤 40℃에서 30분간 교반한다. 파클리탁셀 4mg을 에탄올 2ml에 녹인 후 위의 용액에 워터 타입(water type)의 초음파처리기에서 초음파처리하면서 서서히 떨어뜨린다. 이 용액을 바 타입(bar type)의 초음파처리기를 이용하여 2초간 10번 정도 초음파처리한다. 그리고 PBS(pH 7.4)에서 하룻밤정도 투석한 후 다음 날 증류수에 대해 12시간 정도 투석한 다음 원심분리한 후 0.45 ㎛의 실린지 필터로 여과한 후 동결건조하여 파클리탁셀을 함유한 수용성 키토산 나노파클리탁셀을 제조하였다.

<실시예 5>

수용성 키토산 나노파클리탁셀의 제조

수용성 키토산 나노입자를 상기 실시예 2에 따라 제조된 것을 사용하는 외에는 실시예 4와 동일하게 하여 수용성 키토산 나노파클리탁셀의 제조하였다.

<실시예 6>

수용성 키토산 나노파클리탁셀의 제조

수용성 키토산 나노입자를 상기 실시예 3에 따라 제조된 것을 사용하는 외에는 실시예 4와 동일하게 하여 수용성 키토산 나노파클리탁셀의 제조하였다.

<실험예 1>

MTT 분석

본 발명에서 사용된 수용성 키토산의 독성을 평가하기 위하여 MTT 분석을 수행하였다. 293T 셀(cell)이 96 웰(well)에 한 웰 당 5×104개로 심은 다음 24시간동안 배양하였다.

중량 평균 분자량(Mw) 10,000, 20,000 및 50,000을 갖는 수용성 키토산을 0.1 ~ 100μg/ml의 농도로 각 웰에 첨가하고 37℃에서 4시간동안 배양하였다. 3mg/ml의 농도로 제조된 MTT 50μl을 첨가한 후 다시 37℃에서 4시간동안 배양하였다. 상등액은 모두 제거하고 DMSO 100μl씩을 96웰에 넣고 10분간 방치한 후 마이크로플레이트 판독기(microplate reader; VERSA MAX)로 측정하였다. 세포의 생존가능성(cell viability)은 다음의 식(1)에 의해 계산하였다.

세포의 생존가능성(%)=(OD570(샘플)/OD570(대조군)) ×100 --- 식 (1)

여기서 OD570(샘플)은 수용성 키토산을 처리한 웰로부터 측정한 OD 값을 의미하여 OD570(대조군)은 단지 PBS 완충액으로만 처리한 웰로부터 측정한 OD값을 의미한다. 실험결과를 도 1에 나타냈으며, 도 1에서 알 수 있는 바와 같이 중량 평균 분자량 10,000 내지 50,000 범위의 수용성 키토산이 전혀 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있다.

<실험예 2>

수용성 키토산 나노입자의 FT-IR 및 ¹H-NMR 스펙트럼 측정

상기 실시예 1에 따라 제조된 수용성 키토산 나노입자가 친수성기와 소수성기로 개질됨을 확인하기 위하여 FT-IR(Shimadzu, FT-IR 8700)과 ¹H-NMR spectrometer(Bruker, DRX-500MHz)을 이용하여 측정하였다. ¹H-NMR 스펙트럼을 얻기위하여, 상기 실시예 1에 따라 제조된 수용성 키토산 나노입자를 10mg/ml의 농도로 CDCl₃에 용해하여 298K에서 실험을 수행하였다. 또한, 소수성 중심핵을 가진 나노입자임을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에 따라 제조된 수용성 키토산 나노입자를 D₂O에 용해하여 ¹H-NMR 스펙트럼을 얻은 후 상기 CDCl₃에 용해하여 측정한 스펙트럼과 비교하여 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타냈다.

도 2(a)는 수용성 키토산의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것으로, 글루코즈 아민 단위체의 아민기(amine group)와 아마이드기(amide group)의 특성 피크가 1539cm^-1 와 1635cm^-1에서 각각 현저하게 분리되어 나타남을 알 수 있었다. 수용성 키토산의 사슬에 MPEG를 도입한 결과 그림 2(b)에 나타난 것처럼 MPEG의 지방족-CH에 의한 특성 피크를 2880cm^-1 부근에서 확인하였고, 또한 수용성 키토산의 유리 아민기와 MPEG의 카르보닐기가 아마이드 결합을 형성함으로 인해 수용성 키토산의 특성 피크인 1539cm^-1 부근에서의 아민 피크가 줄어들었으며, 또한 수용성 키토산과 MPEG와의 새로운 아마이드 결합이 형성됨으로써 아민기에 비해 상대적으로 아마이드의 특성 피크의 강도(intensity)가 증가되었음을 확인함으로서 수용성 키토산에 MPEG가 컨주게이트 되었음을 확인할 수 있다.

