KR20050067410A - 치료학적 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CEACAM 수용체에 결합되는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 외막 단백질로부터 분리되는 리간드를 제공하며, 이때 리간드는 기술된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 또는, 이의 단편, 동족체, 작용성 등가물, 유도체, 축퇴물 또는 하이드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 다른 2차 가공 생성물을 포함하는 수용체 결합 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한 당해 리간드를 포함하는 약제 및 백신과, 감염의 치료 또는 예방에 있어서의 이들의 용도를 제공한다. 또한, 신규 치료학적 화합물의 동정을 위한 선별법을 제공한다.

Description

치료학적 펩티드{Therapeutic peptides}
도 1은 니트로셀룰로즈 상에 고정화된 3개의 균주에 대한 CEACAM1-Fc(1 ㎍·㎖-1) 가용성 수용체 작제물 단독(백색, 좌측 바아) 또는 CEACAM1 N-도메인 특이적 항체 YTH71.3(회색, 중심 바아)의 존재하에 상대적인 결합 수준을 도시한 그래프이다. 각 경우에 CD33-Fc 결합은 무시할 만 하다(흑색, 우측 바아). 균주 1, 2, 3은 각각 MX2(ATCC 25238), MX3, MX4(임상적 분리물)이다. 결합은 도트 블롯 오버레이(dot blot overlay) 법으로 측정하고, 반응의 세기는 NIH Scion 이미지 프로그램을 사용하는 밀도측정 분석법에 의해 정량화한다.
도 2는 비해리하에(비가열, 레인 1) 또는 10분 동안 가열한 후에(레인 2) 분리된 균주 MX2 단백질의 웨스턴 블롯을 나타낸 것이다. 블롯은 CEACAM1-Fc(㎍·㎖-1) 및 고추냉이 퍼옥시다제 및 이의 기질에 접합된 항-사람 Fc 항체에 의해 검출되는 수용체 결합과 겹친다.
도 3은 균주 MX2, MX3, MX4(각각 레인 1 내지 3)의 변성 전세포 용해물의 웨스턴 블롯이 CEACAM1-Fc(㎍·㎖-1; a), 항-UspA1 펩티드 항체(10 ㎍·㎖-1; b) 및 항-UspA2 펩티드 항체(10 ㎍·㎖-1; c)와 겹침을 나타내고 있다. 세 균주에서 CEACAM1-Fc 결합 단백질 및 항-UspA1 결합 단백질의 유사한 이동 프로필을 주시한다. 약 250 kDa에서 해리되지 않은 단백질의 잔여물(이 경우에, 알칼리성 포스파타제 검정시 보다 높은 검출 감수성으로 인하여 감지됨)은 CEACAM1-Fc에 결합된다. 이들은 항-펩티드 항체에 의해 단지 약하게 인식되는데, 이는 아마도 합성 펩티드내에 함유된 에피토프가 천연 단백질에 완전히 노출되지 않고, 점진적으로 복합 축퇴물로서 노출되기 때문이다. 항-UspA2 항체는 겉보기 질량이 200 kDa 보다 큰 단백질에 결합되고, 이는 가열후에 해리되지 않고 잔류하며, 이는 UspA2 단백질임을 지적한다.
도 4는 MX2의 CEACAM1 결합 단백질의 트립신 분해 펩티드의 질량 스펙트럼에 이은, 전기-용출(4a)을 나타낸 것이다. 완전한 단백질 동정 데이타베이스로 데이타 입력한 요약이 (4b)에 제시되어 있다. 상위 10개의 동정된 단백질의 테이블 및 확률값이 (4c)에 제시되어 있다. 제1 등급의 후보물인, 이 경우에 Z-스코어가 2.34인 UspA1의 상세한 설명이 매치되는 펩티드 번호, 단백질내에 이들의 위치, 커버된 단백질의 % 및 이 경우에 매치되지 않은 펩티드 리스트를 제시하면서 (4d)에 제시되어 있다.
도 5는 MX2의 UspA1의 트립신 분해 단편의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. A: 2차 항체(B 및 C에 사용되는 염소 항-사람 Fc 및 염소 항-래빗 Ig의 혼합물)를 사용하는 대조군 블롯. B: CEACAM1-Fc 및 염소 항-사람 Fc와 겹쳐진 블롯. C: UspA1 펩티드(ETNNHQDQKIDQLGYALKEQGQHFNNR)(참조 도 6) 및 항-래빗 Ig에 대해 상승된 친화성 정제된 래빗 항체와 겹쳐지는 블롯. * = 분자량 마커가 있는 레인 - 좌측에 제시됨. 이중 화살표로 제시된 펩티드는 항-UspA1 펩티드 항체(C) 뿐만 아니라, CEACAM1-Fc(B)와 강하게 반응한다. 최저 MW 펩티드(화살표)에 대한 항-UspA1 펩티드 항체의 결합은 이러한 CEACAM-결합 단편을 MX2의 UspA1의 N-199 내지 K-863내에 함유된 C-말단 단편으로서 동정한다(참조: 도 6).
도 6은 MX2 UspA1 단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 래빗에서 항혈청을 상승시키는데 사용되는 UspA1-특이적 펩티드는 굵게 나타내었다. CEACAM-결합 영역은 MX2의 UspA1의 밑줄친 C-말단 단편에 함유된다.
도 7은 CEACAM과 반응하는 트립신 분해 펩티드의 분리를 나타낸 것이다. 엠. 카타르할리스 균주 MX2는 37 ℃에서 10분 동안 1 ㎎/㎖의 트립신으로 처리한다. 트립신 분해된 샘플은 SDS-PAGE에 적용시킨다. 염색후, 50 kDa 영역은 밤새 전기용출시킨다. 전기용출된 단백질은 동결건조시키고, 완충액에 재현탁시켜, 2차 겔에 적용시킨다. 겔 부분은 니트로셀룰로즈 상에 블롯팅시키고, CEACAM과 반응하는 펩티드 밴드는 CEACAM1-Fc(블롯)를 사용하여 웨스턴 블롯 오버레이로 동정한다.
[*]: N-말단 서열분석을 위해 보내진 펩티드 밴드를 나타낸다.
도 8은 MX2 UspA1 단백질의 트립신 분해 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 제시된 50 kDa 트립신 분해 펩티드(아미노산 463 내지 863번)는 CEACAM 및 UspA1 펩티드(밑줄친 아미노산 753 내지 780번)에 대한 항혈청에 결합된다. 약 50 kDa CEACAM 결합 펩티드의 N-말단 서열은 아미노산 462번의 트립신 절단 부위 이후에 생성되는 "ALESNVEEGL"이다.
도 9는 재조합 펩티드의 발현을 위한 uspA1 유전자 단편을 생성하는데 사용되는 프라이머의 위치를 도식적으로 나타낸 것이다. CEACAM1 결합 부위는 프라이머 P4 및 P7에 의한 DNA 증폭에 의해 암호화되고, 이 영역(문자 A-l)을 통한 부가의 프라이머를 고안하여 사용한다.
도 10은 재조합 단편 4-7의 서열을 나타낸 것이다. 밑줄친 영역은 CEACAM1-반응성 트립신 분해 펩티드의 N-말단 영역이다. 단편 4-7의 예상되는 분자량은 약 26 kDa이다. His-태그된 단편의 예상 MW: 약 28 kDa. 절단된 펩티드의 위치는 'T'로 나타낸다(참조: 도 13).
도 11은 pQE30 시스템으로 예시되는 바와 같이, 재조합 UspA1 펩티드에 대한 일반적인 클로닝, 발현 및 정제 계획을 나타내는 다이아그램이다.
도 12는 벡터 pQE30의 지도이다.
