KR20060003673A - 염색체 17ｐ11.2-ｐ12 지역의 중복을 제외한 유전자돌연변이를 발병 원인으로 하는 ＣＭＴ 질환의 진단방법및 진단키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 17번 염색체 17p11.2-p12 지역의 중복을 제외한 유전자 돌연변이로 발병하는 유전성 신경질환의 진단방법 및 진단키트에 관한 것이다. 본 발명에서는 새로운 CMT 질환 유발 돌연변이(novel mutation)가 동정되며, 이러한 신규 돌연변이를 이용한 유전성 신경질환의 진단방법이 제공된다. 또한, 본 발명에서는 유전성 신경질환을 유발하는 다양한 유전자변이를 검출하기 위한 프라이머와 이를 이용한 CMT 질환의 진단키트가 제공된다. 본 발명에 따르면, 유전성이 강하면서도 단일 유전자 결함에 의해 발병하는 CMT 질환에 대하여 유전자 검사를 통한 정확한 조기 진단이 가능하며, 정확한 진단에 따라 최근 개발되고 있는 치료방법을 조기에 적용하여 치료할 수 있고, 나아가 정확한 병인에 따른 맞춤치료까지 가능하게 된다.
유전성 신경질환, CMT, 유전자 돌연변이, 진단키트
Description
도 1a 및 1b는 CMT 질환 유발 유전자 변이에 대한 정상인(CTL)과 환자(Patient)의 유전자 분석결과 크로마토그램이다.
도 2는 본 발명의 진단키트를 사용하여 CMT 질환 환자 가계를 분석한 결과이다.
본 발명은 염색체 17p11.2-p12 지역의 중복을 제외한 유전자 돌연변이로 발병하는 CMT 질환의 진단방법 및 진단키트에 관한 것이다.
유전성 신경질환(Inherited neuropathy)은 가족력을 가지며 유전자의 돌연변이에 의해 운동 및 감각 신경계통의 기능 이상을 나타내는 선천성 질환이다. 유전성 신경질환에는 샤르코-마리-투스병 (Charcot-Marie-Tooth disease, CMT), HNPP(hereditary neuropathy with liability to pressure palsies), DSS(Dejerine-Sottas syndrome) 및 CH(congenital hypomyelination) 등이 포함된다. 이들은 유전적으로 이질적인 요인들에 의해 발병되며, 유전성 신경질환 중 가장 높은 빈도를 보이는 CMT는 대략 2,500명 중 한명의 발병율을 보인다.
CMT 질환은 주로 하지 비골 근육에서 서서히 진행하는 근력 약화와 위축을 특징으로 하며 무반사증(areflexia), 말단 감각 소실(distal sensory loss), 발모양의 기형화(pes cavus) 및 청력장애(deafness)를 나타내기도 한다. 발병은 10세 전후에 주로 일어나지만 드물게는 30대 이후에도 일어난다. 그러나, CMT 질환의 임상적 표현형과 발병 연령은 매우 이질적이며 확진을 위한 신경 조직 검사(nerve biopsy)도 용이하지 않으므로 정확한 진단과 치료를 어렵게 한다 (Berger P., Young P., Suter U. Neurogenet. 4: 1-15 (2002)).
유전성 신경질환은 병리학적 특징으로 탈수초성 신경증인 CMT1형과 축삭형 신경증인 CMT2형으로 분류되었지만, 최근 유전적 원인들이 밝혀지면서 분류 체계가 새롭게 정립되고 있다. CMT1형은 유전자 변이에 따라 CMT1A, 1B, 1C로 구분하며 CMT2형은 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G 등으로 나뉘어진다. 상염색체 열성 유전인 CMT4형은 유전자 변이에 따라 CMT4A에서 4F까지 분류된다. 이외에 태생시부터 심한 증상을 보이는 DSS(Dejerine-Sottas syndrome)와 CH(congenital hypomyelination)가 있다. 이중 CMT1A는 CMT 질환 중에서 가장 높은 비율을 차지하며 말초 신경 수초의 PMP22 (periphral myelin protein 22) 유전자를 포함하는 염색체 17p11.2-p12의 중복이 원인으로 알려져 있다. 17p11.2-p12의 결실에 의해 서는 HNPP (hereditary neuropathy with liability to pressure palsies)가 발병한다. CMT1A 다음으로 높은 빈도를 차지하는 것은 CMTX형으로 전체 유전성 신경질환의 10~20%를 차지하며 간극 결합을 형성하는 Cx32 (Connexin 32) 유전자의 변이에 의해 발병한다. 그 외에 MPZ (Myelin protein zero), EGR2 (Early growth response 2), NEFL (neurofilament light), PRX (periaxin) 유전자에서의 돌연변이도 CMT를 포함하는 말초신경증을 유발한다. 표 1은 지금까지 알려진 중요한 말초신경증 유발 유전자들의 유전방식 및 표현형을 나타낸 것이다.
