KR20050062605A - 종양 특이적 에피토프에 대해 지정된 표지된 활성화임파구를 이용한 종양의 검출, 위치결정 및 병기결정 - Google Patents

Abstract

포유동물 말초 혈액 단핵 세포 (PMBC) 내의 T 임파구가 항원 특이적 활성화되는 조건 하에 PBMC를 항원의 면역원성 펩티드 에피토프에 노출시킴으로써 적어도 세포 특이적 항원에 결합하는 항원 특이적 T 임파구를 생산하는 것을 포함하는, 인간 피검자와 같은 포유동물 내의 세포 특이적 항원을 검출하고 위치결정하는 방법이 개시된다. 표지된 항원 특이적 T 임파구를 전형적으로는 IL-2 없이 포유동물에 복강내로 또는 정맥내로 투여한다. 포유동물 내의 이들 세포의 분포를 영상술에 의해 결정함으로써 포유동물 내의 세포 특이적 항원을 검출하고 위치결정한다. PBMC를 면역원성 펩티드에 노출시키는 것은 전형적으로 무세포(cell-free) 펩티드 제제 및 인터류킨-2 (IL-2)를 포함하지만, 항원으로 별도로 펄스된 항원 제시 세포 (APC)와 같은 추가의 세포는 포함하지 않는다. 항원 특이적 T 임파구는 전형적으로 세포 특이적 항원을 발현하는 세포에 대해 세포용해성이며, CD4+, CD8+ 및(또는) CD45RO+ 메모리 T 세포를 포함할 수 있다.

Description

종양 특이적 에피토프에 대해 지정된 표지된 활성화 임파구를 이용한 종양의 검출, 위치결정 및 병기결정 {DETECTION, LOCALIZATION AND STAGING OF TUMORS USING LABELED ACTIVATED LYMPHOCYTES DIRECTED TO A TUMOR SPECIFIC EPITOPE}

본 발명은 진단 및 치료를 포함한 임상 의학 분야에 속한다. 본 발명은 종양 특이적 에피토프와 같은 세포 특이적 항원에 대해 지정된 활성화 임파구의 용도, 감작되는 종양 에피토프로 이동하고 부착하는 상기 임파구의 능력, 아주 작은 종양의 위치결정을 확장시키는 상기 세포의 능력, 및 기지의 면역원성 에피토프로 미지의 원발성 종양, 특히 뮤신 생성 선암종을 확인하는데 있어서의 상기 임파구의 용도에 관한 것이다.

육안 영상화제 또는 항체를 이용하여 온전한 인체 내의, 임파 조직과 같은 조직을 영상화하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들면, 1988년 4월 5일에 골든버그 (Goldenberg)에게 허여된 미국 특허 제4,735,210호는 임파관조영 및 기관 영상화 방법 및 키트, 특히 특정 항체 영상화제로 형성된 포지티브 상에서 육안 영상화제를 사용하여 형성된 네가티브 상을 제외하는 것을 포함하는 임파관섬광조영 또는 자기 공명 임파관조영을 위한 개선된 방법을 개시하고 있다. 본 발명의 또다른 실시태양은 임파관용 영상화제로서 임파 조직에 대한 항체를 사용한다. 또다른 실시태양은 자기 공명 임파관조영술용 자기 공명 영상 증강제를 사용한다. 또다른 실시태양은 섬광조영 및 자기 공명 기관 영상술용으로 기관 항원에 대한 표지된 항체를 사용한다.

인체 전신의 임파구와 같은 방사성표지된 세포의 영상화가 또한 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Wagstaff, J. et al., "A method for following human lymphocyte traffic using indium-111 oxine labeling," Clin Exp Immunol. Mar; 43(3):435-442 (1981a)]은 다수의 인체 임파구를 말초 혈액으로부터 분리하고 인듐-111 옥신으로 시험관내 표지하는 방법을 개시하고 있다. 자가 재주입 이후에, 체내 분포에 이어서 연속 혈액 시료채취, 표면-프로브 계수 및 감마 카메라 영상화가 이어진다. 상기 문헌의 저자들은 임파성 구조의 양호한 해상도가 감마 카메라 영상술을 이용하여 얻어지며 기관 분포에 기록된 변화가 임파구 이동에 대한 동물 모델로부터의 데이타와 상관관계가 있다고 보고하였다. 따라서, 인간 임파구의 인듐-111 옥신 표지는 인간 임파구의 이동 특성을 추적할 수 있는 비침습적 방법을 제공한다. 문헌 [Wagstaff, J. et al., "Human lymphocyte traffic assessed by indium-111 oxine labelling: clinical observations," Clin Exp Immunol. 43:443-449 (1981b)]은 인간 말초 혈액 임파구의 인듐-111 옥신 표지를 이용한 임상 연구를 개시하고 있다. 감마 카메라 영상술에서 골수 및 간 위치결정의 생리학적 중요성이 논의되어 있으며, 결과를 해석할 때 연구 중 임파구의 표면 마커 특징을 고려하는 중요성이 강조된다.

말초 혈액에서 발견되는 여러 유형의 세포를 비롯한 각종 임파양 세포가 포유동물 전신 영상화에 사용되어 왔다. 예를 들면, 문헌 [Reynolds, C. W. et al., "Natural killer activity in the rat.IV. Distribution of large granular lymphocytes (LGL) following intravenous and intraperitoneal transfer," Cell Immunol. 86: 371-380 (1984)]은 쥐 거대 과립 임파구 (LGL) 및 T 임파구의 고농축 집단을 퍼콜 (Percoll)의 불연속 밀도 구배로 제조하고, ¹¹¹In-옥신 또는 ⁵¹Cr로 표지하고, 정상 동계 수용자에 정맥내로 (iv) 또는 복강내로 (ip) 주입하는 방법을 개시하고 있다. 표지된 LGL 또는 T 세포를 정상 수용자에 iv 접종한 이후에, 많은 비율의 방사활성 (18 내지 33％)이 수분 내에 폐에 회수되었다. 전이 후 2 내지 4시간까지, T 세포 (6.4％)보다 상당히 더 많은 LGL (13.5％)이 폐에 남아있었다. 이러한 차이는 48시간 동안 지속되었다 (5.4 대 0.8％). 폐 내의 방사활성 준위의 감소는 비장 및 간 내의 방사활성 계수의 상응하는 증가에 의해 수반된다. 초기 시점에, 상당히 더 높은 비율의 T 세포가 비장까지 분포하는 것으로 밝혀졌으며, 표지된 LGL은 폐 뿐만 아니라 혈액 내에 장기간 동안 존속되었다. 정상 수용자로의 ip 접종 이후에, 복강으로부터 방사성표지된 LGL 및 T 세포의 제거가 서서히 이루어지며, 방사성표지의 20％ 미만이 24시간까지 말초 기관내에 존재하였다. 이러한 결과는 각종 기관 내의 이들 세포에 대해 이전에 보고된 비율과 유사한 LGL 및 T 세포 분포 패턴을 입증하는 것이다.

방사성표지는 또한 일반적으로 입양(adoptive) 임파구 전이 또는 입양 면역요법으로 알려진 절차인, 다양한 조건 하의 시험관내 배양에 의해 세포독성으로 만들어진 후에 각종 암에 걸린 환자에게 주입된 자가 "살해(killer)" 혈액 단핵구의 분포를 설명하는데 사용되어 왔다. 예를 들면, 문헌 [Stevenson, H. C. et al., "Fate of gamma- interferon-activated killer blood monocytes adoptively transferred into the abdominal cavity of patients with peritoneal carcinomatosis," Cancer Res., 47:6100-6103 (1987)]은 복강 표면까지 넓게 전이된 결장직장 암에 걸린 다섯 환자를, 인간 감마-인터페론과의 시험관내 배양에 의해 세포독성으로 만들어진 자가 혈액 단핵구의 주입으로 i.p. 치료하였음을 개시하고 있다. 단핵구는 혈구성분 채집술 및 역류 원심분리 선별 절차를 조합하여 정제되었고; 매주 약 3억 5000만개의 활성화 단핵구가 단일 i.p. 점적주입에 의해 입양 면역요법으로서 환자에게 제공되었다. 8번째 치료 사이클에서, 두 환자에서 ¹¹¹In으로 세포를 예비표지하여 i.p. 주입된 혈액 단핵구의 수송을 연구하였다. 이러한 활성화 세포는 복강 내에 널리 분포되었다. 주입 후 2일 및 5일에, 복막 내의 상기 세포의 위치는 변하지 않았다. 복막 시험편이 ¹¹¹In-표지된 단핵구 주입 후 36시간에 얻어졌을 때, 표지된 단핵구는 자기방사선법 분석에 의해 장막 표면과 관련이 있는 것으로 입증되었다. 복강 외부의 섬광주사 구조는 i.p. 주입된 ¹¹¹In-표지된 단핵구가 5일의 연구 중에 다른 기관으로 수송되지 않았음을 나타내었다. 저자는 자가 살해 혈액 단핵구의 i.p. 입양 전이가 이들 암 환자에서 복막 표면 상의 종양 부위에 상기 세포독성 세포를 전달하는 효과적인 방식인 것으로 결론지었다.

살해 임파구의 영상화에 대한 또다른 보고서인 문헌 [Swift, R.I. et al., "Imaging of metastatic colorectal cancer with tumour-activated killer lymphocytes," Lancet 337:1511-1512 (1991)]은 전이성 결장직장암에 걸린 6명의 환자로부터 임파구를 취하고 환자의 원발성 종양 세포와 배양하여 종양-활성화 살해 (TAK) 임파구를 생산하였음을 개시하고 있다. 이들 연구자들은 전이를 가시화하기 위해 ¹¹¹In-표지된 TAK 세포를 각 환자에게 재주입하였다. 주입후 최대 48시간 동안 감마-카메라로 영상을 관찰하였다. 전이는 초기 4시간에는 폐에서 나타나고 후기 48시간에서는 복부에서 나타났다. 간 영상은 전이성 병변에 해당하는 "냉점(cold spot)"을 나타내었다. 임파절은 가시화되지 않았다. 자가 결장직장 종양에 대항해 발생된 TAK 세포의 재주입은 전이 부위를 밝혀낸다. 상기 문헌의 저자들은 또한 TAK 세포가 생체내 투여후에 IL-2를 필요로 하지 않음을 주목하였다.

마찬가지로, 종양 세포에 의해 생체외 자극된 각종 유형의 방사성표지된 자가 말초 혈액 임파구의 분포는 방사성표지된 세포의 영상화에 의해 결정되었다. 따라서, 문헌 [Spencer R. P. and B. Mukherji, "Utilization of tumour-sensitized ('educated') and radiolabelled lymphocytes for tumour localization," Nucl Med Commun. 9:783-786 (1988)]은 조사된 자가 종양 세포의 존재하의 말초 혈액 임파구 (PBL)의 동시 배양시에, PBL이 시험관내 세포독성 특성에 의해 밝혀지는 바와 같이 종양으로 감작 (또는 아마도 더욱 정확하게는 재감작)될 수 있음을 개시하고 있다. 그 세포들은 ¹¹¹In으로 방사성표지된 인터류킨-2의 존재하에 증식되어 세포 공여체로 다시 주입될 수 있다. 이 기술을 이용하여, 종양 침착물이 7명의 환자 중 5명에서 위치결정되었다. 이 연구를 확대하여, 문헌 [Mukherji, B. et al., "Imaging pattern of previously in vitro sensitized and interleukin-2 expanded autologous lymphocytes in human cancer," Int J Rad Appl Instrum B, 15:419-427 (1988)]은 방사면역검출법 및 입양 면역세포요법의 별법에 대한 가능한 후보로서 전이성 암에 걸린 7명의 환자에서 연구된 자가 종양 (시험관내)에 대해 감작된 임파구의 생체내 패턴을 개시하고 있다. 말초 혈액 임파구 (PBL)는 인터류킨-2 (IL-2)에서 활성화되거나 [임포카인 활성화 살해 (LAK) 세포] 또는 시험관내 동시배양 (IVC)에 의해 자가 종양 세포에 대해 감작되고 IL-2에서 확장되었고 (훈련된 세포); 그후에 둘다 ¹¹¹In으로 표지되었다. 표지된 자가 세포 (1 x 10⁷-5 x 10⁸)를 환자에게 투여하고, 감마 카메라로 다양한 시간 간격으로 영상화하여 생체분포를 연구하였다. 7가지 경우 중 4가지 경우, "훈련된" 세포의 영상이 임상적으로 검출가능한 전이성 종양과 포지티브로 상관관계가 있는 부위에서 방사활성 농도를 나타내었다. 대조적으로, 포지티브 흡수의 한가지 경우만이 LAK 세포에서 관찰되었다. 훈련된 임파구는 자가 종양 세포에 대해 세포독성이었고 훈련된 세포의 세포독성 반응성은 IL-2에서 4-6주 동안 연속 배양액에서 유지되었다. LAK 세포보다 상당히 더 높은 주파수에서의 방사성표지된 훈련된 자가 세포 축적의 증거는, 시험관내 확장된, 훈련된 PBL이 인간 암의 방사면역검출법에 대한 우수한 후보일 수 있으며 그러한 훈련된 자가 PBL의 연속 배양액이 이들 작동체 세포의 반복된 투여에 대한 공급원일 수 있음을 암시하는 것이다.

입양 면역요법 및 방사성표지에 의한 인체 내의 영상화에 대해 사용된 또다른 유형의 임파양 세포는 예를 들어, 로젠버그 (S.A. Rosenberg)와 동료들에 의해 개발된 바와 같은 종양 침윤 임파구 (TIL)이다. 따라서, 문헌 [Fisher, B. et al., "Tumor localization of adoptively transferred indium-111 labeled tumor infiltrating lymphocytes in patients with metastatic melanoma," J Clin Oncol. 7:250-261 (1989)]은 인간 종양에 침윤하는 임파양 세포가 인터류킨-2 (IL-2)를 함유하는 배지에서 시험관내 확장될 수 있음을 개시하고 있다. 저자들은 인듐 111 (¹¹¹In) 옥신으로 표지된 주입된 TIL이 전이성 종양 침착물로 수송되고 위치결정될 수 있는지를 연구하였다. 피하, 결절 및(또는) 내장 질환의 복수개 부위의 전이성 악성 흑색종을 가진 6명의 환자가 이 연구의 대상이었다. 환자에게 시클로포스파미드를 투여하고, 36시간 후에 TIL을 정맥내 (IV) 주입하고, 이어서 8시간 마다 IL-2 IV 투여하였다. TIL의 분포 및 위치결정은 연속 전신 감마 카메라 영상술, 연속 혈액 및 뇨 시료채취, 및 종양 및 정상 조직의 연속 생검을 이용하여 평가하였다. ¹¹¹In-표지된 TIL은 활성 주입한 후 2시간 내에 폐, 간 및 비장으로 위치결정되었다. 폐 안의 활성은 24시간 내에 감소되었다. ¹¹¹In-표지된 TIL을 주입한 후 초기 24시간에, 전이성 침착물 부위로의 TIL의 위치결정은 영상화 연구 또는 생검 시험편, 또는 둘다를 이용하여 6명의 환자 모두에서 입증되었다. 종양 조직 생검에서의 ¹¹¹In 활성 범위는 정상 조직에서의 활성보다 3 내지 40배 더 컸다. 종양 침착물 부위에서의 방사활성 계수의 점차적인 증가가 관찰되었다. 이 연구 결과는 표지된 TIL이 종양에 우선적으로 위치결정될 수 있음을 나타내며, TIL의 치료 효과의 가능한 기전에 관한 정보를 제공한다.

TIL 및 다른 기관의 임파양 세포 영상화의 비교를 비롯한, 입양 면역요법에 대한 많은 추가의 연구들이 보고되었다. 예를 들면, 문헌 [Griffith K. D., et al., "In vivo distribution of adoptively transferred indium-111-labeled tumor infiltrating lymphocytes and peripheral blood lymphocytes in patients with metastatic melanoma," J Natl Cancer Inst. 81:1709-1717 (1989)]은 시클로포스파미드 (CPM), 종양 침윤 임파구 (TIL) 및 인터류킨-2 (IL-2) 요법을 실시한 전이성 흑색종을 가진 환자들을, 감마 카메라 영상술 및 생검을 이용하여 그의 ¹¹¹In-표지된 TIL 또는 말초 혈액 임파구 (PBL)가 종양 부위로 위치결정되는 능력에 대해서 연구하였음을 개시하고 있다. 방사성표지된 TIL의 19 주입액을 18명 환자에게 제공하고, 5명의 환자에게는 TIL 요법 중에 방사성표지된 자가 PBL을 제공하였다. ¹¹¹In-TIL 수용자에 대해 실시된 18개 핵 스캔 시리즈 중 13개에서 분명한 종양 위치결정이 관찰된 반면, ¹¹¹In-PBL 제공된 환자에서는 4 스캔 시퀀스 중 1개에서만 종양이 영상화되었다. CPM, TIL 및 IL-2의 3가지 연속 치료 코스에 대해 핵 스캐닝하여 한명의 환자를 연구하였다. 이 환자에서는 초기에 몇몇 부위에서 ¹¹¹In-TIL에 의한 분명한 종양 위치결정, 그후에 단일 부위에서의 ¹¹¹In-PBL에 의한 희미한 위치결정 및 이후에 복수개 부위에서 반복 ¹¹¹In-TIL 주입에 대한 포지티브 종양 영상화가 입증되었다. 이러한 결과는 CPM 예비처리에 이어서 IL-2로 처리되어 전이된 인간 TIL이 종양 부위로 우선적으로 위치결정됨을 입증하는 이 연구의 초기 데이타를 확인하고 확대하는 것이며, 이러한 위치결정이 PBL보다 TIL의 경우 더 잘된다는 것을 나타낸다.

TIL에 의한 또다른 영상술 연구는 문헌 [Chin. Y., et al., "In vivo distribution of radio-labeled tumor infiltrating lymphocytes in cancer patients," In Vivo 7:27-30 (1993)]에 기재되어 있으며, 이 문헌은 치료시의 종양 침윤 임파구의 효능을 평가하기 위해 이들 임파구의 생체내 이동 및 분포를 연구하는 시도를 하였음을 개시하고 있다. 저 투여량의 재조합 인터류킨-2와 함께 시험관내에서 배양되고 확장된, 악성 전이성 유방암 또는 흑색종을 가진 5명의 환자로부터 분리된 종양 침윤 임파구를 ¹¹¹인듐-옥신으로 표지하고 환자에게 주입하였다. 대형 뷰 감마 카메라를 사용하여 주입된 TIL의 분포 및 위치결정을 평가하였다. 폐 내의 ¹¹¹In-표지된 TIL의 위치결정은 주입 후 2시간 내에 나타났으며, 폐, 간 및 비장에서 24시간에 고준위의 방사활성이 관찰되었다. 폐 내의 활성은 72시간 후에 감소되었다. 전이 부위에서는 ¹¹¹In-표지된 TIL의 특이적인 위치결정이 관찰되지 않았다.

