KR20050038205A

KR20050038205A - 포피로모나스 진지발리스의 세포결합을 저해하는인삼뿌리에서 분리된 산성다당류 및 이를 함유하는 구강치주질환 예방 및 그 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20050038205A
Application number: KR1020030073440A
Authority: KR
Inventors: 김경현; 이지혜; 이정선
Original assignee: 학교법인고려중앙학원
Priority date: 2003-10-21
Filing date: 2003-10-21
Publication date: 2005-04-27
Also published as: KR100573631B1

Abstract

본 발명은 구강질환 발병 원인균인 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis; 이하 포피로모나스)와 숙주세포인 인체 적혈구 세포와의 결합을 저해하는 산성 다당류 분획 및 고려인삼으로부터 상기 산성 다당류 분획을 분리·제조하는 방법에 관한 것이다. 고려인삼(Panax ginseng, C. A. Meyer)의 수용성 추출물에서 분리된 산성다당류(acidic polysaccharide) 분획은 다른 다당류 분획에 비하여 유론산(uronic acid)의 함량이 높고, 포피로모나스에 의한 적혈구 응집반응 (hemagglutination)을 저해하는 활성이 상대적으로 높으므로, 상기 산성 다당류 분획은 포피로모나스에 의하여 야기되는 구강 치주질환 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.

Description

포피로모나스 진지발리스의 세포결합을 저해하는 인삼뿌리에서 분리된 산성다당류 및 이를 함유하는 구강 치주질환 예방 및 그 치료용 조성물 {Acidic polysaccharide extracted from ginseng root and its composition for the use of preventive and therapeutic agents against periodontal diseases}

본 발명은 구강질환 발병 원인균인 포피로모나스 진지발리스

(Porphyromonas gingivalis; 이하 포피로모나스)와 숙주세포인 인체 적혈구 세포와의 결합을 저해하는 산성 다당류 분획 및 고려인삼으로부터 상기 산성 다당류 분획을 분리·제조하는 방법에 관한 것이다.

치주염(齒周炎, periodontitis)은 치주위염(齒周圍炎)이라고도 하며, 잇몸과 골성 조직(bony tissues)에 발병하는 만성 감염증으로, 세포조직이 파괴됨으로써 치아를 잃게 되는 질환이다. 치주는 치아의 주위를 뜻하며, 치주질환(잇몸병)은 치아주위에 부착하고 있는 조직과 치조골이 박테리아 세균의 감염으로 파괴되는 광범위한 잇몸질환이다. 치은, 치근막, 치조골의 세 조직에 염증이 있을 경우 각각 치은염, 치근막염, 치조골염이라는 명칭이 있지만, 이들 세 조직의 관련성이 크고, 동시에 같은 종류의 원인에 의하여 침식되는 경우가 많기 때문에 치주염으로 광범위하게 다루고 있다. 어린이에게는 주로 구강염증에 의한 출혈 즉, 음식 찌꺼기와 박테리아의 복합체인 플라그가 원인인 치은염(gingivitis)이 많이 나타나고 치주질환은 흔하지 않다. 그러나 일단 발현한 치주질환은 그 증상이 상당히 심각하고 치아 주위 조직의 파괴도 심한 경우가 있다. 따라서 치주질환에 의한 치아 주위 조직의 손상은 후속 영구치에도 나쁜 영향을 미치게 된다. 치주염은 나이를 먹을수록 발생률이 증가하는 성인병으로 알려져 있지만, 증상이 급속도로 악화되는 급속진행형 치주염(rapidly progressive periodontitis)과 같이 20대에 발병하여 30대에 대부분 치주조직을 파괴하는 무서운 구강질환도 나타나고 있다. 특히 40대 이후 노년기에 이르기까지 치주염은 거의 만성적인 증상으로 노년건강에 매우 중요한 인자가 되고 있으며, 궁극적으로는 치아를 잃게 됨으로써 건강에 큰 영향을 미치고 있다. 최근 치주염을 앓고 있는 사람이 심장질환에 걸릴 확률이 훨씬 높으며, 치주염을 앓고 있는 임산부는 미성숙 조산아를 낳을 확률이 높다는 연구결과가 보고 되고 있다[참조: Research, Science and Therapy Committee, American Academy of Periodontology. (2002) Periodontal management of patients with cardiovascular diseases. J Periodontol. 73(8): 954-968. 등]. 이는 치주염으로 인한 치아상실에서 더 나아가 치사에 이를 수 있다는 의미이기 때문에, 현재 이 분야의 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한 비만체질의 사람은 정상인 보다 치주염이 나타날 가능성이 더 높고, 비만과 치주염 사이에 높은 상관관계가 보고되고 있다[참조: Wood N, Johnson RB, Streckfus CF. (2003) Comparison of body composition and periodontal disease using nutritional assessment techniques: Third National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III). J Clin Periodontol. 30(4): 321-7. 등]. 당뇨병, 음주 및 흡연과 치주염과의 연관성도 각각 보고됨으로써[참조: Mealey BL, Rethman MP. (2003) Periodontal disease and diabetes mellitus. Bidirectional relationship. Dent Today 22(4): 107-13. 등], 일반적으로 알려진 박테리아성 질환과는 달리, 치주염은 타 질환과의 관련성이 매우 높은 특이 질환임을 알 수 있다.