도 13은 재조합 4-8(레인 3), 4-T(레인 4) 및 4-7(레인 5) 폴리펩티드에 대한 블롯 오버레이인 CEACAM1-Fc의 결합을 나타낸 것이다. 레인 1은 트레포네마 대조군 재조합 펩티드를 함유하고, 레인 2는 4-8 작제물을 함유하는 비-유도된 M15의 용해물을 함유한다.
도 14는 항-His 태그 항체(상부) 및 CEACAM1-Fc(기저)와의 재조합 펩티드 반응성을 나타내는 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 레인 2-4는 6 내지 8개의 펩티드를 함유하고, 레인 1은 대조군으로서 4-8을 함유한다. 펩티드의 예상되는 이동 위치가 우측에 제시되어 있다. 두 펩티드는 모두 항-His 항체에 결합된다. 그러나, 4-8이 CEACAM1-Fc에 결합되는 반면에, 6-8은 결합되지 않는다.
도 15는 D-8 폴리펩티드가 CEACAM1-Fc에 결합되지만(레인 1), 대조군으로서 사용되는 CD33-Fc에는 결합되지 않음(레인 2)을 나타내고 있다. 펩티드의 기원은 항-His 태그 항체(레인 3)와의 반응성에 의해 확인한다.
도 16은 rUspA1 단편의 상대적 크기 및 위치를 나타내는 도식적 다이아그램이다. 재조합체 4-7은 세균성 차단을 위해 사용되었다 - 참조 도 17.
도 17은 CHO-CEACAM1 형질 감염체를 펩티드의 부재하에(A), 또는 제시된 농도의 재조합 대조군 펩티드(트레포네마 펩티드, B)나 UspA1 r4-7 펩티드(균주 MX2에 상응하는 서열, C 및 D) 및 부가된 세균의 존재하에 2시간 동안 배양함을 제시하고 있다. 이 배양이 끝날 무렵, 결합되지 않은 세균은 세척하고, 결합된 세균은 항-엠. 카타르할리스 폴리클로날 항혈청 및 TRITC 접합된 2차 항체에 의해 검출한다. 1 ㎍/㎖에서 이종성 엠. 카타르할리스 균주(MX1)의 상당한 억제가 수득되며, 10 ㎍/㎖에서는, 에이치. 인플루엔자 결합이 엠. 카타르할리스 UspA1 재조합 펩티드에 의해 상당히 억제된다.
실시예 1. 모락셀라 카타르할리스( Moraxella catarrhalis ) 균주는 UspA1 단백질을 통해 사람의 CEACAM1-Fc에 결합한다
이 연구에 사용되는 모락셀라 카타르할리스(Mx) 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에서 입수한 표준 균주(ATCC 25238, 이것의 클론 배양은 MX2로 표시함) 뿐만 아니라, 임상적 분리물(MX3 및 MX4)을 포함한다.
수용체 오버레이 검정법은 Mx가 CEACAM1-Fc 수용체 작제물에 결합되는 것을 나타낸다
엠. 카타르할리스 균주와 CEACAM1과의 상호작용을 평가하기 위하여, 세균(약 4-8 x 106)을 니트로셀룰로즈에 적용시키고, 공기 건조시켜, 비특이적 결합 부위를 3% BSA-PBST로 차단한다. 니트로셀룰로즈 스트립은 CEACAM1-Fc(1 내지 2 ㎍·㎖-1) 단독 또는 CEACAM1 N-도메인 항체 YTH71.3의 존재하에 겹쳐진다. CD33-Fc(1 내지 2 ㎍·㎖-1)는 네가티브 대조군으로서 사용된다. 키메라 단백질 작제물은 앞서 기술한 바와 같이 제조한다11. 키메라성 수용체 결합은 고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제에 접합된 염소 항-사람 Fc 항체에 의해 검출한다. 블롯은 디아미노 벤지덴 및 과산화수소나 니트로블루 테트라졸륨 및 5-브로모-4-클로로-3-인도일포스페이트 기질에 의해 각각 전개시킨다. 모든 Mx 균주는 CEACAM1-Fc에 결합되지만, CD33-Fc에는 결합되지 않는다(도 1). 수용체 결합은 모노클로날 항체 YTH71.3의 존재하에 억제됨으로써, 수용체의 N-말단 도메인에 균주가 결합됨을 제시하고 있다. 따라서, 모든 균주는 단지 N 도메인만을 함유하는(도시되지 않음) CEACAM1의 절단된 N-Fc 작제물에 동일하게 잘 결합된다.
엠. 카타르할리스의 CEACAM1-Fc 결합 단백질의 동정
Mx의 전세포 용해물(약 3 x 107)은 미리 가열 처리없이, 또는 100 ℃에서 10 분 동안 가열한 후에 10% 비스-트리스 폴리아크릴아미드 겔(인비트로겐)의 개개 레인에 적용시키고, 180 V에서 45분 동안 전기영동시킨다. 겔로부터의 단백질을 표준 블롯팅 조건을 사용하여 니트로셀룰로즈 막으로 이동시킨다. 니트로셀룰로즈 막은 상기 기술한 바와 같이 가용성의 키메라성 작제물과 겹쳐진다. 각 경우에, CEACAM1-Fc에 특이적으로 결합되는 단일 단백질이 관찰된다. 겔 상의 단백질의 이동은 Mx의 UspA1 단백질임을 지적하고, 이는 세균 용해물을 열변성없이 적용하는 경우에, CEACAM1 결합 단백질은 겉보기 질량이 200 kDa 보다 크게 이동되는 반면, 용해물을 먼저 가열하면, CEACAM1-결합 단백질은 대략 92 kDa의 감소된 질량으로 이동되기 때문이다(도 2).
UspA1에 대해 유도되고, 유사 단백질인 UspA2에 대해서는 유도되지 않은 항체는 Mx 균주의 CEACAM1-Fc 결합 단백질에 결합된다
펩티드는 엠. 카타르할리스 균주의 UspA 단백질에 대해 공개된 서열에 따라 고안한다. 즉, ETNNRQKDKIDQLGYALKEQGQHFNNR(UspA1-펩티드) 및 KDEHDKLITANKTAIDANKAS(UspA2-펩티드). 펩티드는 혼입된 N-말단 시스테인 잔기를 통해 KLH에 결합되고, 14일 간격으로, 먼저 완전한 프로인트 보조제와 함께, 그 이후에는 불완전 프로인트 보조제와 함께 래빗을 면역화하기 위하여 사용한다(래빗당 200 ㎍의 펩티드). 래빗은 0일째 및 면역화후 14일 간격으로 채혈한다. 폴리클로날 항체는 아미노링크 플러스 칼럼(AminoLink Plus columns)(Pierce)에 결합된 적절한 펩티드를 사용하여 정제한다. UspA-특이적 항체는 웨스턴 블롯 오버레이 법에서 1 내지 10 ㎍·㎖-1의 농도로 사용되며, 알칼리성 포스파타제에 결합된 염소 항-래빗 2차 항체에 의해 검출된다. 블롯은 앞서 기술한 바와 같이 전개시킨다. 세 개의 Mx 균주의 SDS-PAGE 상의 CEACAM1-Fc 결합 단백질의 이동은 UspA1-항체 결합 단백질의 것과 동일하지만, UspA2-항체 결합 단백질의 것과는 동일하지 않다(도 3).