TIL 영상술의 또다른 연구는 문헌 [Pockaj, B. A. et al., "Localization of ¹¹¹Indium-labeled tumor infiltrating lymphocytes to tumor in patients receiving adoptive immunotherapy. Augmentation with cyclophosphamide and correlation with response," Cancer 73: 1731-1737 (1994)]에 기재되어 있으며, 이 문헌은 인터류킨-2 (IL-2)-배양된 종양 침윤 임파구 (TIL)의 입양 전이가 전이성 흑색종을 가진 환자에서 종양 퇴행을 야기시킬 수 있음을 개시하고 있다. 고 투여량의 IL-2 및 TIL을 투여한 전이성 흑색종을 가진 38명의 환자들을 감마 카메라 영상술 및 생검을 이용하여 자가 ¹¹¹In-표지된 TIL이 전이성 종양 침착물로 위치결정되는 능력에 대해서 연구하였다. 26 (68.4％) 치료 코스에서 감마 카메라 영상술에 의해 ¹¹¹In-표지된 TIL에 의한 종양 위치결정을 관찰하였다. TIL 수송에 영향을 미치는 인자들의 단일변량 통계분석에서, 시클로포스파미드 투여는 방사성핵종 영상술에 의해 종양을 위치결정하는 능력과 상당한 관련이 있었다 (P2=0.026). 저자들은 ¹¹¹In-TIL로 영상화된 종양을 갖고 있지 않은 환자들에서 임상적 반응이 관찰되지 않았으므로 종양 내의 위치결정이 TIL 항종양 활성의 기전에 중요할 수 있으며, 또한 TIL 및 IL-2 요법 전의 시클로포스파미드 투여 및 다수의 TIL의 투여가 TIL의 종양으로의 위치결정 빈도수를 향상시키는 것으로 보인다고 결론지었다.

TIL의 영상술은 또한 문헌 [Dillman, R. 0., "Tumor localization by tumor infiltrating lymphocytes labeled with indium-111 in patients with metastatic renal cell carcinoma, melanoma, and colorectal cancer," Cancer Biother Radiopharm. 12:65-71 (1997)]에 개시되어 있다. 이 논문은 자가 종양 침윤 임파구 (TIL)에 의한 입양 면역요법의 한가지 쟁점이 그러한 세포가 정맥내 주입후에 실제로 종양 부위로 이동하는지에 관한 것임을 개시한다. 저자들은 전이성 흑색종을 가진 환자에서 방사성표지된 TIL의 종양 흡수의 몇가지 사례가 보고되어 있지만, 보고된 바에 의하면 다른 종양 유형에서 방사성표지된 TIL로 종양을 가시화하는 시도는 성공하지 못하였음을 주목하였다. 여기서는, 전이성 암을 갖는 8명의 환자 (신장암 5명, 흑색종 2명, 결장암 1명)에게 인터류킨-2 (IL-2)와 동시투여된, 500 μCi 인듐-111에 접합된 5000만 TIL을 비롯한, 20억 내지 1000억의 자가 TIL의 정맥내 주입액을 투여하였다. 한명의 환자에게 TIL 투여 하루 전에 시클로포스파미드 1 gm/㎡을 투여하고; 7명의 환자에게는 TIL을 투여하기 전에 4일 동안 인터페론 알파 2b를 투여하였다. 단광자 방출 전산화 단층촬영 (SPECT)을 비롯한 전신 감마 카메라 영상술을 24시간 및 48시간에 수행하였다. 8명 환자 모두에서 ¹¹¹인듐-표지된 TIL이 하나 이상의 기지의 종양 부위로 흡수됨이 입증되었다. 영상화되지 않은 기지의 종양 부위는 존재하지 않았다. 영상화된 전이 부위는 뼈, 뇌, 종격동 및 폐문주위 임파절, 폐 및 간 유조직, 복부 대동맥주위 임파절 및 골반 종괴를 포함하였다. 한 환자는 그녀가 분명한 질환을 갖지 않았을 때 TIL 스캔이 음성이라는 점에서 음성 대조군으로서 작용하지만, 몇주 후에는 겨드랑이 종양재발을 진단하게 하는 양성 TIL 스캔을 나타내었다. 저자들은 CD8+이든 CD4+이든, 전이성 신장 세포 암종 및 기타 암종에 의한 방사성표지된 TIL의 흡수가 흑색종에서 이전에 보고된 바와 유사한 것으로 결론지었다. 시클로포스파미드에 의한 예비처리는 영상술에 필수적인 것은 아니며, TIL 흡수는 종양 반응을 예측하지 못했다.

임파성 조직을 비롯한, 질환을 가진 환자의 말초 혈액으로부터 얻은 임파구는 또한 질환의 병기결정(staging)의 보조 수단으로서, 시험관내 자극없이 체내 영상화를 위해 방사성표지되었다. 따라서, 문헌 [Grimfors, G. et al., "Tumour imaging of indium-111 oxine-labelled autologous lymphocytes as a staging method in Hodgkin's disease," Eur J Haematol. 42:276-283 (1989)]은 인듐-111 옥신-표지된 자가 임파구 주입 이후에, 호지킨병 (HD)을 앓는 35명의 환자에서 39 임파구 섬광조영술을 실시하였음을 개시하고 있다. 백혈구분리반출 및 임파제제 구배 원심분리 후에 임파구를 얻고 부착 단계에 의해 더 정제하여 단핵구를 제거하였다. 1.2 (0.2-3.7) x 10⁹ 세포의 중간수를 6.7 (범위 1.9-16.6) Mbq 인듐-111 옥신으로 표지하고 환자에게 재주입하였다. 감마 카메라 영상술을 GE 400 AT로 실시하였다. 임파절 비대가 발생한 61 부위 중 54 부위에서 방사활성의 축적이 관찰되었다. 이전에 종양 관련된 임상적 증거가 없는 16 부위에서 또한 증가된 방사활성이 관찰되었다. 이 저자들은 데이타가 아주 유망한 것으로 보이며 추가로 방법론적으로 개선된 임파관섬광조영법은 HD를 가진 환자의 병기결정 절차 및 추적 검사에서 중요한 보충수단이 될 수 있음을 제안하였다.

시험관내 활성화없이 방사성표지된 말초 혈액 임파구의 영상화가 또한 다른 임파성 악성종양에 이용되어 왔다. 예를 들면, 문헌 [Muller, C., "In vivo tracing of indium-111 oxine-labeled human peripheral blood mononuclear cells in patients with lymphatic malignancies," J Nucl Med. 30:1005-1011 (1989)]은 [¹¹¹In]옥신-표지된 말초 단핵 세포 (PMNC)의 생체내 이동을 각종 임파성 악성종양 및 촉지 임파절 비대가 발생한 20명의 환자에서 연구하였음을 개시하고 있다. 10 μCi (0.37 MBq) [¹¹¹In]옥신/10⁸ PMNC의 최대 표지 투여량은 세포 생육성 또는 생체내 임파구 증식에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 생체내 연구의 경우, 1.5 x 10⁹ PMNC는 임파분리반출에 의해 얻어졌으며 방사성 표지, 150 μCi (5.55 MBq) 후에 정맥내로 재주입되었다. 비대 촉지 임파절의 표지는 호지킨병에 걸린 3명의 환자 중 3명에서 또한 고 악성 임파종이 있는 5명 중 5명에서 이루어진 반면, 저 악성 임파종에 걸린 7명의 환자 중 3명이 양성 임파절 영상화를 나타내었고 만성 임파성 백혈병에 걸린 환자는 양성 임파절 영상화를 나타내지 않았다. 따라서 저자들은 PMNC가 [¹¹¹In]옥신 표지 후에 이동하는 그의 능력을 유지하고 이들 세포가 모든 혈액 종양은 아닌 일부의 관련된 임파절로 수송된다고 결론지었다.

다른 경로에 의한 주입 후에 동물 및 인간에서의 인간 PBL의 분포가 또한 연구되었다. 예를 들면, 문헌 [Nelson, H. et al., "Regional and systemic distribution of anti-tumor x anti-CD3 heteroaggregate antibodies and cultured human peripheral blood lymphocytes in a human colon cancer xenograft," J Immunol. 145: 3507-3515 (1990)]은 항-CD3 항체 (OKT3)에 공유 결합된 항-종양 항체 (317G5)가, PBL을 표적화하여 적절한 종양 Ag를 발현하는 종양 세포를 분리할 수 있는 이종응집 (HA) 항체를 생산함을 개시하고 있다. 방사성표지된 HA 항체 317G5 x OKT3 및 방사성표지된 배양 인간 PBL의 i.v. 및 i.p. 분포를 인간 결장 종양 세포주, LS174T에서 형성된 고형성 복강내 종양을 갖고 있는 무흉선 누드 마우스에서 연구하였다. 마우스에 ¹²⁵I-표지된 HA 항체, ¹²⁵I-표지된 항-종양 mAb 또는 ¹¹¹In-표지된 PBL을 주입하고, 정해진 시점에서 조직을 수확하고 방사활성을 측정하였다. ¹²⁵I-317G5 x OKT3은 종양 부위에 특이적으로 위치결정되었다. ¹²⁵I-317G5 x OKT3의 i.v. 및 i.p. 투여 사이에서 관찰된 방사활성 준위의 주요 차이는 i.v. HA 항체 투여 후의 간 방사활성의 증가였다. 자기방사선법으로 항-종양 x 항-CD3 HA 항체가 복강내 종양에 특이적으로 위치결정되었고; i.p. 투여된 HA 항체가 종양에 직접 침투하였으며; i.v. 투여된 HA 항체가 종양 맥관구조를 따라 분포하였음이 확인되었다. 배양된 인간 PBL은 i.v. 투여될 때가 아니라 i.p. 투여될 때 복강내 종양에 적당한 농도로 분포되었다. 저자들은 i.v. 주입된 PBL이 종양으로 잘 위치결정되지 못하는 것은 귀소 수용체 및(또는) 내피 리간드에서의 종 불일치를 초래하며, 이러한 문제점은 동계 모델로 극복될 수 있음을 추측하였다. 그들은 이러한 결과가 HA 항체 및 PBL에 의한 국소 요법이 초기 임상 시험을 위한 전신 요법에 비해 유리할 수 있음을 암시하는 것으로 결론지었다.

종양괴가 아닌 조직으로부터 얻은 임파구(즉, TIL) 또는 말초 혈액으로부터 얻은 임파구를 또한 방사성표지된 임파구 또는 그에 대한 항체의 영상화에 의한 분포를 비롯한 입양 면역요법에 대해 연구하였다. 예를 들면, 1998년 9월 29일자로 마틴 쥬니어 (Martin, Jr.) 등에게 허여된 미국 특허 제5,814,295호는 종양 반응성 세포가 풍부한 임파절의 확인, 그의 증식 및 입양 세포 요법에서의 그의 용도를 개시하고 있다. 특히, 이 발명은 종양 반응성 세포, 예를 들면 CD4+ 종양 특이적 임파구가 풍부한 임파절을 신뢰성있게 확인하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 신생 조직에 의해 생성되거나 또는 그와 관련있는 마커에 특이적으로 결합하는 방사성표지된 로케이터(locator)의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 신생 조직으로부터의 광자 방출 대 환자에서의 배경 광자 방출의 비를 증가시키기 위해, 방사성표지 로케이터의 경우 투여 후에 임의의 신생 조직에서 우선적으로 농축하고 비결합된 방사성표지 로케이터의 경우 제거되게끔 시간이 경과되도록 한다. 시간이 경과한 후에, 임파절 부위에서 프로브로 상승된 방사선 준위를 검출하여 방사성표지된 로케이터의 융합을 나타내는 임파절 부위를 확인하기 위해 방사 검출 프로브를 환자에게 접근시킨다. 그러한 상승된 준위의 방사선을 나타내는 임파절 부위는 제거하여 육안 가시적으로 분석하지만, 다르게는 그러한 부위를 조직학적으로 분석할 수도 있다. 확인되고 제거된 임파절 (또한 육안 관찰에 의해 종양이 없거나 육안의 전이성 질환이 없는 것으로 확인됨)을 선택하고 종양 반응성 세포를 증식하도록 배양한다. 선택된 임파절은 세포분열을 유발하도록 자극한다. 임파절은 인터류킨-2, 항-CD3 모노클로날 항체 및 자가 또는 동종 종양일 수 있는 신생 조직의 존재하에 배양된다. 이 특허는 또한 그러한 자극된 임파절 세포를 제공받은 2명의 환자 (3번 및 4번)가 외생 IL-2의 존재하에 또한 부재하에 종양 퇴행의 증거를 나타내었고, ¹¹¹In-표지된 세포 (환자 5)를 이용한 세포 수송 연구를 비롯한 광범위한 면역학적 데이타가 수집되었지만, 어떠한 한정적인 결론을 내기는 너무 이르다는 것을 개시하고 있다.

최근의 입양 면역요법 방법들은 항원 제시 세포, 특히 각종 공급원의 항원으로 펄스된 수지상 세포에 의해 시험관내 자극되는 각종 공급원으로부터 얻은 T 세포를 이용하였다. 예를 들면, 문헌 [Peng, L. et al., "Helper-independent, L-selectin^low CD8+ T cells with broad anti-tumor efficacy are naturally sensitized during tumor progression," J Immunol. 165: 5738-5749 (2000)]은 저자들이 최근에 배양 활성화되고 입양 전이되어 IL-2를 동시투여하지 않고도 동계 마우스에서 발생된 폐종양 및 두개강내 종양을 제거할 수 있는, 종양 주변 임파절 (TDLN) 내의 낮은 L-셀렉틴 발현 (CD62L^low)된 CD4(+) T 세포 아형에 대해 보고하였음을 개시하고 있다. 이 보고는 이 연구들을 확대하여 약한 면역원성 종양을 가진 마우스의 TDLN에 자연적으로 존재하는 L-셀렉틴^low CD8(+) T 세포의 작은 아형을 특징화한다. 분리된 L-셀렉틴^low CD8(+) T 세포는 헬퍼-독립적 T 세포의 기능적 표현형을 나타내었으며, 입양 전달될 때 L-셀렉틴^low CD4(+) T 세포와 마찬가지로 외인성 IL-2를 동시투여하지 않고 발생된 폐종양 및 두개강내 종양 둘다를 일관되게 제거할 수 있다. 배양 활성화된 L-셀렉틴^low CD8(+) T 세포는 관련 종양 표적을 시험관내 분해하지 않았지만, 관련 종양 제제로 특이적으로 자극될 때 분비된 IFN-감마 및 GM-CSF를 분비하였다. 저자들은 이들 데이타가 특이적 백신 조작없이도, 점차적인 종양 성장이 수확 시기에 표현형으로 L-셀렉틴^low인, TDLN 내의 CD4(+) 및 CD8(+) 항-종양 T 세포 둘다 (각각이 아주 강력한 독립형 작동체 기능을 밝히기 위해 배양 활성화 만을 필요로 함)의 독립적인 감작을 유도함을 암시한다고 결론지었다.

각종 공급원으로부터의 종양 항원으로 펄스된 자가 수지상 세포에 의해 프라이밍된 T 세포를 가진 인간 환자의 입양 면역요법이 또한 보고되어 있다. 따라서, 문헌 [Santin, A. D. et al., "Development and therapeutic effect of adoptively transferred T cells primed by tumor lysate-pulsed autologous dendritic cells in a patient with metastatic endometrial cancer," Gynecol Obstet Invest. 49:194-203 (2000)]은 자궁내막 암종의 외과적으로 절제불가능하고 내화학성인 광범위한 간 전이 상태에 있는 65세 여성을 종양 용해질-펄스된 자가 수지상 세포 (DC)로 자극된 말초 혈액 T 세포를 주입하여 치료하였음을 개시하고 있다. DC-활성화된 T 세포의 광범위한 시험관내 특징화는 표현형 분석, 세포독성 및 세포내 사이토킨 분비를 포함하였다. 자가 종양 세포에 대해서는 높은 세포독성이 관찰되었지만, NK-민감성 K562 세포, 자가 Con-A 임파아구 또는 자가 엡스타인-바르 바이러스 형질전환된 임파아구 세포에 대해서는 관찰되지 않았다. 차단 연구는 용해 활성이 HLA I 류 제한되었음을 입증하였다. 2색 유동 세포측정 분석은 CD8+ T 세포의 상당한 비율이 CD56+임을 밝혀냈으며, 세포내 IFN-감마 및 IL-4 발현의 분석이 1형 사이토킨 바이어스를 제안하였다. 종양 특이적 T 세포를 3-주 내지 4-주 간격으로 3회 주입하여 환자를 치료하고, T 세포를 생체내 분포시키고, 이어서 ¹¹¹In 옥신 표지 및 연속 감마 카메라 영상술을 실시하였다. 종양 위치결정 및 표지된 임파구의 축적은 각각의 주입 이후에 연속 시점에서 일관되게 검출되었다. 그러나, 단광자 방출 전산화 단층촬영 (SPECT) 영상술에 의해 3차원적으로 평가된 바와 같이, 활성화된 T 세포의 대형 종양괴의 심부 침윤은 최소였다. 임상적으로, 치료 중에 광범위한 간 전이의 안정화가 이루어졌다. 총체적으로, 이들 결과는 종양 특이적 CD8+ 세포독성 T-세포 반응이 자궁내막암 환자에서 발생될 수 있음을 나타내며, T-세포 면역요법이 전이성 질환을 가진 환자에서 치료학적 유용성을 가질 수 있음을 암시하는 것으로 보여진다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 종양 주변의 [¹¹¹In 옥신 표지된 CD8+ 세포독성 T-세포의] 방사활성의 위치결정은 ^99mTc-황 콜로이드 섬광조영법으로 비교할 때 남아있는 정상 간 유조직에 비해 탁월하였다.