각 CMT 질환 환자는 단일 유전자 결함(single gene mutation)에 의해 발병하며, 증상의 정도는 차이가 있지만 발병여부는 멘델의 법칙에 매우 충실하다. 현재 유전자 검사가 시행되는 대부분의 질병들은 다유전적 요인(polygenic inheritance)과 환경적 요인의 복잡한 상호작용에 의해 발병하는 질병들이므로, 이들에 대한 유전자 검사는 단지 발병에 대한 경향성을 제시하는데 그친다 (예: 고호모시스테인혈 증과 연관된 MTHFR, 유방암을 일으키는 BRC-A BRC-B 유전자검사). 그러나 CMT 질환은 페닐케톤뇨증(PKU)의 경우처럼 유전적 결함과 발병이 거의 직접적으로 연관되어 유전자검사 결과는 단순한 경향성이나 발병의 가능성 제시의 차원을 넘어서 확진의 의미를 가지므로, 유전자진단 키트를 활용하기에 매우 적합한 유전병이다.
따라서, 유전성이 강하면서도 단일 유전자 결함에 의해 발병하는 CMT 질환에 대해 유전자 검사를 통한 병인을 규명한다면 보다 정확한 진단과 근본적인 치료가 가능할 것이다. 또, 지금까지는 CMT 질환에 대해 조기진단을 한다 해도 적절한 치료방법이 없어 조기진단의 필요성이 크게 제기되지 않았으나 최근 CMT1A에 대한 치료제로서 아스코르빈산(Ascorbic acid)과 프로게스테론 길항제(Progesterone antagonist)가 효과가 있음이 논문을 통해 발표된 바 있다 (Sereda M.W., Horste G.M., Suter U., Uzma N., Nave K.-A. Nature Genet. 9: 1533-1537 (2003); Passage E., Norreel J.C., Noack-Fraissignes P., Sanguedolce V., Pizant J., Thirion X., Robaglia-Schlupp A., Pellissier J.F., Fontes M. Nature Genet. 10: 396-401 (2004)). 따라서, CMT 질환을 조기에 정확하게 진단할 수 있다면 치료법의 개발에 따라 조기치료가 가능해질 것이며, 나아가 유전적 원인에 따른 맞춤치료까지 가능하게 될 것이다. 본 발명은 17p11.2-p12의 중복을 제외한 유전자 돌연변이를 원인으로 하는 CMT 질환의 유전자 분석 및 정확한 진단에 관한 것이다.
2000년대 이후에는 미국이나 유럽에서 뿐만 아니라 일본에서도 유전성 신경질환에 대한 연구가 상당히 이루어지고 있다. 요시하라 등(Yoshihara T., Yamamoto M., Doyu M., Misu K.I., Hattori N., Hasegawa Y., Mokuno K., Mitsuma T., Sobue G. Hum. Mutat. 16: 177-178 (2000))과 누마쿠라 등(Numakura C., Lin C., Ikegami T., Guldberg P., Hayasaka K. Human Mutat.20: 392-398 (2002))은 일본인 100여명의 유전성 신경질환 환자를 대상으로 CMT1A 중복, PMP22, MPZ 및 Cx32에서의 원인 돌연변이를 검출하였다.
아직 한국인에 대한 CMT 질환의 발병 빈도에 대한 정확한 통계는 없지만 유럽인과 비슷할 것으로 추측되고 있다. 본 발명에서는 먼저 한국인 CMT 질환 환자 및 가족을 대상으로 CMT 질환 발병의 유전적 원인을 정확히 분석하고, 그에 따른 진단방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 염색체 17p11.2-p12 지역의 중복을 제외한 유전자 돌연변이로 발병하는 CMT 질환을 정확히 진단하는데 그 목적이 있다.
이를 위해 본 발명에서는 먼저 원인이 되는 유전자 돌연변이를 정확히 동정한다. 본 발명에서는 지금까지 밝혀진 CMT 질환 유발 유전자들인 PMP22, Cx32, MPZ, EGR2, NEFL 및 PRX에 대해 SNP 스크린을 통해 CMT-유발 유전자변이를 동정한다. 이러한 동정과정을 통해 아직 세계적으로 보고되지 않은 새로운 CMT-유발 돌연변이(novel mutation)가 본 발명에서 밝혀지며, 본 발명에서는 이러한 신규 돌연변이를 이용한 유전성 신경질환의 진단방법이 제공된다.