CEACAM1-Fc와 함께 공침전되는 엠. 카타르할리스 리간드는 UspA1로서 동정된다
세균의 밤새 배양물은 프로테아제 억제제 칵테일(pic: PMSF 1 mM, E-64 1 μM, 펩스타틴 A 1 μM, 베스타틴 6 nM 및 EDTA 100 μM)을 함유하는 PBSB중 100 mM 옥틸 βD 글루코피라노시드에 현탁시킨다. 샘플을 철저히 혼합하고, 4 ℃에서 밤새 방치시킨다. 한편, 세파로즈 CL-4B(Sigma)에 결합된 100 ㎕ 단백질 A는 20 ㎍의 CEACAM1-Fc 또는 CD33-Fc(대조군으로 사용됨)에서 4 ℃에서 밤새 배양하고, 이어서 PBSB로 3회 세척하여 결합되지 않은 수용체를 제거한다. 불용성의 세균성 물질은 15,000 g로 30분 동안 원심분리하여 제거한다. 가용성 추출물은 수용체-단백질 A 세파로즈 복합체와 함께 4 ℃에서 2시간 동안 배양한다(수용체 작제물 ㎍ 당 세균 5 x 108의 비율로). 50 mM 옥틸 βD 글루코피라노시드로 광범위하게 세척한 다음, PBSB 샘플은 SDS-PAGE 전기영동법 및 변성 조건하에 웨스턴 블롯팅 법으로 분석한다.
CEACAM1-Fc와의 공침전 실험에서, MX4는 약 97 kDa의 강하게 염색된 단백질을 수득하고, MX3은 약 92 kD의 비교적 약하게 염색된 단백질을 수득한다. 공침전 단백질의 질량은 수용체 오버레이 실험에서 관찰된 것에 상응한다(도 3에 제시됨). 어떠한 단백질도 CD33-Fc와는 공침전하지 않는다. 공침전 단백질은 또한 UspA1 단백질로서 동정되는데, 이는 이들이 항-UspA1 펩티드 항체에 결합되기 때문이다. 또한, 겔로부터 절제한 다음, MX4 단백질은 MALDI-TOF 질량 분석법에 적용시킨다(하기 참조).
MALDI-TOF 질량 분석법에 의한 CEACAM1 리간드 동정
(a) 웨스턴 오버레이 샘플. MX2 및 MX3의 전세포 용해물은 트렌치 겔중 SDS-PAGE에 적용시키고, CEACAM1-Fc 결합 리간드에 상응하는 단백질 밴드는 겔로부터 전기 용출시킨다. 샘플을 농축시키고, 2차 겔의 단일 레인에 다시 적용시켜, 적절한 단백질의 겔 내 트립신 분해 전에 전기영동시킨다. 생성된 펩티드는 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화-이동 시보(Matrix-assisted Laser desorption/ionisation-time-of-flight; MALDI-TOF) 질량 분석법에 의해 분석한다. 생성된 질량 스펙트럼의 예가 MX2의 CEACAM 결합 단백질에 대해 제시되어 있다(도 4a). 수득된 펩티드 매스는 완전한 단백질 동정 부위로 도입시키고, 이 단백질에 대해 제시된 바와 같은 결과를 수득한다(도 4b, c). 이 경우에, 10개의 펩티드 매스가 단백질의 대략 18%를 차지하는 엠. 카타르할리스의 UspA1의 트립신 분해 펩티드에 대해 예상되는 질량과 일치한다(도 4d). 예상치가 2.34인 Z 스코어는 단백질이 UspA1이라는 것을 강하게 예시한다(Z 스코어 > 1.65는 95번째 백분위수 이상이다; http:/129.85.19.192/profound_bin/webProFound.exe.). 또한, 다른 결합되지 않은 MX2의 고분자량 밴드는 유사한 분석에 따라 UspA2로서 동정된다. 균주 MX3에 대해서도 유사하게, CEACAM1 결합 및 비결합 단백질은 UspA1 및 UspA2로서 각각 동정된다.
(b) 공침전 샘플: MX4의 경우, CEACAM1-Fc 공침전 단백질(상기 기술한 바와 같음)은 또한 모든 분류 연구에서 MALDI-TOF MS에 의해 Z 스코어가 2.27인 UspA1로서 동정된다. 단백질의 21%를 차지하는 12개의 펩티드가 일치한다.
따라서, 이 연구는 모락셀라 카타르할리스가 제시된 표준 및 임상적 균주에서 고분자량 단백질 UspA1을 통해 사람의 CEACAM1을 표적으로 함을 확인하였다.
UspA1 및 재조합 펩티드의 효소적 분해
(a) UspA1의 트립신 분해 펩티드는 CEACAM1-Fc에 결합한다
MX2 세균성 현탁액(1010 ㎖-1)은 0.1 내지 1 ㎎/㎖의 농도인 트립신(Sigma)으로 처리하고, 37 ℃에서 1 내지 4시간 동안 배양한다. 분해된 용해물은 SDS-PAGE 완충액에서 해리시키고, 비등하여, 전기영동시킨다. 니트로셀룰로즈로 옮긴 후에, 블롯은 수용체 작제물 CEACAM1-Fc 또는 친화성 정제된 항-UspA1 펩티드 항체와 겹쳐진다. 수용체와 반응하는 작은 단편은 또한 항-UspA1-특이적 항체에 결합된다(도 5).
(b) 엠. 카타르할리스 균주 MX2의 UspA2의 CEACAM 결합 도메인의 위치 결정
MX2 세균성 현탁액은 37 ℃에서 10분 동안 1 ㎎/㎖의 트립신으로 처리한다.
트립신 분해 샘플은 SDS-PAGE 겔에서 수행한다. 염색후, 50 kDa 영역은 밤새 전기용출시킨다. 전기용출된 단백질은 동결건조시키고, 완충액에 재현탁시켜, 2차 겔에 적용시킨다. 겔 부분은 니트로셀룰로즈 상에 블롯팅시키고, CEACAM과 반응하는 펩티드 밴드는 CEACAM1-Fc를 사용하여 웨스턴 블롯팅 오버레이 법으로 동정한다(도 7).
펩티드 밴드는 약 50 kDa에 상응하고, 약 150 kDa 펩티드는 N-말단 서열분석한다. N-말단 서열은 ALESNVEEGL(약 50 kDa 펩티드) 및 ALESNV(약 150 kDa 펩티드)이다. 150 kDa 단백질은 이들이 동일한 N-말단 서열을 가지므로 확실히 50 kDa 단백질의 삼량체이다. 이러한 MX2 UspA1의 펩티드의 N-말단 서열은 도 8에 제시되어 있다.
(c) 재조합 펩티드
도 6에 제시된 서열중 아미노산 1 내지 449번으로 이루어진 작제된 N-말단 재조합 MX2 펩티드는 CEACAM에 결합되지 않는다. 이는 또한 도 8에 제시된 서열의 아미노산 463 내지 863번으로 이루어지고, N-말단 서열 ALESNVEEGL을 갖는 약 50 kDa의 트립신 분해 펩티드가 CEACAM-결합 도메인을 함유한다고 제시한다.
실시예 2. 점막성 병원체의 다중 독성 결정 인자에 대한 수용체 결합 도메인의 동정
엠. 메닝기티디스 및 에이치. 인플루엔자는 CEACAM 상의 중복 부위에 결합하는 리간드를 통해 사람의 CEACAM 분자를 표적으로 한다. 본 발명의 Mx 리간드는 또한 N 도메인을 표적으로 한다. 이들 관찰은 몇몇 점막성 병원체의 리간드에 대한 유사한 특성이 수용체 표적화에 관여될 수 있다는 흥미로운 가능성을 지적하였다.
