KR20050123162A - 세포자멸사 유도를 위한 ｎ-알킬글리신 삼량체의 규명 - Google Patents
세포자멸사 유도를 위한 ｎ-알킬글리신 삼량체의 규명 Download PDFInfo
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Abstract
인간 암세포에서 세포 주기를 정지시키고 암 치료에 유용한 세포자멸사를 유도하는 능력을 가진 N-알킬글리신 삼량체. 상기 N-알킬글리신 삼량체와 탁솔의 병용.
Description
본 발명은 N-알킬글리신의 삼량체 라이브러리의 스크리닝으로부터 유래된, 본원에서 N10-13-10C 및 N13-13-1OC 라고 명명되는 2 가지 슈도펩티드의 규명, 합성 및 정제에 관한 것이다. 본 화합물은 인간 암세포에서 세포 주기를 정지시키고, 이어서 세포자멸사를 유도하는 능력을 가진다.
세포 증식은 세포외 성장 신호, 세포 크기, 및 DNA 본래의 모습을 통합하는 다수의 체크포인트와 관련한 정연되고, 단단히 조절된 과정이다. 체세포 주기는 DNA 합성기 (S 기) 및 단일 세포가 2 개의 딸세포로 분리되는 유사분열 기로 분리된다. 상기 기는 2 개의 갭 기 (gap phase) (G1 및 G2) 에 의해 분류된다.
인간 몸에 있는 대다수의 세포는 비-분리성, 최종적으로 분화된 상태인 GO 기에 존재한다. 그러나, 적절한 외부 자극, 예컨대 성장 인자, 세포-세포 접촉 및 세포 외부 기질로의 부착은 사이클린-의존성 키나아제 (Cdk) 의 촉매 활성 및 따라서 복제 기원의 형성을 조절한다. 특정 Cdk 에 의한 pRb 의 인산화는 E2F/DP 로의 결합을 손상시키고, G1 로부터 S 기로의 진행을 허용하고 (Chellappan, s.P., 등, 1991), Cdk 억제자, 예컨대 p15INK4b, p16INK4a, p21Cip1, 및 p27KIP1 에 의해 소극적으로 조절된다 (Sherr, C.J. 및 Roberts, J.M. , 1995). DNA 합성의 성공적인 완료 후, 세포는 유사분열을 위한 준비에 있는 G2 기에 들어간다. 일단 시작되면, DNA 복제는 마쳐져야 한다. G1 제한점은 유사분열을 통해 세포 주기를 성장 인자 의존성 이른 G1 및 늦은 G1 으로부터 성장 인자 독립성 기로 분류한다. 신호전달 경로는 이른 G1 기 세포가 제한점을 통과하여 최후의 세포 분리를 수행하는지 아니면, 불충분한 신호전달력때문에, 세포 주기를 빠져나와서, G0 로 들어가거나 또는 세포자멸사로 들어가는지 결정한다. 프로- 및 항-세포자멸사 신호의 전체적인 균형이 세포의 운명을 결정한다.
신생 세포는 세포 손실을 최소화하거나, 즉 세포자멸사를 억제하고/하거나 탈조절된 증식을 향상시키는 항상성 기작을 혼란시키는 유전적 변경을 획득한다. 인간 암세포의 공통적인 특징은 p16 의 불활성화, 사이클린 D 의 과발현 및/또는 pRb 의 불활성화이다 (Hall, M. 및 Peters, G., 1996). 종양 세포 및/또는 종양 성장을 지지하는 비종양 세포 예컨대 내피 세포에서의 세포자멸사의 유도는 암 치료법에서 가장 중요한 목표이다. 암세포는 통상 세포자멸사 머시너리의 일부 성분에서의 돌연변이로 인해 세포자멸사에 더욱 저항적이다.
탁솔은 종양학에서 현재 이용되는 광범위한 항신생 스펙트럼을 가진 약물 중에 있다. 탁솔은 미세소관을 안정화시키고, 튜불린으로 되돌아가는 탈중합을 억제하고, 미세소관 동적의 운동학상 붕괴를 야기함으로써 G2/M-기 정지를 유도한다. 탁솔은 또한 유전자 전사 (예를 들어 bax, bak), 사이클린-의존성 키나아제, c-jun N-말단 키나아제 (JNK/SAPK) 및 bc1-2 의 인산화의 활성화를 유도하는 아직 잘 설명되지 않은 여러 기작을 통해 세포자멸사를 유도할 수 있다 (Srivastava, R.K 등, 1999). 탁솔은 암에서뿐만 아니라 정상적인 건강한 세포에서 세포자멸사 유도로 인한 심각한 이차 효과를 가진다.
도 1. 화합물 N10-13-10C, N13-13-10C, N4-13-10C 및 N5-13-10C 는 HT29 증식을 억제시킨다. 탁솔은 N10-13-10C 및 N13-13-10C 의 효과를 방해한다. (A, B) HT29 세포를 탁솔 (11 nM) 이 있게 또는 없이 다양한 농도에서 펩토이드와 함께 키웠다. MTT 측정을 처리한 지 72 시간 후 수행하였다. 대조군 세포의 증식에 비해 증식 억제가 N4-13-10C 및 N13-13-10C (A.), N5-13-10C 및 N10-13-10C (B.) 에서 보여진다. IC50 값은 각 펩토이드에 대해 특이적이다. N10-13-10C 및 N13-13-10C 는 HPLC 에 의해 정제된 펩토이드였고, 주요 및 활성 분획에 상응하였다. N4-13-10C 및 N5-13-10C 펩토이드를 HPLC 에 의해 정제하지 않았다. (C) HT29 세포를 단계 희석액의 탁솔로만 또는 IC50 값의 N13-13-10C (35 μM) 또는 N10-13-10C (40 μM) 와 병용하여 처리하였다. 증식을 처리한 지 72 시간 후 MTT 측정법으로 측정하였다. 100% 의 임의값을 비처리된 배양물의 밀도계측학적 비율로 지정하였고, 모든 다른 값을 그 참조에 대해 묘사한다. 값은 6 (n=6) 개의 복제품 (replicate) 의 평균이다.
도 2. N10-13-10C 및 N13-13-10C 는 프로-세포자멸사 펩토이드인 반면, N4-13-10C 및 N5-13-10C 는 아니다. 세포 주기 프로파일을 DNA 염색으로 분석하였다. HT29 세포를 N4-13-10C (100 μM), N5-13-10C (100 μM), N10-13-10C (40 μM), N13-13-10C (35 μM), 탁솔 (11 nM) 또는 네거티브 대조군으로서 DMSO 의 존재 하에 72 시간 동안 키웠다. GO/G1, S, G2/M 또는 하위G1 피크의 세포의 분획을 상술한다.