도 3은 친수성기로서 MPEG와 소수성기로서 콜레스테롤이 개질된 수용성 키토산의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로, 도 3(a)에서는 반응 후 남아있는 콜레스테롤을 제거하기 전의 수용성 키토산 나노입자를 CDCl₃에 용해한 후 측정한 스펙트럼 으로서 1.5 ~ 0.5ppm 부근에서의 반응하지 않는 콜레스테롤의 피크들을 확인할 수 있었고, 또한 수용성 키토산의 사슬에 결합되어있는 소수성기인 콜레스테롤에 의해 소수성 중심이 형성됨으로서 1.8ppm 부근에서 강한 피크를 확인 할 수 있었다. 이것은 매우 소수성인 콜레스테롤의 피크가 수용성 키토산과 MPEG의 긴 고분자 사슬간에 결합되어 있으므로 입체적 장애로 인해 콜레스테롤의 특성 피크는 1.8ppm에서 소수성 핵이 형성되어 하나의 강한 피크로 나타나는 것으로 생각된다. 도 3(b)는 반응하지 않고 남아있는 콜레스테롤을 제거하기 위해 에틸 에테르로 정제한 후 측정한 수용성 키토산 나노입자의 1H-NMR 스펙트럼이다. 이 그래프에서 알 수 있듯이 1.5 ~ 0.5ppm 부근에서 나타나는 콜레스테롤의 피크가 사라지고 소수성 중심이 형성되었음을 의미하는 1.8ppm의 특성 피크만이 명확하게 나타남을 알 수 있었다. 도 3(c)는 수용성 키토산 나노입자에 소수성 중심이 형성되었음을 확인 할 수 있는 또 다른 하나의 결과로서 수용성 키토산 나노입자를 D₂O에 용해한 후 1H-NMR 스펙트럼을 얻은 것이다. 이 그래프에서 알 수 있듯이 콜레스테롤에 의한 특성 피크가 완전히 사라지고 수용성 키토산과 MPEG의 특성 피크만을 확인함으로써 소수성 중심이 형성되었음을 확인할 수 있었다. 따라서 이상의 결과에 의해 수용성 키토산의 사슬에 MPEG와 콜레스테롤이 성공적으로 결합되었음을 확인할 수 있었다.

<실험예 3>

수용성 키토산 나노입자의 표면 형태를 TEM(Transmission electron microscope; JEOL JEM-2000 FX-II)과 AFM(Atomic force microscope; PARK's Science Autoprobe CP)을 이용하여 관찰하였다. 0.01%의 PTA(phosphotungstic acid)에 분산시킨 후 이 용액 한 방울을 탄소 필름이 코팅된 동 그리드(copper grid) 위에 떨어뜨리고 실온에서 건조하였다. AFM을 측정을 위해, 실시예 1에 따라 제조된 수용성 키토산 나노입자을 0.1mg/ml의 농도로 희석하여 분산시킨 후 실리콘 wafer의 표면위에 떨어뜨리고 실온에서 건조하였다. 도 4는 TEM에 의한 수용성 키토산 나노입자의 표면 형태를 나타낸 것으로 이 사진에서 알 수 있는 것처럼 표면이 매끄러운 둥근 형태를 가진 나노입자임을 확인할 수 있고 나노입자의 크기는 30 - 150nm정도의 크기임을 알 수 있었다. 또한 소수성기인 콜레스테롤의 치환비가 증가할수록 입자의 크기는 줄어들었으며, 이것은 수용성 키토산 사슬에 결합되어 있는 콜레스테롤에 의해 입자가 더욱 조밀하게 줄어들었기 때문인 것으로 생각된다. 또한 도 5는 AFM에의해 관찰된 수용성 키토산 나노입자의 표면 형태를 나타낸 것으로, 위의 TEM의 결과와 마찬가지로 표면이 둥글고 매끄러운 나노입자임을 확인할 수 있었고, 또한 입자의 크기는 소수성기인 콜레스테롤의 치환비가 증가할 수록 입자는 더욱 조밀하게 줄어들어 입자의 크기도 작아진다는 것을 알 수 있다.

