KR20050034573A - 안지오텐신 펩티드-캐리어-컨쥬게이트 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펩티드 유도체를 캐리어, 특히 바이러스성 입자(VLP)에 커플링하여 반복적 스캐폴드로 제시되는 포유동물의 펩티드 호르몬 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I 및 안지오텐신 II의 펩티드 유도체의 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 컨쥬게이트를 제조하는 방법, 레닌-활성화된 안지오텐신계와 관련된 신체 질환을 치료 또는 예방하기 위한 생성된 이뮤노겐 컨쥬게이트의 면역치료학적 용도를 제공한다.

Description

안지오텐신 펩티드-캐리어-컨쥬게이트 및 그의 용도{Angiotensin Peptide-Carrier Conjugates and uses thereof}

본 발명은 의학, 공중위생, 면역학, 분자 생물학 및 바이러스학 분야에 관한 것이다.

포유동물의 동맥혈압은 주로 레닌-안지오텐신계(RAS)로 공지되어 있는 생화학적 캐스캐이드에 의해 조절된다. 이는 동맥혈압이 떨어진 후 신장의 토리곁장치( juxtaglomerular apparatus)의 상피양세포로부터 레닌이 방출되므로써 개시된다. 레닌은 간의 혈청내로 분비되는 펩티드 안지오텐시노겐(아미노산 서열: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu- Val-Ile-His-Asn)을 효소적으로 절단한다. 이 절단에 의해 데카펩티드 안지오텐신 I(아미노산 서열: Asp-Arg-Val- Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu)이 형성된다. 폐의 내피에 존재하는 안지오텐신 전환 효소(ACE)는 ATI의 두개의 C-말단 아미노산을 수초내에 절단하여 안지오텐신 II(아미노산 서열: Asp-Arg-Val- Tyr-Ile-His-Pro-Phe)를 형성한다. 안지오텐신 I의 수명은 생체내에서 짧고 혈관수축 활성이 없거나 매우 경미한 반면, 안지오텐신 II는 순환계 및 내분비계에 충분한 효력을 갖는다. RAS-활성화된 안지오텐신 II의 수준이 증가하면 심장혈관 손상을 일으킬 수 있는 동맥혈압의 증가(고혈압)의 원인이 되는 혈관수축, 염 및 물의 신장내 축적을 초래한다. 고혈압의 가능한 임상소견은 뇌졸증, 경색증, 울혈심부전증, 신부전 또는 망막출혈이다.

U. S. Centers for Disease Control and Prevention(CDC)에 따르면, 울혈심부전증은 노인에게 있어 주요 만성 질환이고, 이는 미국에서 1년에 약 260,000여명이 사망하는 것으로 나타났다. 1995년에 Medicare는 심부전증에 대하여 34억 달러를 지출하였다. 고혈압 치료에 약물들이 이용될 수 있지만, 치료받은 고혈압 환자중 단지 절반 가량의 고혈압이 조절된다. 이는 부분적으로는 환자의 비-순응성(compliance) 또는 사용하는 약물의 효능이 없음에 기인한다.

현 고혈압 치료법은 작은 유기 분자를 사용하는 RAS 시스템의 개입을 포함한다. 주 표적은 레닌, ACE 및 안지오텐신 II에 대한 수용체이다. ACE 저해제는 리시노프릴^R, 캅토프릴^R 및 에나랄프릴^R을 포함하지만, 이들 약물은 완전히 효과적인 것은 아니다. 우선 이는 ACE 활성을 완벽하게 차단하지 못하고 두번째로는 ACE에 의한 브라디키닌을 포함하는 다른 생물학적 활성 펩티드의 생성 또한 영향을 받게 되고, 이는 바람직하지 못하다. 이들 약물은 마른기침과 같은 부작용 및 현기증 및 가능한 실신을 포함하는 제 1 투여 저혈압 효능을 유도할 수 있다. 안지오텐신 II 수용체 길항제는 로사르탄^R, 발사트란^R 및 이스베사프탄^R을 포함하고, 이는 특이적으로 ATI 안지오텐신 수용체에 작용하여 우수한 안지오텐신 II의 혈관수축 작용을 차단하고, 더욱 내성이지만 다른 안지오텐신 호르몬에는 작용하지 않는다. 그러나, 안지오텐신 II 수용체 길항제 및 ACE 저해제는 장기간, 예를 들면, 적어도 부분적으로는 환자의 순응성이 불충분한 다수의 성인의 경우 평생동안 복용되어야 할 필요가 있다. 따라서, 효능이 있고, 내성이 우수하며 환자의 높은 순응성과 관련되는 고혈압 치료법이 절실히 요구되고 있다.

질환 또는 호르몬 활성과 관련된 질환을 치료 또는 예방하는 가능한 접근법은 면역요법, 즉, 호르몬 또는 호르몬 생성에 관여하는 효소에 대하여 환자를 면역화시켜 호르몬의 활성을 중화시키거나 그의 수준을 특정 항-호르몬 또는 항-효소 항체에 의해 저하시켜 환자내 호르몬의 효능을 중화시키는 것이다. 상기 항체는 수동면역화에서 외인 투여될 수 있거나 호르몬 또는 관련 효소에 기초한 이뮤노겐을 사용하는 능동 면역화에서 동소에서(in situ)에서 생성될 수 있다.

고혈압을 조절하기 위한 RAS 성분에 대한 백신화 가능성은 동물 모델에서 나타났다(참조 Michel, Am. Heart J. 117 : 756(1989)). 레닌에 대한 백신화는 혈압 강하에 효능이 있지만, 동물은 자가면역 신장염으로 고생하였다(Michel et al., Circulation 81 : 1899(1990); Lo et al., Hypertension 16 : 80(1990)). 상동의 ACE에 대한 능동 면역화와 관련된 데이타는 매우 한정되어 있다. 한 리포터에는 래빗의 백신화에 대하여 기술하고 있지만 단지 50마리중 1마리만이 검출가능한 항-ACE 항체를 만들었다(Soffer, Fed. Proc. 42 : 2735(1983)). ACE에 대한 면역 혈청을 수동전달하여 래빗의 혈압을 강하시킬 수 있지만 가능하게는 ACE가 폐에서 막-결합 형태로 발현되기 때문에 폐부종과 함께 면역 반응을 보인다(Cadwell, FEBS Lett. 63 : 82(1976)). 안지오텐시노겐에 대한 능동면역화에 대하여 보고된 바 없지만, 여러 연구에서 안지오텐신 I 및 안지오텐신 II에 대한 면역화 가능성에 대하여 연구되고 있다. 두개의 연구는 백신화된 동물에서 혈압 효능을 보고하였지만(Christlieb, J. Clin. Invest. 48 : 1506(1969); Gardiner, Br. J. Pharmacol. 129 : 1178(2000)) 자가면역은 주시하지 않았다. 그러나, 가능하게 안지오텐신 펩티드에 대해 유도된 역가는 매우 낮거나 유도 항체의 특이성이 가장 적절한 것은 아니기 때문에 안지오텐신 펩티드를 사용하는 대다수의 백신화 연구는 부정적이었다. 안지오텐신 II만을 표적으로 하는 백신은 RAS에 대하여 안지오텐신 II 및 안지오텐신 I 및 가능하게는 전구체 안지오텐시노겐에 대한 항체를 유도하는 백신과 동일한 효능을 갖는 것은 아니다.

WO 98/58952에는 파상풍 톡소이드에 컨쥬게이트된 안지오텐신 I을 포함하는 컨쥬게이트에 의한 치료법이 기술되어 있고, 이는 수산화알류미늄과 같은 어쥬번트와 함께 적용되는 경우 래트에서 안지오텐신-특이 항체를 유도한다. 어쥬번트는 주로 독성이거나 적어도 자극성이다. 현재까지 인체 사용이 허가된 어쥬번트는 무기염(수산화알루미늄, 인산알루미늄, 인산칼슘) 및 비로솜(virosome)이다. 가장 빈번하게 인체에 사용되는 어쥬번트는 수산화알루미늄(Alum)이다. 안전한 것으로 판단되지만, 데포를 형성하는 장시간동안 인체에 남아있다. 데포-형성에 대한 결과는 여전히 불충하게 이해되고 있어 그의 면역원성은 늦추지 않으면서 미래 백신에서 Alum을 제거하도록 시도되어야 한다.

따라서, 어쥬번트의 부재하에서도 높은 항체 역가를 유도하는 컨쥬게이트를 제공하고는 것이 본 분야에서 여전히 요구되고 있다.

발명의 간단한 요약

본 발명자는 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II(본 명세서에서 총괄적으로 "안지오텐신 펩티드"로 언급됨)에 특이성인 항체를 유도하는 효능있는 이뮤노겐을 개발하였고, 이는 어쥬번트를 사용하지 않고도 효능이 있으며, 하나 이상의 안지오텐신 펩티드, 예를 들면, 안고텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II을 특이적으로 표적으로 하는 항체를 개발할 수 있도록 한다. 이뮤노겐은 안지오텐신 바이러스성 입자(VLP)에 결합하는 안지오텐신 펩티드 부위로 구성된다. 어쥬번트를 사용하지 않고도 항체 형성을 자극할 수 있는 고도의 면역원성 반복 항원 어레이가 형성된다. 사용되는 안지오텐신 펩티드 부위의 아미노산 서열에 따라 높은 항체 역가가 유도되고, 또한 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II의 N- 또는 C-말단에 대하여 특이적으로 유도될 수 있다. 이로써 한 종의 안지오텐신 펩티드만 또는 그의 배합물을 특이적으로 표적화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 이뮤노겐은 RAS에 의해 생성된 안지오텐신 II의 수준이 증가된 것과 관련되는 이상을 퇴치하기 위한 면역요법에서 사용될 수 있다.

특정 작동 또는 기작 이론에 제한하지 않고, 본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트는 1종 이상의 안지오텐신 펩티드에 결합하는 항체를 유도하여 동시에 관련된 모든 종의 안지오텐신을 차단할 수 있다. 다르게는, 유도된 항체는 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II의 C-말단에 특이적일 수 있다. 이러한 조건 하에, 유도된 항체는 각각 레닌 또는 ACE에 의해 안지오텐시노겐 또는 안지오텐신 I의 활성화를 차단할 것이다. 그럼에도 불구하고, ACE 또는 레닌과 상이한 프로테아제, 예로서 엔도펩티다아제 및 아미노펩티다아제는 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II를 N-말단으로부터 분해하여 항체와 결합한(antibody-bound) 본래의(intact) 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II이 축적되지 못하도록 한다.

따라서, 본 발명은 정돈된 반복적 어레이 구조를 갖는 컨쥬게이트를 형성하기 위해 하나 이상의 코어 입자, 바람직하게 하나 이상의 바이러스성 입자(VLP)에 결합하는 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 또는 펩티드 부위, 또는 그의 유도체를 포함하는 이뮤노겐을 제공한다. 제 1 결합부를 포함하는 코어 입자, 및 제 2 결합부를 포함하는 안지오텐신 펩티드 또는 그의 유도체는 상기 제 1 및 제 2 결합부를 통해 결합하여 정돈된 반복적 어레이를 형성한다. 제 1 및 제 2 부위의 상보작용은 직접적이거나, 적어도 하나의 분자, 예로서 링커를 포함할 수 있다.

일례로, 제 1 결합부는 코어 입자에서 자연적으로 발생된다. 다르게는, 제 1 결합부는 화학 커플링 또는 재조합 기술에 의해 첨가된다. 바람직한 제 1 결합부는 아미노 그룹, 카복실 그룹 또는 설프하이드릴 그룹을 포함한다. 제 1 결합부를 포함하는 바람직한 아미노산은 리신, 아르기닌, 시스테인, 아스파테이트, 글루타메이트, 티로신 및 히스티딘으로부터 선택된다. 특히 바람직한 것은 리신 잔기이다.

안지오텐신 펩티드 또는 그의 유도체상의 제 2 결합부는 아민, 아미드, 카복실 및 설프하이드릴 그룹이다. 코어 입자의 단백질 분자중 반응 그룹과 공유 결합을 형성하여 펩티드/단백질의 가교결합 또는 단백질이 유도 분자과 결합(congjugation)할 수 있도록 개발된 화합물이 광범위하게 존재한다.

본 발명의 제 1 결합부를 포함하는 코어 입자는 정돈된 반복적 어레이 형성에 적절한 모든 입자를 포함한다. 일면에서 상기 코어 입자는 바이러스성 입자(VLP), 박테리오파지, 박테리오파지 바이러스성 입자, 섬모(pili)등을 포함한다. 특정 일례로 이는 HbcAg VLP, 박테리오파지 VLP 및 타입 I 섬모이다. 본 발명은 또한 정돈된 반복적 구조를 형성할 수 있는 상이한 형태의 코어 입자를 제공한다. 상이한 형태는 코어 입자의 재조합 및 자연발생된 형태, 및 돌연변이 형태를 포함한다. 특정 일례로, 코어 입자의 돌연변이 형태는 제 1 결합부의 타입, 또는 상기 결합부의 수가 모체와 상이한 것을 포함한다. 코어 입자상의 리신 잔기수의 변형이 바람직한다.

특정 일면으로, 본 발명의 컨쥬게이트는 바이러스성 입자(VLP)와 화학적으로 커플링하는 안지오텐신 펩티드 부위를 포함한다. 이 결과 어쥬번트를 사용하지 않고도 항체 형성을 자극할 수 있는 고도한 이뮤노겐의 반복 항원 어레이가 형성된다. 사용되는 안지오텐신 펩티드 부위의 아미노산 서열에 따라 높은 항체 역가가 유도되고, 또한 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II의 N- 또는 C-말단에 대하여 특이적으로 유도될 수 있다. 이로써 한 종의 안지오텐신 펩티드만 또는 그의 배합물을 특이적으로 표적화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 이뮤노겐은 RAS에 의해 생성된 안지오텐신 II의 수준이 증가된 것과 관련되는 이상을 퇴치하기 위한 면역요법에서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 면역 반응 유도에 사용하기 적절한 코어 입자 및 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 또는 안지오텐신 펩티드 부위를 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 컨쥬게이트 및 하나 이상의 첨가 성분, 예로서 하나 이상의 부형제 또는 담체, 적절하게 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트는 추가의 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 어쥬번트를 포함하거나 포함하지 않는 백신 컨쥬게이트 또는 컨쥬게이트를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 또한 면역학적 유효량의 하나 이상의 컨쥬게이트 또는 본 발명의 컨쥬게이트를 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 백신 컨쥬게이트를 제공한다. 추가의 일례로, 백신은 추가로 적어도 하나의 어쥬번트, 예로서 Alum 또는 프로인트 불완전 어쥬번트를 포함한다. 본 발명은 본 발명의 컨쥬게이트, 컨쥬게이트, 또는 백신을 면역학적 유효량으로 동물에 투여하여 컨쥬게이트 또는 컨쥬게이트에 대하여 면역 반응을 유도하는 것을 포함하는, 동물, 바람직하게 인간과 같은 포유동물을 면역화하고/거나 치료하는 방법을 제공한다. 본 분야의 공지된 투여 경로, 제한하는 것은 아니지만 피하, 근육내, 비강내, 진피내, 정맥내, 경피, 점막관통, 경구로, 또는 림프절 내로 직접 투여하여 동물을 컨쥬게이트 또는 본 발명의 컨쥬게이트로 적절하게 면역화시킬 수 있다. 비강내 면역화가 특히 적절한 경로이다; 이러한 타입의 투여는 실시예에 기술되는 바와 같이 IgA를 포함하는 높은 항체 역가를 가져오고 고통스러운 면역화 과정(예: 근육내)은 회피하므로써 환자에게 더욱 수용될 수 있고 향상된 순응성을 갖는다.

본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트는 항체 생산을 포함하는 면역 반응을 유도한다. 따라서, 또다른 일례로, 본 발명은 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 또는 안지오텐신 펩티드 부위에 대한 항체 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 RAS와 관련된 생리적 질환의 치료 또는 예방, 안지오텐신 펩티드 또는 안지오텐신 펩티드 부위의 검출, 예를 들면, 동물의 조직 또는 순환에 하나 이상의 RAS 성분 존재와 관련되는 생리 질환을 진단하는 방법에서 유용하다.

관련된 일례로, 본 발명은 RAS 관련 질환, 질병 또는 이상, 제한하는 것은 아니지만, 뇌졸증, 경색증, 울혈심부전증, 신부전, 망막출혈 등의 치료 또는 예방에 유용하다. 컨쥬게이트 또는 본 발명의 컨쥬게이트를 사용한 면역화는 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 또는 안지오텐신 펩티드 부위에 대한 면역 반응을 일으켜 면역 분자, 특히 항체가 안지오텐신 펩티드 또는 안지오텐신 펩티드 부위에 결합하도록 한다. 항체의 수동전달 또한 RAS 관련 질환의 치료 또는 예방에 유용하다.

본 발명자는 바이러스성 입자(VLP)에 결합한 안지오텐신 펩티드 또는 안지오텐신 펩티드 부위의 컨쥬게이트가 고도의 안지오텐신-특이성 IgG 항체를 유도한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 매우 바람직한 일례로 정돈된 반복적 VLP-안지오텐신 펩티드/부위 컨쥬게이트에 기초하는 RAS 관련 질환의 치료법을 제공한다. 이 치료법으로 백신화된 동물에서 고역가의 항-안지오텐신 항체를 유도할 수 있다. 어쥬번트의 부재하에서도 높은 항체 역가가 유도되고 IgG 및 IgA 서브타입을 포함한다. 또한, 이 치료법은 놀랍게도 염증과 같은 강력한 병적 면역 반응 유도와는 관련이 없다. 본 발명의 치료용 컨쥬게이트는 적어도 하나의 안지오텐신 펩티드 또는 안지오텐신 펩티드 부위 및 VLP, 바람직하게 RNA-파지의 VLP, 또는 적어도 하나의 안지오텐신 펩티드 또는 안지오텐신 펩티드 부위 및 대체 코어 입자, 예로서 HbcAg 또는 섬모를 포함한다.

본 발명의 다른 일면을 본 분야에 공지된 것, 하기 도면 및 본 발명의 상세한 설명, 및 청구범위로서 본 분야의 기술자는 명확하게 이해할 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 Qβ 캡시드 단백질에 커플링된 안지오 1, 안지오 2, 안지오 3 또는 안지오 4 펩티드로 면역화된 마우스의 혈청중 안지오 1 펩티드 및 안지오 II에 특이적인 IgG 항체의 ELISA 분석에 관한 것이다.

도 2는 Qβ 캡시드 단백질에 커플링된 안지오 1, 안지오 2, 안지오 3 또는 안지오 4 펩티드로 면역화된 마우스의 혈청중 안지오 2 펩티드 및 안지오 I에 특이적인 IgG 항체의 ELISA 분석에 관한 것이다.

도 3은 Qβ 캡시드 단백질에 커플링된 안지오 5, 안지오 6, 안지오 7 또는 안지오 8 펩티드로 면역화된 마우스의 혈청중 안지오 1 펩티드 및 안지오 II에 특이적인 IgG 항체의 ELISA 분석에 관한 것이다.

도 4는 Qβ 캡시드 단백질에 커플링된 안지오 5, 안지오 6, 안지오 7 또는 안지오 8 펩티드로 면역화된 마우스의 혈청중 안지오 2 펩티드 및 안지오 I에 특이적인 IgG 항체의 ELISA 분석에 관한 것이다.

정의

하기 설명에서 사용되는 다수의 용어들은 분자생물학, 면역학 및 의약분야에서 광범위하게 사용된다. 이 용어에 의한 범위를 포함하여 명세서 및 청구범위의 이해를 명확하게 하기 위하여, 하기 정의는 제한하지 않고 제공된다.

능동면역화: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "능동면역화"는 이뮤노겐, 백신, 항원 또는 안지오텐신 펩티드-캐리어 컨쥬게이트의 투여로 유도된 개체, 전형적으로 동물에서 면역반응을 유도하는 것을 언급한다. 반대로, 수동면역화는 개체내로 면역 분자 또는 세포를 전달하여 이 개체에 면역성을 주는 것을 언급한다.

알파바이러스: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "알파바이러스"는 알파바이러스(A1phavirus) 속에 포함된 어느 RNA 바이러스를 언급한다. 이 속에 포함되는 구성원은 [Strauss and Strauss, Microbiol. Rev., 58 : 491-562(1994)]에 기재되어 있다. 알파바이러스의 예는 오라바이러스(Aura virus), 베바루바이러스(Bebaru virus), 카바소우바이러스(Cabassou virus), 치쿤군야바이러스(Chikungunya virus), 이스터 말 뇌척수염 바이러스(Easter equine encephalomyelitis virus), 포트모건바이러스(Fort morgan virus), 게타바이러스(Getah virus), 키질라가크 바이러스(Kyzylagach virus), 마요아로 바이러스(Mayoaro virus), 미들버그바이러스(Middleburg virus), 뮤캄보바이러스(Mucambo virus), 엔두무 바이러스(Ndumu virus), 픽수나 바이러스(Pixuna virus), 토네이트바이러스(Tonate virus), 트리니티 바이러스(Triniti virus), 우나바이러스(Una virus), 웨스턴 말뇌척수염바이러스(Western equine encephalomyelitis virus), 와타로아바이러스(Whataroa virus), 신드비스바이러스(Sindbis virus)(SIN), 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki forest virus)(SFV), 베네주엘라 말 뇌척수염 바이러스(Venezuelan equine encephalomyelitis virus)(VEE), 및 로스 리버 바이러스(Ross River virus)를 포함한다.

아미노산 링커: 본 명세서에서 사용되는 "아미노산 링커" 또는 그냥 "링커"는 항원 또는 항원 결정기를 제 2 결합부와 결합시키거나, 더욱 바람직하게는 반드시 그런 것은 아니지만, 전형적으로는 하나의 아미노산 잔기와 같은 제 2 결합부를 사전에 포함하거나 함유한다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "아미노산 링커"는 아미노산 잔기들로 구성된 아미노산 링커가 본 발명의 바람직한 일례이지만, 상기 아미노산 링커는 아미노산 잔기들로만 구성되는 것을 의미하는 것은 아니다. 아미노산 링커의 아미노산 잔기는 바람직하게, 본 분야에 공지되어 있는 자연발생 아미노산 또는 자연발생되지 않은 아미노산, all-L 또는 all-D 또는 그의 혼합물로 구성된다. 그러나, 한 분자와 설프하이드릴 그룹 또는 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 링커도 본 발명에 포함된다. 상기 분자는 바람직하게 C₁-C₆ 알킬-, 사이클로알킬(C₅, C₆), 아릴 또는 헤테로아릴 부위를 포함한다. 그러나, 바람직하게 아미노산 링커외에도, C₁-C₆ 알킬-, 사이클로알킬(C₅, C₆), 아릴 또는 헤테로아릴 부위를 포함하고 아미노산(들)이 결여된 링커가 본 발명의 범위내 포함되어야 한다. 항원 또는 항원 결정기 또는 임의로 제 2 결합부와 아미노산 링커의 결합은 바람직하게 적어도 하나의 공유 결합, 더욱 바람직하게 적어도 하나의 펩티드 결합에 의한다.

안지오텐신 펩티드 부위: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "안지오텐신 펩티드 부위"는 부위이건 아니건 간에 생체내에서 자연발생 안지오텐신의 생물학적 활성(예: 수용체에서 자연발생(native) 호르몬 활성, 안지오텐신 I 및 II 모두를 포함)을 갖고, 자연발생 안지오텐신 펩티드의 이뮤노미믹(immunomimic)으로서 작용할 수 있다(즉, 면역학적으로 안지오텐신을 모사(mimic)하여 자연발생 안지오텐신 펩티드에 결합하는 항체를 생산한다). 따라서, 그러한 부위는 통상 안지오텐신 펩티드, 바람직하게 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I(식 Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu의 데카펩티드) 또는 안지오텐신 II(식 Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe의 옥타펩티드), 또는 기능적으로 동등한 그의 변이체를 포함할 수 있다. 그러므로, "안지오텐신 펩티드 부위"는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 "안지오텐신 펩티드"를 포함한다. 기능적으로 동등한 그의 변이체는 단일 또는 다중 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에 의한 안지오텐신 I 또는 II 서열 변형 및 아미노산 잔기가 화학적으로 변형되었지만, 안지오텐신은 보유하고 있는 서열을 포함한다. 기능적으로(또는 면역학적으로) 동등한 변이체는 자연발생의 생물학적 변이로서 발생할 수 있거나, 공지된 일반 기술, 예를 들면, 화학적 합성 또는 변형, 돌연변이화, 예로서, 특정위치돌연변이(site directed mutagenesis) 또는 무작위 돌연변이화 등에 의해 제조될 수 있다. 이 정의의 의도하에 변형과 관련된 중요한 특성은 안지오텐신 펩티드가 자연발생 안지오텐신의 이뮤노미믹으로서 작용할 수 있는 능력을 보유한다는 것이다. 따라서, 예를 들면, 아미노산은 안지오텐신 펩티드 또는 그의 에피토프(들)의 물리화학적 성질, 예를 들면, 전하 밀도, 친수성/소수성, 크기 및 배위를 유지하므로써 면역학적 구조를 유지하는 또다른 것으로 대체될 수 있다. "첨가" 변이는 단일 또는 다중 아미노산의 N- 또는 C-말단 융합 및 서열내 삽입을 포함할 수 있다. 결실은 서열내일 수 있거나, N- 또는 C-말단로부터의 절단일 수 있다. 바람직한 결실 돌연변이는 N- 또는 바람직하게 C-말단 항체를 유도할 수 있는 것이다. 이 항체는 활성 안지오텐신 II의 생산은 저지하지만 항체와 결합한 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II는 분해할 수 있다.

안지오텐신 펩티드: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "안지오텐신 펩티드"는 바람직하게 자연발생된 안지오텐신 펩티드 및 그의 기능적으로 동등한 변이체, 모두를 포함한다. 그러므로, "안지오텐신 펩티드"는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 "안지오텐신 펩티드 부위"의 서브세트일 수 있다. 실질적으로, 주어진 안지오텐신 펩티드(또는 안지오텐신 펩티드 부위)의 변이체가 바람직하게 자연발생된 안지오텐신 펩티드와 "기능적으로 동등한" 것인지는 안지오텐신 펩티드의 생물학적 활성을 측정하는 다양한 에세이 방법에 의해 측정할 수 있다. 특정의 에세이 방법을 본 명세서에 기술하고, 다른 것 역시 본 분야의 당업자에게 친숙할 것이다.

