CN1305899C

CN1305899C - 治疗性肽

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Publication number: CN1305899C
Application number: CNB2003801017669A
Authority: CN
Inventors: M·沃基
Original assignee: University of Bristol
Current assignee: University of Bristol
Priority date: 2002-10-02
Filing date: 2003-10-01
Publication date: 2007-03-21
Anticipated expiration: 2023-10-01
Also published as: KR101057587B1; JP4763291B2; ES2383958T3; CN1705678A; NO20052108L; HK1076475A1; EP1546194B1; MXPA05003474A; ATE549348T1; IL167780A; AU2003299131B2; BR0315031A; EP1546194A2; AU2003299131A1; ZA200503446B; NZ539575A; CA2500960A1; EP2305700A1; GB0222764D0; WO2004031236A3

Abstract

本发明提供了从与CEACAM受体结合的卡他莫拉菌外膜蛋白中分离出的配基，所述的配基包含一个受体结合结构域，该结构域包含选自所公开组的一个氨基酸序列，或者上述序列的一个片段、同源物、功能等价物、衍生物或羟基化、磺化或糖基化的产物或者其次级加工产物。本发明还提供了包含所述配基的药物和疫苗，以及它们在治疗和预防感染中的用途。还提供了鉴定新型治疗用化合物的筛选方法。

Description

治疗性肽

本发明涉及治疗性肽，特别是在疫苗的制备或者在其他对于感染的治疗中及在筛选在感染的治疗中具有潜在药物活性的化合物中有用的治疗性肽，。

本发明的发明者以前发现与癌胚抗原有关的细胞粘连分子(CEACAM)是粘膜病原物，特别是呼吸道病原物，如脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌的受体。CEACAM属于癌胚抗原(CEA)家族，该家族是免疫球蛋白超家族的一个成员。CEA基因家族包括表面表达的亚家族(CEA)和分泌型亚家族(妊娠特异的糖蛋白，PSG)。与膜相关的亚家族被重新界定为CEACAM(与CEA有关的细胞粘连分子)20，该亚家族包括许多有关的糖蛋白，其中CEACAM1在不同的人体组织中表达得最为广泛。本发明的发明者报导的这些研究中主要使用CEACAM1(以前被命名为CD66a和BGPc)转染了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，CEACAM1包含四个细胞外结构域、一个TM区和一个短(S)或者长(L)的细胞质尾(其分子的表达式为NA1BA2-TM-S或L)。此外，还使用了包含一个或者多个细胞外结构域的可溶性截短的构建体。以前的研究表明脑膜炎奈瑟氏菌和流感嗜血杆菌主要以许多CEACAM的N端结构域为靶标^7.9.10。这种靶向定位可以导致对细胞表面的附着以及对细胞的侵袭。此外，细菌可以结合吞噬细胞上以及T和B淋巴细胞上的CEACAM。这种相互作用可以导致细菌细胞死亡、目标细胞死亡或者免疫功能的抑制，例如在奈瑟氏淋球菌(与脑膜炎奈瑟氏菌的亲缘关系很近)与T和B淋巴细胞上的CEACAM结合时导致T和B淋巴细胞的抑制。

由于CEACAM长期被认为与脑膜炎奈瑟氏菌中与外膜不透过性有关的Opa蛋白相关，而流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌都不产生Opa蛋白，所以在流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌中发现存在CEACAM结合配基对于本发明的发明者来说是个意外。在以下对本发明的描述中，将特别涉及粘膜的感染，特别是呼吸道膜的感染，或者是耳部的感染(特别是中耳炎)，但是应该理解的是，在涉及CEACAM受体的其他部位感染，例如在生殖器粘膜或者尿道中的感染或其他受体结合过程，或者在可能从粘膜表面散布细菌的人类其他部位的感染中，本发明有同样的作用。

粘膜病原脑膜炎奈瑟氏菌(Nm)、流感嗜血杆菌(Hi)和卡他莫拉菌(Mx)都是人类特异的生物体，存在于上呼吸道中，从那里它们可以散布，导致严重的感染。至少25％的健康个体的鼻咽中携带有属于不同血清群的脑膜炎球菌菌种¹。但是，在许多个体中，该生物体侵袭粘膜屏障，导致一种发展最为迅速并且极为严重的疾病。增加宿主对于脑膜炎球菌感染易感性的确切因素还不完全清楚。而且，血清群特异的疫苗仅仅提供有限的保护以及B群多糖的非免疫原性增强了对于基础研究的需要，以理解宿主的易感性，确定重要的亚荚膜特征，这些可以作为对抗脑膜炎球菌的共同目标。本发明的发明者进行的研究提供了一种对脑膜炎球菌建群的分子生物学基础的理解，和对于脑膜炎球菌群落与人类屏障细胞(上皮细胞和内皮细胞)以及吞噬细胞相互作用性质的理解。在最近一些年，对共生奈瑟氏菌的粘膜移殖的基础进行了研究，以理解主要是无害的群落和偶然出现的但是严重的病原物例如脑膜炎奈瑟氏菌之间相互区别的特点。此外，这些研究确定了共生奈瑟氏菌是否可以被用作脑膜炎奈瑟氏菌可能的疫苗抗原的载体。