또한, 본 발명에서는 CMT 질환을 유발하는 다양한 유전자변이를 검출하기 위 한 프라이머와 이를 이용한 CMT 질환의 진단키트가 제공된다.
이밖에도 본 발명에서는 한국인의 CMT 질환 유전자를 분석하고 그 결과를 외국 데이터와 비교함으로써 한국인의 CMT 질환의 임상적 특징, 발병 연령, 진행 양상 등을 밝힌다.
본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기에 설명될 것이며, 본 발명의 실시에 의해 더 잘 알게 될 것이다.
본 발명에서는 새롭게 동정된 7개의 CMT 질환 유발 돌연변이가 제공된다. 본 발명에서 동정한 신규 돌연변이의 내용은 다음과 같다.
PMP22의 Ala106fs : PMP22 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 318에서 티민이 결실되어 아미노산 서열위치 106(알라닌)에서부터 프레임쉬프트(frameshift)가 일어난 돌연변이.
MPZ의 Asp118Asn : MPZ 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 352에서 구아닌이 아데닌으로 치환되어 아미노산 서열위치 118에서 아스파라긴산이 아스파라긴으로 대체된 돌연변이.
MPZ의 449-1G>T : MPZ 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 449-1에서 구아닌이 티민으로 치환되어 일어난 3'-스플라이스 부위(3'-splice site) 돌연변이.
MPZ의 Lys236Glu : MPZ 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 706에서 아데닌이 구아닌으로 치환되어 아미노산 서열위치 236에서 리신이 글루탐산으로 대체된 돌연 변이.
Cx32의 Val136Ala : Cx32 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 407에서 티민이 시토신으로 치환되어 아미노산 서열위치 136에서 발린이 알라닌으로 대체된 돌연변이.
Cx32의 Cys168Arg : Cx32 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 502에서 티민이 시토신으로 치환되어 아미노산 서열위치 168에서 시스테인이 아르기닌으로 대체된 돌연변이.
NEFL의 Leu334Pro : NEFL 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 1001에서 티민이 시토신으로 치환되어 아미노산 서열위치 334에서 루이신이 프롤린으로 대체된 돌연변이.
또한, 본 발명에서는 상기 돌연변이 동정 결과를 토대로 각각의 돌연변이를 검출하는 밀초신경증의 진단방법이 제공된다.
즉, 본 발명에서는, PMP22 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 318에서 티민이 결실되어 아미노산 서열위치 106(알라닌)에서부터 프레임쉬프트(frameshift)가 일어난 돌연변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 CMT1의 진단방법이 제공된다.
또 본 발명에서는, MPZ 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 352에서 구아닌이 아데닌으로 치환되어 아미노산 서열위치 118에서 아스파라긴산이 아스파라긴으로 대체된 돌연변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 CMT2의 진단방법이 제공된다.
본 발명에서는, MPZ 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 449-1에서 구아닌이 티 민으로 치환되어 일어난 3'-스플라이스 부위 돌연변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 CMT1의 진단방법이 제공된다.
본 발명에서는, MPZ 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 706에서 아데닌이 구아닌으로 치환되어 아미노산 서열위치 236에서 리신이 글루탐산으로 대체된 돌연변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 CMT2의 진단방법이 제공된다.
본 발명에서는, Cx32 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 407에서 티민이 시토신으로 치환되어 아미노산 서열위치 136에서 발린이 알라닌으로 대체된 돌연변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 CMT1의 진단방법이 제공된다.
본 발명에서는, Cx32 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 502에서 티민이 시토신으로 치환되어 아미노산 서열위치 168에서 시스테인이 아르기닌으로 대체된 돌연변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 CMT1의 진단방법이 제공된다.
본 발명에서는, NEFL 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 1001에서 티민이 시토신으로 치환되어 아미노산 서열위치 334에서 루이신이 프롤린으로 대체된 돌연변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 CMT2의 진단방법이 제공된다.
또한, 본 발명에서는 본 발명에서 새롭게 동정한 유전자변이와 기존에 보고된 유전자변이를 포함하는 CMT 질환 유발 유전자변이를 정확하게 검출할 수 있는 유전성 신경질환의 진단키트가 제공된다.
