KR20050023191A

KR20050023191A - 금전초 추출물을 포함하는 면역증강과 동맥경화 예방 및치료용조성물

Info

Publication number: KR20050023191A
Application number: KR1020030059681A
Authority: KR
Inventors: 박재봉; 김준섭
Original assignee: 학교법인 한림대학교
Priority date: 2003-08-27
Filing date: 2003-08-27
Publication date: 2005-03-09
Also published as: KR100535269B1

Abstract

본 발명은 금전초 추출물을 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명의 금전초 추출물은 대식세포의 식작용을 증가시켜 면역반응을 강화시키며 동시에 대식세포의 혈관 내피세포 부착을 감소시킴으로써 대식세포의 축적으로 인한 동맥경화증을 예방 및 치료하는 용도 또는 면역을 증강시키는 용도로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

금전초 추출물을 포함하는 면역증강과 동맥경화 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION COMPRISING EXTRACT FROM LYSIMACHIAE HERBA FOR PREVENTING AND TREATING ARTERIOSCLEROSIS AND ENHANCEMENT OF IMMUNITY}

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 금전초 추출물을 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 대식세포의 식작용을 증가시켜 면역반응을 강화시키며 동시에 대식세포의 혈관 내피세포 부착을 감소시킬 수 있는 금전초 추출물에 관한 것이다.

[종래기술]

면역 기능을 증강시키기 위한 목적으로는 일차적으로 대식세포의 활성화를 촉진하는 물질 및 이의 활성기작에 대한 연구들이 진행되어오고 있다. 활성화된 대식세포는 항원의 흡수 및 세포독성의 기능이 현저히 향상될 뿐 아니라 인터루킨-1(Interlukin-1)과 같은 각종 물질을 분비하여 다른 면역 세포의 활성화를 촉진함으로써 면역계 전반의 활성화를 유도하게 된다.

골수로부터 생산되는 대식세포(macrophage)는 크게 3가지 기능을 한다. 첫째, 대식세포는 외부로부터 들어오는 이물질을 직접 흡입하는 식작용(phagocytosis)을 하며, 둘째로 함입된 병원체를 활성산소(superoxide)를 이용하여 분해 및 제거하며, 세째로 외부 항원을 변형시킨 후 이를 세포표면으로 표현하여 T세포로 항원을 인식하도록 하고, 궁극적으로 항체를 형성시킨다. 또한 활성화된 대식세포는 T세포, B세포를 포함한 다른 여러 세포를 자극하며 새로운 반응을 유도한다.

대식세포의 식작용은 세포막에 존재하는 수용체 단백질들을 매개로 하여 이루어진다. 수용체 단백질로는 IgG를 인지하는 Fc 수용체와 보체(complement)를 인지하는 보체 수용체가 가장 잘 알려져 있으며(Aderem A and Underhill DM. Mechanisms of phagocytosis in macrophage. Annu Rev Immunol 1999;17:593-623), 세포내에 엑틴 필라멘트를 조절하는 작은 GTPase들 또한 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Caron E and Hall A. Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. Science 1998;282:1717-21).

대식세포는 림포카인, 엔도톡신 또는 RNA와 같은 인터페론 유도물질을 포함하는 외부자극에 의하여 활성화된다. 활성화된 대식세포는 식작용과 종양세포 파괴기능이 항진되며, 세포의 크기가 증가하고 여러 가지의 물질을 다량 분비한다. 또한 활성화된 대식세포의 표면에는 클라스 I MHC 단백질, Mac-1 또는 Fc 수용체와 같은 표면 단백질이 증가한다.

또한 대식세포는 활성산소를 이용하여 세포내 함입된 병원체를 분해한다. 따라서 대식세포의 활성산소 생성능이 감소 또는 소실되는 경우 심각한 면역질환이 발생될 수 있다. 뿐만 아니라 대식세포는 종양세포와 접촉하여 H₂O₂나 OH 라디칼을 분비하므로써 종양세포를 제거한다. 활성산소는 NADPH-옥시데이즈라는 단백질 복합체인 효소작용에 의해 생성되며, 대식세포가 활성화되면 도 1과 같이 세포내의 단백질인 Rac, p67phox, p47phox 및 p40phox이 막단백질인 Rap, p22 및 gp91 단백질들과 결합하여 활성산소를 생성시킨다(Babior BM. NADPH oxidase: an update. Blood 1999;93:1464-76).