至少75％的健康个体可能携带属于流感嗜血杆菌的菌种²。尽管由于Hib疫苗的结果，在西方b型疾病的发病率有了显著的降低，但是由无法定型的Hi菌株(NTHi)导致的疾病仍然是一个问题。NTHi导致局部以及扩散的感染，包括会厌炎、中耳炎、蜂窝织炎、肺炎、心内膜炎、菌血症和脑膜炎。中耳炎是儿科医疗界的一个主要问题，而NTHi是儿童在生命第一年中20％以上中耳炎发病的原因^2，3。NTHi还与具有慢性阻塞性肺炎(COPD)和囊肿性纤维化病人的急性复发性和持久性感染有关。是什么决定了这些病人中由NTHi导致的复发性感染，或者儿童中中耳炎多次发作，这还不清楚。

卡他莫拉菌是人类呼吸道中的另一种寄生菌，通常与Hi一起从局部感染病例中分离出。这两种生物体都与窦炎和哮喘的恶化有关。Mx是导致儿童中耳炎的第三种最常见病因(据估计为每年300到400万病例)。它还导致成年人中的下呼吸道感染，特别是在患COPD的病人中⁵。在罕见的情况下，它与扩散性感染有关⁵。Hi和Mx都导致持续性感染，并且认为它们可以通过组织渗透逃过宿主的免疫机制以及抗生素的作用。已经研究了Mx的许多外膜蛋白的粘附性质。但是几乎没有发现Mx的细胞受体，而且许多病原性机制的详情有待研究。

呼吸道粘膜病原物的一个基本需要是与呼吸道上皮细胞建立稳固的联系。这些人类病原物的目标是人类特异的分子，研究必须要有体外培养的人体组织和器官培养。粘附通常由细菌相和抗原性可变的结构来介导。此外，已经愈加清楚地知道病原物的粘附是多方面的，而且环境适应对于粘附的方式起重大的作用。尽管许多最近的研究已经开始确定复杂的细胞靶向机制的不同阶段，但是对环境适应的详情或者宿主和微生物体之间的交流还有待描述。

本发明的发明者最近进行的研究显示Nm^7-9和Hi^10，11具有一些独特的机制和另一些共有的机制，用来靶向某些人类细胞表面受体的CEACMA¹²。

而且，本发明的发明者最近发现卡他莫拉菌的临床分离株也以人类的CEACAM分子为靶向。此外，现在已经发现一种卡他莫拉菌的高分子量外膜蛋白与该受体结合。已经证明CEACAM在不同组织中，包括在呼吸道上皮细胞中的表达。这些发现提示对CEACAM分子的特异靶向对于呼吸道细菌来说是一个特别的有利条件，它可能是由于趋同进化的结果而出现的。

在脑膜炎奈瑟氏菌的粘附因子中有菌毛(伞毛)^13.14.15以及外膜不透过蛋白，Opa和Opc^15.16。Nm菌毛是长的丝状蛋白结构，由多个伞毛蛋白亚基组成。一般认为它们是荚膜细菌最重要的粘附素^13.14.16，原因是荚膜部分或者全部掩盖了外膜配基，导致配基的功能效力降低，而在完全荚膜细菌中菌毛穿过荚膜，仍然具有功能。Opa属于抗原性可变的蛋白家族，在脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟球菌中都存在。在脑膜炎球菌中，有3-4个opa基因座编码相关的、具有4个暴露于表面的环的跨膜蛋白，其中3个基因座有序列变异^16，17。另一个跨膜蛋白Opc基本上没有变异^15.16。在过去的12年中，本发明的发明者对Nm菌毛的结构功能关系、Opa和Opc蛋白的毒力进行了研究，发现了奈瑟球菌属不透过蛋白的两个人类受体。而且发明者对表面唾液酸在细菌与人类靶细胞相互作用中的功能以及LPS和其他因子在细胞毒性中的作用进行了研究。

发明者们从结合CEACAM受体的莫拉菌外膜蛋白中分离出了高分子量配基，从而导致本发明的出现。

配基的性质可以通过其在SDS-PAGE中的迁移模式进行描述，其SDS-PAGE迁移特征具有USP家族蛋白的特点，即配基在长时间煮沸后，分裂为分子量在大约60kD到150kD之间的单体。

在Mx菌株ATCC 25238(MX2)中的配基被鉴定为UspA1，并且测定了其氨基酸序列。该配基的特点被进一步研究，以确定受体结合的区域或者结构域，即结合受体的肽或者与肽相关的性质。

因此，本发明提供从与CEACAM受体结合的卡他莫拉菌外膜蛋白中分离出来的配基，所述的配基包含一个受体结合结构域，该结构域包含选自以下的氨基酸序列：图6所示的序列中463到863残基、527到668残基、527到863残基、427到623残基、427到668残基以及427到863残基，或者包含上述序列的片段、同源物、功能等价物、衍生物、简并物或羟基化、磺化或者糖基化产物，或者其他次级加工产物。

