KR20050086676A - 간질성 방광염을 치료하는 세포 조절 펩티드 - Google Patents

간질성 방광염을 치료하는 세포 조절 펩티드 Download PDF

Info

Publication number
KR20050086676A
KR20050086676A KR1020057008774A KR20057008774A KR20050086676A KR 20050086676 A KR20050086676 A KR 20050086676A KR 1020057008774 A KR1020057008774 A KR 1020057008774A KR 20057008774 A KR20057008774 A KR 20057008774A KR 20050086676 A KR20050086676 A KR 20050086676A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
peptides
amino acid
xaa xaa
bladder
Prior art date
Application number
KR1020057008774A
Other languages
English (en)
Inventor
티모시 씨. 퐁
알렉시스 이. 테
Original Assignee
상스타트 메디칼 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 상스타트 메디칼 코포레이션 filed Critical 상스타트 메디칼 코포레이션
Publication of KR20050086676A publication Critical patent/KR20050086676A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/046—Tachykinins, e.g. eledoisins, substance P; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 방광 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 방법은 간질성 방광염 및 관련된 질환의 치료법을 제공한다. 본 방법은 추가로, 히스타민 방출 감소, 물질 P 발현의 조정, 신경성장 인자 발현의 조정, 다양한 시토킨 수준의 조정, 및 요/혈액 배리어의 무결성 유지를 포함하는 간질성 방광염과 관련된 다양한 증후에 영향을 끼치는 치료법을 포함한다.

Description

간질성 방광염을 치료하는 세포 조절 펩티드 {CYTOMODULATING PEPTIDES FOR TREATING INTERSTITIAL CYSTITIS}
본 발명은 일반적으로 방광 질환을 치료하는 방법 및 조성물, 특히, 간질성 방광염 및 이와 관련된 상태의 치료와 연관된 치료법에 관한 것이다.
방광은 요의 저장, 요 구성물의 유지, 및 적절한 간격으로 요의 배출을 위한 막성 근육 기관이다. 이의 구조는 상피, 고유판(lamina propria), 고유 근육(즉, 배뇨근) 및 방광주위 연조직을 포함한 4 개의 기본적인 층으로 구성된다. 방광의 내부의 형성하며 요와 접촉하는 상피는 이행상피 또는 요로상피라고 칭하며 요와 혈액 사이의 화학적인 구배를 유지시키는 기능을 한다. 상피의 하부에 존재하는 것은 고유판, 즉, 결합조직과 혈관의 층이다. 얇으며 종종 불연속인 평활근의 층, 즉, 점막내 근육이 고유판 내부에 있다. 이러한 평활근의 표면층은 방광의 벽을 형성하는 두꺼운 평활근 다발로 구성되는 심층 근육인 고유근육 또는 배뇨근과는 구별된다. 방광주위 연조직은 방광의 외층을 포함하며 지방, 섬유조직 및 혈관으로 구성된다. 방광의 기능부전은 일반적이며, 감염된 개체에 쇄약효과를 줄 수 있다.
간질성 방광염(IC)는 병인이 공지되지 않은 방광질환이다. 임상증상은 만성 빈뇨, 절박뇨(urgency), 야간뇨, 및 방광/골반통을 포함한다. 본래 주로 중년의 여성에게서 나타나는 것으로 생각되지만, IC는 남녀 모두 및 모든 연령대에서 나타난다.
문헌에는 방광의 세포 규모 시험을 근거로 하여 두 가지 형태의 IC를 기재하고 있다. 비궤양성 IC, 즉, 가장 일반적인 형태는 방광의 수중방광확장시에 구상화(즉, 점상출혈)의 존재에 의해서 특성화된다. 궤양성 IC는 약 10%의 환자에서 발견되며, 방광벽상의 별모양의 점막 궤양화인 허너 궤양(Hunner's ulcer)의 존재에 의해서 정의된다. 그러나 상당한 수의 IC 환자는 세포 규모의 시험에서 증상이 없으며, 세포 규모 발견의 중증도와 임상 증상 사이의 신뢰할 만한 상관관계가 없다.
세포병리학적 지표는 노출된 상피, 고유판에서의 현저한 백혈구 및 혈장 세포 침윤, 혈관충혈, 배뇨층의 섬유증[문헌: MacDermott, J.P. et al., J. Urol. 145:274-278(1991)]이다. 그러나 이들 특징은 농뇨 및 작은 방광용량으로 진단된 환자중 작은 소그룹으로 제한되는 듯하다. 호중구가 궤양화와 관련하여 유일하게 관찰된다[문헌: Lynes, W.L. et al., Amer. J. Surg. Pathol. 14:969-976(1990)]. 대식세포는 염증 부위에 거의 존재하지 않으며, 염증성 침윤물은 배뇨증층에 거의 없다. 만성 염증은 임상 증상을 보이는 많은 환자에서 존재하지 않는다. 이러한 다양하고 비일관적 세포병리현상 때문에, IC의 진단은 상기 지표들을 조합하여 이용할 수 있다.
손상된 세포 통합성, 감염, 신경성 염증, 비만 세포 활성화, 및 자가 면역성을 포함하는 IC의 원인에 대한 다양한 이론이 있다. 몇가지 연구는 IC 환자에서의 증가된 외피의 투과성을 제시하고 있다[참고: Lavelle, J.P. et al., Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 278: F540-F553(2000)]. 감염된 방광은 점막 글리코사민노글리칸의 양적 변화, 외피의 초구조적 결합, 및 증가된 요 수송을 보인다. 통증 및 절박뇨는 KCl 용액의 방광내 점적주입시에 IC 환자 대부분에서 발생하여 손상된 외피 구조를 암시한다. 유사하게, 방광에 점적주입되고 그 후에 배출되는 요 용액은 대조군에 비해서 IC 환자에서 낮은 요 농도를 나타내어 감염된 대상에서의 증가된 점막 투과성을 나타낸다.
감염이 또한 병인으로 여겨지지만, 샘검 샘플의 PCR 분석은 병인성 박테리아의 존재를 검출하지 못했다[문헌: Keay, S. et al., J. Urol. 159: 280-283 (1998)]. 또한, IC 감염된 방광에서의 박테리아, 균류, 및 바이러스에 대한 분석은 비감염된 환자와의 어떠한 차이를 검출하지 못했다[문헌: Duncan, J.L. et al., Urology 49: 48-51(1997)]. 현재, 병인적 원인의 증거가 없다.
몇가지 연구는 뉴로펩티드 물질 P(Substance P) 및 이의 수용체, 뉴로키닌-1 수용체(NK-1 수용체)를 포함한 신경원성 염증의 IC에서의 역할을 제시하고 있다. 감각 신경의 자극은 비만세포에 의한 염증매개체 및 히스타민의 방출을 촉발시키는 것으로 공지된 물질 P의 방출을 유도한다. IC 동물 모델에서, 물질 P 수준은 방광 및 요에서 증가하며[문헌: Hammond, T.G. et al., Ann J. Physiol. Renal Physiol 278:1440-F451(2000)], 생검은 물질 P 함유 신결섬유의 증가된 밀도를 보였다. 물질 P의 방광내 투여는 마우스에서 방광 염증을 유발시키며, 감각섬유의 탈감작이 방광 하이퍼플렉시아(hyperflexia)를 감소시킨다. NK-1 수용체 길항제는 물질 P 매개된 방광염을 치료하거나 감소시키고, 방광 염증은 NK-1 수용체 녹아웃 마우스에서 약화된다[문헌: Saban, R. et al., Amer. J. Path. 156: 775-780 (2000)]. 물질 P 경로의 관련에 대한 추가의 암시는 IC 환자의 방광 생검에서 나타난 NK-1 수용체의 증가된 발현에 의해서 입증된다[문헌: Marchand, J. E. et, al., Br. J. Urol. 81:224-228(1998)].
물질 P의 가정된 역할은 IC를 유도하는 생리학적 과정에서 비만세포와 연관되어 있다. IC 방광은 배뇨층 및 점막하층에서의 비만세포의 수를 증가시키며, 비만세포의 수가 물질 P 함유 감각 신경 근처에서 증가한다. 비만세포증은 IC 환자의 30 내지 65%에서 존재하며, 히스타민과 트립타제의 수준이 상승한다. 흥미롭게도, 실험적으로 유도된 방광 염증은 비만세포 결핍 마우스 키트(W)/키트(W-v)에서 존재하지 않는다[문헌: Saban, R. et al., Physiol. Genomics 10:35-43 (2001); Saban, R. et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F202-F210 (2002)]. 감각 펩티드와 결부되어 비만세포의 수가 증가하면 비만 세포 매개된 면역반응이 유발된다는 이론이 있다. 그러나, 배뇨층에서의 비만세포의 현저한 존재는 IC에서의 외피의 손상된 상태를 설명하지 못한다. 더욱이, 염증성 세포는 배뇨층에서 거의 발견되지 않는다.
자가면역 유발이 IC에서 의심되는데, 그 이유는 IC와 자가면역 질환, 예컨대, 홍반성 루푸스, 알레르기성 천식, 다발성 경화증, 염증성 장 질환 및 조그렌 질환(Sjorgren's disease) 사이의 외피학적 연관 때문이다. 이러한 자가면역 질환은 IC 감염된 환자에서 과다하게 나타나고 있다. 그러나, IC 대상자의 말초혈액에서의 림프구 표현형(예, CD4/CD8 세포비)은, 자가면역 질환, 홍반성 루푸스, 원발성 담즙성 간경변, 또는 다발성 경화증에 대한 발견과는 대조적으로, 정상이다[문헌: MacDermott, J.P. et al., J. Urol. 145:274-278 (1991)]. 방광 생검의 조직학적 연구는 증가된 림프구 침윤물을 보이지만, 방광의 다양한 구조물에 존재하는 림프구의 형태와는 대조적이다[문헌: MacDermott et al., supra., ; Hanno, P. et al., J. Urol. 143: 278-281 (1990)]. 초기의 연구는 순환하는 방광 특이적 항체의 존재를 지적했지만, 후속되는 연구 결과는 상반되는 데이타를 제시히고 있어서, 이들 호르몬성 지표는 조직 손상의 간접적인 결과일 수 있음을 암시한다. 결과적으로, 면역 체계 조절이상과 IC 사이의 명확한 연관은 없다.
림프구 침윤물의 존재와 증가된 비만세포의 수는 IC에서의 염증성 네트워크의 일부 역할을 암시한다. 배양된 활성화 비만세포로부터 얻은 조절된 배지는 시토킨 TNF-α IL-1b, 및 IL-8, 및 유착 분자 ICAM-1의 요로상피 세포주 합성을 유도할 수 있다[문헌: Batler, R.A. et al., J. Urol. 168:819-825 (2002)]. 한편, 염증매개체는 IC로 진단된 환자의 요에서 현저하게 증가하지 않는다. 시토킨 IL-4, IL-10, IL-12, TNF-α, hGM-CSF, IL-1b 및 IFN-γ; 프로스타글란딘 E2, D2, 및 F2a; 및 트롬복산의 요중 농도는 비감염된 개체와 다르지 않다[문헌: Felson, D. et al., J. Urol. 152: 355-361 (1994); Peters, K.M. Adult Urology 54: 450-453 (1999)]. 활성 IC를 보이는 일부 환자는 상승된 수준의 시토킨 IL-2, IL-6, 및 IL-8을 보이지만, 주요 염증성 시토킨 TNF-α, 또는 IFN-γ의 경우는 아니다(Peters, K.M., supra). 염증성 침윤물이 결여된 배뇨층에서의 비만 세포의 우세, 및 대식세포의 일반적인 부재는 염증성 캐스케이드(cascade)와 IC 사이의 관련과 연관된다. 흥미롭게도, IC의 증상을 완화시키는데 일부 효과가 있는 BCG(바실리 칼메트-구에린: bacilli Calmette-Guerin)는 방광내 점적주입후에 요중의 IL-1, IL-2, IFN-γ 및 TNF-α의 수를 증가시키는 것으로 공지되어 있다[문헌: Peters, K.M. et al., supra; Bohle, A. J. Urol 144: 59-64(1990)].
IC의 치료법은 거의 없으며, 특히 공지되지 않은 질병의 원인에 따라서, 다양하다. 상기된 바와 같은, BCG는 IC 증후군을 치료하는데 일부 효과가 있다. 펜토산 폴리설페이트 나트륨(엘미론®:Elmiron®), 헤파린 유도체가 손상된 방광 외피를 회복시키고 보호하는데 유효한 것으로 사료되지만, 이것은 또한 비만 세포로부터의 히스타민의 방출을 억제한다[문헌: Chiang, G. et al., J. Urol. 164(6): 2119-2125 (2000)]. 디메틸 술폭시드(DMSO)는 방광통을 감소시키고 항염증 효과를 지니는 것으로 제시되고 있다. 면역억제제 시클로스포린[문헌: Forsell, T. et al., J. Urol. 155:1591-1593(1996)] 및 메토트렉세이트[문헌: Moran, P.A. et al., Aust N Z J Obstet Gynaecol. 39: 468-471 (1999)]는 IC 증후군을 완화시키는데 다양한 효과가 있다. IC에 대한 표준의 효과적인 치료법은 부재하지만, 다른 효능적인 치료학적 치료법이 본 기술 분야에서 요구되고 있다. 따라서, 본 발명은 IC의 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
4. 요약
본 발명은 방광의 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물, 특히 간질성 방광염(IC) 및 그와 관련된 상태를 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 펩티드 조성물이 면역 반응을 조절하고, 염증성 시토킨의 수준을 조절하고, p38 MAP 키나아제, JNK, TRAF, 및 IRAK에 의해서 매개된 신호전달 경로를 조절함을 포함하는 다양한 생물학적 활성을 지니는 것으로 공지되어 있다. 올리고펩티드의 다양한 성질은 히스타민 방출의 억제, 물질 P의 수준의 변경, 신경성장인자(NGF)의 수준 조절, 및 시토킨 TNF-α, IFN-γ, IL-6 및 IL-12의 수준 조절을 포함한 다양한 IC 증상에 영향을 주는데까지 확장된다. 조성물은 또한 감염된 조직으로의 다형핵 세포, T-세포, 및 비만 세포 침윤을 감소시키고, 방광의 요/혈액 배리어을 유지시키거나 회복시키는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 방법은 RDP58 올리고펩티드를 포함하는 치료학적 유효량의 조성물을 감염된 대상에게 투여함을 포함하여 IC를 치효하는 방법이다. 급성 및 만성 IC 형태가 본 발명의 조성물에 의해서 치료될 수 있다.
RDP58 올리고펩티드의 다양한 효과에 있어서, 본원에서 제공된 방법은, 또한 대부분이 상태의 진행에 기인되는 것으로 여겨지는, IC와 관련된 하나 이상의 증상을 조절, 바람직하게는 완화시키는 것에 관한 것이다. 일반적인 방법은 IC에 감염된 조직 또는 세포를 약제학적 유효량의 RDP58 조성물과 접촉시켜 질환의 증상을 완화시킴을 포함한다.
한가지 특징으로, 비만 세포는 약제학적 유효량의 RDP58 조성물과 접촉되어 질환 감염된 조직 또는 세포에서의 히스타민 수준을 억제 또는 감소시킨다.
또 다른 특징으로, 질환 감염된 조직 또는 세포는 약제학적 유효량의 올리고펩티드와 접촉되어 물질 P 수준을 감소시킨다.
또 다른 특징으로, 질환 감염된 조직 또는 세포는 약제학적 유효량의 올리고펩티드와 접촉되어 NGF 수준을 감소시킨다.
추가적으로, 질환 감염된 조직 또는 세포는 약제학적 유효량의 올리고펩티드와 접촉되어 시토킨 TNF-α, IFN-γ, IL-6 및 IL-12의 수준을 조절한다.
요/혈액 배리어의 통합성이 또한 약제학적 유효량의 본 발명의 조성물에 의한 치료에 의해서 유지 또는 회복될 수 있다. 올리고펩티드는 방광 투과성의 붕괴를 억제하고, 만성의 질환에서, 방광 투과 특성을 비감염된 방광의 투과 특성으로 회복시킨다.
RDP58의 조성물은 IC 또는 그와 연관된 상태를 치료하는데 효과적인 그 밖으리 제제의 사용을 포함한다. 병합 치료법은 스테로이드, 면역억제제, 트리시클릭 항우울제, 황산염화된 폴리사카라이드, DMSO, 캡사이신, 항히스타민제, 또는 이들의 혼합물의 사용을 포함한다.
RDP58 올리고펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 댜양한 약제학적 조성물이 치료를 위해서 제공된다. 담체는 감염된 대상, 조직 또는 세포에 투여하기 위한 부형제 또는 희석제, 특히, 방광내 전달을 위한 희석제를 포함한다.
펩티드의 투여는 올리고펩티드, 또는 목적하는 펩티드를 엔코딩하는 핵산의 감염된 조직 또는 세포로의 직접 적용 또는 투여에 의함을 포함하는 어떠한 통상의 수단에 의할 수 있다. 본 발명의 조성물의 방광내 점적주입이 바람직하다. 대안적으로는, 펩티드는 정맥내 및 비경구투여를 포함하여 펩티드를 방광에 전달하는 경로를 통해서 간접적으로 투여된다.
5. 도면의 간단한 설명
도 1은 리포폴리사카라이드(LPS), RDP58 펩티드(bc 1nL), LPS+RDP58 펩티드, 또는 매질 단독(대조군)으로 생체외 치료후의 방광 조직내 TNF-α의 수준을 나타낸다.
도 2는 LPS, 물질 P(SP), 또는 이오노마이신으로 유도된 래트 호염기구 백혈병 세포(RBL-2H3)으로부터의 히스타민 방출, 및 배양물중에서 히스타민 방출을 억제하는데 있어서의 RDP58의 효과를 나타낸다.