항체: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "항체"는 에피토프 또는 항원 결정기에 결합할 수 있는 분자를 언급한다. 이 용어는 전체 항원 및 그의 항원-결합 단편을 포함하며, 단쇄 항체를 포함하는 것을 의미한다. 항체는 인간 항원 결합 항체 단편을 포함하고 제한하는 것은 아니지만 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, 디설파이드-결합 Fvs(sdFv) 및 VL 또는 VH 영역을 포함하는 단편을 포함한다. 항체는 조류 및 포유동물을 포함하는 동물로부터 기원하는 것일 수 있다. 바람직하게, 항체는 포유동물 예로서, 인간, 쥐, 래빗, 염소, 기니 피그, 낙타, 말 등, 또는 다른 적절한 동물, 예로서 닭이다. 본 명세서에서 사용되는 바, "인간" 항체는 인간 이뮤노글로블린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 인간 이뮤노글로블린 라이브러리 또는 하나 이상의 인간 이뮤노글로블린이 도입되었지만, 내인성 이뮤노글로블린은 발현시키지 않는 동물로부터 분리된 항체를 포함한다[U. S. Patent No. 5,939, 598에 기재되어 있고, 이는 전체적으로 참고문헌으로서 인용된다].

항원: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "항원"은 항체 또는 MHC 분자에 의해 제시(present)되는 경우 T 세포 수용체(TCR)에 의해 결합할 수 있는 분자를 언급한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "항원"은 또한 T-세포 에피토프를 포함한다. T- 세포 에피토프는 적혈구를 제외한 신체 모든상에 존재하는 MHC I 부류, 또는 면역세포 및 특히 항원제시세포상에 존재하는 II 부류와 관련하여 T-세포 수용체에 의해 인식된다. 인식 이벤트에 의해 T-세포는 활성화되고 연속하여 T-세포 증식, 시토카인 분비, 퍼포린 분비 등과 같은 효과기(effector) 메카니즘을 일으킨다. 항원은 또한 면역계에 의해 인식될 수 있고/거나 B- 및/또는 T- 림프구를 활성화시키는 체액면역반응 및/또는 세포면역반응을 유도할 수 있다. 그러나, 적어도 특별한 경우에는 항원은 T_H 세포 에피토프를 포함하거나 이에 결합되어 있고 어쥬번트중에 제공된다. 항원은 하나 이상의 에피토프(B- 및 T-에피토프)를 포함할 수 있다. 상기 언급한 특이적 반응은 항원은 바람직하게는 전형적으로 고도로 특이적인 방식으로 그에 상응하는 항체 또는 TCR과 반응하지만 다른 항원에 의해 유발될 수 있는 다수의 다른 항체 또는 TCR과 반응하지 않는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 항원은 또한 여러 개채 항원의 혼합물일 수 있다.

항원 결정기: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "항원 결정기"는 B- 또는 T-림프구에 의해 특이적으로 인식되는 항원의 일부분을 언급한다. B-림프구는 항체 생산을 통해 외부 항원 항원 결정기에 대하여 반응하지만, T-림프구는 세포 면역 매개물질이다. 따라서, 항원 결정기 또는 에피토프는 항체, 또는 MHC와 관련하여, T-세포 수용체에 의해 인식되는 항원의 일부분이다. 항원 결정기는 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 알레르겐 또한 척추동물에서 항원으로서 작용한다.

결합(Association): 본 명세서에서 사용되는 바, 제 1 및 제 2 결합부에 적용되는 바 용어 "결합"은 바람직하게 적어도 하나의 비펩티드성 결합인 제 1 및 제 2 결합부의 결합을 언급한다. 결합성은 공유, 이온, 소수성, 극성 결합 또는 그의 조합일 수 있고, 바람직한 결합은 공유 결합이다.

제 1 결합부: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "제 1 결합부"는 항원 또는 항원 결정기상에 위치하는 제 2 결합부가 결합할 수 있는, 비자연발생 또는 자연발생된 코어 입자의 인자를 언급한다. 제 1 결합부는 단백질, 폴리펩티드, 아미노산, 펩티드, 당, 폴리뉴클레오티드, 천연 또는 합성 폴리머, 2차 대사물질 또는 화합물(바이오틴, 형광물질, 레티놀, 디곡시게닌, 금속 이온, 페닐메틸설포닐플루오라이드), 또는 그의 배합물, 또는 그의 화학적 반응 그룹일 수 있다. 제 1 결합부는 전형적이며 바람직하게 코어 입자, 예를 들면, 바람직하게 바이러스성 입자와 같은 코어 입자의 표면상에 위치한다. 다중 제 1 결합부는 전형적으로 반복적 배열로 코어 및 바이러스성 입자 각각의 표면상에 존재한다.

제 2 결합부: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "제 2 결합부"는 코어 입자 및 바이러스성 입자, 각각의 표면상에 위치하는 제 1 결합부가 결합할 수 있는 항원 또는 항원 결정기와 결합되어 있는 요소를 언급한다. 항원 또는 항원 결정기의 제 2 결합부는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 당, 폴리뉴클레오티드, 천연 또는 합성 폴리머, 2차 대사물질 또는 화합물(바이오틴, 형광물질, 레티놀, 디곡시게닌, 금속 이온, 페닐메틸설포닐플루오라이드), 또는 그의 배합물, 또는 그의 화학적 반응 그룹일 수 있다. 적어도 하나의 제 2 결합부는 항원 또는 항원 결정기상에 존재한다. 따라서, 용어 "적어도 하나의 제 2 결합부를 포함하는 항원 또는 항원 결정기"는 적어도 항원 또는 항원 결정기 및 제 2 결합부를 포함하는 항원 또는 항원 구성체를 언급한다. 그러나, 특히 비자연발생 기원, 즉 항원 또는 항원 결정기내에서 자연적으로 발생된 것이 아닌 제 2 결합부의 경우 이들 항원 또는 항원 구성체는 "아미노산 링커"를 포함한다.

결합(Bound): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "결합"은 예를 들면 화학적 커플링에 의한 공유결합 또는 부착, 또는 예를 들면, 이온간 상호작용, 소수성 상호작용, 수소 결합 등의 비공유결합 부착을 언급한다. 공유 결합은 예를 들면, 에스테르, 에테르, 포스포에스테르, 아미드, 펩티드, 이미드, 탄소-황 결합, 탄소- 인 결합 등일 수 있다. 용어 "결합"은 예로서 용어 "커플링," "융합(fused)" 및 "부착(attached)"보다 광범위하다.

코트 단백질(들): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "코트 단백질(들)"은 박테리오파지 또는 RNA-파지의 캡시드 어셈블리내 혼입될 수 있는 박테리오파지 또는 RNA-파지의 단백질을 언급한다. 그러나, RNA-파지의 코트 단백질 유전자중 특정 유전자 산물을 언급하는 경우 용어 "CP"를 사용한다. 예를 들면, RNA-파지 Qβ의 코트 단백질 유전자중 특정 유전자 산물은 "Qβ CP"로 언급되고, 박테리오파지 Qβ 의 "코트 단백질"은 "Qβ CP" 및 A1 단백질을 포함한다. 박테리오파지 Qβ의 캡시드는 주로 Qβ CP과 소수의 A1 단백질로 구성된다. 유사하게, VLP Qβ 코트 단백질은 주로 Qβ CP와 소수의 A1 단백질을 포함한다.

코어 입자: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "코어 입자"는 고유의 반복적 구조를 갖는 단단한 구조를 언급한다. 본 명세서에서 사용되는 바 코어 입자는 합성 과정의 산물 또는 생물학적 산물일 수 있다.

유효량: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "유효량"은 원하는 생물학적 효능을 얻기 위해 필요하거나 충분한 양을 언급한다. 조성물의 유효량은 이러한 선택된 결과를 초래하는 양일 것이며, 이는 본 분야의 기술자에 의해 일반적으로 측정될 수 있다. 예를 들면, 면역결핍 치료를 위한 유효량은 면역계를 활성화시켜 항원에 노출되었을 때 항원 특이성 면역 반응을 발생시키기에 필요한 양일 수 있다. 이 용어는 "충분량"과 유사한 의미를 갖는다.

특정 적용에 대한 유효량은 치료하고자 하는 질환 또는 이상, 투여되는 특정 조성물, 대상의 크기, 및/또는 질환 또는 이상의 경중도와 같은 인자에 의해 달라질 수 있다. 본 분야의 기술자는 부적절한 실험을 요하지 않으면서 본 발명의 특정 조성물의 유효량을 실험적으로 측정할 수 있다.

에피토프: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "에피토프"는 각개 항체 또는 T-세포 수용체에 의해 인식되어 항체 또는 T-세포 수용체가 결합하는 특정 영역, 부위 또는 분자 구조인 기본 요소 또는 가장 작은 유니트를 언급한다. 항원은 수개의 에피토프로 구성될 수 있지만, 합텐(hapten)은 전형적으로 에피토프를 거의 갖지 않을 수 있다.

융합: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "융합"은 코딩 뉴클레오티드 서열의 인프레임(in-frame) 조합에 의한 하나의 폴리펩티드중 상이한 기원의 아미노산 서열의 조합을 언급한다. 용어 "융합"은 명확하게 하나의 말단에 대한 융합외에도 내부 융합, 즉 폴리펩티드 쇄내의 상이한 기원의 서열의 삽입을 포함한다.

이종 서열: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "이종 서열"은 일반적으로 핵산 또는 단백질과 함께 발견되지 않는 핵산 또는 단백질의 제 2 서열을 언급하고, 이는 통상 서열에 첨가되어 특정 성질을 제공한다. 예를 들면, 이종 아미노산은 단백질 정제를 목적으로 하거나, 제 1 결합부로서 작용시키기 위하여 재조합 캡시드 단백질에 첨가될 수 있다.

면역반응: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "면역반응"은 항원과 같은 분자 또는 화합물에 대하여 지시되는 개채의 면역계에 의한 어느 작용을 언급한다. 포유동물에서 면역반응은 세포의 활성 및 시토카인 및 항체와 같은 가용성 분자의 생산을 포함한다. 따라서, 이 용어는 B-및/또는 T-림프구의 활성화 및/또는 증식을 일으키는 체액 면역반응 및/또는 세포 면역반응을 포함한다. 그러나, 일부에서는 면역반응의 강도가 낮아 본 발명에 따른 적어도 하나의 물질을 사용하는 경우에만 면역반응을 검출할 수 있다. "이뮤노겐"은 생체 유기체의 면역계를 자극하여 하나 이상의 면역계 기능을 증가시키고 면역원성 인자(agent)로 향하게 하기 위하여 사용되는 인자를 언급한다. "면역원성 폴리펩티드"는 어쥬번트 존재 여하에 상관없이 단독으로 또는 캐리어에 결합하여 세포 및/또는 체액 면역반응을 유도하는 폴리펩티드이다.

면역 이탈(immune Deviation): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 면역 이탈은 이전의 면역 반응과 상이한 성질의 면역 반응을 자극하는 것을 언급한다. 예를 들면, 알레르겐에 노출시 IgE 항체를 생산하도록 하는 각 개체의 알레르겐에 대한 T_H2 면역반응은 본 발명에 의해 유도되어 알레르겐에 대한 T_H1 면역반응을 형성할 수 있다. T_H1 반응은 알레르긴 유도성 T_H2 반응을 상쇄시켜 알레르기성 질환을 완화시킬 것이다.

면역치료제: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "면역치료제"는 질병, 질환 또는 이상 치료를 위한 컨쥬게이트를 언급한다. 더욱 특히, 이 용어는 유리한 면역 반응이 백신화에 의해 형성되는 치료법을 언급하기 위하여 사용된다.

면역학적 유효량: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "면역학적 유효량"은 개체내로 도입되었을 때 개체내에서 면역반응을 유도하기에 충분한 컨쥬게이트의 양을 언급한다. 면역학적으로 유효하기 위하여 필요한 컨쥬게이트의 양은 컨쥬게이트, 컨쥬게이트중 다른 성분(예: 어쥬번트)의 존재, 항원, 면역화 경로, 개체,이전의 면역 또는 생리 상태 등을 포함하는 다수의 인자에 따라 달라진다.

개체: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "개체"는 다세포 유기체를 언급하고, 식물 및 동물을 포함한다. 바람직한 다세포 유기체는 동물이고, 더욱 바람직한 것은 척추동물이며, 더욱더 바람직한 것은 포유동물이고, 가장 바람직한 것은 인간이다.

분리(isolated): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "분리"가 분자와 관련하여 사용되는 경우, 이 용어는 분자가 그 본래의(native) 환경으로부터 제거된 것을 의미한다.예를 들면, 살아있는 동물내 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "분리"된 것이 아니지만, 그 자연상태의 공존 물질로부터 분리(separa)되어진 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "분리된" 것이다. 또한, 벡터에 포함된 재조합 DNA 분자는 본 발명의 목적을 위하여 분리된 것으로 판단된다. 분리된 RNA 분자는 DNA 및 RNA 분자의 시험관내 또는 생체내 RNA 복제 산물을 포함한다. 또한 분리된 핵산 분자는 합성 생산된 분자를 포함한다. 추가로, 재조합 숙주 세포내 포함된 벡터 분자 역시 분리된 것이다. 따라서, "분리"된 모든 분자가 "정제"될 필요는 없다.

면역치료제: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "면역치료제"는 면역 분자를 포함하고/거나 질병 또는 질환 치료를 위해 면역반응을 유도하는 컨쥬게이트를 언급한다.

개체: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "개체"는 다세포 유기체를 언급하고, 식물 및 동물을 포함한다. 바람직한 다세포 유기체는 동물이고, 더욱 바람직한 것은 척추동물이며, 더욱더 바람직한 것은 포유동물이고, 가장 바람직한 것은 인간이다.

낮음 또는 검출불가: 본 명세서에서 사용되는 바, 유전자 발현 수준과 관련하여 사용되는 용어 "낮음 또는 검출불가"는 유전자가 최대로 유도되었을 때 나타나는 것보다 현저히 낮거나(예: 적어도 5개 낮음) 하기 실시예에서 사용되는 방법으로는 용이하게 검출할 수 없는 발현 수준을 언급한다.

렉틴: 본 명세서에서 사용되는 바, 특이적 모노- 또는 올리고뉴클레오티드에 대하여 결합부를 갖고 특히 콩과 식물의 종자, 및 다수의 다른 식물 및 동물 공급원으로부터 수득된 단백질. 예를 들면 당단백질 연구에서 분석제 또는 표본제(preparative agent)로서 광범위하게 사용되고 있는 콘카나발린 A 및 맥아응집소를 포함한다

미모톱(mimotope): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "미모톱"은 항원 또는 항원 결정기에 대한 면역반응을 유도하는 물질을 언급한다. 일반적으로, 용어 미모톱은 특정 항원과 관련하여 사용될 것이다. 예를 들면, 포스포리파제 A₂(PLA₂)에 대한 항체 생산을 유도하는 펩티드는 항체가 결합하는 항원 결정기의 미모톱이다. 미모톱은 면역반응이 유도되는 항원 또는 항원 결정기와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 갖지 않을 수 있거나 그의 구조적 특성을 공유하거나 공유하지 않을 수 있다. 특정 항원 또는 항원 결정기에 대한 면역반응을 유도하는 미모톱을 형성하고 확인하는 방법은 본 분야에 공지되어 있고, 본 명세서에 기술한다.

뮤테인: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "뮤테인"은 제공된 참고용(예: 자연발생, 야생형 등) 폴리펩티드와 하나 이상의 아미노산이 상이한 단백질 또는 폴리펩티드를 언급한다.

자연발생 기원: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "자연발생 기원"은 전체 또는 그의 일부가 합성된 것이 아니고 자연적으로 존재하거나 생산된 것을 의미한다. 바람직하게, 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "자연발생 기원"은 전체가 합성된 것이 아니고 자연적으로 존재하거나 생산된 것을 의미한다.

비자연발생: 본 명세서에서 사용되는 바, 이 용어는 통상 자연으로부터의 것이 아닌 것, 더욱 특히, 인공을 의미한다.

비자연적으로 발생된 분자 골격(scaffold): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "비자연적으로 발생된 분자 골격"은 제 1 결합부의 단단하고 반복적 어레이를 제공하기 위하여 인공으로 제조된 어느 산물을 언급한다. 반드시 필요한 것은 아니지만, 이상적으로 제 1 결합부는 기하학적으로 배열되어 있다. 비자연적으로 발생된 분자 골격은 유기 또는 무기성일 수 있고 부분적으로 또는 전체적으로 생물학적 공정을 통해 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 비자연적으로 발생된 분자 골격은 (a) 자연발생 또는 비자연발생 기원의 코어 입자; 및 (b) 적어도 하나의 제 1 결합부를 포함한다. 비자연발생적 기원: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "비자연발생적 기원"은 일반적으로 합성 또는 자연으로부터 기원한 것이 아닌 것을 의미하고; 더욱 특히 이 용어는 인공의 것을 의미한다.

정돈된 반복 항원 또는 항원 결정기 어레이: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "정돈된 반복 항원 또는 항원 결정기 어레이"는 전형적이고, 바람직하게는 각각 코어 입자 및 바이러스성 입자에 관하여 항원 또는 항원 결정기의 균일한 공간 배열을 특징으로 하는 통상의 항원 또는 항원 결정기의 반복적 패턴을 언급한다. 본 발명의 일면으로, 반복적 패턴은 기하학적 패턴일 수 있다. 적절하게 정돈된 반복 항원 또는 항원 결정기 어레이의 전형적이고 바람직한 예는 0.5 내지 30 나노미터, 바람직하게 5 내지 15 나노미터 간격으로 항원 또는 항원 결정기가 염격하게 반복적이고 거의 결정과 같은(paracrystalline) 구조를 갖는 것이다.

수동면역화: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "수동면역화"는 생상된 외인성 면역분자(예: 항체) 또는 세포(예: T-세포)를 동물내로 어느 경로를 통해 투여하는 것을 언급한다. 수동면역화는 이뮤노겐, 백신, 항원 또는 합텐-담체 컨쥬게이트 를 개체내로 도입하여 면역 반응을 유도한다는 점에서 "능동" 면역화와 상이하다.

섬모(pili): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "섬모"(단수 "필러스(pilus)")는 정돈된 반복적 패턴으로 조직화된 단백질 모노머(예: 필린 모노머)로 구성된 박테리아 세포의 세포외 구조를 언급한다. 또한, 섬모는 박테리아 세포의 숙주 세포 표면 수용체와의 결합, 세포내 유전자 교환, 및 세포-세포 인식과 같은 과정에 관여하는 구조이다. 섬모의 예는 1형 섬모, P-섬모, F1C 섬모, S-섬모, 및 987P-섬모를 포함한다. 추가로 섬모의 예를 본 명세서에 기술한다.

섬모성 구조(pilus-like structure): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "섬모성 구조"는 섬모와 유사한 성질을 갖고 단백질 모노머로 구성된 구조를 언급한다. "섬모성 구조"의 한 예는 자연발생된 섬모와 본질적으로 동일한 정돈된 반복적 어레이를 형성하지 않는 변형된 필린 단백질을 발현시키는 박테리아 세포에 의해 형성된 구조이다.

폴리펩티드: 본 명세서에서 사용되는 바 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에을 통해 함께 연결된 아미노산 잔기, 일반적으로 자연발생 아미노산 잔기로 구성된 폴리머를 언급한다. 폴리펩티드를 반드시 크기에 따라 제한할 수는 없지만 단백질 및 펩티드를 포함한다. 펩티드는 전형적 크기가 약 5 내지 약 50 아미노산, 또는 일반 범위이내의 아미노산의 폴리펩티드이다. 그러나 펩티드는 그보다 길 수 있고, 예를 들면, 120-150이하의 아미노산일 수 있다.

단백질 : 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 단백질은 일반적으로 크기가 약 5이상, 10이상 20이상, 25이상, 50이상, 75이상, 100이상, 200이상, 500이상, 1000이상, 2000이상 아미노산인 폴리펩티드를 언급한다. 주로 한정된 3차 구조를 갖지 않지만 언폴딩(unfolded)로 언급되는 다수의 상이한 구조를 채택할 수 있는 펩티드 및 폴리펩티드와 대조적으로, 단백질은 반드시 필요로 하지는 않지만, 일반적으로 폴딩(folded)으로 언급되는 한정된 3차 구조를 갖는다. 그러나, 펩티드도 한정된 3차 구조를 가질 수 있다.

정제: 본 명세서에서 사용되는 바, 분자와 관련하여 사용되는 경우 용어 "정제"는 정제하고자 하는 분자의 농도를 그의 자연환경, 또는 생산되거나 발견되거나 합성되는 환경에서 그와 관련된 분자에 대하여 상대적으로 증가시키는 것을 의미한다. 자연적으로 관련된 분자는 단백질, 핵산, 지질 및 당이지만, 일반적으로는 물, 완충액, 및 정제하고자 하는 분자의 정제를 촉진시키거나 무결성(integrity)을 유지하기 위하여 첨가되는 시약은 포함하지 않는다. 예를 들면, 올리고 dT 칼럼 크로마토그래피에서 수성 용매로 mRNA를 희석시킨 경우에 자연발생적으로 관련된 핵산 및 다른 생물학적 분자가 칼럼과 결합하지 않고 대상 mRNA 분자로부터 분리된다면 이 크로마토그래피에 의해 정제된다. 이 정의에 따라, 물질은 그 오염원에 대하여 상대적으로 5%이상, 10%이상, 20% 이상, 30%이상, 40%이상, 50%이상, 60%이상, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 98%이상, 99%이상, 또는 100%일 수 있다.

수용체: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "수용체"는 리간드로 불리는 또다른 분자와 상호작용할 수 있는 단백질 또는 당단백질 또는 그의 단편을 언급한다.

리간드는 생화학 또는 화학 분자 부류에 포함될 수 있다. 수용체는 반드시 막-결합 단백질을 필요로 하지 않는다. 가용성 단백질, 예로서 말토스 결합 단백질 또는 레티놀 결합 단백질이 수용체이다.

잔기: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "잔기"는 폴리펩티드 백본 또는 측쇄중 특정 아미노산을 의미한다.

재조합 숙주 세포: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "재조합 숙주 세포"는 본 발명의 핵산 분자가 하나 이상 도입된 숙주 세포를 언급한다. 숙주 세포는 진핵세포 생물, 예로서 포유동물, 곤충, 식물, 조류, 효소; 및 원핵세포 생물, 예로서 E. coli, B. 섭필러스(B. Subtilis) 등을 포함한다.

재조합 바이러스: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "재조합 바이러스"는 인공적으로 유전자가 변형된 바이러스를 언급한다. 이는 본 분야에 공지된 어느 바이러스를 포함한다. 용어는 특히 인공적으로 유전자가 변형된 알파바이러스, 및 가장 특히, 용어 인공적으로 유전자가 변형된 신비스 바이러스를 언급한다.

RNA-파지: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "RNA-파지"는 세균을 감염시키는 RNA 바이러스, 더욱 특히 세균을 감염시키는 싱글-스트랜드 (+)-센스 RNA 바이러스를 언급한다.

벡터: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "벡터"는 유전 물질을 숙주 세포에 전달하기 위하여 사용되는 인자(예: 플라스미드 또는 바이러스)를 언급한다. 벡터는 DNA 또는 RNA로 구성될 수 있다.

바이러스성 입자 (VLP): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "바이러스성 입자"는 바이러스 입자와 유사한 구조를 언급한다. 또한, 본 발명에 따른 바이러스성 입자는 바이러스 게놈 전체 또는 일부, 특히 바이러스 게놈의 복제성이고 감염성인 성분이 결여되어 있기 때문에 비복제성이고 비감염성이다. 본 발명에 따른 바이러스성 입자는 그의 게놈과 상이한 핵산을 포함할 수 있다. 전형적이고 바람직한 본 발명에 따른 바이러스성 입자는 바이러스 캡시드, 예로서 바이러스, 박테리오파지, 또는 RNA-파지의 바이러스 캡시드이다. 본 명세서에서 호환적으로 사용되는 바, 용어 "바이러스 캡시드" 또는 "캡시드"는 바이러스 단백질 서브유니트로 구성되는 고분자 어젬블리를 언급한다. 전형적이고 바람직하게, 바이러스 단백질 서브유니트는 각각 고유의 반복적 구조를 갖는 바이러스 캡시드 및 캡시드내로 어셈블링된다(여기에서, 구조는 전형적으로 구형 또는 튜브형이다). 예를 들면, RNA-파지 또는 HBcAg의 캡시드는 대칭된 정이십면체 구형을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "캡시드성 구조"는 충분하게 정돈 및 반복 정도를 유지하면서 정의된 의미의 캡시드 형태와 유사하지만, 전형적인 대칭적 어셈블리로부터 이탈된 바이러스 단백질 서브유니트로 구성된 고분자 어젬블리를 언급한다.

박테리오파지의 바이러스성 입자: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "박테리오파지의 바이러스성 입자"는 비복제성이고 비감염성이고, 박테리오파지의 복제수단(machinery)을 코딩하는 적어도 하나의 유전자 및 유전자들이 결여되어 있고, 전형적으로는 바이러스가 숙주와 결합하거나 그 내로 들어가는 것과 관련된 단백질 또는 단백질들을 코딩하는 유전자 또는 유전자들이 결여되어 있는, 박테리오파지의 바이러스성 입자를 언급한다. 그러나, 상기 유전자 또는 유전자들이 존재하지만 불활성화이기 때문에 박테리오파지의 바이러스성 입자를 비복제성이고 비감염성이 되도록 하는 박테리오파지의 바이러스성 입자를 포함하여야 한다.

RNA 파지 코트 단백질의 VLP: 임의로 숙주 RNA를 포함하고 RNA 파지 코트 단백질의 180 서브유니트의 자가-어셈블리로부터 형성된 캡시드 구조를 "RNA 파지 코트 단백질의 VLP"로 언급한다. 특정 일례는 Qβ 코트 단백질의 VLP이다. 특히, Qβ 코트 단백질의 VLP는 Qβ CP 서브유니트로부터만 어셈블리하거나(억제를 통해 장쇄의 A1 단백질의 어느 발현을 저지하는 TAA 종결 코돈을 포함하는 Qβ CP의 발현을 통해 형성, 참조 Kozlovska, T. M., et al., Intervirology 39 : 9- 15(1996)), 추가로 캡시드 어셈블리에 A1 단백질 서브유니트를 포함할 수 있다.

바이러스 입자: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "바이러스 입자"는 바이러스의 형태학적 형태를 언급한다. 일부 바이러스 타입에서 이는 단백질 캡시드로 둘러싸인 게놈을 포함하고; 다른 것은 추가 구조(예: 인벨럽, 테일(tail) 등)을 갖는다.

하나(One),한개(a), 또는 한개(an): 본 명세서에서 하나(One),한개(a), 또는 한개(an)가 사용되는 경우, 이는 달리 언급하지 않는 한 "적어도 하나의" 또는 "하나 이상"을 의미한다.

본 명세서에서 수치로서 사용되는 경우, 용어 "약"은 언급한 값의 ±10% 값(예: "약 50℃"은 45℃ 내지 55℃ 범위의 온도를 포함하고(45℃ 및 55℃도 포함); 유사하게, "약 100 mM"는 90 mM 내지 110 mM 범위의 농도를 포함한다(90 mM 및 110 mM도 포함).