在这里使用配基一词，既是指与受体结合的整个分子，又是指上述分子的包括使配基保持受体结合性质的受体结合结构域的任何部分。因此“配基”包含了仅仅由受体结合结构域组成的分子，即受体结合所需的一个或者几个肽区域。

在一个实施方案中，本发明提供了由选自以下的氨基酸序列组成的配基：图6所示的序列中463到863残基、527到668残基、527到863残基、427到623残基、427到668残基以及427到863残基，或者所述配基是由上述序列的片段、同源物、功能等价物、衍生物、简并物或羟基化、磺化或者糖基化产物或其他次级加工产物所组成。

由于在Mx中存在杂合蛋白，它们可能含有来自UspA1和UspA2两个蛋白的嵌合表位²³，所以结构和/或功能上等价的受体结合结构域也可以在其他的类Usp-A蛋白中出现。包含这种等价受体结构域的配基也属于本发明的范畴。

优选地，配基或者受体结合结构域适用于感染的预防或者治疗。

本发明还提供编码本发明配基蛋白的核酸序列，以及所述核酸序列的同源物、多态物(polymorphism)、简并物以及剪切变异体。

本发明的配基或者其组合，可以被用于疫苗或者感染的其他预防性处理。

疫苗或者其他的感染预防性处理可以包含任何已知的佐剂、媒介物、赋形剂、粘合剂、载体、防腐剂及其类似物，以提供药物上可以接受的配基制剂，用于治疗病人。

本发明还提供了药物上可以接受的用于医疗的配基制剂。

药物上可以接受的配基制剂可以用于治疗或者预防任何涉及到CEACAM受体的疾病，例如治疗或者预防感染、呼吸道疾病、肿瘤性疾病以及与肿瘤病相关的病症和血管新生。

优选地，在进行感染治疗时，感染是粘膜的感染或者是通过粘膜出现的，特别是呼吸道感染。

最优选地，配基被用作针对脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌的疫苗或者用于对这些细菌的其他预防或治疗。理想地，配基被用作针对中耳炎的疫苗或者中耳炎的其他预防或治疗。

进一步说，本发明的配基还可以用于鉴别新型阻滞剂，可用作治疗药剂，以保护易感群体和一般公众免受许多粘膜病原物的侵害。例如配基可以被用于鉴别受体类似物，这些类似物可以用于上面这些目的。

因此本发明还提供一种筛选试验，用于鉴别用作治疗药剂的新型阻滞剂，该试验包含下面的步骤：筛选可能的治疗药剂模拟本发明中配基的能力或者其与本发明中配基的同源性。本发明进一步提供治疗药剂，它们是通过上述的筛选试验鉴别出来的。

有效的疫苗组分可以通过使用本发明确定的受体靶向机制信息来制备，例如有生物活性的肽模拟物。这些组分能够防止细菌向粘膜上形成菌落或侵袭，并且诱导出具有阻滞、调理和杀菌作用的抗体。

由于CEACAM分子与癌症和发育等过程有关，所以由本发明的配基确定的衍生自细菌的生物活性肽序列可以用于研究在癌症和发育中CEACAM的作用。这些肽序列还可以作为潜在的抗癌药剂，用来控制或者治疗血管新生。

在另一个实施方案中，本发明提供了CEACAM受体结合配基在制备用于治疗或者预防疾病的药物中的用途，所述疾病中CEACAM受体参与了导致这种疾病的病原物的细胞靶向，在这种药物中，配基包含选自以下的氨基酸序列：图6所示的序列中463到863残基、527到668残基、527到863残基、427到623残基、427到668残基以及427到863残基，或者包含上述序列的片段、同源物、功能等价物、衍生物、简并物或羟基化、磺化或糖基化产物，或者其他次级加工产物。

优选地，疾病选自下列疾病组成的组：感染，呼吸道疾病、肿瘤性疾病以及与肿瘤病相关的病症，和血管新生。

如以上所述的药物在病原物感染粘膜或者通过粘膜进入时是非常有用的。

这里描述的药物在治疗和预防由卡他莫拉菌导致的感染(疾病)时非常有用。但是这里描述的配基用于制备治疗任何涉及CEACAM受体的疾病，例如脑膜炎奈瑟氏菌和流感嗜血杆菌导致的疾病。

在一个特别优选地实施方案中，疾病是中耳炎。

本发明的配基还可以被用于治疗由其他口腔细菌导致的疾病，例如龋齿。

现在完全通过非限制性的实施例对本发明的实施方案进行描述，这些实施例参考下述附图。

图1显示了只有CEACAM1-Fc(1微克每毫升)可溶性受体构建体(白色、左侧的长棒)存在或者在CEACAM1N一结构域特异抗体YTH71.3(灰色、中间的长棒)存在时，与三个被固定在硝酸纤维素上的Mx菌株的相对结合水平。在每种情况中CD33-Fc的结合可以忽略(黑色，右侧的长棒)。菌株1、2、3：MX2(ATCC25238)，MX3，MX4(临床分离株)。结合的确定使用斑点印迹上层覆盖的方法，反应的强度使用NIH Scion成像程序进行光密度分析来定量。