도 3A-3D는 실험적으로 유도된 IC의 급성형에서 생화학적 마커의 수준에 대한 RDP58 올리고펩티드의 효과를 나타낸다: 도 3A - TNF-α; 도 3B - IL-6; 도 3C - 물질 P; 도 3D- 히스타민 방출; 및 도 3E - NGF.
도 4는 실험적으로 유도된 급성 IC 모델에 FITC-덱스트린을 방광내 설치한 후에 FITC-덱스트린의 혈청 수준을 측정함으로써 측정된 방광 투과성을 나타낸다.
도 5A 및 도 5B는 다양한 치료상태하의 혈청에서 발견된 FITC-덱스트린의 수준 및 요/혈액 배리어의 통합성을 유지시키는 RDP58 올리고펩티드의 효과를 나타낸다. 표시되는 바와 같이, 급성 방광염은 동물에게 LPS를 설치함으로써 유도된다(즉, "LPS" 및 "RDP58"). 다양한 혈청 희석물의 형광을 도 5A에 나타낸다.
도 6은 PLS 또는 LPS+RDP58의 방광 설치 후의 혈청에서의 적절한 백분율의 FITC-덱스트린을 나타낸다. 백분율은 방광에 설치된 양과 비교한 혈청에서 발견된 FITC-덱스트린의 분율을 의미한다.
도 7A 및 도 7B는 만성 IC 동물 모델에서의 TNF-α 및 IL-6 발현에 대한 RDP58 펩티드의 효과를 나타낸다.
도 8은 만성 IC 동물 모델에서의 방광 투과성에 대한 RDP58에 대한 효과를 나타낸다.
도 9A 내지 도 9D 는 만성 IC 동물 모델에서의 헤마토실린-에오신 염색된 및 CD45 면역 염색된 방광 조직 절편을 나타낸다. 동물은 염수(대조군) 또는 LPS중 하나가 설치되었다.
도 10A 내지 도 10F는 만성 IC 동물 모델에 유일하게 염수가 설치된 동물로부터의 CD3 면역 염색된 방법 조직 절편을 나타낸다.
도 11A 내지 도 11H는 최종 LPS 설치 72 시간(도 11A 내지 도 11D) 또는 7일 (도 11E 내지 도 11F) 후의 만성 IC 동물 모델에서의 CD3 면역 염색된 방광 조직 절편을 나타낸다. 조직 절편은 염수 처리된 동물에 비해서 감소된 CD3 양성 세포의 존재를 나타낸다.
도 12A 내지 도 12D는 LPS에 노출되고 후속하여 RDP58 올리고펩티드로 치료된 만성 IC 동물 모델에서의 CD3 면역 염색된 조직 절편을 나타낸다(도 12A: RDP58 치료 24 시간 후; 도 12B: RDP58 치료 72 시간 후). RDP58 치료는 CD3 양성 세포의 감소를 유도한다.
6. 상세한 설명
6.1 간질성 방광염의 치료
본 발명은 간질성 방광염(IC) 및 그와 관련된 상태를 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 조성물은 PCT 공개 WO98/46633호 및 공동 계류중인 미국 특허원 제09/028,083호 및 제08/838,916호에 기재된 화합물에 관한 것이며, 본원에서는 상기된 특허원을 참조로 통합한다. 면역 반응을 조절하고 염증성 시토킨 생성을 억제하는 것으로 기재된 이들 올리고펩티드 화합물은 p38 MAP 키나아제, JNK, TRAF, 및 IRAK에 의해서 매개된 세포성 신호화 경로에 영향을 주는 것으로 추가로 공지되어 있다. 이러한 경로의 신호화는 다양한 질환 상태와 연관되어 있다. 본 발명에서는 RDP58 펩티드의 다양한 생물학적 활성은 IC의 다양한 증상을 조절하는 성질을 지녀서, 다양한 상태를 치료하는 치료제를 제공한다는 것이 밝혀졌다.
본원에 사용된 용어 "간질성 방광염" 또는 "IC"는 간질성 방광염의 하나 이상의 증상에 의해서 특정된 질병, 질환, 또는 상태를 의미한다. 증상은 임상 증후군(예, 빈뇨 및 절박뇨, 야뇨, 및 방광/골반통); 진단 지표(예, KCl 용액 설치에 대한 반응, 수중방광확장시의 구상화; 허너 궤양의 존재), 및 조직병리학적 지표, 예컨대, 림프구 침윤, 증가된 수의 비만 세포, 및 외피 구조의 변화(예, 방광 투과성)을 포함한다. 그 밖의 증상은 이로 한정되는 것은 아니지만 물질 P, IL-2, IL-6, IL-8, 글리코프로테인 51, 항증식인자, 신경성장인자(NGF); 히스타민, 및 그 밖의 질물[참조: Erickson, D.R., Urology 57(Supplement 6A): 15-21 (2001), 본원에서 참조로 인용됨]을 포함한 질환 마커의 발현 또는 존재에서의 변화이다. 한가지 증상이 IC의 지표일 수 있지만, 바람직하게는 하나 이상이 이용되며, 더욱 바람직하게는, 임상 증후군, 조직학적 지표, 및 분자/생화학적 마커의 조합을 포함한 증상의 조합이 이용된다.
본 발명의 펩티드 또는 올리고펩티드 조성물은 급성 및 만성 둘 모두의 IC 동물 모델에서 다양한 증상을 조절, 바람직하게는, 완화시키는 것으로 밝혀졌다. 완화는 질환 상태의 다양한 증상에 대한 변화를 반영하는 질환 상태의 개선이다. RDP58 펩티드는 염증성 시토킨의 수준, 특히 감염된 방광에서의 TNF-α 및 IFN-γ의 발현을 변경시키고; 비만세포로부터 히스타민 방출을 감소시키고; 물질 P 펩티드의 발현에 영향을 주고; 신경성장인자 (NGF)의 발현에 영향을 줄 수 있다. 조직학적 수준으로, RDP58에 의한 치료는 다형핵(PMN) 세포, T 세포, 및 비만 세포에 의한 침윤을 완화시키고; IC와 연관된 부종을 완화시키고; 방광내의 혈액/요 벽의 분해를 감소 또는 제한한다.
따라서, 본 발명은 RDP58 올리고펩티드를 포함하는 치료학적 유효량의 조성물을 감염된 대상에게 투여하여 IC를 치료하는 방법을 제공한다. 치료는 급성 IC 또는 만성 IC일 수 있다. 급성 IC는 비만 세포, 호중구, 대식세포 침윤과 연관이 있으며, T 세포 침윤은 일반적으로 만성 상태와 연관이 있다. 본원에 개시된 바와 같이, RDP58 펩티드는 급성 방광염 모델에서 다형핵 세포 및 비만세포 침윤을 제한하는 것으로 밝혀졌다. 만성 방광염의 경우, 목적 펩티드는 CD3 또는 CD45양성 세포의 존재에 의해서 측정되는 바와 같이 감염된 조직에서 T-세포 침윤을 감소시킬 수 있다. 급성 및 만성 상태에 대한 이러한 설명은 올리고펩티드로 치료할 수 있는 상태를 이로 제한하는 것이 아니며, 단지 질환 상태를 구별하는 본 기술 분야의 지식 상태를 반영하는 것을 이해해야 한다.
펩티드는 또한 IC와 연관된 하나 이상의 증상을 조절, 바람직하게는 완화하는데 사용된다. 질환 감염된 조직 또는 세포는 RDP58 올리고펩티드를 포함하는 치료학적 유효량의 조성물과 접촉되는데, IC의 증상을 조절 또는 완화하기에 충분한 양으로 접촉된다. 따라서, 한가지 특징으로, 펩티드는 히스타민 또는 그 밖의 비만세포 미립 내용물, 예컨대, 프로테오글리칸 및 세린 프로테아제의 방출에 의해서 표시되는 바와 같이 IC에서의 비만세포의 활성화를 감소 또는 억제하는데 사용된다. 비만세포 활성화는 케모킨, 시토킨, 및 지질 매개체(예, 프로스타글란딘 및 류코트리엔)의 합성이 이어지고, 이들은 추가의 시토킨 및 케모킨의 방출 및 염증성 세포, 예를 들어, 호염기구, 에이시노필(eisinophil), 및 대식세포의 보충을 촉진하여 만성 염증을 유도한다. 비만세포증은 IC에서 관찰되며, 실험적으로 유도된 방광염의 중증도는 비만세포 결핍 마우스에서 완화된다[문헌: Bjorling, D.E., J Urol. 162(1): 231-236 (1999)]. 본원에서 입증되고 있는 바와 같이, RDP58 펩티드는 비만세포로부터의 히스타민 방출 수준을 감소시키고, 또한 IC 감염된 조직에 존재하는 비만세포의 수를 감소시킬 수 있다.
또 다른 특징으로, RDP58 펩티드는 IC 감염된 조직 또는 세포에서의 물질 P 수준을 감소시키는데 사용된다. 물질 P는 방광벽으로부터 지속적으로 방출된다[문헌: Saban, R. et al., Br. J. Urol. 79:516-524 (1997)]. IC로 감염된 방광내에서 구심성 신경말단으로부터의 방출시에, 물질 P는 비만세포 활성화 및 히스타민 방출을 촉발시켜서, 질환상태를 유도하거나 악화시키는 것으로 사료된다. 이어서, 비만세포 탈과립화의 생성물이 감각 C 섬유를 활성화시켜 물질 P를 방출시켜서, 비만세포의 연속된 활성화를 위한 양성 피드백 루프를 생성시킨다[문헌: Suzuki, R. et al., J. Immunol. 163:2410-2415 (1999)]. 물질 P는 또한 뉴로키닌 수용체의 결합 및 활성화를 통한 감각경로에서의 매개체이며, IC와 일반적으로 연관되는 방광/골반통을 유발시킬 수 있다. 따라서, 추가의 양태로서, 목적 펩티드의 사용에 의해서 얻어지는 물질 P 수준의 감소는 질환과 연관된 통증을 감소시키는데 유리하다.
RDP58 펩티드는 또한 IC 감염된 조직 또는 세포에서의 신경성장인자(NGF)의 수준 또는 발현을 감소시키는데 사용된다. NGF 수준은 특발성 감각성 절박뇨 및 IC를 포함한 몇가지 방광 질환에서 증가한다[문헌: Lowe, E.M. et al., Br. J. Urol. 79(4):572-527 (1997)]. 신경성장인자는 구심성 신경을 감작시키고 방광 과활성을 유도할 수 있으며, 이는 IC로 정의되는 질환의 군에서 나타나는 증후군중 하나이다. 또한, NGF는 신경경로의 감작성을 증가시켜서, 질환상태에서의 통증을 유발시킬 수 있다(상기 로우(Lowe)의 문헌). 물질 P의 수준을 감소시키는 효과와 유사하게, 목적 펩티드의 사용에 의한 NGF의 감소는 또한 통증의 완화에 유리할 수 있다.
추가의 특징으로, RDP58 펩티드는 IC 감염된 조직 또는 세포에서의 다양한 시토킨, 특히, TNF-α, IFN-γ, IL-6, 및 IL-12의 수준을 감소시키거나 이들의 발현을 억제하는데 사용된다. IFN-γ와 함께 TNF-α는 염증 반응을 유발시키고 전파시키는 주요 염증성 시토킨이다. 이들 시토킨의 생성은 대식세포의 활성화를 유도하고, 이러한 대식세포는 이어서 IL-1을 포함한 추가의 전염증성 시토킨; TNF-α; IL-8을 포함한 케모킨; 및 매개체 IL-6, IL-12, 및 IL-18을 생성시킨다. 시토킨, 케모킨, 및 지질 매개체의 이러한 상호 연관된 네트워크는 T 림프구 및 대식세포의 추가의 활성화, 및 더욱 염증성인 매개체의 분비를 유도하는 혈액 함유 작용세포의 보충에 의한 염증성 캐스케이드를 증폭시키며, 이러한 더욱 염증성인 매개체는 궁극적으로 조직 손상을 유도한다. IL-6 및 IL-12는 조직 손상에 대한 호르몬 반응을 유발시켜서 염증성 반응을 유도할 수 있다.
또 다른 추가의 특징으로, RDP58 펩티드는 IC 감염된 방광의 요/혈액 배리어를 유지 또는 회복시키는데 사용된다. 방광염을 앓고 있는 방광의 외피는 비감염된 방광과는 상이한 구조 및 분자적 차이를 나타내며, 이는 점적된 요 또는 당에 대한 IC 환자의 증가된 점막 투과성에 의해서 입증되는 바와 같이 외피의 손상된 투과 특성을 유도할 수 있다[참조: Erickson, D.R. et al., J. Urol. 164(2):419-422 (2000)]. 이러한 점막 라이닝(lining)의 붕괴 및 요/혈액 배리어의 상응하는 손상은 추가로 IC 환자의 요에서의 혈액의 존재를 나타낸다. RDP58 펩티드에 의한 치료는 급성 및 만성 IC 모델에서 방광의 투과 특성을 유지 또는 회복시키는 것으로 밝혀졌다.
일반적으로, IC 및 이와 관련된 상태를 치료하는 방법은 약제학적 유효량 또는 치료학적 유효량의 RDP58 조성물, 또는 이의 혼합물을 환자 또는 대상자에게 투여함을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "치료"는 질환, 질병 또는 바람직하지 않은 상태의 치료학적 치료, 예방적 처리, 또는 억제 처리를 의미한다. 치료는 질병 증후군의 개시 전에 및/또는 질환의 임상적 증상 또는 그 밖의 증상 후에 적절한 형태의 목적 펩티드를 투여하여 질환의 중증도를 완화시키거나, 질환의 진행을 중단시키거나, 질환을 치료함을 포함한다. 질환의 예방은 바람직하게는 질환에 대한 증가된 감수성이 있는 대상자에서의 질병 또는 질환의 증상의 개시를 연장시키거나 지연시킴을 포함한다. 치료의 효과는 상기된 증상을 근거로 하여 측정한다.
치료제 또는 예방제로서의 사용에 있어서, RDP58 올리고펩티드는 단독으로 또는 그 밖의 치료제와 함께 사용될 수 있다. 이러한 문맥에서, 사용된 올리고펩티드는 이하 기재되는 바와 같은 단일의 올리고펩티드 서열, 또는 본 발명의 다른 올리고펩티드 서열들의 혼합물, 또는 본 발명의 펩티드의 천연 유사체를 포함하는 혼합물 중 하나이다.
질환 상태를 치료하는데 사용된 그 밖의 치료학적 또는 약제학적 활성제는 RDP58 올리고펩티드에 의한 치료의 보조제로서 사용될 수 있다. IC를 참조하여 설명하면, 올리고펩티드와 함게 유용할 수 있는 제제에는, 예시하기 위한 것으로 이로 한정되는 것은 아니지만, 스테로이드(예, 덱사메타손, 등), 면역억제제(예, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 등); 트리시클릭 항우울제(예, 아미트리프틸린, 독사핀); 황산화염된 폴리사카라이드(예, 펜토산 폴리설페이트 나트륨); 항히스타민(예, 히드록시진, 시메티딘, 등); DMSO; 및 캡사이신, C-섬유 구심성 신경독소가 포함된다[문헌: Fagerli, J., Can J Urol. 6(2):737-744 (1999)].
방광염이 병원균인 환경에서, 본 발명의 펩티드가 병원균을 제거하거나 사멸시키는 약물로 사용될 수 있다. 이들은 본 기술분야에 공지되어 있는 바와 같은 항생제, 항균제, 항원충제, 및 항바이러스제를 포함한다. 이들 약물은 본원에 기재된 펩티드에 의한 치료전에, 그러한 치료와 동시에, 또는 그러한 치료 후에 사용될 수 있다.
상기된 설명은 IC의 치료에 관한 것이지만, 본 발명의 방법 및 조성물은 IC에 대한 상기된 하나 이상의 증상에 의해 특성화된 비-간질성 방광염을 치료하는데 유용하다. 비-간질성 방광염에는 예를 들어, 방사선 방광염, 박테리아성 방광염, 화학적 방광염이 포함된다. 본원에 기재된 방사선 방광염은 세포 손상 용량의 방사선, 예컨대, 원발성 요로상피 신생물 또는 그 밖의 골반 악성종양(예, 전립선, 방광, 결장/직장)의 외부 또는 내부활성 방사선 치료에 사용된 이온화 방사선(예, x-레이, 및 γ-레이)에 대한 방광의 노출에 의해 유발되는 방광염을 의미한다. 박테리아성 방광염은 방광 및/또는 요도의 박테리아 감염증을 앓고 있는 방광염을 의미한다. 병원체로 의심되는 박테리아 병원균에는 대장균(E. coli.), 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 클렙시엘라 spp(Klebsiella spp), 또는 엔테로코씨(Enterococci)가 포함된다. 화학적 방광염은 독성 또는 자극성 화합물에 대한 방광의 노출에 의해서 야기되는 방광염을 의미한다. 예시적인 화학적 방광염은 화학치료 약물, 예컨대, 트리에틸렌티오포스포르아미드, 시클로포스프아미드, 미토마이신-C, 아드리마이신, 및 독소루비신 및 이의 유사 발루비신의 방광내 점적주입 또는 방광 이식에 의한 화학치료를 진행중인 방광암 환자에서 발견된다.
6.2 펩티드/올리고펩티드 조성물
IC를 치료하기에 적합한 RDP58 펩티드 조성물은 PCT 공개 WO 98/46633호 및 공동 계류중인 미국특허원 제09/028,083호 및 제08/838,916호에 기재된 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 포함할 것이며, 본원에서는 상기 특허원을 참조로 통합한다. 펩티드는 림프구 세포의 세포독성 활성을 억제하고, 염증성 시토킨의 생성 및 이들 시토킨와 관련된 염증성 반응을 억제하고, 헤메(heme)-함유 효소의 활성을 억제하고, 자가면역 질환의 발병의 위험이 있는 포유동물에서의 자가면역 질환의 개시를 지연시킬 수 있는 것으로 특성화된다.