개요

본 발명자는 어쥬번트를 사용하지 않은 경우에도 효능이 있는, 안지오텐신 펩티드에 특이적인 항체를 유도하기 위한 것으로 안고텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II를 특이적으로 표적화할 수 있는 것을 개발하게 되었다. 이뮤노겐는 바이러스성 입자(VLP) 또는 다른 코어 입자 예로서, 박테리아 섬모 또는 섬모성(pilus-like) 입자에 결합하는 안지오텐신 펩티드 부위로 구성된다. 이는 어쥬번트를 사용하지 않는 경우에도 항체 형성을 자극할 수 있는 고도로 면역원성의 반복적 항원 어레이를 가져온다. 사용되는 안지오텐신 펩티드 부위의 아미노산 서열에 따라, 높은 항체 역가가 유도되고, 또한, 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II의 N- 또는 C-말단 말단에 대하여 특이적으로 유도될 수 있다. 한종의 안지오텐신 펩티드만 또는 그의 배합물을 특이적으로 표적화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 이뮤노겐은 RAS에 의해 생산되는 안지오텐신 펩티드 부위, 특히, 안지오텐신 II 및 그의 유도체 수준의 증가와 관련되는 이상을 퇴치하기 위한 면역치료 요법에서 사용될 수 있다.

본 발명의 컨쥬게이트 형성, 즉, 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위와 코어 입자(예: VLP)의 결합은 부착(attachment), 결합(linkage), 융합 또는 다른 결합, 공유결합 및 비공유결합에 의해 이루어진다. 일례로 VLP는 제 1 결합부를 포함하고, 유기 분자는 제 2 결합부를 포함한다. 유기 분자 사이의 결합은 제 1 및 제 2 결합부가 직접 연결되거나 제 3의 분자에 의해 이루어진다. 결합부는 자연적으로 발생하거나, 도입될 수 있다.

안지오텐신 펩티드 부위 및 코어 입자의 컨쥬게이트, 또는 본 발명에 의해 제공되는 바와 같은 컨쥬게이트를 포함하는 컨쥬게이트는 나타난 안지오텐신 펩티드 부위에 대하여 강력한 면역반응을 유도한다. 따라서, 본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트는 다양한 안지오텐신 펩티드 부위 또는 그의 유도체에 대한 면역반응을 유도하는데 유용하며, 따라서 동물용으로서 사용된다. 또한, 본 발명은 면역학적 유효량의 하나 이상의 컨쥬게이트 또는 본 발명의 컨쥬게이트와 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 백신에 관한 것이다. 본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트는 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위 또는 그의 유도체에 대하여 동물을 백신화시키는데 사용할 수 있다. 예방용 또는 치료용, 또는 상기 두 목적 모두를 위하여 사용할 수 있다. 이와 관련하여 컨쥬게이트 또는 컨쥬게이트에 대하여 형성된 면역 분자, 예로서 항체는 질환, 이상 또는 질병의 치료, 예방 또는 진단에 사용할 수 있다. 그러한 항체, 본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트 는 키트 성분으로서 유용하다.

따라서, 일면으로 본 발명은 정돈된 반복적 안지오텐신 펩티드 부위-캐리어 컨쥬게이트중 캐리어와 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위의 컨쥬게이트, 및 컨쥬게이트 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 본 발명의 컨쥬게이트 및 적어도 하나의 다른 성분, 적절하게 적어도 하나의 부형제 또는 담체 및 특히 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트는 안지오텐신 펩티드 부위에 대한 면역반응을 유도하는데 유용하다. 이러한 면역반응이 치료, 예방 및 진단용으로 유용한 항체 생산에 사용될 수 있다.

본 발명의 컨쥬게이트는 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위의 고도로 정돈된 반복적 어레이를 포함한다. 본 발명의 이 일면에 따른 컨쥬게이트 어레이는 제 1 결합부를 포함하는 (a)코어 입자, 및 제 2 결합부를 포함하는 (b) 안지오텐신 펩티드 부위를 포함하고, 여기에서, 구성요소 (a) 및 (b)는 제 1 및 제 2 결합부를 통해 결합하여 안지오텐신 펩티드 부위의 정돈된 반복적 어레이를 형성하게 된다.

본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트에서 적절하게 사용되는 코어 입자는 자연발생 또는 비자연발생될 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트에서 사용되는 자연발생된 코어 입자는 바이러스 입자, 바이러스성 입자, 및 섬모를 포함한다. 이들 자연발생된 코어 입자의 단백질은 자연발생되거나 재조합될 수 있다. 코어 입자상의 제 1 결합부는 자연발생적으로 발생하거나 화학적 수단 또는 재조합 수단에 의해 도입될 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트에서 사용되는 안지오텐신 펩티드 부위는 다양한 RAS 성분(즉, 다양한 안지오텐신 펩티드 부위 또는 그의 유도체)에 대한 면역반응을 유도하기에 적절한 것, 제한하는 것은 아니지만 바람직하게는 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I(식 Asp- Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu의 데카펩티드) 또는 안지오텐신 II(식 Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe의 옥타펩티드), 또는 본 명세서에서 기술된 안지오텐신 펩티드 부위를 포함하는 그의 기능상 동일한 변이체의 서열, 또는 그의 단편을 포함하거나, 또는 다르게는 상기로 구성된 안지오텐신 펩티드 부위를 포함한다. 안지오텐신 펩티드 부위상의 제 2 결합부는 자연발생적으로 발생하거나 화학적 수단 또는 재조합 수단에 의해 도입될 수 있다. 제 1 및 제 2 결합부 사이의 상호작용은 직접적이거나 예를 들면 링커와 같은 적어도 하나의 다른 분자를 포함할 수 있다. 추가로, 가교-결합 분자는 본 발명에 따라 제 1 및 제 2 결합부 결합을 위해 사용될 있다. 링커외의 가교-결합 분자가 전형적으로 사용된다.

본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트는 놀랍게도 다양한 안지오텐신 펩티드 부위에 대한 면역반응, 특히 항체 유도에 효과적이다. 따라서, RAS와 관련되는 질병, 질환, 또는 이상, 제한하는 것은 아니지만 고혈압, 뇌졸증, 경색증, 울혈심부전증, 신부전 또는 망막출혈을 치료 또는 예방하기 위한 동물의 면역화에 적절한 컨쥬게이트로 유용한다. 본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트로 면연화되어 생성된 항체는 또한 치료용 및 예방용으로 유용하다.

다른 일면으로 본 발명은 본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트를 사용하는 질환의 예방 및 치료방법을 제공한다. 또다른 일면으로 본 발명은 진단 및 스크린에 적절한 키트를 제공한다.

정돈된 반복적 어레이의 컨쥬게이트

본 발명은 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위의 정돈된 반복 어레이를 포함하는 컨쥬게이트, 및 컨쥬게이트의 컨쥬게이트를 제공한다. 추가로, 본 발명은 통상적으로 당업자가 다양한 목적으로, 바람직하게 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위 또는 그의 유도체에 대한 면역반응 유도를 위한 정돈된 반복적 어레이를 작제할 수 있도록 한다.

본 발명의 컨쥬게이트는 본질적으로 두개의 구성요소:(1) 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드; 및 (2) 적어도 하나의 결합을 통해 제 1 결합부에 결합할 수 있는 적어도 하나의 제 2 결합부를 포함하는 적어도 하나의 안지오텐신 펩티드 부위를 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된다.

비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드는 (a) (1) 비자연발생 기원의 코어 입자 및 (2) 자연발생 기원의 코어 입자로 구성된 그룹으로부터 선택되는 코어 입자; 및 (b) 적어도 하나의 공유 결합에 의해 코어 입자에 결합된 적어도 하나의 제 1 결합부를 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된다. 본 발명의 컨쥬게이트, 컨쥬게이트 및 방법에서 사용되는 코어 입자는 무기 분자, 바이러스 입자, 바이러스성 입자, 및 박테리아 섬모를 포함한다. 본 발명의 컨쥬게이트, 컨쥬게이트 및 방법에서 사용되는 안지오텐신 펩티드 부위는 (a) 안지오텐신 펩티드 부위내에서 비자연발생적으로 발생된 결합부; 및 (b) 안지오텐신 펩티드 부위내에서 자연발생적으로 발생된 결합부로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 제 2 결합부를 갖는다.

본 발명은 적어도 하나의 결합에 의한 제 2 결합부와 제 1 결합부의 결합에 의한 정돈된 반복적 배열을 제공한다. 따라서, 안지오텐신 펩티드 부위 및 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드는 이러한 제 1 및 제 2 결합부의 결합을 통해 정돈된 반복적 항원 어레이를 형성한다.

당업자는 특히 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드, 또는 특정 일례로 코어 입자에 결합하는 모든 부위의 배열이 균일하도록 안지오텐신 펩티드 부위 및 제 2 결합부를 디자인할 수 있다. 예를 들면, 단일의 제 2 결합부를 안지오텐신 펩티드 부위상에 위치시켜, 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드에 결합하는 모든 안지오텐신 펩티드 부위가 균일한 방식으로 위치하도록 디자인한다. 본 발명의 일례로 (비자연발생적으로 발생된 제 2 결합부를 가져오는) 하나 이상의 추가의 아미노산을 안지오텐신 펩티드 부위 서열의 C- 또는 N-말단에 가하여 본 발명에 따른 코어 입자와 지향식(oriented)의 정돈된 결합을 하도록 한다. 따라서, 본 발명은 규정된 순서로 반복적 패턴을 형성하는 방식으로 어느 안지오텐신 펩티드 부위를 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드상에 위치시키는 통상의 방법을 제공한다.

본 분야의 기술자에게는 명료한 바, 본 발명의 특정 일례는 원핵세포 및 진핵세포에서 클로닝, 중합효소연쇄반응, DNA 및 RNA 정제, 재조합 단백질의 발현 등과 같은 재조합 핵산 기술의 사용을 포함한다. 이 방법들은 본 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있고, 공개된 실험 방법 매뉴얼에서 용이하게 발견할 수 있다(예: Sambrook, J. et al., eds. , MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.(1989); Ausubel, F. et al., eds. , CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc.(1997)). 조직 배양 세포주 실험에 대란 기본 실험 기술(Celis, J. , ed. , Cell BIOLOGY, Academic Press, 2nd edition,(1998)) 및 항체-기초 기술(Harlow, E. and Lane, D. ,"Antibodies : A Laboratory Manual, "Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.(1988); Deutscher, M. P. ,"Guide to protein purification,"Meth. Enzymol. 128, Academic Press San Diego(1990); Scopes, R. K. ,"protein Purification Principles and Practice,"3 ed. , Springer-Verlag, New York(1994)) 또한 문헌에 적절하게 기술되어 있고, 이 모든 문헌은 전체적으로 참고문헌으로서 인용된다.

추가로, 유기 분자와 아미노산을 커플링시키는 기술 및 본 발명의 실행에 필요한, 적절한 제 2 결합부를 포함하는 안지오텐신 펩티드 부위의 유도체 제조 방법은 본 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 그러한 방법은 화학 교과서 및 문헌에서 볼 수 있고, 그러한 예는 하기를 포함하여 참고문헌으로서 인용된다; US Patent No. 5,876, 727; WO 99/61054; Isomura, S. et al. J. Org. Chem. 66: 4115-4121(2001); Matsushita, H. et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 57: 1006- 1010.(1974); Langone, J. L. and Van Vunakis, H., Methods Enzymol. 84: 628-640(1982); Wong, Chemistry of protein Conjugation and corss-Linking. CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla(1991.)

코어 입자 및 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드

일면에서, 본 발명은 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위의 정돈된 반복 어레이을 형성하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 제 1 및 제 2 결합부를 통해 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위에 코어 입자를 결합시켜 형성된다.

따라서, 본 발명의 특정 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트에서 한 구성요소는 코어 입자 및 제 1 결합부를 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드이다. 더욱 특히, 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드는 (a) 자연발생 또는 비자연발생 기원의 코어 입자 및 (b) 적어도 하나의 공유 결합에 의해 코어 입자에 연결된 적어도 하나의 제 1 결합부를 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된다.

코어 입자. 본 발명의 일면에서 코어 입자는 합성 폴리머, 지질 미셀 또는 금속을 포함한다. 그러한 코어 입자는 본 분야에 공지되어 있고, 이는 그로부터 신규한 본 발명의 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드를 구성하기 위한 기초를 제공한다. 합성 폴리머 또는 금속 코어 입자는 U. S. Patent No. 5,770, 380, and U. S. Patent No. 5,334, 394에 기술되어 있고, 이는 전체적으로 본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다. 적절한 금속은 제한하는 것은 아니지만 크롬, 루비듐, 철, 아연, 셀레늄, 니켈, 금, 은, 백금을 포함한다. 적절한 세라믹 금속은 제한하는 것은 아니지만 이산화 규소, 이산화 티탄, 산화알루미늄, 산화루테늄 및 산화 주석을 포함한다. 이 일면의 코어 입자는 제한하는 것은 아니지만, 탄소 및 적절한 폴리머, 예를 들면, 폴리스티렌, 나일론 및 니트로셀룰로오스를 포함하는 유기 물질로부터 제조될 수 있다. 나노결정 입자, 산화 주석, 산화티타늄 또는 탄소(다이아몬드)로부터 제조된 입자가 유용하다. 본 발명에 사용하기 위한 지질 미셀은 본 분야에 공지된 방법, 예를 들면, Baiselle and Millar(Biophys. Chem. 4 : 355-361(1975)) or Corti et al.(Chem. Phys. Lipids 38 : 197-214(1981)) or Lopez et al.(FEBS Lett. 426 : 314-318(1998)) or Topchieva and Karezin(J. Colloid Interface Sci. 213 : 29-35(1999)) more in et al.,(Nature 308: 457- 460(1984))에 기재된 방법에 의해 제조되고, 상기는 본 명세서에서 전체적으로 참고문헌으로서 인용된다.

본 발명의 일면에서 코어 입자는 자연발생 또는 비자연발생될 수 있는 생물학적 방법을 통해 제조된다. 예를 들면, 바이러스 및 박테리아 섬모 또는 섬모성 구조는 정돈된 반복적 구조로 구성된 단백질로부터 형성된다. 그러므로, 본 발명은 제한하는 것은 아니지만 바이러스, 바이러스성 입자, 박테리아 섬모, 파지, 바이러스 캡시드 입자 또는 그의 단편을 포함하는 유용한 코어 입자를 포함하는 컨쥬게이트, 컨쥬게이트 및 방법을 포함한다. 그런 특정 일례로, 단백질은 재조합일 수 있다.

특정 일례로, 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드의 코어 입자는 바이러스, 박테리아 섬모, 박테리아 섬모, 박테리오파지, 바이러스성 입자, 바이러스 캡시드 입자로부터 형성된 구조 또는 그의 재조합형을 포함한다. 정돈된 반복적 코트 및/또는 코어 단백질 구조를 갖는 본 분야에 공지된 바이러스는 본 발명의 방법, 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트에서 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드로서 사용하기 위하여 선택될 수 있다. 적절한 바이러스의 예는 제한하는 것은 아니지만 신드비스 및 다른 알파바이러스, 랍도바이러스(예: 베시쿨라 스토마티티스 바이러스(vesicular stomatitis virus))), 피코나바이러스(예: 인간 리노 바이러스(human rhino virus), 아키 virus), 토가바이러스(예: 루벨라(rubella) virus), 오르토믹소바이러스(예: 토고토(Thogoto) 바이러스, 바트켄(Batken) 바이러스, 조류독감(fowl plague) virus), 폴리오마바이러스(예: 폴리오마바이러스 BK, 폴리오마바이러스 JC, 조류 폴리오마바이러스 BFDV), 파보바이러스, 로타바이러스, 박테리오파지 Q , 박테리오파지 R17, 박테리오파지 M11, 박테리오파지 MX1, 박테리오파지 NL95, 박테리오파지 fr, 박테리오파지 GA, 박테리오파지 SP, 박테리오파지 MS2, 박테리오파지 f2, 박테리오파지 PP7, 박테리오파지 AP205, 노르워크 바이러스, 구저 질환 바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 담배 모자이크병 바이러스, 플라크 하우스(Flock House) 바이러스, 및 인간 유두종바이러스(예: Bachman, M. F. and Zinkernagel, R. M., Immunol. Today 17 : 553-558(1996)이 표 1 참조)를 포함한다. 본 발명의 더욱 특별한 일례로, 코어 입자는 로타바이러스의 재조합 단백질, 노르워크 바이러스의 재조합 단백질, 알파바이러스의 재조합 단백질, 박테리아 섬모 또는 섬모성 구조를 형성하는 재조합 단백질, 구저 질환 바이러스의 재조합 단백질, 레트로바이러스의 재조합 단백질, B형 간염 바이러스의 재조합 단백질(예: HBcAg), 담배 모자이크병 바이러스의 재조합 단백질, 플라크 하우스(Flock House) 바이러스의 재조합 단백질, 및 인간 유두종바이러스의 재조합 단백질를 포함하거나, 다르게는 상기로 구성될 수 있다.

본 발명의 컨쥬게이트, 컨쥬게이트 및 방법에서 사용되는 코어 입자는 추가로 상기 단백질의 하나 이상의 단편, 및 서로서로 결합하여 정돈된 반복적 항원 또는 항원 결정기 어레이를 형성할 수 있는 능력을 보유하는 상기 단백질의 변이체를 포함하거나, 다르게는 상기로 구성될 수 있다. 예를 들면, 공동 소유의 계류중인 U. S. patent application No: 10/050,902(출원인 2002년, 1월 18일, 본 명세서에서 전체적으로 참고문헌으로서 인용됨)에서 설명된 바와 같이, 코어 입자는 아미노산 서열 일치도 및 유사도, 및 서열 길이가 야생형 입자와 현저하게 상이한 인간 인간 HBcAg의 변이체 형태로부터 형성될 수 있다. 예를 들면, 흰기러기 및 오리를 감염시키는 B형 간염 바이러스 HBcAg의 아미노산 서열은 단백질 배열(alignment)이 어려운 포유동물을 감염시키는 바이러스 HBcAg의 것과 충분하게 상이하다. 그러나, 양 바이러스 모두는 정돈된 반복 항원 어레이를 형성하기에 적절한 능력을 보유하고 있다. 유사하게, HBcAg는 N- 말단 리더 서열 제거, 추가로 결실, 치환, 또는 서열의 첨가 후 전형적인 바이러스의 다중결합 입자를 형성할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 단백질이 상기 구조를 형성하는지를 측정하기 위하여 사용되는 방법은 겔 여과, 아가로스겔 전기영동, 수크로스 구배 원심분리 및 전자현미경검사(예: Koschel, M. et al., J. Virol 73 : 2153-2160(1999))를 포함한다.

제 1 결합부. 자연발생 여부에 상관없이, 본 발명의 컨쥬게이트, 컨쥬게이트 및 방법에서 사용되는 코어 입자는 일반적으로 적어도 하나의 공유 결합에 의해 자연발생이거나 비자연적으로 발생된 코어 입자에 결합하는 제 1 결합부를 포함하는 성분을 갖는다. 제 1 결합부를 포함하는 구성요소는 정돈된 반복적 어레이를 형성하기 위한 핵생성 부위를 제공하는 작위적 방식(non-random fashion)으로 코어 입자에 결합한다. 반드시 그러하지는 않지만, 이상적으로, 이 구성요소는 기하학적 체계(order)로 코어 입자에 결합한다. 제 1 결합부는 코어 입자의 자연발생 부분, 예를 들면, 제 2 결합부와 커플링하기에 적절할 수 있는 표면 노출된 아미노산 잔기일 수 있다. 예를 들면, 리신 및 시스테인은 아미노산 상의 반응성 그룹을 통해 비펩티드 결합을 형성할 수 있다. 다르게는 제 1 결합부를 포함하는 제 1 결합부는 화학 커플링에 의해 또는 재조합 분자의 디자인을 통해 코어 입자내로 도입될 수 있다. 제 1 결합부는 적어도 하나의 공유 결합에 의해 코어 입자에 결합된 것을 포함하는 어느 구성요소이거나, 그 상에서 발견할 수 있다.

제 1 결합부는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산(즉, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 잔기), 당, 폴리뉴클레오티드, 천연 또는 합성 폴리머, 2차 대사물질 또는 화합물(바이오틴, 형광물질, 레티놀, 디곡시게닌, 금속 이온, 페닐메틸설포닐플루오라이드), 또는 그의 배합물, 또는 그의 화학적 반응 그룹을 포함하거나, 다르게는 상기로 구성될 수 있다. 더욱 구체적인 일례로, 항원, 항체 또는 항체 단편, 바이오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 수용체, 수용체 리간드, 리간드, 리간드-결합단백질, 상호작용 류신 지퍼 폴리펩티드, 아미노 그룹, 아미노 그룹에 대하여 반응성인 화학 그룹; 카복실 그룹, 카복실 그룹에 대하여 반응성인 화학 그룹, 설프하이드릴 그룹, 설프하이드릴 그룹에 대하여 반응성인 화학 그룹, 또는 그의 배합물을 포함한다.

일면에서, 본 발명은 이종의 단백질, 펩티드, 항원 결정기 또는 특정의 반응성 아미노산 잔기를 포함하는 제 1 결합부를 포함하는 구성요소와 정돈된 반복적 바이러스 인벨럽 단백질 사이의 융합을 형성하기 위하여 바이러스를 유전공학적으로 이용한다. 본 분야의 기술자에게 공지된 다른 유전자 조작법은 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드의 작제에 포함될 수 있고; 예를 들면, 유전자 돌연변이를 통해 재조합 바이러스의 복제 능력을 제한하는 것인 바람직할 수 있다. 제 1 결합부 단백질을 포함하는 단백질로 융합시키기 위하여 선택된 바이러스 단백질은 조직적이고 반복적 구조를 가져야 한다. 조직적이고 반복적 구조는 바이러스 표면상에 0.5-30nm, 바람직하게 5-15nm의 간격으로 거의 결정과 같은(paracrystalline) 구조를 포함한다. 이러한 타입의 융합 단백질 형성은 바이러스 표면상에 다중의 정돈된 반복적 제 1 결합부를 형성할 것이다. 따라서, 그로부터 형성된 제 1 결합부의 정돈된 반복적 구조는 자연발생된 바이러스 단백질의 일반 구조를 반영한다.

본 분야의 기술자에게 이해되는 바와 같이, 제 1 결합부는 특정의 항원 또는 항원 결정기를 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드에 특이적으로 결합시킬 수 있는 어느 적절한 단백질, 폴리펩티드, 당, 폴리뉴클레오티드, 펩티드(아미노산), 자연발생 또는 합성 폴리머, 2차 대사물질 또는 그의 배합물이거나 그의 일부일 수 있다. 일례로, 결합부는 본 분야에 공지된 것으로부터 선택될 수 있는 단백질 또는 펩티드 이다. 예를 들면, 제 1 결합부는 리간드, 수용체, 렉틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 바이오틴, 에피토프 예로서, HA 또는 T7 태그, Myc, Max, 이뮤노글로블린 영역 및 제 1 결합부로서 유용할 수 있는 본 분야의 공지된 다른 아미노산 서열일 수 있다.

추가로, 본 분야의 기술자는 본 발명의 또다른 일례에서 제 1 결합부는 캡시드 단백질에 대한 인-프레임 융합 구성시 사용되는 제 1 결합부(예: 단백질 또는 폴리펩티드)를 수반하는 구성요소의 형성에 대하여 2차적으로 형성될 수 있다. 예를 들면, 본 분야에서 특정 방식으로 당화되는 것으로 공지된 인벨럽 단백질에 융합시키기 위하여 단백질이 사용될 수 있고 결과적으로 첨가된 당 부위는 항원의 제 2 결합부로서 작용하는 렉틴에 결합하여 바이러스 스캐폴드의 제 1 결합부로 작용할 수 있다. 다르게, 서열은 생체내에서 바이오틴화될 수 있고 바이오틴 부위는 본 발명의 제 1 결합부로 작용할 수 있거나, 서열은 제 1 결합부로서 작용할 수 있는, 시험관내에서의 상이한 아미노산 잔기의 화학적 변형을 겪게 된다.

본 발명의 구체적인 일례로, 제 1 결합부는 프레임내에서 B형 간염 캡시드(코어) 단백질(HBcAg)로 융합되는 JUN-FOS 류신 지퍼 단백질 영역이다. 그러나, 또한 본 분야의 당업자들은 다른 바이러스 캡시드 단백질이 본 발명의 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드에 제 1 결합부를 위치시키기 위한 융합 단백질 작제물로 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 다른 일례로, 제 1 결합부는 프레임내에서 HBcAg에 융합되는 리신 또는 시스테인 잔기로 선택된다. 또한, 본 분야의 당업자들은 다른 바이러스 캡시드 단백질 또는 바이러스성 입자가 본 발명의 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드에 제 1 결합부를 위치시키기 위한 융합 단백질 작제물로 사용될 수 있음을 이해할 것이다.

바이러스 입자. 본 발명의 일면으로, 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드는 재조합 알파바이러스, 및 더욱 특히, 재조합 신드비스 바이러스이다. 알파바이러스과의 여러 구성원, 신드비스(Xiong, C. et al., Science 243 : 1188-1191(1989); Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11 : 18-22(1993)), 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스(SFV)(Liljestrom, P. & Garoff, H., BiolTechnology 9: 1356-1361(1991)) 및 다른 것(Davis, N. L. et al., Virology 171 : 189-204(1989))은 상이한 단백질에 대한 바이러스-기초 발현 벡타로서(Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8 : 578-582(1997); Liljestrm, P. , Curr. Opin. Biotechnol. 5 : 495-500(1994)) 및 백신 개발을 위한 후보물질로서 주목을 받아왔다. 이종 단백질 발현 및 백신 개발을 위한 알파바이러스가 기재되어 있다(참조 U. S. Patent Nos. 5,766, 602; 5,792, 462; 5,739, 026; 5,789, 245; 및 5,814, 482; 본 명세서에서 전체적으로 참고문헌으로 인용된다). 본 발명의 일면에 따르 알파바이러스 스캐폴드 작제는 본 명세서에서 전체적으로 참고문헌으로 인용되는 상기 논문에 기술된 바와 같이 재조합 DNA 기술 분야에서 일반적으로 공지되어 있는 방법에 의해 수행될 수 있다. 다양한 재조합 숙주 세포는 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위 결합을 위한 바이러스-기초 코어 입자 생산에 이용될 수 있다.

패킹된 RNA 서열 또한 숙주 세포 감염에 사용될 수 있다. 이들 패킹 RNA 서열은 배양 배지에 가하여 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 비감염성 알파바이러스 알파바이러스 입자의 제조는 여러 출처, 예를 들면, "Sindbis Expression System", Version C(Invitrogen Corporation, Carlsbad CA; Catalog No. K750-1)에 기술되어 있다.

포유동물 세포를 재조합 숙주세포로 사용하여 바이러스-기초 코어 입자를 생산하는 경우, 이 세포는 일반적으로 조직 배양액에서 배양된다. 배양액내에서 세포를 배양하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다(참조; 예: Celis, J. , ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2nd edition,(1998); Sambrook, J. et al., eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.(1989); Ausubel, F. et al., eds. ,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc.(1997); Freshney, R. , CULTURE OF ANIMAL CELLS, A1an R. Liss, Inc.(1983)).