<실험예 4>

상기 각 실시예에 따라 제조된 수용성 키토산 나노입자의 표면 전하를 측정하기 위해 633nm의 파장에서 He-Ne 레이저 빔을 가진 PCS(Photon Correlation Spectroscopy; Zetasizer 3000, Malvern instruments, England)를 사용하여 측정하 여 그 결과를 다음 표 1에 나타냈다.

구분	조성비율 (WSC:MPEG:Chol)	입자사이즈 (nm)	CAC (mol)	제타 포텐셜 (mV)
실시예 1	10:2:1.0	100~150	1.0 x 10^-5	22.4
실시예 2	10:2:1.5	50~100	0.6 x 10^-5	18.2
실시예 3	10:2:1.8	30~70	0.4 x 10^-5	15.3

소수성 항암제인 파클리탁셀의 봉입을 위해 수용성 키토산 사슬에 친수성기로서 MPEG와 소수성기로서 콜레스테롤을 개질한 결과 상기 표 1에 나타난 바와 같이 콜레스테롤의 치환비가 증가할수록 입자의 크기는 줄어들었으며, 임계회합농도 (critical aggergation concentration, CAC)도 감소함을 알 수 있었는데 이것은 소수성기인 콜레스테롤이 증가할수록 낮은 농도에서도 나노입자를 형성할 수 있다는 것을 의미하는 것으로 생각된다. 또한 양전하를 가진 수용성 키토산의 아민기에 MPEG와 콜레스테롤이 치환됨으로써 양전하는 점점 줄어들고 있음을 제타 포텐셜(Zeta potential) 측정을 통해 알 수 있다.

<실험예 5>

시차 주사 열량계 (DSC)의 측정

파클리탁셀과 수용성 키토산 나노파클리탁셀의 Tm은 TA 인스트루먼트 (instrument; Dupont, TA 2000)을 이용하여 질소기류하에서 측정하였다. 측정 조건으로는 10℃/min의 주사 속도로 20 ~ 350℃의 범위에서 수행하여 그 결과를 도 6에 나타냈다. 도 6은 파클리탁셀을 봉입하기 전(도 6(a))과 봉입한 후 (도 6(b))의 열분석 결과를 나타낸 것이다. 일반적으로 수용성 키토산 나노입자와 파클리탁셀의 Tm은 각각 50℃와 215℃에서 나타난다. 상기 결과에서 알 수 있듯이 파클리탁셀이 봉입되기 전인 수용성 키토산 나노입자의 Tm은 50℃에서 나타남을 알 수 있었고 (도 6(a) 참고) 파클리탁셀을 봉입한 수용성 키토산 나노파클리탁셀의 경우에는 50℃부근에서 수용성 키토산 나노입자의 Tm과 240℃부근에서의 파클리탁셀의 Tm 피크를 확인 할 수 있었다(도 6(b) 참고). 수용성 키토산 나노파클리탁셀에서 파클리탁셀의 Tm(215℃) 보다 조금 높게 나타난 것은 수용성 키토산 나노입자의 소수성 중심에 봉입되었기 때문인 것으로 생각된다.

<실험예 6>

봉입량을 정량하기 위한 HPLC 측정

상기 실시예 4에 따라 제조된 수용성 키토산 나노파클리탁셀의 파클리탁셀 봉입량을 Phenomenex Sphereclone 5micro ODS(2) 250 x 4.6mm 컬럼을 사용하고, 이동상으로는 75%메탄올을 사용하여 HPLC로 정량하였다. 이때, 유속은 1.5ml/min으로 하였고 온도는 50℃ 그리고 검출기는 UV 검출기(detector)(226 nm)를 사용하였고,파클리탁셀은 에탄올에 녹여서 20μl를 주입하였다. 그 결과를 다음 표 2에 나타냈다.