도 3. N10-13-10C 및 N13-13-10C 의 특정 프로 세포자멸사 효과. (A) 표 1 에 상술된 IC50 값에서 N10-13-10C 또는 N13-13-10C 로 처리한 지 72 시간 후 HT29, LoVo, MDA.MB.435 및 그의 폐 전이성 유도체 폐 2 및 폐 6 을 포함하는 다양한 세포주에서 하위G1 피크 분석. (B) 1, 5, 10, 20, 30 및 35 또는 40 μM 에서 각각 N10-13-10C 또는 N13-13-10C 로 HT29 세포의 처리 72 시간 후 하위G1 피크의 투여량-반응 분석. 둘 다, 떠있고 부착하는 세포를 수합하고, 고정하고, 프로피디움 요오다이드로 염색하였고, DNA 함량을 유세포분석법으로 평가하였다. 저이배 DNA 함량, 즉, 하위G1 피크를 가진 세포의 분획을 나타낸다.
도 4. (A) N10-13-10C (40 μM), N13-13-10C (35 μM) 및/또는 탁솔 (11 nM) 로 HT29 세포를 24 시간, 48 시간 및 72 시간 동안 처리한 후 세포 주기 프로파일의 시간 코스 분석. 하위G1 (짙은 청색), GO/G1 (적색), S (황색), G2/M (청색) DNA 함량을 가진 세포의 분획을 총 세포수의 % 로서 나타낸다. (B.) N13-13-10C 펄스 실험. HT29 세포를 35 μM N13-13-10C 로 1, 3, 6, 24, 48 또는 72 시간 동안 일시적으로 처리하고, 72 시간 이하 동안 생성물이 없는 배지에 되돌려 놓았다. DNA 염색을 유세포분석법으로 분석하였다.
도 5. 이른 세포자멸사의 검출. DMSO (우측 패널), N13-13-10C, 35 μM(중앙 패널), 또는 탁솔, 11 nM (좌측 패널) 로 처리한 지 40 시간 후 아넥신 V 측정. HT29 처리된 세포를 아넥신 V-FITC 및 PI 로 염색하고, 유세포분석을 하였다. 아넥신 V 포지티브 (수직선) 및 PI 포지티브 (수평선, 로그값) 세포의 형광 도트 블로트를 나타낸다. 수의 백분율로서 나타낸 세포 분포는 하기를 지시한다 : 이른 세포자멸사 세포, 1 사분면 Q1 (AnV+/IP-) ; 죽은 세포, Q2 (AnV+/IP+) ; 살아있는 세포, Q3 (AnV-/IP-) ; 괴사하는 세포, Q4 (AnV-/IP+).
도 6. (A) JNK 는 N13-13-10C 처리 후에 활성화된다. HT29 세포를 N13-13-10C (35 μM) 로 1, 3, 6 및 24 시간 동안 처리하고, 모으고, 면역블로팅하여 SAP/JNK MAP 키나아제 활성을 평가하였다. 웨스턴 블로트를 처음 JNK-포스포 특정 항체로 프로브하고, 벗기고, 판-JNK (pan-JNK) 항체 및 액틴으로 재프로브하여 총 단백질 레벨을 표준화하였다. JNK 의 인산화를 N13-13-10C 처리한 지 3 - 6 시간 후 관찰하였다. (B) Bcl-xL 은 N10-13-10C 처리 후에 인산화에 의해 후번역적으로 변형되지 않는다. HT29 세포를 N10-13-10C (40 μM), 탁솔 (11 nM) 또는 둘 다를 병용하여 3, 6 및 24 시간 동안 처리하였다. 떠있고 부착하는 세포로부터 추출물을 Bcl-xL, Bax 및 액틴에 대해 면역블로팅하여 총 단백질 로딩을 표준화하였다.
도 7. N10-13-10C 및 N13-13-10C 는 G1 세포 주기 정지를 유도하는 반면, N4-13-10C 및 N5-13-10C 는 그렇지 않다. (A) T98g 세포를 FCS 단독으로 또는 N10-13-10C (100 μM), N13-13-10C (100 μM), 올로무신 (100 μM), 에토포시드 (5 μM) 또는 탁솔 (30 nM) 과 병용하여 19 시간 동안 동조시키고, 재개시하였다. 세포 주기 프로파일을 프로피디움 요오다이드 DNA 염색으로 평가하고, 유세포분석법으로 분석하였다. G1, S, G2/M DNA 함량을 가진 세포의 분획을 총 세포수의 %로서 나타낸다. (B. 및 C.) 동조된 T98g 세포를 FCS 단독으로 또는 N4-13-10C, N5-13-10C, N10-13-10C, N13-13-10C, 올로무신 또는 에토포시드의 단계 희석액과 병용하여 19 시간 동안 재개시하고, 마지막 2 시간 동안에는 BrdU 로 표지하였다. BrdU 혼입을 항-BrdU 항체를 이용하여 ELISA 로 평가하였다. 100% 의 임의값을 비처리된 배양물에 의해 DNA 합성의 밀도계수학적 비율로 정하고, 모든 다른 값을 그 참조에 대해 지정한다. 값은 3 (n=3) 개의 복제품의 평균이다.
도 8. GO/G1 체크포인트와 관련된 단백질의 발현. (A.) HT29 세포를 N10-13-10C (40 μM) 또는 N13-13-10C (35 μM) 로 1, 3, 6 및 24 시간 동안 처리하고, 모으고, 면역블로팅하여 pRb-Ser780 (PpRb) 에서 총 pRb 레벨 또는 Cdk4 특정 인산화를 평가하였다. 웨스턴 블로트를 처음 pRb-Ser780 인산화 특정 항체로 프로브하고, 벗기고, 판-pRb 항체 및 튜불린으로 재프로브하여, 총 단백질 레벨을 표준화하였다. (B.) T98g 세포를 혈청 기아에 의해 동조시키고, 10% FCS 및 DMSO (C), N13-13-10C (100 μM) 또는 탁솔 (30 nM) 로 15, 17, 24 또는 29 시간 동안 재개시하였다. 총 단백질 추출물의 웨스턴 블로트를 p130, pRb, p107, Cdk2, cycA, p27, p21 및 액틴으로의 항체로 프로브하였다. 비인산화된, 저인산화된뿐만 아니라, 고인산화된 pRb 를 검출한다 (화살표). (C.) HT29 세포를 N13-13-10C (40 μM) 또는 대조군으로서 DMSO 로 24 및 48 시간 동안 처리하였다. 면역블로트를 Cdk2, cycA, p21, p27 및 액틴으로의 항체로 염색하였다.