RDP58 펩티드의 코어 서열은 3 내지 4 개의 소수성 아미노산, 특히 3개의 소수성 아미노산, 및 N-말단이 염기성 아미노산인 아미노산에 의해서 분리된 두 개의 염기성 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, C-말단 아미노산은 방향족 아미노산, 특히, 티로신이다. 특히 관심의 대상인 것은 올리고펩티드 코어 말단 아미노산중 하나 이상이 모노머 또는 올리고머 형태의 화합물일 수 있는 올리고펩티드 말단 아미노산인 것이다.
바람직하게는, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 RDP58 펩티드는 서열 B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr을 지닌 올리고펩티드이며, 여기서, B는 염기성 아미노산, 바람직하게는 하나 이상의 위치, 바람직하게는 두 위치에서 Lys 또는 Arg, 특히, Arg이며; J는 Gly, B 또는 5 내지 6개의 탄소원자의 지방족의 소수성 아미노산, 특히, Gly 또는 B이고; X는 지방족 또는 방향족 아미노산이다. 한가지 구체예에서, 3 개 이상의 X 아미노산 잔기는 동일한 비극성 방향족 아미노산이고, 바람직하게는 4 개 이상의 동일한 비극성 지방족 아미노산이며, 더욱 더 바람직하게는 5 개 이상의 동일한 비극성 지방족 아미노산이며, 가장 바람직하게는, 모두가 동일한 비극성 지방족 아미노산이다. 바람직한 구체예에서, 비극성 지방족 아미노산은 5 내지 6개의 탄소원자, 특히 6 개의 탄소원자, 특히, 비극성 지방족 아미노산 Val, Ile, Leu, 및 nL로 이루어진다. 따라서, 일부 구체예에서, X는 하전된 지방족 아미노산 이외의 아미노산, 바람직하게는, 극성 지방족 아미노산 이외의 아미노산이다.
B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr 펩티드 서열에서의 X에 의해서 나타낸 6 개의 아미노산중에, 바람직하게는, 3 이상이 5 내지 6개의 탄소원자의 지방족 아미노산이며, 더욱 바람직하게는, 4 개 이상이 5 내지 6 개의 탄소원자의 지방족 아미노산이고, 가장 바람직하게는, 5 개 이상이 5 내지 6 개, 더욱 바람직하게는 6 개의 탄소원자의 지방족 아미노산이다. 바람직한 구체예에서, 지방족 아미노산은 5 내지 6 개의 탄소원자의 비극성 지방족 아미노산, 특히, Val, Ile, Leu, 및 nL이다. 그 밖의 아미노산은 다른 비하전된 지방족 아미노산, 특히, 비극성 지방족 아미노산 또는 방향족 아미노산일 수 있다.
특히 관심의 대상인 조성물은 서열 Arg-U-X-X-Arg-X-X-X-J-Tyr을 지닌 RDP58 펩티드를 포함할 것이고, 여기서, 모든 기호는 비하전된 지방족 아미노산 또는 방향족 아미노산, 특히 비극성 지방족 아미노산 또는 방향족 아미노산을 포함하는, U를 제외한 상기 정의된 바와 같다.
올리고펩티드의 아미노산은 펩티드가 모든 아미노산에 이르기까지 D-입체이성체의 하나 이상의 아미노산을 지니도록 L- 또는 D-이성체형일 수 있다. 또한, 펨티드는 본 펩티드의 올리고머, 특히, 이의 이량체를 포함하거나, 이하 더 상세히 기재된 바와 같은 고리 구조인 시클릭 펩티드를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해서, L 또는 D-이성질체 형태의 아미노산은 이하 종류로 분류될 것이다:
1 지방족
(a) 비극성 지방족:
Gly, Ala, Val, nL, Ile, Leu
(b) 극성 지방족:
(1) 비하전됨:
Cys, Met, Ser, Thr, Asn, Gln
(2) 하전됨:
Asp, Glu, Lys, Arg
2. 방향족:
Phe, His, Trp, Tyr
여기서, Pro는 비극성 지방족 아미노산에 포함될 수 있지만, 일반적으로는 포함되지 않을 것이다. "nL"은 노르류신을 나타내며, 비극성 지방족 아미노산은 다른 이성질체로 치환될 수 있다.
예시적인 RDP58 펩티드에는 하기 펩티드가 포함된다:
nL=노르류신
RDP58 펩티드의 바람직한 구체예는 서열 Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Gly-Tyr을 포함하며, 여기서 nL은 노르류신이고, 글리신 이외의 모든 아미노산은 D-입체이성질체이다.
그 밖의 RDP58 펩티드는 1998년 4월 10일자 출원된 PCT 출원번호 PCT/US98/07231호, 1997년 4월 11일자 출원된 미국특허원 제08/838,916호, 및 1998년 2월 23일자 출원된 미국특허원 제09/028,083호에 기재되어 있으며, 이들 특허원은 본원에서 참조로 통합된다. 일반적으로, 본원에 기재된 용어 "RDP58 펩티드" 또는 "RDP58 올리고펩티드"는 상기 모든 펩티드 화합물을 포함함을 의미한다.
추가의 구체예에서, 다른 공지된 펩티드, 예컨대, HLA 펩티드 및 TCR 펩티드가 본 발명에서 본 RDP58 조성물의 성분으로 대안적으로 또는 추가적으로 사용될 수 있다. 이들은 HLA-B α1-도메인, 특히, 75 내지 84의 아미노산, 및 2 아미노산 이하의 아미노산이 치환된 이들 서열의 변이체를 포함한다(참조: WO95/13288; 미국특허 제5,723,128호; 제5,753,625호; 제5,888,512호; 제6,162,434호; 및 제6,436,903호; 상기 문헌을 본원에서 참조로 통합한다). 또한, 상기 서열 및 상기 서열로부터 2 이하의 돌연변이를 지니는 서열로 이루어진 사람 TCR-α 트랜스멤브레인 영역을 기초로 하는 서열을 포함한다(참조: 1995년 1월 16일자 출원된 오스트리아 특허 PN 0589호 및 PN 0590호, 상기 특허를 본원에서 참조로 통합한다). 이들 서열은 2개의 염기성 아미노산을 포함하고, 여기서, 2개의 염기성 아미노산은 4 지방족 소수성 아미노산에 의해서 분리되는데, 출원서에서는 3 내지 5개의 소수성 아미노산이 존재할 수 있다고 나타내고 있다. 용어 돌연변이는 하나의 아미노산이 다른 아미노산에 의해서 치환되거나 삽입 또는 삭제됨을 의미하며, 이들 각각은 하나의 돌연변이로 계수한다. 일반적으로, 본원에 사용된 용어 "펩티드" 또는 "올리고펩티드"는 상기된 모든 펩티드 화합물 뿐만 아니라 이의 유사체, 유도체, 및 융합 단백질 등을 포함한다.
본 발명의 펩티드는 당업자에게는 공지된 다양한 통상의 방법으로 변형될 수 있다. 펩티드의 말단 아미노기 및/또는 카르복실기는 알킬화, 아미드화, 또는 아실화에 의해서 변경되어 에스테르, 아미드 또는 치환된 아미노기를 제공할 수 있으며, 여기서 알킬 또는 아실기를 약 1 내지 30, 일반적으로는 1 내지 24, 바람직하게는 1 내지 3 또는 8 내지 24중 하나, 특히, 12 내지 18개의 탄소원자로 이루어질 수 있다. 이러한 변형은 통상의 화학적 합성 방법을 이용함으로서 수행된다. 펩티드 또는 이의 유도체는 아실화 또는 메틸화에 의해서 변경되어 화학적 특성, 예를 들어, 친지성을 변경시킬 수 있다. 아실화 방법, 특히, N-말단의 유리 아미노기를 아세틸화시키는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다. C-말단의 경우에, 카르복실기는 알콜에 의한 에스테르화에 의해서 변경되거나 아미드화되어 -CONH2, CONHR, 또는 CONR을 형성시키고, 여기서, 각각의 R은 히드록시카르보닐(1 내지 6개의 탄소원자)이다. 에스테르화 및 아미드화의 방법은 공지된 기술을 이용함으로써 수행된다. 그 밖의 변형에는 글루타밀 및 아스파라기닐 잔기의 각각의 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아민화; 프롤린 및 리신의 히드록실화; 세린 또는 트레오닌의 히드록실기의 포스포릴화; 및 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 아미노기의 메틸화가 포함된다[참조: T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co. San Francisco, CA, 1983].
또 다른 특징으로, 펩티드의 하나 또는 둘 모두의 말단이 친지성기, 일반적으로는 지방족 또는 아르알킬로서 8 내지 36, 일반적으로는 8 내지 24 개의 탄소원자 및 지방족 쇄에 산소, 질소 및 황인 2 미만의 헤테로원자로 구성된 지방족 또는 아르알킬로 치환될 수 있다. 이하 추가로 기재되는 바와 같이, 쇄는 포화되거나 불포화되며, 바람직하게는 3개의 부위 이하, 일반적으로는 2개의 부위 미만의 지방족 불포화 부분을 지닐 수 있다. 통상적으로는 시판중의 지방족 지방산, 알콜 및 아민이 사용될 수 있으며, 예컨대, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 및 미리스틸 알콜, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산 및 스테아릴 아민, 올레산, 리놀레산, 도코사헥사노산, 등이 사용될 수 있다(참조: 본원에서 참조로 통합되고 있는 미국특허 제6,225,444호). 길이가 14 내지 22개의 탄소원자인 비분지형의 천연지방산이 바람직하다. 그 밖의 친지성 분자에는 글리세릴 지질 및 스테롤, 예컨대, 콜레스테롤이 포함된다. 친지성기는, 지지체상에서의 합성 동안 빈번히, 올리고펩티드가 지지체에 부착하는 부위에 의존하여 통상적인 방법에 따라 올리고펩티드상의 적합한 작용기와 반응할 수 있다. 지질 부착은 숙주내로 펩티드 및 작용제를 투여하기 위해 올리고펩티드가 기타 치료제와 함께 리포좀의 내강내로 도입될 수 있는 경우에 유용하다. 친지성이 증가하면 내피 세포를 가로지르는 화합물의 수송을 증가시키는 것으로 또한 공지되어 있으며, 따라서 이는 이러한 화합물을 장 또는 혈류로부터 주위 조직으로 흡수시키는 것을 촉진하는 데에 유용하다.
추가의 구체예에 있어서, 펩티드의 N-말단 및 C-말단 중 어느 하나 또는 둘 모두는 전체 약 100개 이하, 일반적으로 전체 약 30개 이하, 더욱 일반적으로 약 20개 이하, 종종 약 9개 이하의 아미노산 만큼 신장될 수 있으며, 여기서 아미노산은 25% 미만, 더욱 일반적으로 20% 미만의 극성 아미노산, 더욱 특히 20% 미만의 하전된 아미노산을 지닐 것이다. 따라서, 어느 한 방향으로의 상기 서열의 신장은 주로 친지성 비하전 아미노산, 특히 비극성 지방족 아미노산 및 방향족 아미노산으로 수행된다. 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산 또는 D-아미노산과 L-아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다. 아미노산 신장의 개수에 대한 예외는 하기 기술된 바와 같이 올리고펩티드가 융합체 또는 키메라 단백질로서 발현되는 경우에 고려된다.
펩티드는 또한 올리고머, 특히 헤드(head) 대 헤드, 테일(tail) 대 테일 또는 헤드 대 테일일 수 있는 펩티드의 이량체의 형태로 존재할 수 있으며, 약 6개 이하의 펩티드 반복체로 존재한다. 올리고머는 모든 아미노산에 이르기까지 하나 이상의 D-입체이성질체 아미노산을 함유할 수 있다. 올리고머는 펩티드들 사이에 링커 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 링커 서열이 사용되는 경우, 적합한 링커로는 비하전 아미노산 및 (Gly)n (여기서, n은 1 내지 7임), Gly-Ser (예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n 및 (GGGS)n 이며, 여기서 n은 1 이상임), Gly-Ala, Ala-Ser, 또는 당 분야에 공지된 그 밖의 플렉시블(flexible) 링커를 포함하는 링커가 있다. Gly 또는 Gly-Ser의 링커가 사용될 수 있는데, 이는 이들 아미노산이 비교적 구조화되어 있지 않아서 개개의 펩티드와 세포 표적 분자와의 상호작용을 가능하게 하고 올리고머의 펩티드들 사이의 구조적 통기(pertubation)를 제한시키기 때문이다. 아미노산 이외의 링커는 올리고머 펩티드를 구성하기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
또한, 펩티드는 구조적으로 속박된 형태, 예를 들어 약 9 내지 50개, 일반적으로 12개 내지 36개의 아미노산의 환형 펩티드로 존재할 수 있으며, 여기서 특정된 아미노산 이외의 아미노산은 브리지(bridge)로서 존재할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 말단 시스테인의 첨가는 이황화물 브리지를 형성하게 하여 고리 펩티드를 형성시킬 수 있다. 몇몇 경우, 펩티드를 고리화시키기 위해 아미노산 이외의 물질을 사용할 수 있다. 이작용성 가교제가 펩티드의 둘 이상의 아미노산을 결합시키는 데에 유용하다. 그 밖의 고리 형성 방법은 문헌 [Chen, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5872-5876 (1992); Wu, T.P. et al, Protein Engineering 6:471-478 (1993); Anwer, M.K. et al., Int. J. Pep. Proein Res. 36:392-399 (1990); 및 Rivera-Baeza, C. et al. Neuropeptides 30: 327-333 (1996)]에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 모두 본원에 참조로 포함되어 있다. 또한, 구조적으로 속박된 펩티드는 이량체화 서열을 펩티드의 N- 및 C-말단 단부에 첨가함으로써 제조되며, 여기서 이량체화 서열들 사이의 상호작용은 환형 타입 구조의 형성을 초래한다 (참조: WO/0166565, 참조로 포함됨). 그 밖의 경우, 본 발명의 펩티드는 다른 단백질과의 융합체로서 발현되며, 이는 코일화된-코일 또는 β-턴(turn) 구조의 루프와 같은 표면 노출된 구조상에서의 속박된 디스플레이를 위한 스캐폴드를 제공한다.
의도된 용도에 따라, 특히 포유동물 숙주에 투여하는 경우, 본 발명의 펩티드는 또한 담체 분자내로 혼입시키고, 펩티드 생체이용률을 변화시키고, 반감기를 연장 또는 단축시키고, 다양한 조직 또는 혈류에 대한 분포를 조절하고, 혈액 성분에 대한 결합을 감소 또는 향상시키는 등의 목적을 위해 그 밖의 화합물에 부착시킴으로써 변형될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 혈액, 뇌척수액, 소화 유체 등과 같은 생리학적 환경에서 분해가능하거나 분해가능하지 않은 링커에 의해 이러한 다른 성분들에 결합될 수 있다. 펩티드들은 히드록실, 티올, 카르복실, 아미노 등과 같은 작용기가 존재하는 펩티드의 임의의 지점에서 결합될 수 있다. 바람직하게는, 변형은 N-말단 또는 C-말단에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드는 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 카르복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리딘, 폴리프롤린, 폴리(디비닐-에테르-코-말레산 무수물), 폴리(스티렌-c-말레산 무수물) 등을 공유결합시킴으로써 변형될 수 있다. 수용성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리비닐피롤리딘은 변형되지 않은 화합물과 비교하여 혈류로부터 부착된 화합물을 제거하는 것을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 변형은 또한 수성 매질에서의 용해도를 증가시키고 펩티드들의 응집을 감소시킬 수 있다.
6.3 펩티드 컨쥬게이트 및 융합 단백질
또 다른 양태에 있어서, 펩티드는 바람직하게는 펩티드의 검출 및 단리를 위해 및 올리고펩티드를 특정 세포, 조직 및 장기내로 표적화 또는 수송하기 위해 소분자에 컨쥬게이션된다. 소분자 컨쥬게이트는 합텐을 포함하는데, 이는 이들 자체가 동물내로 도입된 경우에 면역 반응을 개시시키지 못하는 물질이다. 일반적으로, 합텐은 분자량이 약 2kD 미만, 더욱 바람직하게는 약 1kD 미만인 소분자이다. 합텐은 작은 유기 분자 (예를 들어, p-니트로페놀, 디옥신, 헤로인, 코카인, 몰핀, 메스칼린, 리세르그산 (lysergic acid), 테트라히드로칸나비놀, 칸나비놀, 스테로이드, 펜타아미딘, 비오틴 등)를 포함한다. 예를 들어 검출 또는 정제를 위해, 합텐에 결합시키는 것은 비오틴과 결합하는 아비딘과 같은 합텐 특이적 항체 또는 특정 결합 파트너로 수행된다.
컨쥬게이트를 특정 세포 또는 조직에 표적화시키는 소분자가 또한 사용될 수 있다. 비오틴-아비딘 복합체의 존재는 내피 세포를 가로지르는 이러한 변형된 펩티드의 흡수를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 펩티드를 탄수화물 부분, 예를 들어 β-O 결합된 글리코시드를 형성하기 위해 올리고펩티드상의 세린 잔기를 통해 β-글리코시드에 결합시키는 것은 글루코오스 전달물질을 통해 글리코시드 유도체의 수송을 향상시킨다 (Polt, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7144-7118 (1994); Oh et al., Drug Transport and targeting, in Membrane Transporters as Drug Targets, 59-88 (Amidon, G.L. and Sadee, W. eds.), Plenum Press, New York, (1999)). 이러한 변형 타입 둘 모두는 본 발명의 범위내에 포함된다.