따라서, 본 발명은 바이러스, 바이러스성 입자, 파지, 바이러스 캡시드 입자 또는 그의 재조합 형태를 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된 바이러스-기초 코어 입자를 포함한다. 본 분야의 기술자는 코어 입자를 생산하고 그에 제 1 결합부를 결합시키는 것에 대한 지식을 갖고 있다. 코어 입자로서 B형 간염 바이러스성 입자, 특히 HBcAg로부터 어젬블리되거나 자가-어셈블리 된 것, 및 홍역 바이러스 캡시드 입자는 본 명세어세 참고문헌으로서 명확하게 인용되고 있는 WO 00/32227의 실시예 17 내지 22에 기술되어 있다. 일례로 JUN 류신 지퍼 단백질 영역 또는 FOS 류신 지퍼 단백질 영역을 본 발명의 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드에 대한 제 1 결합부로서 사용할 수 있다. 본 분야의 기술자는 각각 제 1 및 제 2 결합부로서 반응성 리신 잔기를 포함하는 인프레임 융합 펩티드 및 유전학적으로 융합된 시스테인 잔기를 수반하는 안지오텐신 펩티드 부위를 수반하는 B형 간염 코어 입자를 작제하는 방법을 이해할 것이다.

다른 일면에서, 본 발명의 컨쥬게이트에서 사용되는 코어 입자는 B형 간염 캡시드(코어) 단백질(HBcAg), HBcAg 단편, 또는 바이러스성 입자를 형성할 수 있는 다른 단백질 또는 펩티드로, 정돈된 어레이이고, 유리 시스테인 잔기를 제거하거나 그 갯수를 감소시키기 위하여 변형된 것으로 구성된다. Zhou 등(J. Virol. 66 : 5393-5398(1992)은 자연적으로 남아있는 시스테인 잔기가 제거되어 변형된 HBcAgs는 다중 구조와 결합하고 형성하는 능력을 보유하고 있다고 증명하였다. 따라서, 본 발명의 컨쥬게이트에 사용하기에 적절한 코어 입자는 자연적으로 남아있는 하나 이상의 시스테인 잔기가 결실되거나 또다른 아미노산 잔기(예: 세린 잔기)로 치환된 변현된 HBcAgs, 또는 그의 단편을 포함하는 것을 포함한다. 본 발명의 일면으로, 서열번호: 1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 그의 하위부분(subportion)을 포함하는 변형된 HBcAg를 사용하여 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드를 제조한다. 특히, 본 발명의 실시에서 사용하기 적절한 변형된 HBcAgs는 서열번호: 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질의 48번, 61번, 107번 및 185번 위치에 상응하는 위치의 하나 이상의 시스테인 잔기가 결실되거나 다른 아미노산 잔기(예: 세린 잔기)로 치환된 단백질을 포함한다. 본 분야의 기술자가 인지하고 있는 바와 같이, 서열번호: 1에 나타낸 것과 상이한 아미노산 서열을 갖는 HBcAg 변이체중 유사한 위치의 시스테인 잔기는 또한 결실되거나 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 변형된 HBcAg 변이체를 사용하여 본 발명의 백신 컨쥬게이트를 제조할 수 있다.

특정 조건하에서(예: 이질성이작용기성(heterobifunctional) 가교제를 사용하여 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위를 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드에 결합시키는 경우), HBcAg중 유리 시스테인 잔기가 존재하는 경우 독소 성분이 코어 입자와 공유적으로 커플링하고, 모노머는 가교결합하여 무제한적으로 여로 종을 형성할 수 있다고 판단된다. 또한, 여러 경우에서 이들 독소 성분은 본 발명의 컨쥬게이트상에서 시행되는 분석에서는 검출할 수 없다. 이는 독소 성분과 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드가 공유적으로 커플링하므로써 독소 성분이 HBcAgs의 상이한 시스테인 잔기, 일부 경우에는 시스테인 잔기외의 것과 결합하는 다양한 종의 집단을 형성하기 때문이다. 다시 말하면, 각 HBcAg의 각 유리 시스테인 잔기는 독소 성분에 공유 결합하지 않을 것이다. 추가로 다수의 경우에는 특정한 HBcAg의 시스테인 잔기중 어느 것도 독소 성분에 공유 결합하지 않을 것이다. 따라서, 독소 성분은 분자의 혼합 집단으로 존재하기 때문에 검출하기 어려울 수 있다. 그러나, 독소 성분을 포함하는 HBcAg 종을 개체에 투여하는 것은 잠재적으로 심각한 부작용을 일으킬 수 있다.

본 분야에서는 유리 시스테인 잔기가 다수의 화학적 부작용에 관여할 수 있다고 공지되어 있다. 이 부작용은 디설파이드 교환, 예를 들면, 다른 물질과의 병용 요법에서 주사되거나 형성된 화학 물질 또는 대사물질과의 반응, 또는 직접적인 산화 및 UV 노출시 뉴클레오티드와의 반응을 포함한다. 특히, HBcAgs는 핵산에 결합하는 경향이 있다는 사실을 고려할 때 독소 첨가 물질이 형성될 수 있다. 광범위한 범위의 분자량을 갖는 산물이 분포하기 때문에 유리 시스테인 및 헤테로이작용기성 가교-결합을 포함하는 HBcAgs을 사용하여 제조된 캡시드를 사용하여 항원-캡시드 컨쥬게이트중 독소 산물을 검출하는 것은 어렵다. 따라서 개별적으로 낮은 농도로 존재할 수 있지만 함께인 경우에는 독성 수준에 도달할 수 있는 독소 첨가 물질은 다수의 종 사이에 분포할 수 있다.

상기와 관련하여, 자연발생적으로 남아있는 시스테인 잔기가 제거되어 변형된 백신 컨쥬게이트중 HBcAgs를 사용하는 것은 안지오텐신 펩티드 부위가 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드에 결합한 경우 독소 종류가 결합하는 부위가 양적으로 감소하거나 모두 제거된다는 잇점을 갖는다. 또한, 고농도의 가교제(crosslinker)를 사용하여 HBcAg 모노머의 무제한적 가교결합 종 여럿(즉, 가교-결합 모노머 HbcAgs의 다양한 혼합물)을 생산한다는 단점없이 고도로 데코레이트된 입자를 생산할 수 있다.

다수의 실시에 사용하기에 적절한 다수의 자연발생된 HBcAg 변이체가 확인되었다. Yuan 등(J. Virol. 73 : 10122-10128(1999))은 예를 들면, 서열번호: 1의 97번 위치에 상응하는 위치의 이소류신 잔기가 류신 잔기 또는 페닐 알라닌 잔기로 대체된 변이체를 기술하였다. 다수의 HBcAg 변이체, 및 수개의 B형 간염 코어 항원 전구체 변이체의 아미노산 서열은 GenBank 리포트 AAF121240, AF121239, X85297, X02496, X85305, X85303, AF151735, X85259, X85286, X85260, X85317, X85298, AF043593, M20706, X85295, X80925, X85284, X85275, X72702, X85291, X65258, X85302, M32138, X85293, X85315, U95551, X85256, X85316, X85296, AB033559, X59795, X8529, X85307, X65257, X85311, X85301, X85314, X85287, X85272, X85319, AB010289, X85285, AB010289, AF121242, M90520, P03153, AF110999, 및 M95589에 기술되어 있고 이들 각각은 전체적으로 참고문헌으로서 본 명세서에서 인용된다. 이들 HBcAg 변이체는 서열번호: 1에서 위치 12,13, 21,22, 24,29, 32, 33,35, 38,40, 42,44, 45,49, 51,57, 58,59, 64,66, 67,69, 74,77, 80,81, 87,92, 93, 97,98, 100,103, 105, 106, 109,113, 116,121, 126,130, 133,135, 141,147, 149,157, 176,178, 182 및 183번에 위치하는 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하는, 여러 위치의 아미노산 서열에서 상이하다.

추가로, 본 발명의 조성물에 사용하기 적절하고 본 명세서에 따라 추가로 변형될 수 있는 HBcAg 변이체는 WO 00/198333, WO 00/177158 및 WO 00/214478에 기술되어 있고, 이는 전체적으로 참고문헌으로서 본 명세서에서 인용된다.

본 발명에서 사용하기 적절한 HBcAgs는 결합하여 정돈된 반복적 항원 어레이를 형성할 수 있는 한 어느 유기체로부터 유도될 수 있다. 일반적으로 프로세싱된 HBcAgs(즉, 리더 서열이 결여된 서열)를 본 발명의 백신 컨쥬게이트에 사용할 것이다. 본 발명은 백신 컨쥬게이트, 및 이 컨쥬게이트를 사용하는 방법을 포함하고, 이는 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드를 제조하기 위하여 상기 기술한 변이체 HBcAg를 사용한다. 결합하여 다이머 또는 다중 구조를 형성할 수 있는 추가의 HBcAg도 본 발명의 범위내 포함된다. 따라서, 본 발명은 서열 번호 1을 포함하는 상기 서열에 나타낸 아미노산 서열중 어느 것과 적어도 약 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 또는 약 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된 HBcAg 폴리펩티드, 및 및 적절하게는 프로세싱되어 N-말단 리더 서열이 제거된 이들 단백질 형태를 포함하는 백신 컨쥬게이트를 포함한다.

폴리펩티드의 아미노산 서열이 상기 나타낸 아미노산 서열중 하나와 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 또는 약 99% 일치하는 아미노산 서열, 또는 그의 하위부분을 갖는지는 Bestfit 프로그램과 같이 공지된 컴퓨터 프로그램을 통상적으로 사용하여 결정할 수 있다. 특정 서열이 본 발명에 따른 참고 아미노산 서열과 예를 들면, 약 95% 일치하는지 결정하기 위하여 Bestfit 또는 어느 다른 서열 배열(alignment) 프로그램을 사용하는 경우 파라미터를 세팅하여 일치도(%)를 전장의 참고 아미노산 서열에 대하여 계산하고 참고 아미노산 서열중 전체 아미노산 잔기의 5% 이하의 상동성의 차는 인정한다. 이러한 방식으로, 서열번호: 1의 HBcAg 및 다른 HBcAg의 아미노산 서열을 비교할 수 있다.

상대적으로 유사한 단백질을 비교하는 경우, 서열번호 1중 특정 위치에 상응하는 위치에 존재하는 HBcAg 변이체의 아미노산 잔기에 대한 언급은 서열번호:1에 나타낸 아미노산 서열중 그 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 참고한다. 이들 HBcAg 변이체 사이의 상동성은 포유동물을 감염시키는 B형 간염 바이러스중에서 대체로 매우 높기 때문에 본 분야의 기술자는 서열번호:1에 나타낸 아미노산 서열과 특정 HBcAg의 변이체의 것을 리뷰하고 "상응하는" 아미노산 잔기를 확인하는 것이 어렵지 않을 것이다. 예를 들면, 서열번호: 1과 우드척을 감염시키는 바이러스로부터 유래된 HBcAg의 아미노산을 비교할 때, 서열번호 1의 아미노산 잔기 155번 및 156번 사이의 서열에 3개의 아미노산 잔기 삽입이 존재한다는 것을 용이하게 식별할 수 있을 것이다.

그러나, 배열이 어려운 경우, 본 분야의 기술자는 서열내 특정 아미노산 또는 모티프의 중요성을 인지할 것이다. 예를 들면, 인간 바이러스로부터의 HBcAg의 아미노산 서열은 오리 바이러스와 상이하여 배열이 어렵지만 본 분야의 기술자는 본 발명의 백신 컨쥬게이트에 포함되기 전에 보존 시스테인 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되었거나 결실되었다는 것을 인지할 것이다.

일례로, 서열번호:1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질중 48번 및 107번 위치의 시스테인 잔기는 결실되거나 다른 아미노산 잔기로 치환되지만 61번 위치의 시스테인은 제자리에 남아있다. 또한, 이어서 변형된 폴리펩티드를 사용하여 본 발명의 백신 컨쥬게이트를 제조한다.

본 발명에 사용할 수 있는 바람직한 B형 간염 바이러스성 입자는 예를 들면, WO 00/32227, 특히 실시예 17 내지 19 및 21 내지 24, 및 WO 01/85208, 특히 실시예 17 내지 19, 21 내지 24, 31 및 41, 및 2002년 1월 18일에 현 양수인에 의해 출원된 계류중인 U. S. Application No. 10/050,902에 기술되어 있다. 후자 출원의 경우에는 특히, 실시예 23, 24, 31 및 51에 기술되어 있다. 3개의 문서 모두 전체적으로 참고문헌으로서 인용된다.

2002년 1월 18일에 현 양수인에 의해 출원된 U. S. Application No. 10/050,902의 실시예 31에 기술한 바와 같이, 용매에 영향을 받기 쉬운 48번 및 107번 위치의 시스테인 잔기는 예를 들면, 특정위치돌연변이에 의해 제거될 수 있다. 한 예로, 2002년 1월 18일에 현 양수인에 의해 출원된 U. S. Application No. 10/050,902(참고문헌으로서 인용된다)에 기술된 바와 같이 작제될 Cys-48-Ser, Cys-107-Ser HBcAg 더블 돌연변이는 E. coli에서 발현될 수 있다.

상기 기술한 바와 같이, 유리 시스테인 잔기를 제거하여 독소 성분이 HBcAg에 결합하는 부위, 동일하거나 이웃하는 HBcAg의 리신 및 시스테인 잔기의 가교-결합 부위의 수를 감소시킨다. 다이머 형성에 관여하고 또다른 HBcAg의 61번 위치의 시스테인과 디설파이드 브릿지를 형성하는 61번 위치의 시스테인은 일반적으로 본 발명의 HBcAg 다이머 및 멀티머의 안정화를 위해 본래 위치에 남겨질 것이다. (1) 유리 시스테인 잔기를 포함하는 HBcAgs 및 (2) 유리 시스테인 잔기가 요오드아세트아미드(iodacetamide)와 비반응성화된 HBcAgs를 사용하여 시행된 가교-결합 실험은 헤테로이작용기성 가교제 유도된 리신 측쇄, 및 유리 시스테인 잔기사이의 반응을 통한 HBcAgs 사이의 가교-결합을 일으킨다고 제시한다. 또한, HBcAg 서브유니트의 가교-결합이 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분할 될 수 없는 무제한적인 크기의 고분자 종을 형성한다는 것을 밝혀냈다.

안지오텐신 펩티드 부위가 리진 잔기를 통해 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드에 결합하는 경우, 유리하게는 서열번호: 1의 7번 및 96번 위치에 상응하는 위치에 존재하는 자연발생적으로 남아있는 리진 잔기, 및 HBcAg 변이체에 존재하는 다른 리신 잔기중 하나 또는 둘 모두를 치환시키거나 결실시킬 수 있다. 이들 리진 잔기를 제거하여 정돈된 어레이를 파괴할 수 있는 안지오텐신 펩티드 부위에 대한 결합 부위를 제거하고, 최종 백신 컨쥬게이트의 질 및 균일성을 향상시킬 수 있다.

다수의 경우, 서열번호: 1에서 7번 및 96번 위치에 상응하는 위치의 자연발생적으로 남아있는 리신 잔기 모두가 제거된 경우, 안지오텐신 펩티드 부위에 대한 결합부로서 또다른 리신이 HBcAg 내로 도입될 것이다. 리진 잔기 삽입 방법은 예를 들면, 2002년 1월 18일에 현 양수인에 의해 출원된 계류중인 U. S. Application No. 10/050,902, 특히 U. S. Application No. 10/050,902의 실시예 23에 기술되어 있고, 이는 참고문헌으로서 인용된다. 예를 들면, 서열번호: 1에서 7번 및 96번 위치에 상응하는 위치의 자연발생적으로 남아있는 리신 잔기 모두가 변경된 경우, 유리하게 리신 잔기를 HBcAg내로 도입하고, 헤테로이작용기성 가교-결합제를 사용하여 안지오텐신 펩티드 부위를 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드에 결합시키기 위해 시도될 것이다.

HBcAg의 C-말단은 이 단백질의 핵 내 이동(nuclear localization)을 지시하는 것으로 나타났다(Eckhardt et al., J. Virol. 65 : 575-582(1991). ) 추가로, 이 영역의 단백질이 핵산에 결합하는 능력을 HBcAg에 주는 것으로 판단된다.

일례로 본 발명의 백신 컨쥬게이트는 핵산 결합 활성을 갖는 HBcAgs(예: 자연발생적으로 남아있는 HBcAg 핵산 결합 영역 포함)를 포함할 것이다. 하나 이상의 핵산 결합 영역을 포함하는 HBcAgs는 T-세포 자극 활성이 증가된 백신 컨쥬게이트의 제조에 유용하다. 따라서, 본 발명의 백신 컨쥬게이트는 결합 활성을 갖는 HBcAgs를 포함하는 컨쥬게이트를 포함한다. 또한, 백신 컨쥬게이트, 및 HBcAgs가 핵산에 결합된 경우 백신화 프로토콜에서 상기 컨쥬게이트의 용도를 포함한다. 이 HBcAgs는 개체에 투여되기 전에 핵산에 결합할 수 있거나 투여후 핵산에 결합할 수 있다.

추가로 본 발명의 실시에 사용하기 적절한 HBcAgs는 N- 및 C-말단 절단 돌연변이(절단 돌연변이), 및 뮤테인의 아미노산 서열이 상기 기술한 절단 돌연변이와 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 또는 약 99% 일치하는 아미노사 서열을 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된 뮤테인을 포함한다.

상기 기술한 바와 같이 본 발명의 특정 일례로 리신 잔기는 제 1 결합부로 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드를 형성하는 폴리펩티드내로 도입된다. 바림직한 일례로, 본 발명의 백신 컨쥬게이트는 79번 및 90번 위치에 상응하는 아미노산이 Gly-Gly-Lys-Gly-Gly의 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 대체되고 48번 및 107번 위치의 시스테인 잔기는 결실되거나 다른 아미노산 잔기로 치환된 반면, 61번 위치의 시스테인은 제자리에 남아있도록 변형된 서열번호 1에서 아미노산 1-144 또는 아미노산 1-149 또는 아미노산 1-185로 구성되거나 다르게는 상기로 구성된 HBcAg를 사용하여 제조된다.

본 발명은 추가로 서열번호 1로부터 서열번호 1중 상응하는 위치에 존재하지 않는 시스테인 잔기가 결실된 서열번호 1에 나타낸 것외의 아미노산 서열을 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된 HBcAg의 단편을 포함하는 백신 컨쥬게이트를 포함한다.

본 발명의 백신 컨쥬게이트는 상이한 HBcAgs의 혼합물을 포함할 수 있다. 따라서, 이들 백신 컨쥬게이트는 아미노산 서열이 상이한 HBcAgs로 구성될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형된(예: 결실, 삽입 또는 치환) 변형된 HBcAg 및 "야생형" HBcAg를 포함하여 백신 컨쥬게이트를 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 또다른 단백질에 융합된 HBcAg를 사용하여 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드가 제조된 백신 컨쥬게이트를 포함한다. 상기 기술한 바와 같이, 융합 단백질의 한 예는 HBcAg/FOS 융합이다. 본 발명의 백신 컨쥬게이트에서 사용하기 적절한 HBcAg 융합 단백질의 다른 예는 HBcAg 다이머 및 멀티머의 형성 및/또는 안정화에 도움이 되는 아미노산 서열이 첨가된 융합 단백질을 포함한다. 이 첨가 아미노산 서열은 HBcAg의 C-말단에 융합될 수 있다. 그러한 융합 단백질의 예는 HBcAg 다이머 및 멀티머를 제조하고 안정화시키기 위하여 사용할 수 있는 비공유 상호작용에 의해 호모다이머를 형성하는 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)의 GCN4 헬릭스 영역과 HBcAg의 융합이다.

일면에서, 본 발명은 C-말단에 융합된 GCN4 폴리펩티드(PAALKRARNEAARRSRARKLQ- RMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKK)과 HBcAg, 또는 그의 단편을 포함하는 HBcAg 융합 단백질을 사용하여 제조된 백신 컨쥬게이트를 제공한다. 이 GCN4 폴리펩티드는 또한 HbcAg의 N-말단에 융합될 수 있다.

또한, HBcAg/src 상동 3(SH3) 영역 융합 단백질을 사용하여 본 발명의 백신 컨쥬게이트를 제조할 수 있다. SH3 영역은 단백질 결합 파트너중 특이적으로 프롤린-풍부 서열과 상호작용하는 능력을 제공하는 다수의 단백질에서 발견되는 상대적으로 작은 영역이다(참조 McPherson, Cell Signal 11 : 229-238(1999). HBcAg/SH3 융합 단백질은 여러 방식으로 사용될 수 있다. 첫번째로, SH3 영역은 안지오텐신 펩티드 부위의 제 2 결합부와 상호작용하는 제 1 결합부를 형성할 수 있다. 유사하게, 프롤린 풍부 아미노산 서열은 HBcAg에 첨가되어 안지오텐신 펩티드 부위의 제 2 결합부 SH3 영역에 대한 제 1 결합부로서 사용될 수 있다. 두번째로, SH3 영역은 HBcAgs내로 도입되는 프롤린 풍부 부위와 결합할 수 있다. 따라서, SH3 영역 및 프롤린 풍부 SH3 상호작용 부위는 동일하거나 상이한 HBcAgs내로 삽입될 수 있고 본 발명의 다이머 및 멀티머를 안정화시키는데 사용될 수 있다.

상기 언급한 예에서 입증된 바, 본 분야의 기술자는 HBcAg 및 HBcAg-유래 뮤테인으로부터의 제 1 결합부 및 코어 입자를 포함하는 분자 스캐폴드를 형성하는 방법을 알고 있을 것이다. 본 분야에 공지된 기술 및 일반적 실험 방법을 적용하여 본 분야의 기술자는 분자 스캐폴드를 구성하기 위하여 다른 바이러스를 유사하게 사용할 수 있는 방법을 이해할 것이다.

본 명세서에 제시된 바와 같이, 바이러스 캡시드는 (1) 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위의 제시(presentation) 및 (2) 본 발명의 백신 컨쥬게이트 제조에 사용될 수 있다. 특히, 발현시 캡시드 또는 캡시드-성 구조를 형성하는, 본 명세서에서 "코트 단백질"로도 언급되는 바이러스 캡시드 단백질은 본 발명의 실시에서 유용하다. 따라서, 이들 캡시드 단백질은 코어 입자 및 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드를 형성할 수 있다. 일반적으로, 이들 캡시드 또는 캡시드-성 구조는 항원 결정기의 제시 및 본 발명의 백신 컨쥬게이트 제조에 사용될 수 있는 정돈된 반복적 어레이를 형성한다.

하나 이상의(예: 하나, 둘, 세개, 네개, 다섯개, 등) 안지오텐신 펩티드 부위는 어느 여러 수단을 통해 바이러스 캡시드 또는 캡시드-성 구조(예: 박테리오파지 코트 단백질)를 형성하는 하나 이상의(예: 하나, 둘, 세개, 네개, 다섯개, 등) 단백질, 및 다른 단백질에 결합할 수 있다. 예를 들면, 안지오텐신 펩티드 부위는 제 1 및 제 2 결합부를 사용하여 코어 입자에 결합할 수 있다. 추가로, 하나 이상의(예: 하나, 둘, 세개, 네개, 다섯개, 등) 헤테로이작용기성 가교제를 사용하여 바이러스 캡시드 또는 캡시드-성 구조를 형성하는 하나 이상의 단백질에 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위를 결합시킬 수 있다.

바이러스 캡시드 단백질, 또는 그의 단편을 사용하여 예를 들면, 코어 입자 및 본 발명의 백신 컨쥬게이트를 제조할 수 있다. 박테리오파지 Qβ 코트 단백질은 예를 들면 E. coli에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 추가로, 발현시 이 단백질은 자발적으로 바이러스성 입자인 캡시드를 형성한다. 또한, 이들 캡시드는 안지오텐신 펩티드 부위의 제시 및 백신 컨쥬게이트의 제조에 사용될 수 있는 정돈된 반복적 항원 어레이를 형성한다.

바람직한 일례로, 바이러스성 입자는 RNA-파지의 재조합 단백질 또는 그의 단편을 포함하거나, 본질적으로는 상기로 구성되거나, 양자택일적으로 구성된다. 바람직하게, RNA-파지는 a) 박테리오파지 Qβ ; b) 박테리오파지 R17; c) 박테리오파지 fr; d) 박테리오파지 GA; e) 박테리오파지 SP; f) 박테리오파지 MS2; g) 박테리오파지 M11 ; h) 박테리오파지 MX1 ; i) 박테리오파지 NL95; k) 박테리오파지 f2 ; l) 박테리오파지 PP7, 및 m) 박테리오파지 AP205로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 또다른 바람직한 일례로, 바이러스성 입자는 RNA-박테리오파지 Q, 또는 RNA-박테리오파지 fr, 또는 RNA-박테리오파지 AP205의 재조합 단백질, 또는 그의 단편을 포함하거나, 다르게는 본질적으로는 상기로 구성되거나, 양자택일적으로 구성된다.

본 발명의 컨쥬게이트 제조에 사용할 수 있는 박테리오파지 코트 단백질의 특정 일례는 박테리오파지 Q(서열번호: 3; PIR 데이타베이스, 수탁번호 VCBPQR, Qβ CP로 언급됨 및 서열번호: 4; 수탁번호 AAA16663, Qβ A1 단백질로 언급됨) 박테리오파지 R17(PIR 수탁번호 VCBPR7), 박테리오파지 fr(PIR 수탁번호 VCBPFR), 박테리오파지 GA(GenBank 수탁번호 NP-040754), 박테리오파지 SP(GenBank 수탁번호 CAA30374, SP CP로 언급됨 및 수탁번호, SP A1 단백질로 언급됨), 박테리오파지 MS2(PIR 수탁번호 VCBPM2), 박테리오파지 M11(GenBank 수탁번호 AAC06250), 박테리오파지 MX1(GenBank 수탁번호 AAC14699), 박테리오파지 NL95(GenBank 수탁번호 AAC14704), 박테리오파지 f2(GenBank 수탁번호 P03611), 박테리오파지 PP7, 박테리오파지 AP205(서열번호: 11)과 같은 RNA 박테리오파지의 코트 단백질을 포함한다. 본 분야의 기술자는 인지하고 있는 바, 캡시드 또는 캡시드-성 구조를 형성하는 어는 단백질을 사용하여 본 발명의 백신 컨쥬게이트를 제조할 수 있다. 추가로, 박테리오파지 Qβ(Genbank 수탁번호 AAA16663(서열번호: 4))의 A1 단백질 또는 그의 C-말단으로부터 약 100, 약 150 또는 약 180 아미노산 정도가 누락된 C-말단 절단형을 Qβ 코드 단백질의 캡시드 어셈블리내로 혼입시킬 수 있다. A1 단백질은 또한 제 2 결합부를 포함하는 안지오텐신 펩티드 부위의 결합을 위해, 제 1 결합부를 포함하는 요소에 융합될 수 있다. 일반적으로, 캡시드 어셈블리중 Qβ CP에 상대적인 A1 단백질의 퍼센트는 캡시드 형성을 안정하게 하기 위하여 제한될 것이다.