CEACAM과 Nm 및 Hi의 상호작용은 표면 발현된 변이적 도메인의 구조적 특징에 의해 영향을 받으므로, 이는 이들이 수용체에 결합될 수 있는 공간 형태로 유사한 결정적인 아미노산을 함유할 수 있고, 이들은 다른 변이 단백질로 보존될 수 있음을 제안한다. 실제로, 우리의 연구 및 다른 연구들은 Opa의 두 개의 과변이 루프(HV1 및 HV2)가 CEACAM 표적화에 관여될 수 있다고 제안하고 있다9,18. 리간드와 수용체와의 상호작용의 가능한 결정 인자를 동정할 수 있는 한 강력한 기술은 파아지 디스플레이(phage display)로, 이는 압타머(aptamer)(리간드 결합을 억제하는 본래 구조에 보다 밀접하게 관련되는 서열)20 뿐만 아니라, 미모토프(결합 도메인을 모방하는 랜덤 서열)19를 동정하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 CEACAM에 결합하는 Mx 리간드 도메인이 다른 CEACAM-결합 점막성 병원체에 대한 모사체로서 작용하고, 이러한 리간드의 구조적 특징은 CEACAM N-도메인 표적화를 위해 Nm 및 Hi 리간드에 필요한 두드러진 특징을 동정하는 것을 도움으로써 상당히 융통성있게 만든다. Mx 도메인에 대한 항체는 동일하거나, 유사하거나, 근접하게 위치하는 수용체 영역을 표적화하는 능력을 갖는 다른 리간드를 동정하는 잠재력을 가질 수 있다.
MX2 UspA1의 최소한의 CEACAM1 결합 도메인의 동정은 단백질 공학 및 재조합 DNA 기술의 공지된 방법을 사용하여 수행한다. 재조합 펩티드는 수용체에 결합되는 MX2 도메인을 검출하기 위하여 상기 기술한 수용체 오버레이 검정법에 의해 시험관내에서 선별할 수 있다. His-태그 펩티드는 닉켈 칼럼에서 분리할 수 있고, His-태그는 필요에 따라 절단하고, 다른 연구를 위한 항체를 수득하기 위하여 래빗 및 마우스를 면역화시키는데 사용된다.
생물학적 적용을 위한 적절한 길이의 펩티드는 수용체 결합의 차단과 같은, 다른 작용 뿐만 아니라, 면역학적 자극 특성을 조사하여 결정할 수 있다.
실시예 3. 리간드 상호작용에 필요한 수용체의 두드러진 특징
CEACAM의 N-도메인은 Opa 단백질의 상호작용에 충분하므로, 본 발명자는 또한 CEACAM N-도메인의 유착성 에피토프를 연구하기 위하여 파지 디스플레이 기술을 사용한다. 수용체의 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발9에 의해 본 발명자가 연구하여 온 수용체에 대한 리간드-결합 영역(들)의 지식들이 이 연구를 용이하게 한다. 이 경우에 또한, 리간드 오버레이 검정법이 수용체 서열을 함유하는 키메라 파지의 바이오패닝(biopanning)(친화성 농축)에 유용하다.
수용체 동족체는 생성된 Opa 형태와 무관하게 다중 균주를 차단하는 잠재력을 갖는데, 이는 본 연구가 항원성 변화에도 불구하고, 특정 Opa 단백질이 1차 유착을 위해 수용체에 대한 통상의 특성을 필요로 한다고 이미 제시하고 있기 때문이다9. CEA 항원은 장 점막으로부터 생성되고, CEACAM을 표적으로 하는 것으로 또한 공지된 이. 콜라이(E. coli) 균주의 유착을 차단할 수 있음을 특히 주지한다. 이는 선천적 면역성 대 장 병원체의 메카니즘으로서 제안되었다. 12따라서, 이들 수용체 동족체는 치료학적 제제로서 작용한다.
실시예 4. 재조합 CEACAM-결합 모락셀라 카타르할리스 UspA1 펩티드의 생성
요약:
UspA1 길이에 따른 몇몇 단편의 PCR 증폭은 도 9에 제시된 프라이머를 사용하여 수행한다. 재조합 펩티드는 하기에 기술되는 바와 같이 수득한다. 첫 라운드에서, CEACAM1에 결합되는 재조합 펩티드는 프라이머 P4 및 P8에 의해 증폭된 DNA에 의해 암호화되지만, P1 내지 P5 사이의 영역에 의해서 암호화되는 것은 아님이 밝혀졌다. 또한, 재조합 P4 내지 P7은 CEACAM1에 결합되지만, P6 내지 P8은 아니다. 부가의 프라이머가 P4 및 P7 영역내에서 사용된다. 영역 D-7은 CEACAM-결합을 보유한다. 단편 4-7의 서열이 도 10에 제시되어 있다.
재조합 UspA1 펩티드에 대한 일반적인 클로닝, 발현 및 정제 계획
UspA1 단편 1 내지 5는 pBAD 시스템을 사용하여 생성한다. 필요한 PCR 생성물은 pBAD 벡터로 클론화된 TA이고, TOP10 이. 콜라이 균주가 증폭을 위해 사용된다. 과정의 나머지는 도 11에 제시되어 있으나, 단 pBAD는 아라비노즈를 사용하여 유도한다. 단편 4 내지 7은 pBAD 및 pQE30을 모두 사용하여 생성한다(도 11). 유사한 CEACAM-결합을 갖는 시스템이 생성된다. 단편의 나머지는 도 11의 계획을 사용하여 생성한다.
벡터 및 pQE30 발현 시스템
벡터 pQE30(도 12)은 이. 콜라이 균주 M15와 함께 사용된다. M15는 pQE30으로 클로닝된 DNA의 전사를 제한하는 리프레서를 암호화하는 플라스미드 pREP4를 함유한다. 1 mM의 농도로 IPTG의 부가는 이 리프레서의 암호화 및, 이에 따른 pQE30중 클로닝된 단편의 전사를 방지한다.
클로닝 계획
PCR 증폭 인자를 먼저 pCR2.1에 결합시킨다. 이는 증폭 인자가 제한 분해(BamHI/PstI)로 회수할 수 있는 안정한 숙주를 제공하여, 유전자 단편의 각 말단이 절단되도록 보장한다. pQE30은 유사하게 분해하고, 두 제한 부위를 절단하는 것이 또한 보장되는, 겔 정제에 의해 회수한다. 분해된 pQE30 및 UspA1 증폭 인자는 밤새 16 ℃에서 T4 DNA 리가제로 결합시켜, CaCl2 컴피턴트 이. 콜라이 M15로 형질전환시킨다. 형질전환체는 암피실린(100 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)으로 보충된 LB 한천 위에서 선택한다. 4 내지 8개 콜로니를 채취하고, 항생제를 함유하는 LB 브로스에서 성장시킨다. 3 내지 4 ㎖의 배양액으로부터 세균은 원심분리에 의해 수거하고, 알칼리 분해 미니프렙 법에 적용시킨다. 정제된 벡터는 상기와 같이 분해 하여 uspA1 삽입물을 체크한다. 정확한 크기의 삽입물을 갖는 pQE30을 함유하는 세균은 50 ㎖ 배양액에서 성장시키고, IPTG에 의해 유도한다(하기 참조). 그 다음에, 웨스턴 블롯을 재조합 단백질 제조에 대해 선별하기 위하여 사용한다. 또한, 벡터는 삽입물이 DNA의 정확한 부위에 존재하는 지를 결정하고, 서열 오차를 조사하기 위하여 서열분석한다.
발현 및 정제
pQE30/uspA1 작제물을 함유하는 M15는 1 mM 농도의 IPTG를 부가하기 전에 OD600 = 0.5로 교반하면서, LB(100 ㎍/㎖의 암피실린 및 25 ㎍/㎖의 카나마이신으로 보충됨) 브로스에서 성장시킨다. 배지는 다시 3 내지 4시간 동안 배양시키고, 세균은 원심분리에 의해 회수한다. 세균 펠릿은 완충액 B(8M 우레아, 50 mM 트리스, 10% 에탄올, 2% 트윈, 5 mM 이미다졸, pH 7)에서 1 내지 3시간 동안 용해시키고, 막 물질은 20,000 g에서 20분 동안 원심분리하여 제거한다. 상등액은 회전식 혼합기에서 1 내지 2시간 동안 닉켈 수지와 함께 배양하고, 폴리프로필렌 칼럼을 통해 통과시킨다. 보유된 수지는 5 내지 10 ㎖의 완충액 B로 세척하고, 결합된 단백질은 100 mM 이미다졸이 보충된 완충액 B의 0.5 ㎖ 용출로 용출시킨다. 용출된 단백질은 투석 전에 SDS-PAGE로 조사하여 우레아 및 다른 염을 제거한다.