인간 뮤신 1 (MUC1이나 MUC-1로 칭함)은 유방, 폐, 췌장, 전립성, 위, 결장 및 난소를 포함한 모든 선암종의 90％에서 과발현되는 상피세포 뮤신 당단백질이다. 고형 선암종을 가진 환자에서는 성장하는 종양을 제거하기에 충분히 강하지 않은, MUC1에 대한 낮은 세포성 및 체액성 면역 반응이 관찰되므로 MUC1은 면역 개입에 대한 표적이다. 예를 들면, 문헌 [Hiltbold, E. M. , et al., "Naturally processed class II epitope from the tumor antigen MUC1 primes human CD4+ T cells," Cancer Res. 58: 5066-5070 (1998)]은 상피 세포 뮤신 MUC1이 유방, 췌장, 난소 및 기타 종양에서 종양 항원으로서 작용하는 불충분한 글리코실화 형태로 선암종 상에 발현되며, 2가지의 주요 MUC1-특이적 면역 반응 (IgM 항체, 및 MUC1 단백질 코어 상의 직렬로 반복되는 에피토프를 인식하는 CD8+ CTLs)이 환자에서 발견되었음을 보고하고 있다. 암 환자에서 MUC-1 특이적 CD4+ T-헬퍼 세포가 이전에 보고된 바가 없다고 주장하며, MUC-1 특이적 CD4+ T 세포가 제거되거나 내성화되지 않으며, MUC1의 적절한 가용 형태가 사용될 때 CD4+ T 세포 반응이 발생될 수 있다고 설명한다. 건강한 공여자로부터의 비감작 CD4+ T 세포는 수지상 세포에 의해 제시되는, 5회의 비글리코실화 직렬 반복을 나타내는, 100 아미노산의 합성 MUC1 펩티드로 시험관내 프라이밍되었다. 그것은 IFN-감마를 생성하였으며 적당한 세포용해 활성을 가졌다. 저자들은 또한 HLA-DR3에 의해 제시될 때 이 반응을 유도하는 하나의 코어 펩티드 서열 PGSTAPPAHGVT를 확인하였다.

MUC1은 이 항원 상의 종양 특이적 펩티드 에피토프의 MHC-비제한적 TCR 인식이 일어날 수 있다는 점에서 특별한 것이다. 따라서, 문헌 [Magarian-Blander, J. et al., "Intercellular and intracellular events following the MHC-unrestricted TCR recognition of a tumor-specific peptide epitope on the epithelial antigen MUC1," J Immunol. 160:3111-3120 (1998)]은 MUC1 상의 종양 특이적 펩티드 에피토프의 직접적인 TCR 인식에 관련된 기능적 및 분자적 파라메터를 논의한다. 이 펩티드 에피토프는 가공되어 MHC에 결합되기 보다는 직렬로 반복되어 천연 분자 상에 인식된다. 마가리안-블랜더, 제이. (Magarian-Blander, J.) 등이 교시한 바와 같이, T 임파구는 전형적으로 APC의 표면 상에 자체 MHC 분자의 홈 안에서 그들에게 제시되는 항원성 펩티드를 인식한다. 이러한 MHC-제한된 인식은 TCR/CD3 복합체를 통해 매개된다. TCR/CD3 복합체에 의한 항원성 펩티드의 인식 결과 연속단계의 신호 전달 과정을 통해 T 세포의 활성화가 일어나게 된다. T 세포의 활성화의 결과 궁극적으로 사이토킨의 방출, 새로운 표면 분자의 발현 및 작동체 기능의 성숙을 유도하는 각종 유전자의 증식 및 전사 활성화가 일어나게 된다.

마가리안-블랜더, 제이. 등은 또한 유관 상피세포 뿐만 아니라 동일한 기원의 암성 세포의 표면 상에 발현되는 I형 막횡단 당단백질인 MUC1 상의 펩티드 에피토프를 인식하는 MHC-비제한된 βT 세포에 대해 이미 보고하였음을 주목한다. 상기 세포의 세포외 도메인의 많은 비율은 T 세포 에피토프를 함유하는 직렬 반복된 20-아미노산 서열로 구성된다. MUC1 직렬 반복 에피토프의 MHC-비제한된 인식은 TCR 및 CD3 복합체에 대한 Ab에 의해 차단되며, 이는 이러한 인식이 TCR 매개되는 것임을 나타낸다. 이들 연구원들은 MUC1 직렬 반복단위가 프로세싱되지 않은 에피토프의 조밀한 어레이를 MHC 분자에 의해 제시될 필요가 없는 단단한 구조로서 TCR에 직접 제시함을 제안하였다. 합성 펩티드 유사체를 이용한 MUC1 직렬 반복 단백질 코어의 구조적 연구 결과, T 세포 에피토프가 폴리펩티드 코어의 연장된 β-회전 나선 구조를 지나서 돌출된 루프를 형성하는 안정한 규칙적인 구조를 나타내는 것으로 확인되었다.

보다 최근에는, 특정 MUC1 에피토프에 대해, 별개로 제조된 항원 제시 세포들을 사용하는 펩티드의 제시없이, 오로지 에피토프 제시 펩티드와의 배양에 의한 시험관내 MUC1 항원 특이적 항-종양 임파구의 활성화가 보고되었다. 따라서, 문헌 [Wright S. E. et al., "Cytotoxic T lymphocytes from humans with adenocarcinomas stimulated by native MUC1 mucin and a mucin peptide mutated at a glycosylation site," J Immunother. 23:2-10 (2000)]은 MUC1 뮤신 펩티드가 선암종을 가진 인간으로부터 얻은 세포독성 T 임파구 (CTL)를 자극하였음을 개시하고 있다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 종양 주변 임파절 (TDLN) 세포 또는 종양 침윤 임파구 (TIL)는 유방 또는 난소의 선암종을 가진 인간으로부터 얻은 단핵 세포를 이용하여, 각각 (a) 20 아미노산의 천연 MUC1 뮤신 직렬 반복 펩티드 (MUC1-mtr1) + 재조합 인간 인터류킨-2 (IL-2), (b) 돌연변이된 (T3N) MUC1-mtr1 + IL-2, 또는 (c) 고정된 항-CD3 + IL-2, 또는 (d) IL-2 단독으로 자극되었다. 이들 4가지 조건의 각각에 의해 자극된 CTL은 주로 CD4+였다. 그러나, 천연 MUC1-mtr1 또는 (T3N) MUC1-mtr1에 의해 자극된 CTL은 항-CD3 + IL-2 또는 IL-2 단독에 의해 자극된 CTL에 비해 MUC1을 발현하는 유방암 세포주에 대해 5-10배 더 큰 세포독성을 나타내었다. 각 배양 조건은 T-세포 수용체의 다른 가변적인 베타 유전자 족을 가진 CTL을 발생시켰으며, 이는 각각에 대해 제한된 CTL 레퍼토리의 올리고클로날 확대를 암시하는 것이다. 따라서, 펩티드-자극된 T 세포는 비특이적 (항-CD3 또는 IL-2) 자극에 의해 유도되지 않은 세포독성 세포의 발현을 나타내었다. 또한, 이 저자들은 뮤신-펩티드 자극된 세포주의 세포독성이, 추측상 유방암을 가진 공여자로부터의 PBLC에 대한 HLA I 및 II 류의 농도 및 난소암을 가진 공여자로부터의 TIL에 대한 적어도 I 류의 농도에서 비-HLA 제한되었음을 보고하였다. 이러한 연구는 비만은 아니지만 당뇨병을 가진 중증 복합 면역결핍 (NOD SCID) 마우스에게 입양 전이된, 유방암을 앓는 환자로부터 얻은 뮤신 1 자극된 조혈 단핵 세포 (M1SHMC)가 육안 선암종의 치료 모델의 생존 기간을 연장시키고 최소 질환 모델에서 종양 성장을 방지하였음을 밝히기 위해 발명자들에 의해 확대되었다 (Wright, S.E...., Phillips, C. A., et al., "Adoptive immunotherapy of mucin1 expressing adenocarcinomas with mucinl stimulated human peripheral blood mononuclear cells," Int J Mol Med. 9:401-404 (2002)). M1SHMC는 뮤신 1을 발현하는 인간 유방 선암종 세포주인 MCF-7의 특이적 용해를 나타내었으며 인터페론 감마를 생성하였다. M1SHMC는 MCF-7이 피하 (SC) 주입된 후에 거대 촉지 종양이 나타난 후에 NOD SCID 마우스에 복강내 (IP) 주입되었다. 생존 기간은 M1SHMC 대조군 없이 비교될 때 증가되었다. 그러나, 종양은 결국 모든 마우스에서 재성장하였다. 최소 질환 (MD)이 조절될 수 있는지를 결정하기 위해, NOD SCID 마우스에 MCF-7 세포가 주입되고, 같은 날에 M1SHMC가 IP 주입되었다. M1SHMC 주입된 마우스는 종양 성장으로부터 보호되었다. 이 결과는 M1SHMC가 생존 기간을 연장할 수는 있지만, 거대 촉지 선암종을 가진 NOD SCID 마우스를 치료하지는 못함을 암시한다. 그러나, 최소 질환 모델에서 종양 성장이 방지되었다.

지질-변형된 muc-1 유도체에 관하여, 2003년 7월 29일에 아그라월 (Agrawal) 등에게 허여된 미국 특허 제6,600,012호는 다수의 말초 혈액 임파구 (PBL)와 항원 부하된 리포좀을 조합하여 항원 부하된 PBL을 생산하고, 항원 부하된 PBL을 비감작, 무반응 또는 메모리 T-세포와 조합하여 활성화된 T-세포를 생산함으로써 활성화 T-세포의 혼합물을 형성하는 방법을 개시한다. 그러한 활성화는 생체내에서 또는 시험관내에서 수행된다. 이 발명의 방법에 따라서 제조된, 항원 부하된 PBL 및 활성화된 T-세포는 암 및 바이러스 질환을 치료하기 위한 세포성 백신으로서의 용도를 갖는 것으로 언급된다. 이 특허 및 그에 인용된 참조문헌은 수지상 세포 (DC)가 초기에 비감작 T-세포를 프라이밍하는 가능한 APC인 것으로 간주되며, DC가 일차 항원 특이적 CTL 반응의 시험관내 자극에 대한 APC로서 사용되었음을 교시하고 있다. DC는 프라이밍되지 않은 T-세포와 강하게 응집할 수 있으며, 비감작 휴지 T-세포의 자극에 대해 중요한, B7.1 및 B7.2와 같은 고밀도의 보조 분자를 발현함이 제안되었다. 그러나, 아그라월 (Agrawal) 등은 또한 DC가 (1) 면역요법에 대한 각종 펩티드의 면역원성의 결정 및 (2) 입양 세포 요법에 대한 확대를 위한 T-세포의 자극을 위한 우수한 후보는 아님을 교시하고 있다. 이러한 면에서, 선행 기술은 DC를 사용한 항원-특이적 CD8.sup. + CTL 반응의 발생에 관한 것이다. 아그라월 (Agrawal) 등에 따르면, 개시된 발명은 (a) 리포좀 캡슐화 펩티드 항원을 다수의 말초 혈액 임파구와 조합하여 항원 부하된 항원 제시 세포를 생산하는 단계; (b) 비감작 또는 무반응 T-세포를 상기 항원 부하된 항원 제시 세포와 조합하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 조합으로부터 얻은 활성화 T-세포를 분리하는 단계를 포함하는, 활성화 T-세포를 발생시키는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 이 발명은 상기 활성화 T-세포가 T 헬퍼 세포인 그러한 방법 및 상기 활성화 T-세포가 세포독성 T-세포인 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양은 비감작 T-세포를 리포좀 캡슐화 펩티드 항원으로 이미 부하된 PBL (APC로서 작용함)로 활성화함으로써 시험관내에서 발생되는, MUC-1 펩티드 특이적인 활성화 CD4+ 및 CD8+ T-세포 집단의 형성에 관한 것이다. 또다른 실시태양에서, 이 발명은 리포좀 캡슐화 항원 및 자가 전체 말초 혈액 임파구 (PBL)(항원 제시 세포로서 작용함)와 함께, 비감작 T-세포, 메모리 T-세포 및 무반응 T-세포, 또는 3가지 세포 유형 모두의 혼합물을 이용한 활성화 T-세포의 형성에 관한 것이다.

비-종양 세포 특이적 항원의 영상화를 위한 임파구의 사용이 또한 개시되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Mazzoni, G. et al., "Indium-labeled presensitized T cells for diagnosis of graft rejection," J Surg Res. 52:85-88 (1992)]은 보고된 실험의 목표가 초기 동종이식 거부반응의 필요한 정확한 진단을 위한 안전하고 비침습적인 방법을 시험하는 것임을 개시하고 있다. 심장-폐 동종이식은 공여자로서 브라운 노르웨이 (BN) 쥐와 수용자로서 루이스 (LEW) 쥐를 이용하여 이소성 (異所性)으로 수행되었다. T 세포 현탁액은 전층 BN 피부 이식의 심각한 거부반응을 나타낸 특이적으로 감작된 LEW 쥐의 임파절로부터 제조되었다. 세포 수는 50 x 10(6) 세포/㎖로 조정되었다. 현탁액은 ¹¹¹In 옥시드 (1 mCi-㎖)와 함께 시험관내 배양되었다. 40 x 10⁶ 세포 및 200 mCi의 총 방사활성을 함유하는 표지된 세포 현탁액의 분취량을 심장-폐 이식 후 3일 및 6일에 각 동물에게 정맥내 투여하였다. T 세포의 수송은 대형 뷰 감마 카메라로 생체내 및 분리된 기관에서 추적되었다. 감마 카메라는 심장이 활발히 박동될 때 이식 시작 수술후 5일째에 방사활성을 나타내었고; 동계이식된 기관 부위에서는 방사활성을 나타내지 않았다. 조직학은 방사선영상 세기 등급에 대응하는 경도 내지 중등도 세포성 침윤을 나타내었다. 인듐-표지 예비감작된 T 세포의 주입으로 거부 반응의 임상적 증상이 없고 및(또는) 거부반응 연속단계가 역전될 수 있을 때 초기에 거부 반응 과정을 검출할 수 있다.

포유동물 체내의 세포 영상화를 위한 기타 각종 방사성표지 계통의 방법들이 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Anders, G. T. et al., "SPECT gallium-67 scanning in early human immunodeficiency virus (HIV) infection. Failure of scanning abnormalities to correlate with immunologic staging," Clin Nucl Med. 15:295-302 (1990)]은 AIDS 환자의 치료에서의 갈륨 스캐닝의 사용을 개시하고 있다. 또한, 문헌 [Korf, J., et al., "Divalent cobalt as a label to study lymphocyte distribution using PET and SPECT," J Nucl Med. 39:836-841 (1998)]은 PET 및 SPECT에 의해 살아있는 인간에서 임파구 (단, 이들 세포는 생체외에서 적절하게 예비표지됨) 분포를 연구할 수 있음을 교시하며, 또한 2가 코발트 동위원소 (PET의 경우 ⁵⁵Co²⁺, 반감기 17.5시간; SPECT의 경우 ⁵⁷Co²⁺, 반감기 270일)의 임파구 표지 능력을 기재하고 있다. 또한, 1998년 11월 24일에 램버트 (Lambert) 등에게 허여된 미국 특허 제5,840,859호는 세포막을, 예를 들면 요오드의 방사성 동위원소, 즉 ¹²³I, ¹²⁵I 또는 ¹³¹I로 방사성표지하기 위한 (아미노스티릴)피리디늄 화합물; 또는 폴리카르복실산에 의해 킬레이트화된, ¹¹¹In 또는 ^99mTc와 같은 금속 방사성 동위원소 1 당량을 포함하는 킬레이트기를 개시하고 있다. 램버트 등은 개시된 방법에 따라서 표지된 자가 임파구가 생체내 임파구 추적 및 임파성 악성종양의 임상적 영상화에 사용될 수 있음을 교시하며, 개시된 화합물이 입양 면역요법 전에 전이성 흑색종을 영상화하기 위해 배양된 임파구를 표지하는 바람직한 제제로서 ¹¹¹인듐-옥신을 대체할 수 있음을 제안한다.

2000년 11월 14일에 루빈 (Rubin) 등에게 허여된 미국 특허 제6,146,614호는 영상술을 이용하여 포유동물에서의 임파구 분포 및 수송을 확인하는 방법에 관한 것이다. 포유동물의 임파구와 특이적으로 상호작용할 수 있는 표지된 리간드를 포유동물에 투여하여 표지된 리간드가 임파구와 생체내 상호작용하도록 하여 표지된 임파구를 형성하거나, 또는 표지된 리간드를 임파구와 시험관내 접촉시켜 표지된 리간드가 임파구와 상호작용하도록 하여 표지된 임파구를 형성하고 표지된 임파구를 포유동물에 투여한다. 포유동물에서의 표지된 임파구의 분포 또는 수송은 영상술에 의해 확인된다. 포유동물의 임파구 분포 또는 수송 패턴을 확인하고, 질병을 가진 포유동물에서의 요법에 대한 반응을 모니터하고, 임파구의 분포 또는 수송을 변화시키는 제제의 능력을 평가하고 질병을 가진 포유동물을 치료하는데 유용한 제제를 확인하여 포유동물에서의 질병의 진행 정도를 진단하는 방법이 또한 기재되어 있다. 특정 실시태양에서, 포유동물은 질환, 예를 들면 HIV 감염, 자기면역 질환, 감염성 질환 또는 악성종양을 갖는다. 임파구는 예를 들면, B 세포 또는 T 세포일 수 있다. 특정 실시태양에서, 임파구는 CD4-양성 세포 또는 CD8-양성 세포인 것이 바람직하다. 리간드는 예를 들면, 항체, 예를 들면 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체, 예를 들면 항-CD4 모노클로날 항체, 항체 단편, 재조합 항체, 펩티드, 펩티드 모방체, 탄수화물 또는 당단백질일 수 있다.

발명의 간단한 요약

본 발명은 표지된 항원 특이적 임파구, 바람직하게는 포유동물의 말초 혈액 단핵 세포를 세포 특이적 항원의 면역원성 에피토프를 나타내는 펩티드에 노출시켜 얻은 활성화된 T 세포를 투여하고, 포유동물 내의 표지된 임파구의 분포를 영상술로 확인하여 포유동물 내의 세포 특이적 항원을 검출하고 위치결정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 발명자들에 의해 인식되는 다음의 작동 요소에 부분적으로 기초한다:

종양 특이적 에피토프에 대해 지정된 방사성표지 활성화 임파구 집단이 본 발명의 진단 방법에 유용하다;

상기 세포는 감작되는 종양 에피토프로 이동하여 부착하는 능력을 갖는다;

상기 세포는 아주 작은 종양 (예를 들면, 직경이 2 ㎜ 이하임)의 위치결정을 확장시키는 능력을 갖는다;

그러한 세포는 기지의 면역원성 에피토프로 미지의 원발성 종양, 예를 들면 항-뮤신 펩티드 세포독성 T 임파구 (CTL), 즉 뮤신 폴리펩티드 또는 또다른 종양 항원의 아미노산 서열로부터 유래된 면역원성 펩티드로 활성화된 T 세포를 사용하여 검출될 수 있는 뮤신 생성 선암종을 확인하는데 유용하다.