구강 안에는 다양한 세균이 존재하는데 이들 대부분이 질병을 일으키지는 않는다. 그러나 입 안의 그램양성(Gram-positive) 세균이 그램음성(Gram-negative) 혐기성 세균으로 대체되면 치은염 더 나아가 치주염이 발병한다. 치주염을 일으키는 세균을 한 가지로만 대변할 수는 없지만, 포피로모나스 진지발리스 (Porphyromonas gingivalis; 이하 포피로모나스)는 그램음성 박테리아로서 인체에 만성적인 중증 치주염을 유발하는 제일 중요한 병원체로 알려져 있다. 이 병원체의 유전체 염기 서열이 최근에 규명되었으며, 구강 안에 질병을 유발하는 병원 미생물의 완전한 유전체 염기 서열이 밝혀진 연구 사례는 이번이 처음이다[참조: Duncan MJ. (2003) Genomics of oral bacteria. Crit Rev Oral Biol Med. 14(3): 175-87.]. 염기서열 규명은 미국 국립치과-두개안면연구소(National Institute of Dental and Craniofacial Research)의 지원으로 미국 유전체연구소(The Institute for Genomic Research)와 포시스연구소(The Forsyth Institute) 공동으로 이루어 졌다[참조: http://www.tigr.org/tigr-scripts/CMR.spl]. 이번 연구를 통해 밝혀진 치주염 병원균 포피로모나스는 230만 DNA 염기쌍(base pairs)의 유전체 크기를 갖고 있으며, 세균 다양성(bacterial diversity)과 그램음성 혐기성 세균에 작용하는 항생제 약물 표적(drug target) 선택연구에도 활용 가치가 높을 전망이다. 그램음성 혐기성 세균은 태생적으로 일부 항생제에 대해 약물 저항성(drug resistance)을 갖는 동시에 다른 많은 항생제에 대한 저항성을 획득하는 경향을 보인다. 따라서 유전체 염기 서열 규명 성과는 치주염 병원균의 독성(virulence)에 대한 유전 기작(genetic mechanism)을 규명하고, 치주염 치료 또는 예방책 개발을 앞당기는데 기여할 수 있을 것으로 전망된다. 이미 구강치주염 백신이 개발되고 있는 시점에서 [참조: Yonezawa H, Ishihara K, and Okuda K. (2001) Arg-Gingipain A DNA Vaccine Induces Protective Immunity against Infection by Porphyromonas gingivalis in a Murine Model. Infect Immun. 69 (5): 2858 2864. 등], 새로운 백신표적 항원단백질(vaccine target antigen)을 탐색하는데도 도움을 줄 것으로 예상하고 있다. 또한 포피로모나스가 구강 점막내 상피세포에 결합하는 세포부착 작용에 의하여 질환을 야기하기 때문에, 세포부착에 관여하는 부착수용체(adhesin) 단백질에 대한 동정이 빠른 시일내에 이루어질 것으로 기대되고 있다.