표 1. N10-13-10C 및 N13-13-10C 는 HT29, LoVo, K562, T98g, MDA.MB.435 및 그의 폐 전이성 유도체 폐2 및 폐6 을 포함하는 인간 암세포주의 패널에 대해 성장 억제적 특성을 가진다. 각각의 세포주에 대해 N10-13-10C, N13-13-10C, N4-13-10C 및 N5-13-10C 에 대한 IC50 을 처리한지 72 시간 후 MTT 측정법으로 결정하였다 (n.d. 로서 상술되지 않는 한).
언급된 문헌
본 발명의 발견은 화합물 예컨대 N10-13-10C 및 N13-13-10C 가 세포 주기 및 세포자멸사 머시너리를 조절함으로써 작용하고, 따라서 화합물 또는 그의 유도체가 암의 예방 및/또는 치료 및 다른 증식 질환의 치료를 위한 제제로서 선호할만하게 이용될 수 있다는 것을 말한다. 더욱이, 규명된 상기 화합물은 세포자멸사 과정의 유도와 관련된 추가의 분자적 표적의 연구에 툴을 제공한다.
2 가지 화합물 예를 들어 N-알킬글리신의 삼량체의 조합 라이브러리의 스크리닝으로부터 유래된 N10-13-10C 및 N13-13-10C 는 G1 정지를 유도하고, 세포자멸사를 유도할 수 있었다.
N10-13-10C 및 N13-13-10C 화합물은 암 예컨대 인간 대장선암 (human colon adenocarcinoma), 인간 교모세포종 (human glioblastoma), 만성 골수성 백혈병 (chronic myelogenous leukemia), 인간 유방암 (human breast cancer) 및 폐암 (lung cancer) 을 대표하는 인간 암세포주의 패널에 대항하여 성장 억제성 특성을 가진다. 규명된 화합물은 유세포분석법 및 아넥신 V 측정법을 병용하여 DNA 단편화에 의해 결정되는 바와 같은 세포자멸사의 유도자로서 규명되었다. 세포자멸사는 화학요법제가 암세포의 성장을 억제하는 것을 통한 중요한 세포성 기능이다.
더욱 상세하게는, N10-13-10C 및 N13-13-10C 는 지수적으로 증가하는 세포 또는 혈청 기아에 의해 GO/G1 기에 동조된 세포에서 G1 세포 정지를 유도한다. N13-13-10C 에 의해 유도된 세포 주기 진행에서 G1-정지는 pRb 및 p130 과인산화의 억제와 관련되었다. 더욱이, pRb, p107, cycA, 및 그의 활성화 파트너 Cdk2 의 E2F 의존성 단백질 발현에서 두드러진 감소가 관찰되었다. 결국, CKl, p21Cip1 및 p27kip1 의 과발현이 나타났다. p27kip1 레벨은 유비퀴틴-프로테오좀 경로에 의해 주로 조절되는 것으로 생각된다 (Hengst, L. 및 Reed, S.I., 1996 ; Shirane, L. 등, 1999). 신규-항암제로서 작용하는 특정 프로테아좀 억제자의 잠재성은 현재 집중적인 연구하에 있고, 따라서 추가의 분석이 p27kip1 의 축적을 설명하고, N10-13-10C 및 N13-13-10C 의 활동 기작을 정의하기 위해 수행될 것이다. p27kip1 발현은 종양의 광범위한 스펙트럼의 진단에서 독립적인 예후 인자인 것으로 보고되어 왔다. 인간 종양에서 p27kip1 발현의 감소 또는 결핍은 다양한 악성 종양의 높은 공격성 및 불량한 예후와 관련되어 있다 (Lloyd, R. V. 등, 1999 ; Karter 등, 2000). p27kip1 의 이소 (ectoptic) 과발현은 이식 모델에서 종양 발달을 유도하는 것을 실패하는 것과 관련되어 있다 (Chen J. 등, 1996). 따라서, N10-13-10C 및 N13-13-10C 는 암 치료법을 위한 가장 중요한 후보이다.
다른 목표 중에서 화합물의 선택을 위한 처음의 스크린은 다른 효과 중에서 탁솔의 활동을 시너지할 수 있었던 규명 화합물을 설명하였다. 선택된 측정법에서, 탁솔 효과를 시너지하는 화합물의 혼합물을 규명하는 것이 가능하였다. 일부 혼합물은 세포 증식의 억제자인 것으로 발견되었고, 탁솔과 병용해서 상기 억제가 방해되었다. 본 발명에서, 우리는 세포 증식을 억제하고, 지수적인 세포 및 혈청 기아에 의한 G0/G1 기에 동조된 세포에서 G1 세포 정지를 유도하고, 세포자멸사를 유도할 수 있는 화합물의 규명을 설명한다. 상기 화합물은 그것들을 항암 약물로서 자격을 주는 선호할만한 치료성 프로파일을 가진다.
화합물이 세포 주기의 G1 정지를 유도하는 것이 지수적인 세포 및 GO/G1 동조된 세포 둘 다에서 관찰되고, pRb 및 p130 의 저인산화와 관련되어 있다. 더욱이, pRb, p107, cycA, 및 그의 활성화 파트너 Cdk2 의 E2F 의존성 단백질 발현에서 두드러진 감소가 관찰된다. 결국, p21Cip1 및 p27kip1 의 동시수반하는 유도가 검출된다. 화합물의 프로-세포자멸사 효과는 아넥신 V 염색 및 DNA 저이배수성에 의해 수행되었고, 하위-G1 특정으로서 규명되었다. 화합물의 또다른 특징은 그것이 인산화에 의해 bcl-xL 을 불활성화시키지 않는다는 것이다.
10.648 화합물을 함유하는 펩토이드 라이브러리의 스크리닝을 위해, N-알킬글리신 올리고머 분자 (펩토이드) 의 삼량체의 조절된 혼합물이 이용되었고, 4 가지 위치 스캐닝 포맷하에 수행되었다. 화학적 다양성은 22 개의 상이한 일차 아민에 의해 위치 R1, R2 및 R3 의 치환을 통해 도입되었다. 66 가지 조절된 혼합물은 R1, R2, R3 정의된 위치에 따라 3 가지 상이한 하위군으로 분류되었다. 라이브러리는 HT29 인간 대장선암 세포로 세포성 증식 측정법에서 스크리닝되었다. 화합물은 단독으로 또는 낮은 투여량의 탁솔 (11 nM) 과 함께 테스트되었다. 배양한 지 72 시간 후, 세포의 생존성을 MTT 측정법으로 측정하였다.