Qβ 코트 단백질은 또한 E. coli에서 발현될 때 캡시드내로 자가-어셈블리하는 것으로 밝혀졌다(Kozlovska TM. et al., 유전자 137 : 133-137(1993)). 수득된 캡시드 또는 바이러스성 입자는 직경 25 nm이고 준대칭성 T=3인 20면체의 파지성 캡시드 구조를 나타내었다. 추가로, 파지 Qβ의 결정형 구조가 해석되었다. 캡시드 는 디설파이드 브릿지에 의해 공유 펜타머 및 헥사머로 결합된 180개 카피수의 코트 단백질을 포함한다(Golmohammadi, R. et al., 구조 4 : 543-5554(1996)). 다른 RNA 파지 코트 단백질 또한 박테리아 숙주에서 발현될 때 자가-어셈블리하는 것으로 나타났다(Kastelein, RA. et al., Gene 23: 245-254(1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287 : 452-455(1986), Adhin, MR. et al., Virology 170 : 238-242(1989), Ni, CZ., et al., protein Sci. 5 : 2485-2493(1996), Priano, C. et al. , J. Mol. Biol. 249: 283-297(1995)). Qβ 파지 캡시드는 코트 단백질외에도, 이른바 리드-트루(read-through) 단백질 A1 및 돌연변이 단백질 A2를 포함한다. A1은 UGA 종결 코돈에서의 억제에 의해 형성되고 길이는 329 aa이다. 본 발명에서 사용되는 파지 Qβ 재조합 코트 단백질의 캡시드에는 A2 용해(lysis) 단백질이 결핍되어 있고, 숙주로부터의 RNA를 포함한다. RNA 파지의 코트 단백질은 RNA 결합 단백질이고 바이러스의 라이프 사이클동안 해독 억제물질로부터 작용하는 리플리카제 유전자의 리보솜 결합 위치의 스템 루브와 상호작용한다. 상호작용의 구조 요소 및 서열은 공지되어 있다(Witherell, GW. & Uhlenbeck, OC. Biochemistry 28 : 71-76(1989); Lim F. et al., J. Biol. Chem. 271 : 31839-31845(1996)). 일반적으로 스템 루프 및 RNA가 바이러스 어셈블리에 관여한다고 공지되어 있다(Golmohammadi, R. et al., Structure 4 : 543-5554(1996).

E. coli에서 발현될 때, [Stoll, E. et al. J. Biol. Chem. 252: 990-993(1977)]에 기술된 바와 같이 N-말단 Edman 시퀸싱에 의해 본 발명자가 관찰한 바 Qβ 코트 단백질의 N-말단 메티오닌은 통상 제거된다. N-말단 메티오닌이 제거되지 않은 Qβ 코트 단백질로부터 구성된 VLP, 또는 N-말단 메티오닌이 절단되거나 존재하는 Qβ 코트 단백질의 혼합물을 포함하는 VLP 모두 본 발명의 범위내 포함ㄷ한다.

1. 본 발명의 추가로 바람직한 일례로, 바이러스성 입자는 RNA-파지 AP205의 재조합 단백질, 또는 그의 단편을 포함하거나, 다르게는 본질적으로 상기로 구성되거나, 양자택일적으로 상기로 구성된다.

2. AP205 게놈은 돌연변이 단백질, 코트 단백질, 리플리카제 및 관련된 파지에는 존재하지 않는 두개의 오픈 리딩 프레임: 돌연변이 유전자의 해독에서 중요한 역할을 하는 오픈 리딩 프레임 및 분해 유전자로 구성된다(Klovins, J. , et al., J Gen. ViroL 83 : 1523-33(2002)). AP205 코트 단백질은 pQb1O의 유도체(Kozlovska, T. M.. et al., 유전자 137 : 133-37(1993))이고, AP205 리보솜 결합 부위를 포함하는 플라스미드 pAP283-58(서열번호: 11)로부터 발현될 수 있다. 다르게는, AP205 코트 단백질은 벡터에 존재하는 리보솜 결합 부위 하류의 pQb185내로 클로닝될 수 있다. 2002년 7월 17일에 "분자 항원 어레이"이라는 명칭으로 출원된 현재 계류중인 US 가출원 번호 60/396,126 (본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다), 특히 실시예 2에 기술된 바과 같이 상기 양 방법에 의해 단백질이 발현되고 캡시드가 형성된다. 벡터 pQb10 및 pQb185는 pGEM 벡터로부터 유도된 벡터이고 이들 벡터내 클로닝된 유전자의 발현은 trp 프로모터에 의해 조정된다(Kozlovska, T. M. et al., 유전자 137 : 133-37(1993)). 플라스미드 pAP283-58(서열번호: 11)는 하기 서열에서 XbaI 위치의 하류, 및 AP205 코트 단백질의 ATG 개시 코돈 상류 바로 가까이에 추정의 AP205 리보솜 결합 위치를 포함한다: tctagaATTTTCTGCGCACCCAT

CCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg. 벡터 pQb185는 XbaI 위치로부터 하류 및 개시 코돈의 상류에 Shine Delagarno 서열을 포함한다(tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAG TCAGGCCatg, Shine Delagarno 서열은 밑줄로 표시).

3. 본 발명의 추가로 바람직한 일례로, 바이러스성 입자는 RNA-파지 AP205의 재조합 코트 단백질, 또는 그의 단편을 포함하거나, 다르게는 본질적으로 상기로 구성되거나, 양자택일적으로 상기로 구성된다.

4. 따라서, 본 발명의 바람직한 일면은 캡시드를 형성하는 AP205 코트 단백질를 포함한다. 상기 단백질은 재조합적으로 발현되거나 자연발생된 공급원으로부터 재조된다. 박테리아에서 생산된 AP205 코트 단백질은 전자현미경(EM) 및 면역확산법에 의해 입증된 바 자발적으로 캡시드를 형성한다. AP205 코트 단백질(서열번호: 12)에 의해 형성된 캡시드의 구조적 성질 및 AP205 RNA 파지의 코트 단백질에 의해 형성된 캡시드의 것은 EM에 의해 관찰할 경우 거의 식별불가능하다. AP205 VLP는 고도로 면역원성이고, 항원 및/또는 항원 결정기와 결합하여 반복적 방식으로 방향성을 띤 항원 및/또는 항원 결정기를 디스플레이하는 백신 구조물을 형성할 수 있다. 결합한 항원 및/또는 항원 결정기는 항체 분자와 상호작용하기 쉽고 면역원성이라는 것을 나타내는 디스플레이된 항원에 대하여 고역가를 유도한다.

5. 본 발명의 추가로 바람직한 일례로, 바이러스성 입자는 RNA-파지 AP205의 재조합 돌연변이 코트 단백질, 또는 그의 단편을 포함하거나, 다르게는 본질적으로 상기로 구성되거나, 양자택일적으로 상기로 구성된다.

6. 5번 아미노산인 프롤린이 트레오닌으로 치환된 AP205 코트 단백질(서열번호: 13)을 포함하는 어셈블링 수행능력이 있는 돌연변이 형태의 AP205 VLP 또한 본 발명의 실시에 사용할 수 있고, 본 발명의 추가의 바람직한 일례이다. 이들 VLP, 자연발생 공급원으로부터 유래된 AP205 VLP, 또는 AP205 바이러스 입자는 항원과 결합하여 본 발명의 항원의 정돈된 반복 어레이를 형성할 수 있다.

7. AP205 P5-T 돌연변이 코트 단백질는 pQb185로부터 직접적으로 유도되고 Qβ 코트 단백질 유전자 대신 돌연변이 AP205 코트 단백질 유전자를 포함하는 플라스미드 pAP281-32(서열번호. 14)로부터 발현될 수 있다. AP205 코트 단백질을 발현시키기 위한 벡터를 E. coli내로 형질감염시켜 AP205 코트 단백질을 발현시킨다.

8. 각각 VLP내로 자가-어셈블리하는 코트 단백질 및 돌연변이 코트 단백질을 발현시키는 방법은 현 양수인에 의해 발명의 명칭 "분자 항원 어레이"으로 2002년 7월 17일에 출원된 현재 계류중인 US 가출원번호 60/396,126(본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다)에 기술되어 있다. 적절한 E. coli 균주는 제한하는 것은 아니지만 E. coli K802, JM 109, RR1이다. 적절한 벡터 및 균주 및 그의 배합물은 SDS-PAGE에 의해 각각 코트 단백질 및 돌연변이 코트 단백질의 발현을 테스트하여 확인하고 캡시드 형성 및 어셈블리는 임의로 우선 겔 여과에 의해 캡시드를 정제한 후 연속하여 면역확산 분석(Ouchterlony test) 또는 전자현미경법에 의해 테스트하여 확인한다(Kozlovska, T. M.. et al., 유전자 137 : 133-37(1993)).

9. 벡터 pAP283-58 및 pAP281-32로부터 발현된 AP205 코트 단백질은 E. coli의 세포질에서 프로세싱되기 때문에 초기 메티오닌 아미노산이 결핍되어 있을 수 있다. 절단, 절단되지 않은 형태의 AP205 VLP, 또는 그의 혼합물이 본 발명의 추가의 바람직한 일례이다.

10. 본 발명의 추가로 바람직한 일례로, 바이러스성 입자는 RNA-파지 AP205의 재조합 코트 단백질, 또는 그의 단편의 혼합물 및, RNA-파지 AP205의 재조합 돌연변이 코트 단백질, 또는 그의 단편의 혼합물을 포함하거나, 다르게는 본질적으로 상기로 구성되거나, 양자택일적으로 상기로 구성된다.

11. 본 발명의 추가로 바람직한 일례로, 바이러스성 입자는 RNA-파지 AP205의 재조합 코트 단백질 또는 재조합 돌연변이 코트 단백질의 단편을 포함하거나, 다르게는 본질적으로 상기로 구성되거나, 양자택일적으로 상기로 구성된다.

12. 각각 VLP 및 캡시드내로 어셈블링할 수 있는 재조합 AP205 코트 단백질 단편은 또한 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 이 단편은 코트 단백질 및 돌연변이 코트 단백질의 내부 또는 말단에서 결실되므로써 형성될 수 있다. VLP내로의 어셈블리에 적합한 코트 단백질 및 돌연변이 코트 단백질 서열내 삽입 또는 항원 서열과 코트 단백질 및 돌연변이 코트 단백질 서열의 융합이 본 발명에 포함되고, 이는 각각 키메라성 AP205 코트 단백질, 및 입자를 가져온다. 삽입, 결실 및 코트 단백질 서열에 대한 융합 결과 및 VLP내로의 어셈블리 적합성 여부는 전자현미경으로 측정할 수 있다.

13. 현 양수인에 의해 발명의 명칭 "분자 항원 어레이"으로 2002년 7월 16일에 출원된 현재 계류중인 US 가출원(본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다)에 기술된 바와 같이 상기 기술된 AP205 코트 단백질, 코트 단백질 단편 및 키메라성 코트 단백질에 의해 형성된 입자는 침전에 의한 분류 단계 및 예를 들면, 세파로스 CL-4B, 세파로스 CL-2B, 세파로스 CL-6B 칼럼 및 그의 조합을 사용하여 겔 여과에 의한 정제 단계를 병용하여 순수한 형태로 분리할 수 있다. 바이러스성 입자를 분리하는 다른 방법은 공지되어 있고, 이를 사용하여 박테리오파지 AP205의 바이러스성 입자(VLP)를 분리할 수 있다. 예를 들면, 효모 레트로트랜스포존(retrotransposon) Ty의 VLP를 분리하기 위하여 초원심분리법을 사용하는 것이 U. S. Patent No. 4,918, 166(본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다)에 기술되어 있다.

본 발명에 따라, 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위는 RNA 파지 코트 단백질의 캡시드의 하나의 서브유니트에 결합할 수 있다. RNA 파지 코트 단백질의 캡시드, 특히 Qβ 캡시드 서브유니트당 수개의 안지오텐신 펩티드 부위가 결합하는 능력에 의해 조밀한 안지오텐신 펩티드 부위 어레이가 형성된다. 다른 바이러스 캡시드를 화학적 가교-결합에 의한 안지오텐신의 공유 결합에 사용할 수 있는, 예로서 주요 고면역원성(immunodominan) 부위(MIR)중 리신 잔기로 변형된 HBcAg이다(WO 00/32227). HBcAg의 스파이크(MIR에 상응) 사이의 거리는 50 옹스트롬이고(Wynne, SA. et al., Mol. Cell 3 : 771-780(1999)), 따라서 안지오텐신 펩티드 부위 어레이는 50 옹스트롬 이하로 형성될 수 있다.

Qβ 코트 단백질의 캡시드는 캡시드 내부로 향하고 RNA와 상호작용하는 3개의 리신 잔기, 및 캡시드 외부로 노출된 다른 4개의 리신 잔기를 갖는 제한된 토폴로지로 그의 표면상에 제한된 갯수의 리신 잔기를 디스플레이한다. 이러한 제한된 성질은 안지오텐신 펩티드 부위가 리신 잔기가 RNA와 상호작용하는 내부가 아닌, 입자 외부에 결합에 바람직하다. 다른 RNA 파지 코트 단백질의 캡시드 또한 그의 표면상에 제한된 갯수의 리신 잔기를 갖고, 이들 잔기의 제한된 토폴로지를 갖는다. RNA 파지로부터 유래된 캡시드가 갖는 또다른 장점은 박테리아에서 발현율이 높다는 것이고, 이로써 적절한 비용으로 대량의 물질을 생산할 수 있다.

Qβ 코트 단백질의 또다른 성질은 그의 안정성이다. Qβ 서브유니트는 서브유니크를 공유결합시키는 디설파이드 브릿지에 의해 서로 결합한다. Qβ 캡시드 단백질 또한 유기 용매 및 변성화제 대하여 특이적인 내성을 나타낸다. 놀랍게도, 본 발명자는 캡시드의 안지오텐신 펩티드 부위 배열을 형성하는 능력 또는 안정성에 아무런 영향을 주지 않으면서 약 30% 농도의 DMSO 및 아세토니트릴, 및 약 1 M의 구아니디니움을 사용할 수 있다는 것을 관찰하게 되었다. 따라서, 이 유기 용매는 특정의 안지오텐신 펩티드 부위와 같이 소수성 분자를 커플링시킬 때 사용할 수 있다. Qβ 코트 단백질의 캡시드의 고도의 안정성은 포유동물 및 특히 인간의 면역화 및 백신화에 사용하는 것과 관련된 중요한 특성이다. 유기 용매에 대한 캡시드의 내성에 의해 수용성 완충액에서 불용성인 안지오텐신 펩티드 부위 또는 그의 유도체는 커플링할 수 있다.

시스테인 잔기를 RNA 파지 MS-2의 코트 단백질중 N-말단 β-헤어핀내로 삽입하는 것이 U. S Patent No. 5,698, 424(본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다)에 기술되어 있다. 그러나, 본 발명자는 캡시드중 노출된 유리 시스테인 잔기의 존재가 디설파이드 브릿지 형성에 의해 캡시드를 올리고머화시킬 수 있다는 것에 주목하게 되었다. 상기 U. S. patent에서 주시된 다른 결합은 안지오텐신 펩티드 부위 및 Qβ 입자 사이의 디설파이드 브릿지 형성을 포함한다. 상기 결합은 설프하이드릴-부위 포함 분자에는 불안정하다.

Qβ상에 시스테인-잔기와 함꼐 형성된 초기 디설파이드 브릿지와 유리 설프하이드릴 잔기를 포함하는 항원과의 반응으로 안지오텐신 펩티드 부위외의 설프하이드릴 포함하는 종이 유리된다. 새로 형성된 설프하이드릴을 포함하는 종은 입자상에 존재하는 다른 디설파이드 브릿지와 다시 반응하여 평형해 도달할 수 있다. 입자상에 형성된 디설파이드 브릿지와의 반응시, 안지오텐신 펩티드 부위는 입자로부터의 시스테인-잔기, 또는 입자상의 초기 디설파이드 브릿지를 형성하는 이탈 그룹 분자의 시스테인-잔기와와 디설파이드 브릿지를 형성한다. 또한, 한쪽에서는 Qβ 입자상의 시스테인과, 다른 한쪽에서는 안지오텐신 펩티드 부위상의 리신 잔기와 반응하는 헤테로-이작용기성 가교제를 사용하는 기술한 또다른 결합 방법에 의해 입자상에 안지오텐신 펩티드 부위가 일정치 않은 방향성을 갖도록 할 수 있다.

본 발명자는 추가로 Qβ 및 Fr 코트 단백질의 캡시드와는 대조적으로 U. S Patent No. 5,698, 424에 기술된 재조합 MS-2에는 본질적으로 핵산이 결핍되어 있는 반면, 상기 두개의 캡시드내부에 RNA가 패킹되어 있다는 점에 주목하였다.

본 발명자는 이에 컨쥬게이트에 다양한 밀도로 안지오텐신 에피토프를 포함하는 안지오텐신 펩티드 부위의 강력한 어레이를 형성시킬 수 있는 신규하고 독창적인 컨쥬게이트를 기술한다.본 발명자는 안지오텐신 펩티드 부위를 VLP에 결합시켜 고밀도의 에피토프를 얻을 수 있다는 점을 제시한다. 추가로, 안지오텐신 펩티드 부위의 밀도 및 거리는 적절한 제 1 결합부로 잔기의 수 및 타입을 바꾸어 변형될 수 있다. 예를 들면 2002년 1월 18일 출원된 U. S. patent application No. 10/050,902에는 야생형 Qβ 코트 단백질에 의해 관찰된 경우보다 더욱 고밀도의 어레이를 수득하기 적절한 추가의 리신 잔기를 갖는 Qβ 돌연변이 코트 단백질이 기술되어 있다. 추가로, 상기 출원에는 또한 적절한 거리를 둔 수개의 항원을 동시에 디스플레이하기 적절한 컨쥬게이트, 및 적절하고 바람직한 방식으로 가용성을 증진시키거나 캡시드를 변형시키는 부속 분자가 첨가된 컨쥬게이트가 기술되어 있다. 바이러스성 입자인 캡시드를 형성하는 다른 Qβ 코트 단백질 돌연변이는 U. S. patent application No: 10/050,902에 기술되어 있고 본 발명의 조성물 제조에 적절하다. 특히, 안지오텐신 펩티드 부위, 및 Qβ-안지오텐신 펩티드 항원 어레이의 용해도가 Qβ 바이러스성 입자상에 결합할 수 있는 안지오텐신 펩티드 부위의 갯수를 제한하는 경우, 리신 잔기와 상이한 반응성을 갖는 아르기닌으로 리신 잔기가 치환된 돌연변이를 사용할 수 있다. 이 조성물을 제조할 때 고농도의 안지오텐신 펩티드 부위, 또는 제 2 결합부를 포함하도록 변형된 안지오텐신 펩티드 부위를 사용하여 wt Qβ 바이러스성 입자를 사용하는 경우와 같이 더욱 많은 결합 안지오텐신 펩티드 부위를 갖는 잠재적으로 불용성인 입자는 형성하지 않으면서 돌연변이 Qβ 바이러스성 입자상의 리신 잔기에서 완전하게 반응시킬 수 있다.

여러 RNA 박테리오파지의 결정형 구조가 측정되었다(Golmohammadi, R. et al., 구조 4 : 543-554(1996)). 상기 정보를 사용하여, 본 분야의 기술자는 용이하게 표면 노출 잔기를 확인하고 하나 이상의 반응성 아미노산 잔기가 삽입될 수 있도록 박테리오파지 코트 단백질을 변형시킬 수 있다. 따라서, 본 분야의 기술자는 용이하게 본 발명의 실시에 사용할 수 있는 변형된 형태의 박테리오파지 코트 단백질을 생성하고 확인할 수 있다. 따라서, 캡시드 또는 캡시드-성 구조를 형성하는 단백질의 변이체(예: 박테리오파지 Qβ, 박테리오파지 R17, 박테리오파지 fr, 박테리오파지 GA, 박테리오파지 SP, 및 박테리오파지 MS2의 코트 단백질) 또한 본 발명의 백신 컨쥬게이트 제조에 사용할 수 있다.

상기 논의된 변이체 단백질의 서열은 야생형 카운터파트와 상이하지만, 이 변이체 단백질은 일반적으로 캡시드 또는 캡시드-성 구조를 형성하는 능력을 보유하고 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 캡시드 또는 캡시드-성 구조를 형성하는 단백질 변이체를 포함하는 백신 컨쥬게이트, 및 상기 백신 컨쥬게이트를 제조하는 방법, 백신 컨쥬게이트를 제조하기 위하여 사용되는 개체 단백질 서브유니트를 포함한다. 따라서, 정돈된 반복적 어레이를 형성하고 캡시드 또는 캡시드-성 구조와 결합하고 형성하는 능력을 보유하는 야생형 단백질의 변이체 형태(예: 캡시드 또는 캡시드-성 구조를 형성하는 단백질 변이체)도 본 발명의 범주내 포함된다. 일반적으로, C- 및 N-말단 절단 변이체는 바이러스성 입자를 형성하는 능력을 보유하고 있다. 결과, 결실, 첨가, 또는 치환을 포함하는 변이체 형태, 키메라성 형태, 및 자연발생적인 변이체가 본 발명의 적절한 요소이다.

박테리아 섬모 및 필린 단백질(필린) 단백질. 다른 일면으로, 박테리아 필린, 박테리아 필린의 하위부분, 또는 박테리아 필린 또는 그의 하위부분을 포함하는 융합 단백질의 박테리아 필린, 박테리아 필린의 하위부분을 사용하여 본 발명의 백신 컨쥬게이트를 제조할 수 있다. 필린 단백질의 예는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 헤모필루스 인플루엔자에( Haemophilus influenzae), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 네이세리아 고노르호에아에(Neisseria gonorrhoeae), 카울로박터 크레스텐투스(Caulobacter crescentus), 슈도모나스 스투제리(Peudomonas stutzeri), 및 슈도모나스 아에루기노사(Peudomonas aeruginosa)에 의해 제조된 필린을 포함한다. 본 발명에 사용하기 적절한 필린 단백질의 아미노산 서열은 GenBank 리포트 AJ000636, AJ132364, AF229646, AF051814, AF051815, 및 X00981에 기술된 것을 포함하고, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고문헌으로 인용된다.

박테리아 필린 단백질은 일반적으로 단백질이 박테리아의 원형질막공간에 노출되기 전에 N-말단 리더 서열을 제거하도록 프로세싱된다. 추가로, 본 분야의 기술자가 인지하고 있는 바와 같이 본 발명의 백신 컨쥬게이트 제조에 사용되는 박테리아 필린 단백질는 일반적으로 자연발생적으로 존재하는 리더 서열을 갖지 않는다.

본 발명에 사용하기 적절한 필린 단백질의 한 특정 일례는 E. coli의 P-필린(GenBank 리포트 AF237482)이다. 본 발명에 사용하기 적절한 1형 E. coli 필린의 한 예는 GenBank 리포트 M27603에 기술된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩된, GenBank 리포트 P04128에 기재된 아미노산 서열(서열번호: 2)을 갖는 필린이다. 이 GenBank 리포트 전체는 본 명세서에서 참조문헌으로 인용된다. 다시, 상기 참조된 단백질의 성숙한 형태는 본 발명의 백신 컨쥬게이트 제조에 일반적으로 사용될 것이다.

본 발명의 실시예 적절한 박테리아 필린 또는 필린 하위부분는 일반적으로 결합하여 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드를 형성할 수 있다. 시험관내에서 섬모 및 섬모성 구조를 제조하는 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, [Bullitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 12890-12895(1996)]에는 E. coli P-섬모 서브유니트의 시험관내 재구성이 기술되어 있다. 추가로, [Eshdat et al(R Bacteriol. 148 : 308-314(1981))]에는 E. coli의 1형 섬모를 분해하고 섬모를 재구성하는 적절한 방법이 기술되어 있다. 간단하게, 이 방법은 하기와 같다: 섬모를 포화된 구아니딘 하이드로클로라이드에서 37℃하에 인큐베이션시켜 분해한다. 이어서 필린 단백질을 크로마토그래피에 의해 정제한 후, 5 mM tris(하이드록시메틸) 아미노메탄 클로라이드(pH 8.0)에 대하여 투석시켜 필린 다이머를 형성한다. Eshdat 등은 또한 필린 다이머는 5 mM MgCl₂를 포함하는 5 mM tris(하이드록시메틸) 아미노메탄(pH 8.0)에 대하여 투석시킬 때 다시 어셈플리하여 섬모를 형성한다는 것을 밝혀냈다.

추가로, 예를 들면, 통상의 유전 공학 방법 및 단백질 변형 방법을 사용하여 안지오텐신 펩티드 부위가 제 2 결합부를 통해 결합하는 제 1 결합부를 필린 단백질을 포함하도록 변형시킬 수 있다. 다르게는 안지오텐신 펩티드 부위를 제 2결합부를 통해 이들 단백질중 자연발생적으로 남아있는 아미노산 잔기에 직접 결합시킬 수 있다. 이 변형된 필린 단백질을 본 발명의 컨쥬게이트를 면역화시키는데 사용할 수 있다.

본 발명의 컨쥬게이트 제조에 사용되는 박테리아 필린 단백질는 HBcAg에 대하여 기술된 것과 유사한 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 시스테인 및 리신 잔기를 결실시키거나 다른 아미노산 잔기로 치환시킬 수 있고 제 1 결합부를 이 단백질에 첨가할 수 있다. 추가로, 필린 단백질은 변형 형태로 발현되거나 발현 후 화학적으로 변형될 수 있다. 유사하게, 본래의 섬모를 박테리아로부터 수거한 후 화학적으로 변형시킬 수 있다.

또다른 일례로, 섬모 또는 섬모성 구조를 박테리아(예: E. coli)로부터 수거하고 본 발명의 백신 컨쥬게이트 형성에 사용한다. 백신 컨쥬게이트 제조에 적절한 섬모의 예는 E. coli의 1형 섬모로 이는 서열번호:2에 기술한 아미노산 서열을 갖는 필림 모노머로부터 형성된다.

박테리아 섬모를 수거하는 다수의 방법이 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, [Bullitt and Makowski(Biophys. J. 74 : 623-632(1998))]에는 E. coli로부터 P-섬모를 수거하는 섬모 정제 방법이 기술되어 있다. 이 방법에 따라, P-섬모 플라스미드를 포함하는 과다하게 섬모가 형성된 E. coli로부터 섬모를 전단하고 가용화 및 MgCl₂(1.0 M) 침전 사이클에 의해 정제하였다. 2002년 1월 18일 출원된 US. patent application No: 10/050,902는 박테리아로부터 자연발생된 섬모인 1형 섬로를 수거하고 정제하거나, 섬모 생산에 관여하는 핌(fim) 오페론을 코딩하는 벡터내로 도입될 수 있다고 기재하고 있다.