즉, 본 발명에서는, CMT 질환 유발 유전자 중 수초성 유전자인 Cx32, PMP22 및 MPZ의 돌연변이를 검출하는 서열번호 1 내지 34의 17개 프라이머쌍을 포함하는 진단키트가 제공된다.
또 본 발명에서는, CMT 질환 유발 유전자 중 상대적으로 낮은 발병원인을 제공하는 비수초성 유전자인 EGR2, NEFL 및 PRX의 돌연변이를 검출하는 서열번호 35 내지 78의 22개 프라이머쌍을 포함하는 진단키트가 제공된다.
또한, 본 발명에서는 상기 수초성 유전자와 비수초성 유전자의 돌연변이를 동시에 또는 순차적으로 진단할 수 있도록 서열번호 1 내지 78의 39개 프라이머쌍을 포함하는 진단키트가 제공된다.
이하, 구체적인 실험 및 분석사례 등의 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 다음의 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능한 것은 물론이다.
CMT 질환 유발 유전자에서의 돌연변이 탐색
지금까지 밝혀진 CMT 질환 유발 유전자들인 PMP22, Cx32, MPZ, EGR2 및 NEFL에 대해 SNP 스크린을 통해 CMT 질환 유발 원인 돌연변이를 동정하였다.
(1) CMT 환자 가계 시료 및 임상자료 수집
① 시료 및 임상자료
본 발명에서는 한국인 CMT 환자 본인과 그 가족들을 포함하는 100여 가계의 시료를 수집, 분석하였다. 환자 및 그 가족의 시료는 병원에서 1993년 이후 10여 년 동안 수집된 것으로 환자의 임상적 특징과 가계의 병력을 확보한 것이며, 환자별 임상적 특징과 유전자 변이와의 상관성을 조사한 것이다.
② 환자의 전기 생리학적검사
모든 연구 대상에서 정중신경, 척골신경의 운동 및 감각신경과 비골신경, 후경골신경의 운동신경, 비복신경의 감각신경을 검사하였다. 또, 청각 장애가 의심되는 모든 환자들을 대상으로 전정신경의 이상 유무를 검사하기 위하여 뇌간청각 유발전위검사(BAEP; brainstem auditory evoked potential)를 시행하였다. 안면마비를 보이는 환자에 대해서는 안면신경 전도 검사 및 순목반사(blink reflex)를 시행하였다.
③ CMT 질환으로 인한 기능저하 척도 (FDS: functional disability scale)의 분류
유전성 신경 질환의 심한 정도를 측정하기 위하여 9단계로 된 기능저하 척도를 사용하였으며, 기준은 다음과 같다. 0: 정상, 1: 정상이지만 피로감이나 통증이 있는 경우(normal but with cramps and fatigability), 2: 달리기를 할 수 없는 경우(inability to run), 3: 걷기가 어렵지만 도움 없이 걷는 것이 가능한 경우, 4: 지팡이를 가지고 걸을 수 있는 경우(walk with cane), 5: 목발을 가지고 걸을 수 있는 경우(walk with crutches), 6: 보조기를 착용하고 걸을 수 있는 경우(walk with a walker), 7: 휠체어를 타고 다녀야 하는 경우(wheelchair bound), 8: 누워 서 생활하는 경우(bedridden).
(2) 시료채취 및 DNA 추출
CMT 가계의 구성원 및 정상인(대조군)으로부터 혈액이나 타액을 시료로 채취하였다. 혈액은 EDTA가 처리된 튜브에 모은 후, DNA 정제 장치를 사용하여 genome DNA를 추출하며, 모근이나 타액으로부터의 DNA 추출은 55℃에서 3hr의 프로테이나제 K(Proteinase K)를 처리한 후 페놀:클로로포름 방법으로 추출하였다.
(3) 원인 유전자 탐색
(가) 유전자 스크린
17p11.2-p12의 중복에 의한 CMT1A형과 결실에 의한 HNPP 환자가 아닌 말초신경증 환자를 대상으로 원인 돌연변이를 해당 유전자들로부터 탐색한다. 유전적 원인 제공의 비율에 따라 다음과 같은 순서로 SNP 등 돌연변이를 탐색하였다.