재조합 단편
A: 단편 1 내지 5 및 4 내지 8
pBAD 시스템에 의해 생성된 이들 단편은 1-5가 CEACAM1에 결합되지 않지만, 4-8은 결합된다고 밝히고 있다.
B: pQE30 시스템을 사용하여 제조한 단편 4-8, 4-8T, 4-7 및 6-8
단편 4 내지 8은 제조된 첫 번째 rUspA1 단편으로, 블롯-오버레이 검정에서 높은 친화성으로 CEACAM1과 결합하는 것으로 밝혀졌다. 전체 길이의 4-8 rUspA1 펩티드 이외에, 보다 작은 절단된 단백질이 관찰된다. 이 펩티드(4-T로 표시됨)는 또한 CEACAM1에 결합되고, 4-8보다 낮은 수준으로 발현되는 것으로 나타났다(도 13). pQE30/4-T의 서열 분석으로 불일치(CAA to TAA)는 잔기 Q624에서 종결 코돈을 유도하는 것으로 밝혀졌다(참조: 도 10).
펩티드 4-7 및 6-8은 2차 CEACAM 결합 부위가 6-8에 생성되는 가능성을 배제하기 위하여 제조한다. 4-T 펩티드로부터 예상되는 바와 같이, 4-7은 CEACAM 결합(도 13)을 나타내지만, 6-8은 이를 나타내지 않는다(도 14).
C: pQE30 시스템에 의해 제조된 단편 D-8 및 D-7
rUspA1 단편 D-8(도 15) 및 D-7(도시되지 않음)은 모두 CEACAM1과 결합하는 것으로 밝혀졌다.
재조합 펩티드 4-7의 생물학적 활성
엠. 카타르할리스 균주 MX1 및 에이치. 인플루엔자 균주 Rd는 CEACAM1로 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 결합된다. 이들의 결합은 엠. 카타르할리스 UspA1 재조합 펩티드 4-7에 의해 차단될 수 있지만, 대조군 펩티드에 의해서는 차단될 수 없다(도 17).
문헌참조:
본 발명은 치료학적 펩티드 및 특히, 감염의 치료시 잠재적인 약제학적 활성에 대한 화합물의 선별시 뿐만 아니라, 감염에 대한 백신 또는 다른 치료제의 제조시 유용한 치료학적 펩티드에 관한 것이다.
본 발명자는 암배 항원 관련 세포 유착 분자(CEACAM; Carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecules)가 점막의 병원체, 특히 호흡기 병원체[예: 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 및 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis)]에 대한 수용체임을 이미 확인하였다. CEACAM은 면역글로블린 상과의 일원인 암배 항원(CEA)과에 속한다. CEA 유전자 과는 표면 발현되고(CEA), 분비된 [임신 특이성 당단백질(pregnancy-specific glycoprotein), PSG] 아과를 포함한다. CEACAM(CEA-관련 세포 유착 분자)20로서 재정의된 막-결합 아과는 CEACAM1이 특정 사람의 조직12에서 가장 광범위하게 발현되는 몇몇 관련 당단백질을 포함한다. 본 발명자에 의해 보고된 연구는 주로 4개의 세포외 도메인, TM 영역 및 짧거나(S) 긴(L) 세포질 꼬리부(분자식: MA 1BA2-TM-S 또는 L)를 함유하는 CEACAM1에 의해 형질 감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO; Chinese Hamster Ovary) 세포(이전에 CD66a 및 BGPc로서 언급됨)를 사용한다. 또한, 하나 이상의 세포외 도메인을 함유하는 가용성의 절단된 작제물이 사용된다. 이전의 연구는 네이세리아 메닝기티디스 및 해모필루스 인플루엔자가 모두 주로 몇몇 CEACAM7,9,10의 N-도메인을 표적으로 한다는 것을 입증하였다. 이러한 표적화는 세포 침입9 뿐만 아니라, 세포 표면 접착을 유도할 수 있다. 또한, 세균은 식세포 및 T와 B 림프구 상의 CEACAM에 결합될 수 있다. 이러한 상호작용은 , 예를 들면, 엔. 고노르호애(N. gonorrhoeae)(엔. 메닝기티디스에 밀접하게 관련됨)가 이들 림프구21,22의 CEACAM에 결합되는 경우에 T 및 B 림프구의 세균 세포 사멸8, 표적 세포 사멸 또는 T 및 B 림프구의 면역 기능의 억제를 유도할 수 있다.
모락셀라 카타르할리스 및 해모필루스 인플루엔자중 CEACAM-결합 리간드의 존재는 CEACAM가 네이세리아의 외막 불투명도-관련 Opa 단백질과 오랫동안 관련이 있어왔고, 해모필루스 인플루엔자나 모락셀라 카타르할리스는 Opa 단백질을 생성하지 않기 때문에 본 발명자에게는 놀라운 발견이었다. 이어지는 설명에서, 본 발명은 점막, 특히 호흡기 막의 감염 또는, 귀(특히, 중이염)의 감염을 특별히 언급하면서 기술할 것이지만, 본 발명은 CEACAM 수용체가 감염이나 다른 수용체-결합 과정에 관여되는 생식기 점막 또는 요도, 또는 세균이 점막 표면으로부터 전파될 수 있는 사람 감염의 그 밖의 다른 곳과 같은 다른 부위에서 동등한 유용성을 밝혔음을 이해해야 한다.
점막 병원체인 네이세리아 메닝기티디스(Nm), 해모필루스 인플루엔자(Hi) 및 모락셀라 카타르할리스(Mx)는 사람 특이적 유기체이고, 이들이 심각한 감염을 유발할 수 있는 상부 호흡기관에 잔류한다. 특정 혈청 그룹(serogroup)의 수막염 구균성 균주는 건강한 개인의 25% 이하의 비인강내로 옮겨질 수 있다1. 그러나, 수많은 개체중, 유기체는 점막 장벽을 침입하여 가장 신속히 진행되고 상당히 심각한 질병중 하나를 유발한다. 수막염 구균 감염에 대한 숙주 감수성을 증가시키는 정확한 요인은 완전히 이해되고 있지 않다. 더욱이, 그룹-특이적 백신에 의해 제공되는 제한된 보호와 그룹 B 다당류의 비-면역원성은, 숙주 감수성을 이해하고 수막염 구균에 대항하기 위한 통상의 표적으로서 작용할 수 있는 두드러진 피막하 특성을 확인하기 위한 기본적인 연구에 대한 필요성을 강조하고 있다. 본 발명자에 의한 연구는 수막염 구균의 군집화에 대한 분자 수준의 이해 및 식세포 뿐만 아니라 사람의 장벽 세포(상피 및 내피)와의 상호작용 특성의 이해를 제공한다. 최근에, 공생의 네이세리아에 의한 점막 군집화에 대한 기본바탕이 상당히 무해한 군집체와 가끔, 그러나 심각한 병원체(예: Nm)간에 구분되는 특성을 이해하기 위하여 연구되었다. 또한, 연구는 공생의 네이세리아가 Nm의 잠재적인 백신 항원의 캐리어로서 사용될 수 있는 지를 결정하였다.