포피로모나스는 구강 점막 상피세포에 결합하는데, 콜라젠(collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 비트로넥틴(vitronectin) 및 사이토케라틴 (cytokeratin) 등에 결합하는 것이 알려져 있다[참조: Kontani M, Ono H, Shibata H, Okamura Y, Tanaka T, Fujiwara T, Kimura S, Hamada S. (1996) Cysteine protease of Porphyromonas gingivalis 381 enhances binding of fimbriae to cultured human fibroblasts and matrix proteins. Infect. Immun. 64: 756-762. 등]. 최근 포피로모나스가 숙주세포 표면 글라이코사미노글라이캔 (glycosaminoglycan) 자체 혹은 이를 구성하고 있는 탄수화물 당을 인식하는 사실이 보고되면서[참조:Wadstrom T, Ljungh A. (1999) Glycosaminoglycan-binding microbial proteins in tissue adhesion and invasion: key events in microbial pathogenicity. J. Med. Microbiol. 48: 223-233. 등], 탄수화물과 이를 인식하는 박테리아 표면 단백질간의 상호작용 및 결합에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 포피로모나스의 특징은 균의 성장에 필요한 탄소와 질소성분을 탄수화물에 의존하지 않고, 아미노산이나 펩타이드에 의존한다는 점이다. 따라서 세포 밖으로 배출하는 단백질 가수분해 효소, 시스테인 프로티에이스(cysteine protease)를 이용하여, 세포 외부에 존재하는 단백질을 분해하여 이를 섭취하는 것이 필수적이다. 이미 가수분해 효소로 아르지닌 특이성 진지페인(arginine-specific gingipain; 이하 RGP)과 라이신 특이성 진지페인(lysine-specific gingipain; 이하 KGP)이 알려져 있고, 인체내 혈청알부민(serum albumin), 항체(immunoglobulin), 헤모글로빈 (hemoglobin) 등의 숙주세포 단백질을 주로 분해한다. 이들은 분해기능 외에도 혈구응집(hemagglutination), 백혈구 파괴 등의 기능을 갖고 있다[참조: Nakayama K, Kadowaki T, Okamoto K, Yamamoto K. (1995) Construction and characterization of arginine-specific cysteine proteinase (Arg-gingipain)-deficient mutants of Porphyromonas gingivalis. Evidence for significant contribution of Arg-gingipain to virulence. J. Biol. Chem. 270: 23619-23626. 등]. 특히 RGP 혹은 KGP 단백질은 세포부착(adhesion)에 관여하는 단백질내 카르복실 말단 영역(C-terminal domain)을 갖고 있으며, RGP의 경우 헤모글로빈(hemoglobin)에 결합하는 것이 보고되어 있다[참조: Kuboniwa M, Amano A, Shizukuishi S. (1998) Hemoglobin-binding protein purified from Porphyromonas gingivalis is identical to lysine-specific cysteine proteinase (Lys-gingipain). Biochim. Biophys. Res. Commun. 249: 38-43.]. 박테리아 세포는 일반적으로 혈구응집 반응을 보이는데, 이는 박테리아 표면에 존재하는 단백질 부착수용체(adhesin)가 적혈구와 같은 인체세포 표면의 탄수화물 혹은 단백질을 인식함으로써 일어나는 반응이다. 특히 포피로모나스는 철을 비롯한 중요한 영양분을 위하여 헴(heme), 헤모글로빈의 공급이 세포성장에 필수적이다. 따라서 혈구응집반응은 포피로모나스의 인체 내 기생을 위한 세포성장에 필요한 작용기작이며, 이를 통하여 헴의 공급을 확보하게 된다[참조: Nakayama K, Ratnayake DB, Tsukuba T, Kadowaki T, Yamamoto K, Fujimura S. (1998) Hemoglobin receptor protein is intragenially encoded by the cysteine proteinase-encoding genes and the hemagglutinin-encoding gene of Porphyromonas gingivalis. Mol. Microbiol. 27: 51-61.]. 세포와 세포간 인식작용에 이용되어온 적혈구 응집반응은, 적혈구 세포의 표면이 인체 상피세포와 같거나 비슷한 탄수화물 조성을 보유하고 있는 특성 때문에, 세포-세포간 인식작용에 광범위하게 적용되어 왔다. 따라서 포피로모나스의 적혈구 응집반응을 통하여 박테리아 표면 단백질과 숙주세포간의 상호 인식작용에 대하여 연구가 가능하다. 중요한 점은 구강 점막 내 상피세포의 탄수화물과 적혈구의 탄수화물 조성이 동일 내지 유사하므로, 상호작용에 의한 결합을 저해하면 포피로모나스에 의해 유발되는 구강 잇몸위장병 치료 및 예방에 이용할 수 있는 것이다.