① CMTX를 유발하는 Cx32의 돌연변이 스크린(단, 가계도의 분석에서 male-to-male의 유전이 없고, female의 증상이 male에 비해 경미한 경우)
② 상염색체 우성의 CMT1과 CMT2를 유발하는 MPZ 돌연변이 스크린
③ CMT1과 HNPP를 유발하는 PMP22 스크린
④ CMT4, DSS, CH를 유발하는 EGR2 돌연변이 스크린
⑤ 우성 및 열성 방식의 CMT1과 CMT2를 유발하는 NEFL 돌연변이 스크린
⑥ 상염색체 열성 방식의 CMT1과 DSS를 유발하는 PRX 돌연변이 스크린
(나) 염기서열 분석
원인 유전자로 고려되는 후보 유전자들의 염기서열을 프로모터(promoter) 부위(약 1kb)와 엑손(exon) 및 인접 인트론(intron) 부위를 중심으로 조사하였다. 각 DNA 조각의 PCR을 위한 프라이머를 제작하여 PCR을 실시하고, 증폭된 DNA를 정제한 후 곧바로 자동염기서열분석기(ABI 3100 automatic sequencer)를 이용하여 염기서열을 결정하였다.
(4) 결과
CMT1A 중복을 보이지 않은 42 유전성 신경질환 가족에 대해서 PMP22, MPZ, Cx32, EGR2 및 NEFL 유전자에서의 원인 돌연변이를 탐색한 결과, 9 가족으로부터 총 10개의 원인 돌연변이를 동정하였으며, 그 중 8개가 아직 세계적으로 보고되지 않은 신규 돌연변이(novel mutation)이었다. 돌연변이의 내용과 임상적 특징에 대해서는 다음의 표 2에 정리하였다. 표 2에서 "New"로 표시한 것이 본 발명에서 동정한 신규 돌연변이이다.
분석결과를 외국 데이터와 비교한 결과, EGR2의 Arg359Trp 미스센스 돌연변이(missense mutation)가 유럽집단에서는 모두 증상이 심한 DSS 환자였지만 한국인에서는 CMT1 환자인 것으로 관찰되어 인종별 차이가 있는 것으로 나타났다.
또, 상기 돌연변이를 포함하여 유전자 분석을 통해 탐색된 염기서열의 변이를 모두 정리하여 표 3에 나타내었다. 표에서 'This study'로 표기된 것은 본 발명에서 처음으로 밝힌 한국인 집단의 유전자 변이로서 아직 세계적으로 보고된 바가 없는 것이다.
상기 표 3에서 정리된 유전자변이에 대해 정상인(CTL)과 환자(Patient)의 유전자를 분석하여 자동염기서열분석기로 얻은 크로마토그램을 돌연변이 위치마다 비교하여 도 1a 및 1b에 나타내었다.
유전자별로 보면, PMP22 돌연변이 1개(2.4%), MPZ 3개(7.1%), Cx32 3개 (7.1%), EGR2 1개(2.4%) 및 NEFL 2개(4.8%)가 탐색되었으며, 탐색된 10개의 돌연변이 중 8개가 미스센스(missense) 돌연변이였으며, frameshift와 3'-splice site 돌연변이가 각각 한개씩 발견되었다. 이중 7개의 돌연변이(PMP22의 Ala106fs, MPZ의 Asp118Asn, 449-1G>T, Lys236Glu, Cx32의 Val136Ala, Cys168Arg 및 NEFL의 Leu334Pro)는 본 발명에서 새롭게 동정한 것으로, 한국인-특이성을 보였다 (표 2에서 "New"로 표시됨). EGR2에서의 Arg359Trp는 세계적으로 네 환자에서 보고되었는데, 모두 호흡기손상(respiratory compromise)과 조기 발병의 DSS 환자였지만, 본 발명에서 관찰된 환자는 호흡기손상(respiratory compromise)을 보이지 않고, 발병도 8세로서 비교적 늦게 나타났다. 또 median NCV는 25m/sec로 DSS가 아닌 CMT1형의 증상을 보여 동일 유전적 원인에 대해서도 유럽인과는 다른 임상적 표현형을 보이는 것으로 나타났다 (Taroni F., Pareyson D., Botti S., Sghirlanzoni A., Nemni R., Riva D. Neurology 52 [Suppl 2]: 258-259 (1999)). 본 발명에서 조사된 MPZ(7.1%)와 PMP22(2.4%)의 돌연변이율은 유럽 집단에서 보고된 MPZ의 4.8-10.6%와 PMP22의 1.6-2.8%와 비슷한 비율이었다. Cx32의 돌연변이율은 7.1%로 유럽 집단과 비교하면 상당히 낮지만(Spain 21.3%, Finland 19.0%, Russia 13.0%, Italy 16.7%, Germany 11.9%), 일본인의 5.6-5.7%와는 비슷한 것으로 나타났다 (Yoshihara T., Yamamoto M., Doyu M., Misu K.I., Hattori N., Hasegawa Y., Mokuno K., Mitsuma T., Sobue G. Hum. Mutat. 16: 177-178 (2000); Numakura C., Lin C., Ikegami T., Guldberg P., Hayasaka K. Human Mutat.20: 392-398 (2002)). 이와 같은 결과는 Cx32가 아시아 집단에서 유럽인 보다 CMT 질환의 유발 원인으로 덜 작용하는 것으로 추측된다. 아직 NEFL과 EGR2 유전자에 대한 집단 유전학적 연구 결과는 많지 않다. 본 발명에서 NEFL 돌연변이율은 4.8%인데 비해, Jordanova et al.는 323 백인 CMT 집단으로부터 7개의 원인 돌연변이를 탐색하여 2.2%의 돌연변이율을 보고한 바 있다 (Jordanova A., De Jonghe P., Boerkoel C.F., Takashima H., De Vriendt E., Ceuterick C., Martin J.J. et al. Brain 126: 590-597 (2003)). 이 같은 연구 결과들은 NEFL의 돌연변이율은 PMP22의 비율과 비슷하거나 더 높을 수 있음을 암시한다.