일부 혼합물은 탁솔과 병용해서 상기 억제가 다소 방해되는 반면, 세포성 증식의 억제자인 것으로 발견되었다. 투여량-반응 커브가 구축되고, 6 가지 혼합물 ; R1 위치에서 4 가지 상이한 아민, R2 위치에서 1 가지 아민 및 R3 위치에서 1 가지 아민이 규명되었다. 다음, 4 가지 화합물이 합성되고, N4-13-10C, N5-13-10C, N10-13-10C 및 N13-13-10C (N4, N5, N10 및 N13 으로 약칭되기도 함) 과 같은코드된 명명법에 따라 불리워졌다. 상기는 N-말단 잔기에서 각각 달랐다. 모든 4 가지 화합물은 테스트 시스템에서 세포성 증식을 억제하였으나, 탁솔은 N10-13-10C (도 1. B) 및 N13-13-10C (도 1. A) 에 대해서만 화합물의 효과를 예방하였다. N13-13-10C 는 IC50 = 35 μM 로 가장 잠재적인 증식 억제자였고, 다음으로는 N10-13-10C, IC50 = 40 μM 이고, 다음 IC50 = 100 μM 로 N4-13-10C 및 N5-13-10C 였다.
N10-13-10C 및 N13-13-10C 가 그의 IC50 에서 탁솔의 단계적인 희석액과 병용되어 측정되는 경우, 화합물의 잠재된 항-증식 효과가 탁솔만의 경우에 대해 관찰되었다 (도 1. C).
화합물에 의해 유도된 증식 억제는 인간 대장선암 (HT29 및 LoVo), 인간 교모세포종 (T98g), 만성 골수성 백혈병 (K562), 인간 유방선암 (MDA.MB 435 및 그의 폐 전이성 유도체 폐 2 및 폐 6) 을 포함하여 여러 세포주에서 평가되었다. 4 가지 화합물로 처리된 지 72 시간 후에 수득된 세포성 증식 억제에 대한 IC50 값은 (MTT 측정법) 표 1 에 반영된다.
N10-13-10C 및 N13-13-10C 는 72 시간 처리 후 유세포분석적 DNA 분석 및 하위-G1 피크 검출에 의해 결정된 바와 같이 HT29 세포에서 세포자멸사를 유도할 수 있었다. 반면, 하위-G1 피크가 N4-13-10C 및 N5-13-10C 처리 세포에서는 관찰되지 않았다 (도 2). 상기 관찰은 HT29 세포에만 제한된 것은 아니었다. N10-13-10C 및 N13-13-10C 는 HT29 및 MDA.MB.435 폐 2 유도체 세포에서 가장 높은 세포자멸사 (50-70%) 를 유도하였다 (도 3. A). 선암 LoVo 세포, MDA.MB.435 및 그의 폐 6 유도체는 약 20-30% 세포자멸사를 나타낸 반면, N4-13-10C 및 N5-13-10C 는 나타내지 않았다.
HT29 세포는 N10-13-10C 또는 N13-13-10C 의 증가하는 투여량으로 72 시간 동안 처리되었고, 하위 G1 피크가 유세포분석법에 의해 검출되었다. 도 3. B. 에서 나타낸 바와 같이, HT29 에서 N10-13-10C 및 N13-13-10C 처리는 투여량-의존성 세포자멸사를 초래하였다.
시간-코스 분석이 N10-13-10C 및 N13-13-10C 의 세포자멸사 특징을 검출하기 위해 수행되었다 (도 4. A). 세포자멸사는 48 시간 후 이미 HT29 처리된 세포에서 분명하였고, 72 시간째에 N10-13-10C 에 대해서는 20% 및 N13-13-10C 에 대해서는 약 40% 로 측정된 가장 높은 투여량에서 최대에 도달하였다. 더욱이, 두 가지 화합물만 배양 중에 24 시간 후 G1-기에서 세포의 백분율을 증가시키는 것으로 보였고, 반면 G2/M 축적은 시간에 관찰되지 않았다. 그러나, 낮은 투여량의 탁솔과 병용해서 N10-13-10C 또는 N13-13-10C 로 처리된 세포 수의 약 60% 는 G2/M 기에 유지되어 있었고, 이는 탁솔만 처리한 경우와 비교해 증가된 백분율이었다. 상기는 HT29 세포에 있어서 탁솔의 항-증식 효과의 N13-13-10C 의 잠재된 효과를 설명할 것이다 (도 1).
DNA 염색의 분석은 시간 펄스 동안에 N13-13-10C 또는 N10-13-10C 로 처리된 HT29 세포에서 수행되었다. 다음, 세포는 72 시간 이하 동안에 약물이 없는 배지로 되돌려졌다. 도 4. B 에서 나타낸 바와 같이, 최소한의 24 시간 펄스의 N13-13-10C 가 세포자멸사의 역행할 수 없는 유도를 유도하기 위해 필요하다. N13-13-10C 로 1, 3 및 6 시간의 짧은 시간 펄스 동안에 처리된 세포는 대조군 세포와 구별되지 않는 세포 주기 프로파일을 나타낸다.
세포자멸사에서 이른 사건은 아넥신 V, 포스파티딜세린에 대해 높은 친화성을 가진 인지질-결합 단백질을 통해 모니터링될 수 있는 세포막의 내부에서 외부판으로 포스파티딜세린의 전좌이다. 아넥신 V-FITC 검출 측정법은 N13-13-10C 에 의해 HT29 세포상에서 유도된 이른 세포자멸사의 개시를 규명하기 위해 수행되었다. 아넥신-V 검출법의 시간-코스 분석은 N13-13-10C (35 μM) 로 40 시간 처리 후 14% 의 초기 세포자멸사 세포 (IP 네거티브, 아넥신 V 포지티브) 를 나타내었다. 상기는 대조군 세포에 비해 3.5 배 증가를 나타내고, 탁솔 처리된 세포와 유사하다 (도 5).
JNK 가 다양한 스트레스 요인에 반응하여 세포자멸사의 활성화를 위한 세포내 신호를 조정한다고 이전에 보고되었기 때문에 (Tournier 등, 2000 ; Xia 등, 1995 ; Minden A., 및 Karin, M., 1997 ; Ip, Y. 및 Davis, R.J., 1998 ; Chen 등, 1996 ; Johnson 등, 1996 ; Verheij 등, 1996 ; Park 등, 1997), HT29 세포가 N10-13-10C 또는 N13-13-10C 로 처리되었다. 웨스턴 블로트 분석은 JNK 가 JNK-인산화 특정 항체로 블로트의 배양 후 관찰된 바와 같이 3 내지 6 시간 후에 활성화되었음을 나타내었다 (도 6. A).