또한 대식세포는 상기에 언급하 바와 같이 생체내에서 양성적인 작용을 하지만 때로는 음성적인 작용을 하기도 한다. 즉 대식세포는 동맥혈관의 손상된 부위에 축적된 산화성 저밀도 지단백질(low density lipoprotein, LDL)을 탐식하여 거품세포로 전환되어 축적되게 된다. 거품세포들의 축적에 의하여 형성된 지질층은 평활근 세포(smooth muscle cell)의 이동을 초래하고, 이들은 단핵세포-주화성 단백질-1(monocyte-chemotactic protein-1: MCP-1)의 분비를 촉진하여 대식세포들의 소집을 증가시킨다. 거품세포들은 결국 자유 라디칼이나 산화 지단백질들의 세포독성으로 인하여 지질을 방출하고, 혈관 손상 부위 내에 세포괴사 지질 핵을 형성시킨다. 이러한 과정이 반복되면서 동맥은 좁아지게 되고, 이로 인하여 혈액 응고, 심장질환 및 뇌졸증 등이 발생할 가능성이 증가되게 된다(Li AC, Glass CK. The macrophage foam cell as a target for therapeutic intervention. Nat Med 2002;8:1235-42).

최근, 동맥경화 방지를 위한 임상연구와 약제개발은 주로 대식세포의 증식과 염증반응을 억제하는 작용에 초점을 맞추고 있다. 일예로, 동맥경화 치료제인 스타틴계열의 약제 또는 PPAR-gamma, PPAR-alpha 등의 길항제는 대식세포의 활성을 줄임으로 염증을 억제하는 것으로 알려져 있다(Ruggeri ZM. Platelets in atherothrombosis. Nature Med. 2002;8(11):1227-34; Libby P. Changing concepts of atherogenesis. J Intern Med. 2000;247(3):349-58).

동맥경화를 치료하는 약제로는 고지혈증 치료제인 로바스타인, 심바스타틴 또는 프라바스타틴이 있다. 이들 스타틴계열의 약품들은 1 ㎏에 1억원가량으로 매우 비쌀 뿐 아니라 장기간 복용시 심장근육과 간에 심각한 부작용을 일으킨다. 그 외 최신 약제들은 동맥경화증을 치료하기 위한 수단으로 대식세포의 기능을 저해함으로써, 혈관에 대량의 지질과 콜레스테롤이 축적되는 것을 억제하고 혈관세포의 손상을 방지할 수 있는 효과를 가진다. 그러나 동맥경화 치료제가 대식세포의 기능을 저해하는 경우, 대식세포에 의한 면역기능 역시 저해될 수 있다. 따라서, 대식세포의 축적을 효과적으로 방지하면서도 대식세포에 의한 면역기능은 유지시킬 수 있는 동맥경화 치료제의 개발이 요구되고 있다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 대식세포의 면역반응에 부작용을 야기하지 않으면서, 동시에 대식세포의 혈관내 부착을 억제하여 동맥경화를 예방 및 치료할 수 있는 식물 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 대식세포의 면역반응을 증강시킬 수 있는 식물 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 인체에 무해한 동맥경화 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 금전초 추출물을 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 금전초 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 대식세포의 면역기능을 증가시키면서 동시에 혈관 내피세포의 부착을 억제할 수 있어, 동맥경화로 인한 질환의 치료제로 사용가능한 금전초 추출물에 관한 것이다.

금전초는 학명이 글레초마 헤데라세카(Glechoma hederaeca var. longituba Nakai)인 국명은 긴병꽃풀의에서 수득한 한약재이다. 금전초 추출물은 통상의 식물 추출물 제조방법으로 하여 준비되며, 바람직하기로는 금전초에 물 또는 유기용매를 가하여 추출된다. 금전초는 약용으로 이용되고 있어 인체에 무해함이 입증되어 있다. 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 5의 알콜, 헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트로, 알콜의 예로는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 이소프로판올 및 프로판올이 있다.