따라서, 본 발명의 방법의 한 실시태양은

환자의 혈액 또는 다른 임파양 세포 함유 부위로부터 유래된 임파양 세포 집단이 뮤신과 같은 특정 종양 에피토프에 대해 자극되고;

활성화된 임파양 세포는 시험관내에서 특정 종양을 사멸시키거나 인식하는 능력에 대해 평가되며;

임파양 세포의 활성화 집단은 시험관내에서 인듐 옥신 또는 다른 유사한 방사성 동위원소로 방사성표지되거나 "태그"되며;

방사성표지된 세포는 정맥내로 또는 복강내로 (복강 종양) 전달되며;

생체분포는 48시간 동안 핵 의학에 의해, 또한 프로스타신트 (ProstaScint)(등록상표) 전립선 스크린 기술에서와 같이 "열소 (hot spot)"의 존재에 대해 분석된 영상에 의해 모니터되며;

SPECT 핵 의학 영상은 이 부위에서 종양을 입증할 수 있는지를 확인하기 위해 CT 또는 MRI 영상과 융합되며, 이러한 영상은 추가의 확인을 위해 PET 영상과 비교될 수 있다.

본 발명자는 또한 이러한 비침습적 진단 방식의 사용이 예를 들면, 전이를 확인하지 않는 시험적 수술 후에 외과적 회복하는데 걸리는 불필요한 시간 손실을 방지하고, 예를 들어, 치료가 개시된 후에 새로운 위치에서 전이성 질환이 검출되는 경우 더욱 효율적인 방식의 사용을 용이하게 할 것임을 이해하였다. 양전자 방출 단층촬영 (PET) 만을 이용하는 진단 방법은 임상적 치료를 현저하게 변화시키는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명자들은 상기 방법을 단독으로 또는 PET와 같은 다른 기술과 조합하면 암을 조기에 검출할 수 있을 뿐만 아니라 암의 병기결정을 더 잘 수행할 수 있다고 생각했다.

본 발명의 방법에 대한 초기의 임상적 연구는 문헌 [Phillips, C. A., et al., "Trafficking as a consideration in adoptive immunotherapy: How does the route of administration affect the delivery of cytotoxic T lymphocytes to tumor?" J. Immunol. 25(6):S34 (November/December 2002)]에 다음과 같이 개시되어 있다:

특정 세포독성 T 임파구 (CTL)를 사용하는 입양 면역요법은 통상의 수술, 방사선 및 화학요법 후에 잔류 종양을 파괴하기 위한 실험적 요법이다. 다른 경로에 의해 투여되는, 입양 전이된 CTL 제제의 이동 패턴은 환자에서 최소한으로 연구되었다. 우리는 종양 뮤신 펩티드에 대해 자극된 ¹¹¹인듐-표지된 CTL 제제의 생체내 이동을 모니터하였다. 이들 세포의 생체분포는 정맥내 투여될 때와 복강내 투여될 때가 아주 다르다. 활성화된 임파구의 제제는 소수의 유방암 환자 (종양이 있는 환자 2명과 종양이 없는 환자 2명) 및 재발성 종양을 가진 5명의 난소암 환자 (BB IND 8620)에게 투여되었다. 프로토콜은 매달 2번 주입하는 것으로 기록되어 있다 (4개월 동안 하나는 방사성표지되고 하나는 표지되지 않음). 유방암 환자에서 정맥내 투여된 CTL 제제의 생체분포는 인듐 옥신 백혈구 스캔의 대표적인 것이다. 시간별 생체분포의 수량화로 비-세포독성 T 및 비-특이적 세포독성 세포가 종양으로 수송되지 않았음이 밝혀졌다. 시간별 세포 이동의 상세한 것이 밝혀질 것이다. 난소암 환자에서, 패턴은 아주 주목할만하였다. 복강내로 주입된, 방사성표지된 CTL 제제는 첫번째 영상에서 인식가능한 패턴을 형성하였으며, 이 패턴은 다음 수일에 걸쳐 자체적으로 수정되었고 각 환자에 대해 독특하다. 복막 밖으로의 이동은 신속하며, 1시간에 약 10％이고 98시간에 약 30％이다. 방사성표지된 CTL 제제는 기지의 종양 (CT 스캔으로부터)에 또한 복강내 및 복강외, 전이 종양으로서 아직 확인되지 않은 부위에 위치결정되었다. 유방 및 난소암 환자에 대한 특정 경우의 방사성표지된 CTL 제제의 생체분포 및 난소암의 경우에 대한 CT 스캔 및 SPECT 영상의 융합이 밝혀질 것이다. CTL 전달에 대한 장점들이 상세히 논의될 것이다.

상기한 면에서, 본 발명의 목적은 개체에서 활성화된 항원 특이적 임파구 분포 및 수송을 탐지하여 세포 특이적 항원을 검출하기 위한 안전하고, 효율적이고 용이한, 바람직하게는 비침습적인 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 개체의 활성화된 임파구 분포 및 수송 패턴으로부터 세포 특이적 항원의 위치결정을 확인하기 위해 영상술을 이용하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 개체의 활성화된 임파구 분포 및 수송 패턴으로부터 세포 특이적 항원의 위치결정을 확인하여 개체에서의 질병의 진행을 평가하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 개체에서 활성화된 임파구 분포 및 수송 패턴으로부터 세포 특이적 항원의 위치결정에 대한 질병의 요법의 효과를 평가하여 질병에 대한 요법의 효능을 평가하는 것이다.

따라서, 한 면에서 본 발명은 (a) 포유동물로부터 말초 혈액 단핵 세포를 얻는 단계; (b) 말초 혈액 단핵 세포 내의 T 임파구가 항원 특이적 활성화되는 조건 하에 말초 혈액 단핵 세포를 세포 특이적 항원의 면역원성 에피토프를 나타내는 면역원성 펩티드에 노출시킴으로써 세포 특이적 항원에 결합하는 활성화된 항원 특이적 T 임파구를 생산하는 단계; (c) 영상술에 의해 검출가능한 표지로 항원 특이적 T 임파구를 표지하는 단계; (d) 표지된 항원 특이적 T 임파구를 포유동물에 투여하는 단계; 및 (e) 포유동물 내의 표지된 항원 특이적 T 임파구의 분포를 영상술로 결정함으로써 포유동물 내의 세포 특이적 항원을 검출하고 위치결정하는 단계를 포함하는, 인간과 같은 포유동물에서 세포 특이적 항원을 검출하고 위치결정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법의 일부 실시태양에서, T 세포의 활성화를 촉진하는 인터류킨-2 (IL-2)의 존재하에 말초 혈액 단핵 세포를 면역원성 펩티드에 노출시키는 상기 단계 (b)를 수행한다.

유리하게는, 표지된 항원 특이적 T 임파구를 포유동물에 투여하는 단계 (d) 전에 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 추가의 세포를 첨가하지 않고 말초 혈액 단핵 세포에 면역원성 펩티드의 무세포(cell-free) 제제를 첨가함으로써 말초 혈액 단핵 세포를 면역원성 펩티드에 노출시키는 단계 (b)를 수행한다. 따라서, 이전에 개시된 T 세포 활성화 방법, 예를 들면 아그라월 등에게 허여된 미국 특허 제6,600,012호 (MUC-1 펩티드 특이적인 활성화 CD4+ 및 CD8+ T-세포 집단은 PBMC 중의 비감작 T-세포를 항원 제시 세포 (APC)로서 작용하는 말초 혈액 백혈구 (PBL)로 활성화함으로써 시험관내에서 발생됨)의 방법과 대조적이다. 이들 PBL은 개별 배양액에서 리포좀 캡슐화 펩티드 항원으로 이미 부하되었고, 그후에 PBMC로부터의 비감작 T-세포의 배양액에 첨가됨으로써, T 세포 활성화 과정의 복잡성 및 다중 세포 배양액을 조작하는데 있어서 오염 또는 기타 원인으로 인한 손실 위험이 증가되었다.

또한, 세포 특이적 항원을 발현하는 세포에 대해 세포용해성인 항원 특이적 T 임파구의 사용이 본 발명에서 유리하다. 따라서, 세포용해성 (또는 더욱 일반적으로는 세포독성) T 세포 (CTL)가 표적화된 세포 특이적 항원을 갖고 있는 세포에비-세포용해성 항원 특이적 T 세포보다 더욱 효율적으로 결합할 수 있지만; 입양 면역요법 용도와 달리 본 발명의 진단 방법은 항원 보유 표적 세포를 효과적으로 살해할 수 있는 T 세포를 반드시 필요로 하지는 않는다. 따라서, 본 발명의 방법의 활성화된 항원 특이적 T 세포는 CD4+ 임파구 또는 CD8+ 임파구 또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 활성화 항원 특이적 세포는 또한 메모리 T 세포, 특히 CD45RO+ 메모리 T 세포를 포함할 수 있다. 표적 항원의 에피토프를 나타내는 폴리펩티드 또는 펩티드와 같은 무세포 항원에 PBMC로부터의 T 세포를 노출시켜 항원 특이적 T 임파구를 생산하는 본 발명의 방법의 또다른 잇점은 그러한 항원 특이적 T 임파구가 미미한 양의 자연 살해 (NK) 세포를 포함할 수 있다는 것이다 (예를 들어, CD3-, CD8-, CD56+ 표현형을 갖는 세포의 백분율로 나타나는 바와 같이, 약 10％ 미만, 바람직하게는 약 6％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 3％ 미만임).

일부 실시태양에서, 포유동물 내의 표지된 항원 특이적 T 임파구의 분포를 결정하는 단계 (e)를 수행하기 전에 상기 T 임파구 투여와 함께 또는 투여 후에 사이토킨, 특히 IL-2를 포유동물에 투여하지 않고 표지된 항원 특이적 T 임파구를 포유동물에 투여하는 단계 (d)를 수행하는 것이 유리하다. 따라서, TIL 세포와 같은 T 세포에 의한 입양 면역요법에서는 일반적으로 세포독성 T 세포의 세포독성을 유지하기 위해 활성화된 세포독성 T 세포 투여와 함께 또한 투여 후에 고 투여량의 사이토킨, 특히 IL-2를 환자에게 투여할 필요가 있지만, 본 발명에서 진단 목적으로 사용될 때에는 활성화된 T 세포가 초기에 세포독성 활성화 상태로 있거나 그러한 상태로 유지될 필요가 없다. 그러므로, 본 발명의 방법에 따른 활성화된 T 세포를 이용함으로써, 다른 유형의 활성화된 T 세포의 입양 전이에 필요한 고 투여량의 IL-2 투여의 추가의 비용 및 잠재적인 부작용을 피할 수 있다.

본 발명의 방법의 일부 실시태양에서, 표지된 항원 특이적 T 임파구를 포유동물에 투여하는 단계 (d)는 임파구를 복강내로 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 필립스 (Phillips, C.A.) 등의 문헌 (상기 참조)에 개시된 바와 같이, 종양 뮤신 펩티드에 대해 자극된 입양 전이된 CTL 제제의 이동 패턴은 정맥내 투여될 때와 복강내 투여될 때가 아주 다르다. 유방암 환자에서의 정맥내 투여된 CTL 제제의 생체분포는 인듐 옥신 백혈구 스캔의 대표적인 것이다. 예를 들면, 레이놀드 (Reynolds, C.W.) 등 (상기 참조)은 표지된 LGL 또는 T 세포를 정상 수용자에게 i.v. 접종한 이후에, 폐에서 수분내에 많은 비율의 방사활성 (18 내지 33％)이 회복되었음을 교시한다. 폐에서의 방사활성 준위의 감소는 비장 및 간에서의 방사활성 계수의 상응하는 증가에 의해 수반된다. 마찬가지로, 친 (Chin, Y.) 등 (상기 참조)은 폐에서의 ¹¹¹In-표지된 TIL의 위치결정이 주입후 2시간 내에 보였으며, 폐, 간 및 비장에서 24시간에 고준위의 방사활성이 관찰되었음을 보고하였다. 폐에서의 활성이 72시간 후에 감소되었지만, 전이 부위에서 ¹¹¹In-표지된 TIL의 특이적 위치결정은 관찰되지 않았다. 마지막으로, 스위프트 (Swift, R.I.) 등 (상기 참조)은 ¹¹¹In-표지된 종양 활성화 살해 (TAK) 세포가 초기 4시간에는 폐에서 나타나고 후기 48시간에서는 복부에서 나타났지만, 간 영상은 아마도 정상 간 조직 내의 세포의 높은 배경으로 인해 전이성 병변에 상응하는 "냉점"을 나타내었음을 보고하였다.

각종 임파구의 정맥내 투여에 의한 일반적인 발견과 대조적으로, 본 발명자는 복강내로 주입된, 방사성표지된 CTL 제제가 첫번째 영상에서 인식가능한 패턴을 형성하였으며, 이 패턴은 이후 수일에 걸쳐 자체적으로 수정되었고 각 환자에 대해 독특함을 발견하였다. 복막 밖으로의 이동은 신속하며, 1시간에 약 10％이고 98시간에 약 30％이다. 방사성표지된 CTL 제제는 기지의 종양 (CT 스캔으로부터)에 또한 복강내 및 복강외, 전이 종양으로서 아직 확인되지 않은 부위에 위치결정되었다.

본 발명의 방법의 또다른 실시태양에서, 표지된 항원 특이적 T 임파구를 상기 포유동물에 투여하는 단계 (d)는 임파구를 정맥내로 투여하는 것을 포함한다. 유리하게는, 그러한 실시태양에서, 임파구의 정맥내 투여는 포유동물에 당접합체(glycoconjugate)를 투여하는 것을 더 포함하여, 당접합체를 투여하지 않고 임파구를 투여하는 경우에 비해 임파구의 수송이 변경된다. 따라서, 2003년 3월 14일에 WO 03/077864 A2로서 공개된 국제 출원 제PCT/US93/07834호 (본원에 전체적으로 참조문헌으로 인용됨)는 세포를 표적 세포로 향하게 하는 방법을 개시한다. 이 방법의 일부 실시태양은 탄수화물 제시 분자 (예를 들면, 당접합체) 및 세포를 포유동물에 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함한다. 이 방법에서, 당접합체, 특히 아시알로오로소뮤코이드(asialoorosomucoid)(아시알로 알파-(1)-산 글리코프로테인)와 같은 아시알로 혈장 단백질을 포함한 아시알로당접합체는 간 아시알로당접합체 수용체에 일시적으로 결합하며, 그에 따라 간 수용체에 의해 결합되는 아시알로 결정기를 갖고 있는, 임파구 및 특히 CD4+ 세포를 포함한 세포의 부착을 경쟁적으로 억제하는 것으로 생각된다. 이론에 얽매이길 바라는 것은 아니지만, 본 발명자는 하이포시알릴화 및 데시알릴화 단백질/당접합체 (또한, 아시알로당접합체로 칭함) 및 유사한 결정기를 갖고 있는 세포가 간 아시알로글리코프로테인 수용체에 대한 결합의 결과로서 간에서 결합되거나 또는 "포획"되는 것으로 생각한다. 아시알로당접합체에 의한 수용체의 점유는 간에서 유사한 당해 결정기를 갖고 있는 세포의 격리를 억제한다. 따라서, 본 발명의 방법에서 항원 특이적 T 임파구, 특히 CD4+ 임파구의 정맥내 투여 전에 또는 동시에 아시알로오로소뮤코이드와 같은 아시알로당접합체의 투여는 그러한 임파구가 정상 폐 및 간 조직 내에 축적되는 것을 방지함으로써 그러한 조직 내의 표지된 세포의 배경을 감소시키고 이들 조직 내의 종양 세포와 같은 항원 보유 세포의 검출을 증강시킨다. 또한, 상기 PCT 개시는 개시된 발명의 당접합체가 주입된 세포의 폐포 맥관계내 농축을 방지함을 나타낸다. 따라서, 항원 특이적 T 임파구, 특히 CD4+ 임파구의 정맥내 투여 전에 또는 동시에 오로소뮤코이드(orosomucoid)와 같은 아시알로당접합체의 투여는 또한 그러한 임파구가 정상 폐 조직 내에 축적되는 것을 방지함으로써 이 조직 내의 표지된 세포의 배경을 감소시키면서 간 및 비장으로의 세포 전달을 증강시킨다.

또다른 면에서, 본 발명은 종양 특이적 항원인 세포 특이적 항원을 검출하고 위치결정하는 방법을 제공한다. 유리하게는, 항원은 인간 뮤신1 (MUC-1)과 같은 종양 특이적 뮤신이며, 펩티드 면역원은 MUC-1의 에피토프를 나타낸다. MUC-1 (또한 MUC1로 칭함)은 유방, 폐, 췌장, 전립선, 위, 결장 및 난소를 포함한 모든 선암종의 90％에서 과발현되는 상피세포 뮤신 당단백질이다. 유리하게는, MUC-1의 면역원성 펩티드 에피토프를 이용하는 본 발명의 방법은 MUC-1 에피토프를 갖고 있는 세포에 대해 MHC-비제한된 세포독성을 나타내는 CD4+ 임파구를 포함하는 T 세포를 제공한다. 따라서, 마가리안-블랜더, 제이. 등 (상기 참조)은 MUC-1 상의 종양 특이적 펩티드 에피토프의 MHC-비제한된 TCR 인식을 논의한다. 또한, 라이트 (Wright S. E.) 등 (상기 참조)은 MUC1 뮤신 펩티드가 선암종을 가진 인간으로부터 얻은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 내의 세포독성 T 임파구 (CTL)를 자극하였음을 개시한다. 따라서, 펩티드 자극된 T 세포는 비특이적 (항-CD3 또는 IL-2) 자극에 의해 유도되지 않은 세포독성 세포의 발현을 나타내었다. 또한, 이 저자들은 뮤신-펩티드 자극된 세포주의 세포독성이 비-HLA 제한 (즉, MHC-비제한)되었음을 보고하였다. MHC-비제한된 세포독성을 나타내는 항원 특이적 T 임파구를 제공하는 면역원을 이용하는 잇점은 그러한 단일 면역원이 본 발명에 사용되어 MHC 배경에 상관없이 어떠한 환자로부터의 항원 특이적 T 임파구를 생산할 수 있다는 것이다.

마가리안-블랜더, 제이. 등 및 그에 인용된 참조 문헌에 개시된 바와 같이, Ag-특이적 MHC-비제한된 인식의 다른 예가 또한 기재되어 있다. 예를 들면, 마이코박테리아 Ag에 대해 특이적인 MHC-비제한된 T 세포는 류머티스성 관절염을 앓는 환자의 활액 및 마이코박테리아 결핵으로 면역된 마우스로부터 분리되었다. B 세포 종양 상의 Ig Ids, 헤르페스바이러스 당단백질 및 비펩티드 프레닐 피로포스페이트와 같이 Ag에 대해 특이적인 MHC-비제한된 T 세포가 또한 분리되었다. Ag-특이적인, MHC-비제한된 βT 세포는 또한 아비딘 및 미엘린 염기성 단백질과 같은 복합 단백질, 뿐만 아니라 헤모글로빈의 헴 (heme) 성분과 같은 비펩티드 Ag에 대해 설명되었다. 몇가지 연구들은 또한 MHC 분자의 부재하에 Ag를 인식할 수 있는 아르손산염- 및 플루오레세인-특이적 T 세포를 설명하였다. 수포성 구내염 바이러스 뉴클레오프로테인으로부터 유래된 글리코실화 펩티드 상의 탄수화물 성분에 대해 특이적인 탄수화물 특이적 MHC-비제한된 T 세포가 또한 생성되었다.