항-세포자멸사 Bcl-2 단백질은 미토콘드리아로부터 시토크롬 c 방출을 예방하고, 그로 인해 세포 생존을 유지한다고 당업계에 공지되어 있다. 반면, 탁솔은 미세소관-안정화제이고, Bcl-xL 및 Bcl-2 의 JNK 의존성 인산화를 유도한다고 기술되어 있다 (Razandi 등, 2000 ; Srivastava 등, 1999). 상기 인산화는 항-세포자멸사 Bc1-2 단백질의 불활성화를 조정한다. JNK 활성화가 N10-13-10C 또는 N13-13-10C 단독으로 또는 탁솔과 병용하여 처리된 HT29 세포에서, 단백질의 Bcl-2 과의 일원인 Bcl-xL 의 인산화와 관련되어 있는지를 평가하기 위해 시간-코스 분석을 수행하였다. 더 느린 이동 밴드가 인산화된 bcl-xL 에 상응하는 탁솔-처리된 HT29 세포 추출물에서 검출되었다. 상기 효과는 N10-13-10C 처리된 세포에서는 나타나지 않았다 (도 6. B). 더욱이, 탁솔과 병용하여, N10-13-10C 처리는 탁솔 유도된 Bcl-xL 과인산화를 방해하지 않았다. 동일한 양상이 N13-13-10C 처리된 세포에서 관찰되었다 (데이타는 나타내지 않음). bcl 과의 프로-세포자멸사 일원인 Bax 는 HT29 세포의 N10-13-10C 및/또는 탁솔 노출 후에 증가되지 않았다.
이미 언급된 바와 같이, GO/G1 기에서 세포에서 약간의 증가가 24 시간 후에 N10-13-10C 또는 N13-13-10C 처리된 세포에서 관찰되었고 (도 4. A) 상기 효과는 세포 주기에서 특정 체크포인트 (들) 에서의 세포의 정지로 인한 것으로 예상된다. 실험적으로 상기 발견은 동조된 세포로 세포성 모델에서 화합물을 분석하도록 구체화되었다. T98g 세포는 72 시간 후에 MCDB 105 배지에서 혈청 기아에 의해 G1 기 (82%) 에서 정지되었다. 10% 혈청 재첨가 시, 세포는 세포 주기로 다시 들어가게 되었다. FCS 도입 19 시간 후, 세포의 50% 초과가 S-기에 있었고, 단지 20% 만이 G1 에 머물러 있었다. 혈청 첨가의 순간에 배양물에 N10-13-10C 또는 N13-13-10C 를 첨가하면 S-기 도입을 저지하였다 (도 7. A). 약 40% 의 세포가 G1 에 머물러 있었다. 결론적으로, N10-13-10C 및 N13-13-10C 둘 다 세포 주기 DNA 분석에 의해 결정된 바와 같이 비동조 또는 동조 세포 배양물에서 G1 정지를 유도할 수 있었다. 비교로, cdk2 억제자인 올로무신 (Olomucine) 은 G1 에서 세포의 80% 를 유지하였다. 토포이소머라제 Ⅱ 억제자 에토포시드 처리된 세포는 세포 주기의 S 기에서 정지되었다 (세포 수의 85%). 탁솔이 G2/M 정지를 유도하기 때문에, 그의 작용은 G1/S 체크포인트에 독립적이고, 처리 19 시간 후 세포 주기 프로파일에 영향을 주지 않는다.
세포 주기의 G1 정지를 확인하기 위해, 우리는 BrdU 혼입 측정법에 의해 DNA 합성을 분석하였다. 화합물 N4-13-10C, N5-13-10C, N10-13-10C, N13-13-10C, 에토포시드 또는 올로무신의 단계적인 희석액을 도 7. A. 에서 기술된 바와 같이 동조된 T98g 세포에서 측정하였다. 정지된 세포는 17 시간 동안 혈청만 또는 테스트 화합물과 함께 재-첨가, 이어서 2 시간 10 μM BrdU 와 병용함으로써 세포 주기 재도입으로 유도되었다. 도 7. B 및 C 에서 나타낸 바와 같이, 올로무신은 BrdU 혼입의 매우 강한 억제자이고 (IC50 = 50 μM), DNA 염색에 의해 관찰된 G1 기에서 82% 세포와 관계있다 (도 7. A). DNA 합성 억제 랭킹은 N13-13-10C (IC50 = 150 μM), N10-13-10C (IC50 = 100 μM) 및 에토포시드 (IC50 = 200 μM) 에 이어진다. N5-13-10C 는 어느 정도 BrdU 혼입을 억제하는 반면 (180μM 에서 30%), N4-13-10C 는 그렇지 않다.
세포 주기 진행은 여러 기작을 통해 그의 조절을 유지하고, 그 중 하나는 체크포인트 단백질 예컨대 망막모세포종 pRb 와 관계 있다. pRb, p130 및 p107 은 소위 포켓 단백질의 과를 구성하나, 결국 단지 pRb 만 G1/S 체크포인트 조절의 중심에 있다 (Harrington 등, 1998). 그의 비인산화된 형태에서 pRb 는 S-기 진행에 필수적인 유전자의 전사를 조절하는 전사 인자인 E2F 에 결합하고, 억제시킨다. 유사분열 자극 후, pRb 는 사이클린 D/cdk4 에 의해 부분적으로 인산화되고, 사이클린 E 발현을 위해 충분한 E2F 를 방출한다. 추가로, 사이클린 E/cdk2 는 pRb 를 완전히 인산화시켜서, 자유 E2F 를 방출하고, S-기로의 E2F-의존성 진행을 촉진하였다.
N10-13-10C 또는 N13-13-10C 처리된 세포에 의해 유도된 G1-정지 분석 시, pRb 의 인산화 상태와의 관계가 주목되었다. N10-13-10C 및 N13-13-10C HT29 처리된 세포의 pRb 발현의 시간-코스 분석은 웨스턴 블로트에 의해 수행되었다. 우리는 Ser780 에서 pRb 의 특정 cycD1/cdk4 인산화를 분석하였다 (Kitagawa 등, 1996). Ser780 에서 상기 pRb 인산화는 전체 pRb 레벨과 비교해 HT29 세포의 N13-13-10C 처리 후 감소하지 않았다 (도 8. A). 상기 결과는 cycD1/cdk4 활성이 손상되지 않고, cycE/Cdk2 활성이 어느 정도 억제된 것을 나타낼 것이다. 더욱이, pRb 레벨은 배양한 지 24 시간 후 대조군과 비교해 화합물-처리 세포에서 감소되었다.