바람직한 금전초 추출물 제조방법은 금전초 건조물을 분쇄하고, 여기에 추출용매를 건조물 중량대비 1: 1 내지 10 중량비로 가하여 열추출 또는 상온추출법으로 추출한다. 상기 추출용매는 물 또는 유기용매일 수 있으며, 에탄올이 바람직하다. 에탄올은 100 % 에탄올로 사용할 수 있으나, 희석액 최소 50 % 에탄올도 사용가능하다. 이후 추출액을 진공농축하여 에탄올을 제거하고, 동결건조하여 수분이 제거된 분말상으로 수득한다. 상기한 방법으로 제조된 것을 금전초 추출물이라 할 수 있으며, 이후 금전초 추출물에 유기용매를 가하여 분획하여 분획물 형태로 제조할 수도 있다.

본 발명에서는 일실시예로, 금전초 추출물을 용매 70 % 에탄올을 사용하여 제조하였으며, 금전초 추출물에 의한 효능을 확인하였다.

즉, 금전초 추출물은 대식세포의 식작용을 약 113 % 증가시키고(도 6) 동시에 대식세포의 혈관 내피세포 부착을 약 55 % 감소시킨다(도 11). 따라서, 금전초 추출물은 대식세포의 혈관 내피세포의 축적으로 인한 동맥경화를 감소시키며, 동시에 대식세포의 면역기능은 증가시켜 동맥경화 예방 및 치료에 매우 유용하다.

금전초 추출물은 동맥경화 예방 및 치료용 조성물 또는 면역증강용 조성물로 사용가능하므로, 본 발명은 금전초 추출물을 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물 또는 금전초 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 금전초 추출물만을 단독으로 포함할 수 있으며, 그 외 약리학적으로 허용가능한 담체를 더욱 포함할 수 있다. 조성물내 금전초 추출물의 유효함량은 0.1 내지 40 중량%가 바람직하다. 금전초 추출물의 함량이 0.1 중량% 미만인 경우 금전초 추출물에 의한 동맥경화 치료 및 예방효과, 또는 면역증강효과가 미비하여 다량의 투여량을 처리하여야 하며, 40 중량% 초과하는 경우 효과대비 비경제적일 수 있다. 그러나 가장 바람직한 금전초 추출물의 유효함량은 동맥경화 치료제의 사용방법 및 목적에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다.

본 발명의 동맥경화 예방 및 치료용 조성물, 또는 면역증강용 조성물에 부가적으로 포함시킬 수 있는 담체는 제형에 따라 통상의 물질을 사용할 수 있으며, 대표적인 것으로는 물, 글리세린, 유당, 전분 또는 생리식염수가 있다.

동맥경화 예방 및 치료용 조성물, 또는 면역증강용 조성물은 약제, 식품 또는 식품첨가제로 사용할 수 있으며, 약제로 사용하는 경우 경구 또는 비경구로 사용될 수 있다. 상기 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으나, 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 침제(INFUSIONS), 정제(TABLETS), 주사제(INJECTIONS), 캅셀제(CAPSULES) 및 환제(PILLS)등으로 제조할 수 있다.

일반적으로 세포실험에서 사용한 농도의 약 100배 내지 200 배를 동물실험에서 사용하므로, 본 발명의 동맥경화 예방 및 치료용 조성물, 또는 면역증강용 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 좋으며, 금전초 추출물을 기준으로 하였을 때 1일 25 ㎎/㎏(체중) 내지 30 ㎎/㎏(체중)으로 투여할 수 있다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 식물 추출물 제조

금전초 건조물 100 g을 곱게 마쇄하고, 70 % 식음용 주정 에탄올 200 ㎖로 50 ℃에서 2시간 추출하였다. 추출액은 진공회전증발기로 에탄올은 완전히 제거하고 농축한 다음 동결건조기로 48시간동안 수분 제거하여 분말상태의 금전초 추출물(9.8 g)을 수득하였다.