또, 매우 특이적으로 Cx32의 Val136Ala과 EGR2의Arg164Gln 돌연변이가 한 CMT1 환자에서 발견되었다. Cx32의 Val136Ala는 de novo mutation로, 두개의 돌연변이를 가진 딸의 증상은 EGR2 돌연변이만 가진 아버지에 비해 훨씬 심각한 증상을 보였다. 지금까지 한 환자로부터 동일 유전자내에서 이중 돌연변이가 보고된 적은 드물게 있지만(Silander K., Meretoja P., Juvonen V., Ignatius J., Pihko H., Saarinen A., Wallden T., Herrgard E., Aula P., Savontaus M.-L. Hum. Mutat. 12: 59-68 (1998); Mersiyanova I.V., Ismailov S.M., Polyakov A.V., Dadali E.L., Fedotov V.P., Nelis E., et al. Human Mutat. 15: 340-347 (2000)), 다른 유전자에서 이중 돌연변이가 보고된 것은 세계적으로 처음이다.
진단키트
(1) 수초성 유전자 진단 키트(MyelinGene Detection Kit)
① 키트의 구성
엑손과 슈반세포(Schwann cell) 간의 통신에 중요한 역할을 하는 막관통 단백질인 peripheral myelin족을 생산하는 Cx32, PMP22 및 MPZ 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있게 키트를 구성한다. 이를 위해 앞에서 밝힌 모든 변이 부위를 정확하게 증폭할 수 있도록 프라이머를 제작한다. 프라이머는 증폭 길이는 300-500bp 내외로 하고 Tm값은 60℃ 이상으로 하여 비특이적 DNA의 증폭을 최소화한다.
각 유전자 당 증폭 단위는 PMP22 6, Cx32 5, MPZ 6으로 Kit는 총 17 PCR 증폭단위로 구성하고, 각 증폭단위에 대한 정확한 증폭조건을 확립한다.
수초성 유전자 진단키트(MyelinGene Detection Kit)를 구성하는 프라이머를 정리하여 다음의 표 4에 나타내었다.
(2) 비수초성 유전자 진단키트(NonMyelinGene Detection Kit)
최근에 밝혀지고 상대적으로 낮은 발병 원인을 제공하는 EGR2, NEFL, 및 PRX 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있도록 키트를 구성한다.
EGR2와 NEFL은 상기에서 탐색한 유전자 변이 자료와 본 발명에서 확립한 증폭 조건을 활용하였다. PRX 유전자에 대해서는 각 엑손의 증폭법과 한국인의 CMT 환자에서 SNP 변이성의 기초 자료를 확보하여 활용하였다.
비수초성 유전자 진단키트(MyelinGene Detection Kit)를 구성하는 프라이머를 정리하여 다음의 표 5에 나타내었다.
(3) 비교 임상실험 및 진단율
정상인(100명) 및 환자가족군(50명)을 대상으로 SNP를 포함한 DNA 변이에 대한 분석 데이터 확보하고, 이를 토대로 병인 돌연변이의 분리와 유전자별 질병 유발의 비율을 계산하여 확진율을 구했다.
진단키트를 이용한 유전자검사
상기 표 4 및 표 5와 같이 구성된 본 발명의 수초성 유전자 진단키트(MyelinGene Detection Kit)와 비수초성 유전자 진단키트(MyelinGene Detection Kit)를 사용하여 실제 CMT 질환 환자 6가족(FC53, FC26, FC19, FC2, FC22, FC7)에 대한 유전자검사를 실시하였다.