일단 수거되면, 섬모 또는 섬모성 구조는 여러 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 제 1 결합부를 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위가 제 2 결합부를 통해 결합할 수 있는 섬모에 첨가할 수 있다. 다시 말하면, 박테리아 섬모 또는 섬모성 구조는 수거되고 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드를 형성할 수 있도록 변형될 수 있다.

섬모 또는 섬모성 구조는 비자연발생 제 1 결합부의 부재하에서 안지오텐신 펩티드 부위의 결합에 의해 변형될 수 있다. 예를 들면, 항원 또는 항원 결정기는 자연발생적으로 발생된 시스테인 잔기 또는 리신 잔기에 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 자연발생된 아미노산 잔기의 고도한 정열과 반복성을 통해 안지오텐신 펩티드 부위가 섬모 또는 섬모성 구조에 커플링할 수 있다. 예를 들면, 섬모 또는 섬모성 구조는 헤테로이작용기성 가교제를 사용하여 안지오텐신 펩티드 부위의 제 2 결합부에 결합할 수 있다.

유기체에 의해 자연적으로 합성된 구조(예: 섬모)를 사용하여 본 발명의 백신 컨쥬게이트를 제조하는 경우, 이 유기체가 바람직한 성질을 갖는 구조을 생성하도록 유전 공학적으로 조작한다는 잇점을 갖는다. 예를 들면, E. coli의 1형 섬모를 사용하는 경우, 이들 섬모가 수거된 E. coli는 특정 성질을 갖는 구조를 생성하도록 변형될 수 있다. 필린 단백질의 가능한 변형 예는 하나 이상의 리신 잔기의 삽입, 하나 이상의 자연발생적으로 남아있는 리신 잔기의 결실 또는 치환, 및 하나 이상의 자연발생적으로 남아있는 시스테인 잔기(예: 서열번호 2;에서 44번 및 84번 위치의 시스테인 잔기)의 결실 또는 치환을 포함한다.

추가로, 추가의 변형을 통해 리신 잔기이외의 제 1 결합부(예: FOS 또는 JUN 영역)를 포함하는 발현 산물을 수득시키는 필린 유전자를 제조할 수 있다. 물론, 적절한 제 1 결합부는 필린 단백질이 본 발명의 백신 컨쥬게이트에 사용하기 적절한 섬모 또는 섬모성 구조를 형성하지 못하도록 것으로 제한될 것이다. 섬모를 형성하는 재조합 필린 단백질의 능력은 전자현미경법을 포함하는 여러 방법에 의해 측정될 수 있다.

박테리아 세포에 자연적으로 존재하는 필린 유전자는 생체내에서 변형될 수 있거나(예: 상동성 재조합에 의해) 또는 특정의 성질을 갖논 필린 유전자는 이들 세포내로 삽입될 수 있다. 예를 들면, 필린 유전자는 복제가능한 클로닝 벡터 또는 박테리아 염색체내로 삽입되는 벡터 성분으로서 박테라아 세포내로 삽입될 수 있다. 삽입된 필린 유전자는 또한 발현 조절 조정 서열(예: lac 오퍼레이터)과 연결될 수 있다.

대체로, 본 발명의 백신 컨쥬게이트에 사용되는 섬모 또는 섬모성 구조는 필린 서브유니트의 싱글 타입으로 구성될 것이다. 그러나, 본 발명의 컨쥬게이트는 또한 이질성 필린 서브유니트로부터 형성된 섬모 또는 섬모성 구조를 포함하는 백신을 포함한다. 동일한 서브유니트로 구성된 섬모 또는 섬모성 구조는 일반적으로 고도로 정돈된 반복적 항원 어레이를 제시하는 구조를 형성할 수 있다고 기대되기 때문에 사용될 것이다.

제 2 결합부. 정돈된 반복적 어레리를 갖는 분자 스캐폴드의 제조는 고밀도의 에피토프와 RNA 파지 코트 단백질 캡시드의 본 컨쥬게이트에 의해 제공된다. 안지오텐신 펩티드 부위의 성질, 및 그 부위상의 제 2 결합부의 성질 및 위치는 본 분야의 기술자가 이해하고 있는 바와 같이, 본 발명의 컨쥬게이트 구성에 사용할 수 있는 수단, 및 면역 반응의 유도시 본 컨쥬게이트의 효능에 영향을 줄 수 있는 중요한 인자이다.

제 2 결합부를 디자인하기 위한 필요조건은 융합, 삽입 또는 일반적으로 유전공학적으로 처리되거나 결합되는 위치의 선정이다. 본 분야의 기술자는 제 2 결합부 위치의 선정시 가이던스를 아는 방법을 알고 있을 것이고, 다수의 요소는 이러한 결정과 관련하여 고려되어야 한다. 안지오텐신 펩티드 부위의 화학적 및/또는 결정형 구조는 커플링에 적절한 분자상의 영역의 유용성에 대한 정보를 제공할 것이다. 제 1 결합부의 화학적 커플링의 키네틱에서 반응성 영역이 용매에 영향을 받기 쉽다는 것은 제한적인 요소가 될 수 있다. 커플링에 적절한 그룹, 예를 들면, 설프하이드릴 잔기를 사용할 수 있다. 일반적으로, 안지오텐신 펩티드 부위에 의해 면역화하여 안지오텐신 펩티드 부위, 또는 그의 자연발생 리간드, 예로서 기질 또는 수용체를 포함하는 자가-항원과의 상호작용을 저해하고자 하는 경우에는 제 2 결합부를 가하여 자연발생 리간드와 상호작용하는 위치에 대한 항체를 생성하도록 한다. 따라서, 제 2 결합부의 위치는 제 2 결합부 또는 이를 포함하는 어느 아미노산 링커로부터의 입체 방해를 피할 수 있도록 선정될 것이다. 추가의 일례로, 자연발생된 리간드를 갖는 항원의 상호작용 부위로부터 떨어진 위치로 향하는 항체 반응이 바람직하다. 그러한 일례로 제 2 결합부는 자연발생된 리간드를 갖는 항원의 상호작용에 대한 항체 생성을 방지하도록 선정될 것이다. 고려할 다른 요소는 안지오텐신 펩티드 부위의 성질, 그의 생화학적 성질, 예를 들면, pI, 전하 분포, 추가의 변형을 포함한다. 일반적으로, 가요성 링커가 바람직하다.

제 2 결합부의 위치를 선정하는 다른 기준은 안지오텐신 펩티드 부위의 올리고머화 상태, 올리고머화 위치, 공인자의 존재, 및 부위의 변형이 작용 부위에 적합하거나, 상기 부위를 인식하고, 바람직하게는 안지오텐신 펩티드 부위의 작용을 차단하는 항체의 생성에 적합한, 부위 구조 및 서열중 위치를 제신하는 실험정 증거의 유용성을 포함한다. 특정 일례로, 하나 이상의 추가의 아미노산(비자연적으로 발생된 제 2 결합부)을 안지오텐신 펩티드 부위 서열의 C- 또는 N-말단에 가하여 본 발명에 따라 안지오텐신 펩티드 부위이 바이러스성 입자에 특히 정돈되고 일정한 방향으로 결합하도록 한다.

폴리펩티드 항원을 VLP, 및 특히 RNA 파지 코트 단백질의 캡시드에 결합시키는 특히 바람직한 방법은 RNA 파지 코트 단백질의 캡시드 표면상의 리신 잔기를 시스테인 잔기에서 발견되는 것과 같은 항원상의 설프하이드릴 그룹 잔기를 연결시키는 것이다. 유사하게, 안지오텐신 펩티드 부위상의 유리 설프하이드릴 그룹 또한 유효한 결합 위치일 수 있다. 산화된 설프하이드릴 그룹이 제 2 결합부로서 작용하기 위하여 환원상태로 존재하여야 하는 경우, 예를 들면, DTT, TCEP 또는 β-머캅노에탄올을 사용하여 환원시킬 수 있다. 본 발명에 따라, RNA 파지 코트 단백질의 캡시드의 에피토프 밀도는 가교제 및 다른 반응 조건을 선택하여 조절할 수 있다. 예를 들면, 가교제 Sulfo-GMBS 및 SMPH에 의해 고밀도 에피토프를 얻을 수 있다. 고농도의 반응 물질은 유도체화에 긍정적으로 작용하고, 반응 조건을 조작하여 RNA 파지 캡시드 단백질, 특히 Qβ 캡시드 단백질에 커플링하는 항원의 수를 조절할 수 있다. 또한, 코어 입자상의 제 1 결합부의 수는 안지오텐신 펩티드 부위 배열의 밀도에 영향을 주는 또다른 요소이다. 본 발명의 일례로, 본 발명자는 고밀도 배열을 수득하기에 적절한, 추가의 리신 잔기를 포함하는 Qβ 돌연변이 코트 단백질을 제공한다.

가장 바람직한 일례로, 안지오텐신 펩티드 부위는 단일 제 2 결합부 또는 코어 입자 및 VLP 또는 VLP 서브유니트상에 각각 제 1 결합부와 결합할 수 있는 단일 반응성 결합부를 포함한다. 적어도 하나, 그러나 전형적으로는 하나 이상, 바람직하게 10, 20, 40, 80, 120 이상의 항원이 코어 입자 및 VLP에 각각 제한적이고 균일하게 결합(binding)하고 결합(association)할 수 있도록 한다. 항원상의 단일 반응성 결합부 또는 단일 제 2 결합부를 제공하여 고도로 정돈된 반복적 어레이를 이끄는 단일의 균일한 타입의 결합(binding) 및 결합(association)을 각각 확실시 한다. 예를 들면, 결합(binding) 및 결합(association)이 각각 리신-(제 1 결합부로서) 및 시스테인-(제 2 결합부로서) 상호작용에 의해 영향을 받는 경우, 본 발명의바람직한 일례에 따라 시스테인 잔기가 항원상에 자연발생적으로 존재하는지 여부와는 상관없이 항원당 하나의 시스테인 잔기가 각각 VLP 및 코어 입자의 제 1 결합부와 결합(binding) 및 결합(association)할 수 있는가 확실시된다.

본 발명의 추가의 바람직한 일례로, 공유는 비-펩티드 결합이다.

일례로, 항원상의 제 2 결합부의 조작은 본 발명의 개시에 따라 제 2 결합부로서 적절한 아미노산을 포함하는 아미노산 링커의 융합을 요한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 일례로, 아미노산 링커는 적어도 하나의 공유 결합에 의해 항원 또는 항원 결정기에 결합한다. 바람직하게, 아미노산 링커는 제 2 결합부를 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된다. 추가의 바람직한 일례로, 아미노산 링커는 설프하이드릴 그룹 또는 시스테인 잔기를 포함한다. 또다른 바람직한 일례로, 아미노산 링커는 시스테인이다. 아미노산 링커 및 본 발명에 따른 추가의 바람직한 일례의 아미노산 링커의 선정 기준은 이미 언급하였다.

본 발명의 추가의 바람직한 일례로, 적어도 하나의 항원 또는 항원 결정기, 즉, PrP 단백질, PrP 펩티드 또는 PrP 영역은 각각 코어 입자 및 바이러스성 입자에 융합한다. 상기 약술한 바와 같이 VLP 전형적으로 VLP내로 어셈블리하는 적어도 하나의 서브유니트로 구성된다. 따라서, 다시 본 발명의 추가의 바람직한 일례로, 항원 또는 항원 결정기, 바람직하게 적어도 하나의 안지오텐신 펩티드 부위는 키메라성 VLP-서브유니트-안지오텐신 펩티드 부위 융합을 형성하는 VLP내로 도입될 수 있는 단백질 또는 바이러스성 입자의 적어도 하나의 서브유니트와 융합된다.

안지오텐신 펩티드 부위의 융합은 VLP 서브유니트 서열내로의 삽입에 의해, 또는 VLP내로 도입될 수 있는 단백질 또는 VLP-서브유니트의 N- 또는 C-말단으로의 융합에 의해 수행될 수 있다. 이하, 펩티드와 VLP 서브유니트의 융합 단백질을 언급하는 경우, 서브유니트 서열 끝의 융합 또는 서브유니트 서열내 펩티드의 내부 삽입을 포함한다.

또한, 추가로 절단 돌연변이로 언급되는, 서브유니트 서열의 일부가 결실된 VLP 서브유니트의 변이체내로 안지오텐신 펩티드 부위 서열을 삽입하여 융합시킬 수 있다. 절단 돌연변이는 VLP 서브유니트 서열 일부의 N- 또는 C-말단, 또는 내부 결실을 갖는다. 예를 들면, 79번 내지 81번 아미노산 잔기가 결실된 특정 VLP HBcAg는 내부 결실을 갖는 절단 돌연변이이다. 절단 돌연변이 VLP-서브유니트의 N- 또는 C-말단에 안지오텐신 펩티드 융합 또한 본 발명의 일례이다. 유사하게, 에피토프의 VLP 서브유니트 서열내로의 융합은 예를 들면, 특정 VLP HBcAg의 경우, 아미노산 79-81이 외부 에피토프로 대체되는 치환에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 이하 언급되는 바 융합은 VLP 서브유니트 서열중 안지오텐신 펩티드 부위 서열의 삽입, VLP 서브유니트 서열 일부의 안지오텐신 펩티드 부위 서열로 치환, 또는 결실,치환 또는 삽입의 조합에 의해 수행될 수 있다.

키메라성 안지오텐신 펩티드 부위-VLP 서브유니트는 일반적으로 VLP내로 자가-어셈블리할 수 있다. 서브유니트로 융합되는 에피토프를 나타내는 VLP를 키메라성 VLP로 언급한다. 언급한 바와 같이, 바이러스성 입자는 적어도 하나의 VLP 서브유니트를 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된다. 본 발명의 추가의 일례로, 바이러스성 입자는 키메라성 VLP 서브유니트 및 비-키메라성 VLP 서브유니트의 혼합물, 즉 그에 융합되는 항원을 갖지 않는 VLP 서브유니트를 포함하거나, 다르게는 상기로 구성되고, 이는 모자이크 입자를 가져온다. 이는 VLP의 형성 및 어셈블리를 확실시한다는 잇점을 갖는다. 일례로, 키메라성 VLP-서브유니트의 비율은 1, 2,5, 10, 20, 30,40, 50,60, 70,80, 90, 95% 이상일 수 있다.

측면에 위치하는 아미노산 잔기를 VLP의 서브유니트의 서열 말단에 융합되도록 펩티드 또는 에피토프의 서열 말단에 가하거나 VLP의 서브유니트의 서열내 펩티드 서열을 내부 삽입시키기 위하여 가할 수 있다. 글리신 및 세린 잔기가 융합시키고자 하는 안지오텐신 펩티드 부위에 첨가되는 측면 서열로 사용되는 특히 바람직한 아미노산이다. 글리신 잔기는 추가의 가요성을 제공하여 VLP 서브유니트 서열내로 외부 서열을 융합시킬 때 강력한 탈안정화 작용을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 구체적인 일례로, VLP는 B형 간염 코어 항원 VLP이다. 소위 주요 고면역원성 영역(MIR)중 HBcAg N-말단에 대한 융합 단백질(Neyrinck, S. et al., Nature Met. 5 : 1157-1163(1999)) 또는 삽입은 기술되어 있고(Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44 : 98-114(2001)), WO 01/98333), 이는 본 발명의 바람직한 일례이다. MIR중 결실을 갖는 자연발생된 HBcAg 변이체 또한 기술되어 있고(Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44 : 98-114(2001), 이는 본 명세서에서 참조문헌으로 인용된다), wt HBcAg와 비교하여 결실 위치에 상응하는 MIR 위치에서의 삽입 및 N- 또는 C-말단의 융합도 본 발명의 추가의 일례이다. C- 말단 의 융합도 기술되어 있다(Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44 : 98-114(2001)). 본 분야의 기술자는 일반적인 분자 생물학적 기술(Sambrook, J. et al., eds. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. edition, Cold Spring Hab또는 Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.(1989), Ho et al., 유전자 77: 51(1989))을 사용하여 융합 단백질을 구성하는 방법에 대한 가이던스를 용이하게 발견할 것이다. HBcAg 및 HBcAg 융합 단백질을 코딩하고 HBcAg 및 HBcAg 융합 단백질 발현에 유용한 벡터 및 플라스미드는 기술되어 있고(Pumpens, P. & Grens, E. Intervirology 44: 98-114(2001), Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5 : 1157-1163(1999)) 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 본 발명자는 또한 실시예(실시예 6)에 의해 에피토프를 HBcAg의 MIR에 삽입하여 키메라성 자가-어셈블링 HBcAg를 일으키는 것을 기술한다. 자가-어셈블리의 효율 및 HBcAg의 MIR에 삽입되는 에피토프의 디스플레이의 최적화를 위한 중요한 요소는 삽입, 다시 말하면, HBcAg을 형성하는 아미노산이 새로운 에피토프로 치환될 때 삽입 위치, 및 MIR내 HBcAg 서열로부터 결실되는 아미노산의 수의 선정이다(Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44 : 98- 114(2001); EP 421'635; US 6'231'864). 예를 들면, 외부 에피토프를 사용한 HBcAg 아미노산 76-80,79-81, 79-80,75-85 또는 80-81의 치환이 기술되어 있다(Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44 : 98-114(2001) ; EP0421635 ; US 6'231'864). HBcAg는 캡시드 어셈블리에 필수적이고 핵산을 결합시킬 수 있는(Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44 : 98-114(2001)) 장쇄의 아르기닌 테일(Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44 : 98-114(2001))을 포함한다. 아르기닌 테일을 포함하거나 결여된 HBcAg 모두 본 발명의 일례이다.

본 발명의 추가의 바람직한 일례로, VLP는 RNA 파지의 VLP이다. RNA 파지의 주요 코트 단백질은 박테리아, 및 특히 E. coli에서 발현할 때 VLP내로 자발적으로 어셈블리한다. 본 발명의 조성물을 제조에 사용할 수 있는 박테리오파지 코트 단백질의 특정 일례는 예로서, 박테리오파지 Q(서열번호: 10; PIR 데이타베이스, 수탁번호 VCBPQβ, Qβ CP and 서열번호: 11; 수탁번호 AAA16663, Qβ au 단백질) 및 박테리오파지 fr(서열번호: 4; PIR 수탁번호 VCBPFR)와 같은 RNA 박테리오파지의 코트 단백질을 포함한다.

더욱 바람직한 일례로, 적어도 하나의 안지오텐신 펩티드 부위는 Qβ 코트 단백질에 융합된다. 에피토프가 Qβ의 A1 단백질의 절단형의 C-말단에 융합되거나 A1 단백질에 삽입된 융합 단백질이 기술되어 있다(Kozlovska, T. M., et al., Intervirology, 39 : 9-15(1996)). A1 단백질은 UGA 종결 코돈의 억제에 의해 형성되고 그 길이는 329 aa이거나, N-말단 메티오닌 절단을 고려하면 328 aa이다. 알라닌(Qβ CP 유전자에 의해 코딩되는 두번째 아미노산)앞의 N-말단 메티오닌의 절단은 E. coli에서 일반적으로 발생하고, 이는 Qβ 코트 단백질 CP N-말단의 경우이다. A1 유전자의 일부인, 3'의 UGA 앰버(amber) 코돈은 CP 신장을 코딩하고, 이 길이는 195 아미노산이다. CP 신장의 72번 및 73번 상의 적어도 하나의 안지오텐신 펩티드 부위의 삽입은 볼 발명의 추가의 일례이다(Kozlovska, T. M., et al., Intervirology 39 : 9-15(1996)). C-말단의 절단된 Qβ A1 단백질의 C-말단에 안지오텐신 펩티드 부위의 융합도 본 발명의 추가의 바람직한 일례이다. 예를 들면, Kozlovska et al.,(Intervirology, 39 : 9-15(1996))에는 에피토프가 19번 위치에서 절단된 Qβ CP 신장의 C-말단에 융합된 Qβ A1 단백질 융합이 기술되어 있다.

Kozlovska et al.(Intervirology, 39 : 9-15(1996))에 의해 기술된 바와 같이, 융합된 에피토프를 디스플레이 하는 입자의 어셈블리는 모자이크 입자를 형성하기 위해서는 A1 단백질-안지오텐신 펩티드 부위 융합 및 wt CP 모두를 필요로 한다. 그러나, 바이러스성 입자, 및 특히 그에 융합된 적어도 하나의 안지오텐신 펩티드 부위를 갖는 VLP 서브유니트로만 구성된 RNA 파지 Qβ 코트 단백질의 VLP를 포함하는 일례 또한 본 발명의 범위내 포함된다.

모자이크 입자 생성은 여러 방식으로 수행될 수 있다. [Kozlovska et al., Intervirolog, 39 : 9-15(1996)]에는 본 발명의 실시에 사용되는 두가지 방법이 기술되어 있다. 첫번째 접근법에서, UGA 코돈을 Trp로 해독하는 클로닝된 UGA 억제자 tRNA를 코딩하는 플라스미드(pISM3001 플라스미드(Smiley B. K., et al., Gene 134 : 33-40(1993)))를 포함하는 E. coli 균주에서 CP 및 CP 신장사이에 UGA 종결 코돈을 갖는 Qβ A1 단백질 융합을 코딩하는 플라스미드의 발현에 의해 VLP상의 융합된 에피토프의 효율적인 디스플레이가 매개된다. 또다른 접근법에서, CP 유전자 종결 코돈은 UAA로 변형되고 A1 단백질-안지오텐신 펩티드 부위 융합을 발현시키는 두번째 플라스미드가 함께 형질전환된다. 두번째 플라스미드는 상이한 항생제 내성을 코딩하고 복제 기점은 첫번째 플라스미드와 상용성이다(Kozlovska, T. M., et al., Intervirology 39 : 9-15(1996)). 세번째 접근법에서, CP 및 A1 단백질- 안지오텐신 펩티드 부위 융합은 [Kozlovska et al., Intervirology, 39 : 9-15(1996)]의 도 1에 도시된 바와 같이 프로모터, 예로서 Trp 프로모터에 작동가능하게 연결된 바이시스트론(bicistronic) 방식으로 코딩된다.

추가의 일례로, 안지오텐신 펩티드 부위는 fr CP의 2번 및 3번 아미노산(N-말단 메티오닌이 절단된 CP의 번호화) 상이에 삽입되어 안지오텐신 펩티드 부위-fr CP 융합 단백질이 형성된다. VLP로 자가-어셈블리하는 fr CP 융합 단백질의 작제 및 발현을 위한, 본 발명의 실시에 유용한 벡터 및 발현 시스템이 기술되어 있다(Pushko P. et al., Prot. Eng. 6 : 883-891(1993)). 구체적인 일례로, 안지오텐신 펩티드 부위 서열은 fr CP의 잔기 3 및 4가 결실된 fr CP의 결실 변이체중 2번 아미노산뒤에 삽입된다(Pushko P. et al., Prot. Eng 6 : 883-891(1993)).

RNA 파지 MS-2의 코트 단백질의 N-말단 돌출된 β-헤어핀에 에피토프를 융합시킨 후 RNA 파지 MS-2의 자가-어셈블리된 VLP상에 융합된 에피토프를 제시하는 것 또한 기술되어 있고(WO 92/13081), RNA 파지 MS-2의 코트 단백질내로의 삽입 또는 치환에 의한 안지오텐신 펩티드 부위의 융합도 본 발명의 범위내 포함된다.

본 발명의 또다른 일례로, 안지오텐신 펩티드 부위는 파필로마바이러스(Papillomavirus)의 캡시드 단백질에 융합된다. 더욱 구체적인 일례로, 안지오텐신 펩티드 부위는 소 파필로마바이러스(Papillomavirus) 1형(BPV-1)의 주요 캡시드 단백질 L1에 융합된다. 바쿨로바이러스(baculovirus)/곤충 세포계에서 BPV-1 융합 단백질의 작제 및 발현을 위한 벡터 및 발현 시스템이 기술되어 있다(Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 : 2373-2378(1999), WO 00/23955). BPV-1 L1의 130-136번 아미노산을 안지오텐신 펩티드 부위로 치환하여 BPV-1 L1-안지오텐신 펩티드 부위 융합 단백질을 수득하고, 이는 본 발명의 바람직한 일례이다. 바쿨로바이러스(baculovirus) 벡터내 클로닝 및 Cloning in a baculo바이러스 벡터 및 바쿨로바이러스(baculovirus) 감염 Sf9 세포내 발현이 기술되어 있고, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다(Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 : 2373- 2378(1999), WO 00/23955). 융합된 안지오텐신 펩티드 부위를 디스플레이하는 어셈블린된 입자의 정제는 여러 방식으로, 예를 들면, 겔 여과 또는 수크로스 구배 초원심분리에 의해 수행될 수 있다(Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 : 2373-2378(1999), WO 00/23955).

본 발명의 추가의 일례로, 안지오텐신 펩티드 부위는 Ty VLP로 혼입될 수 있는 Ty 단백질로 융합된다. 더욱 구체적인 일례로, 안지오텐신 펩티드 부위는 TYA 유전자에 의해 코딩되는 캡시드 단백질 또는 p1로 융합된다(Roth, J. F., Yeast 16 : 785-795(2000)). 효모 레트로트랜스포존 Ty1, 2,3 및 4는 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces Serevisiae)로부터 분리된 반면, 레트로트랜스포존 Tf1은 스키조사카로미세스 폼바에(Schizosaccharomyces Pombae)로부터 분리된다(Boeke, J. D. and Sandmeyer, S. B. ,"Yeast Transposable elements,"in The molecular and 세포ular Biology of the Yeast Saccharomyces : Genome dynamics, Protein Synthesis, and Energetics., p. 193, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1991)). 레트로트랜스포존 Ty1 및 2는 식물 및 동물 구성 요소중 copia ㅋ클래스와 관련되는 반면, Ty3은 식물 및 동물 레트로바이러스와 관련된 레트로트랜스포존의 gypsy 패밀리에 속한다. Ty1 레트로트랜스포존에서, Gag 또는 캡시드 단백질로 언급되는 p1 단백질의 길이는 440 아미노산이다. P1은 VLP의 성숙동안 408번 위치에서 절단되어 VLP의 필수 성분인 p2 단백질을 가져온다.

효모에서 p1로의 융합 단백질 및 상기 융합 단백질의 발현을 위한 벡터가 기술되어 있다(Adams, S. E., et al., Nature 329 : 68-70(1987)). 예를 들면, pMA5620 플라스미드의 BamH1 위치내로 안지오텐신 펩티드 부위를 코딩하는 서열을 삽입하여안지오텐신 펩티드 부위는 p1에 융합시킬 수 있다(Adams, S. E., et al., Nature 329 : 68-70(1987)). 외부 에피토프를 코딩하는 서열을 pMA5620 벡터내로 클로닝하여 외부 에피토프의 N-말단에 대하여 C-말단으로(terminally) 융합된 Ty1-15의 p1중 아미노산 1-381을 포함하는 융합 단백질이 발현된다. 유사하게 안지오텐신 펩티드 부위의 N-말단 융합, 또는 p1 서열로의 내부 삽입, 또는 p1 서열 일부 치환 또한 본 발명의 범위내 포함된다. 특히, Ty 단백질 p1중 30-31번, 67- 68번, 113-114번 및 132-133번 아미노산 사이의 Ty 서열내로 안지오텐신 펩티드 부위를 삽입하는 것이(EP0677111) 본 발명의 바람직한 일례이다.