포켓 단백질, 사이클린 및 Cdk 의 단백질 발현에 있어 동조된 T98g 세포에서 N13-13-10C 및 탁솔의 효과는 G1 체크포인트와 관련되었다. HT29 세포에 대해 도 8. A 에서 나타낸 바와 같이, N13-13-10C 로의 T98g 세포의 처리는 pRb 과인산화를 예방하고, 전체 pRb 레벨을 감소시켰다 (도 8. B). 반면, p130 또한 저인산화된 상태로 남아 있는 한편, 전체 레벨은 증가된다. 결국, p107 레벨은 하향조절된다. E2F 조절된 유전자 예컨대 cycA, p107 및 pRb 의 발현은 하향조절된다. pRb 인산화의 시간 코스는 cycE/Cdk2 활성의 억제에 의한 G0/G1 정지와 잘 연관되어 있다. pRb 하향조절은 세포자멸사과 연관된다.
3 μM 또는 30 μM, N10-13-10C 또는 N13-13-10C 의 존재 하에 cycD, Cdk4 및 pRb 단백질을 함유하는 33Pan 퀴나아제 (Qinase) 측정법이 수행되었다. pRb 인산화의 억제가 상기 측정법에서 관찰되지 않았고, 이는 cycD/Cdk4 활성이 N10-13-10C 또는 N13-13-10C 에 의해 영향을 받지 않았음을 확인시켰다 (도 8. A).
우리는 cycA 단백질 레벨 및 pRb 저인산화가 N10-13-10C 또는 N13-13-10C 처리된 세포의 세포 추출물에서 감소한다느 것을 관찰하였었다 (도 8). 상기 화합물이 Cdk2 활성의 직접적인 억제자인지 평가하기 위해, Cdk2 에 대한 시험관 내 키나아제 측정법이 수행되었다. 두 화합물 중 어느 것도 3 μM 또는 30 μM 에서 cycA-Cdk2 키나아제 활성을 억제할 수 없었다.
Cdk 가, 세포 주기를 통해 단백질 인산화 및 진행을 촉진시키기 위해 사이클린에 의한 활성화와 함께 Tyr/Thr 잔기의 인산화에 필요하다는 것이 당기술분야에 공지되어 있다. Cyc/Cdk 활성은 CKI 예컨대 p15INK4b, p16INK4a, p21Cip1 및 p27KIP1 에 의해 소극적으로 조절된다 (Sherr, C.J. 및 Roberts, J.M., 1995). 우리는 웨스턴 블로트에 의해 G1/S 전이 체크포인트에서 세포의 도입을 조절하는 것으로 알려진 p21Cip1 및 p27KIP1 의 레벨을 분석하였다 (도 8. B). p27KIP1 및 p21Cip1 둘 다 어셈블리 Cdk4-6/CycD 복합체의 잠재자로서 기술되어 있다 (LaBaer 등, 1997). 반면, p27kip1 및 p21Cip1 은 모든 Cdk2 복합체의 잠재적인 억제자이고, 그의 활성을 완전히 억제시키기에 충분한 p21Cip1 의 한 분자이다 (Hengst 등, 1998 ; Adkins 등, 2000). 정상적인 세포에서, p27kip1 의 양은 GO 기 동안에 높으나, 이는 특정 유사분열 인자, 예컨대 TGFβ, p53 또는 AMPc 에 의해 이끌어진 G1/S 기로 재도입 시 급격히 감소한다 (Poon, R. Y. 등, 1995). p27kip1 의 강행된 발현은 G1 기에서 세포 정지를 초래한다 (Polyak, K 등, 1994 ; Toyoshima, H. 및 Hunter, T., 1994). 웨스턴 블로트는 T98g 세포에 N13-13-10C 처리의 15 시간 후 p27kip1 의 적절한 유도를 나타내었고, 이는 저인산화된 pRb 의 검출에 필적하였다.
p21Cip1 의 분석은 N13-13-10C 처리의 17 시간 후 피크 레벨을 지시하였다. p21Cip1 및 p27Kip1 의 과발현 또한 24 시간 및 48 시간 동안 N13-13-10C 로 처리된 HT29 세포에서 관찰되었다 (도 8. C). p21Cip1 은 p53 의 다운스트림 조정자이기도 하고 (Haapajarvi 등, 1999) HT29 세포는 돌연변이된 p53 을 품는 반면, T98g 세포는 p53 에 대해 야생형이며 ; p21Cip1 발현의 유도는 p53 독립적이었음을 지시한다. 더욱이, p53 레벨은 N13-13-10C 처리 후에 변경되지 않는다.
추가의 실시예
N -알킬글리신의 라이브러리의 합성. 66 가지 조절된 혼합물에서 10.648 화합물의 라이브러리가 고체상에서 위치적 스캐닝 포맷을 이용함으로써 합성되었다. 22 가지 시판하는 일차 아민의 모음이 라이브러리에서 목적하는 화학적 다양성을 도입하는데 이용되었다. 상기 합성의 상세한 것은 어디에나 기술되어 있다 (W00228885). 간단히, 링크 아미드 수지 (Rink amide resin) (Rapp Polymere, 0.7 meq.) 로부터 출발하여 8-단계 합성 경로가 Fmoc 보호기의 초기 방출과 연관되었다. 다음, 특별한 일차 아민 또는 22 가지 아민의 등분자 혼합물을 이용하여 클로로아세틸 클로라이드로 아실화에 이어 클로로메틸 중간체의 상응하는 아민화의 연속 단계가 적절히 수행되었다. 상기 모든 반응은 이중으로 수행되었다. 마침내 생성물이 트리플루오로아세트산-디클로로메탄-물 혼합물을 이용하여 수지로부터 방출되었고, 용매는 증발되었고, 잔류물은 스크리닝을 위해 10 ㎎/㎖ 의 농도로 동결건조되고 10% 디메틸술폭시드 (DMSO) 에서 용해되었다.