박테리아 표면 단백질 수용체(adhesin)가 인식하는 탄수화물을 이용하여 당배합체를 개발하는 것은 매우 중요한 발명대상에 속한다. 구강질환을 위하여 개발된 항생제 혹은 화학약품이 매우 제한적이고[참조: Leke N, Grenier D, Goldner M, Mayrand D. (1999) Effects of hydrogen peroxide on growth and selected properties of Porphyromonas gingivalis. FEMS Microbiol. Letters 174: 347-353.], 대부분 치주질환 수술에 의존하고 있기 때문에, 새로운 기술 혹은 약품의 개발이 필요한 시점이다. 기존의 항생제나 화학약품을 이용하면 부작용 뿐만 아니라 개발기술이 세포 파괴적인 반면, 숙주세포 표면의 탄수화물 인식 및 상호작용을 저해하는 신물질은 세포 간 결합을 저해하여 구강 밖으로 유출시켜 구강 내 잇몸염증을 최소화하는 비 파괴적 기술이라는 점에서 중요한 의미를 갖고 있다. 따라서 인체세포의 인식 혹은 부착을 저해하는 탄수화물의 개발은 21세기 친환경적 신물질을 창출할 것으로 판단된다. 이러한 비파괴적 기술이 적용되는 대표적인 예로 모유나 구강내 침을 들 수 있다.

본 발명은 포피로모나스의 구강 내 부착, 증식 및 활동을 저해하는 생리활성 물질을 천연자원에서 탐색하여 분리한 기술로서, 특히 생명공학 분야에서 새롭게 인식되고 있는 탄수화물 공학적 연구방법을 이용한 것이다. 종래에는 고려인삼에서 다당류 혹은 탄수화물을 포함하는 조추출물 분획으로 생리활성 측정이 이루어져 왔다. 따라서 분획 중에서 어느 특정 성분이 활성을 갖고 있는지에 대한 분자적 수준에서의 연구가 기술적 한계에 부딪쳐 왔지만, 현재 개발되고 있는 탄수화물 공학적 기술을 이용하여 다당류의 분리, 정제, 동정 및 구조적 분석을 이룸으로써 고부가가치 상품으로의 개발이 가능해지고 있다.

본 발명에서는 포피로모나스가 적혈구 세포와 결합하여 응집반응을 유도하는데, 고려인삼의 수용성 추출물 중에서 이온교환 수지 및 젤여과 수지로 분리된 산성 다당류(acidic polysaccharid) 분획이 포피로모나스에 의한 적혈구 응집반응을 억제하며 저해 효과가 다른 다당류 분획에 비하여 상대적으로 높은 특징을 갖고 있음을 확인하였으며, 인삼은 오랫동안 생약 및 식용으로 쓰여 왔던 약재인데 본 발명의 인삼뿌리로부터 추출된 산성다당류는 동물실험을 통하여 독성이 없음도 아울러 밝혀내었다. 적혈구 응집반응 저해는 앞서 기술한 바와 같이 포피로모나스 병원균에 의한 치주염뿐만 아니라, 심장질환 등과의 연관성이 보고 되고 있기 때문에, 구강 점막 내 상피세포에 대한 연관성 외에도 향후 심장질환에 관계되는 점에도 시사하는 바가 크다고 하겠다.

따라서 본 발명은, 구강질환 발병 원인균인 포피로모나스와 인체 적혈구 세포와의 결합을 저해함으로써 구강내 잇몸질환을 비롯한 치주염 예방 및 치료제로 이용할 수 있는 산성 다당류 분획을 제공한다.

또한 본 발명은 고려인삼으로부터 상기 산성 다당류 분획을 분리·제조하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 고려인삼내 생리활성 물질 중에서 탄수화물 분획을 분리하게 되었고, 특히 산성 다당류 당배합체 분획의 생리활성을 측정한 결과, 밀리몰 (millimolar) 이하의 수준에서 포피로모나스에 의한 적혈구 응집반응에 강한 저해효과를 보였으므로 구강내 잇몸질환을 비롯한 치주염 예방 및 치료제로서 높은 가능성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 구강내 치주염 주요 병원균인 포피로모나스에 의하여 야기되는 적혈구 응집반응을 저해하는 산성 다당류 및 상기 산성 다당류를 고려인삼의 수용성 추출물 중에서 이온교환 크로마토그래피, 젤 여과 크로마토그래피로 분리·제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 고려인삼 뿌리 부분을 뜨거운 증류수로 추출하는 단계; 최신 탄수화물 공학적 기술을 이용하여 이온교환 및 젤 여과 크로마토그래피로 생리활성 산성다당류를 분리하는 단계; 및 상기 산성다당류의 포피로모나스에 의한 적혈구 응집반응 저해활성을 측정하는 단계로 이루어진다.