건강한 개인의 75% 이하는 에이치. 인플루엔자 종(species H. influenzae)에 속하는 균주를 보유할 수 있다2. Hib 백신의 결과로, 서구에서 b형 질환의 발병률에 있어서 상당한 감소를 이루었음에도 불구하고, 비-타입의 Hi(NTHi) 균주에 의해 유발되는 질병은 주요한 문제점으로 남아있다. NTHi는 후두개염, 중이염, 봉와염, 폐렴, 심내막염, 균혈증 및 수막염을 포함하는 국부 및 산재성 감염을 유발한다. 중이염은 소아 의학의 주요 문제점중 하나이고, NTHi는 생후 1년 동안에 어린이에서의 20%를 초과하는 사례와 관련이 있다2,3. NTHi는 또한 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD) 및 낭포성 섬유증을 앓고 있는 환자에 있어서 급성 재발성 및 지속성 감염과 관련이 있다. 이들 환자중 NTHi에 의한 재발성 감염 또는 어린이들중 중이염의 다발성 사례를 결정하는 것은 확실치 않다2,3,4.
사람 호흡기관의 다른 상주균인, 모락셀라 카타르할리스는 종종 Hi와 함께 국부 감염의 경우로부터 분리된다. 두 유기체는 모두 부비동염 및 천식 상태의 악화와 관련이 있다5,6. Mx는 어린이 중이염의 세 번째로 가장 통상적인 원인이다(매년 3 내지 4백만건에 관련되어 있는 것으로 평가됨). 성인, 특히 COPD를 앓고 있는 환자에 있어서 하부 호흡기관 감염을 또한 유발한다5. 드문 경우로, 산재성 감염과 관련이 있다5. Hi 및 Mx는 모두 지속성 감염을 유발하며, 조직 침투에 의해 숙주 면역 메카니즘 및 항생제를 피할 것으로 사료된다4. Mx의 몇몇 외막 단백질이 이들의 유착 특성에 대해 연구되었다. 그러나, Mx에 대해 극히 적은 세포성 수용체가 확인되었고, 병원성 메카니즘에 대한 많은 세부적 사항이 연구되어야 한다4,5,6.
호흡기 점막 병원체에 대한 주요 요건은 호흡성 상피 세포와의 확고한 접촉의 성립에 있다. 이들 사람 향성 병원체의 표적은 사람 특이적 분자이고, 연구는 시험관내 사람 조직 및 기관 배양에 의존해야 한다. 접착은 종종 세균성 단계- 및 항원성 변이적인 구조물에 의해 매개된다. 또한, 병원체의 접착은 다면적이고, 환경적 순응은 접착 방식에서 중요한 역할을 하는 것이 점차 확실해지고 있다. 많은 최근의 연구가 복잡한 세포 표적 메카니즘에서 다양한 단계를 규명하기 시작했음에도 불구하고, 환경적 순응 또는 숙주-미생물 크로스-토크의 세부 사항은 아직 조사되어야만 한다.
본 발명자에 의한 최근의 연구는 Nm7-9 및 Hi10,11가 특정한 사람 세포 표면 수용체 CEACAM12를 표적으로 삼는 독특하고 다른 통상적인 메카니즘을 공유한다고 밝혔다.
더욱이, 본 발명자는 최근에 모락셀라 카타르할리스의 임상적 분리체가 또한 사람의 CEACAM 분자를 표적으로 함을 확인하였다. 또한, 오늘날 고분자량의 모락셀라 외막 단백질이 수용체에 결합됨을 발견하였다. 호흡기 상피 세포를 포함하는 특정 조직12에서 CEACAM의 발현이 입증되었다24. 이들 관찰은 CEACAM의 특이적 표적화가 호흡성 세균에 특히 유용하고, 수렴 진화의 결과로서 발생될 수 있음을 의미한다.
그중, 네이세리아 메닝기티디스에 의해 사용되는 유착 인자는 선모(pili, 섬모(fimbriae))13,14,16 및 외막 불투명도 단백질, Opa와 Opc15,16이다. Nm 선모는 다중 필린 서브 유니트로 구성된 긴 필라멘트형의 단백질 구조물이다. 그들은 일반적으로 피막이 부분적으로 또는 전체적으로 외막 리간드를 차폐하여 이들의 기능적 효능을 감소시키는 반면에, 선모는 피막을 가로질러 완전히 피막된 세균에서 기능적으로 잔류한다는 사실로 인하여, 피막 세균13,14,16에서 가장 중요한 어드헤신(adhesin)으로서 간주된다. Opa는 단백질의 항원성 변이적 과이며, 엔. 고노르호애(N. gonorrhoeae) 뿐만 아니라, 엔. 메닝기티디스에서 생성된다. 수막염 구균에서, 3 - 4 opa 유전자 좌위는 4개의 표면 노출 루프를 갖는 관련 막관통 단백질을 암호화하고, 이중 세 개는 서열이 변이된다16,17. 다른 막관통 단백질인 Opc는 상당히 불변이다15,16. 지난 12년 동안, 본 발명자는 Nm 선모의 구조/기능 관계, Opa 및 Opc 단백질의 독성 잠재력을 연구하였고, 네이세리아 불투명도 단백질에 대한 2개의 사람 수용체를 확인하였다. 또한, 세포 독성에서 LPS 및 다른 인자의 역할 뿐만 아니라, 사람 표적 세포와 세균의 상호작용에 있어서 표면 시알산의 역할이 본 발명자에 의해 연구되었다.
본 발명은 CEACAM 수용체에 결합되는 모락셀라 외막 단백질로부터 분리된 고분자량의 리간드를 본 발명자가 동정함으로써 완성되었다.
리간드는 이의 SDS-PAGE 이동 패턴에 의해 특성화될 수 있고, 이 패턴은 오랜 기간동안 비등시키는 경우에 분자량이 대략 60 내지 150 kD인 단량체로 분해되는 단백질의 USP-과임을 지적한다.
리간드는 Mx 균주(ATCC 25238(MX2))에서 UspA1으로서 특성화되었고 이의 아미노산 서열이 결정되었다. 리간드는 또한 수용체 결합 영역 또는 도메인, 즉 수용체에 결합되는 펩티드 또는 펩티드-연합 특성을 결정하기 위해 특성화되었다.
따라서, 본 발명은 CEACAM 수용체에 결합되는 모락셀라 카타르할리스 외막 단백질로부터 분리된 리간드를 제공하며, 이때 리간드는 도 6에 제시된 서열의 잔기 463 내지 863, 527 내지 668, 527 내지 863, 427 내지 623, 427 내지 668 및 427 내지 863으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 동족체, 작용성 등가물, 유도체, 축퇴물 또는 하이드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물이나, 다른 2차 가공 생성물을 포함하는 수용체 결합 도메인을 포함한다.
용어 리간드는 본 명세서에서, 수용체 결합 도메인을 포함하여, 이것이 수용체 결합 특성을 보유하도록 하는 수용체에 결합되는 전체 분자 및 이의 일부를 모두 나타내기 위하여 사용된다. 따라서, "리간드"는 수용체 결합 도메인만으로 이루어진 분자, 즉 수용체 결합을 위해 필요한 펩티드 영역 또는 영역들을 포함한다.
한 양태로, 본 발명은 도 6에 제시된 서열의 잔기 463 내지 863, 527 내지 668, 527 내지 863, 427 내지 623, 427 내지 668 및 427 내지 863으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 동족체, 작용성 등가물, 유도체, 축퇴물 또는 하이드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물이나, 다른 2차 가공 생성물로 이루어진 리간드를 제공한다.
구조적 및/또는 작용적으로 동등한 수용체 결합 도메인은 다른 UspA 형 단백질에서 또한 생성될 수 있는데, 이는 UspA1 및 UspA2 단백질 모두로부터 유도된 모자이크 에피토프를 함유할 수 있는 Mx에서 하이브리드 단백질이 생성되기 때문이다23. 이러한 동등한 수용체 결합 도메인을 포함하는 리간드도 또한 본 발명의 범위에 속한다.
바람직하게는, 리간드 또는 수용체 결합 도메인은 감염의 예방 또는 치료시 사용하기에 적합하다.