N13-13-10C 및 N10-13-10C 의 합성. 상기 화합물은 고체 지지체로서 폴리스티렌 링크 아미드 AM RAM 수지 (0.6 g, 0.7 mmol/g, 0.42 mmol 의 로드 (load)) 를 이용하여 10 ㎖ 폴리프로필렌 주사기에서 합성되었다. 탈보호 : 수지를 담근 후, DMF (디메틸포름아미드) 에서 20% 피페리딘의 5 ㎖ 을 함유하는 용액을 첨가하고, 혼합물을 25℃ 에서 30 분 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, DMF (3 × 5 ㎖), iPrOH (3 × 5 ㎖) 및 DCM (디클로로메탄) (3 × 5 ㎖) 로 세척하였다. 아실화 : 수지를 5 ㎖ 의 DCM-DMF (2:1) 에서 클로로아세트산 (198 mg, 2.1 mmol) 및 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (2.1 mmol) 의 용액으로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하고, 여과시켰다. 수지를 배수하고, DCM (3 × 5 ㎖), iPrOH (3 × 5 ㎖) 및 DMF (3 × 5 ㎖) 로 세척하였다. 아민 커플링 : 5 ㎖ 의 DMF 에서 페네틸아민 (2.1 mmol) 및 트리에틸 아민 (2.1 nmol) 의 용액을 수지에 첨가하고, 현탁액을 25℃ 에서 3 시간 동안 교반하였다. 상층액을 제거하고, 혼합물을 배수하고, DMF (3 × 3 ㎖), iPrOH (3 × 3 ㎖) 및 CH2Cl2 (3 × 3 ㎖) 로 세척하였다. 두번째 및 세번째 아실화 단계 및 아민 커플링이 상기 기술된 바와 같이 수행되었다. 상기 2 가지 아민 커플링은 N13-13-10C 의 경우 4-메톡시페네틸아민 (2.1 mmol), 및 N10-13-10C 의 경우 세번째 아민화 단계에서 페네틸아민을 이용하여 수행되었다. 절단 : 수지를 60:40:2 (v/v/v) TFA/DCM/H2O 의 혼합물로 25℃ 에서 30 분 동안 처리하였다. 절단 혼합물을 여과하고, 합해진 여과물을 풀 (pool) 하고, 용매를 감압하에 증발로써 제거하였다. 상기 모든 방법을 이중으로 수행하였다.
분석 및 구조 데이타
분석을 1 ㎖/분의 유속에서 Kromasil 100 C8 (15 × 0.46 ㎝, 5 ㎛) 칼럼을 이용하여 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 에 의해 수행하였다. 용매 A 는 H2O 에서 0.07% TFA (트리플루오로아세트산) 를 함유하는 아세토니트릴 (CH3CN) 및 0.1% TFA 를 함유하는 용매 B 로 이루어졌다. 분석 조건은 1 ㎖/분의 유속 및 λ 220 ㎚에서 2 분 20% 용매 A, 20 내지 80% 에서 17 분 및 80% 용매 A 에서 1 분에서 구축되었다.
세포. HT29 및 LoVo (인간 대장선암) 및 MDA.MB.435 세포 및 그의 유도체 MDA.MB.435 폐2 및 MDA.MB.435 폐6 (인간 유방선암) 세포를 10% 태아 소 혈청 (FCS) 을 함유하는 DMEM-F12 배지에서 배양하였다. 인간 교모세포종 T98g 만성 골수성 백혈병 K562 세포가 10% FCS 를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 성장되었다. 모든 세포를 그의 지수적인 성장기에서 이용하였고, EZ-PCR 미코플라즈마 (Mycoplasma) 테스트 키트 (Biological Industries) 로 미코플라즈마 프리로 테스트하였다.
세포성 측정법. 조합 라이브러리를 HT29 인간 대장선암 세포로 세포성 증식 측정법 상에서 스크리닝하였다. 화합물을 단독으로 또는 낮은 투여량의 탁솔 (nM) 과 함께 테스트하였다. 배양한 지 3 일 후, 세포의 생존성을 MTT 측정법 (3-4,5-디메틸-2-티아졸리-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로미드) 으로 측정하였다. MTT 를 세포 배양물에 최종 농도 1 ㎎/㎖ 에서 첨가하고, 37℃ 에서 4 시간 동안 배양한 다음, 세포 파쇄 (cell lysis) 를 15% SDS/DMF (v/v) 로 측정하였다. 570 ㎚ 에서 MTT-포르마잔 및 630 ㎚ 에서 참조 필터의 분광 측광학적 측정은 세포의 생존성의 정량화를 가능하게 한다. 화합물 단독으로 인한 증식 억제를 탁솔 플러스 화합물 처리된 배양물에서 관찰된 억제와 비교하였다.
아넥신 V 측정법. 처리된 세포를 EDTA 0.02% in Hank's balanced Salt Solution (HBSS) 으로 모으고, HBSS 에서 세척하고, 다음 1% BSA (소 태아 혈청) 을 함유하는 PBS (포스페이트 완충 식염수, phosphate buffered saline) 에서 세척하고, 최종적으로 1% BSA 를 함유하는 아넥신 V 배양 완충액 (10 mM HEPES 7.4 ; 140 mM NaCl ; 2.5 mM CaCl2) 에서 재현탁시켰다. 105 개의 세포를 5 ㎕ 아넥신-V FITC (Bender MedSystems) 와 실온에서 암실에서 1 시간 동안 배양하였다. 죽은 세포를 2 ㎍/㎖ 에서 프로피디움 요오다이드 (PI) 로 염색하였다. 분석을 유세포분석기로 즉시 수행하였다.
DNA 분석. 화합물로 처리된 떠있고 부착하는 세포를 트립신처리에 의해 수합하고, PBS로 2 회 세척하였다. 세포를 얼음-냉각된 에탄올 70% 로 -20℃ 에서 하룻밤 동안 침투시켰다. 세포를 PBS 에서 세척하고, 0.5 × 106 세포/㎖ 로 맞추고, 37℃ 에서 30 분 동안 20 ㎍/㎖ 프로피디움 요오다이드 및 2 ㎕/㎖ RNase DNase-프리와 배양하였다. 세포를 4℃ 에서 하룻밤 동안 유지시킨 다음, 유세포 분석기로 분석하였다. 유세포 분석 실험을 Epics XL 유세포 분석기(Courter Corporation, Hialeah, Florida) 를 이용해 수행하였다. 기계를 표준 사양 : 샘플의 흥분 (excitation) 을 15 ㎽ 파워에서 표준 488 ㎚ 공기-냉각 아르곤-이온 레이저를 이용해 수행함으로 세팅하였다. 포워드 스캐터 (FSC), 사이드 스캐터 (SSC) 및 PI 에 대한 적색 (620 ㎚) 형광을 획득하였다. 광학 배열을 10 ㎚ 형광 비드 (Immunocheck, Epics Division) 로부터 최적화된 신호를 기반으로 하였다. 기계의 안정성의 대조군으로서 시간을 이용하였다. 적색 형광을 1024 단일파라미터 히스토그램 상에 투사하였다. 그의 면적 대 피크 형광 신호에 의해 단일 세포를 게이팅하여 응집물을 배제하였다. 단일 형광 히스토그램 상에서 DNA 분석 (배수성 분석) 을 Multicycle software (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA) 를 이용해 수행하였다.