(1) 분석된 환자 가계
(a) FC53 : PMP22의 Ala106fs 돌연변이를 갖는 환자 가족
(b) FC26 : MPZ의 Asp118Asn 돌연변이를 갖는 환자 가족
(c) FC19 : MPZ의 449-1G>T 돌연변이를 갖는 환자 가족
(d) FC2 : Cx32의 V136A, EGR2의 R359W 돌연변이를 갖는 환자 가족
(e) FC22 : Cx32의 C168R 돌연변이를 갖는 환자 가족
(f) FC7 : NEFL의 E397K 돌연변이를 갖는 환자 가족
(2) PCR 조건
각 유전자에 따른 프라이머 및 PCR 조건은 다음의 표 6 내지 11과 같다.
표 6은 PMP22의 PCR을, 표 7은 MPZ의 PCR을, 표 8은 Cx32의 PCR을, 표 9는 EGR2의 PCR을, 표 10은 NEFL의 PCR을, 표 11은 PRX의 PCR 조건을 나타낸 것이다.
(3) 분석 및 결과
PCR 증폭물은 자동염기서열분석기(ABI 3100)로 분석하고 유전자형은 Chromas 프로그램을 이용하여 분석하였다(Ver. 2.23).
가계도분석(pedigree analysis) 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2의 각 가계도에서 네모 속에 숫자가 적힌 구성원은 해당 돌연변이를 가진 사람이며, 화살표(↗)는 프로밴드(proband)를 나타낸다. FC2 가계의 경우 III-2는 Cx32의 V136A와 EGR2의 R359W 두 돌연변이를 보였지만, II-3은 EGR2의 R359W만 보였다.
본 발명에 따르면, 한국의 CMT 질환 환자에서 병인이 되는 새로운 유전자 돌연변이가 밝혀지고 이를 이용하여 유전자 돌연변이를 발병원인으로 하는 유전성 신경질환의 정확한 진단이 이루어지게 된다. 본 발명의 수초성 유전자 진단키트를 본 발명자의 다른 발명인 17p11.2-p12 지역의 중복을 검출하는 키트와 함께 사용할 경우 유전성 신경질환에 대한 확진율은 80% 이상이 되며, 여기에 본 발명의 비수초성 유전자 진단키트를 함께 사용할 경우 유전성 신경질환의 확진율은 90% 이상이 된다. 이는 신경질환의 특성상 조직생검이 용이하지 않아 정확한 해부학적 및 전기생리학적 진단이 어려운 질병에 대해 해부없이 유전자진단키트 만을 이용하여 정확한 진단을 할 수 있다는 놀라운 효과를 갖는 것이며, 키트를 활용한 정확한 병인의 진단으로 환자의 진료비 및 치료비 부담까지 경감시킬 수 있는 효과가 있는 것이다.
따라서, 본 발명에 따르면 유전성이 강하면서도 단일 유전자 결함에 의해 발병하는 CMT 질환에 대하여 유전자 검사를 통한 정확한 조기 진단이 가능하며, 정확 한 진단에 따라 최근 개발되고 있는 치료방법을 조기에 적용하여 치료할 수 있고, 나아가 정확한 병인에 따른 맞춤치료까지 가능하게 된다. 또 본 발명은, 아직 세계적으로도 유전성 신경질환의 유전자 진단시스템의 개발이 이루어지지 않은 상태에서 한국인의 CMT 질환의 유전적 원인을 먼저 분석하고 그 자료를 바탕으로 유전자 진단 키트를 개발함으로써 우리 국민에게 인종적 특성을 감안한 양질의 의료 서비스가 제공되는 토대가 될 수 있다.