올리고펩티드에는 검출 및 추적을 위해 방사성 표지 및 형광 표지와 같은 다양한 표지 부분이 부착될 수 있다. 형광 표지로는 플루오레세인, 에오신, 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor), 오레곤 그린 (Oregon Green), 로다민 그린, 테트라메틸로다민, 로다민 레드, 텍사스 레드, 쿠마린 및 NBD 플루오로포어(fluorophore), QSY 7, 다브실 및 다브실 크로모포어(chromophore), BIODIPY, Cy5 등이 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
한 가지 양태에 있어서, 펩티드는 다양한 목적을 위해 광범위한 다른 펩티드 또는 단백질에 결합된다. 펩티드는 결합을 위한 편리한 작용기, 예를 들어 아미드 또는 치환된 아미드 형성, 예를 들어 환원성 아민화를 위한 경우 아미노기, 티오에테르 또는 이황화물 형성을 위한 경우 티올기; 아미드 형성을 위한 경우 카르복실기 등을 제공하도록 펩티드 또는 단백질에 결합될 수 있다. 특히 관심있는 것은 다수의 항원성 펩티드 시스템 (MAPS)으로 일컬어지는 2개 이상, 더욱 일반적으로 3개 이상 약 60개 이하의 리신기, 특히 약 4개 내지 20개, 일반적으로 6개 내지 18개의 리신 단위로 이루어진 폴리리신의 펩티드이며, 여기서 본 발명의 펩티드는 리신 아미노기, 일반적으로 약 20% 이상, 더욱 일반적으로 약 50% 이상의 이용가능한 아미노기에 결합되어 멀티펩티드(multipeptide) 생성물을 제공한다 (Butz, S. et al., Pept. Res. 7:20-23 (1994)). 이러한 방식으로, 다수의 본 발명의 펩티드를 지닌 분자가 수득되며, 여기서 본 발명의 펩티드의 배향은 동일한 방향으로 되어 있고; 사실상, 이러한 결합기는 테일 대 테일 이량체화 또는 올리고머화를 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 다른 천연 또는 합성 펩티드 및 단백질은 본 발명의 펩티드에 대한 항체를 생성시키기 위한 담체 면역원을 제공하도록 사용될 수 있고, 여기서 항체는 올리고펩티드를 검출하거나 필적하는 입체형태를 지닌 다른 펩티드를 확인하기 위한 시약으로서 기능한다. 항체를 생성시키기 위해 적합한 담체로는 특히 헤모시아닌 (예를 들어, 키호울 림펫 헤모시아닌 - KLH); 알부민 (예를 들어, 우혈청 알부민, 오발부민, 인간 혈청 알부민 등); 면역글로불린; 티로글로불린 (예를 들어, 소과동물 티로글루볼린); 독소 (예를 들어, 디프테리아 톡소이드, 테타누스 톡소이드); 및 폴리리신 또는 폴리알라닌-리신과 같은 폴리펩티드가 있다. 단백질이 바람직한 담체라고 하더라도, 다른 담체, 바람직하게는 고분자량 화합물이 사용될 수 있으며, 이의 예로는 충분한 크기 및 면역원성을 지니는 탄수화물, 폴리사카라이드, 리포폴리사카라이드, 핵산 등이 있다. 또한, 생성된 항체는 표적 부위에 결합하는 것에 대해 본 발명의 펩티드와 경합할 수 있는 항-이디오타입 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 항-이디오타입 항체는 본 발명의 펩티드가 결합하는 단백질을 확인하는 데에 유용하다.
또 다른 양태에 있어서, 펩티드는 올리고펩티드를 세포 및 조직에 표적화시키거나 추가의 작용기를 펩티드에 첨가하기 위해 다른 펩티드 또는 단백질에 컨쥬게이션된다. 표적화를 위해, 컨쥬게이션에 사용되는 단백질 또는 펩티드는 요법을 위해 표적화되는 세포 또는 조직을 기초로 하여 선택될 것이다 (Lee, R, et al., Arthritis. Rheum. 46:2109-2120 (2002); Pasqualini, R., Q. J. Nucl. Med. 43: 159-62 (1999); Pasgualini, R., Nature 380: 364-366 (1996); 이들 문헌은 본원에 참조로 포함됨). 단백질은 또한 컨쥬게이션된 펩티드를 함유하는 소포 또는 입자의 제조를 위해 폴리에틸렌 글리콜과 같은 다른 중합체내로 혼입될 수 있는 폴리아르기닌; 및 폴리리신, 폴리아스파르트산 등을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 폴리-아미노산을 약화시킬 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 펩티드는 키메라 단백질 또는 융합 단백질을 형성하기 위해 내부, 또는 N- 또는 C-말단에서 폴리펩티드 사슬의 일부가 되는 다른 펩티드 또는 단백질과 함께 발현될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "융합 폴리펩티드" 또는 "융합 단백질" 또는 "키메라 단백질"은, 천연 상태로 결합되지만 연속 폴리펩티드를 형성하기 위해 펩티드 결합을 통해 각각의 아미노 및 카르복시 말단에 의해 결합된 다수의 단백질 성분으로 구성된 단백질을 의미한다. 이와 관련하여, 다수란 둘 이상을 의미하며, 바람직한 구체예들은 일반적으로 3개 내지 12개의 성분을 이용하지만, 그 이상이 사용될 수 있다. 단백질 성분들은 직접 결합되거나 하기 약술되는 바와 같이 펩티드 링커/스페이서를 통해 결합될 수 있다.
융합 폴리펩티드는, 세포 및 조직에 표적화시키기 위해, 세포내 구획에 표적화시키기 위해, 세포 또는 생물체에서 융합 단백질을 추적하기 위해 및 올리고펩티드와 결합하는 다른 분자를 스크리닝하기 위해 입체형태적으로 제한된 형태의 본 발명의 올리고펩티드를 디스플레이하도록 다양한 펩티드 또는 단백질에 대해 생성될 수 있다. 융합 단백질을 생성시키는 데에 유용한 단백질은 다양한 리포터 단백질, 구조 단백질, 세포 표면 수용체, 수용체 리간드, 독소 및 효소를 포함한다. 예시적 단백질로는 형광 단백질 (예를 들어, 애쿠오리아 빅토리아 (Aequoria victoria) GFP, 레닐라 레니포르미스 (Renilla reniformis) GFP, 레닐라 무엘레리 (Renilla muelleri) GFP, 루시페라아제 등, 및 이들의 변이체); β-갈락토시다아제; 알칼리 포스파타아제; 대장균 말토오스 결합 단백질; 섬유상(filamentous) 박테리오파지의 코트 단백질 (예를 들어, 파지 디스플레이용의 부(minor) 코트 단백질인 pIII 또는 주(major) 코트 단백질인 pVIII); T 세포 수용체; 카리브도톡신(charybdotoxin) 등이 있다.
융합 단백질은 또한 단독으로 또는 거대 단백질 서열의 일부로서 단백질 또는 다른 펩티드의 단편과의 융합체를 포함한다. 따라서, 융합 폴리펩티드는 융합 파트너를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "융합 파트너"란 용어는 동일한 부류의 단백질의 모든 구성원에 공통된 기능 또는 능력을 부여하는 펩티드와 결합되는 서열을 의미한다. 융합 파트너는 이종성 (즉, 숙주 세포에 대해 천연적이지 않음) 또는 합성 (임의의 세포에 대해 천연적이지 않음)일 수 있다. 융합 파트너는 a) 입체형태적으로 제한되거나 안정한 형태의 올리고펩티드를 제공하는 제시(presentation) 구조물; b) 세포내 또는 세포외 구획으로 펩티드를 국재화시킬 수 있는 표적화 서열; c) 펩티드 또는 이를 엔코딩하는 핵산에 대한 분해로부터의 안정성 또는 보호에 영향을 주는 안정성 서열; d) 융합 파트너로부터 올리고펩티드를 입체형태적으로 디커플링(decoupling)시키는 링커 서열; 및 e) 상기한 것들의 임의의 조합을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
한 가지 양태에 있어서, 융합 파트너는 제시 구조물이다. 본원에 사용된 용어 "제시 구조물"은 본 발명의 펩티드에 융합된 경우에 입체형태적으로 제한된 형태의 펩티드를 제시하는 서열을 의미한다. 바람직한 제시 구조물은 루프와 같은 용매 노출되는 외부 표면상에 펩티드를 제시함으로써 다른 결합 파트너와의 결합 상호작용을 향상시킨다. 일반적으로, 이러한 제시 구조물은 올리고펩티드의 N-말단에 결합된 제 1 부분 및 올리고펩티드의 C-말단에 결합된 제 2 부분을 포함한다. 즉, 본 발명의 펩티드는 제시 구조물내로 삽입된다. 바람직하게는, 제시 구조물은 표적 세포에서 발현되는 경우에 최소 생물학적 활성을 지니도록 선택되거나 설계된다.
바람직하게는, 제시 구조물은 펩티드 또는 외부 루프를 디스플레이하거나 제시함으로써 펩티드에 대한 접근가능성을 최대화시킨다. 적합한 제시 구조물은 코일화된 코일 스템 구조물, 미니보디(minibody) 구조물, β-턴상의 루프, 이량체화 서열, 시스테인 결합된 구조물, 트랜스글루타미나아제 결합된 구조물, 환형 펩티드, 나선형 배럴(barrel), 루신 지퍼(zipper) 모티프 등을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다.
한 가지 구체예에 있어서, 제시 구조물은 본 발명의 펩티드를 외부 루프 (Myszka, D. G. et al., Biochemistry 33:2363-2373 (1994))상에 제시하는 것을 가능하게 하는 코일화된 코일 구조물, 예를 들어 코일화된-코일 루신 지퍼 도메인 (Martin, F.et al., EMBO J. 13:5303-5309 (1994))이다. 제시 구조물은 또한 미니보디 구조물을 포함할 수 있으며, 이는 최소 항체 상보성 영역을 필수적으로 포함한다. 미니보디 구조물은 일반적으로 폴딩된 단백질의 3차 구조의 단일 면을 따라 제시되는 두 개의 펩티드 영역을 제공한다 (Bianchi, E. et al., J. Mol. Biol. 236: 649-659 (1994); Tramontano, A. et al., J. Mol. Recognit. 7: 9-24 (1994)).
또 다른 양태에 있어서, 제시 구조물은 두 개의 이량체화 서열을 포함한다. 동일하거나 상이할 수 있는 이량체화 서열은 디스플레이되는 펩티드를 구조적으로 속박하기 위해 생리적 조건하에서 충분한 친화성을 지니며 비공유적으로 결합한다. 따라서, 이량체화 서열이 본 발명의 올리고펩티드의 각각의 말단에서 사용되는 경우, 생성된 구조물은 구조적으로 제한되거나 속박된 형태의 본 발명의 펩티드를 디스플레이할 수 있다. 다양한 서열이 이량체화 서열로서 적합하다 (참조: WO 99/51625; 참조로 포함됨). 당 분야에 공지된 임의의 수의 단백질-단백질 상호작용 서열이 이러한 목적을 위해 유용하다.
또 다른 양태에 있어서, 제시 서열은 입체형태적으로 제한된 2차 구조를 생성하도록 금속 이온과 결합하는 능력을 부여한다. 따라서, 예를 들어, C2H2 아연핑거(finger) 서열이 사용된다. C2H2 서열은 아연 이온이 킬레이팅되도록 위치하는 두 개의 시스테인 및 두 개의 히스티딘을 지닌다. 아연 핑거 도메인은 구조적으로 독립적이고 플렉시블하게 결합되는 도메인을 형성하도록 다수의 아연-핑거 펩티드로 독립적으로 존재하는 것으로 알려져 있다 (Nakaseko, Y. et al., J. Mol. Biol. 228:619-636 (1992)). 일반적인 컨센서스 서열은 (5개 아미노산)-C-(2개 내지 3개 아미노산)-C-(4개 내지 12개 아미노산)-H-(3개 아미노산)-H-(5개 아미노산) 이다. 바람직한 예는 3개 내지 20개 아미노산-HIRSHTG의 -FQCEEC-무작위 펩티드일 것이다. 유사하게는, 컨센서스 서열 -C-(2개 아미노산)-C-(4개 내지 20개 무작위 펩티드)-H-(4개 아미노산)-C-를 지닌 CCHC 박스가 사용될 수 있다 (Bavoso, A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 242:385-389 (1998)). 다른 예들은 1) 누클레오캡시드 단백질 P2를 기초로 하는 -VKCFNC-4개 내지 20개 무작위 아미노산-HTARNCR-; (2) Lasp-1 LIM 도메인의 천연 아연-결합 펩티드의 서열로부터 변형된 서열 (Hammarstrom, A. et al., Biochemistry 35: 12723-32 (1996)); 및 NMR 구조적 앙상블(ensemble) 1ZFP를 기초로 하는 -MNPNCARCG-4개 내지 20개 무작위 아미노산-HKACF- (Hammarstrom et al., 상기 참조)를 포함한다.
또 다른 양태에 있어서, 제시 구조물은 이황화물 결합이 형성되어 입체형태적으로 속박된 구조를 생성시킬 수 있도록 둘 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 서열이다. 즉, 본 발명의 올리고펩티드의 각각의 말단에 시스테인 함유 펩티드 서열을 사용하면 상기 기술된 바와 같이 환형 펩티드 구조물이 생성된다. 환형 구조물은 단백가수분해에 대한 제시된 펩티드의 감수성을 감소시키고, 이의 표적 분자에 대한 접근가능성을 증가시킨다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 이러한 특정 구체예는 분비성 표적화 서열이 펩티드를 세포외 공간으로 유도시키기 위해 사용되는 경우에 특히 적합하다. 또한, 프로테아제, 예를 들어 매트릭스 메탈로프로테아제 (예를 들어, MMP-2 또는 젤라티나아제 A, MMP-9 또는 젤라티나아제 B, 또는 MMP-7 또는 매트릴리신)에 의해 인식되고 분해되는 서열이 사용될 수 있다. 이들 잔기는 펩티드 반감기 또는 막 투과성을 증가시키기 위해 환형 펩티드를 형성하도록 사용된다. 적합한 프로테아제에 의한 환형 펩티드의 후속 분해는 요망되는 위치에서 활성의 선형 형태의 펩티드를 방출시킨다.
또 다른 구체예에 있어서, 융합 파트너는 표적화 서열이다. 표적화 서열은 소정의 분자 또는 분자의 부류에 발현된 생성물을 결합시킬 수 있으며 발현 생성물의 생체활성을 보유하는 결합 서열; 융합 단백질 또는 결합 파트너의 선택적 분해를 시그널링하는 서열; 및 펩티드를 소정의 세포 위치에 구성적으로 국재화시킬 수 있는 서열을 포함한다. 전형적인 세포 위치는 세포내 위치 (예를 들어, 골지, 세포질세망, 핵, 누클레올리(nucleoli), 핵막, 미토콘드리아, 분비성 소포, 리소좀) 및 분비성 시그널의 사용에 의한 세포외 위치를 포함한다.
다양한 표적화 서열이 당 분야에 공지되어 있다. 핵에 표적화하는 것은 핵 국재화 시그널 (NLS)를 사용함으로써 달성된다. NLS는 NLS가 존재하는 단백질을 세포 핵으로 유도시키는 일반적으로 짧은 양하전된 도메인이다. 전형적인 NLS 서열은 SV40 거대 T 항원의 단일 염기성 NLS (Kalderon, D. et al., Cell 39: 499-509 (1984)); 인간 레틴산 수용체-β 핵 국재화 시그널 (NF-kB p50 및 p65 (Ghosh, S. et al., Cell 62:1019-1029 (1990); Nolan, G. et al., Cell 64:961-999 (1991)); 및 누클레오플라스민(nucleoplasmin)에 의해 예시되는 이중 염기성 NLS (Dingwall, C. et al., J. Cell Biol. 107:841-849 (1988))을 포함한다.
또 다른 양태에 있어서, 표적화 서열은 막-앵커링(anchoring) 서열이다. 펩티드는 시그널 서열을 통해 막에 유도되고, 소수성 트랜스멤브레인 도메인 (TM으로 표시됨)을 통해 막에 안정하게 혼입된다. TM 세그먼트는 당 분야에 공지된 바와 같이 세포내 또는 세포외적으로 본 발명의 펩티드를 디스플레이하기 위해 발현된 융합 단백질상에 적절히 위치한다. 막 앵커링 서열 및 시그널 서열은 (a) 클래스 I 내재성 막 단백질, 예를 들어 IL-2 수용체 β-사슬 (Hatakeyama, M. et al., Science 244: 551-556 (1989)) 및 인슐린 수용체 β-사슬 (Hatakeyama et al, 상기 참조); (b) 클래스 II 내재성 막 단백질, 예를 들어 중성 엔도펩티다아제 (Malfroy, B. et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 144:59-66 (1987)); 및 (c) 타입 III 단백질, 예를 들어 인간 시토크롬 P450 NF25 (Hetakeyama et al, 상기 참조)로부터 유래된 서열; 및 CD8, ICAM-2, IL-8R 및 LFA-1로부터의 서열을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
막 앵커링 서열은 또한 GPI 앵커를 포함하며, 이는 글리코실-포스파티딜이노시톨을 통한 GPI 앵커 서열과 지질 이중막 사이의 공유 결합 형성을 유도한다. GPI 앵커 서열은 Thy-1과 DAF를 포함하는 다양한 단백질에서 발견되었다 (Homans, S.W. et al., Nature 333:269-272 (1988)). 유사하게는, 아세틸화 서열은 지질 부분의 부착 예를 들어, 이소프레닐화 (즉, 파르네실 및 게라닐-게라닐: 문헌[Farnsworth, C.C. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11963-11967(1994) and Aronheim, A. et al., Cell 78:949-61(1994)), 미리스토일화(Stickney, J.T.Methods Enzymol. 332:64-77 (2001)] 참조) 또는 팔미토일화를 허용한다. 한 양태에서, 주 펩티드는 말단에서 지질기에 결합하여, 리포좀과 같은 지질 멤브레인에 결합할 수 있다.