안지오텐신 펩티드 부위의 융합에 적절한 추가의 VLP는 예를 들면 레트로바이러스성-입자(W09630523), HIV2 Gag(Kang, Y. C., et al, Biol. Chem. 380 : 353-364(1999)), Cowpea Mosaic 바이러스(Taylor, K. M. et al., Biol. Chem. 380 : 387-392(1999)), 파르보바이러스(parvovirus) VP2 VLP(Rueda, P. et al., Virology 263 : 89-99(1999)), HBsAg(US 4,722, 840, EP0020416B1)이다.

본 발명의 실시에 적절한 키메라성 VLP의 예는 Intervirology 39 : 1(1996)에 기술되어 있다. 본 발명에서 사용되는 것으로 주시되는 추가의 VLP는 예로서: HPV-1, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-45, CRPV, COPV, HIV GAG, Tobacco Mosaic Virus이다. SV- 40, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 로타바이러스 및 노르워크 바이러스의 바이러스성 입자이 제조되고, 이들 VLP의 키메라성 VLP도 본 발명의 범위내 포함된다.

가교 결합. 안지오텐신 펩티드 부위를 코어 입자에 결합시키는 방법은 본 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있고, 당업자는 다수의 참조문헌을 참조할 수 있다(예: Sambrook, J. et al., eds. , MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.(1989); Ausubel, F. et al., eds. , CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc.(1997); Celis, J. , ed. , Cell BIOLGY, Academic Press, 2nd edition,(1998); Harlow, E. and Lane, D. ,"Antibodies : A Laboratory Manual, "Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.(1988), 모두 참조문헌으로서 본 명세서에서 전체적으로 인용된다.

코어 입자 및 안지오텐신 펩티드 부위를 결합시키는 상이한 방법이 본 명세서에 기술되어 있고 추가로 2002년 1월 18일에 출원된 U. S. patent application No. 10/050,902에 기술되어 있다(본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다). 방법은 각각 JUN 및 FOS 류신 지퍼 단백질 영역을 본 발명의 제 1 및 제 2 결합부로 사용하는 것을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일례는 화학적 가교 결합에 의해 비자연발생된 분자 스캐폴드를 안지오텐신 펩티드 부위와 커플링하는 것을 포함한다. 단백질/펩티드 또는 단백질과 유도된 분자, 예: 안지오텐신 펩티드 부위의 가교 결합을 촉진시키기 위하여 개발된 화합물은 광범위한다. 제한하는 것은 아니지만, 카복실산 유도 활성 에스테르(활성화된 화합물), 혼합된 무수화물, 아실 할라이드, 아실 아지드, 알킬 할라이드, N-말레이미드, 이미노 에스테르, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트를 포함하고, 이는 본 분야의 기술자에게 공지되어 있다. 이는 단백질 분자의 반응 그룹과 공유 결합을 형성할 수 있다. 활성화 그룹에 따라 반응 그룹은 단백질 그룹상의 리신 잔기의 아미노 그룹 또는 반응시 아미드, 아민, 티오에테르, 아미딘 우레아 또는 티오우레아 결합을 형성하는, 캐리어 단백질 또는 변형된 캐리어 단백질 분자내 티올 그룹이다. 본 분야의 기술자는 추가로 적절한 활성화 그룹, 예를 들면 일반 참고문헌, 예로서 [Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking(Wong(1991) CRC Press, Inc. , Boca Raton, Fla. )에서 확인할 수 있다. 대부분의 시약은 바람직하게는 리신 쇄 그룹과 반응한다.

일례로, 안지오텐신 펩티드 부위는 헤테로이작용기성 가교제를 사용하여 화학적 가교-결합에 의해 코어 입자에 결합한다. 수개의 헤테로-이작용기성 가교제는 본 분야에 공지되어 있다. 일례로, 헤테로-이작용기성 가교제는 코어 입자의 리신 잔기의 측쇄 아미노 그룹과 반응할 수 있는 작용 그룹, 및 존재하거나, 환원 반응에 이용할 수 있도록 제조되거나, 안지오텐신 펩티드 부위상에서 조작되고 임의로 환원 반응에 이용할 수 있도록 제조된 시스테인 잔기 또는 설프하이드릴 그룹과 반응할 수 있는 작용 그룹을 포함한다. 소위 유도화로 불리는 공정의 첫번째 단계는 코어 입자와 가교제의 반응이다. 이 반응 산물은 활성화된 캐리어라 불리는 활성화된 코어 입자이다. 두번째 단계에서 반응하지 않은 가교제는 겔 여과 또는 투석과 같은 일반적인 방법을 사용하여 제거된다. 세번째 단계에서, 항원(예: 안지오텐신 펩티드 부위)는 활성화된 코어 입자와 반응하고, 이 단계는 커플링 단계로 불린다. 임의로 반응하지 않은 항원이 제거될 수 있다.

다른 일례로, 안지오텐신 펩티드 부위는 제 1 결합부에 가교 결합하기 적절한 활성 부위로 유도화되어 활성화된 안지오텐신 펩티드 부위를 형성한다. 이 유도화는 분리된 안지오텐신 펩티드 부위상에서 또는 화학적 합성을 통해 발생된다. 활성화된 안지오텐신 펩티드 부위는 코어 입자와 반응하므로써 커플링하게 된다.

수개의 헤테로-이작용기성 가교제가 본 분야에 공지되어 있다. 이는 가교제 SMPH(Pierce), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA 및 Pierce Chemical Company(Rockford, IL, USA)로부터 입수되고 아미노 그룹에 대하여 반응성인 하나의 작용 그룹 및 SH 잔기에 대하여 반응성인 하나의 작용 그룹을 갖는, 이용가능한 다른 가교제를 포함한다. 상기 언급한 가교제 모두 티오에테르 결합을 형성한다. 본 발명의 실시에 적절한 다른 부류의 가교제는 커플링시 안지오텐신 펩티드 부위 및 코어 입자사이에 디설파이드 결합을 도입하는 것을 특징으로 한다. 이 부류에 속하는 가교제는 예를 들면 SPDP and Sulfo-LC-SPDP(Pierce)를 포함한다. 유기 화학 분야의 반응 이론에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 가교제에 의한 코어 입자의 유도화 범위는 실험 조건, 예를 들면, 반응 파트너의 농도, 한 시약의 다른 것에 대한 초과량, pH, 온도 및 등장성을 달리하여 영향을 받을 수 있다. 커플링도, 즉 캐리어 1개당 안지오텐신 펩티드 부위의 양은 상기 기술한 실험 조건을 달리하여 백신의 필요조건에 일치하도록 조절할 수 있다. 안지오텐신 펩티드 부위의 용해도가 각 서브유니트상에 커플링할 수 있는 항원의 양을 제한할 수 있고, 수득한 백신이 불용성인 경우에는 서브유니트당 항원의 양을 줄이는 것이 바람직하다.

구체적인 일례로 화학 약품은 헤테로이작용기성 가교제, (1) 아미노 그룹과 반응성인 숙신이미드 그룹 및 (2) SH 그룹과 반응성인 말레이미드 그룹 반응성을 포함하는 ε-말레이미도카프론산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(Tanimori et al., J Pharm. Dyn. 4 : 812(1981); Fujiwara et al., J Immunol. Meth. 45 : 195(1981))이다. 제 1 결합부의 이종 단백질 또는 폴리펩티드는 헤테로이작용기성 가교제의 숙신이미드 부위에 대한 반응 부위로서 작용하는 하나 이상의 리신 잔기를 포함하도록 조작될 수 있다. 일단 이종 단백질의 리신 잔기에 화학적으로 커플링되면, 헤테로이작용기성 가교제의 말레이미드 그룹은 항원 또는 항원 결정기상의 시스테인 잔기의 SH 그룹과 반응에 이용될 것이다. 이 경우 항원 또는 항원 결정기 시료는 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드 제 1 결합부상에 결합한 가교제상의 유리 말레이미드에 반응할 수 있도록 제 2 결합부로서 설프하이드릴 잔기의 조작을 필요로 할 수 있다. 따라서, 이 경우, 헤테로이작용기성 가교제는 비자연적으로 발생된 분자 스캐폴드의 제 1 결합부에 결합하고 안지오텐신 펩티드 부위의 제 2 결합에 스캐폴드를 연결시킨다.

안지오텐신 펩티드 부위를 코어 입자에 커플링하는 다른 방법은 안지오텐신 펩티드 부위가 카보디이미드 결합을 사용하여 코어 입자에 가교결합하는 방법을 포함한다. 이는 카보디이미드 EDC(1-(3- 디메틸아미노프로필) -3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드), 및 NHS를 포함한다. 한 방법에서, EDC를 유리 카복실산, 아미노 또는 아미도 부위를 포함하는 안지오텐신 펩티드 부위와 혼합하고 단백질 캐리어에 가한다. 다른 방법에서, 상기 부위는 호모-이작용기성 가교제, 예로서 구트아르알데히드, DSG, BM [PEO]₄, BS³,(Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA) 또는 코어 입자의 아민 그룹 또는 카복실 그룹에 대하여 반응성이 작용 그룹을 갖는 다른 공지된 호모-이작용기성 가교제를 사용하여 코어 입자에 결합한다.

코어 입자 및 바이러스성 입자에 합텐을 결합시키기에 적절한 각각의 추가의 가교-결합 방법 및 가교제, 및 커플링 반응 수행 및 화학 가교제 및 화학 가교결합 방법에 사용에 대한 가이던스는 [Hermanson, G. T. in Bioconjugate Techniques, Academic Press Inc. , San Diego, CA, USA.]에서 찾을 수 있다.

코어 입자를 안지오텐신 펩티드 부위에 결합시키는 추가의 방법은 코어 입자를 바이오틴화하고, 상기 부위를 스트렙타아비딘에 융합시킨 방법, 또는 상기 부위 및 코어 입자가 바이오틴화된 방법을 포함한다. 이 경우, 안지오텐신 펩티드 부위는 먼저 유리 결합부가 다음 단계에서 첨가되는 코어 입자와의 결합에도 이용할 수 있도록 스트렙타아비딘에 대한 상기 부위의 비를 조절하여 스트렙타아비딘 또는 아비딘에 결합할 수 있다. 다르게는, 모든 성분을 "원 팟(one pot)"에서 혼합할 수 있다. 가용성 형태의 수용체 및 리간드가 이용될 수 있고 코어 입자 또는 안지오텐신 펩티드 부위에 가교결합할 수 있는 다른 리간드-수용체 쌍을 안지오텐신 펩티드 부위를 코어 입자에 결합시키기 위한 결합제로서 사용할 수 있다.

안지오텐신 펩티드 부위

따라서, 일면으로 본 발명은 안지오텐신 펩티드 부위에 대한 면역화에 적절한 안지오텐신 펩티드 부위의 정돈된 반복적 어레이를 제공한다. 바람직한 안지오텐신 펩티드 부위는 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II의 서열 또는 그의 단편을 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된 것이다. 상기 기술한 바와 같이, 하나 이상의 추가의 아미노산을 안지오텐신 펩티드 부위 서열의 C- 또는 N-말단에 적절하게 가하여 특히, 안지오텐신 펩티드 부위가 코어 입자와 일정한 방향으로 정돈되게 결합할 수 있도록 할 수 있다.

본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트에 사용하기 위한 바람직한 안지오텐신 펩티드 부위는 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II의 전장 서열을 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된 것이다. 바람직하게, 안지오텐신 펩티드 부위는 안지오텐신 II의 전장 서열, 예로서 CGGDRVYIHPF(본 명세서에서 "안지오 1"로 언급; 안지오텐신 펩티드 서열 오외의 아미노산은 이탤리체 표기), 또는 안지오텐신 I의 전장 서열, 예로서 CGGDRVYIHPFHL("안지오 2"), DRVYIHPFHLGGC("안지오 3"), 및 CDRVYIHPFHL("안지오 4")을 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된다. 추가로 바람직한 예는 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II 서열중 단편 하나만을 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된 안지오텐신 펩티드 부위이다. 특정 일례로 안지오텐신 펩티드 C- 말단에 적어도 3개의 아미노산을 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된 안지오텐신 펩티드 부위, 및 다른 일례로 N-말단의 적어도 4개의 아미노산이 결실된 안지오텐신 펩티드 부위를 포함한다. 다른 관련된 일례는 안지오텐신 I로부터 유도된 것, 예로서 CHPFHL("안지오 5") 및 CGPFHL("안지오 6"), 또는 안지오텐신 II로부터 유도된 것, 예로서 CYIHPF("안지오 7"), CGIHPF("안지오 8") 및 CGGHPF("안지오 9")이다.

본 발명의 추가의 일례는 안지오텐신 펩티드 N- 말단의 적어도 3개의 아미노산을 포함하거나, 다르게는 상기로 구성된 안지오텐신 펩티드 부위, 추가의 바람직한 일례로, C-말단의 적어도 4개 바람직하게 5개의 아미노산이 결실된 안지오텐신 펩티드 부위를 사용한다. 다른 관련된 것은 DRVYIGGC("안지오 13"), DRVYGGC("안지오 14") 및 DRVGGC("안지오 15")이다.

그러나, 본 분야의 기술자는 하기 안지오텐신 펩티드 부위의 예는 제한적인 예가 아니고, C 또는 N 말단에 커플링시키깅 위하여 첨가되는 아미노산의 성질 및 수는 다양할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 발명에서, 안지오텐신 펩티드 부위를 면역화하는 것이 반드시 어느 특정 안지오텐신 펩티드 부위의 본래의 전(entire) 분자를 포함하는 것은 아니다. 관심의 대상이 되는 안지오텐신 펩티드 부위에 대한 면역 반응은 안지오텐신 펩티드 부위의 단편, 또는 그의 유도체, 돌연변이, 뮤테닌을 사용하여 형성될 수 있다.

본 발명은 안지오텐신 펩티드 부위와 코어 입자의 상이한 결합 위치 및 결합 수단을 포함하고, 본 명세서에 그에 대한 제한하지 않고 기술한다. 바람직한 결합 위치 및 수단은 선행 실험, 이론 및 일반화된 실험에 기초하여 본 분야의 기술자에 의해 결정될 수 있다.

컨쥬게이트, 백신 및 사용 방법

따라서, 본 발명은 하나 이상의 RAS 성분들, 특히 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위와 관련되는 질병 또는 이상을 예방하고/거나 약독화시키기 위하여 사용될 수 있는 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명은 추가로 개체, 특히 동물 예로서, 표유동물, 및 특히 인간에서 질병 또는 이상을 예방하고/거나 약독화시키기 위한 백신화 방법을 제공한다. 바람직한 일례로, 본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트는 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위에 결합하는, 항체를 포함하는 면역 분자의 생산을 유도하는 면역반응을 자극한다. 본 발명은 추가로 개체에서 RAS와 관련되는 질병 또는 이상을 예방하고/거나 약독화시키기 위한 백신화 방법을 제공한다.

면역 반응의 성질 또는 타입은 본 개시의 제한적인 요소가 아니다. 치료적 또는 예방적 면역 반응의 바람직한 결과는 본 분야에 공지된 원리, 및 질병에 따라 상이할 수 있다. 하기의 기계적 설명에 의해 본 발명을 제한하지 않고, 본 발명은 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 종에 결합하는 항체를 유도하여 동시에 관련된 모든 종의 안지오텐신을 차단할 수 있다. 또한, 유도된 항체는 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II의 C-말단에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 조건하에, 유도된 항체는 각각 레닌 또는 ACE에 의해 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I의 활성화를 차단할 것이다. 그럼에도불구하고, 레닌 또는 ACE과 상이한 프로테아제, 예로서 엔도펩티다아제 및 아미노펩티다아제는 N-말단으로부터 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II를 분해하여 항체-결합된 본래의 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II가 축적되지 않도록 할 수 있다.

추가로, 본 분야에 공지된 원리, 및 질병에 따라 상이한 타입의 면역 반응을 자극하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 일부 면역 반응은 다른 면역 반응보다 특정 항원에 대하여 더욱 적절하다고 공지되어 있다. 실제로, 면역 반응은 부적절하고, 병원성 염증과 같은 병리를 유발할 수 있다.

면역 반응 성질은 항원의 성질, 신체내 투여 경로, 투여량, 투여 요법, 항원 반복적 성향, 숙주 백그라운드, 및 면역계의 시그날 인자에 의해 영향을 받을 수 있다. 이는 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 면역반응은 본 분야의 공지되 이론 및 일반적인 실험 방법 모두를 적용하여 적절하게 조절될 수 있다.

추가로, 본 발명은 안지오텐신 펩티드 부위에 대한 백신화 과정동안 상이한 코어 입자를 사용하는 것을 포함한다. 코어 입자, 예로서 섬모에 대한 강력한 면역 반응을 나타내는 개체는 코어 입자는 상이하지만 동일한 안지오텐신 펩티드 부위를 포함하는 컨쥬게이트에의해 면역화될 수 있다.

이론에 국한하지 않고, 본 발명의 컨쥬게이트는 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위에 대한 면역 반응을 일으키는 약제학적 컨쥬게이트의 성분, 특히 백신으로서 특히 신규하고 놀라운 잇점을 제공한다. BSA, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 파상풍톡소이드, 박테리아 세포벽 단백질, 콜레라독소, 및 슈도모나스 아에루기노세(Peudomonas aeruginose) 외독소(Exotoxin) A를 포함하는, 본 분야에 공지된 다른 캐리어는 개체, 특히 인간에 사용하기에는 부적절할 수 있다. 상기 언급한 캐리어는 알레르기 반응을 유도할 수 있거나 병원성 면역반응(예를 들면, 콜레라독소, KLH, BSA)을 자극할 수 있다. 상기 언급한 캐리어는 인간에 사용하기 부적절하다는 점을 고려하면, 어쥬번트 예로서 프로인트 완전아주반트를 필요로 할 수 있다. 다수의 캐리어가 현 백신의 성분이 될 수 있다(예를 들면, 파상풍톡소이드, 콜레라독소, 외독소 A). 개체들은 이들 캐리어에 대한 높은 수준의 사전(pre-existing)을 갖고 있기 때문에 항원-캐리어 컨쥬게이트에 의한 면역화는 신규 항원보다 상기 캐리어에 대하여 상대적으로 더욱 우수한 면역 반응을 유도할 것이다. 이러한 이유에서, 개별적으로 또는 전체적으로 본 발명의 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트는 상기 기술한 캐리어 단백질에 대하여 유용한 개선안을 제공한다.

본 발명의 일례의 사용에서 코어 입자에 컨쥬게이트된 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위는 항원제시 세포에 의해 포획되어 T-세포 헬프를 자극하여 면역 반응을 유도할 수 있다. T 헬퍼 세포 반응 타입 1(T_H1) 및 타입 2(T_H2) T 헬퍼 세포 반응으로 분류될 수 있다(Romagnani, Immunol. Today 18 : 263-266(1997)). T_H1 세포는 인터페론-감마 및 B 세포가 IgGI-3 항체를 생산하도록 하는 다른 시토카인을 분비한다. 반대로, T_H2 세포에 의해 생산되는 중요한 시토카인은 IL-4이며 이는 B 세포가 IgG4 및 IgE를 생산하도록 한다. 여러 실험 시스템에서, T_H1 세포는 T_H2 세포의 유도를 억제하고, 반대의 경우도 동일하기 때문에 T_H1 및 T_H2 반응은 서로 배타적이다. 따라서, 강력한 T_H1 반응을 유발하는 항원은 동시에 T_H2 반응을 억제시켜 IgE 항체의 생산을 억제한다. 흥미롭게도 실질적 모든 바이러스는 숙주에서 T_H1 반응을 유도하지만 IgE 항체는 생산하지 못한다(Coutelier et al., J Exp. Med. 165 : 64-69(1987)). 알레르긴 반응에서 IgE 동형의 항체는 중요한 성분이다. 비만 세포는 표면상의 IgE 항체에 결합하고 비만세포 표면상에 결합한 IgE 분자에 특이적 항원이 결합할 때 히스타민 및 알레르기 반응의 다른 매개물질을 방출한다.? 67 T_H1 반응에 전형적인 동형 패턴을 살아있는 바이러스로 제한하는 것은 아니지만, 불활성화된 또는 재조합 바이러스 입자에 대해서도 관찰되었다(Lo-Man et al., Eur. J. Immunol. 28 : 1401-1407(1998)). 따라서, 본 발명의 방법을 사용하여(예: 알파백신 기술), 바이러스 입자에 다양한 안지오텐신 펩티드 부위를 첨가(decorate)하여 면역화에 사용할 수 있다. 생성된 어레이의 "바이러스 구조"에 의해 T_H1 반응을 유도하고, "보호" IgG1-3 항체를 생산하고, 알레르기 반응을 유발하는 IgE 항체 의 생산은 방지할 것이다. 따라서, 본 발명은 바람직한 면역 반응, 현저하게 T_H1 반응을 유발할 수 있는 컨쥬게이트를 포함한다. 또한, 본 발명은 관심의 대상이 되는 항원에 대한 다른 백신에 의해 유도된 알레르기 반응을 상쇄시키기 위한 본 발명의 컨쥬게이트의 용도를 포함한다.

본 발명의 추가의 잇점은 T-세포 헬프의 존재 여부에 상관없이 안지오텐신 펩티드 부위가 입자상에 유효한 면역반응을 유도할 수 있는 규칙적이고 반복적 배열로 제시될 수 있다는 것이다. 본 발명의 이러한 특성이 특히 이롭다.

분리된 단백질과 달리, 바이러스는 T-세포 헬프의 존재 여부에 상관없이 어느 어쥬번트의 부재하에서 즉각적이고 유효한 면역 반응을 유도한다(Bachmann & Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol: 15: 235-270(1997)). 바이러스는 주로 단백질로 구성되는 것은 아니지만, 분리된 성분보다 더욱 강력한 면역 반응을 일으킬 수 있다. B-세포 반응의 경우 바이러스의 면역원성에 대한 중요한 요소는 표면 에피토프의 반복성 및 정렬이라고 공지되어 있다. 다수의 바이러스는 B 세포상의 에피토프-특이성 이뮤노글로블린과 효율적으로 가교결합하는 에피토프의 규칙적인 배열을 디스플레이하는 준 결정형(quasi-crystalline) 표면을 나타낸다(Bachmann & Zinkernagel, Immunol. Today 17: 553-558(1996)). B 세포상의 표면 이뮤노글로블린의 가교결합은 세포-사이클 진행 및 IgM 항체의 생산을 직접적으로 유도하는 강력한 활성화 시그날이다. 추가로, 이렇게 유도된 B 세포는 T 헬퍼 세포를 활성화시켜 결국에는 B 세포에서 IgM으로부터 IgG 항체 생산하도록 스위치를 유도하고, 어느 백신화가 목적으로 하는 장기간 B-세포 메모리를 형성한다(Bachmann & Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270(1997)). 본 발명은 안지오텐신 펩티드 부위와 코어 입자의 결합을 통해 면역화에 사용하는 안지오텐신 펩티드 부위의 반복성을 증가시켜 면역화 효율을 개선시킬 수 있는 한 방법을 제공한다. 앞서 주시된 바와 같이, 본 발명은 형성체(organizer)의 수/또는 배열을 바꾸기 위하여 변형된 코어 입자를 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다.

본 분야의 기술자가 이해하고 있는 바와 같이, 본 발명의 컨쥬게이트를 개체에 투여하는 경우, 염, 완충액, 어쥬번트, 또는 컨쥬게이트의 효능을 향상시키기에 바람직할 수 있는 다른 물질을 포함하는 컨쥬게이트로 존재할 수 있다. 약제학적 컨쥬게이트 제조시 사용하기 적절한 물질은 다수의 공급원, 예를 들면, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol, A, ed., Mack Publishing Co. ,(1990))에 의해 제공된다.

본 발명의 컨쥬게이트는 수령자가 투여에 대하여 내성인 경우 "약물학적으로 허용가능"이라고 언급된다. 또한, 본 발명의 컨쥬게이트는 "치료학적 유효량"(즉, 바람직한 생리학적 효능을 일으키는 양)으로 투여될 것이다. 면역반응을 유도하기 위하여, 본 발명의 컨쥬게이트는 본 분야에 공지된 다양한 방법으로 동물, 적절하게 인간과 같은 포유동물에 투여될 수 있지만, 일반적으로 주입, 흡입, 경구 투여, 또는 다른 적절한 물리적 방법에 의해 투여될 것이다. 다르게 컨쥬게이트는 근육내, 정맥내, 점막관통, 경피 또는 피하에 투여될 수 있다. 투여용 컨쥬게이트의 성분은 멸균수(예: 생리학적 염수) 또는 비수용성 용액 및 현탁액을 포함한다. 비수용성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물유 예로서, 올리브 오일, 및 주사용 유기 에스테르 예로서, 에틸 올레이트이다. 밀봉드레싱용 캐리어를 사용하여 피부 투과성을 증진시키고 항원 흡착을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 추가의 일면은 본 발명의 컨쥬게이트의 면역화에 의해 생산된 면역 분자를 포함한다. 면역 분자는 백신화된 개체내에서 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위를 표적하여 결합하는데 유용할 수 있다. 또한, 면역 분자는 본 발명의 컨쥬게이트 또는 컨쥬게이트에 대하여 면역화되지 않은 또다른 개체로 전달된 경우, "수동" 전달 면역에 유용할 수 있다. 일례로, 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위에 결합하기 적절한 모노클로날 항체는 개체내로 전달되어 치료하거나 예방시킬 수 있다.

본 발명은 또한 면역분석법(예: ELISA)으로 하나 이상의 안지오텐신 펩티드 부위를 검출하기 위한 키트내에서 본 발명의 컨쥬게이트 또는 컨쥬게이트로 면역화되어 생산된 항체의 용도를 포함한다. 관련된 일례로, 안지오텐신 펩티드 부위의 반복적이고 정돈된 어레이가 결합분석법에서 상기 부위에 대한 항체의 검출에 유용할 수 있다. 본 발명의 다른 일례로 본 발명의 컨쥬게이트를 제조하는 방법 및 특히 RAS와 관련되는 하나 이상의 생리학적 질병, 예로서 고혈압, 뇌졸증, 경색증, 울혈심부전증, 신부전 또는 망막출혈을 치료하기 위하여 상기 컨쥬게이트를 사용하는 치료 방법을 포함한다.