본 발명에서는, 당배합체의 분리를 위하여 고려인삼의 일반적인 섭취 및 추출방식에 따라 뜨거운 증류수로 추출한다. 기존의 인삼 생리활성물질 추출은 주로 유기용매 추출법에 의존하고 있는데, 이는 우리가 인삼을 물에 끓여서 섭취하는 것과 대치되는 것이다. 따라서 뜨거운 증류수(60-100℃)에 의하여 추출되는 수용성 분획은 인삼의 경우 생리활성 물질 탐색에 좀 더 실제적인 접근이라고 할 수 있다.

상기 분리된 산성다당류는 유론산 함량이 20-35%에 달하며 주어진 조건에서 분리 추출된 다른 다당류 분획에 비하여 유론산 함량이 제일 높은데, 이는 포피로모나스의 인체 구강 점막 내 상피세포 인식을 저해하는 중요한 요인으로 판단된다. 유론산은 중성 단당류의 C6 알코올기 탄소가 카르복실기로 치환되어 중성 pH에서 음전하를 띠고 있는 특징을 갖고 있다. 포피로모나스가 구강 점막 상피세포에 결합하는 기작에 참가하는 다른 탄수화물의 특성을 살펴보면, 사이알릭산(N-acetylneuraminic acid), 글루구론산(glucuronic acid) 등이 있다. 즉, 특이당인 사이알릭당, 글루구론산에 특이적임을 알 수 있다. 인삼뿌리에서 추출 분리 정제된 산성다당류의 탄수화물 조성을 보면 글루구론산이 전체 당의 20%에 가까운 조성을 보여주고 있다. 또한 글루구론산은 C6 위치에 카르복실기 음전하를 띠고 있고, 분리된 산성다당류가 글루구론산의 함량이 높은 점이 포피로모나스의 인체 숙주세포 인식을 저해하는 중요한 요인으로 판단된다.

또한, 상기 산성다당류의 포피로모나스에 의한 적혈구 응집반응을 저해하는 최소 유효량은 다른 다당류에 비하여 훨씬 낮은 농도 0.25 mg/ml 로서 효과적인 저해활성을 보여주고 있다. 더욱이 포피로모나스 결합을 저해하는데 개발되고 있는 기존의 당의 유효량이 25 mM 이상 즉, 약 5 mg/ml 이상의 농도라는 점은 산성다당류 자체(분자량 약 10 kDa)의 저해활성이 상대적으로 높다는 것을 대변하고 있다 (약 25 μM 수준).

본 발명에 이용된 DEAE-Sepharose CL-6B 이온교환 수지 및 Superdex 200 prepacked columns은 아마샴-파마시아 바이오텍(Amersham Phamacia Biotech, Sweden)에서 구입하였다.

본 발명에 사용된 효소 펙티네이스(pectinase), 트립신(trypsin), 글루구론산(glucuronic acid), 갈락튜론산(galacturonic acid), 람노스(rhamnose), 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 포도당(glucose), 갈락토스(galactose) 등은 시그마(Sigma, USA)에서 구입하였다.

본 발명에 이용된 적혈구 응집반응에 필요한 AB, O형 적혈구는 고려대 의대에서 확보하였으며, 항응고제와 트립신 효소 처리와 무처리를 한 다음 이용하였다.

본 발명에 이용된 포피로모나스 박테리아(ATCC33277)는 50% 연마소고기 (ground beef), 3% 트립티케이스(trypticase), 0.5% 효모추출액(yeast extract), 0.05% 시스테인(cysteine), 10 ml/L 헤민(hemin), 0.15 ml/L 비타민 K₁ 배지에서 37 ℃, 10% 이산화탄소, 10% 수소 조건에서 3일간 배양하였으며, 액체질소에 보관하여 실험에 이용하였다.