图2显示在非解离(未加热，泳道1)的条件或者煮沸10分钟后(泳道2)的条件下分离出的菌株MX2蛋白的蛋白质印迹。印迹上面覆盖CEACAM1-Fc(1微克每毫升)孵育，用与辣根过氧化物酶偶联的抗人Fc抗体以及辣根过氧化物酶的底物来检测受体的结合。

图3显示了菌株MX2、MX3、MX4的变性全细胞裂解产物(分别在泳道1-3中)的蛋白质印迹。印迹上面覆盖CEACAM1-Fc(1微克每毫升；a)，抗UspA1肽抗体(10微克每毫升；b)以及抗UspA2肽抗体(10微克每毫升；c)孵育。注意在三个菌株中CEACAM1-Fc结合蛋白和抗UspA1结合蛋白具有相似的迁移模式。残余的未解离的蛋白大小约为250kD(由于使用了碱性磷酸酶测定，具有更高的灵敏度，所以在这里被检测到)，与CEACAM1-Fc结合。这些仅仅被抗肽抗体微弱识别，大概是因为合成的肽中包含的表位在未变性的蛋白中没有完全暴露，而随着复合物的变性而逐渐暴露。抗UspA2抗体与表观分子量大于200kD在煮沸后仍然未解聚的蛋白结合，这是UspA2蛋白所具有的一个性质。

图4显示MX2的CEACAM1结合蛋白在电洗脱之后用胰蛋白酶消化的肽质谱图谱(4a)。输入到ProFound蛋白质鉴定数据库中的数据汇总于(4b)。鉴定的前10个蛋白以及其概率数值示于4c。排在第一位的候选者，这里是一个Z分值为2.34的UspA1蛋白，其详细情况示于(4d)，其中显示了匹配的肽的数目、它们在蛋白质中的位置，该蛋白质被覆盖的百分比以及这里未匹配的肽的清单。

图5显示了MX2的UspA1经过胰蛋白酶消化之后的片段的蛋白质印迹。A：使用二抗(分别在B和C中使用的山羊抗人Fc和山羊抗兔Ig的混合物)的对照印迹。B：覆盖CEACAM1-Fc以及山羊抗人Fc的印迹。C：覆盖亲和纯化的抗UspA1肽的兔抗体(ETNNHQDQKIDQLGYALKEQGQHFNNR(SEQ ID NO：1))(参见图6)，以及抗兔的免疫球蛋白的印迹。*＝具有分子量标记的泳道--在左侧标示出来。用双箭头指明的肽与CEACAM1-Fc发生强烈反应(B)，也和抗UspA1肽的抗体发生强烈反应(C)。由于抗UspA1肽抗体与最低分子量的肽(箭头所指)的结合，所以该CEACAM结合片段被鉴定为MX2的UspA1蛋白的天冬酰胺199到赖氨酸863(参见图6)之间的C末端片段。

图6显示了MX2的UspA1蛋白的氨基酸序列。用粗体标示了出用于在兔中制备免疫抗血清的UspA1特异的肽。CEACAM结合区域包含在划线的MX2UspA1蛋白的C末端片段中。

图7显示了与CEACAM发生反应的胰蛋白酶水解肽的分离。使用1毫克每毫升的胰蛋白酶处理卡他莫拉菌菌株MX2，在37摄氏度处理10分钟。胰蛋白酶消化的样品进行SDS-PAGE。染色之后，对50kD的区域进行电洗脱过夜。电洗脱出来的蛋白被冻干，用缓冲液重悬后上第二块胶。胶的一部分转移到硝酸纤维素膜上进行蛋白质印迹。在印迹上覆盖CEACAM1-Fc来确定与CEACAM发生反应的肽条带。

“*”：指的是被送去作N末端序列分析的肽。

图8显示MX2的UspA1蛋白在胰蛋白酶消化之后的一个肽的氨基酸序列。所示的50kD胰蛋白酶水解肽(氨基酸463到863)结合CEACAM以及抗UspA1肽(氨基酸753到780，划线的)的抗血清。该分子量大约为50kD的CEACAM结合肽的N末端序列是“ALESNVEEGL”(SEQ IDNO：4)，该序列出现在胰蛋白酶切割位点462号氨基酸之后。

图9是一幅示意图，显示了扩增产生uspA1基因片段用于进行重组蛋白表达的引物的位置。由引物P4和P7扩增出的DNA编码CEACAM1结合位点，还设计和使用了通过该区域的其他引物(字母A至I)。

图10显示了重组片段4-7的序列。划线的区域是具有CEACAM1反应性的胰蛋白酶肽的N末端区域。片段4-7的预测分子量大约是26kD。加上组氨酸标记的片段分子量约为28kD。截短的肽的位置用“T”标示出来(参见图13)。

图11是一幅示意图，显示了用于重组UspA1肽的一般克隆、表达以及纯化策略，如pQE30系统所表示。

图12是载体pQE30的图。

图13显示了CEACAM1-Fc在印迹覆盖试验中与重组子4-8的结合(泳道3)、与4-T的结合(泳道4)以及与4-7的结合(泳道5)。泳道1含有梅毒螺旋体对照重组肽，泳道2含有未诱导的包含4-8构建体的M15的裂解产物。