구분	조성비율 (WSC:MPEG:Chol)	적재함량 (wt. - %)	적재효능 (wt. - %)
실시예 4	10:2:1.0	4.4	13
실시예 5	10:2:1.5	10	13
실시예 6	10:2:1.8	18	26

상기 표 2는 실시예 4 내지 6에 따라 파클리탁셀을 봉입한 수용성 키토산 나노파클리탁셀의 봉입량과 봉입효율을 나타낸 것으로, MPEG가 도입된 수용성 키토산의 사슬에 소수성기인 콜레스테롤의 치환비가 증가할 수록 봉입양과 봉입효율은 더 증가하는 것을 알 수 있으며, 이 결과는 도 7에 나타낸 HPLC에 의한 정량분석에 의해 다시 확인할 수 있었다.

도 7에 나타난 바와 같이 파클리탁셀의 특성 피크(b)는 3.4 min에서 나타났으며 (a)는 수용성 키토산 나노파클리탁셀에 봉입된 파클리탁셀을 정량한 것으로 소수성기인 콜레스테롤의 함량이 증가할수록 봉입된 파클리탁셀의 함량은 증가함을 알 수 있었고 이는 수용성 키토산 나노입자와 콜레스테롤의 소수성 상호작용에 의한 것으로 생각된다.

<실험예 7>

CT-26 마우스 종양 모델에서의 종양억제실험

CT-26 mourine tumor cell(5×104 cells/mice)을 BALB/c mice(Female, 평균 체중 20g)의 등에 있는 피하에 이식하였다. 종양이 거의 3mm×3mm 정도의 크기에 도달했을 때 치료군과 대조군으로 나누었다. 8마리의 종양을 가진 마우스로 구성된 각 군은 귀에 표시해두었고 실험이 진행되는 동안 관찰하였다. 약물과 비히클(vehicle)의 정맥주사 투여는 종양 이식 후 15일에 시작하였다. 각 약물은 낮은 복용량(low dose)으로서 kg 당 2mg이 투여되었고 높은 복용량(high dose)으로서 kg당 10mg이 3일 간격으로 12일 동안 4회 투여하였다. 대조군은 비히클(cremophor:dehydrated ethyl alcohol, 1:1 v/v)을 투여하였다. 마우스의 사망률은 매일 체크하였고 종양의 성장 정도는 구경(caliper) 측정장치에 의해 2일 혹은 3일 간격으로 측정하였다. 종양의 크기는 다음의 식(2)을 사용하여 계산하였다.

종양 용적(Tumor volume: mm³) = (길이 × 폭²)/2 ---- 식(2)

종양을 이식시키고 2주 후에 마우스의 꼬리 정맥(tail vein)에 약물, 또는 비히클을 투여하였다. 도 8은 파클리탁셀과 수용성 키토산 나노파클리탁셀이 각각 투여된 마우스의 생존율을 나타낸 그래프이다. 대조군은 모든 군들 중에서 가장 빠른 속도로 죽어가는 것을 확인할 수 있다. 10mg/kg의 고 복용량의 경우에는 40일까지 다른 세 개의 군보다 훨씬 더 빠르게 죽었으나, 사실상 파클리탁셀 2mg/kg, 10mg/kg 그리고 수용성 키토산 나노파클리탁셀(WSC-NPT) 2mg/kg 군 사이의 생존율은 크게 다르지 않았다. 고 복용량(10mg/kg)으로 수용성 키토산 나노파클리탁셀을 투여한 시험군들이 다른 시험군들보다 전 실험기간동안 가장 높은 생존율을 유지하였다.

도 9는 생체내에서의 CT-26 종양모델에 대한 파클리탁셀과 수용성 키토산 나노파클리탁셀(WSC-NPT)의 항암활성을 나타낸 그래프이다. 종양 크기의 측정은 종양 세포를 이식하고 15일째부터 시작하였다. 저 복용량(2mg/kg)에서 파클리탁셀과 수용성 키토산 나노파클리탁셀은 종양의 크기에 있어서 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나, 고 복용량(10mg/kg)의 경우에, 파크리탁셀은 대조군(control), 파크리탁셀(2mg/kg) 그리고 수용성 키토산 나노파클리탁셀(2mg/kg)와 비교했을 때 종양의 크기가 현저하게 감소하는 것을 알 수 있었다. 파클리탁셀 10mg/kg의 경우에 종양의 성장은 현저하게 줄어들었지만 30일 후에 다시 성장하는 특성을 보여주었다. 도 9에 나타난 것처럼 10mg/kg의 복용량에서의 수용성 키토산 나노파클리탁셀은 모든 군들 중에서 항암 활성이 가장 뛰어남을 알 수 있다. 수용성 키토산 나노파클리탁셀의 경우에 종양의 성장은 38일까지 억제되었고 40일 이후에는 다시 성장함을 알 수 있다.