기타 세포내 표적 서열은 라이소좀 표적화 서열(예를 들어, LAMP-1 및 LAMP-2에서의 서열; Uthayakumar,S. et al., Cell Mol.Biol.Res. 41:405-420 (1995) and Konecki, D.S. et al., Biochem. Biophys.Res.Comm. 205:1-5(1994)); 미토콘드리아 편재 서열 (예를 들어, 미토콘드리아 매트릭스 서열, 미토콘드리아 내막 서열, 미토콘드리아 막사이 서열 또는 미토콘드리아 외막 서열; Shatz, G., Eur.J.Biochem. 165:1-6 (1987)); 소포체 편재 서열 (예를 들어, 칼레티큘린(calreticulin), Pelham, H.R. Royal Soc. London Transactions B: 1-10(1992); 아데노바이러스 E3/19K 단백질, Jackson, M.R. et al., EMBO J. 9:3153-3162 (1990)); 및 퍼옥시좀 편재 서열 (예를 들어, 루시퍼라아제 퍼옥시좀 매트릭스 서열, Keller, G.A. et al., Proc. Natl.Acad.Sci.USA 4: 3264-3268 (1987)이다.
또 다른 양태에서, 표적 서열은 펩티드 분비를 유도하는 분비 시그널 서열이다. 많은 분비 서열은 이식된 서열을 포함하여, 특히 세포에 의한 펩티드 분비를 위한 관련 펩티드에 관한 아미노산 말단부에 위치할 경우, 세포외 공간으로 펩티드 분비를 유도하는 것으로 공지되어 있다. 적합한 분비 시그널은 IL-2(Villinger, F. et al., J.Immuno. 155:3946-3954 (1995)), 성장 호르몬 (Roskam, W.G. et al., Nucleic Acids Res. 7:305-320 (1979)), 프레프로인슐린 및 인플루엔자 HA 단백질에서 발견된 시그널을 포함한다.
융합 파트너는 융합 단백질 또는 이를 코드화하는 핵산에 안정성을 부여하는 안정성 서열을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 개시 메티오닌(예를 들어, MG 또는 MGG) 뒤의 글리신의 혼입은 바르사브스키의 N-엔드 룰(N-End rule of Varshavsky)에 따라 유비퀴틴화를 통해 융합된 펩티드를 안정화시키거나 분해되는 것으로부터 보호하여, 세포에서 증가된 반감기에 기여한다.
추가의 아미노산은 검출 또는 정제를 위해 펩티드를 태깅시키기 위해 첨가될 수 있다. 이들 서열은 리간드 예컨대, 금속 이온에 결합하는 항체 또는 서열에 의해 인지되는 에피토프를 포함할 수 있다. 다양한 태그 서열 및 리간드 결합 서열은 당해분야에 널리 공지되어 있다. 이들은 비제한적으로, 폴리-히스티딘(예를 들어, 6xHis 태그, 이는 항체에 의해 인지되나, 또한 이가 금속 이온에 결합함); 폴리-히스티딘-글리신(폴리-his-gly) 태그; flu HA 태그 폴리펩티드; c-myc tag; Flag 펩티드 (Hopp et al., Bio Technology 6:1204-1210(1988)); KT3 에피토프 펩티드; 투불린 에피토프 펩티드(Skinner et al., J.Biol.Chem.266:15163-12166(1991)); 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 tag(Lutz-Freyermuth et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:6363-6397(1990))을 포함한다.
융합 파트너는 펩티드를 링킹시키고, 방해되지 않은 구조의 펩티드를 제시하기 위한 링커 또는 테터링(tethering) 서열을 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 유용한 링커는 글리신 중합체(G)n(여기서 n은 1 내지 약 7임), 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n 및 (GGGS)n (여기서, n은 1이상임)), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 당해분야에 공지된 기타 융통성 있는 링커를 포함한다. 바람직하게는, 링커는 글리신 또는 글리신-세린 중합체인데, 이들 아미노산이 비교적 비구조화되고, 친수성이며, 단백질 및 펩티드의 세그먼트를 결합시키는에 효과적이기 때문이다.
본 발명에서, 융합 파트너의 혼합물이 사용될 수 있다. 제시 구조, 타겟팅 구조, 레스큐 서열(rescue sequence), 태그 서열 및 안정성 서열중 임의의 수의 혼합물이 링커 서열과 함께 또는 부재하에 사용될 수 있다.
6.4 펩티드 제조 및 염
RDP58 올리고펩티드는 많은 방식으로 제조될 수 있다. 펩티드의 화학적 합성법은 당해분야에 널리 공지되어 있다. 고체상 합성법이 일반적으로 사용되며, 다양한 통상적인 합성 장치 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템스 인크.(Applied Biosystems Inc., Foster City, CA; Beckman; etc.)의 자동화된 합성기가 구입가능하다. 용액상 합성 방법 또한 특히, 대규모 생산을 위해 사용될 수 있다. 이러한 표준 기법을 사용하므로써, 자연적으로 발생하는 아미노산은 비자연적인 아미노산 특히, D-입체이성질체, 및 상이한 길이 또는 작용을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산으로 치환될 수 있다. 화학 합성 동안 소분자, 라벨 부분, 펩티드 또는 단백질에 컨쥬게이팅하거나, 고리화된 펩티드를 형성하기 위한 작용기가 분자내로 유입될 수 있다. 또한, 소분자 및 라벨 부분은 합성 공정 동안 부착될 수 있다. 바람직하게는, 작용기의 유입 또는 기타 분자로의 컨쥬게이션은 본 펩티드의 구조 및 작용에 최소한적으로 영향을 끼친다.
본 발명의 펩티드는 또한, 염의 형태 일반적으로, 약제학적으로 허용되는 염 형태로 존재할 수 있다. 이는 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간 등의 무기 염을 포함한다. 펩티드의 다양한 유기염이 비제한적으로, 아세트산, 프로피온산, 피루브산, 말산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 살리실산 등으로 제조될 수 있다.
올리고펩티드 및 이의 유도체의 합성은 또한 재조합 기법을 이용하여 수행될 수 있다. 재조합 생성을 위해, 개재 아미노산 또는 서열과 나란히 위치하는 단일 올리고펩티드 또는 바람직하게는 다수의 본 펩티드를 코드화하는 핵산 서열이 제조될 수 있으며, 이는 단일 펩티드 또는 헤드의 테일 이량체로의 절단을 가능하게 한다. 메티오닌 또는 트립토판이 부재하는 경우, 개재 메티오닌 또는 트립토판이 혼입될 수 있으며, 이는 각각 CNBr 또는 BNPS-Skatole(2-(2-니트로페닐설페닐)-3-메틸-3-브로모인돌레닌)을 사용하여 단일 아미노산 절단을 가능하게 한다. 대안적으로, 절단은 자가-절단 부위 (예를 들어, 압토바이러스 및 카르디오바이러스의 2A 서열; Donnelly, M.L., J.Gen. Virol. 78:13-21(1997); Donnelly, M.L., J.Gen.Virol.82:1027-41(2001) 본원에 참고문헌으로 인용됨)로서 작용하는 효소적 절단 또는 서열에 대한 특정 프로테아제에 의해 인지되는 서열을 사용하므로써 달성될 수 있다. 본 펩티드는 단리될 수 있는 더 큰 펩티드의 일부, 및 단백질분해 절단 또는 화학적 절단에 의해 수득된 올리고펩티드로서 제조될 수 있다. 특정 서열 및 제조 방식은 편리성, 경제성, 요구되는 순도 등에 의해 결정될 것이다. 이들 조성을 제조하기 위해, 특정 펩티드, 단백질 또는 융합 단백질을 코드화하는 유전자는 본 발명의 올리고펩티드를 코드화하는 DNA 서열에 결합하여 융합 핵산을 형성시키고, 이는 발현 벡터로 유입된다. 융합 핵산의 발현은 특정 숙주 세포 또는 유기체에서의 발현을 위해 하기 기술된 바와 같은 적합한 프로모터 및 기타 조정 서열의 조절하에 있다 (Sambrook et al., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (3rd ed. 2001); Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, (updates up to 2002) (1998); 본원에 참고문헌으로 인용됨).
본 발명의 펩티드에 다양한 분자를 컨쥬게이팅하기 위해, 올리고펩티드 및 기타 분자상의 작용기는 적합한 컨쥬게이팅제(예를 들어, 가교제)의 존재하에 반응한다. 사용된 컨쥬게이팅제 또는 가교제의 유형은 작용기 예컨대, 사용되는 일차 아민, 설프히드릴, 카르보닐, 카르보히드레이트 및 카르복실산에 의해 좌우된다. 제제는 염착제 또는 가교제일 수 있으며, 이는 호모이작용성, 헤테로이작용성 또는 삼작용성 가교제일 수 있다 (Pierce Endogen, Chicago, IL). 통상적으로 사용되는 염착제 및 가교제는 포름알데히드, 글루타르알데히드, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 디숙시미딜 에스테르, 말레이미드 (예를 들어, 비스-N-말레이미도-1-8-옥탄) 및 카르보디이미드(예를 들어, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드; 디시클로헥실카르보이미드를 포함한다. 2-20개 탄소 길이를 갖는 알킬 또는 치환된 알킬 사슬을 포함하는 스페이서 분자는 컨쥬게이트를 분리하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 변형을 위해 선택되지 않은 올리고펩티드상의 반응성 작용기는 펩티드가 다른 반응성 분자에 결합하기 전에 보호되어 원하지 않은 부반응을 제한한다. 본원에 사용된 "보호기"는 선택적으로 제거가능하여 작용기를 재노출시키는 특이적 작용기에 결합된 분자이다 (Greene, T.W. and Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Inc., New York (3rd ed. 1999). 펩티드는 합성 후 그러나, 가교제와 반응하기 전에 보호된 아미노산 전구체와 합성하거나 보호기와 반응할 수 있다. 컨쥬게이션은 또한 예를 들어, 바이오틴 부분을 부착하므로써 간접적으로 유도될 수 있으며, 이는 스트렙타비딘 또는 아비딘과 커플링되는 화합물 또는 분자와 접촉할 수 있다.
컨쥬게이팅된 형태의 감소된 활성을 갖는 올리고펩티드에 있어서, 올리고펩티드와 컨쥬게이팅된 화합물간의 결합은 예를 들어, 목적하는 세포 또는 조직으로 이동한 후, 목적하는 조건하에 절단을 유도하기에 충분히 불안정하도록 선택된다. 생물학적으로 불안정한 공유 결합 예를 들어, 이미노 결합과 에스테르는 당해분야에 널리 공지되어 있다 (본원에 참고문헌으로 인용된 U.S. 특허 제 5,108,921호 참조). 이들 변형은 잠재적으로 덜 활성인 형태의 올리고펩티드의 투여를 허용하며, 그 후, 불안정한 결합의 절단에 의해 활성화된다.
6.5 핵산, 발현 벡터 및 도입 방법
올리고펩티드의 합성 또는 전달이 본 펩티드를 코드화하는 핵산을 경유하는 경우, 핵산은 발현 벡터로 클로닝되고, 세포 또는 숙주로 도입된다. 발현 벡터는 자가-복제 염색체외 벡터 또는 숙주 크로모좀으로 통합되는 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스에 근거한 벡터, 부위 특이적 재조합 서열을 갖는 벡터, 또는 상동 재조합에 의한 벡터이다. 일반적으로, 이들 벡터는 올리고펩티드를 코드화하는 핵산에 작동적으로 결합된 조정 서열을 포함한다. "조정 서열"은 특정 숙주 유기체에서 본 펩티드를 발현시키는데 필요한 핵산 서열을 의미한다. 따라서, 조정 서열은 프로모터 서열, 인핸서 또는 전사적 활성화제 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 또는 종료 서열; 폴리아데닐화 시그널 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 핵산의 전사 및 번역에 요구되는 서열을 포함한다.
다양한 프로모터가 본 발명의 펩티드를 발현하는데 유용하다. 프로모터는 구성적이며, 유도가능하고/거나 세포 특이적일 수 있으며, 천연 프로모터, 합성 프로모터(예를 들어, tTA 테트라시클린 유도성 프로모터) 또는 다양한 프로모터의 하이브리드를 포함할 수 있다. 프로모터는 특히 단백질이 발현되는 세포 또는 유기체, 목적하는 발현 수준, 및 발현의 조절에 근거하여 선택된다. 적합한 프로모터는 박테리아 프로모터(예를 들어, pL I 파아지 프로모터, tac 프로모터, lac 프로모터 등); 효모 기재 프로모터(예를 들어, GAL4 프로모터, 알코올 수소이탈효소 프로모터, 트립토판 신타아제 프로모터, 구리 유도성 CUPI 프로모터 등), 식물 프로모터(예를 들어, CaMV S35, 노폴린 신타아제 프로모터, 타바코 모자익 바이러스 프로모터, 등), 곤충 프로모터(예를 들어, 오토그라파 뉴클레어 폴리헤드로시스 바이러스, 아데스 DNV 바이럴 p& 및 p61, hsp70 등), 및 포유동물 세포 발현을 위한 프로모터(예를 들어, 유비퀴틴 유전자 프로모터, 리보좀 유전자 프로모터, β-글로빈 프로모터, 티미딘 키나아제 프로모터, 열쇼크 단백질 프로모터, 및 리보좀 유전자 프로모터, 등), 및 특히 바이러스 프로모터 예컨대, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 시미안 바이러스(SV40) 프로모터, 및 레트로바이러스 프로모터이다.
본원에서 "작동적으로 결합된"은, 핵산이 또 다른 핵산과 기능적 관계에 위치한다는 것을 의미한다. 본원에서, "작동적으로 결합된"은, 조정 서열이 코드화된 펩티드의 발현이 일어나는 방식으로 본 펩티드를 코드화하는 핵산 서열과 관련하여 위치한다는 것을 의미한다. 벡터는 플라스미드를 포함할 수 있거나, 바이러스 벡터, 예를 들어, 세포가 분열 세포인 경우 유용한 전달 시스템인 레트로바이러스 벡터, 또는 세포가 비분열 세포인 경우 렌티바이러스 및 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 특히 바람직한 것은 자가-불활성화 레트로바이러스 벡터(SIN 벡터)이며, 이는 3'-LTR에서 불활성화된 바이러스 프로모터를 가져서, 바이러스 벡터에 삽입된 비-바이러스 프로모터를 사용하므로써 이종성 유전자의 발현을 조정가능하게 한다(예를 들어, 문헌[Hofmann, A. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93:5185-5190(1996)] 참조). 당해분야에 자명한 바와 같이, 슈도타이핑에 의한 시스템의 변형은 모든 진핵 세포, 특히 고급 진핵세포에 대해 레트로바이러스 벡터를 사용가능하게 한다(Morgan, R.A. et al., J.Virol. 67:4712-4721 (1993); Yang,Y. et al., Hum.Gene Ther. 6:1203-1213 (1995)).
또한, 발현 벡터는 선택가능한 마커 유전자를 함유하여 변형된 숙주 세포의 선택을 가능하게 한다. 일반적으로, 선택은 발현 벡터를 함유하는 세포를 풍부하게 하는 검출가능한 표현형에 기여하며, 추가로 선택 유전자를 발현하는 세포와 발현하지 않는 세포간의 분화를 허용한다. 선택 유전자는 당해분야에 널리 공지되어 있으며, 사용된 숙주 세포에 따라 변할 것이다. 적합한 선택 유전자는 세포가 약물에 내성을 띠게하는 유전자, 영양적으로 결핍된 배지중에서 성장을 가능하게하는 유전자, 및 리포터 유전자(예를 들어, β-갈락톡시다아제, 형광 단백질, 글루코우로니다아제 등)를 포함하며, 이들 모두는 당해분야에 널리 공지되어 있으며, 당업자에게 입수가능하다.
핵산을 생육가능한 세포로 도입시킬 수 있는 다양한 기법이 있다. 본원에서 "도입"은, 핵산을 핵산의 후속 발현에 적합한 방식으로 세포에 유입시키는 것을 의미한다. 핵산을 도입시키는 기법은 핵산이 실험관내에서 배양된 세포로 이동되거나 생체내에서 고려되는 숙주 유기체의 세포내로 이동되는지에 따라, 그리고 숙주 유기체의 유형에 따라 변화될 것이다. 실험관내에서 핵산을 유입시키기 위한 예로는 리포좀, 리포펙틴®(Lipofectin®), 일렉트로포레이션, 미세주입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 및 바이오리스틱 입자폭격(biolistic particle bombardment)을 포함한다. 생체내 이동 기법은 핵산의 직접 도입, 바이러스 벡터, 전형적으로 레트로바이러스 벡터 이용, 및 리포좀 매개된 트랜스펙션 예컨대, 바이러스 코팅된 리포좀 매개된 트랜스펙션을 포함한다. 본 발명의 펩티드를 발현하는 핵산은 세포질에서 일시적으로 또는 안정적으로 존재하거나, 숙주의 크로모좀내로 안정적으로 통합된다 (즉, 표준 조절 서열, 선택 마커 등을 사용하므로써). 적합한 선택 유전자 및 마커 유전자는 본 발명의 발현 벡터중에 사용된다.