본 발명은 또한 이의 동족체, 다형성체, 축퇴물 및 스플라이스 변이체와 함께, 본 발명의 리간드 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.
본 발명의 리간드 또는 이의 배합물이 백신 또는 감염의 다른 예방적 치료에 사용될 수 있다.
백신 또는 다른 예방적 치료법은 환자의 치료시 사용하기 위한 리간드의 약제학적으로 허용되는 제제를 제공하기 위하여 공지된 보조제, 비히클, 부형제, 결합제, 담체 및 방부제 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 약제에 사용하기 위한 리간드의 약제학적으로 허용되는 제제를 제공한다.
리간드의 약제학적으로 허용되는 제제는 CEACAM 수용체가 연루되는 질환의 치료 또는 예방시, 예를 들면, 감염, 호흡기 질환, 신생물 질환 및 신생물 질환 관련 상태와, 혈관형성의 치료 또는 예방시 사용될 수 있다.
바람직하게는, 감염을 치료하는 경우에, 감염은 점막의 것이거나, 점막을 통해 발생되고, 특히 호흡기 감염이다.
가장 바람직하게는, 리간드는 네이세리아 메닝기티디스, 해모필루스 인플루엔자 및 모락셀라 카타르할리스를 위한 백신으로서 또는 이들의 다른 예방 또는 치료시 사용된다. 이상적으로, 리간드는 중이염을 위한 백신으로서 또는 이의 다른 예방 또는 치료시 사용된다.
다른 측면으로, 본 발명의 리간드는 또한 일반적으로 몇몇 점막 병원체에 대해 공격받기 쉬운 그룹 및 공공을 보호하기 위하여 치료학적 제제로서 사용하기 위한 신규 차단 시약을 동정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 리간드는 이를 위해 유용한 수용체 동족체를 확인하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 치료학적 제제로서 사용하기 위한 신규 차단 시약의 동정을 위한 선별 검정법을 제공하며, 이 검정법은 본 발명의 리간드에 대한 이들의 모의 능력 또는 이들의 상동성에 대해 잠재적인 치료학적 제제를 선별하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 언급한 선별 검정법에 의해 동정되는 치료학적 제제를 제공한다.
효과적인 백신 성분은 생물학적으로 활성인 펩티드 모의체와 같은 본 발명에 의해 동정되는 수용체 표적화 메카니즘의 정보를 사용하여 제조할 수 있다. 이들은 차단, 옵소닌 작용 및 살균 작용을 하는 항체를 유도할 뿐만 아니라, 점막의 세균성 군집화/침입을 방지할 수 있다.
본 발명의 리간드에 의해 동정되는 세균 유도된 생물학적 활성 펩티드 서열은 암에서 CEACAM의 역할을 연구하는데 사용될 수 있고, 분자로서의 개발은 이들 과정과 관련이 있다. 이들은 또한 항암제로서 및 혈관형성을 억제하거나 달리 이의 치료 잠재력을 갖는다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 CEACAM 수용체가 질환을 유발하는 병원체의 세포성 표적화에 관여하는 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조시 CEACAM 수용체-결합 리간드의 용도를 제공하며, 이때 리간드는 도 6에 제시된 서열의 잔기 463 내지 863, 527 내지 668, 527 내지 863, 427 내지 623, 427 내지 668 및 427 내지 863으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 동족체, 작용성 등가물, 유도체, 축퇴물 또는 하이드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물이나, 다른 2차 가공 생성물을 포함한다.
바람직하게는, 질환은 감염, 호흡기 질환, 신생물 질환 및 신생물 질환과 관련된 상태와, 혈관형성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
상기 기술한 바와 같은 약제는 특히, 병원체가 점막을 감염시키거나, 이를 통해 도입되는 경우에 유용성이 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 약제는 특히, 모락셀라 카타르할리스에 의해 유발되는 감염(질환)의 치료 또는 예방에 유용하다. 그러나, 본 명세서에 기술된 바와 같은 리간드는 CEACAM 수용체가 관여되는 질환, 예를 들면, 네이세리아 메닝기티디스 및 해모필루스 인플루엔자에 의해 유발되는 질환 치료용 약제의 제조시 유용하다.
특히 바람직한 양태로, 질환은 중이염이다.
본 발명의 리간드는 또한 다른 구강 세균에 의해 유발되는 질환, 예를 들면, 치아 우식증의 치료시 사용될 수 있다.
본 발명의 양태는 이제 하기의 도면을 참조로 비제한적 예에 의해 전적으로 기술할 것이다.
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Glu Ala Thr Asn 115 120 125 Gln Tyr Ser Thr Ile Gly Gly Gly Asp Asn Asn Thr Ala Lys Gly Arg 130 135 140 Tyr Ser Thr Ile Gly Gly Gly Gly Tyr Asn Glu Ala Thr Ile Glu Asn 145 150 155 160 Ser Thr Val Gly Gly Gly Gly Tyr Asn Gln Ala Lys Gly Arg Asn Ser 165 170 175 Thr Val Ala Gly Gly Tyr Asn Asn Glu Ala Thr Gly Thr Asp Ser Thr 180 185 190 Ile Ala Gly Gly Arg Lys Asn Gln Ala Thr Gly Lys Gly Ser Phe Ala 195 200 205 Ala Gly Ile Asp Asn Lys Ala Asn Ala Asp Asn Ala Val Ala Leu Gly 210 215 220 Asn Lys Asn Thr Ile Glu Gly Glu Asn Ser Val Ala Ile Gly Ser Asn 225 230 235 240 Asn Thr Val Lys Lys Gly Gln Gln Asn Val Phe Ile Leu Gly Ser Asn 245 250 255 Thr Asp Thr Thr Asn Ala Gln Asn Gly Ser Val Leu Leu Gly His Asn 260 265 270 Thr Ala Gly Lys Ala Ala Thr Ile Val Asn Ser Ala Glu Val Gly Gly 275 280 285 Leu Ser Leu Thr Gly Phe Ala Gly Ala Ser Lys Thr Gly Asn Gly Thr 290 295 300 Val Ser Val Gly Lys Lys Gly Lys Glu Arg Gln Ile Val His Val Gly 305 310 315 320 Ala Gly Glu Ile Ser Asp Thr Ser Thr Asp Ala Val Asn Gly Ser Gln 325 330 335 Leu His Ala Leu Ala Thr Val Val Ala Gln Asn Lys Ala Asp Ile Lys 340 345 350 Asp Leu Asp Asp Glu Val Gly Leu Leu Gly Glu Glu Ile Asn Ser Leu 355 360 365 Glu Gly Glu Ile Phe Asn Asn Gln Asp Ala Ile Ala Lys Asn Gln Ala 370 375 380 Asp Ile Lys Thr Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu 385 390 395 400 Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Asp Asn Asn Ile Asn 405 410 415 Asn Ile Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile 420 425 430 Lys Thr Leu Lys Asn Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly 435 440 445 Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Leu Thr Lys Asp Ile Lys Ala Leu 450 455 460 Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile 465 470 475 480 Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Gln Asn 485 490 495 Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr Asn Glu Leu Gln Asp Ala 500 505 510 Tyr Ala Lys Gln Gln Thr Glu Ala Ile Asp Ala Leu Asn Lys Ala Ser 515 520 525 Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile Ala Glu 530 535 540 Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu Asn Lys 545 550 555 560 Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp Lys Lys 565 570 575 Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala Val Gly 580 585 590 Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn 595 600 605 Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu Ala Gln 610 615 620 Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys Val Ser 625 630 635 640 Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala Asp Ala 645 650 655 Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu Ile Glu Gln Gly 660 665 670 Glu Ala Leu Val Glu Gln Asn Lys Ala Ile Asn Gln Glu Leu Glu Gly 675 680 685 Phe Ala Ala His Ala Asp Val Gln Asp Lys Gln Ile Leu Gln Asn Gln 690 695 700 Ala Asp Ile Thr Thr Asn Lys Thr Ala Ile Glu Gln Asn Ile Asn Arg 705 710 715 720 Thr Val Ala Asn Gly Phe Glu Ile Glu Lys Asn Lys Ala Gly Ile Ala 725 730 735 Thr Asn Lys Gln Glu Leu Ile Leu Gln Asn Asp Arg Leu Asn Arg Ile 740 745 750 Asn Glu Thr Asn Asn His Gln Asp Gln Lys Ile Asp Gln Leu Gly Tyr 755 760 765 Ala Leu Lys Glu Gln Gly Gln His Phe Asn Asn Arg Ile Ser Ala Val 770 775 780 Glu Arg Gln Thr Ala Gly Gly Ile Ala Asn Ala Ile Ala Ile Ala Thr 785 790 795 800 Leu Pro Ser Pro Ser Arg Ala Gly Glu His His Val Leu Phe Gly Ser 805 810 