본 발명에 이용된 대장균(BL21(DE3), BL21(DE3)/pLysS)은 Luria-Bertani (LB) broth 배지에서 항생제 처리없이 37 ℃에서 6시간 배양하였으며, 배양된 대장균은 -70 ℃에 보관하여 실험에 이용하였다.

본 발명 산성다당류는 인삼뿌리 함유성분의 분리 및 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 획득할 수 있다.

이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 단백질 및 탄수화물 정량

전체 탄수화물, 유론산 및 단백질의 양은 페놀-황산 방법, 카바졸(carbazole), 및 로우리(Lowry) 방법을 각각 포도당, 갈락튜론산 (galacturonic acid), 글루구론산(glucuronic acid), 소혈청 알부민을 표준으로 사용하여 결정하였다[참조: Chaplin MF. Monosaccharides, 1. Carbohydrate analysis.(1986) In: Chaplin MF, Kennedy JF, editors. Oxford. IRL PRESS. pp. 1-36.][참조: Bradford MM. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Chem 72: 48-54.].

실시예 2: 인삼뿌리로부터 산성다당류의 분리

산성 다당류의 제조방법은 다음과 같다. 인삼 뿌리를 뜨거운 증류수로 추출한 후 에탄올 침전을 하여 얻은 침전물을 분무건조함으로써 인삼추출물을 얻었다. 상기 인삼추출물을 뜨거운 증류수 (40- 100℃)로 추출하여, 10,000 g에서 원심분리한 후 상등액을 얻었다. 이들 상등액을 모아 5% 세틸피리디니움 클로라이드 (cetylpyridinium chloride) 용액을 이용하여 휘저으면서 (stirring) 3시간 정도 37℃에서 인큐베이션(incubation)하여 원심분리 후 침전물을 얻었다. 10% NaCl용액을 이용하여 남아있는 세틸피리디니움 클로라이드 (cetylpyridinium chloride)를 투석 제거한 다음, 7배 부피의 에탄올로 침전시키고, 이를 최소부피의 20 mM Tris 완충용액 (pH 8.0)에 녹여 투석 후 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다. 산성다당류는 이 때 0-1 M 염화나트륨 용액 농도기울기를 이용하였으며, 염화나트륨 농도 0.2-0.3 M에서 분리되어 유출됨을 확인하였다. 분리된 다당류는 투석 후 동결 건조한 다음, 젤 여과 크로마토그래피를 이용하여 다당류 크기별로 분리하여 이중 가장 크고 활성이 제일 높은 분획을 얻었다(도 2 참조). 분리된 산성다당류 분획에서는 단백질이 검출되지 않았다. 또한 비결합성 분획은 주로 중성 다당류로 이루어져 있음을 확인하였고, 결합성 분획에서는 산성다당류, 특히 활성이 있는 분획임을 확인하였다. 도 1은 인삼뿌리 시료로부터 젤 여과 크로마토그래피로 분리되는 전체적인 분리 정제과정을 나타낸다.

실시예 3: 산성다당류의 단당류 탄수화물 분석

가) 가수분해: 2M 트라이플로로 초산(trifluoroacetic acid)에 시료를 녹여 밀폐된 유리관에서 질소 기체 하에서 반응시킨 다음 회전 농축기(rotary evaporator)로 농축시켰다.

나) 환원반응: 시료와 표준시료에 0.05M 소듐하이드록사이드(NaOH)와 소듐보로하이드라이드(NaBH₄)를 각각 가하고 실온에서 반응시켰다. 환원 반응 후 남은 소듐보로하이드라이드 물질은 빙초산으로 제거하였다.

다) 아세틸화 반응: 환원된 단당류는 피리딘(pyridine), 아세틱 안하이드라이드(acetic anhydride)를 가하여 아세틸화 시켰다. 실온에서 시료가 건조상태가 될 때까지 농축하고, 톨루엔 용액에 첨가하여 완전히 증발할 때까지 농축하였다. 건조되어 남은 물질은 클로로포름/물에 녹여 교반(vortex) 한 다음, 1,000g에서 원심분리를 하여 유기 용매 층과 수용액 층으로 분리하였다. 유기 용매 층을 진공에서 다시 농축하여 다음 실험에 사용하였다. 건조된 시료와 표준시료에 메탄올 염산을 첨가하여 밀폐된 유리관내 80℃에서 반응시킨 다음 진공상태에서 농축하였다.