도 10은 종양을 이식한 후 약물의 투여에 따른 체중 변화를 나타낸 그래프로, 이 그래프에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군, 파클리탁셀(2mg/kg) 그리고 수용성 키토산 나노파클리탁셀(2mg/kg) 사이에서의 체중 변화는 크게 다르지 않았다. 고 복용량의 경우에 수용성 키토산 나노파클리탁셀는 체중이 현저하게 줄어들었다는 것을 알 수 있다. 이 결과는 고 복용량에 있어서의 수용성 키토산 나노파클리탁셀의 종양의 크기는 다른 군들 보다 더 작았으며 이것이 체중의 증가를 억제한 것으로 생각된다.

수용성 키토산 나노파클리탁셀의 경우에 있어서 비록 종양의 성장과 생존율이 저 복용량에서는 크게 변화하지 않았다고 하더라도, 고 복용량에 있어서는 수용성 키토산 나노파클리탁셀이 파클리탁셀과 비교했을 때 생존율이 더 우세했을 뿐 만 아니라 종양의 크기도 현저하게 감소되었음을 알 수 있다. 따라서 10mg/kg의 고 복용량 이상의 수용성 키토산 나노파클리탁셀은 항암활성이 훨씬 우수하다는 것을 알 수 있다.

상기와 같이 구성되는 본 발명의 항암제의 전달체용 수용성 키토산 나노입자는 기본 구성물로 수용성 키토산을 사용하여 반응성이 높은 유리 아민기의 위치에 친수성 및 소수성기를 각각 도입함으로써 항암제인 파클리탁셀를 용이하게 봉입한 수용성 키토산 나노파클리탁셀을 제공할 수 있고, 이 수용성 키토산 나노파클리탁셀은 천연고분자물질인 수용성 키토산을 중심으로 한 고분자의 여러 가지 장점으로 인해 동결건조 후 증류수에서의 재분산 능력이 매우 뛰어나고, 기존의 다른 항암제 전달체에 비해 종양 세포에 더 많이 축적되고, 또한 수용성 키토산은 약간 산성에서 더 안정화된다는 특성을 가지고 있으므로 정상세포에 비해 표적성을 부여할 수 있으므로 암 세포에 나노입자가 더 축적될 수 있어 탁월한 항암효과를 나타낸다.

Claims

수용성 키토산(Water soluble chitosan)의 사슬에 소수성기로서 콜레스테롤 (cholesterol)과 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜){Methoxy poly(ethylene glycol)}를 도입하여 구성됨을 특징으로 하는 항암제의 전달체용 수용성 키토산 나노입자.
제 1항에 있어서, 상기 수용성 키토산(Water soluble chitosan) : 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜){Methoxy poly(ethylene glycol)} : 콜레스테롤(cholesterol) = 10 : 2 : 1 내지 1.8의 비율로 됨을 구성됨을 특징으로 하는 항암제의 전달체용 수용성 키토산 나노입자.
수용성 키토산(Water soluble chitosan)의 사슬에 소수성기로서 콜레스테롤 (cholesterol)과 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜){Methoxy poly(ethylene glycol)}를 도입하여 구성된 수용성 키토산 나노입자에 파클리탁셀이 봉입된 수용성 키토산 나노파클리탁셀.
1) 수용성 키토산에 MPEG를 부가하여 아마이드(amide)결합을 형성하고 부생성물인 p-니트로 페닐 기를 제거하는 단계; 및

2) 상기 단계의 반응액에 콜레스테롤을 부가하여 수용성 키토산의 유리 아민기와 콜레스테릴 클로로포름에이트(cholesteryl chloroformate)와의 또 다른 아마 이드 결합을 형성시키는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 항암제의 전달체용 수용성 키토산 나노입자의 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 1)단계에서 생성된 부생성물인 p-니트로 페닐 기는 얼음물(ice water)로 투석하면서 제거한 후, 남아있는 부생성물은 무수 에탄올로 정제함으로써 완전히 제거함을 특징으로 하는 항암제의 전달체용 수용성 키토산 나노입자의 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 수용성 키토산 나노입자 제조의 각 단계는 PBS 용액내에서 이루어짐을 특징으로 하는 항암제의 전달체용 수용성 키토산 나노입자의 제조방법.