图14的蛋白质印迹显示了重组肽与抗组氨酸标记抗体(上)以及与CEACAM-Fc(下)的反应性。泳道2到4包含6-8肽，泳道1包含4-8肽作为对照。预测的肽迁移位置示于右侧。两个肽都与抗组氨酸标记抗体结合。但是尽管4-8与CEACAM1-Fc结合，但是6-8则不然。

图15显示D-8肽与CEACAM1-Fc结合(泳道1)，但是不与用作对照的CD33-Fc结合(泳道2)。此肽的来源由其与抗组氨酸标记抗体发生反应得到证实(泳道3)。

图16是一幅示意图，显示了重组rUspA1片段的相对大小和位置。使用了重组的4-7用于细菌阻滞试验——参见图17。

图17显示，CHO-CEACAM1转染子在没有肽(A)的条件下孵育，或者与重组的对照肽(梅毒螺旋体肽)一起孵育(B)，或者与UspA1 r4-7肽(序列与MX2菌株的相应，C和D)一起孵育。加入肽的浓度以及细菌如图所示，孵育的时间为2小时。在孵育结束时，漂洗掉未结合的细菌，结合上的细菌使用抗卡他莫拉菌的多克隆抗血清以及与四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)偶联的二抗进行检测。重组的卡他莫拉菌UspA1肽的浓度为1微克每毫升时，已经对异源的卡他莫拉菌株(MX1)有了显著的抑制，且浓度为10微克每毫升时，对于流感嗜血杆菌有显著的抑制。

实施例1卡他莫拉菌株通过UspA1蛋白与人CECAM1-Fc结合

在本研究中使用的卡他莫拉菌株(Mx)包括临床分离物(MX3和MX4)以及从美国模式培养物保藏所购得的参考菌株(ATCC25238，该菌株的一个克隆培养物被命名为MX2)。

受体覆盖试验显示Mx与CEACAM1-Fc受体构建体结合

为了评价卡他莫拉菌株与CEACAM1的相互作用，将细菌(大约4-8×10⁶个)加到硝酸纤维素膜上，空气干燥后使用3％BSA-PBST封闭非特异位点。在硝酸纤维素条上覆盖CEACAM1-Fc(1-2微克每毫升)或者同时加入CEACAM1的N端结构域抗体YTH71.3。CD33-Fc(1-2微克每毫升)用作阴性对照。根据以前所述制备嵌合蛋白构建体。通过偶联辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶的山羊抗人Fc抗体检测嵌合受体的结合。显色底物分别用二氨基联苯胺和过氧化氢或者硝基蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸。所有的菌株都与CEACAM1-Fc结合，但是都不与CD 33-Fc结合(图1)。在单克隆抗体YTH71.3存在时受体的结合受到抑制，这提示该菌株与受体的N末端结构域结合。因此，所有的菌株与只包含N端结构域的CEACAM1的截短的N-Fc构建体都有很好的结合(未显示结果)。

卡他莫拉菌中CEACAM1-Fc结合蛋白的鉴定

将未经过事先热处理的或者在100摄氏度煮沸10分钟的Mx的全细胞裂解产物(大约3×10⁷个细胞)加入到10％双tris聚丙烯酰胺(Invitrogen)凝胶的各泳道中，在180伏电泳45分钟。使用标准的印迹条件将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素滤膜上。根据上面的描述，将可溶性嵌合构建体覆盖在膜上。在每种情况下都观察到与CEACAM1-Fc特异结合的单个蛋白。蛋白在凝胶上的迁移显示为Mx的UspA1蛋白，因为细菌的裂解产物在上样时若没有加热变性则CEACAM1结合蛋白以＞200kD的表观分子量迁移，如果裂解产物首先经过变性，则CEACAM1结合蛋白以降低的分子量(大约92kD)迁移(图2)。

抗UspA1的抗体而非抗类似蛋白UspA2的抗体与Mx菌株的CEACAM1-Fc结合蛋白有结合

根据出版的卡他莫拉菌的UspA蛋白的序列设计肽。即ETNNRQDQKIDQLGYALKEQGQHFNNR(SEQ ID NO：1；UspA1肽)以及KDEHDKLITANKTAIDANKAS(SEQ ID NO：6；UspA2肽)。肽通过N末端的半胱氨酸残基与KLH偶联，偶联的肽用于免疫兔(每只兔200微克肽)，免疫间隔14天。开始使用完全弗氏佐剂，之后使用不完全弗氏佐剂。在第0天和免疫之后每隔14天进行采血。使用与AminoLink Plus柱(Pierce)偶联的适宜的肽来纯化多克隆抗体。在蛋白质印迹覆盖试验中使用UspA特异的抗体，浓度为1-10微克每毫升，抗体的检测使用偶联碱性磷酸酶的山羊抗兔二抗。印迹的显色如前所述。三个Mx菌株的CEACAM1-Fc结合蛋白在SDS-PAGE上的迁移与UspA1抗体结合蛋白的迁移相同，但是与UspA2抗体结合蛋白的迁移不同(图3)。