일부의 경우에서, 표적 세포 또는 조직 예컨대, 세포 표면 단백질 또는 표적 세포에 대해 특이적인 항체, 표적 세포상의 수용체에 대한 리간드, 세포막상의 지질 성분, 또는 세포 표면상의 탄수화물을 타겟으로 하는 제제를 포함하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우, 엔도사이토시스된 세포 표면 단백질에 결합하는 단백질이 표적화 및/또는 흡수 촉진에 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 특정 세포 유형에 자극성인 캅시드 단백질 또는 이들의 단편, 내재화되거나(Wu, G.Y. et al., J.Biol.Chem. 262:4429-4432 (1987); Wagner, E. et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)) 생체내 반감기를 증가시키는 단백질에 대한 항체를 포함한다.
발현은 박테리아, 효모, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 진핵생물 및 원핵생물에 걸친 광범위한 범위의 숙주 세포에서 수행된다. 본 발명의 올리고펩티드는 특히 대장균, 사카로마이시스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 폼베(Saccharomyces pombe), 타바코(Tobacco) 또는 아라비돕시스(Arabidopsis) 식물, 곤충 쉬나이더(Schneider) 세포, 및 포유동물 세포 예컨대, COS, CHO, HeLa 등에서 펩티드를 적합한 시그널 펩티드에 융합시키므로써 분비된 형태로 또는 세포내에서 발현될 수 있다. 숙주 세포로부터의 분비는 올리고펩티드를 코드화하는 DNA와 시그널 펩티드를 코드화하는 DNA를 융합하므로써 수행될 수 있다. 박테리아, 효모, 곤충, 식물 및 포유동물계에 대한 분비 시그널은 당업계에 널리 공지되어 있다. 올리고누클레오티드를 발현하는 핵산은 세포 예를 들어, 조직 발현을 위한 줄기 세포 또는 장 발현을 위한 박테리아, 및 숙주로 이식된 세포로 삽입되어 올리고펩티드의 생체내 공급원을 제공할 수 있다.
6.6 정제된 펩티드
바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고펩티드는 합성 또는 발현 후에 정제되거나 분리될 수 있다. "정제된" 또는 "분리된"은 펩티드가 합성되거나 발현되는 환경으로부터 유리되고, 실질적으로 사용될 수 있는 형태임을 의미한다. 따라서, "정제된" 또는 "분리된"은, 펩티드 또는 이의 유도체가 실질적으로 순수하고, 즉 90%가 넘게 순수하고, 더욱 바람직하게는 95%가 넘게 순수하고, 바람직하게는 99%가 넘게 순수하다는 것을 의미한다. 올리고펩티드 및 이의 유도체는 샘플중에 존재하는 기타 성분에 따라 당업자에게 널리 공지된 방식에 의해 정제되고 분리될 수 있다. 표준적인 정제 방법은 이온 교환, 소수성, 친화도, 크기 배제, 역상 HPLC 및 크로마토포커싱을 포함하는 일렉트로포레틱, 면역학적 및 크로마토그래픽 기법을 포함한다. 단백질은 또한, 예를 들어, 염 또는 유기 용매의 존재하에 선택적 용해도에 의해 정제될 수 있다. 요구되는 정제 정도는 본 올리고펩티드의 용도에 따라 변할 것이다. 이와 같이, 어떤 경우에는, 정제가 필요없을 것이다.
대부분의 경우, 사용된 조성물은 생성물 제조 방법, 정제 공정과 관련된 오염물 및 이의 의도된 용도 예를 들어, 치료학적 치료를 위한 약제학적 담체와 관련하여 20 중량% 이상, 더욱 일반적으로는 약 75 중량% 이상, 바람직하게는 약 95 중량% 이상, 및 일반적으로 약 99.5중량% 이상의 목적하는 생성물을 포함할 것이다. 일반적으로, 퍼센테이지는 총 단백질을 기준으로 할 것이다.
6.7 약제 조성물
본 조성물은 단독으로 또는 혼합되어 특정 적용에 따라 실험관내, 생체외 및 생체내에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체 및 약제학적으로 유효한 양의 하나 이상의 본 펩티드 또는 이의 적합한 염을 포함하는 약제 조성물을 투여하는 것을 제공한다. 약제 조성물은 분말, 과립, 용액, 현탁액, 에어로졸, 고형물, 환약, 정제, 캡슐, 젤, 국소용 크림, 좌약, 피부 패치 (예를 들어, 경피 이온영동치료) 등으로서 제형화될 수 있다.
상기 지시된 바와 같이, 펩티드의 약제학적으로 허용되는 염은 유기산 및 무기산 및/도는 염기를 포함하는 약제학적으로 허용되는 염으로 당해분야에서 인정된 것을 포함한다. 염의 예로는 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 일차, 이차 및 삼차 아민, 저급 탄화수소의 에스테르 예컨대, 메틸, 에틸 및 프로필을 포함한다. 기타 염으로는 유기산 예컨대, 아세트산, 프로피온산, 피루브산, 말산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 살리실산 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 조성물을 제형하는데 있어서 당업자에게 공지된 표준의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 따라서, 예컨대 약제학적으로 허용되는 염 또는 컨쥬게이트로서 존재하는 본 펩티드 자체, 또는 이러한 펩티드를 코드화하는 핵산 비히클은 약제학적으로 허용되는 희석제 예를 들어, 염수, 인산염 완충 염수(PBS), 수성 에탄올 또는 글루코스, 만니톨, 덱스트란, 프로필렌 글리콜, 오일 (예를 들어, 식물성유, 동물성유, 합성유 등), 마이크로크리스탈린 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 마그네슘 스테아레이트, 인산 칼슘, 젤라틴, 폴리소르베이트 80 등의 용액중의 제형, 또는 적합한 부형제중의 고체 제형으로서 제조될 수 있다. 제형은 살균제, 안정화제, 완충제, 에멀션화제, 방부제, 감미제, 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구적으로 투여되는 경우, 올리고펩티드는 적합한 장 코팅을 사용하거나 기타 적합한 보호 수단 예를 들어, 중합체 매트릭스중의 억류제 예컨대, 미세입자 또는 pH 민감성 히드로겔을 사용하므로써 분해로부터 보호될 수 있다.
적합한 제형은 특히 본원에 참고문헌 인용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Philadelphia, PA (17th ed., 1985) and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed, Washington DC, American Pharmaceutical Association (Kibbe, A.H.ed., 2000)]에서 발견될 수 있다. 본원에 기술된 약제 조성물은 당업자에게 널리공지된 방식으로 제조될 수 있다 (예를 들어, 예를 들어, 비제한적으로 혼합, 용해, 과립화, 분쇄, 에멀션화, 캡슐화, 포획화 또는 동결건조 공정을 포함하는 당해분야에 통상적인 방법에 의해).
또한. 펩티드는 이동을 위해 그리고, 생체외 또는 생체내에서 펩티드의 수명을 연장시키기 위해 리포좀의 루면으로 도입되거나 캡슐화될 수 있다. 당해분야에 공지된 바와 같이, 리포좀은 다양한 형태로 분류될 수 있다: 멀티라멜라(MLV), 안정한 플루리라멜라(SPLV), 소유니라멜라(SUV) 또는 대유니라멜라(LUV) 소포. 리포좀은 포스파티딜 에테르 및 에스테르 예컨대, 포스포티딜세린, 포스포티딜콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 디미리스토일포스파티딜콜린; 스테로이드 예컨대, 콜레스테롤; 세레브로시데스; 스핑고미엘린; 글리세로지질; 및 기타 지질 (예를 들어, U.S. 특허 제 5,833,948호 참조)을 포함한 다양한 지질 화합물로부터 제조될 수 있으며, 이는 합성적으로 또는 자연적으로 발생할 수 있다.
양이온 지질은 또한 리포좀을 형성하는데 적합하다. 일반적으로, 양이온 지질은 넷 양전하를 가지며, 친지성 부분 예컨대, 스테롤 또는 아실 또는 디아실 측쇄를 갖는다. 바람직하게는, 헤드기는 양성적으로 하전된다. 전형적인 양이온 지질은 1,2-디올레일옥시-3-(트리메틸아미노)프로판; N-[1-(2,3-디테트라데실옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-N-히드록시에틸암모늄 브로마이드; N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸암모늄 브로마이드; N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드; 3-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤; 및 디메틸디옥타데실암모늄을 포함한다.
특히 관심있는 것은 융해 리포좀이며, 이는 생리학적 상태의 적절한 변화시 세포막으로 융합하는 이들의 능력, 또는 융해 성분 특히, 융해 펩티드 또는 단백질의 존재를 특징으로 한다. 한 양태에서, 융해 리포좀은, 세포막과의 융합이 온도 및/또는 pH의 변화에 영향을 받는다는 점에서 pH 및 온도에 민감하다 (참조: 예를 들어, 미국특허 제 4,789,633호 및 제 4,873,089호). 일반적으로, pH 민감성 리포좀은 산에 민감하다. 따라서, 융합은 pH가 완만하게 산성인 생리학적 환경 예를 들어, 라이소좀, 엔도좀 및 염증 조직의 환경하에 증진된다. 이러한 특성으로 인해, 리포좀의 엔도시토시스 후에 리포좀 함유물이 세포내 환경으로 직접적으로 유출된다 (Mizoue, T., Int.J.Pharm. 237:129-137 (2002)).
또 다른 형태의 융해 리포좀은 융해 증진제를 함유하는 리포좀을 포함한다. 즉, 리포좀으로 혼입되거나 지질에 부착되는 경우, 제제는 리포좀과 기타 세포막과의 융합을 증진시켜, 리포좀 함유물을 세포내로 이동시킨다. 이러한 제제는 융합 증진 펩티드 또는 단백질일 수 있으며, 인플루엔자 바이러스의 헤마그글루티닌 HA2 (Schoen, P., Gene Ther. 6:823-832 (1999)); 센다이 바이러스 엔벨로프 당단백질 (Sendai virus envelope glycoproteins)(Mizuguchi, H., Biochem. Biophys.Res.Commun. 218:402-407 (1996)); 수포성 구내염 바이러스 엔벨로프 당단백질(VSV-G) 당단백질 (Abe,A. et al., J Virol. 72; 6159-63 (1998)); 융합 증진 단백질의 펩티드 세그먼트 또는 미믹스(mimics); 및 합성 융합 증진 펩티드 (Kono, K. et al., Biochim. Biophys. Acta. 1164:81-90 (1993); Pecheur, E.I., Biochemistry 37:2361-71 (1998); U.S. Patent No. 6,372,720)를 포함한다.
리포좀은 본원에 참고문헌으로 인용된 미국특허 제 5,013,556호 및 제 5,395,619호 (또한, 문헌[Kono,K. et al., J. Controlled Release 68:225-35 (2000); Zalipsky,S. et al., Bioconjug. Chem. 6: 705-708 (1995)] 참조)에서 제시된 바와 같이 친수성 중합체로 유도된 소포를 포함하여, 생체내에서의 생명 주기를 연장시킨다. 리포좀의 코팅 또는 유도를 위한 친수성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸 에테르, 폴리아스파르트아미드, 히드록시메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스 등을 포함한다. 또한, 상기 기술된 바와 같이, 엔도시토시스된 세포 표면 단백질에 결합하는 부착 단백질 예를 들어, 특정 세포 유형에 자극성인 캅시드 단백질 또는 이의 단편 및 내재화되는 세포 표면 단백질에 대한 항체 (Wu et al., supra; Wagner et al., supra)는 특이적 세포 또는 조직에 대한 리포좀을 표적화시키거나 흡수를 촉진시키는데 사용될 수 있다.
리포좀은 당해분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, Szoka,F. et al., Ann.Rev.Biophys. Bioeng. 9:467-508 (1980)). 한 전형적인 방법은 지질 필름 수화 기법이며, 여기서 지질 성분은 유기 용매중에 혼합되고, 용매를 증발시켜 지질 필름을 생성시킨다. 바람직하게는, 본 펩티드 또는 핵산을 함유하는 수성 완충액중의 필름의 수화는 에멀션을 생성시키고, 이는 초음파처리되거나 분출되어 크기 및 다분산성을 감소시킨다. 기타 방법은 역상 증발 (예를 들어, 문헌[Pidgeon,C. et al., Biochemistry 26:17-29 (1987); Duzgunes, N. et al., Biochim. Biophys. Acta. 732:289-99 (1983)] 참조), 포스포리피드 혼합물의 냉동 및 해동, 및 에테르 주입을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 담체는 미세입자, 미세캡슐, 미소구체 및 나노입자의 형태이며, 이는 생분해가 가능하거나 가능하지 않을 수 있다 (예를 들어, 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Microencapsulates: Methods and Industrial Applications, in Drugs and Pharmaceutical Sciences, Vol 73, Marcel Dekker Inc., New York (Benita, S. ed, 1996] 참조). 본원에 사용된 바와 같은 미세입자, 미소구체, 미세캡슐 및 나노입자는 전달한 물질을 함유하는 전형적으로 고형인 입자를 의미한다. 이러한 물질은 입자의 코어내에 위치하거나, 입자의 중합체 네트워크에 부착된다. 일반적으로, 미세입자( 또는 미세캡슐 또는 미소구체)와 나노입자간의 차이는 크기 뿐이다. 본원에 사용된 바와 같은 미세입자는 약 1 내지 약 >1000 마이크론의 입자 크기를 갖는다. 나노입자는 약 10 내지 약 1000 nm의 입자 크기를 갖는다.
다양한 물질이 미세입자를 제조하는데 유용하다. 생분해되지 않는 미세캡슐 및 미세입자는 비제한적으로, 폴리술폰, 폴리(아크릴로니트릴-코-비닐 클로라이드), 에틸렌-비닐 아세테이트, 히드록시에틸메타크릴레이트-메틸-메타크릴레이트 공중합체로 제조된 것을 포함한다. 이들은 캡슐화된 펩티드는 캡슐로부터 방산되는 주입 목적에 유용하다. 또 다른 양태에서, 미세캡슐 및 미세입자는 생분해가능한 중합체 바람직하게는 독성이 낮으며, 면역계에 충분히 내성인 중합체를 기재로 한다. 이들로는 피브린, 카세인, 혈청 알부민, 콜라겐, 젤라틴, 레시틴, 키토산, 알기네이트 도는 폴리-아미노산 예컨대, 폴리-리신으로부터 제조된 단백질 기재 미세캡슐 및 미세입자를 포함한다. 캡슐화를 위한 생분해가능한 합성 중합체는 중합체 예컨대, 폴리락티드(PLA), 폴리글리콜리드(PGA), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA), 폴리(카프로락톤), 폴리디옥사논 트리메틸렌 카르보네이트, 폴리히드록시알코네이트 (예를 들어, 폴리(β-히드록시부티레이트), 폴리(γ-에틸 글루타메이트), 폴리(DTH 이미노카르보닐(비스페놀 A 이미노카르보네이트), 폴리(오르토 에스테르), 및 폴리시아노아크릴레이트를 포함할 수 있다. 본 조성물을 함유하는 미세입자를 제조하는 다양한 방법이, 용매 제거 방법 (예를 들어, 미국특허 제 4,389,330호 참조); 에멀션화 및 증발 (Maysinger, D. et al., Exp. Neuro. 141:47-56 (1996); Jeffrey,H. et al., Pharm.Res. 10:362-68 (1993)), 분무 건조 및 분출 방법을 포함하여, 널리 공지되어 있다.
또 다른 유형의 담체는 나노입자이며, 이는 일반적으로 정맥내 투여에 적합하다. 초미세 및 나노 입자는 일반적으로 당해분야에 공지된 바와 같은 친양쪽성 이중블록, 삼중블록 또는 다중블록으로 제조된다. 나노입자를 형성하는데 유용한 중합체는 폴리(락트산)(PLA: Zambaux et al., J. Control Release 60: 179-188 (1999)), 폴리(락티드-코-글리코리드), 폴리(락티드-코-글리코리드)와 폴리카프로락톤의 블렌드, 이중블록 중합체 폴리(l-류신-블록-l-글루타메이트), 이중블록 및 삼중블록 폴리(락트산)(PLA) 및 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO)(De Jaeghere, F. et al., Pharm.Dev. Technol.; 5: 473-83 (2000)), 아크릴레이트, 아릴아미드, 폴리스티렌 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 미세입자에 대해 기술된 바와 같이, 나노입자는 생분해가능하거나 불가능할 수 있다. 나노입자는 또한 폴리(알킬시아노아크릴레이트) 예를 들어, 폴리(부틸시아노아크릴레이트)로부터 제조될 수 있으며, 여기서 펩티드는 나노입자상으로 흡수되고, 게면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 80)으로 코팅된다. 나노입자를 제조하는 방법은 미세입자를 제조하는 방법과 유사하며, 특히 연속적 수성상중에서의 에멀션 중합화, 에멀션화-증발, 용매 치환, 및 에멀션화-확산 기법을 포함한다 (본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Kreuter, J.Nano-particle Preparation and Applications, in Microcapsules and nanoparticles in medicine and pharmacy, pg. 125-148,(M.Donbrow, ed.) CRC Press, Boca Rotan, FL (1991)] 참조).