금전초 추출물 0.98 g은 10 ㎖의 물에 녹여 이를 원액(98 ㎎/㎖)으로 사용하였다.

금전초 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여, 금전초 추출물을 1/100 (0.98 ㎎/㎖)으로 희석한 후 이를 10 ㎖의 배지안의 대식세포에 1 ㎖(98 ㎍/㎖)를 하루동안 처리하였다. 이후 트리판 블루(Trypan Blue) 침착방법을 실시하였으며, 현미경으로 살아있는 세포와 죽은 세포를 계수하여 생존율을 확인하였다. 그 결과 금전초 추출물을 1/100으로 희석하여 사용한 경우 대식세포는 80 % 이상이 생존율을 나타내어 무해함을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 대식세포 식작용에서의 금전초 추출물의 영향

2-1. 식작용 측정법

대식세포의 식작용을 연구하는데 있어 가장 힘든점이 분석 방법이다. 일반적으로는 현미경으로 대식세포안으로 합입된 파티클(식균된 적혈구, 효모 및 세균 등)을 개수하여 확인한다. 본 실험에서는 Hed 등이(Hed, J., et. al., (1987) J. Immunol. Methods, 101:119-125) 등이 제시한 방법을 변형하여 좀더 간단, 정확하게 식작용을 분석하였다.

실험방법은 형광광도계를 이용하여 FITC(Fluorescein isothiocyanate )의 파장의 세기로 식작용을 측정하는 것으로, 크리스탈 바이올렛 시약을 이용하여 세포의 표면에 붙은 파티클과 완전히 함입된 파티클을 각각 관찰하였다.

가. FITC-자이모산(zymosan)의 제조

자이모산 파티클을 FITC로 표지하고, 원심분리하였다. 침전물에 FBS(adjusted to 5 x 10⁸ 자이모산 파티클/㎖)를 넣고 37 ℃에서 1시간동안 식균한 다음 크렙스-링거 완충액(Krebs-Ringer buffer(KRG), 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.7 mM KH₂PO₄, 8.3 mM Na₂HPO₄, 10 mM 글루코스, 1 mM CaCl ₂, and 1.5 mM MgCl₂)에 현탁하여 -70 ℃에서 보관하였다.

나. 식작용의 조사

형광광도계용 실험관에 5x10⁵의 FITC-자이모산 파티클을 넣고, 다양한 농도의 크리스탈 바이올렛에 의한 FITC 형광의 퀀칭(Quenching) 효과를 형광광도계로 확인하였다. 그 결과는 도 2에 도시하였다. 1 mM에서 FITC 형광파장의 90 % 이상이 크리스탈 바이올렛에 의하여 퀀칭되는 것으로 확인되었다.

이후, 대식세포에 FITC-자이모산 파티클을 처리하여 시간별 식작용을 측정하였다. 대식세포 J774A.1 세포주는 20 mM HEPES/NaOH(pH 7.4) 5 mM NaHCO₃, 10% FBS(fetal bovine serum) 및 항생제(100 U/㎖의 스트렙토마이신 및 100 U/㎖의 페니실린)를 포함한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)상에서 37 ℃ 및 5 % CO₂조건으로 배양하였다(Kim JS et. al., (2003) Exp Mol Med 35:211-221).

대식세포 J774A.1 세포주는 2x10⁵ 세포의 밀도로 35 ㎜ 배양접시에 배양하였고, 5x10⁵의 FITC-자이모산 파티클을 가하여 30분간 37 ℃에서 배양하였다. 대식세포는 PBS로 3회 세척하고, PBS 1 ㎖에 부유시켰다. FITC는 490 nm에서 여기시키고, 형광광도계를 이용하여 520 nm에서 FITC 형광을 측정하였다. 표면에 붙은 FITC 과립은 5 mM의 크리스탈 바이오렛(crystal violet)을 가하여 퀸칭(quenching)하였다.