与CEACAM1-Fc共沉淀的卡他莫拉菌配基被确定为UspA1

细菌的过夜培养物用含有100mM的辛基βD吡喃葡萄糖苷的PBSB重悬，其中含有蛋白酶抑制剂混合物(图；1mM PMSF，1mM E-64，1μM胃蛋白酶抑制剂A，6nM苯丁抑制素以及100μM EDTA)。样品在4摄氏度不断混和过夜。同时将100微升与SepharoseCL-4B偶联的蛋白A(Sigma)与20微克的CEACAM1-Fc或者CD33-Fc(做为对照使用)一同孵育，在4摄氏度过夜。然后用PBSB漂洗3次，去掉任何未结合的受体。15000g离心30分钟去除不溶的细菌物质。可溶性的提取物分别与两种受体-蛋白A-Separose复合物之一同在4摄氏度孵育2小时。(比例为5×10⁸个细菌每微克的受体构建体)。在使用50mM的辛基βD吡喃葡萄糖苷和PBSB反复漂洗之后，在变性条件下用SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹分析样品。

在与CEACAM1-Fc的共沉淀试验中，MX4产生了一个强烈染色的蛋白条带(约97kD)，而MX3产生一条相对弱染色的蛋白条带，约92kD。被共沉淀的蛋白的分子量与那些在受体覆盖实验中观察到的蛋白的分子量相符合(在图3中显示)。两个蛋白都不与CD33-Fc共沉淀。由于被共沉淀的蛋白与抗UspA1肽的抗体结合，所以它们被进一步确定为UspA1蛋白。此外，将MX4蛋白从凝胶上切下来之后，用MALDI-TOF质谱对其进行分析(见下面)。

通过MALDI-TOF质谱鉴定CEACAM1配基

(a)Western覆盖样品。MX2和MX3的全细胞裂解产物在Trench胶中进行SDS-PAGE。用电洗脱的方法将与CEACAM1-Fc结合配基相对应的蛋白条带洗脱出来。将样品浓缩，加入第二块胶中的一个泳道中，进行电泳，然后对电泳之后适当的蛋白进行胶内胰蛋白酶消化。得到的肽使用基质辅助激光解吸/离子化-飞行时间(MALDI-TOF)质谱进行分析。图4a显示了得到的MX2的CEACAM结合蛋白质谱图谱的一个例子。得到的肽分子量输入ProFound蛋白鉴定位点中，得到的结果如图4b，c所示。在此有10个蛋白的分子量与卡他莫拉菌的UspA1蛋白经过胰蛋白酶消化后产生的肽的预测分子量相配，该片段占UspA1蛋白的大约18％(图4d)。估算的Z分值为2.34，有力地提示该蛋白是UspA1(Z分值高于1.65就是高于95％；http://129.85.19.192/profound_bin/webProFound.exe)。此外，经类似分析，MX2的另一个非结合的高分子量条带被确定为UspA2。类似地对于MX3菌株，CEACAM1结合和非结合蛋白被分别确定为UspA1和UspA2。

(b)共沉淀的样品：对于MX4，被CEACAM1-Fc共沉淀的蛋白(如上所述)也在一次全分类查询中经MALDI-TOF质谱被确定为UspA1，Z分值为2.27。12个肽被匹配上，覆盖了该蛋白的21％。

因此本研究确定在所述的参考和临床菌株中卡他莫拉菌通过高分子量蛋白UspA1靶向人CEACAM1。

对UspA1和重组肽的酶切

(a)UspA1经过胰蛋白酶酶切之后的肽与CEACAM1-Fc结合

使用0.1-1毫克每毫升的胰蛋白酶(Sigma)处理MX2细菌悬液(1010个细胞每毫升)，在37摄氏度孵育1-4小时。消化后的裂解产物用SDS-PAGE缓冲液解离，煮沸并且上样进行电泳。转移至硝酸纤维素膜上之后，使用受体构建体CEACAM1-Fc或者亲和纯化的抗UspA1肽抗体覆盖印迹。与受体反应的小片段也与抗UspA1的特异抗体结合(图5)。

(b)卡他莫拉MX2菌株UspA2蛋白的CEACAM结合结构域的定位

使用1毫克每毫升的胰蛋白酶处理MX2细菌悬液，37摄氏度孵育10分钟。

胰蛋白酶消化的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳。染色后，对50kD区域进行过夜电洗脱。冻干电洗脱出的蛋白，用缓冲液重悬，上第二块胶。胶的一部分转移到硝酸纤维素膜上，通过使用CEACAM1-Fc的蛋白质印迹覆盖，确定了与CEACAM反应的肽条带(图7)。

对应于分子量大约50kD和大约150kD的肽进行N末端测序。N末端的序列是ALESNVEEGL(SEQ ID NO：4)(大约50kD的肽)和ALESNV(SEQ IDNO：7)(大约150kD的肽)。150kD的蛋白显然是50kD蛋白的三聚体，因为它们有相同的N末端序列。该MX2 UspA1肽的N末端序列示于图8。

(c)重组肽

构建的由图6所示的序列中1-449号氨基酸组成的N末端重组MX2肽与CEACAM不发生结合。这进一步显示大约50kD的胰蛋白酶消化后的肽(由图8所示的序列中的463-863号氨基酸组成)，具有包含CEACAM结合结构域的ALESNVEEGL(SEQ ID NO：4)的N末端序列。