관련 분야의 기술자는 본 명세서에 기술한 방법 및 적용에 대한 적절한 변형 및 조절에 대하여 용이하게 이해할 수 있고 본 발명의 또는 그의 어느 일례로부터 벗어나지 않도록 수행할 수 있다. 본 발명을 상세히 설명하고, 하기 실시예를 참고로 하여 더욱 명확하게 이해될 것이며, 실시예는 단지 설명을 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 안지오텐신 I 및 안지오텐신 II으로부터 유도된 펩티드와 Qβ 의 커플링 및 생성된 컨쥬게이트를 사용한 마우스의 면역화

A. 컨쥬게이트 제조

하기 안지오텐신 펩티드 부위를 화학적으로 합성하였다: CGGDRVYIHPF("안지오 1"), CGGDRVYIHPFHL("안지오 2"), DRVYIHPFHLGGC("안지오 3"), CDRVYIHPFHL("안지오 4"), CHPFHL("안지오 5"), CGPFHL("안지오 6"), CYIHPF("안지오 7"), CGIHPF("안지오 8"), CGGHPF("안지오 9"), DRVYIGGC("안지오 13"), DRVYGGC("안지오 14") 및 DRVGGC("안지오 15"). 하기에 기술하는 Qβ와의 화학적 커플링에 사용하였다.

펩티드 안지오 1 내지 안지오 4의 경우: 20 mM Hepes. 150 mM NaCl pH 7.4중 5 ml의 2 mg/ml Qβ 캡시드 단백질 용액을 30분동안 H₂0중의 507㎕의 13 mg/ml Sulfo-MBS(Pierce) 용액과 25℃하에 요동식 진탕기(rocking shaker)상에서 반응시켰다. 이어서, 반응 용액을 2 L의 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.4에 대하여 2시간동안 4℃에서 2회 투석하였다. 665㎕의 투석된 반응 혼합물을 2.8㎕의 각각의 상응하는 100 mM 펩티드 저장액(DMSO중)과 2시간동안 25℃하에 요동식 진탕기에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 연속하여 2리터의 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.4에 대하여 2시간동안 4℃에서 2회 투석하였다.

펩티드 안지오 5-9 및 안지오 13-15: 20 mM Hepes. 150 mM NaCl pH 7.2중 3 ml의 2 mg/ml Qβ 캡시드 단백질를 50분동안 DMSO중 86㎕의 100 mM SMPH(숙신이미딜-6-(β-말레이미도프로피오노아미도 헥사노에니트, Pierce) 용액과 25℃하에 요동식 진탕기에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 연속하여 2리터의 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.2에 대하여 2시간동안 4℃에서 2회 투석하였다. 514㎕의 투석된 반응 혼합물을 3.6㎕의 각각의 상응하는 100 mM 펩티드 저장액(DMSO중)과 4시간동안 25℃하에 요동식 진탕기에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 연속하여 2리터의 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.4에 대하여 2시간동안 4℃에서 2회 투석하였다.

B. 면역화

암컷 Balb/c 마우스를 어쥬번트를 첨가하지 않고 Qβ 캡시드 단백질과 커플링된 9개의 안지오텐신 펩티드 유도체중 하나로 백신화하였다. 각 샘플의 총 단백질중 50μg(Qβ- 안지오 1-4 백신) 또는 20μg(Qβ-안지오 5-9 백신)을 PBS에 200㎕로 희석학 0일 및 14일째 피하 주사하였다(배쪽 양면(two ventral side)에 100㎕). 21일째 마우스를 안와후에 출혈시키고 그 혈청을 안지오텐신-특이적 ELISA를 사용하여 분석하였다.

인간 및 마우스의 안지오텐신 펩티드 서열이 서로 일치한다는 것에 주시하여야 한다. 따라서, 본 발명에 따라 항원 결정기로서 안지오텐신 펩티드 부위를 포함하는 백신 또는 컨쥬게이트를 사용하여 인간 또는 마우스를 면역화시키는 것이 자가-항원에 대한 백신화이다.

실시예 2: Qβ과 커플링된 안지오텐신 I 및 안지오텐신 II으로부터 유도된 펩티드에 의해 백신화된 마우스 혈청의 ELISA 분석

실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 안지오 1 내지 안지오 9 및 안지오 13-15 펩티드 유도체를 화학적 가교제 설포-SPDP를 사용하여 개별적으로 소 RNAse A(Sigma)에 커플링하였다. ELISA 플레이트를 밤새도록 4℃에서 피복 완충액(0.1M NaH₂CO₃, pH 9.6)중 10 pg/ml의 농도의 커플링된 RNAse 시료로 코팅하였다. 다르게는 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 II(SIGMA)를 동일한 코팅 완충액에 200g/ml의 농돌 희석하였다. 플레이트를 차단 완충액(PBS중 2% 송아지 혈청 알부민(BSA)(pH 7.4)/ 0.05% Tween 20)으로 2시간동안 37℃에서 차단시키고, PBS(pH 7. 4)/ 0. 05% Tween 20로 세척한 후 차단 완충액중 일련의 희석된 마우스의 혈청과 함께 실온에서 2시간동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBS(pH 7. 4)/ 0. 05% Tween 20로 세척한 후 1 pg/ml의 홍당무과산화효소-표지된 염소 항-마우스 IgG 항체와 1시간동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBS(pH 7. 4)/ 0. 05% Tween 20로 세척하고 기질 용액을 가하였다(0.066M Na₂HP0₄, 0.035 M 시트르산(pH 5.0) + 0.4 mg OPD(1,2-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) + 0. 01% H₂0₂). 10분후 5% H₂ SO₄ 을 사용하여 발색 반응을 종결시키고 450 nm에서 흡광도를 판독하였다.

대조군으로서, 동일한 마우스의 면역전 혈청을 시험하였다. Qβ와 가교결합된 관련이 없는 펩티드 또는 다른 캐리어로 면역화된 마우스의 혈청을 사용한 대조군 ELISA 시험은 검출된 항체가각 펩티드에 대하여 특이성임을 나타내었다. ELISAdptj 1/2 최대 시그날(최대 흡광동의 50%)를 나타내는 역 혈청 희석율(Reciprocal serum dilution)로서 ELISA 역가를 산출하였다.

결과

도 1은 Qβ 캡시드 단백질에 커플링된 안지오 1-4 펩티드로 면역화된 마우스의 혈청중 안지오 2 펩티드 및 안지오텐신 I에 특이적인 IgG 항체의 ELISA 분석을 나타낸다. 도에서 사용되는 바, Qβ-안지오 1, Qβ-안지오 1, Qβ-안지오 3 및 Qβ-안지오 4는 안지오텐신 펩티드의 상기 정의에 따라 유도된 혈청을 갖는 마우스에 주사된 백신을 나타낸다. 암컷 Balb/c 마우스를 0일 및 14일째 피하로 PBS중 50μg의 백신에 의해 백신화시켰다. 21째 Qβ-안지오 1, Qβ-안지오 2, Qβ- 안지오 3 및 Qβ-안지오 4로 백신화된 마우스의 혈청중 IgG 항체를 RNAse A와 커플링된 안지오 2 펩티드 및 안지오텐신 I에 대하여 측정하였다. 대조군으로서, 면역전 혈청 또한 분석하였다. 지정한 혈청 희석액에 대한 결과를 450nm에서 흡광도로 나타내었다. 각 3마리의 평균값(표준 편차 포함)을 안지오 2에 대하여 나타내었다. 각 2마리의 평균값을 안지오텐신 I에 대하여 나타내었다. 안지오 2, 안지오 3 또는 안지오 4 펩티드로 면역화된 마우스는 안지오 2, 안지오 3 및 안지오 4 펩티드와 매우 유사한 안지오 1 및 안지오텐신 I로 백신화된 것보다 더욱 높은 역가를 나타내지만 모든 백신화된 마우스는 안지오 2 펩티드 및 안지오텐신 I에 대한 IgG 항체를 제조하였다.

도 2는 Qβ 캡시드 단백질에 커플링된 안지오 1-4 펩티드로 면역화된 마우스의 혈청중 안지오 1 펩티드 및 안지오텐신 II에 특이적인 IgG 항체의 ELISA 분석을 나타낸다. 도에서 사용되는 바, Qβ-안지오 1, Qβ-안지오 1, Qβ-안지오 3 및 Qβ-안지오 4는 안지오텐신 펩티드의 상기 정의에 따라 유도된 혈청을 갖는 마우스에 주사된 백신을 나타낸다. 암컷 Balb/c 마우스를 0일 및 14일째 피하로 PBS중 50μg의 백신에 의해 백신화시켰다. 21째 Qβ-안지오 1, Qβ-안지오 2, Qβ- 안지오 3 및 Qβ-안지오 4로 백신화된 마우스의 혈청중 IgG 항체를 RNAse A와 커플링된 안지오 1 펩티드 및 안지오텐신 II에 대하여 측정하였다. 대조군으로서, 면역전 혈청 또한 분석하였다. 지정한 혈청 희석액에 대한 결과를 450nm에서 흡광도로 나타내었다. 각 3마리의 평균값(표준 편차 포함)을 안지오 1에 대하여 나타내었다. 각 2마리의 평균값을 안지오텐신 II에 대하여 나타내었다. 안지오 1로 면역화된 마우스는 안지오 1 펩티드 및 안지오텐신 II와 매우 유사한 고역가를 나타내지만, 모든 백신화된 마우스는 안지오 1 펩티드 및 안지오텐신 II에 대한 IgG 항체를 제조하였다.

도 3은 Qβ 캡시드 단백질에 커플링된 안지오 5-9 펩티드로 면역화된 마우스의 혈청중 안지오 2 펩티드 및 안지오텐신 I에 특이적인 IgG 항체의 ELISA 분석을 나타낸다. 도에서 사용되는 바, Qβ-안지오 5, Qβ-안지오 6, Qβ-안지오 7, β-안지오 8 및 Qβ-안지오 9는 안지오텐신 펩티드의 상기 정의에 따라 유도된 혈청을 갖는 마우스에 주사된 백신을 나타낸다. 암컷 Balb/c 마우스를 0일 및 14일째 피하로 PBS중 20μg의 백신에 의해 백신화시켰다. 21째 Qβ-안지오 4, Qβ-안지오 5, Qβ-안지오 6, Qβ-안지오 7, β-안지오 8 및 Qβ-안지오 9로 백신화된 마우스의 혈청중 IgG 항체를 RNAse A와 커플링된 안지오 2 펩티드 및 안지오텐신 I에 대하여 측정하였다. 지정한 혈청 희석액에 대한 결과를 450nm에서 흡광도로 나타내었다. 각 2마리의 평균값을 나타내었다. β-안지오 8 및 Qβ-안지오 9로 백신화된 두마리의 마우스는 안지오 2 펩티드 및 안지오텐신 I에 대한 매우 낮은 역가 또는 비특이성 역가를 나타내었고, 이는 주로 안지오텐신 II의 C-말단에 특이적이지만, 안지오텐신 I에는 비특이성인 백신 유도 항체의 두가지 형태를 암시한다(참조 도 4).

도 4는 Qβ 캡시드 단백질에 커플링된 안지오 5-9 펩티드로 면역화된 마우스의 혈청중 안지오 1 펩티드 및 안지오텐신 II에 특이적인 IgG 항체의 ELISA 분석을 나타낸다. 도에서 사용되는 바, Qβ-안지오 5, Qβ-안지오 6, Qβ-안지오 7, β-안지오 8 및 Qβ-안지오 9는 안지오텐신 펩티드의 상기 정의에 따라 유도된 혈청을 갖는 마우스에 주사된 백신을 나타낸다. 암컷 Balb/c 마우스를 0일 및 14일째 피하로 PBS중 20μg의 백신에 의해 백신화시켰다. 21째 Qβ-안지오 4, Qβ-안지오 5, Qβ-안지오 6, Qβ-안지오 7, β-안지오 8 및 Qβ-안지오 9로 백신화된 마우스의 혈청중 IgG 항체를 RNAse A와 커플링된 안지오 1 펩티드 및 안지오텐신 II에 대하여 측정하였다. 지정한 혈청 희석액에 대한 결과를 450nm에서 흡광도로 나타내었다. 각 2마리의 평균값을 나타내었다. β-안지오 5 및 Qβ-안지오 6으로 백신화된 두마리의 마우스는 안지오 1 펩티드 및 안지오텐신 II에 대한 매우 낮은 역가 또는 비특이성 역가를 나타내었고, 이는 주로 안지오텐신 I의 C-말단에 특이적이지만, 안지오텐신 II에는 비특이성인 백신 유도 항체의 두가지 형태를 암시한다(참조 도 3).

하기 표가 Qβ에 커플링된 안지오 펩티드 1 내지 9로 백신화된 마우스 혈청의 ELISA 분석을 요악한다. 21일째 평균 ELISA 역가는 실시예 2에 기술된 바와 같이 산출하였다.

표 1 : 마우스 백신화에 사용된 안지오텐신 유도 펩티드 및 사용된 펩티드, 및 안지오텐신 I 및 안지오텐신 II에 대하여 생성된 항체 반응.

*n.t = 비측정

주시 : 모든 시험한 항원에 대하여 면역전 혈청은 50 미만의 역가를 가졌다.

안지오 5 및 안지오 6에 대한 결과는 펩티드가 안지오텐신 I을 선택적으로 인식하다록 유도될 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 안지오 7-9에 대한 결과는 안지오텐신 II는 선택적으로 인식하지만 안지오텐신 I는 인식못하는 항체를 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. 안지오텐신 I 및 II는 C-말단에서 2개의 아미노산만 상이하고 나머지 8개의 아미노산은 일치하기 때문에 이들 결과를 통해 안지오 5 또는 안지오 6에 의해 유도된 모든 항체는 선택적으로 안지오텐신 I의 C-말단를 인식하고 안지오 7-9, 특히 안지오 8-9에 의해 유도된 모든 항체는 선택적으로 안지오텐신 II의 C-말단를 인식한다는 것이 입증되었다. 따라서, 공유하는 8개의 아미노산은 인식되지 않고 특히 공유하는 N-말단은 인식되지 않는다. 따라서, 결합시 N-말단은 항체내 묻혀있지 않기 때문에 프로테아제에 영향을 받기 쉽다.

명확한 이해를 위해 설명 및 실시예를 통해 더욱 상세힌 본 발명을 전체적으로 기술하였고, 본 분야의 기술자는 본 발명의 범위 또는 그의 특정 일례에 영향을 주지 않으면서 광범위하고 동등한 범위의 조건, 제조 및 다른 파라미터내에서 본 발명을 변형하거나 수정하여 동일하게 수행할 수 있꼬, 그러한 수정 및 변형이 본 발명의 범위내 포함된다는 것을 이해할 것이다.

본 명세서에서 기술된 모든 출원, 특허 및 특허 출원은 본 발명이 포함된 분야의 기술자의 수준으로 암시되고, 각 개의 출원, 특허 및 특허 출원은 참고문헌으로서 인용된다고 구체적이고 개별적으로 지정된 바와 같이 참고문헌으로서 인용된다.

Claims (49)

1. (a) 적어도 하나의 제 1 결합부를 갖는 캐리어(carrier), 및

   (b) 적어도 하나의 제 2 결합부를 갖는 안지오텐신 펩티드 부위;

   (여기에서, 캐리어는 코어 입자를 포함하고;

   제 2 결합부는 적어도 하나의 공유 결합을 통해 제 1 결합부에 결합하여 정돈된 반복적 안지오텐신 펩티드 부위-캐리어 컨쥬게이트를 형성한다)를 포함하는 안지오텐신 펩티드 부위-캐리어 컨쥬게이트.
2. 제 1항에 있어서, 코어 입자가 바이러스 또는 바이러스성 입자인 컨쥬게이트.
3. (a) 적어도 하나의 제 1 결합부를 갖는 캐리어(캐리어), 및

   (b) 적어도 하나의 제 2 결합부를 갖는 안지오텐신 펩티드 부위;

   (여기에서, 캐리어는 바이러스 또는 바이러스성 입자인 코어 입자를 포함하고;

   제 2 결합부는 적어도 하나의 공유 결합을 통해 제 1 결합부에 결합하여 정돈된 반복적 안지오텐신 펩티드 부위-캐리어 컨쥬게이트를 형성한다)를 포함하는 안지오텐신 펩티드 부위-캐리어 컨쥬게이트.
4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 바이러스성 입자는

   (a) B형 간염 바이러스의 재조합 단백질;

   (b) 홍역 바이러스(measles virus)의 재조합 단백질;

   (c) 신드비스 바이러스(Sindbis virus)의 재조합 단백질;

   (d) 로타바이러스(Rotavirus)의 재조합 단백질;

   (e) 구저 질환 바이러스(Foot-and-Mouth-Disease virus)의 재조합 단백질 ;

   (f) 레트로바이러스의 재조합 단백질 ;

   (g) 노르워크 바이러스(Norwalk virus)의 재조합 단백질;

   (h) 알파바이러스의 재조합 단백질;

   (i) 인간 파필로마바이러스(Papillom virus)의 재조합 단백질;

   (j) 폴리오마바이러스의 재조합 단백질;

   (k) 박테리오파지의 재조합 단백질 ;

   (l) RNA-파지의 재조합 단백질 ;

   (m) Qβ-파지의 재조합 단백질 ;

   (n) GA-파지의 재조합 단백질

   (o) fr-파지의 재조합 단백질

   (p) AP205 파지의 재조합 단백질; 및

   (q) Ty의 재조합 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택된 재조합 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트.
5. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 바이러스성 입자가 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질인 컨쥬게이트.
6. 제 5항에 있어서, B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 아미노산 서열이 서열번호: 1의 서열과 80% 일치하는 컨쥬게이트
7. 제 5항에 있어서, 코트 단백질이 적어도 하나의 리신 잔기의 결실, 적어도 하나의 리신 잔기의 삽입에 의한 첨가, 또는 적어도 하나의 리신 잔기의 치환에 의해 변형된 컨쥬게이트.
8. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 바이러스 또는 바이러스성 입자가 RNA-박테리오파지의 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트.
9. 제 8항에 있어서, RNA-박테리오파지가

   a) 박테리오파지 Qβ ;

   b) 박테리오파지 R17 ;

   c) 박테리오파지 fr;

   d) 박테리오파지 GA;

   e) 박테리오파지 SP;

   f) 박테리오파지 MS2;

   g) 박테리오파지 Mil ;

   h) 박테리오파지 MX1 ;

   i) 박테리오파지 NL95;

   j) 박테리오파지 f2 ;

   k) 박테리오파지 AP205; 및

   l) 박테리오파지 PP7로 구성된 그룹으로부터 선택되는 컨쥬게이트.
10. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 바이러스성 입자가 박테리오파지 Qβ의 재조합 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트.
11. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 바이러스성 입자가 박테리오파지 fr 또는 박테리오파지 AP205의 재조합 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트.
12. 제 8항에 있어서, RNA-박테리오파지가의 재조합 단백질이 돌연변이 코트 단백질을 포함하는 컨쥬게이트.
13. 제 12항에 있어서, 돌연변이 코트 단백질이 적어도 하나의 리신 잔기의 치환에 의한 제거, 또는 적어도 하나의 리신 잔기의 치환에 의한 첨가에 의해 변형된 컨쥬게이트.
14. 제 12항에 있어서, 돌연변이 코트 단백질이 적어도 하나의 리신 잔기의 결실, 또는 적어도 하나의 리신 잔기의 삽입에 의한 첨가에 의해 변형된 컨쥬게이트.
15. 제 12항에 있어서, 재조합 단백질이 서열번호 : 3의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 코트 단백질을 포함하는 컨쥬게이트.
16. 제 12항에 있어서, 재조합 단백질이 서열번호 : 4의 아미노산 서열 또는 그의 돌연변이, 및 서열번호 : 3의 아미노산 서열을 갖는 코트 단백질의 혼합물을 포함하는 컨쥬게이트.
17. 제 12항에 있어서, 재조합 단백질이 돌연변이 Qβ 코트 단백질를 포함하는 컨쥬게이트.
18. 제 17항에 있어서, 돌연변이 Qβ 코트 단백질이 적어도 하나의 리신 잔기의 치환에 의한 제거, 또는 적어도 하나의 리신 잔기의 치환에 의한 첨가에 의해 변형된 컨쥬게이트.
19. 제 17항에 있어서, 돌연변이 Qβ 코트 단백질이 적어도 하나의 리신 잔기의 결실, 또는 적어도 하나의 리신 잔기의 삽입에 의한 첨가에 의해 변형된 컨쥬게이트.
20. 제 17항에 있어서, 돌연변이 Qβ 코트 단백질이

    a) 서열번호 : 6의 아미노산 서열;

    b) 서열번호 : 7의 아미노산 서열;

    c) 서열번호 : 8의 아미노산 서열;

    d) 서열번호 : 9의 아미노산 서열; 및

    e) 서열번호 : 10의 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함하는 컨쥬게이트.
21. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 바이러스성 입자가

    a) 서열번호 : 6의 아미노산 서열;

    b) 서열번호 : 7의 아미노산 서열;

    c) 서열번호 : 8의 아미노산 서열;

    d) 서열번호 : 9의 아미노산 서열; 및

    e) 서열번호 : 10의 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 하나 이상의 돌연변이 Qβ 코트 단백질을 포함하는 컨쥬게이트.
22. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 제 1 결합부가

    (a) 아미노 그룹;

    (b) 카복실 그룹;

    (c) 설프하이드릴 그룹;

    (d) 하이드록시 그룹;

    (e) 구아니디닐 그룹; 또는

    (f) 히스티디닐 그룹를 포함하는 컨쥬게이트.
23. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 적어도 하나의 제 1 결합부가 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 아스파테이트 글루타메이느 잔기, 세린 잔기, 트레오닌 잔기, 히스티딘 잔기 및 티로신 잔기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 컨쥬게이트.
24. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 적어도 하나의 제 1 결합부가 리신 잔기인 컨쥬게이트.
25. 제 1항에 있어서, 코어 입자가 박테리아 섬모(pilus) 또는 섬모성 입자인 컨쥬게이트.
26. 제 25항에 있어서, 박테리아 섬모 또는 섬모성 입자가

    (a) 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli);

    (b) 헤모필루스 인플루엔자에( Haemophilus influenzae);

    (c) 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis);

    (d) 네이세리아 고노르호에아에(Neisseria gonorrhoeae);

    (e) 카울로박터 크레스텐투스(Caulobacter crescentus);

    (f) 슈도모나스 스투제리(Peudomonas stutzeri);

    (g) 슈도모나스 아에루기노사(Peudomonas aeruginosa);

    (h) 살모넬라 종(Salmonella spp); 및

    (i) 비브리오 콜레라(Vibrio cholera)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유기체에 의해 생산된 필린(pilin) 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트.
27. 제 25항에 있어서, 섬모성 입자가

    (a) 1형 필린 단백질; 및

    (b) P-필린 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 필린 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트.
28. 제 25항에 있어서, 섬모성 입자가 재조합 단백질을 포함하는 컨쥬게이트.
29. 제 25항에 있어서, 섬모성 입자가 재조합 및 비-재조합 단백질의 혼합물을 포함하는 컨쥬게이트.
30. 제 25항에 있어서, 섬모성 입자가 1형 필린 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트.
31. 제 25항에 있어서, 섬모성 입자가 돌연변이 섬모 단백질을 포함하는 컨쥬게이트.
32. 제 31항에 있어서, 돌연변이 섬모 단백질이 적어도 하나의 리신 잔기의 치환에 의한 제거, 적어도 하나의 리신 잔기의 치환에 의한 첨가, 적어도 하나의 리신 잔기의 결실, 또는 적어도 하나의 리신 잔기의 삽입에 의한 첨가에 의해 변형된 컨쥬게이트.
33. 제 30항에 있어서, 섬모성 입자가 서열번호: 2의 아미을 갖는 필린 단백질로 구성된 컨쥬게이트.
34. 제 1항 또는 제 3에 있어서, 안지오텐신 펩티드 부위가 바람직하게 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I, 안지오텐신 II로 구성된 그룹으로부터 선택되는 안지오텐신 펩티드, 및 그의 단편 또는 유도체인 컨쥬게이트.
35. 제 1항 또는 제 3에 있어서, 제 2 결합부를 갖는 안지오텐신 펩티드 부위가

    a) CGGDRVYIHPF;

    b) CGGDRVYIHPFHL;

    c) DRVYIHPFHLGGC ;

    d) CDRVYIHPFHL;

    e) CHPFHL;

    f) CGPFHL ;

    g) CYIHPF;

    g) CGIHPF;

    h) CGGHPF;

    i) CRVYIGGC;

    j) DRVYGGC; 및

    k) DRVGGC로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 컨쥬게이트.
36. 하나 이상의 제 1항 또는 제 3항의 컨쥬게이트 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
37. 면역학적 유효량의 제 1항 또는 제 3항의 컨쥬게이트 및 면역학적으로허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 백신 조성물.
38. 제 37항에 있어서, 추가로 적어도 하나의 어쥬번트를 포함하는 백신 조성물.
39. 동물이 안지오텐신 펩티드 부위에 대한 면역반응을 일으킬 수 있도록 하는 조건하에서 제 1항 또는 제 3항의 컨쥬게이트를 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물을 안지오텐신 펩티드 부위에 대하여 면역화시키는 방법.
40. 제 39항에 있어서, 컨쥬게이트를 비강내 투여, 경구 투여, 피하 투여, 경피 투여, 근육내 투여 및 정맥내 투여로 구성된 그룹으로 선택되는 투여 경로를 통해 동물에 투여하는 방법.
41. 제 39항에 있어서, 컨쥬게이트를 비강내 투여하는 방법.
42. 동물이 안지오텐신 펩티드 부위에 대한 면역반응을 일으킬 수 있도록 하는 조건하에서 제 37항의 백신 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물을 안지오텐신 펩티드 부위에 대하여 면역화시키는 방법.
43. 제 42항에 있어서, 조성물을 비강내 투여, 경구 투여, 피하 투여, 경피 투여, 근육내 투여 및 정맥내 투여로 구성된 그룹으로 선택되는 투여 경로를 통해 동물에 투여하는 방법.
44. 제 42항에 있어서, 조성물을 비강내 투여하는 방법.
45. 치료학적 또는 예방학적 유효량의 하나 이상의 제 1항 또는 제 3항의 컨쥬게이트를 그를 필요로 하는 동물에 투여하는 것을 포함하는, 레닌-활성화된 안지오텐신계와 관련된 신체 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
46. 제 45항에 있어서, 레닌-활성화된 안지오텐신계와 관련된 신체 질환이 고혈압, 뇌졸증, 경색증, 울혈심부전증, 신부전 또는 망막출혈로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
47. 치료학적 또는 예방학적 유효량의 제 36항의 약제학적 조성물을 그를 필요로 하는 동물에 투여하는 것을 포함하는, 레닌-활성화된 안지오텐신계와 관련된 신체 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
48. 면역학적 유효량의 제 37항의 백신 조성물을 그를 필요로 하는 동물에 투여하는 것을 포함하는, 레닌-활성화된 안지오텐신계와 관련된 신체 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
49. 제 47항 또는 제 48항에 있어서, 레닌-활성화된 안지오텐신계와 관련된 신체 질환이 고혈압, 뇌졸증, 경색증, 울혈심부전증, 신부전 또는 망막출혈로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.