유리하게는, 본 발명에 따라서 MUC-1을 발현시키는 세포의 위치결정을 위하여, 면역원성 펩티드는 서열 (통상적인 단문자 코드로 표시됨): (서열 확인 번호: 1) PDTRP를 포함하는 MUC-1 서열의 원순열(circular permutation)인 아미노산 서열을 포함하는 MUC-1의 에피토프를 나타낸다. 유리하게는, 펩티드는 아미노산 서열 (서열 확인 번호: 2) GSTAPPAHGVTSAPDTRPAP를 갖는다. 본 발명에 이용될 수 있는 다른 MUC-1 면역원성 펩티드 및 그의 유도체는 다른 문헌에, 예를 들어 아그라월 등에게 허여된 미국 특허 제6,600,012호에 개시되어 있으며, 그 예로는 제한되는 것은 아니지만 항원 특이적 T 세포 반응을 발생시키며 아미노산 서열 STAPPAHGVTSAPDTRAPGSTAPP (서열 확인 번호: 3)의 약 7 내지 약 20 아미노산의 서열을 포함하는 MUC-1 펩티드가 있다.

또한 유리하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 면역원성 펩티드는, 예를 들어 본 발명의 방법이 아그라월 등에 의해 교시된 바와 같이 (a) 리포좀 캡슐화 펩티드 항원을 다수의 말초 혈액 임파구와 조합하여 항원 부하된 항원 제시 세포를 생산하는 단계; (b) 비감작 또는 무반응 T-세포를 상기 항원 부하된 항원 제시 세포와 조합하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 조합으로부터 얻은 활성화 T-세포를 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 발생된 활성화 T 세포를 사용할 때, 지질 잔기로 공유 변형된 리포좀 캡슐화 펩티드 또는 MUC-1 펩티드이다.

본 발명에 따라서 임파구를 검출하는데 사용되는 표지는 포유동물의 체내 세포를 검출하기 위한 당업계에 공지된 임의의 표지일 수 있다. 유리하게는, 표지는 감마 방출체, 양전자 방출체, 자성체, 밀도 기초의 조영제 및 그의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 표지가 감마 방출체일 때, 그것은 인듐-111, 테크네튬-99m, 테크네튬-99, 요오드-123 및 그의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 유리하게는, 표지는 전형적으로 인듐 옥신 형태인 인듐-111이다.

본 발명의 방법에서 표지된 임파구의 위치결정을 위한 영상술은, 물론 표지의 성질에 따라서 방사선영상술, 자기 공명 영상술, 양전자 방출 단층촬영 영상술 및 X-선 전산화 단층촬영 영상술로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한, 영상술은 단일 스캔 또는 연속 스캔으로 수행될 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 방법에 사용된 영상술은 포유동물의 전신 스캔을 포함한다.

일부 실시태양에서, 영상술은 2가지 이상의 별도의 스캔을 포함하며, 각각의 별도의 스캔은 방사선영상술, 자기 공명 영상술 (MRI), 양전자 방출 단층촬영 (PET) 및 X-선 전산화 단층촬영 (CT) 영상술로 이루어진 군에서 선택된다. 유리하게는, 그러한 실시태양에서 2가지 이상의 별도의 스캔으로부터 얻은 영상 데이타는 예를 들어, 다중 스캔으로부터의 데이타를 단일 표시 영상으로 융합하는 방법에 의해 비교된다. 예를 들면, 1988년 4월 5일에 골든버그에게 허여된 미국 특허 제4,735,210호는 임파관조영 및 기관 영상화 방법 및 키트, 특히 특정 항체 영상화제로 형성된 포지티브 상에서 육안 영상화제를 사용하여 형성된 네가티브 상을 제외하는 것을 포함하는 임파관섬광조영 또는 자기 공명 임파관조영을 위한 개선된 방법을 개시하고 있다. 더욱 최근에는, 2002년 12월 3일에 타운센드 (Townsend) 등에게 허여된 미국 특허 제6,490,476호는 통합된 PET 및 X-선 CT 단층촬영, 및 단일 장치에서 CT 및 PET 영상을 연속적으로 획득하여 내부 기관 이동, 스캐너 침대 단면의 변화 및 스캔하기 위한 환자의 위치잡기로 인한 정렬 문제를 극복하기 위해 상기한 바를 사용하는 방법을 교시하고 있다. 단층촬영술은 외부 마커 및 내부 랜드마크를 사용하지 않고, 정확하게 상관기록되는 기능적 및 해부학적 영상을 얻는다.

본 발명의 한가지 목적은 표준 영상술에 의해 현재 검출가능한 것보다 더 이전에 더 작은 종양을 검출하고 최초 원발성 종양이 쉽게 발견될 수 없는 종양을 발견하는 것이다. 또다른 잇점은 재발 단계가 더 잘 결정되어 불필요한 수술을 피하는 환자에 대한 최적의 치료 계획이 고안될 수 있도록 하는 것이다. 이 기술은 MRI, CT, PET 및 실험실 시험과 같은 발견을 입증하는데 사용될 수 있다.

그러므로, 한 면에서 본 발명은 (a) 포유동물로부터 말초 혈액 단핵 세포를 얻는 단계; (b) 말초 혈액 단핵 세포 내의 T 임파구가 항원 특이적 활성화되는 조건 하에 말초 혈액 단핵 세포를 상기 세포 특이적 항원의 면역원성 에피토프를 나타내는 면역원성 펩티드에 노출시킴으로써 세포 특이적 항원에 결합하는 항원 특이적 T 임파구를 생산하는 단계; (c) 항원 특이적 T 임파구를, 영상술에 의해 검출가능한 표지로 표지하는 단계; (d) 표지된 항원 특이적 T 임파구를 포유동물에 투여하는 단계; 및 (e) 포유동물 내의 표지된 항원 특이적 T 임파구의 분포를 영상술로 확인함으로써 포유동물 내의 세포 특이적 항원을 검출하고 위치결정하는 단계를 포함하는, 인간과 같은 포유동물에서 세포 특이적 항원을 검출하고 위치결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 특히 인간 피검자, 특히 종양 특이적 항원과 같은 세포성 항원의 이상 발현을 포함한 질병 또는 상태를 가진 환자에 유용하다.

1. 활성화 항원 특이적 T 임파구

본 발명에 사용하기 위해 포유동물로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 얻는 것은 일반적으로 당업계에 공지된 임의의 통상의 방법에 의해 행해질 수 있다. 예를 들면, 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque) 구배 원심분리와 같은 방법을 이용하여 말초 혈액 시료로부터 "연층 (buffy coat)"을 수집하여 다른 성분으로부터 말초 혈액 임파구를 분리하였다. 예를 들면, 본원에 참조문헌으로 인용된 문헌 [pages 7.0.5 - 7.1.5 of CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John E. Coligan, ed., John Wiley & Sons, New York, 1991]에 기재된 기술을 참조한다.

본 발명의 방법은 특히, 포유동물로부터의 PMBC 내의 T 임파구가 항원 특이적 활성화되는 조건 하에 PBMC를 세포 특이적 항원의 면역원성 에피토프를 나타내는 면역원성 펩티드에 노출시켜 포유동물로부터의 PBMC 내의 항원 특이적 T 세포를 활성화함으로써 세포 특이적 항원에 결합하는 활성화된 항원 특이적 T 임파구를 생산하는 것을 더 포함한다. 본원에 사용된 "활성화된" T 임파구 또는 T 세포는 유사분열 및(또는) 세포 분열되고 있다. 활성화된 T 임파구는 T 헬퍼 (T_H) 세포 또는 세포독성 T 세포 (세포독성 T 임파구 (CTL 또는 Tc))일 수 있다. 비감작 T-세포의 활성화는 그러한 세포를 항원 제시 세포 (APC)(항원/MHC 복합체를 함유함)에 또한 IL-1, IL-2, IL-12, IL-13, γ-IFN과 같은 분자, 및 유사한 임포카인에 노출시킴으로써 개시될 수 있다. 항원/MHC 복합체는 T 세포 표면 상의 수용체 (T 세포 수용체 (TCR))와 상호작용한다 [Golub et al., eds. Immunology: a Synthesis, Chapter 2: "The T-cell Receptor" (1991)]. 따라서, 본 발명의 방법의 일부 실시태양에서 T 세포의 활성화를 촉진시키는 인터류킨-2 (IL-2)의 존재하에 말초 혈액 단핵 세포를 면역원성 펩티드에 노출시키는 단계 (b)를 수행한다.

유리하게는, 표지된 항원 특이적 T 임파구를 포유동물에 투여하는 단계 (d) 전에 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 추가의 세포를 첨가하지 않고 말초 혈액 단핵 세포에 펩티드의 무세포 제제를 첨가함으로써 말초 혈액 단핵 세포를 면역원성 펩티드에 노출시키는 단계 (b)를 수행한다. 따라서, T 세포 활성화의 이전에 개시된 방법, 예를 들면 아그라월 등에게 허여된 미국 특허 제6,600,012호 (활성화 CD4+ 및 CD8+ T-세포가 비감작 T-세포를 항원 제시 세포 (APC)로서 작용하는 말초 혈액 백혈구 (PBL)로 활성화함으로써 시험관내에서 발생됨)와 대조적으로, 본 발명은 유리하게는 종양 특이적 항원을 발현하는 피검자의 PBMC 내의 T 임파구 전구체를 사용함으로써 항원 제시 세포 (APC)를 필요로 하지 않는다. 따라서 이론에 얽매이길 바라는 것은 아니지만, 본 발명자는 종양 특이적 항원, 특히 MUC-1 종양 항원을 발현하는 피검자의 PBMC가, 펩티드 제시를 위한 APC를 필요로 하지 않고, 종양 특이적 항원의 면역원성 펩티드 에피토프에 직접 노출시켜 종양 항원에 적어도 결합하도록 활성화될 수 있는 항원 특이적 T 임파구의 전구체를 함유하는 것으로 생각한다. 예를 들면, 종양 특이적 항원을 발현하는 피검자의 PBMC 내의 T 임파구는 종양 특이적 항원을 발현하는 숙주에서 "프라이밍"을 경험할 수 있다. 이 명세서에서, "프라이밍"은 활성화 및(또는) 메모리의 결과를 나타내도록, 동물 (인간 포함) 또는 배양된 세포를 항원에 노출시키는 것을 의미하는데 사용된다. 표적 항원에 대한 CD4+ 임파구 또는 CD8+ T 세포 반응의 발생은 일반적으로 자연 감염 또는 계획적 면역법을 통한 생체내 프라이밍에 좌우된다. 본 발명의 임상적 시험에서 활성화 항원 특이적 T 임파구를 생산하는데 이용되는 상세한 임상적 프로토콜은 하기 실시예 1에 제시되어 있다.

별법으로, 본 발명의 방법에 사용되는 활성화 항원 특이적 T 임파구는 항원으로, 특히 표적화된 세포 특이적 항원의 펩티드 에피토프 또는 그러한 펩티드 에피토프의 면역원성 유도체로 부하된 APC에 대한 시험관내 노출에 의해, 세포 특이적 항원에 전혀 노출되지 않은 비감작 T 세포를 활성화시킴으로써 생산될 수 있다. 예를 들면, 아그라월 등에게 허여된 미국 특허 제6,600,012호에 기재된 바와 같이, APC는 개별 배양액으로 리포좀 캡슐화 펩티드 항원으로 이미 부하되었고, 그후에 PBMC로부터의 비감작 T-세포의 배양액에 첨가된 PBL일 수 있다.

또한, 세포 특이적 항원을 발현하는 세포에 대해 세포용해성인 항원 특이적 T 임파구의 사용이 본 발명에서 유리하다. 따라서, 세포용해성 (또는 더욱 일반적으로는 세포독성) T 세포 (CTL)가 표적화된 세포 특이적 항원을 갖고 있는 세포에비-세포용해성 항원 특이적 T 세포보다 더욱 효율적으로 결합할 수 있지만; 입양 면역요법 용도와 대조적으로 본 발명의 진단 방법은 항원 보유 표적 세포를 효과적으로 살해할 수 있는 T 세포를 반드시 필요로 하지는 않는다. 따라서, 본 발명의 방법의 활성화된 항원 특이적 T 세포는 CD4+ 임파구 또는 CD8+ 임파구 또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 활성화 항원 특이적 세포는 또한 메모리 T 세포, 특히 CD45RO+ 메모리 T 세포를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "메모리 T 세포" ("메모리 표현형"으로서 공지되기도 함)는 이미 펩티드 항원을 만났지만, 현재는 휴지 상태이고 활성화될 수 있는 T 임파구류를 칭하는데 사용된다. 메모리 T 세포는 항원에 노출되고 그후에 자극 항원의 부재하에 몸 안에서 장기간 동안 생존하는 T 세포이다. 그러나, 이들 메모리 T 세포는 "리콜(recall)" 항원에 반응한다. 일반적으로, 메모리 T 세포는 펩티드 항원에 대한 비감작 T 세포 반응과 비교할 때 "리콜" 항원에 대해 더욱 반응성이다. 메모리 세포는 구별된 T 세포에 대한 마커인, CD45R0, CD58, CD11α, CD29, CD44 및 CD26과 같은 특정 세포-표면 항원의 존재에 의해 인식될 수 있다. 메모리 T 세포는 당업계의 숙련자에게 공지된 기술에 의해 분리된다. 예를 들면, 간단하게 총 T 세포 집단은 분리되고, 이어서 항-CD45R0, 항-CD44 또는 항-CD26 모노클로날 항체를 이용하여 형광 활성화 세포 분류 (FACS)된다 [Hollsberg et al., Cellular Immunology 149: 170 (1993); Bruno et al., Immunity 2: 37 (1995); and J Immunol. 150 (part 1): 3119 (1993) 참조].

표적 항원의 에피토프를 나타내는 폴리펩티드 또는 펩티드와 같은 무세포 항원에 PBMC로부터의 T 세포를 노출시켜, 본 발명에 따른 항원 특이적 T 임파구를 생산하는 본 발명의 방법의 또다른 잇점은 그러한 항원 특이적 T 임파구가 미미한 양의 자연 살해 (NK) 세포를 포함할 수 있다는 것이다 (예를 들어, CD3-, CD8-, CD56+ 표현형을 갖는 세포의 백분율로 나타내는 바와 같이, 약 10％ 미만, 바람직하게는 약 6％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 3％ 미만임). 예를 들면, 라이트 (Wright S. E.) 등의 문헌 [J. Immunother. 23:2-10 (2000)]은 활성화된 제제 내의 총 세포의 3-6％가 상기 NK 표현형을 나타내었음을 보고하였다. 또한, 본 발명의 방법에 따라 생산된 항원 특이적 T 세포는 활성화 후에 수개월 이상의 기간 동안 냉동 저장됨으로써, 예를 들면 수주 또는 수개월에 걸쳐 치료 과정을 추적하기 위해, 동일한 환자에서의 항원의 다중 위치결정을 위한 재현가능한 표지 및 영상화 조건에 대해 T 세포의 균일한 공급원을 제공하게 된다.

2. 활성화 T 임파구의 투여

일부 실시태양에서, 유리하게는 표지된 항원 특이적 T 임파구를 포유동물에 투여하는 단계 (d)는 포유동물 내의 표지된 항원 특이적 T 임파구의 분포를 확인하는 단계 (e)를 수행하기 전에, 사이토킨, 특히 IL-2를 T 임파구와 함께 또는 그후에 포유동물에 첨가하지 않고 수행된다. 별법으로, 생체내 사이토킨 지지체를 필요로 하는, TIL, LAK 또는 NK (TAK는 아님) 세포와 같은 T 세포에 의한 입양 면역요법에서와 같이, 항원 특이적 임파구의 투여와 동시에 및(또는) 후에 사이토킨, 특히 IL-2의 투여가 포함될 수 있다. 예를 들면, 폭케이지 (Pockaj, B. A.) 등 (상기 참조)은 고 투여량의 IL-2 및 TIL을 투여한 전이성 흑색종을 가진 환자에서의 인터류킨-2 (IL-2)-배양된 종양 침윤 임파구 (TIL)의 입양 전이를 개시하고 있다.

표지된 임파구의 포유동물로의 투여는 주사, 주입, 침착, 이식, 경구 섭취 또는 국소 투여를 비롯한 각종 방법에 의해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 투여는 주사에 의해 이루어진다. 주사는 예를 들면, 정맥내, 피내, 피하, 근육내 또는 복강내로 이루어질 수 있다. 본 발명의 방법의 일부 실시태양에서, 표지된 항원 특이적 T 임파구를 포유동물에 투여하는 단계 (d)는 임파구를 복강내로 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 필립스 등의 문헌 (상기 참조)에 개시된 바와 같이, 종양 뮤신 펩티드에 대해 자극된 입양 전이된 CTL 제제의 이동 패턴은 정맥내 투여될 때와 복강내 투여될 때가 아주 다르다.

유방암 환자에서의 정맥내 투여된 CTL 제제의 생체분포는 인듐 옥신 백혈구 스캔의 대표적인 것이다. 예를 들면, 레이놀드 등 (상기 참조)은 표지된 LGL 또는 T 세포를 정상 수용자에게 정맥내 접종한 이후에, 폐에서 수분내에 많은 비율의 방사활성 (18 내지 33％)이 회복되었음을 교시한다. 폐에서의 방사활성 준위의 감소는 비장 및 간에서의 방사활성 계수의 상응하는 증가에 의해 수반된다. 마찬가지로, 친 등 (상기 참조)은 폐에서의 ¹¹¹In-표지된 TIL의 위치결정이 주입후 2시간 내에 보였으며, 폐, 간 및 비장에서 24시간에 고준위의 방사활성이 관찰되었음을 보고하였다. 폐에서의 활성이 72시간 후에 감소되었지만, 전이 부위에서는 ¹¹¹In-표지된 TIL의 특이적 위치결정은 관찰되지 않았다. 마지막으로, 스위프트 등 (상기 참조)은 ¹¹¹In-표지된 종양 활성화 살해 (TAK) 세포가 초기 4시간에는 폐에서 나타나고 후기 48시간에서는 복부에서 나타났지만, 간 영상은 아마도 정상 간 조직 내의 세포의 높은 배경으로 인해 전이성 병변에 해당하는 "냉점"을 나타내었음을 보고하였다.