히드로겔은 숙주로 본 제제를 전달하는데 또한 유용하다. 일반적으로, 히드로겔은 펩티드를 포함한 다양한 약물 화합물에 침투성인 가교된 친수성 중합체 네트워크이다. 히드로겔은 중합체 팽창의 선택적 유발제라는 이점을 가지며, 이는 포획된 약물 화합물의 조정된 방출을 유도한다. 중합체 네트워크의 조성물에 따라, 팽창 및 후속 방출은 pH, 이온 강도, 열, 전기, 초음파 및 효소 활성을 포함한 다양한 자극 요인에 의해 유발된다. 히드로겔 조성물에 유용한 중합체의 비제한적 예로는 특히, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드); 폴리(메타크릴산-g-폴리에틸렌 글리콜); 폴리아크릴산 및 폴리(옥시프로필렌-코-옥시에틸렌)글리콜; 및 천연 화합물 예컨대, 크론드로이탄 설페이트, 키토산, 젤라틴, 피브리노겐, 또는 합성 및 천연 중합체의 혼합물 예를 들어, 키토산-폴리(에틸렌 옥시드)의 중합체로부터 형성된 중합체를 포함한다. 중합체는 가역적으로 또는 비가역적으로 가교되어 본 발명의 올리고펩티드가 포함된 겔을 형성한다 (예를 들어, 본원에 참고문헌으로 인용된 미국특허 제 6,451,346호; 제 6,410,645호; 제 6,432,440호; 제 6,395,299호; 제 6,361,797호; 제 6,333,194호; 제 6,297,337호, 문헌[Johnson, O. et al., Nature Med.2:795(1996)] 참조).
6.8 용량 및 투여
펩티드 또는 이를 코드화하는 핵산의 농도는 특정 목적을 통상적인 공정에 따라 실험적으로 측정될 것이다. 일반적으로, 치료학적 목적을 위한 생체외 또는 생체내 펩티드 투여를 위해, 본 펩티드는 약제학적 유효량으로 제공된다. "약제학적 유효량" 또는 "약물학적 유효량"은 원하는 생리학적 효과를 유도하기에 충분한 양 또는 원하는 결과를 달성할 수 있는 양 특히, 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 현상을 감소시키거나 제거하는 것을 포함하여, 질병 또는 질환을 치료할 수 있는 양이다.
숙주로 투여된 양은 투여되는 물질, 투여 목적 에컨대, 예방 또는 치료, 숙주 상태, 투여 방식, 투여 횟수, 투여 간격 등에 따라 변할 것이다. 이들은 당업자에 의해 실험에 의해 결정되며, 치료학적 반응 정도에 대해 조절될 수 있다. 적합한 용량을 측정하는데 고려되는 요인으로는 피검체의 크기 및 체중, 피검체의 연령 및 성별, 증상의 중증도, 질환 단계, 제제의 전달 방법, 제제의 반감기, 및 제제의 효능을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 질환이 급성 또는 만성, 재발성 또는 완화성인지를 고려해야 하며, 질환의 진행성을 고려해야 한다. 치료학적 유효량에 대한 투여 용량 및 투여 시간을 결정하는 것은 당해분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
본 발명에 사용된 화합물에 있어서, 치료학적 유효량은 당해분야에 공지된 방법에 의해 용이하게 결정된다. 예를 들어, 초기 유효량은 세포 배양 검정으로부터 초기에 예측될 수 있다. 염증 반응의 인디케이터 또는 펩티드 활성의 인디케이터 예컨대, 전염증성 시토킨(예를 들어, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-12 등)의 발현 수준, CTL 활성의 억제, IC 질환 마커의 존재 (예를 들어, 히스타민, 물질 P(substance P) 등)가 이용될 수 있다. 그 후, 용량은 동물 모델에서 제형화되어, 세포 배양 검정에 의해 측정되는 바와 같이 IC50을 포함하는, 순환 농도 또는 조직 농도를 형성한다.
또한, 독성 및 치료학적 효능은 일반적으로 세포 배양 검정 및/또는 실험 동물 전형적으로, LD50(시험 군집의 50%까지 치사되는 용량) 및 ED50(시험 군집의 50%가 치료학적으로 효과적임)에 의해 측정된다. 독성 및 치료학적 효능의 용량비는 치료학적 지수이다. 높은 치료학적 지수를 나타내는 개별적인 또는 혼합된 조성물이 바람직하다. 유효량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 설명을 숙지한 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
일반적으로, 펩티드 조성물이 숙주에 직접 투여되는 경우, 본 발명은 본 조성물의 알약 또는 주입액을 제공하며, 이는 약 0.01-50, 더욱 일반적으로 약 0.1-25mg/kg 숙주 체중으로 투여될 것이다. 투여량은 일반적으로 펩티드의 반감기에 따라 조절되며, 여기서 반감기는 일반적으로 1분 이상, 더욱 일반적으로 약 10분, 바람직하게는 약 10분 내지 12시간일 것이다. 개별적인 용량, 연속적 주입액 또는 반복적 투약으로 효능이 달성되는 한 짧은 반감기도 허용가능하다. 투여용 제형은 유닛 투약 형태 예를 들어, 앰플, 캡슐, 환약, 또는 다용량 컨테이너 또는 주사가능 물질로 존재할 수 있다. 더욱 낮은 범위의 용량 및 심지어 더 낮은 용량이 사용될 수 있으며, 여기서 펩티드는 증가된 반감기를 갖거나, 디팟으로써 제공되며, 예컨대, 입자, 연장된 기간 동안 펩티드를 함유하는 중합체 매트릭스(예를 들어, 콜라겐 매트릭스, 칼보머 등)를 포함하는 서방형 조성물이 제공되며, 펌프를 사용하여 사실상 연속적인 비율로 연장된 기간에 걸쳐 펩티드가 연속적으로 우러난다. 용량은 또한 투여 경로와 관련하여 조절된다. 예를 들어, 투여가 전신, 경구 또는 정맥 투여인 경우, 용량은 생체이용성에 따라 적합하게 조절된다. 숙주 또는 피검체는 가축, 애완동물, 실험용 동물, 영장류, 특히 사람 피검자를 포함한 모든 포유동물일 수 있다.
본 펩티드 조성물을 실험관내에서 세포 배양물, 생체외에서 특정 세포, 또는 생체내의 포유동물 숙주에 직접 투여하는 것 이외에, 본 펩티드를 코드화하는 핵산 분자 (DNA 또는 RNA)가 또한 투여되어, 원하는 적용을 위한 본 펩티드의 효과적인 공급원을 제공한다. 상기 기술된 바와 같이, 본 펩티드를 코드화하는 핵산 분자는 적합한 환경하에 핵산의 발현을 촉진하는 조정 서열의 전사 조절하에 다수의 널리 공지된 발현 플라스미드 (Sambrook et al., supra) 및/또는 바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 문헌[Jacobs et al., J.Virol. 66:2086-2095(1992), Lowenstein, Bio/Technology 12:1075-1079(1994) and Berkner, Biotechniques 6:616-624 (1988)] 참조)로 클로닝될 수 있다. 이러한 핵산-기재 비히클은 생체외 세포 또는 조직 (예를 들어, 펩티드 생성 세포의 이식을 위한 세포의 생체외 바이러스 감염)으로 또는 예를 들어, 주입, 카테터, 경구 (예를 들어, 히드로겔) 등으로 생체내에서 목적하는 부위로 직접 투여할 수 있거나, 바이러스-기재 벡터인 경우, 전신 투여에 의해 투여될 수 있다. 조직 특이적 프로모터가 선택적으로 사용되어, 관심있는 펩티드가 선택된 유형의 특정 조직 또는 세포에서만 발현되게 한다. 이러한 핵산-기재 비히클을 재조합적으로 제조하는 방법은 펩티드 생성을 위한 핵산-기재 비히클을 투여하기 위한 기법으로서 당해분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 목적에 있어서, 투여 방법은 처리되는 조건, 본 펩티드의 형태, 및 약제 조성물에 따라 선택된다. 올리고펩티드의 투여는 피부, 피하, 정맥내, 경구, 국부, 경피, 복막내, 근내 및 방광내를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 방법으로 수행된다. 예를 들어, 미세입자, 미소구체 및 미세캡슐화 제형은 경구, 근내, 또는 경피 투여에 유용하다. 리포좀 및 나노입자는 추가적으로 정맥내 투여에 적합하다. 약제 조성물의 투여는 단일 경로 또는 동시에 여러 경로를 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여는 정맥내 주입 또는 비경구 주입과 함께 수행될 수 있다.
한 바람직한 구체예에서, 투여 방법은 분말, 정제, 환약 또는 캡슐 형태로 경구적으로 전달된다. 경구 투여용 약제 제형은 하나 이상의 펩티드를 접합한 부형제 예컨대, 당(예를 들어, 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨), 셀룰로오스(예를 들어, 전분, 메틸 셀룰로오스, 히드록시메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스 등), 젤라틴, 글리신, 사카린, 탄산마그네슘, 탄산칼슘, 중합체 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리비닐피롤리돈 등과 혼합되어 제조될 수 있다. 환약, 정제 또는 캡슐은 장용 코팅을 가질 수 있으며, 이는 위에서는 손상되지 않은채 유지되나 장에서는 용해된다. 다양한 장용 코팅은 당해분야에 공지되어 있으며, 이들 대부분은 통상적으로 구입가능하며, 메타크릴산-메타크릴산 에스테르 공중합체, 중합체 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 아세테이트, 프탈레이트, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 펩티드의 경구용 제형은 적합한 희석제중에 제조된다. 적합한 희석제는 수성 희석제 예컨대, 물, 염수, 인산염 완충된 염수, 수성 에탄올, 당 용액 (예를 들어, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨), 글리세롤, 젤라틴 수성 형탁액, 메틸 셀룰로오스, 히드록시메틸 셀룰로오스, 시클로덱스트린 등중의 다양한 액체 형성물(예를 들어, 시럽, 슬러리, 현탁액 등)을 포함한다. 일부 구체예에서, 오일 예를 들어, 식물성 오일, 땅콩유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유, 해바라기씨유, 콩유 등; 지방산 에스테르 예컨대, 올레이트, 트리글리세리드 등; 콜레스테롤 올레이트, 콜레스테롤 리놀레이트, 콜레스테롤 미리스틸레이트 등을 포함하는 콜레스테롤 유도체; 리포좀 등을 포함하는 친지성 용매가 사용된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 투여는 피부, 경피, 복강내, 근내 및 정맥내로 수행된다. 상기 기술된 바와 같이, 적합한 수성 매질중에 용해되거나 현탁된 펩티드 형태로 존재한다. 또한, 주입용 약제 조성물은 친지성 용매중에 제조될 수 있으며, 친지성 용매는 오일 예컨대, 식물성유, 올리브유, 땅콩유, 야자유, 콩유, 해바라기씨유, 등; 합성 지방산 에스테르 예컨대, 에틸 올레이트 또는 트리글리세리드; 콜레스테롤 올레이트, 콜레스테롤 리놀레이트, 콜레스테롤 미리스틸레이트 등을 포함한 콜레스테롤 유도체; 또는 상기 기술된 바와 같은 리포좀을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 조성물은 친지성 용매 또는 바람직하게는, 유/수 에멀션중에 직접적으로 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Liu, F. et al., Pharm.Res. 12:1060-1064 (1995); Prankerd, R.J.J. Parent. Sci. Tech. 44: 139-49 (1990); and U.S. Patent No. 5,651,991] 참조).
특히 바람직한 구체예에서, 본 조성물은 방광내 점적주입에 의해 투여된다. 일반적인 공정은 카테터를 요로에 삽입하고, 본 조성물을 함유하는 적합한 희석액으로 방광을 충전시키는 것을 포함한다. 충전은 수동 주입 또는 신장 펌프에 의해 수행될 수 있다. 기전 약물 투여는 추가로 방광내 약물 전달을 추가로 보조할 수 있다 (예를 들어, 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Riedl, C.R. et al., J.Endourol. 12:269-72 (1998)] 참조).
전달 시스템은 또한 당해분야에 널리 공지된 지속된 방출 또는 장기간 전달 방법을 포함한다. 본원에 사용된 "지속된 방출" 또는 "장기간 방출"은 전달 시스템이 하루 넘게, 바람직하게는 일주일 넘게, 가장 바람직하게는 약 30일 내지 60일 동안, 또는 그 이상 동안 약제학적 치료량의 본 화합물을 투여한다는 것을 의미한다. 장기간 방출 시스템은 본 펩티드를 함유하는 이식가능한 고형물 또는 겔, 예컨대, 상기 기술된 생분해가능한 중합체 (Brown, D.M. et al., Anticancer Drugs 7:507-513 (1996)); 연동식 펌프 및 플루오로카본 추진제 펌프를 포함하는 펌프; 삼투성 및 미니-삼투성 펌프; 등을 포함할 수 있다. 연동식 펌프는 펌프를 각각 활성화시키면서 소정량의 약물을 전달하고, 저장기는 바람직하게는, 포트를 통해 통피적으로 재충전될 수 있다. 제어기는 용량을 세팅하고, 또한 전달된 용량, 잔존하는 용량, 및 전달 빈도에 대한 리드아웃(readout)을 제공할 수 있다. 플루오로카본 추진제 펌프는 플루오로카본 액체를 사용하여 펌프를 작동시킨다. 플루오로카본 액체는 대기압을 초과하는 증기압을 가하여, 약물을 함유하는 챔버를 압축하여 약물을 방출시킨다. 삼투압 펌프 (및 미니-삼투압 펌프)는 삼투압을 이용하여 일정 속도로 약물을 방출시킨다. 펩티드 조성물은 불투과성 막에 함유되며, 이는 삼투성 제제에 의해 둘러쌓인다. 반투과성 막은 삼투성 제제를 함유하며, 전체 펌프는 케이싱에 하우징된다. 반투과성 막을 통한 물의 확산은 약물을 보유하는 막을 압착시켜, 약물을 혈류, 기관 또는 조직으로 밀어낸다. 이들 및 기타 이러한 주입은 지속된 장기간 방식으로 본 발명의 올리고펩티드를 전신적 (예를 들어, 정맥내 또는 피하내) 또는 국소적 용량으로 전달하므로써 특히, 재발성 증상 발현을 나타내는 질병 또는 자연적으로 진행형인 질병을 치료하는데 특히 유용하다.
본 발명은 또한, 키트 또는 패키징된 제형 형태로 올리고펩티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 키트 또는 패키징된 약물은 특정 질병 또는 질환 상태를 치료하기 위한 투여 용량을 보유하는 컨테이너내에 하나 이상의 올리고펩티드 및 이의 염을 포함하는, 1회 이상의 투여용량의 약제 조성물을 포함한다. 예를 들어, 패키지는 수성 용액중에 혼합하기 위한 분말 형태로 혼합된 약제학적 담체와 함께 펩티드를 함유할 수 있으며, 이는 방광내로 주입되거나 투여될 수 있다. 패키지 또는 키트는 적합한 설명서를 포함하며, 이는 제형을 사용하기 위한 설명을 제공하는 도표, 레코딩 (예를 들어, 오디오, 비디오, 컴팩 디스크) 및 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
본 발명의 특정 구체예의 상기 설명은 예시 및 설명을 위한 것이다. 이들은 본 발명을 정확히 기재된 형태로만 제한하는 것이 아니며, 상기 교시된 점의 관점에서 명백히 많은 변형 및 변화가 가능하다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌 및 특허 출원은 각각의 개별적인 문헌 또는 특허 출원은 특별하고 개별적으로 본원에 참고된 것으로 지시되어 있는 경우, 동일한 문헌에 본원에 참고 문헌으로 인용된 것이다.
7. 실시예
7.1 실시예 1: 방광 세포에서 시토킨 생성물에 대한 RDP58 올리고펩티드의 영향
방광 세포에서 시토킨 생성을 억제하는 RDP58 펩티드 bc-1nL의 능력을 시험하였다. 첫번째 연구에서, BALB/c 마우스를 CO2로 안락사시키고, 방광으로부터 요를 제거한 후 방광을 수거하였다. 방광을 페니실린과 스트렙토마이신을 함유하는 RMPI 1640 배지로 부드럽게 세척하고, 1-2mm 조각으로 썰었다. 동일한 양의 조직을 37℃에서 1ug LPS(대장균 055:B5; Sigma), 50ul의 RDP58 펩티드(1mg/ml)(50uM 최종 농도), 1ug LPS + 50ul의 RDP58 펩티드의 존재하에 0.5ml의 RPMI 배양 배지, 또는 배지 단독으로만 밤새 인큐베이션시켰다. 배양 상청액을 18시간 후에 수집하고, 원심분리 후 정제되고, 시토킨 TNF-α 및 INF-γ에 대해 ELISA에 의해 검정하였다.
RDP58 펩티드의 존재는 TNF-α 생성을 각각의 풀에서 약 30%까지 억제하였다. 유사하게는, RDP58 펩티드는 IFN-γ 생성을 한 풀에서 약 10%까지 억제시키고, 두번째 풀에서 67%까지 억제시켰다. 이와 같이, 상기 결과는 RDP58 펩티드가 방광 세포에서 시토킨 생성을 억제하는데 효과적이라는 것을 보여준다.
두번째 연구에서, 12마리의 정상적인 마우스로부터 방광을 수거하고, 3개의 방광씩 4세트로 풀링하고, 조직을 1-2mm 조각으로 썰었다. 동일양의 조직을 밤새 LPS, RDP58 펩티드, LPS+RDP58 펩티드를 함유하는 배양 배지, 또는 상기 기술된 바와 같은 배지중에서 인큐베이션시켰다. 배양 배지를 원심분리에 의해 정화시킨 후, 상청액을 ELISA에 의해 TNF-α의 존재에 대해 검정하였다.
결과는, RDP58 펩티드의 존재는 TNF-α 생성을 LPS 단독으로 처리해서 관찰된 수준의 약 3.9 내지 13%로 억제하며, 평균 LPS 자극된 풀에서의 억제율의 평균 9.8% ±4.1%(p<0.001)이다 (표 V). 이와 같이, RDP58 펩티드는 일괄적이고 효과적으로 방광 세포에서의 TNF-α 생성을 억제한다.