815 Gly Tyr His Asn Gly Gln Ala Ala Val Ser Leu Gly Ala Ala Gly Leu 820 825 830 Ser Asp Thr Gly Lys Ser Thr Tyr Lys Ile Gly Leu Ser Trp Ser Asp 835 840 845 Ala Gly Gly Leu Ser Gly Gly Val Gly Gly Ser Tyr Arg Trp Lys 850 855 860 <210> 3 <211> 401 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 3 Ala Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg 1 5 10 15 Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala 20 25 30 Gln Asn Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr Asn Glu Leu Gln 35 40 45 Asp Ala Tyr Ala Lys Gln Gln Thr Glu Ala Ile Asp Ala Leu Asn Lys 50 55 60 Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile 65 70 75 80 Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu 85 90 95 Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp 100 105 110 Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala 115 120 125 Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala 130 135 140 Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu 145 150 155 160 Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys 165 170 175 Val Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala 180 185 190 Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu Ile Glu 195 200 205 Gln Gly Glu Ala Leu Val Glu Gln Asn Lys Ala Ile Asn Gln Glu Leu 210 215 220 Glu Gly Phe Ala Ala His Ala Asp Val Gln Asp Lys Gln Ile Leu Gln 225 230 235 240 Asn Gln Ala Asp Ile Thr Thr Asn Lys Thr Ala Ile Glu Gln Asn Ile 245 250 255 Asn Arg Thr Val Ala Asn Gly Phe Glu Ile Glu Lys Asn Lys Ala Gly 260 265 270 Ile Ala Thr Asn Lys Gln Glu Leu Ile Leu Gln Asn Asp Arg Leu Asn 275 280 285 Arg Ile Asn Glu Thr Asn Asn His Gln Asp Gln Lys Ile Asp Gln Leu 290 295 300 Gly Tyr Ala Leu Lys Glu Gln Gly Gln His Phe Asn Asn Arg Ile Ser 305 310 315 320 Ala Val Glu Arg Gln Thr Ala Gly Gly Ile Ala Asn Ala Ile Ala Ile 325 330 335 Ala Thr Leu Pro Ser Pro Ser Arg Ala Gly Glu His His Val Leu Phe 340 345 350 Gly Ser Gly Tyr His Asn Gly Gln Ala Ala Val Ser Leu Gly Ala Ala 355 360 365 Gly Leu Ser Asp Thr Gly Lys Ser Thr Tyr Lys Ile Gly Leu Ser Trp 370 375 380 Ser Asp Ala Gly Gly Leu Ser Gly Gly Val Gly Gly Ser Tyr Arg Trp 385 390 395 400 Lys <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 4 Ala Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu 1 5 10 <210> 5 <211> 242 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 5 Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Lys Asn Asn Val Glu Glu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Leu Thr 20 25 30 Lys Asp Ile Lys Ala Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp 35 40 45 Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln 50 55 60 Ala Asp Ile Ala Gln Asn Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr 65 70 75 80 Asn Glu Leu Gln Asp Ala Tyr Ala Lys Gln Gln Thr Glu Ala Ile Asp 85 90 95 Ala Leu Asn Lys Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala 100 105 110 Glu Leu Gly Ile Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala 115 120 125 Gln Ala Asn Glu Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile 130 135 140 Gln Leu His Asp Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met 145 150 155 160 Val Ala Arg Ala Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn 180 185 190 Ile Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys 195 200 205 Thr Leu Ala Lys Val Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn 210 215 220 Lys Ala Glu Ala Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn 225 230 235 240 Thr Leu <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 6 Lys Asp Glu His Asp Lys Leu Ile Thr Ala Asn Lys Thr Ala Ile Asp 1 5 10 15 Ala Asn Lys Ala Ser 20 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 7 Ala Leu Glu Ser Asn Val 1 5

Claims (19)

  1. 도 6에 제시된 서열의 잔기 463 내지 863, 527 내지 668, 527 내지 863, 427 내지 623, 427 내지 668 및 427 내지 863으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 동족체, 작용성 등가물, 유도체, 축퇴물 또는 하이드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 다른 2차 가공 생성물로 이루어진, CEACAM 수용체 결합 도메인을 포함하는 리간드.
  2. 제1항에 따르는 리간드 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 보조제, 비히클, 부형제, 결합제, 담체 또는 방부제를 포함하는 약제.
  3. 감염의 치료 또는 예방을 위한, 제2항에 따르는 약제의 용도.
  4. CEACAM 수용체가 관여되는 질환의 치료 또는 예방을 위한, 제2항에 따르는 약제의 용도.
  5. 제4항에 있어서, 감염, 호흡기 질환, 신생물 질환 및 신생물 질환 관련 상태와, 혈관형성의 치료 또는 예방을 위한 용도.
  6. 제3항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, 감염이 점막에 존재하거나, 이를 통해 발생되는 용도.
  7. 제6항에 있어서, 감염이 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 또는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis)에 의해 유발되는 용도.
  8. 중이염의 예방 또는 치료를 위한, 제2항에 따르는 약제의 용도.
  9. 제1항에 따르는 리간드에 대한 모의 능력 또는 당해 리간드에 대한 상동성에 대해 잠재적인 치료학적 제제를 선별하는 단계를 포함하는, 치료학적 제제로서 사용하기 위한 신규 차단 시약의 동정을 위한 선별 검정법.
  10. 제1항에 따르는 리간드 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 보조제, 비히클, 부형제, 결합제, 담체 또는 방부제를 포함하는 백신.
  11. 유효량의 제2항에 따르는 약제를 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서의 감염을 치료하거나 예방하는 방법.
  12. 내용없음
  13. 실질적으로 첨부된 도면의 도 6을 참조로 상기 기술된 바와 같고, 도 6에 제시된 바와 같은 리간드.
  14. 제13항에 따르는 리간드를 포함하는 실질적으로 앞서 기술한 바와 같은 약제.
  15. CEACAM 수용체가 질환을 유발하는 병원체의 세포성 표적화에 관여되는 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 있어서, 도 6에 제시된 서열의 잔기 463 내지 863, 527 내지 668, 527 내지 863, 427 내지 623, 427 내지 668 및 427 내지 863으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 동족체, 작용성 등가물, 유도체, 축퇴물 또는 하이드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 다른 2차 가공 생성물을 포함하는 CEACAM 수용체-결합 리간드의 용도.
  16. 제15항에 있어서, 질환이 감염, 호흡기 질환, 신생물 질환 및 신생물 질환 관련 상태와, 혈관형성으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 병원체가 점막을 감염시키거나, 이를 통해 진입하는 용도.
  18. 제15항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서, 질환을 유발하는 병원체가 네이세리아 메닝기티디스, 해모필루스 인플루엔자 및 모락셀라 카타르할리스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.
  19. 제18항에 있어서, 질환이 중이염인 용도.
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