각종 임파구의 정맥내 투여에 의한 일반적인 발견과 대조적으로, 본 발명자는 복강내로 주입된, 방사성표지된 CTL 제제가 첫번째 영상에서 인식가능한 패턴을 형성하였으며, 그것은 다음 수일에 걸쳐 자체적으로 수정되고 각 환자에 대해 독특함을 발견하였다. 복막 밖으로의 이동은 신속하며, 1시간에 약 10％이고 98시간에 약 30％이다. 방사성표지된 CTL 제제는 기지의 종양 (CT 스캔으로부터)에 또한 복강내 및 복강외 전이 종양으로서 아직 확인되지 않은 부위에 위치결정되었다.

본 발명에 따른 활성화된 임파구의 복강내 투여는 제한되는 것은 아니지만, 종양 특이적 항원을 발현하는 전이와 같은, 표적 세포 항원을 발현하는 복강내 조직괴를 가진 암환자, 특히 난소암 환자와 같은 피검자에 특히 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 복강내 수술 전에, 비침습적으로 검출하기에 너무 작을 수도 있는 전이까지 확인하기 위해, 수술 후 화학 요법 개시 전의 추적 관찰 중에, 또한 화학 요법 경과 중에 또는 후에, 개입술의 효능을 평가하기 위해 또한 심지어는 작은 나머지 종양괴의 반응이 없는 경우에 추가의 또는 다른 요법의 필요를 나타내기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 방법의 또다른 실시태양에서, 표지된 항원 특이적 T 임파구를 상기 포유동물에 투여하는 단계 (d)는 임파구를 정맥내로 투여하는 것을 포함한다. 유리하게는, 그러한 실시태양에서, 임파구의 정맥내 투여는 포유동물에 당접합체를 투여하는 것을 더 포함하여, 임파구의 수송이 당접합체의 투여없이 임파구를 투여하는 경우에 비해 변화하게 된다. 따라서, 2003년 3월 14일에 WO 03/077864 A2로서 공개된 국제 출원 제PCT/US93/07834호 (본원에 전체적으로 참조문헌으로 인용됨)는 세포를 표적 세포로 향하게 하는 방법을 개시한다.

본 발명에 사용하기에 적합한 당접합체는 일반식 P-(S)x-Gal (여기서, P는 인간 혈청 당단백질의 펩티드 잔기이고, S는 인간 혈청 당단백질의 당 잔기이고, x는 1 내지 100의 정수이고, Gal은 갈락토스 잔기임)에 의해 일반적으로 표시될 수 있다. 당접합체는 부분적으로 또는 완전히 아시알릴화될 수 있다. 특히 유용한 당접합체는 페투인스 (fetuins), 아시알로페투인스, 오로소뮤코이드 및 아시알로오로소뮤코이드를 포함한다.

당접합체는 항원 특이적 세포의 투여와 관계되는 임의의 시간대에 포유동물에 투여될 수 있다. 그것은 세포의 투여 전에, 후에 또는 동시에 투여될 수 있다. 전형적인 실시태양에서, 당접합체는 세포 전에 투여된다. 당접합체는 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 그들은 비경구로, 더욱 바람직하게는 정맥내로 포유동물에 투여된다. 따라서, 본 발명의 방법에서 항원 특이적 T 임파구, 특히 CD4+ 임파구의 정맥내 투여 전에 또는 동시에 아시알로오로소뮤코이드와 같은 아시알로당접합체의 투여는 그러한 임파구가 정상 폐 및 간 조직 내에 축적되는 것을 방지한다. 추가로, 본 발명에 따른 항원 특이적 T 임파구, 특히 CD4+ 임파구의 정맥내 투여 전에 또는 동시에 이루어지는 오로소뮤코이드와 같은 아시알로당접합체의 투여는 또한 그러한 임파구가 정상 폐 조직 내에 축적되는 것을 방지하면서 간 및 비장으로의 세포 전달을 증강시킨다.

3. 면역원성 에피토프 및 항원

또다른 면에서, 본 발명은 종양 특이적 항원인 세포 특이적 항원을 검출하고 위치결정하는 방법을 제공한다. 유리하게는, 항원은 인간 뮤신1 (MUC-1)과 같은 종양 특이적 뮤신이며, 펩티드 면역원은 MUC-1의 에피토프를 나타낸다. MUC-1 (또한 MUC1로 칭함)은 유방, 폐, 췌장, 전립선, 위, 결장 및 난소를 포함한 모든 선암종의 90％에서 과발현되는 상피세포 뮤신 당단백질이다. 유리하게는, MUC-1의 에피토프를 나타내는 면역원성 펩티드를 이용하는 본 발명의 방법은 MUC-1 에피토프를 갖고 있는 세포에 대해 MHC-비제한된 세포독성을 나타내는 CD4+ 임파구를 포함하는 T 임파구를 제공한다. 따라서, 마가리안-블랜더, 제이. 등 (상기 참조)은 MUC-1 상의 종양 특이적 펩티드 에피토프의 MHC-비제한된 TCR 인식을 논의한다. 또한, 라이트 등 (상기 참조)은 MUC1 뮤신 펩티드가 선암종을 가진 인간으로부터 얻은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 내의 세포독성 T 임파구 (CTL)를 자극하였음을 개시한다. 따라서, 펩티드 자극된 T 세포는 비특이적 (항-CD3 또는 IL-2) 자극에 의해 유도되지 않은 세포독성 세포의 발현을 나타내었다. 또한, 이 저자들은 뮤신-펩티드 자극된 세포주의 세포독성이 비-HLA 제한 (즉, MHC-비제한)되었음을 보고하였다. MHC-비제한된 세포독성을 나타내는 항원 특이적 T 임파구를 제공하는 면역원을 이용하는 잇점은 그러한 단일 면역원이 본 발명에 사용되어 MHC 배경에 상관없이 어떠한 환자로부터의 항원 특이적 T 임파구를 생산할 수 있다는 것이다.

유리하게는, 본 발명에 따라서 MUC-1을 발현시키는 세포의 위치결정을 위하여, 면역원성 펩티드는 서열 (통상적인 단문자 코드로 표시됨): (서열 확인 번호: 1) PDTRP를 포함하는 MUC-1 서열의 원순열인 아미노산 서열을 포함하는 MUC-1의 에피토프를 나타낸다. 유리하게는, 면역원성 펩티드는 아미노산 서열 (서열 확인 번호: 2) GSTAPPAHGVTSAPDTRPAP를 갖는다. 본 발명에 이용될 수 있는 다른 MUC-1 면역원성 펩티드 및 그의 유도체는 다른 문헌에, 예를 들어 아그라월 등에게 허여된 미국 특허 제6,600,012호 및 2002년 2월 5일에 산드린 (Sandrin) 등에게 허여된 미국 특허 제6,344,203호 (MUC1의 펩티드 모방체 또는 암 백신에 포함되어 암 환자를 위한 방법에 사용될 수 있는 다른 암 펩티드를 기재함)에 개시되어 있다.

마가리안-블랜더, 제이. 등 및 그에 인용된 참조 문헌에 개시된 바와 같이, Ag-특이적 MHC-비제한된 인식의 다른 예가 또한 기재되어 있다. 예를 들면, 마이코박테리아 Ag에 대해 특이적인 MHC-비제한된 T 세포는 류머티스성 관절염을 앓는 환자의 활액 및 마이코박테리아 결핵으로 면역된 마우스로부터 분리되었다. B 세포 종양 상의 Ig Ids, 헤르페스바이러스 당단백질 및 비펩티드 프레닐 피로포스페이트와 같이 Ag에 대해 특이적인 MHC-비제한된 T 세포가 또한 분리되었다. Ag-특이적인, MHC-비제한된 βT 세포는 또한 아비딘 및 미엘린 염기성 단백질과 같은 복합 단백질, 뿐만 아니라 헤모글로빈의 헴 성분과 같은 비펩티드 Ag에 대해 설명되었다. 몇가지 연구들은 또한 MHC 분자의 부재하에 Ag를 인식할 수 있는 아르손산염- 및 플루오레세인-특이적 T 세포를 설명하였다. 수포성 구내염 바이러스 뉴클레오프로테인으로부터 유래된 글리코실화 펩티드 상의 탄수화물 성분에 대해 특이적인 탄수화물 특이적 MHC-비제한된 T 세포가 또한 생성되었다.

a. 일반적으로 유용한 항원

항원 특이적 MHC II 류 및 I 류 제한된 CD4+ 및 CD8+ T-세포 반응은 각종 병원성 조건에 대한 중요한 숙주 면역 반응이다. 그러므로, 항원 특이적 T-세포 반응의 발생이 특히 중요하다. 이 명세서에 사용된 바와 같이, "항원 특이적" T-세포 반응은 펩티드와 같은 주어진 항원성 자극에 대한 T 세포 반응 (증식성, 세포독성, 사이토킨 분비)이며, 이는 다른 아미노산 서열을 가진 펩티드 (대조 펩티드)와 같은 다른 자극에 의해 입증되지 않는다. T 세포의 반응성은 제한되는 것은 아니지만, CD25 및 CD69를 비롯한, T-세포 활성화의 특징인 세포 표면 분자의 외관을 평가함으로써 측정된다. 그러한 분석법은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 방법은 일반적으로 광범위한 항원에 적용된다. 이들 항원은 T 세포 특이적 면역 반응을 유도할 수 있기만 하면, 거의 어떠한 화학적 구조를 가질 수도 있으며, 그것은 1개 이상의 T 세포 특이적 에피토프를 함유할 수 있다. 예시적인 항원은 펩티드, 탄수화물, 지질 및 특히 그의 조합으로부터 유래될 수 있다. 특히 중요한 항원은 펩티드, 리포펩티드 및 글리코펩티드이다. 이디오타입 및 항-이디오타입 항원이 특별히 포함된다.

본 발명의 방법을 이용하는데 아주 유리한 항원은 종양 항원을 포함한다. 종양 항원은 일반적으로 종양의 존재와 상관이 있는 천연 또는 이종 항원이다. 종양 항원이 정상 조직으로부터 이상 조직을 구별하는데 유용하므로, 그들은 진단에서 뿐만 아니라 치료적 중재에 대한 표적으로서 유용하다. 따라서, 종양 항원에 대한 T 세포 특이적 면역 반응을 발생시키기 위한 본 발명의 방법의 용도는 발명의 중요한 면이다.

종양 항원은 당업계에 잘 알려져 있다. 사실상, 몇가지 예는 잘 특징화되어 있으며 현재 종양 특이적 요법에 관심이 집중된다. 종양 항원의 비제한적 예는 MUC-1과 같은 상기 뮤신 이외에, 암배아 항원 (CEA), 전립선 특이 항원 (PSA), 흑색종 항원 (MAGE, BAGE, GAGE)이다.

MUC-1 뮤신 항원은 많은 선암종에 대해 면역원을 발생시키는 잠재적인 면역요법 표적으로서 인식되어 왔다. 따라서, 본 발명의 한 실시태양은 본 발명의 방법에서의 APC의 표면 상의 I 류 및 II 류 중 어느 하나 또는 둘다에 결합할 수 있는 "MUC-1 유도체"의 용도에 관한 것이다. "MUC-1 유도체"는 일반적으로 펩티드 또는 펩티드를 기반으로 한 것이며, 그 예로는 제한되는 것은 아니지만 상기 인용된 MUC-1 펩티드가 있다. MUC-1 유도체는 MUC-1 단백질의 단편일 수 있다. 그러한 단편은 글리코실화되거나 비-글리코실화될 수 있다. 본 발명에 따라서, 본 발명의 범위내의 단편은 펩신 또는 파파인과 같은 프로테아제에 의한 분해를 포함하는 방법을 이용하여 재조합 DNA 방법에 의해 생산되는 MUC-1 또는 정제된 MUC-1로부터 얻을 수 있다. 물론, MUC-1 단편은 또한 재조합 방법에 의해 직접 제조될 수도 있다. 또한, 본 발명에 포함되는 MUC-1 단편은 어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems), 멀티플 펩티드 시스템스 (Multiple Peptide Systems) 및 기타 회사에 의해 상업적으로 공급되는 것과 같은 자동화 펩티드 합성기를 이용하여 합성되거나, 또는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 수동으로 생산될 수 있다 [Geysen et al., J. Immunol. Methods 102: 259 (1978) 참조]. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 추가의 MUC-1 유도체는 아그라월 등의 문헌 (상기 참조)에 기재되어 있다. 또한, 코어 서열의 하나 이상의 아미노산은 필수 T 세포-활성화 작용이 유지되도록, 바람직하게는 당업계에 공지된 보존적 방식으로 변화될 수 있다. 전형적인 치환은 다음 아미노산 기 중에서 이루어질 수 있다: (a) G, A, V, L 및 I; (b) G 및 P; (c) S, C, T, M; (d) F, Y 및 W; (e) H, K 및 R; 및 (f) D, E, N 및 Q. 일부 바람직한 치환은 다음 기 중에서 이루어질 수 있다: (i) S 및 T; (ii) P 및 G; 및 (iii) A, V, L 및 I.

상기한 바와 같이, 이들 바람직한 MUC-1 유도체는 당업계에 공지된 방법에 따라서 글리코실화 또는 부분 글리코실화될 수 있다. 또한, MUC-1 및 MUC-1 유도체가 폴리에틸렌 글리콜과 같은 고분자량 중합체로 변형될 수 있는 것으로 예측된다. 또한, 지질 변형은 유도체의 리포좀에 의한 캡슐화 또는 상호작용을 촉진시킬 수 있으므로 바람직하다. 이 목적에 유용한 예시적인 지질 변형은, 제한되는 것은 아니지만 팔미토일, 미리스토일, 스테아로일 및 데카노일기, 또는 더욱 일반적으로는 임의의 C₂ 내지 C₃₀ 포화, 단일불포화 또는 다중불포화 지방산 아실기를 포함한다. 또한, 본 발명에 사용하기에 적합한 MUC-1 유도체의 예는 비-펩티드 "모방체", 즉 MUC-1 단백질의 하나 이상의 기능적 특징을 모방하는 화합물이다. 모방체는 일반적으로 수용성이고, 단백질분해 내성이고 비면역원성이다. MUC-1을 모방하는 형태적으로 제한된, 환식 유기 펩티드는 예를 들어, 문헌 [Saragovi, et al., Science 253: 792 (1991)]에 공지된 방법에 따라서 생산될 수 있다. "MUC-1 탄수화물 유도체"도 예측된다. 본원에 사용된 그러한 유도체는 MUC-1 유도체의 면역자극 특징을 유지하는 당단백질이다. 그러한 탄수화물 유도체는 MUC-1 단백질에 부착된 탄수화물의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. MUC-1 탄수화물의 하나 이상의 성질을 모방하는 모방체가 사용될 수도 있다.

당업계의 숙련자는 다른 항원이 활성화 T-세포의 발생에 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 그러한 항원의 예는, 제한되는 것은 아니지만 비-자기 (이종) 펩티드 항원, 및 바이러스, 종양, 세균 또는 기타 기생충으로부터의 펩티드 항원을 포함한다.

b. 다른 유용한 항원의 동정

본 발명의 방법에 유용한 전체 항원들이 각종 T 세포 반응을 측정하기 위한 인식된 방법을 이용하여 동정될 수 있지만, 특별한 에피토프와 연관된 더욱 특이적인 반응을 발생시키는 것이 중요하다. 이 접근법은 훨씬 더 작은, 따라서 더욱 경제적으로 생산되는 항원성 자극의 사용을 가능하게 한다. 그러므로, 바람직한 항원은 소분자, 전형적으로는 약 100 아미노산 미만, 일반적으로 약 60 아미노산 미만 정도의 펩티드 또는 펩티드 유도체이다.

당업계에 공지된 방법에 따라서, 천연 (거대) 항원이 동정되면, 그의 항원성은 하나 또는 몇개의 특정 에피토프로 더 수정될 수 있다. 한가지 전통적인 방법은 거대 항원을 단백질분해 처리하여 더 작은 항원으로 유도하는 것을 포함한다. 또한, 단백질 항원의 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 생성되고 특별한 에피토프를 동정하도록 분석될 수 있다. 또한, 작은 펩티드는 시험관내 합성 방법에 의해 생성되고 분석될 수 있다. 무손상 항원의 일부분을 제조하고 그것을 분석하기 위한 임의의 접근법의 대안으로서, 더욱 생물학적 관련있는 접근법이 가능하다. 특별하게는, MHC I 류 및(또는) II 류 분자에 결합하는 항원성 단편이 특히 중요하므로, 한가지 예시적인 접근법은 MHC 분자 자체를 분리하고 그후에 그들과 관련된 펩티드를 분리하는 것이다. 일반적으로, 이 방법은 종양 항원의 특히 유용한 에피토프를 더 한정하기 위한 것이다.

전형적인 방법에서, 당해 항원을 발현하는 원발성 종양 세포 또는 세포주가 제공된다. 또한, 대식세포와 같은 포식 항원 제시 세포 (또는 임의의 APC)가 공급된 대형 항원 (또는 그의 일부)일 수 있고 이들 방법에 대한 출발 물질로서 작용한다는 것을 이해할 것이다. MHC I 류 또는 II 류 분자는 항체 친화력 (MHC-특이적 항체) 및 크로마토그래피 기술과 같은 공지된 방법을 이용하여 이들 출발 세포로부터 분리될 수 있다. 분리된 MHC 분자는 그후에 결합된 펩티드를 방출하도록 처리된다. 이는 결합된 펩티드와 MHC 분자 사이의 상호작용을 파괴하는 제제, 예를 들면 디터전트, 우레아, 염화 구아니디늄, 이가 양이온, 각종 염 및 극한 pH로 처리함으로써 이루어질 수도 있다. 방출된 펩티드는 통상의 크로마토그래피 및 항체 친화력 (항원 특이적 항체를 이용함) 방법을 이용하여 더 정제될 수 있다. 정제된 펩티드는 그후에 예를 들어 펩티드 서열화, 가스 크로마토그래피 및(또는) 질량 분광분석법을 이용하여 서열 및 구조 확인될 수 있다. 이러한 방식으로, I 류 및(또는) II 류 분자와 연관된 가장 일반적인 펩티드 에피토프의 서열/구조가 확인될 수 있다. 이 서열/구조 정보가 공급될 때, 확인된 서열의 순열이 상술한 바와 같이 만들어지고 공지된 T-세포 분석법을 이용하여 분석된다.