<110> CHUNG, Ki Wha
CHOI, Byung Ok
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except for 17p11.2-p12 duplication
<160> 78
<170> KopatentIn 1.71
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(R)
<400> 64
tctctaggca gggaagtgtg ggc 23
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(F)
<400> 65
ccagccgtgg gaatccaggt c 21
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(R)
<400> 66
tctgacactt tgggcagctc tac 23
<210> 67
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(F)
<400> 67
cagaggttcg actcccagag gtg 23
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(R)
<400> 68
gccatctcag gcattttagg gag 23
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(F)
<400> 69
tgaggtgaaa ctcccgaagg tgc 23
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(R)
<400> 70
ggctgcagac agggaagtgt tac 23
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(F)
<400> 71
ccaagctagg gagggcagag tc 22
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(R)
<400> 72
caaacttggg gagagcaaac ctg 23
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(F)
<400> 73
cctcaggcaa ggtagaggtg gc 22
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(R)
<400> 74
gtcacggtgg gcatcttaaa gac 23
<210> 75
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(F)
<400> 75
agcaggctac agggttcagg tgcgac 26
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(R)
<400> 76
ggaacttggg tgacttctct ctgac 25
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(F)
<400> 77
gtccgcttgc cacgtgtagg c 21
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer(R)
<400> 78
ctgccagccc tggtcagtca c 21
Claims (10)
- PMP22 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 318에서 티민이 결실되어 아미노산 서열위치 106(알라닌)에서부터 프레임쉬프트(frameshift)가 일어난 돌연변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 CMT1의 진단방법.
- MPZ 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 352에서 구아닌이 아데닌으로 치환되어 아미노산 서열위치 118에서 아스파라긴산이 아스파라긴으로 대체된 돌연변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 CMT2의 진단방법.
- MPZ 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 449-1에서 구아닌이 티민으로 치환되어 일어난 3'-스플라이스 부위 돌연변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 CMT1의 진단방법.
- MPZ 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 706에서 아데닌이 구아닌으로 치환되어 아미노산 서열위치 236에서 리신이 글루탐산으로 대체된 돌연변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 CMT2의 진단방법.
- Cx32 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 407에서 티민이 시토신으로 치환되어 아미노산 서열위치 136에서 발린이 알라닌으로 대체된 돌연변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 CMT1의 진단방법.
- Cx32 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 502에서 티민이 시토신으로 치환되어 아미노산 서열위치 168에서 시스테인이 아르기닌으로 대체된 돌연변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 CMT1의 진단방법.
- NEFL 유전자의 뉴클레오티드 서열위치 1001에서 티민이 시토신으로 치환되어 아미노산 서열위치 334에서 루이신이 프롤린으로 대체된 돌연변이를 검출하는 것을 특징으로 하는 CMT2의 진단방법.
- Cx32, PMP22 및 MPZ 유전자의 돌연변이를 검출하는 서열번호 1 내지 34의 17개 프라이머쌍을 포함하는 유전성 신경질환의 진단키트.
- EGR2, NEFL 및 PRX 유전자의 돌연변이를 검출하는 서열번호 35 내지 78의 22개 프라이머쌍을 포함하는 유전성 신경질환의 진단키트.
- Cx32, PMP22, MPZ, EGR2, NEFL 및 PRX 유전자의 돌연변이를 동시에 또는 순차적으로 검출할 수 있도록 서열번호 1 내지 78의 39개 프라이머쌍을 포함하는 유전성 신경질환의 진단키트.
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020040052653A KR100613038B1 (ko) | 2004-07-07 | 2004-07-07 | 염색체 17ｐ11.2-ｐ12 지역의 중복을 제외한 유전자돌연변이를 발병 원인으로 하는 ＣＭＴ 질환의 진단방법및 진단키트 |
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| KR100613038B1 KR100613038B1 (ko) | 2006-08-16 |
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ID=37106078
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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| KR (1) | KR100613038B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018088694A3 (ko) * | 2016-11-14 | 2018-08-09 | 주식회사 툴젠 | 인위적으로 조작된 sc 기능 조절 시스템 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP0512181A1 (en) | 1991-05-07 | 1992-11-11 | N.V. Innogenetics S.A. | Process for the in vitro diagnosis of chromosomal anomalies liable to be correlated with CMT1A disease |
| US5306616A (en) | 1991-06-06 | 1994-04-26 | Baylor College Of Medicine | Molecular diagnosis of autosomal dominant charcot-marie-tooth disease |
| US5645993A (en) | 1993-09-16 | 1997-07-08 | University Of Utah | Deletion in chromosome 17p11.2-12 which causes the disorder hereditary neuropathy with liability to pressure palsies |
-
2004
- 2004-07-07 KR KR1020040052653A patent/KR100613038B1/ko not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018088694A3 (ko) * | 2016-11-14 | 2018-08-09 | 주식회사 툴젠 | 인위적으로 조작된 sc 기능 조절 시스템 |
| RU2768043C2 (ru) * | 2016-11-14 | 2022-03-23 | Тулджен Инкорпорейтед | Искусственно созданная система управления функцией шк |
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| Publication number | Publication date |
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| KR100613038B1 (ko) | 2006-08-16 |
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