实施例2在粘膜病原物的多重毒力决定簇上确定受体结合结构域

脑膜炎奈瑟氏菌和流感嗜血杆菌通过与CEACAM上的重叠位点结合的配基靶向人CEACAM分子。本发明的Mx配基也靶向N结构域为。这些观察结果显示了一个令人兴奋的可能性，即受体靶向可能涉及许多粘膜病原物配基上的相似特征。

由于Nm和Hi与CEACAM的相互作用受到在表面表达的可变结构域的结构特征影响，这提示它们可能包含相似的关键氨基酸，这些氨基酸的空间构型使它们能够与受体结合，这些关键氨基酸可能在可变蛋白中是保守的。确实，我们的研究和其他人的研究提示Opa的两个高变环(HV1和HV2)可能参与CEACAM靶向^9.18。一项有力的技术可以确定配基和受体之间相互作用的可能决定簇，该技术是噬菌体展示，它可以用于确定模拟表位(模拟结合结构域的随机序列)¹⁹以及适体(与抑制配基结合的初始结构更为接近的序列)20。

本发明还使下面的情况变得十分可行，即与CEACAM结合的Mx配基结构域会做为其他结合CEACAM的粘膜病原物的模拟物，并且该配基的结构特征会有助于确定在Nm和Hi的配基靶向CEACAM的N端结构域所需的重要特点。Mx结构域的抗体可能具有确定其他能够靶向受体中相同、相似或者相近位置区域的配基的潜力。

目前正在使用已知的蛋白质工程方法以及重组DNA技术来开展确定MX2 UspA1中最小CEACAM1结合结构域的工作。可以通过以上描述的受体覆盖试验在体外筛选重组肽，以检测与受体结合的MX2结构域。组氨酸标记的肽可以在镍柱上分离，并根据需要进行切割，并用于免疫兔和小鼠，以得到抗体，用于进一步的研究。

可以通过检查其免疫刺激性质以及其他功能例如对受体结合的阻滞，来确定对于生物应用具有适宜长度的肽。

实施例3受体与配基相互作用所需的重要特征

由于CEACAM的N端结构域足以使CEACAM与Opa蛋白相互作用，本发明的发明者正在使用噬菌体展示技术，也对CEACAM N端结构域的粘附表位进行研究。本发明的发明者已经使用对受体的丙氨酸扫描突变研究了受体上的配基结合区域的信息，此研究对于本研究是有所帮助的。还有对于这种情况，也可用配基覆盖试验对于携带有受体序列的嵌合噬菌体进行生物淘选(亲和浓缩)。

受体类似物具有阻滞多种菌株的潜能，这与产生的Opa蛋白类型无关，因为我们的研究已经显示尽管Opa蛋白具有抗原变异，但是对于初级粘附，不同的Opa蛋白需要受体上具有相同的性质。另外有趣的是，注意到CEA抗原从肠道粘膜上脱落，并且有可能阻滞大肠杆菌菌株的粘附，而已知大肠杆菌也靶向CEACAM。这已经被提出做为一个先天免疫应对肠内病原物的机制。因此这些受体类似物用作治疗药剂。

实施例4与CEACAM结合的重组卡他莫拉菌UspA1肽的制备

概述：

沿着UspA1的全长由PCR扩增出许多片段，使用如图9所示的引物。如下描述获得重组肽。在第一轮，发现与CEACAM1结合的重组肽由P4和P8引物扩增得到的DNA编码，而不是由P1和P5之间的DNA区域编码，而且，P4到P7区域重组子与CEACAM1结合，而P6到P8区域的不能。在P4到P7区域内还使用了其他的引物。D-7区域保留了与CEACAM结合的性质。4-7片段的序列示于图10。

对于重组UspA1肽的一般克隆、表达以及纯化策略

使用pBAD系统制备UspA1片段1-5。所需的PCR产物以TA克隆到pBAD载体中，并且使用TOP10大肠杆菌菌株进行扩增。剩余的步骤如图11所示，唯一的区别在于使用阿拉伯糖诱导pBAD。使用pBAD和pQE30(图11)两个系统制备片段4-7，得到相似的与CEACAM结合结果。剩余的片段使用图11中的策略进行制备。

载体和pQE30表达系统

使用pQE30载体(图12)以及大肠杆菌菌株M15。M15包含质粒pREP4，该质粒编码一个抑制因子，该因子抑制了克隆到pQE30载体中DNA的转录。加入IPTG浓度达到1mM抑制了该抑制因子的编码，则克隆到pQE30中的片段得到转录。