도 3a는 엑틴으로 염색된 대식세포를 나타낸 것이고, 3b는 FITC-자이모산을 나타낸 것이고, 3c는 3a 및 3b를 동시에 나타낸 것으로, 대식세포의 식작용으로 함입된 FITC-자이모산을 나타낸 것이다.

도 4는 대식세포의 자이모산 파티클 식작용을 시간별로 측정한 것으로, 반응 30분에 최대 식작용을 나타내었다.

2-2. 금전초 추출물 처리시 식작용 측정

대식세포를 미리 10 ㎍/㎖의 LPS 또는 10 μM의 Cyto-D 로 처리한 후, FITC-자이모산을 30 분간 처리하여 형광광도계로 식작용을 관찰하였다.

도 5는 LPS 및 Cyto-D 각각에 의한 대식세포 식작용을 나타낸 것으로, LPS는 무처리한 대조군에 비하여 약 100 % 이상 식작용을 증가시켰고 cyto-D는 약 80 % 정도 식작용을 감소시켰다.

금전초 추출물 원액의 1/100 희석액 100 ㎕을 10 ㎖ DMEM 배지에 배양중인 2x10⁶의 대식세포에 가하여 하룻동안 둔 후, FITC-자이모산을 30분간 처리하여 식작용을 유도하였다. 이후 형광광도계로 식작용을 조사하였다.

도 6은 금전초 추출물에 의한 대식세포 식작용을 나타낸 것으로, 금전초 추출물은 대식세포의 식작용을 약 113 % 증가시켰다(*:p<0.05, **:p< 0.01).

실시예 3: 대식세포의 활성산소 생성능에서의 금전초 추출물의 영향

대식세포의 활성산소생성을 확인하는 방법으로는 사이토크롬 C의 환원에 의한 방법이 가장 보편적이다. 그러나 상기 방법은 세포 밖으로 방출된 양만을 측정할 수 있으며, 실험값의 오차가 크고 그 측정범위가 매우 적어 세밀한 변화를 측정하기 어렵다. 이에 본 실험에서는 화학발광(chemiluminescence)법을 이용하여 활성산소 생성을 확인하였다(Dahlgren C, Karlsson A. Respiratory burst in human neutrophils.(1999) J Immunol Methods, 232:3-14).

3-1. 이소루미놀(Isoluminol)로 증폭된 화학발광에 의한 O₂ ^- 탐지

이소루미놀은 세포막을 통과하지 못하는 분자로, 대식세포의 식작용이 활성화되었을 때 방출되는 O₂ ^-에 의해 여기된다. 여기된 이소루미놀가 기저상태(ground state)로 회복되면서 방출시키는 빛을 측정하여 O₂ ^-을 탐지한다.

실험관에 KRG(Krebs Ringer phosphate buffer) 0.65 ㎖, 0.5 mM 이소루미놀 0.1 ㎖, 80 U/㎖ HRP 0.05 ㎖ 및 대식세포 0.1 ㎖(약 10²-10⁶ 개)를 미리 넣고, 여기에 자이모산 0.1 ㎖을 첨가한 후 발광계(luminometer)상에서 세포밖으로 방출되는 O₂ ^-를 측정하였다.

도 7은 대식세포에 의한 생성되어 세포밖으로 방출된 O₂ ^- 을 측정한 것으로, 대식세포에 자이모신 처리 후 약 3분 내지 4분후 O₂ ^-가 탐지되어 시간경과에 따라 점차 많은 양이 검출되었으며, 약 25분후 점차 감소되는 것으로 관찰되었다.

3-2. 루미놀(luminol)로 증폭된 화학발광에 의한 O₂ ^- 탐지

루미놀은 세포막을 쉽게 통과하는 분자로, 대식세포의 식작용이 활성화되었을 때 방출되는 O₂ ^-에 의해 여기된다. 여기된 루미놀이 바닥상태로 회복되면서 방출하는 빛을 측정하여 O₂ ^-를 측정하게 된다. 세포외로 방출된 O₂ ^-는 세포내로 들어갈 수 없는 SOD를 사용하여 제거하였다.