4. 세포 표지 및 영상술

본 발명에 따라서 임파구를 검출하는데 사용되는 표지는 포유동물 체내의 세포를 검출하기 위한 당업계에 공지된 임의의 표지일 수 있다. 편리하게는, 전형적으로 인듐 옥신 형태의 인듐-111이 당업계에 공지되고 본원에 인용된 문헌에 기재된 통상의 방법을 이용하여 임파구를 직접 표지하는데 사용된다. 그러나, 포유동물 체내의 세포를 영상화하기 위한 다양한 다른 방사성표지를 기반으로 하는 방법이 또한 사용될 수 있으며, 그 예로는 앤더스 (Anders, G.T.) 등 (상기 참조)에 의해 개시된 바와 같은 SPECT를 통한 갈륨-67 검출, 코프 (Korf, J.) 등 (상기 참조)에 의해 개시된 바와 같은 PET 또는 SPECT를 이용한 이가 코발트 검출, 또는 램버트 (Lambert) 등 (상기 참조)에 의해 교시된 바와 같이, 세포막을, 예를 들면 요오드의 방사성 동위원소, 즉 ¹²³I, ¹²⁵I 또는 ¹³¹I로 방사성표지하기 위한 (아미노스티릴)피리디늄 화합물; 또는 폴리카르복실산에 의해 킬레이트화된, ¹¹¹In 또는 ^99mTc와 같은 금속 방사성 동위원소 1 당량을 포함하는 킬레이트기가 있다.

별법으로, 본 발명의 방법에 사용되는 활성화 T 세포는 루빈 등 (상기 참조)에 의해 교시된 바와 같이, 활성화 T 세포에 특이적으로 결합하는 표지된 리간드를 사용하여 간접적으로 표지될 수 있으며, 여기서는 임파구와 특이적으로 상호작용할 수 있는 표지된 리간드를 포유동물에 투여하여 표지된 리간드가 임파구와 생체내 상호작용하도록 하여 표지된 임파구를 형성하거나, 또는 표지된 리간드를 임파구와 시험관내 접촉시키고 형성된 표지된 임파구를 포유동물에 투여한다. 표지된 리간드 내의 표지는, 예를 들면 감마 방출체, 예를 들면, 인듐-111, 테크네튬-99m, 테크네튬-99 또는 요오드-123, 양전자 방출체, 예를 들면 불소-18, 탄소-11 또는 요오드-124, 자성체, 예를 들면 가돌리늄, 초상자성 물질, 또는 수화된 철 산화물 입자, 또는 밀도 기초의 조영제일 수 있다.

체내의 표지된 임파구의 분포는 영상술에 의해 확인된다. 영상술이란 비침습적 수단에 의해 체내의 표지 분포를 탐지하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법에 사용되는 영상술은, 물론 표지의 성질에 따라서 방사선영상술, 자기 공명 영상술, 양전자 방출 단층촬영 영상술 및 X-선 전산화 단층촬영 영상술로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한, 영상술은 단일 스캔 또는 연속 스캔으로 이루어질 수 있으며, 포유동물의 전신 또는 국부 스캔일 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 방법에 사용된 영상술은 포유동물의 전신 스캔, 특히 ¹¹¹In-표지된 임파구의 SPECT 영상술을 포함한다.

바람직하게는, 포유동물에 투여된 표지된 임파구의 투여량은 적절한 양의 방사활성이 투여되도록 하는 약 50 내지 약 75 ㎤의 피검자의 전혈에 존재하는 임파구의 양과 거의 등가이다. 방사활성의 양은 사용된 동위원소에 좌우되며 과도한 시험없이 당업계의 숙련자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 약 1.5 내지 약 3.0 mCi/인듐-111 투여량, 약 10 내지 약 30 mCi/테크네튬-99 투여량, 약 5 내지 약 10 mCi/요오드-123 투여량, 약 5 내지 약 10 mCi/요오드-124 투여량, 약 10 내지 약 20 mCi/불소-18 투여량 및 약 20 내지 약 30 mCi/탄소-11 투여량을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다. 특정 실시태양에서, 표지된 임파구의 다중 투여가 실시될 수 있다.

일부 실시태양에서, 영상술은 2가지 이상의 별도의 스캔을 포함하며, 각각의 별도의 스캔은 방사선영상술, 자기 공명 영상술 (MRI), 양전자 방출 단층촬영 (PET) 및 X-선 전산화 단층촬영 (CT) 영상술로 이루어진 군에서 선택된다. 유리하게는, 그러한 실시태양에서 2가지 이상의 별도의 스캔으로부터 얻은 영상 데이타는 예를 들어, 다중 스캔으로부터의 데이타를 단일 표시 영상으로 융합하는 방법에 의해 비교된다. 예를 들면, 1988년 4월 5일에 골든버그에게 허여된 미국 특허 제4,735,210호는 임파관조영 및 기관 영상화 방법 및 키트, 특히 특정 항체 영상화제로 형성된 포지티브 상에서 육안 영상화제를 사용하여 형성된 네가티브 상을 제외하는 것을 포함하는 임파관섬광조영 또는 자기 공명 임파관조영을 위한 개선된 방법을 개시하고 있다.

더욱 최근에는, 2002년 12월 3일에 타운센드 등에게 허여된 미국 특허 제6,490,476호는 통합된 PET 및 X-선 CT 단층촬영, 및 단일 장치에서 CT 및 PET 영상을 연속적으로 획득하여 내부 기관 이동, 스캐너 침대 단면의 변화 및 스캔하기 위한 환자의 위치잡기로 인한 정렬 문제를 극복하기 위해 상기한 바를 사용하는 방법을 교시하고 있다. 단층촬영은 외부 마커 또는 내부 랜드마크를 사용하지 않고, 정확하게 상관기록되는 기능적 및 해부학적 영상을 얻는다.

표지된 임파구 투여 후의 스캔 시기는 수분, 수시간, 수일, 수주 또는 수개월일 수 있다. 특별한 시기는 예를 들면, 표지 유형, 표지 양, 임파구 거동 및 질환 상태를 비롯한 많은 인자에 좌우된다. 시기는 그러한 인자와 단지 일상적인 실험을 이용하여 당업계의 숙련자에 의해 결정될 수 있다.

5. 본 발명의 방법의 응용예

상기한 특별한 응용예를 제외하고, 본 발명의 방법은 포유동물에서의 질병의 진행 정도를 진단하는데 이용될 수 있으며, 여기서 질병의 진행은 세포- 또는 병원균-특이적 항원 분포의 변화에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 질병은 바이러스 감염, 예를 들면 HIV 감염, 또는 기타 감염성 질환, 자기면역 질환, 예를 들면 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 전신성 홍반성 루푸스, 또는 건선, 또는 악성종양, 예를 들면 골수종, 임파종, 백혈병 또는 상기한 종양을 포함한 고형 종양일 수 있다. 그러한 질병에서 발현되는 관련된 세포- 또는 병원균-특이적 항원의 면역원성 펩티드 에피토프에 의해 활성화될 수 있는 임파구를 가진 포유동물에 사용될 수 있는 방법이 제공된다. 표지된 임파구의 분포 또는 수송 패턴은 질병의 진행 정도를 진단하기 위해, 다른 시간에 동일한 포유동물에서 또는 질병을 앓지 않는 다른 포유동물에서 발생된 표준 패턴과 비교된다. 본 발명은 본 방법의 활성화 T 임파구를 이용하는 입양 면역요법을 비롯한 면역조절 요법이 적합한 질병에 특히 유용하다.

본 발명의 다른 면은 질병을 가진 포유동물에서 요법에 대한 반응을 모니터하는 방법이다. 치료 단계에 대한 포유동물의 반응은 영상술에 의해 요법이 활성화 항원 특이적 임파구의 분포 또는 수송 패턴을 변화시키는지를 확인함으로써 모니터된다.

본 발명의 또다른 면은 영상술에 의해 제제가 활성화 항원 특이적 임파구의 분포 또는 수송 패턴을 변화시키는지를 확인하여, 질병, 예를 들면 HIV 감염, 자기면역 질환, 감염성 질환 또는 악성종양을 가진 포유동물을 치료하는데 유용한 제제를 확인하는 방법이다.

실시예 1

활성화된 T 임파구의 활성화 및 수확을 위한 임상 과정

CTL 발생 표준 조작 과정

0일째: 환자의 부분절제 백과 명찰 라벨을 커피 블러드 센터 (Coffee Blood Center)로부터 입수하여 밀봉된 튜브에 시료를 보관하였다. 이를 스냅-캡 바이알에 넣어 CBC (전혈 계수)용 HCC로 정하였다. 부분절제 백의 용량을 표시해 놓았다. 환자 라벨을 배양 백에 부착하고 시험 #-환자#-부분절제 4 라벨을 붙였다. 별도의 환자 기록장은 1차 부분절제로 시작하였다. 이 실험에서 행해진 모든 적절한 데이타, 정보 및 결과를 이 기록장에 기록하였다.

충분한 양의 AIM-V 배지를 37 ℃, 2 내지 3 리터 수조에서 가온시켰다. 오틸리 프레쉬 (Otily fresh) 1호 미개봉 병을 사용하였다. 일단 개봉한 병은 그 환자용으로만 지정하였다. 부분절제 백으로부터 부분절제물을 회수하는데 있어서의 편의를 위하여, 일정 용량의 부분절제 백으로부터 1000 ㎖를 빼고 상기 용적의 AIM-V를 배양 백으로 옮겼다.

루어-락 (luer-lock) 60 ㎖ 주입기를 배양 백의 적절한 포트에 부착하여 AIM-V 배지를 배양 백으로 옮겼다. 다른 포트는 모두 밀폐시켰다. 이어서 이송 관류를 사용하여 부분절제 백을 배양 백으로 옮겨 비운 다음, 부분절제 백과 배양 백에 구멍을 뚫었다. SEBRA 가열 밀봉기를 사용하여, 배양 백에 밀착되어 있는 관류를 4차례 밀봉시켰다. 상기 관류는 배양 백으로부터 3차 밀봉내에 절단하였다.

세포수/㎖의 수로서 CRC로부터의 WBC 계수량을 사용하고 부분절제 백의 용적을 곱해, 부분절제 백 내 (세포의 총수)를 결정하였다. 이 수를 1000 ㎖로 나누어 (배양 백 중 세포 농도)를 구하였다. 배양 백의 최대 용적은 2000 ㎖이다. 세포가 2x10^{^} 세포수/㎖에서 시작되기 때문에, 필요한 세포의 최대수는 4000x10 (4x10^{^}09)이다. 배양 백 중 세포의 총수가 4x10⁹를 넘지 않을 경우, 세포가 회수되지 않았다. 세포의 총수가 4x10⁹를 넘을 경우, 적절한 용적이 회수되었다. (회수될 백 중 세포의 총수# - 4x10⁹개의 세포)를 (배양 백 중 세포 농도)로 나누어 배수시킬 용적을 결정하였다.

초기에 세포를 회수할 필요가 없는 경우:

60 ㎖ 루어 락 주입기를 갖춘 배양 백에 AM 배지를 가하고, 이의 플런저를 제거하였다가 약하게 되돌려 놓은 다음, 적절한 백 포트에 부착시켰다. 1 ℓ 이상을 가할 경우, 흘리지 않도록 주의하면서 병내 AIM-V을 모두 주입기 (이제 깔대기로 작용함)에 쏟아 부을 수 있다. 1 ℓ 미만을 가할 경우, 멸균시켜 각각 랩으로 감싼 50 ㎖ 피펫을 사용하여 병으로부터 배지를 주입기/깔대기로 옮길 수 있다. 배양 백을 전후 좌우로 가볍게 주기적으로 흔들어 내용물을 혼합하였다.

초기에 세포를 회수할 필요가 있는 경우:

루어 락 60 ㎖ 주입기를 적절한 포트에 부착시키고, 주입기에 플런저를 장착하였다. 배양 백을 전후 좌우로 가볍게 흔들어 내용물을 혼합하였다. 주입기 플런저를 잡아당겨 세포 현탁액을 주입기로 빼내고 다시 아래로 밀어 세포를 혼합하였다. 이를 1 내지 2회 반복하여 주입기에서 적당히 혼합하였다. 2차 또는 3차 해동후 액체 수준이 주입기의 45 nil 표시에 오도록 하였다. 주입기로부터 상기 포트를 제거하고, 백 위로 올려 밀폐시켰다. 주입기 내 현탁액을 50 ㎖ 튜브에 넣어 밀폐시켰다. 배양 백 포트를 주입기에 다시 부착시키고 요구되는 양이 배출될 때까지 상기 공정을 반복하였다. 필요한 50 ㎖형 튜브의 수는 배출시킬 용적에 따른다. 이들 세포를 추가 실험을 위하여 추가의 배양 백용의 바이알 또는 벌크 형태로 냉동시켰다.

이때 시료는 반드시 배양 백으로부터 회수하여 0일째 세포 시료와 상등액을 수거하고, 이후 세포독성 및 사이토킨 검정에 사용하였다. 통상적으로, 40x10⁶ 세포를 회수하였다. 2x10⁶ 세포/㎖의 경우, 대략 20 ㎖이다. 이 시료를 동일한 방법으로 회수할 수 있으며, 과량의 세포를 제거함에 따라, 백을 부드럽게 흔들어 혼합하는 단계를 포함하였다. 60 ㎖ 주입기 대신 30 ㎖ 주입기를 사용할 수 있다. 회수한 세포를 50 ㎖ 튜브에 넣었다. 이를 10분간 400 g (1200 rpm)으로 회전시켰다. 상등액 6 ㎖를 취하여 1 ㎖ 멸균 표지된 바이알에 분취하여 -20 ℃에서 냉동시켰다. 나머지 상등액은 버린다. 세포를 4 ㎖ 냉동 배지 (태소 혈청 + 10％ 디메틸술폭시드)에 10x10⁶ 세포/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 1 ㎖씩 분취하여 3개의 멸균 표지된 동결바이알에 넣었다. 동결 배지 1 ㎖를 나머지 1 ㎖ 세포 현탁액에 가하여 농도가 5x10⁶ 세포/㎖가 되도록 하고, 1 ㎖를 분취하여 2개의 멸균 표지된 동결바이알에 넣었다. 스티로폼 선반이 있는 스티로폼 박스는 항상 -85 ℃로 냉동기에 보관하였다. 동결바이알은 다음날 이들을 -135 ℃ 냉동기에 넣을 때까지 모두 상기 용기에 넣었다. 이들 바이알의 위치 (냉동기 선반, 박스 및 지점)는 시험 #-환자#-부분절제#, 날짜, 배양일, 세포#, 용적 및 캡 색상 (필요에 따라)이 기록되어 있는 3x5 카드상에 기재하였다. 이들 카드는 임상 시험 목록 박스에 보관하였다.

이제, '뮤신' 펩티드와 인터류킨-2 (IL-2)를 상기 백에 가한다: 첨가되는 양은 둘 다 백의 용적에 따르기 때문에, 배출되거나 첨가되는 ㎖의 수는 환자 기록장에 주의하여 기록하였다. 백 중 '뮤신' 농도는 1 ㎍/nil이다. '뮤신'의 저장 용액을 1 ㎍/㎕로 만들어 백에 첨가되는 ㎕의 양이 백 중 ㎖의 숫자와 대등하도록 하였다. 백내 1-2 사이토킨 농도는 100 IU/㎖이다. IL-2 저장 용액의 농도는 변할 수 있기 때문에, 요구되는 IU의 총수는 백의 용적 (㎖)에 100 IU/㎖를 곱하여 결정하여야 한다. 이어서 IU 총수를 저장 용액 농도로 나누어 필요한 ㎕ 수를 얻었다. 이들은 둘 다 깔대기로서 작용하는 주입기가 장착되어 있는 동일한 장비를 사용하여 가할 수 있다. 3.5 또는 10 ㎖ 주입기를 사용할 수 있다. 백 포트를 부착하기 전에 플런저를 제거하고 별도의 멸균하여, 개별적으로 랩으로 감싼 마이크로 피펫 팁을 사용하여 가능한 한 주입기와 멀리 떨어져서 아래로 '뮤신'과 IL-2를 가하였다. 신선한 AIM-V 배지 2 ㎖를 사용하여 주입기와 백 관류를 세정하였다. 상기 2 ㎖는 백의 총용적에 부가되었다.

미리, 백을 옆으로, 앞뒤로 부드럽게 흔들어 혼합할 수 있다. 이후 5％ CO₂가 포함되어 있는 37 ℃ 배양기에 놓았다.

3일째: 시료를 백으로부터 배출시키기 전에 백을 부드럽게 흔들어 혼합시켜야 한다. 10 ㎖ 주입기를 사용하여, 회수하고 다시 넣는 과정을 수회 반복한 후 주입기의 수준이 1 ㎖ 표시에 오도록 하였다. 포트를 위로 올려 밀폐시킨 후, 상기 시료를 비멸균 바이알에 넣어 CBC용으로 정한 다음 폐기시킬 수 있다. 농도가 2x10⁶ 세포/㎖ 이상인 경우, 배지를 가하여 농도를 희석시켰다. 이어서 40x10⁶ 세포를 회수하여 0일째에서와 같이, 이후의 검정을 위하여 동결시켰다. 상등액 6 ㎖를 1 ㎖/바이알씩 분취하여, 0일째에서와 같이 -20 ℃로 동결시켰다. 첨가되거나 제거되는 용적은 기록하여야 한다. 상기에서와 동일한 방법으로 IL-2를 가하여, 필요한 전체 IU를 측정하고 저장 용액 농도로 나눈다.

7일째: 백으로부터 3일째에서와 같이 CRC용으로 1 ㎖를 빼낸다. 세포 농도를 측정하고 배지를 가하였다. 이날 멸균 시료 (13 ㎖)를 회수하였다. '뮤신' 펩티드와 IL-2를 0일째에서와 같이 가하는데, 백 용적을 더하거나 뺀다.

멸균: 13 ㎖를 두 부분, 8 ㎖와 5 ㎖로 나눈다. 5 ㎖ 분취량의 세포와 상등액을 마이크로 테스트, 인크. (Micro Test, Inc) M4-RT 튜브 (Multi Micro Media)에 넣었다. 시험#-환자#-부분절제#와 날짜를 표시하였다. 이를 생물학적 위험 백의 지퍼 주머니에 넣고 황색 양식은 뒤편 주머니에 넣었다. 이 백을 HCC로 정하고 급사에게 PCR 마이코플라즈마 (mycoplasma) 시험용 특수 랩으로 밤새 송달하도록 지시하였다. 결과를 환자 기록장에 기록하였다.

8 ㎖의 분취량은 10분간 400 g (1200 rpm)으로 회전시켰다. 상등액을 시험#-환자#-부분절제# 라벨이 붙여있는 멸균 튜브에 넣었다. 2 ㎖를 별도의 멸균 튜브 (HARDY Diagnostics TSB 및 Fluid Thioglycollate 튜브)로 회수하였다. 튜브중 나머지 양은 스티로폼 박스에 냉각 팩과 함께 넣었다. 필요한 양식을 복사하여, 플라스틱 지퍼백에 넣고 시료와 함께 밀봉하였다. 박스를 밤새 LAL 시험에 의한 내독소 수준을 위하여 에어본 (Airbourne)을 통하여 바이오위태커사 (Biowhittaker)로 보내었다. 결과를 환자의 기록장에 기록하였다.