克隆策略

首先将PCR扩增产物连接到pCR2.1中。这样产生了一个稳定的宿主，扩增产物可以通过限制性酶切(BamHI/PstI)进行回收，这也保证了基因片段的两端都已被切割。pQE30也进行类似的酶切并且用凝胶纯化回收酶切后的载体，这也保证了两个限制性位点都已被切割。已经酶切的pQE30和UspA1扩增产物使用T4DNA连接酶在16摄氏度连接过夜，连接产物转化入用氯化钙处理的大肠杆菌M15感受态细胞中。在含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和卡那霉素(25微克每毫升)的LB琼脂平板上筛选转化子。挑取4-8个菌落在添加有抗生素的LB液体培养基中培养。3-4毫升的培养物离心得到菌体，用碱裂解的方法小量提取质粒。经过纯化的载体如上所述进行酶切，检查uspA1插入片段。包含具有正确插入片段大小的pQE30载体的细菌在50毫升培养基中生长，培养物用IPTG诱导(见下面)。然后使用蛋白质印迹筛选重组蛋白的表达。此外还对载体进行测序，以确定插入片段是否是正确的DNA区域，并且检查是否有任何的序列错误。

表达和纯化

包含pQE30/uspA1构建体的M15生长在含有氨苄青霉素(100微克每毫升)和卡那霉素(25微克每毫升)的LB液体培养基中，振荡培养直至OD600＝0.5，然后加入IPTG至浓度为1mM。培养物进一步培养3-4小时，离心回收菌体。菌体沉淀物在缓冲液B(8M尿素，50mMTris，10％乙醇，2％Tween，5mM咪唑，pH7)中增溶1-3小时，20,000g离心20分钟出去膜物质。上清与镍树脂一起在摇床上孵育1-2小时，然后通过聚丙烯柱。用5-10毫升缓冲液B漂洗剩余的树脂，使用0.5毫升的洗脱缓冲液(缓冲液B中加入100mM咪唑)洗脱结合上的蛋白。洗脱的蛋白用SDS-PAGE检查，然后进行透析去掉尿素和其他的盐类。

重组片段

A：片段1-5和4-8

这些由pBAD系统制备的片段显示1-5不与CEACAM1结合而4-8与CEACAM1结合。

B：使用pQE30系统制备的片段4-8，4-8T，4-7以及6-8

片段4-8是第一个制备的重组UspA1片段，在印迹覆盖试验中发现它与CEACAM1高度亲和地结合。除了全长的4-8重组UspA1肽以外，还观察到一个较小的、截短的蛋白。该肽(命名为4-T)也与CEACAM1结合，看起来其表达水平比4-8要低(图13)。对pQE30/4-T进行序列分析发现，由于一个错配(CAA到TAA)导致在残基谷胺酰胺624处出现一个终止密码子(参见图10)。

制备肽4-7和6-8以排除在6-8中出现第二个CEACAM结合位点的可能性。正如从肽4-T所预测的那样，4-7显示了与CEACAM的结合(图13)，而6-8没有与CEACAM结合(图14)。

C：由pQE30系统制备的片段D-8和D-7

发现rUspA1片段D-8(图15)以及D-7(未显示)与CEACAM1都结合。

重组肽4-7的生物活性

卡他莫拉菌菌株MX1以及流感嗜血杆菌菌株Rd与转染了CEACAM1的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞结合。它们的结合可以被卡他莫拉菌的UspA1重组肽4-7抑制，但是不能被对照肽抑制(图17)。

参考文献

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Claims

1.配基，其为包括CEACAM受体结合结构域的整个UspA1分子的一部分，所述配基包含SEQ ID No：2的残基427-623或其片段。

2.根据权利要求1的配基，其中该配基由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID No：2的残基463-863、527-668、527-863、427-623、427-668以及427-863。

3.包含根据权利要求1或2的配基以及一或多种药物上可以接受的佐剂、媒介物、赋形剂、粘合剂、载体或者防腐剂的药物。

4.根据权利要求3的药物，用于治疗或者预防感染。

5.根据权利要求3的药物，用于治疗或者预防疾病，该疾病中CEACAM受体涉及引起该疾病的病原物的细胞靶向。

6.根据权利要求5的药物，用于治疗或者预防感染、呼吸道疾病、肿瘤病以及与肿瘤病相关的病症以及血管新生。

7.根据权利要求4-6中的任何一项的药物，其中感染是粘膜感染或者通过粘膜出现的感染。

8.根据权利要求7的药物，其中的感染是由脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌或者卡他莫拉菌引发的。

9.根据权利要求3的药物，用于治疗或者预防中耳炎。

10.包含根据权利要求1的配基以及一或多种药物上可以接受的佐剂、媒介物、赋形剂、粘合剂、载体或者防腐剂的疫苗。

11.权利要求1或2的配基在制备用于治疗或预防感染的药物中的用途。

12.CEACAM受体结合配基在制备用于治疗或者预防一些疾病的药物中的用途，所述疾病中CEACAM受体涉及引起该疾病的病原物的细胞靶向，其中该配基为包括CEACAM受体结合结构域的整个UspA1分子的一部分，所述配基包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID No：2的残基463-863、527-668、527-863、427-623、427-668以及427-863；或者其片段。

13.根据权利要求12的用途，其中所述疾病选自：感染、呼吸道疾病、肿瘤病和与肿瘤病相关的病症以及血管新生。

14.根据权利要求12或者13的用途，其中病原物感染粘膜或者通过粘膜进入。

15.根据权利要求12的用途，其中导致疾病的病原物选自：脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌。

16.根据权利要求15的用途，其中所述疾病是中耳炎。