실험관에 KRG 0.68 ㎖, 0.5 mM 루미놀 0.1 ㎖, 5000 U/㎖ SOD 0.01 ㎖, 200,000 U/㎖ 카탈라제 0.01 ㎖ 및 대식세포 0.1 ㎖(약 10²-10⁶ 개)를 미리 넣은 후 여기에 자이모산 0.1 ㎖을 넣어준 후, 생성된 O₂ ^-를 측정하였다.

도 8은 대식세포에 의한 생성된 세포내 O₂ ^- 을 측정한 것으로, 대식세포에 자이모신 처리 후 약 2분후 O₂ ^-가 탐지되어 시간경과에 따라 점차 많은 양이 검출되었으며, 약 20분후 점차적으로 감소되는 것으로 관찰되었다.

3-3. 금전초 추출물 처리시 대식세포의 O₂ ^- 생성능 측정

금전초 추출물 원액의 1/100 희석액 100 ㎕을 10 ㎖ DMEM 배지에 배양중인 2x10⁶의 대식세포에 가하여 24시간 방치하였다. 이후 대식세포를 수거하고, 상기 루미놀을 이용한 방법과 동일한 방법으로 실시하였으며 1시간동안 발광계에서 측정하여 최대 활성산소 생성능을 확인하였다.

도 9는 대식세포의 활성산소 생성에 있어 금전초 추출물의 영향을 확인한 것으로, 금전초 추출물을 처리한 경우 활성산소(O₂ ^-) 생성이 다소 감소된 것으로 관찰되었다. 그러나 감소폭이 미비하여 대식세포의 면역기능을 크게 저하시키진 못할 것으로 생각된다.

실시예 4: 금전초 추출물에 의한 대식세포 부착력 변화

동맥경화는 많은 지질을 함유한 대식세포가 혈관의 내피세포에 부착되어 발생된다. 이에 금전초 추출물이 대식세포의 혈관 내피세포 부착을 억제시킬 수 있는지 확인하기 위한 실험을 실시하였다.

실험에서는 실험용 배양접시에 콜라겐을 도포하고 세포를 넣은 다음 붙어있지 않은 세포를 세척하고 붙어있는 세포에 CMFDA(5-chloromethylfluorescein diacetate)를 처리하여 CMFDA가 세포내의 에스테라제(esterase)에 의해 분해가 되면서 형광을 띄는 성질을 이용하여 대식세포의 부착력을 측정하였다.

4-1. 실험확립

부착력 측정실험을 확립하였다. 하기에서 사용하는 C3(C3 exoenzyme)과 Tat-C3(Tat-C3 exoenzyme, Tat-C3: Tat-peptide domain)은 Rho 단백질들의 활성을 저해하여 대식세포의 부착능력을 감소시키는 것으로 알려진 물질이다(Anderson SI, et. al., (2000) J Cell Sci 113:2737-45). 상기 Tat-C3은 C3을 Tat에 융합시켜 세포내로 침투가 용이하도록 제작한 것이다.

100 ㎜ 배양접시에 대식세포를 약 90 %까지 배양하였다. 96웰 마이크로플레이트에 피브리노겐을 도포하여 24시간 방치하였다. 이후 각 웰에 상기 대식세포를 넣고, 1시간 후에 부착되지 않은 대식세포들은 세척하여 제거하였다. 여기에 CMFDA를 1시간동안 처리하여 염색하고, 50 ㎍/㎖의 C3 와 10 ㎍/㎖의 Tat-C3를 각각 30분간 처리하였다. 대식세포는 DMEM 배지에 재부유시킨 후, 다시 접종하여 1시간 배양하였다. 배지는 제거하고, 대식세포는 PBS로 세척한 다음 형광광도계로 부착된 세포 수를 측정하였다.

도 10은 C3 또는 Tat-C3에 의한 대식세포 부착력 변화를 관찰하여 나타낸 것이다. 도 10에서 C3과 Tat-C3 모두 대식세포의 부착력을 감소시켰으며, 특히 세포내 침투가 용이하도록 제작한 Tat-C3이 현저한 부착력 감소를 유도하는 것으로 확인되었다.

따라서, 상기한 방법을 대식세포 부착력 확인 실험으로 이용가능함을 확인하였다.