라) 트라이플로로 아세틸화 반응(trifluoroacetylation): 건조되고 남은 물질은 다이클로로메탄(dichloromethane), 트라이플로로 초산(trifluoroacetic acid)에 의하여 트라이플르오로 아세틸화 반응을 수행하였다.

마) 가스 크로마토그래피에 의한 분석: 시료는 가스 크로마토그래피를 이용하여 측정하였다. 시료를 CBP5 25 미터 융합 실리카 미세관 컬럼(fused silica capillary column)에 가하고. 단당류 유도체를 프래임-이온 측정기(flame-ionization detector)을 이용하여 측정하였다. 오븐온도는 처음 온도 140℃ 그리고 점차 증가하여 분당 4℃의 기울기로 270℃까지 높여 사용하였다.

사) 매스 스펙트라 측정(mass spectra): 단당류의 동정은 가스크로마토그래피/매스 스펙트라로 동정 확인하였다.

분리된 산성다당류 분획은 유론산의 함량이 높을 뿐만 아니라 다른 당배합체 분획에 비하여 아라비노스(arabinose)와 갈락토스(galactose)의 함량이 매우 높았다 (표 1 참조). 이에 반하여 비결합성 분획에서 얻어진 중성다당류 분획은 유론산의 함량이 상대적으로 매우 적고, 단당류의 조성비도 대부분 포도당임을 확인하였다. 특히 갈락튜론산, 글루구론산으로 대변되는 유론산의 함량이 다른 다당류 분획에 비하여 상대적으로 매우 높은 것을 발견하였으며, 이 중에서도 글루구론산의 함량은 특이당으로서 약 18%에 달하는 것으로 나타났다.

인삼뿌리로부터 분리정제된 산성다당류 최종분획 F2의 탄수화물 조성

	아라비노스(arabinose)	자일로스(xylose)	람노스(rhamnose)	만노스(mannose)	갈락토스(galactose)	글루코스(glucose)	갈락튜론산(galacturonic acid)	글루구론산(glucuronic acid)
다당류 최종분획	28.0	3.2	4.7	2.6	26.3	7.9	7.9	18.4
<주> 각 수치는 상대 몰퍼센트(mol%)임.

인삼뿌리 외에도 쑥에서 정제된 산성다당류는 이미 헬리코박터 파이로리 위장질환 병원균에 대한 세포부착 저해활성이 높다는 연구결과를 얻은 바 있다[참조: Lee JH, Park EK, Uhm C, Chung M, Kim KH. (2003) Inhibition of Helicobacter pylori adhesion to human gastric adenocarcinoma epithelial cells by acidic polysaccharides from Artemisia capillaris and Panax ginseng. Planta Medica. In press.]. 그러나 쑥에서 정제된 산성다당류는 포피로모나스 세포부착에 대해서는 저해활성이 전혀 없다. 쑥 산성다당류의 경우, 갈락튜론산 함량비가 높은데 비하여 글루구론산은 존재하지 않는다. 또한 포피로모나스의 인체세포와의 부착작용에 대하여 사이알릭산(N-acetylneuraminic acid), 글루구론산(glucuronic acid)이 저해활성이 있다는 보고와 함께 종합해 볼 때, 인삼뿌리에서 정제된 산성다당류의 특이적 저해활성은 글루구론산의 높은 함량과 관계가 있을 것으로 생각된다.

실시예 4: 포피로모나스에 의한 적혈구 응집반응 저해

배양된 포피로모나스를 인산 완충용액으로 묽게 만든 후 동량의 적혈구 용액과 혼합하여 실온에서 30분-3시간 약하게 교반하여 반응시키거나, 혹은 4℃에서 밤새도록 반응시켜, 이를 양성 적혈구 응집반응으로 하였다. 분리된 다당류 분획들을 이용하여 응집반응에 대한 저해활성을 위해서, 포피로모나스 용액과 당배합체 용액을 혼합하여, 실온, 혹은 4 ℃에서 반응시킨 다음, 다시 적혈구 용액을 혼합하여 반응시킨 후 응집반응을 현미경을 이용하여 측정하였다.