상등액 중 2 ㎖를 미리 회수하여, 1 ㎖를 TSB 및 티오글리콜레이트 액 튜브 라벨을 붙인 각각의 튜브에 혐기적으로 접종하였다. 이는 시료가 충전되어 있는 1 ㎖ 피펫을 각 튜브의 바닥에 부드럽게 놓음으로써 이루어진다. 피펫 내의 시료를 튜브의 바닥에 가라앉도록 서서히 밀어내었다. 피펫을 주의하면서 빼내어 유체중에 기포가 생기지 않도록 하고 튜브를 단단하게 밀폐시켰다. 각 종류의 미접종 튜브 또한 다른 튜브와 같이 라벨을 붙였다. 이어서 티오글리콜레이트 액 튜브를 34 ℃ 배양기에 넣고 캡을 느슨하게 풀어주었다. TSB 튜브는 실온의 캐비넷에 놓았다. 이 튜브는 배양 3일, 7일 및 14일 후 체크하였다. 혼탁도 사인은 세균 생육을 나타낸다. 결과를 환자의 기록장에 기록하였다.

8일째: 백을 혼합한 후, 충분한 용적을 배출시켜 0일째에서와 같이 세포독성 및 사이토킨 검정, 뿐만 아니라 동결 시료 (40x10⁶)에 충분한 양의 세포와 상등액을 회수하였다. 1 ㎖를 또한 멸균 튜브 중에 회수하여 환자 라벨로 확인된, 그램 염색법 (Gram Stain)용 BSA로 정하였다. 전날 (7일째)의 세포 계수량을 사용하여 세포의 총수와 배출시키는데 필요한 용적을 결정하였다. XTT 및 알마르 블루 (Almar Blue) 세포독성 검정에 통상적으로 1x10⁶ 세포가 필요하다. 세포를 400 g (1200 rpm)으로 10분간 원심분리시키고 상등액을 6 ㎖ 이상 분취하여 1 ㎖/바이알 씩 6개의 바이알에 넣었다. 세포독성 검정은 가능한 한 일찍 시작하였다 (XTT 및 Alamar Blue 공법 참조). 사이토킨 검정 (통상적으로 g-IFN 및 IL-10)은 가능한 한 빨리 시작하였다 (사이토킨 공법 참조). 사이토킨 검정으로부터의 결과는 6시간내에 입수하여 주입 기준을 정하여야 한다.

주입 기준: 사이토킨 검정 중 0일째 시료에서 8일째에 걸쳐 통계학적으로 유의적인 증가는 CTL 생산에 대한 충분한 증거가 되며 주입은 그램 염색법 결과가 네가티브인 한 계속 지속할 수 있다. 사이토킨 검정에서 통계학적으로 유의적인 증가가 없을 경우 XTT 결과가 다음날 집계될 때 까지 주입을 지연하였다. 자문/승인을 위하여 검정 데이타를 스테펜 라이트 (Stephen Wright) 박사에게 제공하였다. 낸시 블레이즈 (Nancy Blades)는 ASAP와 접촉하여 주입 시기를 결정하였다. 세포를 수확하고 제조하는데는 (Harvest Procedure 참조) 2 내지 3시간이 소요되었다.

CTL 수확 표준 조작 과정

일단 수확이 시작되면, 한 인간이 연구소에 내내 남아 있어야 할 것이다.

1) 수확 양식 (Harvest form)에 모든 용액의 로트 번호와 유효 기간을 기록한다. 별도의 명시가 없는 한, 모든 실험 절차는 청정 공기 후드 중에서 수행될 것이다. 사용된 모든 비품들은 생물학적 유해 폐기물로 폐기될 것이다.

2) 지지 클램프에 5 ㎖ 주입기를 위치시킨다. 배양 백을 배양기에서 꺼내고 그 백을 전후 좌우로 가볍게 흔들어 주어 혼합되도록 한다. 백 포트/캡을 알콜 약솜으로 소독한다. 캡을 제거하여 알콜 약솜 위에 놓아두고 포트를 주입기에 연결한다. 관류 클램프를 풀고 관류를 조작하여 클램프에 의한 죄임을 완화시킨다.

a) 플런저를 주입기 총 용적 만큼 서서히 끌어당김으로써 세포 현탁액을 주입기 내로 끌어 들인다. 플런저를 서서히 내리 눌러 현탁액을 백으로 되돌린다. 2회 반복한다.

b) 플런저를 다시 가볍게 끌어 올려 2 ㎖ 표시선까지 내려오게 한다.

c) 주입기에서 분리시키고 포트를 들어올려 액체를 백으로 역 유동시킨 다음, 포트에 캡을 다시 씌운다. 관류 클램프를 조인다.

d) 주입기 중 시료 1 ㎖를 무균 바이알에 분배하여 그램 염색 (Gram Stain)용으로 비에스에이 미생물 연구소 (BSA Microbiology Laboratory)로 보낸다. 세포를 환자에게 다시 제공할 수 있기 전, 휴대용 무선 호출기를 통해 그램 염색으로부터 "미생물 미검출"이라는 결과를 받아야 한다. 이 전달 사항은 양쪽 전문가에 의해 전달 및 이해될 것이고 수확 양식 상에 기록될 것이다.

e) 잔여 시료 1 ㎖를 미량 원심 분리관에 배치시켜 CBC용으로 해링톤 암 센터 연구소 (Harrington Cancer Center Laboratory)로 보낸다.

f) 지지 클램프에서 5 ㎖ 주입기를 제거하여 이를 폐기물로 처리한다.

3) 수확될 세포의 수는 환자 체 표면적에 의해 결정된다: 1-4 x 10⁸ 세포수/m². 필요한 수의 세포를 하기 방법에 의해 백으로부터 취한다.

a) 백으로부터 취해질 용적을 결정한다. [필요한 세포수를 (CBC로부터 얻은) 백 중에서의 ㎖ 당 세포수로 나눈 수치]

b) 이전과 같이, 60 ㎖ 주입기를 지지 클램프에 위치시키고, 백을 가볍게 혼합시키고 낮은 선반 또는 박스를 사용하여 지지시키며 라벨을 붙인다.

c) 백 캡/포트를 알콜 약솜으로 소독한다. 캡을 제거하고 종전과 같이 포트를 주입기에 부착시킨다. 관류 클램프를 풀고 관류를 조작하여 죄임을 완화시킨다. 매번 관류의 다른 부분에서 클램프를 조여줌으로써 관류가 제 위치를 잡도록 한다.

d) 종전과 같이 세포 현탁액을 주입기 내로 끌어 들이되, 이를 3회 반복한다. 최종 시간을 작성하고 45 ㎖ 표시선까지 끌어 내린다.

e) 백 포트를 분리시키고 들어 올려서 캡을 씌운다. 관류 클램프를 밀폐시킨다.

f) 세포 현탁액을 50 ㎖ 무균 튜브 내에 배치시키고 튜브에 캡을 편안하게 씌운다.

g) 적절한 양의 세포 현탁액을 뽑아내기에 필요한 만큼 단계 "c)"에서부터 반복한다.

4) 배양 백을 배양기로 되돌려 보낸다.

5) 원심분리기 홀더 내의 모든 튜브를 균형 유지시킨다. 필요에 따라, 균형 유지용 튜브를 사용한다. 1,200 rpm (400 x g)에서 11분 동안 회전시킨다. 제동 장치가 작동한다.

6) 세포가 원심 분리되는 동안:

a) 25％ (v/v) 알부민 25 ㎖를 주입기/니들을 사용하여 주입 백에 담는데, 이때 모든 접속 단계 전후 알콜로 소독한다.

b) 0.9％ NaCl 약 250 ㎖를 주입기/니들 또는 "관류" 세트를 사용하여 무균 병 또는 플라스크에 담는데, 이때 모든 접속 단계 전후 알콜로 소독한다. NaCl 50 ㎖를 주입기/니들을 사용하여 주입백에 담는데, 이때 모든 접속 단계 전후 알콜로 소독한다.

7) 원심 분리기를 정지시킨 후, 캐리어로부터 튜브를 조심스럽게 꺼내어 후드로 돌려 보낸다.

8) 진공/흡입 계를 사용하여 상등액을 흡입시킨다. 진공 플라스크는 그 중에 "표백제 (Bleach)" 100 ㎖를 함유할 것이다.

a) 무균 유리 파스퇴르 (Pasteur) 피펫을 흡입 플라스크 관류에 부착시킨다.

b) 펠릿이 연질이기 때문에 주의를 요한다. 튜브를 바로 세워 유지시키고 상등액을 튜브 내 원추로 뽑아 내려 바닥에 수 ㎖가 남도록 한다.

c) 모든 튜브를 흡입시킨 후, 별도의 소형 플라스크로부터 표백제를 피펫 내로 흡입시켜 피펫 및 관류를 세정한다

9) 각각의 튜브는 세포 펠릿을 포함하며, 이들 펠릿 모두는 하나로 합해져야 한다.

a) AIM-V 배지 25 ㎖를 제1 튜브에 첨가하고 펠릿 상단으로 배지를 방출시킴으로써 펠릿을 온화하게 재현탁시킨다. 모든 배지가 배출된 후, 이를 피펫내로 끌어 올리고 다시 방출시킨다. 펠릿이 완전히 산산이 부수어질 때 까지 반복한다.

b) 세포 펠릿이 부수어지면, 세포 현탁액 25 ㎖를 뽑아 올리고 이를 다음 튜브에 첨가한다. 모든 튜브에 대해 동일 세포 현탁액 25 ㎖를 사용하여 재현탁 공정을 반복한다.

c) 신선한 AIM-V 배지 10 ㎖를 사용하여 모든 튜브를 세정하고 이 세척액을 이전의 세포 현탁액 25 ㎖에 첨가한다.

10) 튜브를 균형 유지시키고 1,200 rpm (400 x g)에서 11분 동안 원심분리시킨다. 제동 장치가 작동한다.

11) 원심 분리기가 정지되면, 상등액을 흡입시킨다.

12) 염수 25 ㎖ 중 세포 펠릿을 재현탁시킴으로써 세포를 0.9％ NaCl 중에서 한번 세척한다.

13) 튜브를 균형 유지시키고 1,200 rpm (400 x g)에서 11분 동안 원심분리시킨다. 제동 장치가 작동한다.

14) 상등액을 흡입시킨다. 0.9％ NaCl 25 ㎖ 중에서 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 이 세포 현탁액을 30 ㎖ 주입기/니들 내로 뽑아 올려 주입 백 내로 주입시키데, 이때 모든 접속 단계 전후 알콜을 사용하여 소독한다.

15) 0.9％ NaCl 25 ㎖를 튜브에 더 첨가하여 측면 및 바닥을 세정한다. 일단 튜브가 세정되면, 30 ㎖ 주입기/니들을 사용하여 세척액을 빼내고 주입 백으로 주입시키는데, 이때 모든 접속 단계 전후 알콜을 사용하여 소독한다.

16) 주입 백을 상하로 흔들어 주입 백 중 내용물을 가볍게 혼합시킨다.

17) 환자의 성명, 세포 수, 백 내의 액체의 양, 및 프로토콜-환자 및 부분절제 번호를 기입한 라벨을 부착시킨다.

18) 그 다음 주입 백을 헤링톤 암 센터로 보내어 해당 환자 담당 간호사에게 제공한다. 전문가 및 간호사 양측 모두 추적 양식 (Tracking Form)에 서명할 것이다. 사본은 낸시 블레이즈에게 제공될 것이며, 정본은 환자의 연구소 기록장에 자리할 것이다.

명세서에 언급된 모든 공보, 특허, 특허 출원, 및 기타 서류는 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가들의 수준을 나타낸다. 개개의 공보, 특허, 특허 출원 또는 기타 서류는 전체적으로 참조 문헌으로서 본원에 구체적으로 및 개별적으로 여러 목적을 위해 인용되도록 나타내어지는 것과 동일한 정도로, 모든 공보, 특허, 특허 출원, 및 기타 서류는 본원에 전체적으로 참조문헌으로서 여러 목적을 위해 인용되어 있다. 부제는 단지 서류의 검토를 용이하게 할 목적으로 포함되어 있으며 서류의 내용을 어떠한 방식으로든 제한하고자 의도하는 것이 아니다.

전술한 발명이 이해를 명료하게 할 목적으로 예시 및 실시예라는 방식으로 어느 정도 상세히 기술되어 있긴 하지만, 첨부된 특허 청구의 범위의 범주내에서 특정한 변형 및 수정이 행해질 수 있다는 사실이 명백할 것이다.

본 출원은 여러 목적을 위해 전체 개시내용이 본원에 도입되는, 2002년 10월 10일자로 출원된 미국 가출원 제60/417,303호를 우선권으로 주장한다.

<110> DEPARTMENT OF VETERANS AFFAIRS, ... <120> DETECTION, LOCALIZATION AND STAGING OF TUMORS USING LABELED ACTIVATED LYMPHOCYTES DIRECTED TO A TUMOR-SPECIFIC EPITOPE <130> V029 1030.1P <140> PCT/US 03/32602 <141> 2003-10-10 <160> 4 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Asp Thr Arg Pro 1 5 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 1 5 10 15 Arg Pro Ala Pro 20 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Believed to be based on MUC-1 sequence of Homo Sapiens; see U. S. Patent No. 6,600,012 <400> 3 Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg 1 5 10 15 Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro 20 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr 1 5 10

Claims (28)

1. (a) 포유동물로부터 말초 혈액 단핵 세포를 얻는 단계;

   (b) 상기 말초 혈액 단핵 세포 내의 T 임파구가 항원 특이적 활성화되는 조건 하에 상기 말초 혈액 단핵 세포를 세포 특이적 항원의 면역원성 에피토프를 나타내는 펩티드에 노출시킴으로써 상기 세포 특이적 항원에 결합하는 항원 특이적 T 임파구를 생산하는 단계;

   (c) 영상술에 의해 검출가능한 표지로 상기 항원 특이적 T 임파구를 표지함으로써 표지된 항원 특이적 T 임파구를 생산하는 단계;

   (d) 상기 표지된 항원 특이적 T 임파구를 상기 포유동물에 투여하는 단계; 및

   (e) 상기 포유동물 내의 상기 표지된 항원 특이적 T 임파구의 분포를 영상술로 결정함으로써 포유동물 내의 상기 세포 특이적 항원을 검출하고 위치결정하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 세포 특이적 항원을 검출하고 위치결정하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 인터류킨-2 (IL-2)의 존재하에 상기 말초 혈액 단핵 세포를 상기 펩티드에 노출시키는 단계 (b)를 수행하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 표지된 항원 특이적 T 임파구를 상기 포유동물에 투여하는 단계 (d) 전에 상기 말초 혈액 단핵 세포에 추가의 세포를 첨가하지 않고 상기 말초 혈액 단핵 세포에 상기 펩티드의 무세포(cell-free) 제제를 첨가함으로써 상기 말초 혈액 단핵 세포를 상기 펩티드에 노출시키는 단계 (b)를 수행하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 항원 특이적 T 임파구가 상기 세포 특이적 항원을 발현하는 세포에 대해 세포용해성인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 항원 특이적 T 임파구가 CD4+ 임파구를 포함하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 항원 특이적 T 임파구가 CD8+ 임파구를 포함하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 항원 특이적 T 임파구가 CD45RO+ 메모리 T 세포를 포함하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 항원 특이적 T 임파구가 미미한 양의 자연 살해 (NK) 세포를 포함하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 내의 상기 표지된 항원 특이적 T 임파구의 분포를 결정하는 단계 (e)를 수행하기 전에 상기 T 임파구 투여와 함께 또는 투여 후에 IL-2를 상기 포유동물에 투여하지 않고 상기 표지된 항원 특이적 T 임파구를 상기 포유동물에 투여하는 단계 (d)를 수행하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 표지된 항원 특이적 T 임파구를 상기 포유동물에 투여하는 단계 (d)가 상기 임파구를 복강내로 투여하는 것을 포함하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 표지된 항원 특이적 T 임파구를 상기 포유동물에 투여하는 단계 (d)가 상기 임파구를 정맥내로 투여하는 것을 포함하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 임파구의 정맥내 투여가 상기 포유동물에 당접합체(glycoconjugate)를 투여하는 것을 포함하여, 상기 포유동물에 상기 당접합체를 투여하지 않고 상기 임파구를 투여하는 경우에 비해 상기 임파구의 수송이 변경되는 방법.
13. 제11항에 있어서, 당접합체 투여를 포함하는 당접합체 투여가 아시알로오로소뮤코이드(asialoorosomucoid) 투여를 포함하는 방법.
14. 제11항에 있어서, 당접합체 투여를 포함하는 당접합체 투여가 오로소뮤코이드(orosomucoid) 투여를 포함하는 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 세포 특이적 항원이 종양 특이적 항원인 방법.
16. 제10항에 있어서, 상기 펩티드가 인간 뮤신1 (MUC-1)의 에피토프를 나타내는 방법.
17. 제11항에 있어서, 상기 항원 특이적 T 임파구가, 상기 MUC-1 에피토프를 갖는 세포에 대해 MHC 비제한된 세포독성을 나타내는 CD4+ 임파구를 포함하는 방법.
18. 제12항에 있어서, 상기 펩티드가, 서열 PDTRP를 포함하는 MUC-1 서열의 원순열(circular permutation)인 아미노산 서열을 포함하는 MUC-1의 에피토프를 나타내는 방법.
19. 제13항에 있어서, 상기 펩티드가 아미노산 서열 GSTAPPAHGVTSAPDTRPAP를 갖는 방법.
20. 제1항에 있어서, 상기 표지가 감마 방출체, 양전자 방출체, 자성체, 밀도 기초의 조영제 및 그의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 표지가 인듐-111, 테크네튬-99m, 테크네튬-99, 요오드-123 및 그의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 감마 방출체인 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 표지가 인듐-111인 방법.
23. 제1항에 있어서, 상기 영상술이 방사선영상술, 자기 공명 영상술, 양전자 방출 단층촬영 영상술 및 X-선 전산화 단층촬영 영상술로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 영상술이 단일 스캔 및 연속 스캔으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
25. 제23항에 있어서, 상기 영상술이 상기 포유동물의 전신 스캔을 포함하는 방법.
26. 제23항에 있어서, 상기 영상술이 2가지 이상의 별도의 스캔을 포함하며 상기 별도의 스캔 각각이 양전자 방출 단층촬영 영상술 및 X-선 전산화 단층촬영 영상술로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
27. 제26항에 있어서, 2가지 이상의 별도의 스캔으로부터 얻은 영상 데이타를 비교하는 방법.
28. 제26항에 있어서, 2가지 이상의 별도의 스캔으로부터 얻은 영상 데이타를 단일 표시 영상으로 융합하는 방법.