4-2. 금전초 추출물에 의한 대식세포 부착력 변화 확인

상기와 동일한 방법으로 실시하였고, C3 또는 Tat-C3의 처리없이 금전초 추출물 원액의 1/100 희석액을 사용하였다.

즉, 100 ㎜ 배양접시에 대식세포를 약 90 %까지 배양한 후 금전초 추출물을 24시간 처리하였다. 96웰 마이크로플레이트에 피브리노겐을 도포하여 24시간 방치하였다. 이후 각 웰에 상기 대식세포를 넣고, 1시간 후에 부착되지 않은 대식세포들은 세척하여 제거하였다. 부착된 세포의 수를 확인하기 위하여 CMFDA를 처리한 후 발산되는 형광을 형광광도계 516 nm에서 측정하였다.

도 11은 금전초 추출물을 처리한 후 대식세포의 부착력 변화를 확인한 것이다. 금전초 추출물을 처리하지 않은 것을 대조군(Con)으로 두고 대조군의 부착력을 100 %으로 하였을 때, 금전초 추출물을 처리한 실험군은 약 55 %의 부착력을 가지는 것으로 측정되었다. 따라서, 금전초 추출물은 대식세포의 부착력을 감소시킬 수 있음이 확인되었다.

상기 실시예 2 내지 4를 통한 실험결과에 따르면, 본 발명의 금전초 추출물은 대식세포의 식작용은 증강시키면서 동시에 혈관내피세포로의 부착력을 감소시킬 수 있어, 동맥경화 치료제로 사용할 수 있음을 알 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 금전초 추출물은 대식세포의 식작용을 증가시켜 면역반응을 강화시키며, 대식세포의 혈관 내피세포 부착을 감소시킨다. 따라서, 금전초 추출물은 대식세포의 축적으로 인한 동맥경화증을 예방 및 치료하고 면역을 증강시키는 용도로 사용할 수 있다.

도 1은 대식세포(Macrophage; J774A.1)에서의 활성산소 생성기작을 간략하게 나타낸 것이다.

도 2는 크리스탈 바이올렛에 의한 FITC(fluorescein isothiocyanate) 형광의 퀀칭(Quenching) 효과를 나타낸 것이다.

도 3a는 Phalloidin-TRITC을 사용하여 대식세포의 엑틴(Actin)을 염색하여 나타낸 것이다.

도 3b는 FITC-자이모산(Zymosan)을 나타낸 것이다.

도 3c는 3a 및 3b를 동시에 나타낸 것이다.

도 4는 대식세포에 의한 자이모산 파티클(particles) 식작용을 시간별로 측정한 것이다.

도 5는 Lipopolysaccharide(이하 "LPS"라 함) 및 Cytochalasin-D(이하 "Cyto-D"라 함) 각각이 대식세포 식작용에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 6은 금전초 추출물이 대식세포 식작용에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 7은 대식세포에 의해 생성되어 세포밖으로 방출된 O₂ ^- 을 측정한 것이다.

도 8은 대식세포에 의하여 생성된 세포내 O₂ ^- 을 측정한 것이다.

도 9는 대식세포의 활성산소 생성에 있어 금전초 추출물의 영향을 확인한 것이다.

도 10은 C3 또는 Tat-C3에 의한 대식세포 부착력 변화를 관찰하여 나타낸 것이다.

도 11은 금전초 추출물을 처리한 후 대식세포의 부착력 변화를 확인한 것이다.

Claims

금전초 추출물을 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 금전초 추출물은 동맥경화 예방 및 치료용 조성물내에 0.1 내지 40 중량%로 포함되는 것인 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 금전초 추출물은 금전초에 물 또는 유기용매를 가하여 추출하여 제조된 것인 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 5의 알콜, 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 용매인 것인 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 알콜은 에탄올인 것인 조성물.
금전초 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 금전초 추출물은 금전초에 물 또는 유기용매를 가하여 추출하여 제조된 것인 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 5의 알콜, 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 용매인 것인 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 알콜은 에탄올인 것인 조성물.