웨스턴 블로팅. 떠있고 부착하는 세포를 모으고, 펠렛을 RIPA 완충액 (50 mM Tris/HCl 7.4, 250 mM NaCl, 0.5% Igepal CA630, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 ㎍/㎖ 레우펩틴 (leupeptin), 50 mM NaF, 0.1 mM Na3VO4) 또는 데옥시클로레이트 완충액 (10 mM 포스페이트 완충액 7.4, 0.1 mM NaCl, 0.5% 데옥시클로레이트, 1% Igepal, 0.1% SDS, 1 mM PMSF) 에 재현탁시켰다. 단백질 농도를 RIPA 추출물에 대한 BCA 단백질 측정법 키트 (Pierce) 또는 데옥시리보클로레이트 추출물에 대한 Bradford 측정법 (BioRad) 으로 결정하였다. 총 단백질 (20 - 30 ㎍/레인) 을 SDS-PAGE 로 분리하고, PVDF 막 (Gellman) 에 이동시키고, BCI-xL (Transduction); Bax (Santa Cruz); JNK (Santa Cruz); 포스포-JNK (Cell Signaling); pRb (Pharmingen); pRb-포스포 Ser780 (Cell Signalling); p130 (Santa Cruz); p107 (Santa Cruz); Cdk2 (Santa Cruz); p27kip1 (Santa Cruz); p21Cip1 (Santa Cruz); 액틴 (Sigma); 또는 튜불린 (ICN) 에 대한 항체로 프로브시키고, ECL 시스템 (AmershamPharmacia biotech) 으로 발색시켰다.
BrdU 측정법. 마이크로티터 플레이트에서 5000 세포/웰로 있는 T98g 교모세포종 세포는 MCDB 105 배지에서 혈청 부족에 의해 72 시간 동안 G1-기에서 정지되었다. 혈청 (10%) 재첨가에 의해, 세포를 화합물의 단계 희석액으로 17 시간 동안 처리하고, 이어서 10 μM BrdU 와 21/2 시간 동안 병용시켰다. BrdU 혼입, 즉 DNA 합성을 세포 증식 ELISA 시스템, vs. 2 (AmershamPharmacia biotech) 로 제조업자에 의해 기술된 바와 같이 정량하였다.
Cdk2/CycA-E 키나아제 활성의 테스트를 위한 키나아제 측정법. ELISA 플레이트를 200 ㎕ 의 블라킹 용액 (1% BSA, 0.02% Tween 및 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 PBS) 으로 4℃ 에서 하룻밤 동안 블라킹시켰다. 다음, 플레이트를 100 ㎕ 의 세척액 (0.02% Tween 및 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 PBS) 으로 각각 5 분씩 이어서 3 회 세척하였다. 다음, 플레이트를 실온에서 2 내지 4 시간 동안 건조시켰다. 최종 부피 60 ㎕ 내에서 4 ㎍ 의 히스톤 H1, 30 μM ATP, 2 mM DTT, 0.1 ㎕ ATP-P32, 800 nM GST-CDK2, 및 800 nM GST-사이클린 A 를 함유하는 키나아제 완충액 (Hepes 25 mM pH 7.4 및 MgCl2 10 mM) 내에서 키나아제 측정을 수행하였다. 측정을 체크되는 펩티드 혼합물의 상이한 농도의 존재 또는 부재 하에 수행하였다. 반응 배지에 800 nM 의 p21 을 첨가하여 억제 조절을 수행하였다. 혼합물을 37 ℃ 에서 30 분 동안 배양하였다. 배양 후, 각 혼합물의 50 ㎕ 를 도트 블로트 장치에 있는 니트로셀룰로스막에서 여과하였다. 다음, 샘플을 200 ㎕ 의 키나아제 완충액으로 세척한 다음, 35 ㎕ TCA 10% 로, 최종적으로 100 ㎕ TCA 10% 로 2 회, 이어서 100 ㎕ H2O 로 세척하였다. 상기 과정 후, 막을 실온에서 건조시켰다. 막과 연관된 방사능을 "Phosphor-imager" 로 검출하였다.
Cdk4/CycD1 키나아제 활성을 측정하기 위해, Cdk4 를 바쿨로바이러스 발현 시스템을 이용하여 재조합 GST-융합 단백질로서 Sf9 곤충 세포에서 발현시켰다. 키나아제 측정을 33PanQinase activity assay (ProQinase) 및 Beckman Coulter/Sagian robotic system 을 이용하여 50 ㎕ 반응 부피에서 96-웰 FlashPlate (MEN) 에서 수행하였다. 반응 칵테일은 20 ㎕ 의 측정 완충액 (50 mM Hepes-NaOH pH 7.5, 3mM MgCl2, 3mM MnCl2, 3 μM Na-오르토바나데이트, 1 mM DTT, 0.1 μM (33P)-dATP) ; 1 ㎍ pRb 단백질 ; 100 ng 효소 ; 및 10% DMSO 내의 5 ㎕ 의 테스트 화합물이었다. 반응 칵테일을 30℃ 에서 80 분 동안 배양하였다. 반응을 50 ㎕ 의 0.2% (v/v) H3PO4 로 정지시키고, 플레이트를 흡인기로 빨아내고, 0.9% (w/v) NaCl 로 2 회 세척하였다. 33P 의 혼입을 마이크로플레이트 섬광 계수기 (Microbeta, Wallac) 로 결정하였다.
Claims (9)
- 탁솔 (Taxol) 및 하기 화학식 Ⅰ 의 화합물을 포함하는 약학적 조성물 :(식 중 :R1 은 H 또는 OR' 이고R2 는 H, R" 이고R3 는 H, R" 이고R4 는 H, R", OR' 이고R' 는 C1 - C6 알킬 잔기이고R" 는 메틸, 에틸, 부팀임).
- 제 1 항에 있어서, R1 이 H, R2 가 OR', R3 가 H 이고, OR' 가 파라-위치에 있는 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R1 이 OR', R2 가 OR', R4 가 H 이고, OR' 가 파라-위치에 있는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, R4 가 H 인 조성물.
- 세포자멸사 유도용 의약의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
- 과다증식 질환 치료용 의약의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
- 화합물이 동시적으로 또는 순차적으로 적용되는 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
- 탁솔이 있는 일차 패키지 및 화학식 Ⅰ 의 화합물을 포함하는 이차 패키지를 포함하는 파트의 약학적 키트.
- 하기를 포함하는 암 치료 방법 :탁솔로 일차 치료를 수행하고 ;상기 암세포에서 세포자멸사를 유도하는 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 화합물로 환자에게 이차 치료를 수행함 (여기서, 일차 및 이차 치료는 임의의 순서 또는 동시적으로 수행됨).
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