포피로모나스에 의한 적혈구 응집반응을 저해하는 활성측정 결과, 인삼뿌리에서 정제된 여러 분획 중에서도 산성다당류 최종 분획은 0.25 mg/ml의 낮은 농도에서 저해 활성을 나타내었다. 기 보고된 특이 단당류, 즉 사이알릭산(N-acetylneuraminic acid), 글루구론산(glucuronic acid)은 약 5 mg/ml 이상의 농도, 즉 25 mM 이상의 높은 농도에서 저해활성을 보이고 있다. 본 발명의 대상인 산성 다당류는 이에 반하여, 상대적으로 높은 활성을 지닌 것을 확인할 수 있다. 즉, 분자량 약 10 kDa에 근거하여 약 25 μM 수준에서 저해활성을 보이고 있다(도 3 참조).

실시예 5: 대장균에 의한 적혈구 응집반응 저해

배양된 대장균을 완충용액으로 묽게 만든 후 동량의 적혈구 용액과 혼합하여 실온에서 30분-3시간 약하게 교반하여 반응시키거나, 혹은 4℃에서 밤새도록 반응시켜, 이를 양성 적혈구 응집반응으로 하였다. 분리된 다당류 분획들을 이용하여 응집반응에 대한 저해활성을 위해서, 대장균 용액과 당배합체 용액을 혼합하여, 실온, 혹은 4℃에서 반응시킨 다음, 다시 적혈구 용액을 혼합하여 반응시킨 후 응집반응을 현미경을 이용하여 측정하였다.

대장균에 의한 적혈구 응집반응을 저해하는 활성측정 결과, 인삼뿌리에서 정제된 여러 분획 중에서도 산성다당류 최종 분획은 1.0-2.5 mg/ml의 높은 농도를 이용하였을 경우에도 저해활성을 보이지 않았다(도 4 참조). 따라서 본 발명 대상인 산성다당류는 포피로모나스 균에 의하여 유도되는 혈구응집반응에 대해서는 높은 저해작용을 보이는 반면, 대장균에 의한 혈구응집반응에는 아무런 저해효과를 보이지 않음으로써, 포피로모나스 세포부착에 특이적인 활성임을 확인할 수 있었다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 고려인삼으로부터 분리·제조되며 구강질환 발병 원인균인 포피로모나스와 인체 적혈구 세포와의 결합을 저해하는 산성 다당류 분획에 관한 것으로, 숙주세포 표면의 탄수화물 인식 및 상호작용을 저해하는 상기 산성 다당류는 세포-세포간 부착 및 결합을 저해하여 구강질환을 최소화하며, 천연소재로서 독성이 없으며, 기존의 항생제나 화학의약품과 같은 부작용을 최소한으로 줄일 수 있는 효과를 갖고 있다. 따라서 이는 식품 및 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 인삼뿌리로부터 본 발명 산성 다당류를 분리 및 정제하는 과정을 나타낸 모식도이다.

도 2a는 DEAE(diethylaminoethyl) 이온교환 크로마토그래피를 이용한 인삼뿌리 유래 산성 다당류의 유출 프로필을 나타낸 그래프이다. 점선은 소금의 농도변화를 나타낸다.

도 2b는 젤 여과 크로마토그래피를 이용한 인삼뿌리 유래 산성 다당류의 유출 프로필을 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명 산성 다당류가 포피로모나스 진지발리스에 의한 적혈구 응집반응(hemagglutination)을 저해하는 활성여부를 농도에 따라 실험한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명 산성 다당류가 대장균(Escherichia coli)에 의한 응집반응을저해하는 활성여부를 농도에 따라 실험한 결과를 나타낸 것이다.

Claims

인삼뿌리를 열수추출한 후 에탄올 침전시켜 얻은 침전물을 분무건조하여 인삼 추출물을 얻는 단계; 상기 인삼추출물을 열수추출하고 원심분리하여 상등액을 얻는 단계; 상기 상등액을 세틸피리디니움 클로라이드 처리하여 원심분리 후 침전물을 얻는 단계; NaCl을 이용하여 세틸피리디니움 클로라이드를 투석 제거하고 에탄올로 침전시키는 단계; 및 상기 에탄올 침전물을 이온 교환 크로마토그래피 및 젤 여과 크로마토그래피를 이용하여 분리하는 단계에 의하여 제조되며, 유론산을 20~35 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는, 포피로모나스의 세포결합 저해활성이 있는 산성 다당류.
제1항의 산성 다당류를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 구강 질환 예방 및 치료용 조성물.
제1항의 산성 다당류를 인간을 제외한 포유류에 사용하는 것을 특징으로 하는 구강질환 치료방법.