표 V
LPS 처리된 방광 세포에서의 TNF-α 수준a
대조군 LPS RDP58 RDP58/LPS LPS 유도된 수준b의 %
풀 1 0 473.1 0 49.6 10.5
풀 2 53.6 444.6 17.1 52.6 11.8
풀 3 0 361.1 0 47.1 13.0
풀 4 0 431.1 10.6 16.6 3.9
평균 13.4 427.5 6.9 41.5 9.8
표준 편차 26.8 47.6 8.4 16.7 4.1
aTNF-α 수준 pg/ml
bLPS로만 처리된 샘플에 대한 RDP58/LPS 처리된 샘플에서의 TNF-α 수준 %
7.2. 실시예 2: 급성 간질성 방광염 모델
급성 간질성 방광염의 유도
마우스를 도뇨법으로 처리하고, 150ul중의 15ug의 대장균 리포폴리사카라이드로 점적시키므로써 급성 IC 모델을 유도하였다. 대조군을 150ul의 염수로 점적시켰다. 45분 후, 방광을 비우고, 150ul의 증류수(DW) 또는 RDP58(1mg/ml)을 30분 동안 점적시켰다. 최종 처리하고 4시간 후, 방광을 분석을 위해 절제하였다(n= 군당 3).
시토킨, 신경 성장 인자, 및 물질 P의 검정
절제된 방광을 PBS중에 간단하게 세척한 후, 10% FBS를 함유하는 500ul의 RPMI/Pen/Strep 배지로 이동시켰다. 멸균 외과 가위로, 방광을 1mm 섹션으로 슬라이싱하고, 37℃에서 5% CO2와 함께 RPMI 배지(16시간)중에서 밤새 방치하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 원심 튜브로 모으고, ~3000rpm에서 스핀 다운(spin down)시켜 방광 조각 및 부스러기를 제거하였다. 상청액을 ELISA에 의해 검정할 때 까지 -70℃로 냉동시켰다. 물질 P에 대한 검정은 어세이 디자인, 인크(Assay Designs, Inc.: Cat.No. 900-018)로부터의 키트를 사용하였다. NGF에 대한 검정은 케미콘 인터내셔널(Chemicon International: Cat.No. CYT304)로부터의 샌드위치 ELISA 시스템을 사용하였다. 시토킨 TNF-α, IFN-γ 및 IL-6에 대한 검정은 바이오소스(Biosource: Camarillo, CA: TNF-α Immunoassay Cat.No. KMC3011C; IL-6 Immunoassay Cat.No.KMC0061C; and IFN-γ Immunoassay Cat No.KM4021C)로부터의 ELISA 키트를 사용하였다.
히스타민 검정
히스타민 검정은 HTRF 바이오어세이 키트(HTRF Bioassay Kit: CIS bio international, France)를 사용하였다. 검정에서, 샘플중의 히스타민은 히스타민의 라벨링된 컨쥬게이트와 경쟁하여, 라벨링된 항-히스타민 항체가 컨쥬게이트에 결합하는 것을 방해하여, 컨쥬게이트상의 라벨과 항체간의 FRET를 감소시켰다. 실험관내에서, 히스타민에 대한 검정은 래트 바소필(rat basophil) 세포주 RBL-2H3을 사용하였다.
방광 투과성 측정
마우스를 도뇨법으로 처리하고, 150ul 부피의 15ug의 LPS로 점적시키므로써 급성 방광염을 유도하여 방광 투과성을 측정하였다. 대조군은 150ul의 염수로 점적시켰다. 45분 후, 방광을 비우고, 30분 동안 150ul의 FITC-덱스트란(25mg/ml)로 점적시켰다. FITC-덱스트란을 히드록실기에 FITC-플루오르가 불규칙하게 컨쥬게이팅된 95% 알파-D 링키지로 이루어진 무수글루코스 중합체이다. 이는 다소 플라즈마 단백질에 결합하지 않으며, 생체내에서 24시간 넘게 안정적이다.
FITC-덱스트란 점적 후, 혈액을 카디악 드로(cardiac draw)에 의해 모으고, 5분 동안 4,000rpm에서 원심분리하여 혈청을 수득하였다. 혈청의 형광성을 485nm/535nm에서 측정하였다. 방광 투과성에 대한 RDP58 올리고펩티드의 효과를 측정할 경우, 동물을 대조군에 대해서는 염수로 점적시키고, LPS 유도된 동물에 대해서는 염수 또는 RDP58로 점적시켰다. 염수 또는 LPS로도 처리하지 않은 비처리 동물은 처리하지 않은채로 방치하였다.
7.3 실시예 3: 만성 간질성 방광염 모델
만성 간질성 방광염의 유도
마우스를 도뇨법으로 처리하고, 150ul중의 15ug의 대장균 리포폴리사카라이드(LPS)로 점적시키므로써 만성 IC 모델을 유도하였다. 대조군은 150ul의 염수로 점적시켰다. 동물을 2주 동안 1주에 3회 처리하였다. RDP58의 효과를 측정하기 위해, 동물을 LPS 점적 후 14일에 펩티드로 점적시켰다. 방광의 조직학적 검정을 처리 후 24시간 또는 72시간에 수행하였다. RDP58로 처리한 후 24시간에 방광을 제거하고, 조직을 생체외에서 배양시키고, 상기 기술된 바와 같이 시토킨을 검정하므로써 시토킨 수준을 분석하였다. 방광 투과성은 FITC-덱스트란 검정을 이용하였다.
조직의 조직학적 검정
다양한 동물군으로부터의 방광을 처리한 후 회수하고, 절제하였다. 헤마톡실린-에오신으로 염색하므로써 형태학적으로 검사하였다. 항-CD45 및 항-CD3 항체로 면역염색하므로써 T-세포 분화 마커 CD3 또는 CD45의 존재하에 섹션을 검사하였다.
SEQUENCE LISTING <110> SangStat Medical Corporation <120> Cytomodulating Peptides for Treating Interstitial Cystitis <130> FP-71864-PC (465840-00522) <140> PCT/US03/37043 <141> 2003-11-17 <150> US 60/470,839 <151> 2003-05-15 <150> US 60/426,684 <151> 2002-11-15 <160> 35 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> The Xaa at position 1 can be any basic amino acid, preferably lysine or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(4) <223> The Xaa at positions 2 to 4 can be any non-polar aliphatic or aromatic amino acid of from 5 to 6 carbon atoms, preferably any amino acid other than a polar aliphatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> The Xaa at position 5 can be any basic amino acid, preferably lysine or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(8) <223> The Xaa at positions 6 to 8 can be any non-polar aliphatic or aromatic amino acid of from 5 to 6 carbon atoms, preferably any amino acid other than a polar aliphatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> The Xaa at position 9 can be glycine, or any basic amino acid, or an aliphatic hydrophobic amino acid of from 5 to 6 carbon atoms <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> The Xaa at position 2 can be an uncharged aliphatic or aromatic amino acid, preferably a non-polar aliphatic or aromatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(4) <223> The Xaa at positions 3 to 4 can be any non-polar aliphatic or aromatic amino acid of from 5 to 6 carbon atoms, preferably any amino acid other than a polar aliphatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(8) <223> The Xaa at positions 6 to 8 can be any non-polar aliphatic or aromatic amino acid of from 5 to 6 carbon atoms, preferably any amino acid other than a polar aliphatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> The Xaa at position 9 can be glycine, or any basic amino acid, or an aliphatic hydrophobic amino acid of from 5 to 6 carbon atoms <400> 2 Arg Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 3 Arg Leu Leu Leu Arg Leu Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 4 Arg Val Leu Leu Arg Leu Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 5 Arg Ile Leu Leu Arg Leu Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 6 Arg Leu Val Leu Arg Leu Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 7 Arg Leu Ile Leu Arg Leu Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 8 Arg Leu Leu Val Arg Leu Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 9 Arg Leu Leu Ile Arg Leu Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 10 Arg Leu Leu Leu Arg Val Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 11 Arg Leu Leu Leu Arg Ile Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 12 Arg Leu Leu Leu Arg Leu Val Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 13 Arg Leu Leu Leu Arg Leu Ile Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 14 Arg Leu Leu Leu Arg Leu Leu Val Gly Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 15 Arg Leu Leu Leu Arg Leu Leu Ile Gly Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 16 Arg Trp Leu Leu Arg Leu Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 17 Arg Leu Trp Leu Arg Leu Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 18 Arg Leu Leu Trp Arg Leu Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 19 Arg Leu Leu Leu Arg Trp Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 20 Arg Leu Leu Leu Arg Leu Trp Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 21 Arg Leu Leu Leu Arg Leu Leu Trp Gly Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 22 Arg Tyr Leu Leu Arg Leu Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 23 Arg Leu Tyr Leu Arg Leu Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 24 Arg Leu Leu Tyr Arg Leu Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 25 Arg Leu Leu Leu Arg Tyr Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 26 Arg Leu Leu Leu Arg Tyr Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 27 Arg Leu Leu Leu Arg Leu Leu Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(4) <223> The Xaa at positions 2 to 4 are norleucine or any D-stereoisomer amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(8) <223> The Xaa at positions 2 to 4 are norleucine or any D-stereoisomer amino acid <400> 28 Arg Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Gly Tyr 1 5 10 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 29 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 30 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 30 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 31 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> The Xaa at positions 1 to 5 can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(9) <223> The Xaa at positions 7 to 9 can be any amino acid, where one of amino acids 7 to 9 can be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(22) <223> The Xaa at positions 11 to 22 can be any amino acid, where up to 8 of amino acids 11 to 22 can be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(26) <223> The Xaa at positions 24 to 26 can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(32) <223> The Xaa at positions 28 to 32 can be any amino acid <400> 31 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 32 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(26) <223> The Xaa at positions 7 to 26 can be any amino acid, where up to 17 amino acids 7 to 26 can be absent <400> 32 Phe Gln Cys Glu Glu Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Ile Arg Ser His Thr 20 25 30 Gly <210> 33 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> The Xaa at positions 2 to 3 can be any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(24) <223> The Xaa at positions 4 to 24 can be any amino acid, where up to 16 amino acids 4 to 24 can be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(29) <223> The Xaa at positions 26 to 29 can be any amino acid <400> 33 Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 20 25 30 <210> 34 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(26) <223> The Xaa at positions 7 to 26 can be any amino acid, where up to 16 amino acids 7 to 26 can be absent <400> 34 Val Lys Cys Phe Asn Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Thr Ala Arg Asn Cys 20 25 30 Arg <210> 35 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(29) <223> The Xaa at positions 10 to 29 can be any amino acid, where up to 16 amino acids 10 to 29 can be absent <400> 35 Met Asn Pro Asn Cys Ala Arg Cys Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Lys Ala 20 25 30 Cys Phe

Claims (20)

  1. RDP58 올리고펩티드를 포함하는 약제학적 유효량의 조성물을 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 간질성 방광염을 치료하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, RDP58 올리고펩티드가 아미노산 서열 Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Gly-Tyr로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 말단 아미노산이 변형된 아미노산임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 변형된 아미노산이 아미드화된 아미노산 또는 이의 염임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 D 이성질체임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 모든 아미노산이 D-이성질체임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 투여가 방광내 점적주입에 의해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 간질성 방광염이 급성 간질성 방광염임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 간질성 방광염이 만성 간질성 방광염임을 특징으로 하는 방법.
  10. 질환에 걸린 조직 또는 세포를 RDP58 올리고펩티드를 포함하는 약제학적 유효량의 조성물과 접촉시켜 간질성 방광염의 증후를 개선시키는 것을 포함하여, 간질성 방광염을 치료하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 증후가 히드타민 방출로서 나타나며, 세포는 비만세포임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 증후가 물질 P(Substance P) 발현으로 나타남을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 증후가 NGF 발현으로 나타남을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10항에 있어서, 증후가 TNF-α 발현으로 나타남을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10항에 있어서, 증후가 요/혈액 배리어의 붕괴로 나타남을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 10항 내지 제 15항중의 어느 한 항에 있어서, RDP58 올리고펩티드가 아미노산 서열 Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Gly-Tyr로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 올리고펩티드의 하나 이상의 아미노산이 D-이성질체임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 올리고펩티드의 모든 아미노산이 D-이성질체임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 말단 잔기가 변형된 아미노산임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 변형된 아미노산이 아미드화된 아미노산 또는 이의 염임을 특징으로 하는 방법.
KR1020057008774A 2002-11-15 2003-11-17 간질성 방광염을 치료하는 세포 조절 펩티드 KR20050086676A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42668402P 2002-11-15 2002-11-15
US60/426,684 2002-11-15
US47083903P 2003-05-15 2003-05-15
US60/470,839 2003-05-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20050086676A true KR20050086676A (ko) 2005-08-30

Family

ID=32329122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057008774A KR20050086676A (ko) 2002-11-15 2003-11-17 간질성 방광염을 치료하는 세포 조절 펩티드

Country Status (13)

Country Link
US (1) US7671026B2 (ko)
EP (1) EP1594519A4 (ko)
JP (1) JP2006516546A (ko)
KR (1) KR20050086676A (ko)
AU (1) AU2003294357A1 (ko)
BR (1) BR0316290A (ko)
CA (1) CA2505922A1 (ko)
CO (1) CO5640064A2 (ko)
MA (1) MA27607A1 (ko)
MX (1) MXPA05005101A (ko)
NO (1) NO20052814L (ko)
RU (1) RU2005118425A (ko)
WO (1) WO2004045554A2 (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2069791B1 (en) * 2006-07-27 2012-01-25 University of Maryland, Baltimore Cellular receptor for antiproliferative factor
DK2252627T3 (en) * 2008-01-24 2017-08-14 Esperance Pharmaceuticals MERGER CONSTRUCTION WITH LYTIC DOMAIN AND METHOD FOR PRODUCING AND USING SAME.
AU2009282625A1 (en) * 2008-08-18 2010-02-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Derivatives of APF and methods of use
JP5857056B2 (ja) 2010-10-14 2016-02-10 ザイジェン インフラメーション エルティーディー 慢性又は非慢性の炎症性眼疾患を治療するためのｊｎｋシグナル伝達経路の細胞透過性ペプチド阻害剤の使用
WO2014204988A2 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Asana Biosciences, Llc 5t4-targeted immunofusion molecule and methods
WO2015197194A2 (en) * 2014-06-26 2015-12-30 Xigen Inflammation Ltd. New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
WO2014206426A1 (en) * 2013-06-26 2014-12-31 Xigen Inflammation Ltd. New use for jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases
WO2014206427A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Xigen Inflammation Ltd. New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases
WO2015197097A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 Xigen Inflammation Ltd. New use for jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases
US10859579B2 (en) * 2016-03-31 2020-12-08 William Beaumont Hospital Methods for detecting, diagnosing and treating ulcerative interstitial cystitis

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6696545B1 (en) * 1997-04-11 2004-02-24 Sangstat Medical Corporation Cytomodulating lipophilic peptides for modulating immune system activity and inhibiting inflammation
CN1216900C (zh) * 1997-04-11 2005-08-31 桑斯塔特医学有限公司 用于调节免疫系统活性和抑制炎症的细胞调节性亲脂肽
JP2002512259A (ja) * 1998-04-17 2002-04-23 ユニバーシティ・オブ・メリーランド， ボルティモア 組換えヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子（ｈｂ−ｅｇｆ）による間質性膀胱炎の治療方法
PL374700A1 (en) * 2002-09-20 2005-10-31 Alcon, Inc. Use of cytokine synthesis inhibitors for the treatment of dry eye disorders

Also Published As

Publication number Publication date
JP2006516546A (ja) 2006-07-06
AU2003294357A1 (en) 2004-06-15
EP1594519A2 (en) 2005-11-16
CO5640064A2 (es) 2006-05-31
EP1594519A4 (en) 2006-08-16
MXPA05005101A (es) 2005-09-08
WO2004045554A2 (en) 2004-06-03
MA27607A1 (fr) 2005-11-01
BR0316290A (pt) 2005-10-11
NO20052814D0 (no) 2005-06-10
RU2005118425A (ru) 2006-02-10
NO20052814L (no) 2005-08-04
US7671026B2 (en) 2010-03-02
CA2505922A1 (en) 2004-06-03
US20060194738A1 (en) 2006-08-31
WO2004045554A3 (en) 2005-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20040186052A1 (en) Cytomodulating peptides and methods for treating neurological disorders
US20090047335A1 (en) Anti-angiogenic peptides and methods of use thereof
US20050074884A1 (en) Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and /or nuclear transport of proteins, DNA and viruses
US20070253968A1 (en) Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and viruses
US8119601B2 (en) Voltage dependent anion channel (VDAC1) compositions and methods of use thereof for regulating apoptosis
JP2012529272A (ja) Ｇｄｎｆおよびｂｄｎｆを中枢神経系へ送達するための融合タンパク質
US11046739B2 (en) BH4 stabilized peptides and uses thereof
KR20050086676A (ko) 간질성 방광염을 치료하는 세포 조절 펩티드
WO2006042282A2 (en) Peptide inhibitors against seprase
US7094413B2 (en) Combined therapy for treatment of HIV infection
KR101752260B1 (ko) 당뇨병의 혈관 합병증 치료
JP2005524650A (ja) 細胞破壊治療によって誘導される消化管毒性の治療方法及び治療のための組成物
KR102017973B1 (ko) 항-b형 간염 바이러스 x 단백질 폴리펩티드 약제
CA3145703A1 (en) A peptoid-peptide hybrid, nmeg-acgrp, and its use in cardiovascular diseases
CN1735425A (zh) 用于治疗间质性膀胱炎的细胞调节肽
WO2005009457A1 (en) Rdp58 compositions and methods for inhibiting vascularization of cell populations
KR20100003823A (ko) 제2형 수분통로단백이 포배된 막과 특이적으로 결합하는펩타이드 및 이의 용도
WO2005001075A1 (en) Rdp58 compositions and methods for modulating the activity of osteoclasts and osteoblasts
KR20090091590A (ko) 스태빌린-2의 ｅｇｆ-유사 도메인의 반복부위 단편을유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid