KR20050016764A - 벤조에이트- 및 안트라닐레이트-유도성 프로모터 - Google Patents

벤조에이트- 및 안트라닐레이트-유도성 프로모터

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KR20050016764A
KR20050016764A KR10-2005-7000077A KR20057000077A KR20050016764A KR 20050016764 A KR20050016764 A KR 20050016764A KR 20057000077 A KR20057000077 A KR 20057000077A KR 20050016764 A KR20050016764 A KR 20050016764A
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KR10-2005-7000077A
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다이안 엠. 레탈락
벤키테스와란 수브라마니안
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다우 글로벌 테크놀로지스 인크.
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Abstract

신규 벤조에이트- 또는 안트라닐레이트-유도성 프로모터, 및 신규 직열 프로모터, 및 상용 원핵세포 발효 시스템에 유용한 그의 변이체 및 개선된 돌연변이체, 프로모터를 포함하는 핵산 구조물, 그를 사용하는 발현 시스템, 그를 사용하여 단백질을 발현하기 위한 방법, 및 그에 의해 발현된 단백질.

Description

벤조에이트- 및 안트라닐레이트-유도성 프로모터{BENZOATE- AND ANTHRANILATE-INDUCIBLE PROMOTERS}
임의의 유기체에서와 같이, 박테리아 내에서의 유전자 발현은 유전자를 전사시키기 위해 코딩 서열로부터 5' (즉, 상류 (upstream))에 위치하는 조절 영역에 프로모터의 존재를 필요로 한다. 프로모터는 항시발현성 (constitutive) 프로모터 및 피조절 (regulated) 프로모터로 분류된다. 상업적으로 유용한 박테리아 발현 시스템에서, 피조절 프로모터는 목적 유전자(들)이 불활성인 동안에도 유기체의 바이오매스를 증가시키기 때문에 특히 유용한 것으로 입증되었다. 이는 숙주 유기체가 세포 분열 및 성장에 최대의 에너지를 소비하도록 만든다. 그리고, 피조절 프로모터가 활성화/유도되는 경우, 보다 많은 세포가 목적 유전자(들)을 발현할 수 있게 되므로, 목적 유전자 생성물(들)의 수율이 증가하게 된다.
피조절 프로모터는 (1) 활성화성 프로모터, 즉 활성자 단백질이 5' 조절 영역에 결합하기 전까지 불활성인 프로모터; 및 (2) 억제성 프로모터, 즉 5' 조절 영역이 억제자 단백질에 결합된 동안 불활성인 프로모터를 포함한다. 일부 유전자 또는 오페론은 하나 이상의 메커니즘에 의해 조절된다. 예를 들어, 일부 박테리아 유전자 및 오페론은 "이화대사산물 억제"라 불리는 제1 활성화 또는 억제 조절 메커니즘, 및 제2 조절 메커니즘의 조절을 받는다. "글루코스 이화대사산물 억제" 또는 "탄소 이화대사산물 억제"라고도 불리는 이화대사산물 억제는, 피조절 프로모터의 조절하에 있는 유전자(들)이 글루코스 농도 (1차 탄소원)가 역치 수준 미만으로 떨어질 때까지, 예를 들어 글루코스 기아 조건이 될 때까지 발현되지 않는 상태도 유지되는 현상이다. 달리 말하자면, 이러한 유전자(들)은 1) 글루코스 감소/기아 및 2) 피조절 프로모터의 활성화 또는 억제라는 두 가지 조건이 만족될 때까지 발현될 수 없는 것이다. 단 하나 또는 다른 조건만 이루어져서는 상기 유전자(들)의 발현을 달성하는데 충분치 못하다. 이화대사산물 억제를 받는 것으로 밝혀진 유전자 및 오페론 중에서 다수는 비글루코스 탄소원, 즉 대체 탄소원을 이용하는데 필요한 효소 및(또는) 경로를 코딩하는 것이다.
이화대사산물 억제가 이루어지는 메커니즘은 아직 열심히 조사중에 있다. 대장균 (E. coli)에서 일부 이화대사산물-억제된 오페론의 경우 전사 조절 수준이 정해져 있는데, 여기서 이화대사산물 억제는 "활성화성 프로모터" 메커니즘에 의해 극복된다. 예를 들어, 대장균 락토스 오페론 (lacZYA)은 글루코스 기아로 인해 "이화대사산물 활성자 단백질"이 오페론의 5' 조절 영역에 결합하게 될 때까지 전사되지 않는 상태로 유지되고; 락토스가 존재하는 경우, Lac 억제자 단백질이 5' 조절 영역의 별도의 부위(들)(lac 작동자(들))로부터 제거되고 억제해제되어 전사가 개시된다. 대장균에서는 lac 오페론-코딩된 mRNA의 형성을 위해서는 두 가지 조건, 즉 글루코스 기아 및 락토스의 존재 모두가 필요하다.
일부 경우, 전사후 조절이 있는 것으로 추측된다. 예를 들어, 슈도모나드 (Pseudomonads) 및 밀접하게 관련된 종에서는 crc 유전자가 관련된 이화대사산물 억제가 전사후 매개된다는 증거가 있다. 이는 bdkR [참고문헌 7]의 조절에 대한 연구로부터 알 수 있다. 전사 활성자인 bdkR 단백질은, 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)에서 분지쇄 케토산 디히드로게나제의 발현 조절에 관여한다. 데이터에 의하면, 풍부한 배지에서는 bdkR 전사체의 존재에도 불구하고 야생형 P. 푸티다에서 검출가능한 bdkR 단백질이 없었다. 그러나, crc가 손상되거나 불활성화된 돌연변이 P. 푸티다에서는 bkdR 단백질이 검출되었고, bkdR 전사체 수준은 야생형 균주에서 발견되는 것보다 약간 낮았으며, bdkR-피조절 유전자, bdkA의 전사체는 약 4배 유도되었다. 또한, bdkR의 이화대사산물 억제가 극복된 돌연변이체에서 동정된 돌연변이는, crc 유전자 또는 그의 인지체 (cognate) 유전자 vacB에 대해 맵핑되었다. 쉬젤라 플렉스네리 (Shigella flexneri)에 있어서 vacB 단백질은 독성 유전자를 전사후 조절하는데, 이는 부수적이긴 하지만 crc가 전사후 작용한다는 추가의 증거이다 [참고문헌13].
상업적인 원핵세포 시스템에서 발효에 의한 단백질 및 화학 물질의 생산과 관련된 기술적 핵심 과제 중 하나는, 형질전환 유전자 (transgene) 발현의 총체적인 조절이다. 관심 대상인 형질전환 유전자의 발현에 사용하기 위해 선택된 프로모터는 이하 특징들을 가져야 한다. 프로모터는
1. 성장을 반응으로부터 분리시켜야 하고;
2. 효과적이며/최고의 생성물 수율을 위해 유전자 발현을 조절해야 하고;
3. 저/무비용으로 관심 대상인 유전자를 유도해야 하고;
4. 억제 또는 비유도된 상태에서 현저한 수준이 전사를 허용하지 않아야 한다.
이러한 이유로, 피조절 프로모터들은 광범위하게 의존적이다. 특히, lac 프로모터 (즉, lacZ 프로모터) 및 그의 유도체, 특히 미국특허 제4,551,433호 (DeBoer)에 기술된 tac 및 trc 프로모터, 및 하기 표 1에 열거된 관련 프로모터들은 거의 배타적으로 의존적이다.
시판용 lac 프로모터, 유도체 & 관련체
프로모터 시판용 유도자 (Inducer) 박테리아 숙주 세포(들) 참고문헌(들)
Ptac16 IPTG 대장균 (E. coli),슈도모나드 (Pseudomonads) 3, 4
Ptac17 IPTG 대장균, 슈도모나드 3
PlacUV5 IPTG 대장균, 슈도모나드 3
Plac IPTG 대장균 3, 4
Plac (하향) IPTG 대장균 3
T7 IPTG 대장균, 슈도모나드 3, 4
통상적인 상용 박테리아 발효 시스템에서, 숙주 세포는 tac 프로모터가 발현시키고자 하는 유전자 또는 오페론에 조작가능하게 (operably) 결합된 구조물을 포함한다. lac 작동자에 결합하는 Lac 억제자 단백질을 코딩하는 항시발현적으로 발현되는 유전자인 lacI 유전자도 박테리아 숙주 세포에 포함된다 (통상적으로, 다수 카피의 lacI 유전자가 포함됨). 소정의 양 또는 밀도의 바이오매스로 성장한 후, tac 프로모터를 억제해제하고 목적 유전자 또는 오페론을 발현시키기 위해 유도자가 배양물에 첨가된다.
lac-타입 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터를 사용하는 시판용 발효 시스템에서, 무상 (gratuitous) 유도자인 IPTG ("이소프로필티오갈락토시드"라고도 불리는 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드)는 거의 보편적으로 사용된다. 그러나, IPTG는 고가이고 생물학적 시스템에 현저한 독성이 있기 때문에 조심스럽게 조절해야만 한다. 표준 IPTG 제제는 현재 그램 당 약 US$18, 또는 10 그램 당 약 US$125에 판매되고 있는데, 이 IPTG 제제는 생물학적 시스템에 역시 독성이 있는 디옥산도 포함하고 있다. 디옥산-부재 IPTG도 시판되고는 있지만, 표준 IPTG 가격의 약 2배의 비용이 든다 (즉, 현재 그램 당 약 US$36 또는 10 그램 당 약 US$250임). 비용 및 발효 시스템 자체에 대한 높은 독성 문제점 이외에, IPTG는 인간, 동물 및 기타 생물학적 유기체에게 독성 위험성도 내포하고 있기 때문에, 발현 생성물 또는 발효 생성물이 판매될 경우 거기에 존재하는 IPTG로 인한 환경 및 보건 규제 문제가 발생하게 된다.
결국, 상용 발효 생산 시스템에 유용하면서도 비독성 또는 저독성인 유도자에 의해 활성화되는 프로모터가 필요하다.
lac 프로모터 및 그의 유도체 사용의 추가적인 단점은, 이 프로모터들이 심지어 천연의 억제된 상태에서도 상대적으로 높은 배경 수준의 발현을 허용한다는 점에서 "누출성 (leaky)"이라는 점이다. 따라서 lac-타입 프로모터의 억제도를 증가시키기 위해서, 발현 숙주 세포 내에는 통상적으로 다수 카피의 LacI 억제자 단백질 유전자가 포함된다. 결국, 시판용 발효 시스템에 유용하면서도 유도되기 전까지는 불활성인 상태로 엄격하게 용이하게 조절될 수 있는 프로모터가 필요하다.
이러한 점에 비추어, 상용 원핵세포 발효 시스템에서 유전자 발현을 조절하기 위한 여러 가지의 기타 비-lac-타입 프로모터가 제안되어 왔다 (하기 표 2 참조).
제안된 유도성 시판용 비-lac 프로모터
프로모터 유도자 박테리아 숙주 세포(들) 참고문헌(들)
λPR 고온 대장균 (E. coli),슈도모나드 (Pseudomonads) 3, 4
λPL 고온 대장균, 슈도모나드 3, 4
Pm 알킬- 또는 할로-벤조에이트 슈도모나드 4, 5
Pu 알킬- 또는 할로-톨루엔 슈도모나드 5
Psal 살리실레이트 슈도모나드 5
Para 글루코스 부재시 아라비노스 대장균 5
상기 표 2에 열거된 처음 2개의 프로모터에 대해, 고온에 의해 유도되는 프로모터는 고온이 숙주 세포 배양에 해로울 수 있고; 대규모의 상용 발효 부피 전체에 걸쳐 균일하게 온도를 증가시키는 것이 대개 비실용적이며; 상용 발효 장치는 그러한 유도에 필요한 온도보다 낮은 온도에서 작동하는 것이 바람직하기 때문에 문제가 된다. 표 2에 열거된 다른 4개의 제안된 프로모터는 발명자가 알고 있는 바로는 대규모 발효 조건에서 잘 기능하는지가 입증되지 않았으며, Pu 프로모터의 알킬- 및 할로-톨루엔 유도자는 또한 생물학적 시스템에 현저한 독성이 있다.
따라서, 상용 발효 생산 시스템에 유용하고, 저비용, 저독성 화학적 유도자에 의해 활성화되며 엄격하게 조절되는 프로모터가 여전히 필요하다.
또한, 하나의 원핵세포 유기체를 사용하는 통상적인 발효 플랫폼에서 단백질 (및 기타 발현 생성물) 및 화학 물질 (발현 생성물 및(또는) 숙주 세포의 작용에 의해 처리된)의 생산을 위한 유전자 발현의 조절을 용이하게 위해, 발현 카세트의 라이브러리를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 카세트는 강도가 다르고(다르거나), 각각 상이한 성장 조건하에서 또는 상이한 화학 물질에 의해 유도되는 하나 이상의 다양한 프로모터를 각각 포함할 것이다. 그리고, 이러한 발현 카세트는 발효에 적합한 조건하에 상기 유전자의 총체적인 조절을 달성하기 위해, 다양한 관심 대상인 유전자에 연결될 것이다. 따라서, 광범위한 성장상-의존성 또는 화학적-유도성 프로모터의 동정 및 최적화가 상기 발효 플랫폼에서의 발효 동안 (형질전환)유전자 발현의 조절에 필수적이다.
또한, 유전자 발현을 매우 정밀하게 조절하기 위한 수단으로서, 제1 유전자 또는 오페론의 활성화 또는 유도가 하나 이상의 후속 유전자 또는 오페론을 억제 또는 활성화시키는 유전 회로의 구성이 제안되어 왔다. 선형 (예를 들어, 연속 및 케스케이드) 및 환형 (예를 들어, 데이지-체인)의 유전 회로가 모두 만들어져 왔다. 예를 들어, 미국특허 공개 제20010016354 A1호 (Cebolla Ramirez et al.) 참조. 이러한 유전 회로는 기능하기 위해서 다수의 각기 다른 프로모터를 필요로 하고, 상용 발효시 유전 회로는 상용 발효 조건에서 효과적인 프로모터에 의존할 필요가 있을 것이다. 따라서, 유전 회로 분야에서는 상용 발효에 유용한 보다 다양한 프로모터가 필요하다.
상기 나타낸 바와 같이, 시판용 발효 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 발현이 유도시에만 일어나고, 바람직하게는 발효 런 (run)의 후반에 작용하도록 엄격하게 조절되어야 한다. 프로모터를 유도하는데 사용되는 화학 물질은 저가이고 숙주 박테리아 및 기타 유기체에 저독성이어야 하며, 유전자 발현을 엄격하게 조절해야 한다. 상기 논의에 비추어, 저독성 유도자를 사용하면서 저가로 유도되고 엄격하게 조절되는 신규 프로모터가 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 상용 발효에서 유전자 발현에 유용한 신규 프로모터를 제공한다. 보다 구체적인 면에서, 본 발명은 벤조에이트-유도성 프로모터, 안트라닐레이트-유도성 프로모터, 및 박테리아 시판용 발효 시스템에 사용될 수 있는 직열 (tandem) 프로모터를 제공한다.
본 발명은
슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) 천연 벤조에이트 프로모터의 -10 영역의 상류에 15-20 뉴클레오티드 링커로 결합된, 그리고 서열 번호 1에서 발견되는 작동 프로모터 핵산 분절(들)에 결합된, 슈도모나스 플루오레센스 천연 벤조에이트 프로모터 -35 영역을 포함하는 단리된 및(또는) 재조합 벤조에이트 프로모터 핵산;
뉴클레오티드 서열이 상기 프로모터 핵산과 90% 이상의 상동성을 갖는 돌연변이 및 밀접하게 관련된 프로모터 핵산;
벤조에이트 프로모터 활성자 단백질 (BenR) 결합 부위를 추가로 포함하는 상기 프로모터 핵산; 및
서열 번호 2에 나타낸 활성자 단백질 아미노산 서열의 천연형, 돌연변이형 및(또는) 절단형 중 임의의 하나와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 벤조에이트 프로모터 활성자 단백질을 코딩하는, 벤조에이트 프로모터 활성자 단백질 코딩 서열을 추가로 포함하는 상기 프로모터 핵산
을 제공한다.
본 발명은 또한
슈도모나스 플루오레센스 천연 안트라닐레이트 프로모터의 -10 영역의 상류에 15-20 뉴클레오티드 링커로 결합된, 그리고 서열 번호 7에서 발견되는 작동 프로모터 핵산 분절(들)에 결합된, 슈도모나스 플루오레센스 천연 안트라닐레이트 프로모터의 -35 영역을 포함하는 단리된 및(또는) 재조합 안트라닐레이트 프로모터 핵산;
뉴클레오티드 서열이 상기 프로모터 핵산과 90% 이상의 상동성을 갖는 돌연변이 및 밀접하게 관련된 프로모터 핵산;
안트라닐레이트 프로모터 활성자 단백질 (AntR) 결합 부위를 추가로 포함하는 상기 프로모터 핵산; 및
서열 번호 9에 나타낸 활성자 단백질 아미노산 서열의 천연형, 돌연변이형 및(또는) 절단형 중 어느 하나와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 안트라닐레이트 프로모터 활성자 단백질을 코딩하는, 안트라닐레이트 프로모터 활성자 단백질 코딩 서열을 추가로 포함하는 상기 프로모터 핵산
을 제공한다.
본 발명은 또한
천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터의 상류에 직접 또는 프로모터간 폴리뉴클레오티드 링커로 결합된 (즉, 공유적으로 결합된), 비-이화대사산물-억제된 프로모터를 포함하는 직열 프로모터 (여기서, 이화대사산물-억제된 프로모터의 이화대사산물 억제는 극복되고(되거나) 상이한 개선된 프로모터 성질이 나타난다);
원핵세포의 비-이화대사산물-억제된 프로모터를 원핵세포의 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터의 상류에 직접 또는 프로모터간 폴리뉴클레오티드 링커로 공유적으로 결합시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 직열 프로모터;
상기 프로모터간 폴리뉴클레오티드 링커가 약 100 뉴클레오티드 길이 이하인 상기 직열 프로모터;
비-이화대사산물-억제된 및 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터 성분이 원핵세포 프로모터 또는 박테리아 프로모터이고; 상기 성분 프로모터가 슈도모나드 및 밀접하게 관련된 박테리아, 및(또는) 슈도모나스 속의 동일하거나 다른 종, 및(또는) 슈도모나스 플루오레센스로부터 수득되며; 상기 성분 프로모터가 대체 탄소원 사용 효소(들) 또는 경로(들)을 코딩하는 유전자(들) 또는 오페론(들)로부터 얻어지고; 비-이화대사산물-억제된 프로모터가 안트라닐레이트 분해 경로를 코딩하는 오페론으로부터 얻어지며, 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터는 벤조에이트 분해 경로를 코딩하는 오페론으로부터 얻어지고(지거나), 안트라닐레이트 프로모터 및 벤조에이트 프로모터는 상기 단락들에 요약된 것들로부터 선택되는 것인 상기 직열 프로모터;
서열 번호 13에 나타낸 성분 프로모터에서 발견되거나 그로부터 구성된 작동성 직열 프로모터(들)
을 제공한다.
본 발명은 또한
적어도 서열 번호 1의 염기 1275-1307, 적어도 서열 번호 7의 염기 1239-1274, 및 적어도 서열 번호 13의 염기 1329-1509 중 임의의 하나의 청구된 프로모터 또는 서열 중 임의의 하나의 염기 서열과 90% 이상 동일하고 이종성인 염기 서열을 갖는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 수득하고; 원핵생물 숙주 세포 내에서 직접 전사할 수 있는 능력, 및 임의로 하나 이상의 프로모터 성질에 대해 폴리뉴클레오티드(들)을 스크리닝하고; 그 결과에 따라 임의로 하나 이상의 개선된 특성을 갖는 하나 이상의 프로모터를 동정하는 것을 포함하는 방법으로 제조된 변형된 프로모터; 및
적어도 서열 번호 1의 염기 1275-1307, 적어도 서열 번호 7의 염기 1239-1274, 및 적어도 서열 번호 13의 염기 1329-1509 중 임의의 하나의 청구된 프로모터 또는 서열 중 임의의 하나의 염기 서열을 갖는 프로모터 폴리뉴클레오티드를, 그와 90% 이상의 상동성을 갖는 서열-변형된 폴리뉴클레오티드(들)에 대한 혼성화 프로브로서 사용하거나, 상기 서열-변형된 폴리뉴클레오티드(들)을 생성하기 위해 상기 프로모터 폴리뉴클레오티드에 돌연변이 생성 및(또는) 재조합을 수행하거나, 프로모터 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 나타내는 정보 스트링 (information string)을 그와 90% 이상의 상동성을 갖는 이종성 스트링에 대한 서치를 수행하기 위해 사용하고, 상기 이종성 스트링에 의해 나타내어지는 염기 서열을 갖는 서열-변형된 폴리뉴클레오티드를 제공하거나; 상기 정보 스트링을 상기 이종성 스트링으로 개질시키고, 그와 동일한 정보 스트링을 동정하기 위해 상기 개질된 스트링을 사용한 다음, 상기 정보 스트링에 의해 나타내어지는 염기 서열을 갖는 서열-변형된 폴리뉴클레오티드를 제공하고; 원핵생물 숙주 세포 내에서의 직접 전사하는 능력, 및 하나 이상의 프로모터 성질에 대해 서열-변형된 폴리뉴클레오티드(들)을 스크리닝하고; 그 결과에 기초하여 하나 이상의 개선된 특성을 갖는 하나 이상의 프로모터를 동정하는 방법에 의해 제조된 개선된 프로모터
를 제공한다.
본 발명은 또한
상보체가 엄격한 혼성화 및 세척 조건하에서 적어도 서열 번호 1의 염기 1275-1307, 적어도 서열 번호 7의 염기 1239-1274, 및 적어도 서열 번호 13의 염기 1329-1509 중 임의의 하나 또는 임의의 하나의 청구된 프로모터의 염기 서열을 갖는 핵염기 중합체 분자에 혼성화되는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자 (여기서, 단리된 핵산 분자는 원핵세포 내에서 프로모터로 기능할 수 있다); 및
적어도 서열 번호 1의 염기 1275-1307, 적어도 서열 번호 7의 염기 1239-1274, 및 적어도 서열 번호 13의 염기 1329-1509 중 임의의 하나 또는 임의의 하나의 청구된 프로모터의 염기 서열과 90% 이상 동일한 염기 서열을 갖는, 원핵세포 프로모터 폴리뉴클레오티드 분자의 염기 서열을 갖는 단리된 핵염기 중합체 분자
를 제공한다.
본 발명은 또한
적어도 서열 번호 1의 염기 1275-1307, 적어도 서열 번호 7의 염기 1239-1274, 및 적어도 서열 번호 13의 염기 1329-1509 중 임의의 하나 또는 임의의 하나의 청구된 프로모터의 염기 서열과 90% 이상 동일한 염기 서열을 포함하는 프로모터를 포함하는, 원핵세포 내에서 발현 구조물(들)로서 기능할 수 있는 재조합 핵산 분자를 제공하고; 상기 재조합 발현 구조물은 mRNA-코딩 서열을 포함하며; 상기 재조합 발현 구조물은 벡터이고; 상기 벡터는 플라스미드이며; 유전공학적으로 조작된 원핵생물 숙주 세포는 임의의 상기 재조합 발현 구조물을 포함하고, 상기 재조합 발현 구조물의 프로모터에 대한 관련 활성자 단백질을 코딩하는 유전자 (상기 유전자는 숙주 세포 내에서 발현됨)를 바람직하게는 적어도 하나, 보다 바람직하게는 한 카피 이상 포함하고; 상기 유전공학적으로 조작된 원핵생물 숙주 세포를 포함하는 발현 시스템은 상기 재조합 발현 구조물의 프로모터에 대한 관련 활성자 단백질을 코딩하는 유전자 (상기 유전자는 숙주 세포 내에서 발현됨)를 바람직하게는 적어도 하나, 보다 바람직하게는 한 카피 이상 포함하고; 상기 발현 시스템의 프로모터는 벤조에이트-유도성 프로모터이고 상기 활성자 단백질은 임의로 Asn152를 포함하는 서열 번호 2의 잔기 1-335 또는 21-335 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 가지며; 상기 발현 시스템의 프로모터는 안트라닐레이트-유도성 프로모터이고 상기 활성자 단백질은 서열 번호 9의 잔기 1-330, 또는 Ala268을 포함하는 서열 번호 9의 잔기 1-330의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 또한
상기 유전공학적으로 조작된 원핵생물 숙주 세포를 성장시키고, 그의 재조합 발현 구조물을 유도하여 그에 의해 코딩되는 전사 생성물을 발현시키는 것을 포함하는 전사 생성물의 제조 방법; 및 전사 생성물을 제조하기 위해 상기 방법을 사용하여 mRNA 전사 생성물을 발현시키고, 추가로 숙주 세포가 mRNA를 그가 코딩하는 폴리펩티드로 번역하도록 하는 것을 포함하는, 폴리펩티드의 제조 방법
을 제공한다.
본 발명은 또한. 원핵세포에서 작동성인 전사 활성자 단백질을 제공한다. 이는 서열 번호 2의 잔기 1-335, Asn152를 포함하는 서열 번호 2의 잔기 1-335, 서열 번호 2의 잔기 21-335, 및 Asn152를 포함하는 서열 번호 2의 잔기 21-335 중 임의의 하나와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 전사 활성자 단백질; 및 서열 번호 9의 잔기 1-330, 또는 Ala268을 포함하는 서열 번호 9의 잔기 1-330 중 임의의 하나와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 전사 활성자 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한, 상기 전사 활성자 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명에 따른 벤조에이트-유도성 프로모터, Pben509를 포함하는 벡터, pDOW1019의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 벤조에이트-유도성 프로모터, Pben278을 포함하는 벡터, pDOW1028의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 안트라닐레이트-유도성 프로모터를 비롯한 그에 대한 활성자 단백질의 코딩 서열을 포함하는 벡터, pDOW1035의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 안트라닐레이트-벤조에이트 직열 프로모터를 포함하는 벡터, pDOW1057의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 5는 Pben509 (서열 번호 1의 뉴클레오티드 c994-c1502) 및 Pben278 (서열 번호 1의 뉴클레오티드 g1228-c1502) 벤조에이트-유도성 프로모터의 뉴클레오티드 서열의 비교를 나타낸다. 상류 ORF의 TTA 번역 정지 부위, 및 추정되는 -35 영역 (TTGACG), -10 영역 (TACGGT) 및 "C" 전사 개시 부위에는 밑줄을 그었다. Pben278 서열에서 이중으로 밑줄친 "C"는 Pben509 및 게놈 서열과 다른 Pben278의 돌연변이를 나타내고; 이 돌연변이는 PCR 증폭 동안 도입되었다.
도 6은 0 mm(□) 또는 10 mM (■)의 소듐 벤조에이트 존재하에, Pben509 (pDOW1019) 또는 Pben278 (pDOW1028) 조절하의 β-갈락토시다제 유도를 보여주는 막대 그래프이다. pDOW1017은 프로모터가 없는 벡터이다. 나타낸 결과는 유도 24시간 후에 분석된 삼중 반복실험 (triplicate) 웰의 평균 측정치이다 (숙주 세포는 유도 전 24시간 동안 한정 (defined) 염 배지에서 배양했다).
도 7은 Pant+AntR (서열 번호 13의 a1-c1395), Pant713 (서열 번호 7의 뉴클레오티드 c592-c1304), Pant705 (서열 번호 7의 뉴클레오티드 c592-g1288) 및 Pant311 (서열 번호 7의 뉴클레오티드 c994-c1304)의 네 개의 Pant 프로모터의 뉴클레오티드 서열의 비교를 나타낸다. 이중으로 밑줄친 뉴클레오티드 트리플렛 (TCA 및 CAT)은 각각, 기재한 가닥에 상보적인 가닥에 의해 코딩되는 AntR ORF의 정지 및 개시 코돈을 나타낸다. 이중으로 밑줄친 하나의 "A"는 양쪽 가닥 모두에서 확인된 게놈 서열로부터의 돌연변이를 나타내고, 이는 AntR 코딩 서열 내에 위치하는데; 이러한 변화는 AntR 단백질 내에서 알라닌에서 세린으로의 발현된 변화를 야기한다. 추정되는 -35 영역 (ATAGCC), -10 영역 (CTTAAT) 및 전사 개시 부위 ("A"), 및 추정되는 리보좀 결합 부위 (GGAGG)의 상보적 부위는 모두 밑줄쳤다.
도 8은 5 mM의 안트라닐레이트 또는 2 mM의 6-클로로안트라닐레이트로 유도했을 때 Pant713 구조물 (pDOW1029) 대 antR/Pant 구조물 (pDOW1035)의 활성을 비교하는 그래프를 나타낸다. 모든 구조물에서, 프로모터는 β-갈락토시다제-코딩 서열에 융합되었다. β-갈락토시다제 리포터의 활성은 유도후 8시간 경로에 걸쳐 측정했다. 결과는 유도후 pDOW1035의 활성이 훨씬 빨리 나타났고 pDOW1029의 활성보다 훨씬 높았슴을 보여준다.
도 9는 Pant-Pben 직열 프로모터 구조물의 유도, 및 성분 프로모터 구조물의 유도를 보여주는 막대 그래프이다. 모든 구조물에서, 프로모터는 β-갈락토시다제-코딩 서열에 융합된다. Pant-Pben 직열 프로모터 구조물 (pDOW1057)의 벤조에이트 또는 안트라닐레이트로의 유도를, 성분 프로모터인 Pben278을 포함하는 Pben 프로모터 구조물 (pDOW1028), 및 antR/Pant를 포함하는 Pant 프로모터 구조물 (pDOW1035) 중 하나를 포함하는 구조물의 유도와 비교해 나타냈다. 도 9A는 유도 5시간 후의 결과를 나타내고, 도 9B는 유도 24시간 후의 결과를 나타낸다.
도 10은 Pben509의 오류 빈발 (error prone) PCR에 의해 생성된, 개선된 돌연변이 2d3 및 21b5의 활성에 대한 Pben509 활성의 비교를 보여주는 막대 그래프이다. 발현 구조물은 프로모터-포함 단편을 phoA 리포터 유전자에 융합시켜 형성되었다. 구조물을 포함하는 배양물을 10 mM의 벤조에이트로 유도하고, 유도 24시간 후 알칼리성 포스파타제 활성을 측정했다.
도 11은 Pben509의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 1의 뉴클레오티드 c994-c1502), 및 오류 빈발 PCR 방법으로 생성된 그의 두 개의 개선된 돌연변이: 돌연변이 2d3 (a1106→t1106을 갖는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 c994-c1502) 및 돌연변이 21b5 (c1223→tl223 및 g1302→a1302를 갖는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 c994-c1502)의 비교를 보여준다. 상류 ORF의 TTA 번역 정지 부위, 및 추정되는 -35 영역 (TTGACG), -10 영역 (TACGGT) 및 "C" 전사 개시 부위는 밑줄쳤다. 돌연변이는 이중으로 밑줄쳐 표시했다.
도 12는 20 L 발효 조건에서 안트라닐레이트-유도된 발현의 그래프를 나타낸다. antR/Pant 구조물 pDOW1035 (■) 및 직열 프로모터 구조물 pDOW1057 (▲)은, 1 mM/시간의 안트라닐레이트 공급을 더하면서 5 mM의 소듐 안트라닐레이트로 유도했다. 각 20 L의 발효 런에 대한 활성 수준을 나타냈다.
도 13은 숙주 세포 (슈도모나스 플루오레센스)에서 antA 유전자를 단일 교차 녹아웃시킴으로써 생성된 antA 녹아웃 숙주에서, 직열 프로모터 구조물 (pDOW1057)로부터의 개선된 안트라닐레이트-유도된 발현을 입증하는 그래프이다. 결과는 약 5 mM 소듐 안트라닐레이트의 표적 수준에서 유도되고, 유도후 48시간 경로에 걸쳐 측정한 20 L 발효에 대한 것이다. 안트라닐레이트 공급은 필요하지 않았다. 도 13A는 리포터 유전자 구조물로부터 발현된 β-갈락토시다제의 활성을 나타내고; 도 13B는 안트라닐레이트 농도의 유지를 보여줌으로써, 녹아웃 숙주 세포가 안트라닐레이트를 대사하지 않는다는 것을 입증해주고 있다.
도 14는 Pben -10 돌연변이의 유도를 보여주는 막대 그래프이다. 0 mM (□) 또는 5 mM (■) 소듐 벤조에이트로의 유도 24시간 후, 표시된 Pben::phoA 융합체를 포함하는 P. 플루오레센스의 알칼리성 포스파타제 활성을 나타냈다. 대표적인 삼중 반복실험의 표본을 나타냈다.
도 15는 Pant -10 돌연변이의 유도를 보여주는 막대 그래프이다. 0 mM (□) 또는 5 mM (■) 안트라닐레이트로의 유도 24시간 후, 표시된 Pant::phoA 융합체를 포함하는 P. 플루오레센스 antA::kanR의 알칼리성 포스파타제 활성을 나타냈다. 대표적인 삼중 반복실험의 표본을 나타냈다.
도 16은 antR-Pant311-Pben 직열 프로모터의 활성에 대한 Pben88 -10 돌연변이의 영향을 나타내는 막대 그래프이다. 0 mM (□) 또는 5 mM (■) 소듐 벤조에이트 (도 16A) 또는 안트라닐레이트 (도 16B)로의 유도 24시간 후, 표시된 직열 프로모터::lacZ 융합체를 포함하는 P. 플루오레센스의 β-갈락토시다제 활성을 나타냈다. 대표적인 삼중 반복실험의 표본을 나타냈다.
도 17은 benR이 pDOW1090과 다수 카피로 존재하는 경우, 20 L 발효 동안 벤조에이트의 소비에 대한 그래프이다. 나타낸 데이터는 2회 반복 발효시 두 개의 20 L 발효기의 유도 전체에 대한 벤조에이트 농도를 측정하는 HPLC 분석이고, 런 "030211I" (●) 및 런 "030211K" (■)로 나타냈다. 배양물은 5 mM의 소듐 벤조에이트로 유도했다.
도 18은 직열 프로모터 구조물 활성의 비교를 보여주는 막대 그래프이다. 표시된 직열 프로모터::lacZ 융합체 (ant 활성자-Pant311::1acZ인 pDOW1035; 및 ben 활성자 Pben88 -10공통::lacZ인 pDOW1126은 제외)를 포함하는 P. 플루오레센스의 β-갈락토시다제 활성은, 0 또는 5 mM의 소듐 벤조에이트 (2, 4 및 24시간 시점에 대해 도 18A 및 18B) 또는 안트라닐레이트 (0, 2, 6 및 24시간 시점에 대해 도 18C 및 18D)로의 유도후 나타냈다. 대표적인 삼중 반복실험의 표본을 나타냈다. 시점은 "유도후"를 "I" 문자로 나타냈다.
도 19는 benAB 녹아웃 균주에서 Pben 활성의 분석을 보여주는 막대 그래프이다. pDOW1019 (Pben278::1acZ)를 갖는 P. 플루오레센스 MB101 benAB 녹아웃 균주의 β-갈락토시다제 활성은, 24시간 이하 동안 0 mM (□) 또는 5 mM (■) 소듐 벤조에이트로의 유도에 의한 결과로서 나타냈다. 세포는 LB 배지에서 배양했다.
바람직한 실시태양의 상세한 설명
본 발명은 박테리아 시판용 발효 시스템에 사용될 수 있는 상업적으로 유용한 벤조에이트-유도성 프로모터, 안트라닐레이트-유도성 프로모터, 및 직열 프로모터를 제공한다. 이러한 시스템에 사용하기 위한 바람직한 박테리아 숙주 세포는, 슈도모나드 및 밀접하게 관련된 박테리아를 포함한다. 이러한 프로모터의 화학 물질 유도자는 벤조산 및 안트라닐산, 그의 효과적인 화학적 유사체, 및 그의 생물학상 허용되는 염을 포함한다.
벤조산 및 안트라닐산, 및 그의 생물학상 허용되는 염, 바람직하게는 그의 나트륨 또는 칼륨염은 저렴하고 독성이 낮은 화학 물질로서, 슈도모나드 및 밀접하게 관련된 박테리아를 포함하는 박테리아 숙주 세포에 의해 (대체) 탄소원으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들 화학적 유도자는 그램 당 약 US$0.15 미만 (IPTG는 그램 당 약 US$18 또는 US$36인데 비해)으로 구입할 수 있다.
본원 발명자들은 글루코스의 부재시 벤조에이트로 유도될 수 있는 P. 플루오레센스 벤조에이트 (benABCD) 분해 유전자, 및 안트라닐레이트로 유도될 수 있는 P. 플루오레센스 (antABC) 분해 유전자를 발현시키는 천연 프로모터를 단리, 시퀀싱 및 특징화했다. (상기 오페론의 발현 생성물은, 슈도모나스 플루오레센스 바이오타입 A에서 각각 벤조에이트 및 안트라닐레이트를 분해하는 이화 경로 효소이다.) 이 프로모터는 5 mM의 소듐 벤조에이트 및 5 mM의 소듐 안트라닐레이트로 각각 유도했을 때, 외인성 유전자의 발현을 벤조에이트 프로모터의 경우 약 250배, 그리고 안트라닐레이트 프로모터의 경우 약 25배 내지 약 35배 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본원 발명자들은 상기 프로모터가 슈도모나드 및 밀접하게 관련된 박테리아를 비롯한 박테리아 숙주 세포에서 단백질 및 화학 물질을 생산하기 위한 시판용 발효 시스템에 사용하기에 충분히 유도성이라는 것을 발견했다.
또한, 본원 발명자들은 비-이화대사산물-억제된 프로모터가 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터의 상류에 연결되어 놀랍게도 후자 프로모터의 이화대사산물 억제를 극복하고(하거나), 이로써 상이한 개선된 특성 (예를 들어, 증가된 유도 강도 또는 증가된 조절 강도)을 갖는 직열 프로모터 구조물을 제조했다. 직열 프로모터 구조물의 하나 이상의 예가 외래 유전자의 발현에 대해 기술되어 왔다 [6]. 그러나, 이러한 예는 동일한 프로모터, Plac 두 카피의 직열 배열에 관한 것이고, 상기 참고문헌은 직열 Plac-Plac 프로모터가 단일 Plac 프로모터를 능가하는 장점을 갖는지에 대해서는 증거를 제시하지 않고 있다. 이와 마찬가지로, 예를 들어, 각기 다른 종 또는 속에서 작동성인 2개의 프로모터가 모두 동일한 유전자에 조작가능하게 결합되어 유전자가 2개의 상이한 종 또는 속에서 발현될 수 있는 셔틀 벡터에 사용하기 위한 이중 프로모터 구조물은 공지되어 있다.
이러한 직열 및 이중 프로모터 구조물과 대조적으로, 2개의 동일하지 않은 프로모터가 직열 배열된 본 발명에서 제작된 직열 프로모터 구조물은 놀랍게도, 두 프로모터 모두의 바람직한 특징을 보유하고 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 안트라닐레이트 프로모터, Pant, 및 벤조에이트 프로모터, Pben의 직열 배열은, 발효 조건하에서 안트라닐레이트로 유도했을 때 이화대사산물 억제로부터의 자유 (Pben은 갖지 않는 Pant의 바람직한 특징) 및 개선된 유도 강도 (Pant은 갖지 않는 Pben의 바람직한 특징)를 모두 갖는 직열 프로모터가 형성되었다. 따라서, 본 발명의 직열 프로모터는 각각의 프로모터 요소의 바람직한 특성을 보유하도록 함으로써, 그로부터 형성된 직열 프로모터가 개선된 특성: 예를 들어, 증가된 유도 강도 또는 증가된 조절 강도 (즉, 프로모터의 활성자 또는 억제자 단백질의 관련 유도자와 접촉했을 때에만 전사); 및(또는) 이화대사산물 억제 결여를 보유할 수 있다.
용어 해설
A### (흡수)
분석 검출에 대해 본원에 사용된 바와 같이, "A450"과 같은 용어는 "450 nm 파장에서의 흡수"를 의미한다.
A 및 An (부정관사)
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an", 및 "the"는 명백히 다르게 나타내지 않으면 단수 및 복수의 지시 대상을 모두 포함한다. 따라서, 예를 들어 "숙주 세포"는 문자 그대로 단일 숙주 세포만을 사용하는 실시태양, 단일 형태의 숙주 세포 다수개를 사용하는 실시태양, 및 다수 형태의 숙주 세포 다수개를 사용하는 실시태양을 모두 의미한다.
* (별표)
계산에 대해 본원에 사용된 바와 같이, "*" 기호 (별표)는 수학의 곱셈 함수를 나타낸다.
BCIP
5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 예를 들어 이나트륨염 (disodium salt)과 같은 그의 이가염. 이는 예를 들어 테트라졸륨염, 예를 들어 니트로블루 테트라졸륨 (NBT)의 할라이드염, 예를 들어 비스-[2-(4-일-2-메톡시페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐-테트라졸륨 클로라이드]; 또는 요오도블루 테트라졸륨이라고도 불리는 요오도-니트로-테트라졸륨 (INT)의 할라이드염, 예를 들어 2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐 테트라졸륨 클로라이드와 함께 사용된다.
포함하는 (comprising)
본원에 사용된 바와 같이, "포함하는"이라는 용어는 주어가 "포함하는"이라는 용어 다음에 열거된 요소, 뿐만 아니라 그렇게 열거되지 않은 임의의 기타 요소들도 포함함을 의미한다. 여기서, "포함하는"이라는 용어는 광범위하고 개방형인 (open-ended) 용어로 해석되어야 하고; 따라서, 열거된 요소들을 "포함하는" 주어에 대한 청구항은 포괄적으로, 즉 열거된 요소에 의해 한정되지 않는 것으로 해석해야 한다. 따라서, "포함하는"이라는 용어는 예를 들어 "갖는", "함유하는" 또는 "포함하는 (including)"과 같은 용어와 동의어로 생각할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명은 "포함하는" 및 "특징으로 하는"의 용어를 사용하여 기술된다. 그러나, 이보다 좁은 의미를 갖는 단어 및 구절도 본 발명을 보다 좁게 기술, 정의 또는 청구하는데 개방형 용어의 대신으로서 유용하다.
상응하는
폴리뉴클레오티드원에 "상응하는" 서열 기록에 대해 본원에 사용된 바와 같이, "상응하는"이란 용어는 정보 스트링으로서 서열 기록 내에 포함된 소정의 염기 서열이 폴리뉴클레오티드원 내에서 물리적인 핵염기 서열-함유 분자의 형태로 존재함을 의미한다.
ddH2O
본원에 사용된 바와 같이, ddH2O는 Q-GARD 정제 팩 (밀리포어 (Millipore), 메사추세츠주 베드포드)을 갖춘 밀리-Q (Milli-Q) 구배 시스템으로 정제된, 증류된 탈이온수를 나타낸다.
dNTPs
다르게 나타낸 경우를 제외하고는, 폴리뉴클레오티드 합성 반응을 위한 시약에 대해 본원에 사용된 바와 같이, "dNTPs"라는 용어는 각각 네 가지의 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dGTP, dCTP, dATP, dTTP)의 동일 몰 용액을 의미한다. 따라서, 예를 들어 10 mM의 dNTPs는 dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP를 각각 10 mM 포함하는 용액을 나타낸다.
외인성 및 외래의
"외인성"이라는 용어는 주어진 세포 또는 분자에 대해 "외부의 근원으로부터"를 의미한다. 당 분야에서 통상적으로 사용되는 바와 같이, 본 출원에서 이 용어는 "외래의"라는 용어와 동의어로서 상호 교환되어 사용된다. 상기 두 가지의 용어 모두 소정의 물체가 소정의 세포 또는 분자 (예를 들어, 프로모터 폴리뉴클레오티드)에 대해 외래의 것임을, 즉 자연계에서는 세포 내에서 발견되지 않고(않거나) 자연계에서는 그 분자와 함께 또는 관련하여서는 발견되지 않음을 나타내기 위해 본원에 사용된다.
이종성인
본원에 사용된 바와 같이, "이종성"이라는 용어는 서열이 "동일하지 않음" (염기 서열이 100% 동일하지 않음)을 의미한다.
내에서 및 상에서
성장 배지를 사용하는 유기체 배양에 대해 본원에 사용된 바와 같이, 유기체는 배지 "내에서" 또는 "상에서" 성장한다고 할 수 있다. 본 발명의 발현 시스템에서, 배지는 바람직하게는 겔 또는 액체 배지, 보다 바람직하게는 수성 겔 또는 액체 배지, 보다 더 바람직하게는 수성 액체 배지이다. 따라서, 이러한 상황에서 "내에서" 및 "상에서"라는 용어는 숙주 세포를 배지와 접촉시켜 성장시킨다는 것을 나타내기 위해 서로 동의어적으로 사용된다.
정보 스트링
본원에 사용된 바와 같이, "정보 스트링"이라는 구절은 주어진 일련의 핵염기 정보를 연속적으로 나타내는 일련의 데이터 요소 (예를 들어 비트, 바이트, 또는 영숫자)를 의미한다.
IPTG
이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드.
ONPG
2-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드로도 알려진, O-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드.
ORF
오픈 리딩 프레임.
PNPP
파라-니트로페닐 포스페이트, 예를 들어 이나트륨염과 같은 그의 이가염. 4-니트로페닐 포스페이트로도 지칭됨.
폴리뉴클레오티드 길이
본원에 사용된 바와 같이, "뉴클레오티드"라는 용어는 폴리뉴클레오티드의 길이를 기술하기 위해 사용된다. 그러나, 이와 관련하여 용어법상으로는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드에 대한 뉴클레오티드 자체의 길이, 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 대한 염기쌍의 길이 모두를 지칭하는 것을 의미한다.
폴리뉴클레오티드원
본원에 사용된 바와 같이, "폴리뉴클레오티드원"이라는 구절은 소정의 핵염기 서열을 포함하는 핵산, 예를 들어 핵산 표본의 물리적 실시태양의 임의의 근원, 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 천연 세포 또는 클론을 의미한다.
프로모터 활성자 단백질 용어법
소정의 프로모터에 대한 천연 활성자는 "R"로, 예를 들어 Pben 및 Pant 프로모터의 천연 활성자에 대해서는 각각 BenR, AntR로 나타낸다.
프로모터 용어법
"Pant": P. 플루오레센스의 안트라닐레이트 오페론에 대한 프로모터.
"Pben": P. 플루오레센스의 벤조에이트 오페론에 대한 프로모터.
"Plac": 대장균의 락토스 오페론에 대한 프로모터.
"P직열" 및 "직열 프로모터": 비-이화대사산물-억제된 프로모터가 0 내지 약 100 뉴클레오티드의 서열로 이화대사산물-억제된 프로모터의 상류에 결합된, 직열 프로모터 배열. 이는 본원에서 Pant-Pben 직열 프로모터 구조물로 예시된다.
"프로모터": 원핵생물의 " -35 영역부터 -10 영역을 포함하는, 25 뉴클레오티드 이상, 보다 통상적으로는 약 30 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드. "바람직하게는, 이 "-35 영역부터 -10 영역까지"는 단일 유전자로부터 얻어진 "-35 영역부터 -10 영역까지"이거나, 또는 하나 이상의 원핵생물, 보다 바람직하게는 "슈도모나드 및 밀접하게 관련된 종" 중 하나 이상의 유기체로부터 얻어진 인지체 유전자로부터 얻어진 -35 영역 및 -10 영역의 조합이다. 바람직하게는, "-35 영역부터 -10 영역까지"는 σ70 "-35 영역부터 -10 영역까지"이고, 조합에서 "-35 영역" 및 "-10 영역"은 각각 σ70 -35 영역 및 σ70 -10 영역이다.
-35 영역은 바람직하게는 약 15 내지 약 20 뉴클레오티드의 프로모터내 폴리뉴클레오티드로 -10 영역의 상류에 연결된다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로모터는 약 35 뉴클레오티드를 포함하고, 이는 "-35 영역부터 -10 영역까지" 이외에, 약 5 내지 약 10 뉴클레오티드 바로 하류 (downstream), 보다 바람직하게는 6 내지 7 뉴클레오티드 바로 하류의 분절 (전사 개시 부위 뉴클레오티드에서 종결)을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 이 분절은 -35 또는 -10 영역 중 하나 이상을 제공하는 유전자와 동일한 유전자로부터 얻어진다. 특히 바람직한 실시태양에서, 프로모터는 또한 프로모터 활성자 단백질 결합 부위, 바람직하게는 AraC/XylS-군 결합 부위를 포함하는 약 20 내지 약 250 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 40 내지 약 150 뉴클레오티드 바로 상류의 영역을 포함할 것이다. 바람직한 실시태양에서, 결합 부위 영역은 -35 또는 -10 영역 중 하나 이상을 제공하는 유전자와 동일한 유전자로부터 얻어진다.
본원에 사용된 바와 같이, "-35 영역" 또는 "마이너스 35 영역"이란 용어는 "+1"로 번호를 붙인 전사 개시 부위의 (즉, 5' 방향으로) 약 35 뉴클레오티드 상류에서 시작하는 5-6 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이와 마찬가지로, "-10 영역" 또는 "마이너스 10 영역"이란 용어는 "+1"로 번호를 붙인 전사 개시 부위의 (즉, 5' 방향으로) 약 10 뉴클레오티드 상류에서 시작하는 5-6 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
RNA 용어
본원에 사용된 바와 같이, 하기 RNA 용어들은 하기 언급된 정의들을 갖는다.
aRNA: 안티센스 RNA
cRNA: 세포질 RNA
gRNA: 가이드 RNA (미토콘드리아 전구-mRNAs를 에디팅하기 위한)
hnRNA: 이핵성 (heteronuclear) RNA
mRNA: 메신저 RNA
miRNA: 마이크로RNA (mRNA 발현을 조절하기 위한)
mtRNA: 미토콘드리아 RNA
nRNA: 핵 RNA
ncRNA: 비-코딩 RNA
pRNA: 패키징 RNA (바이러스 및 파지 입자 조립을 위한)
rRNA: 리보좀 RNA
satRNA: 위성 (satellite) RNA
scRNA: 소세포질 RNA
siRNA: 소간섭 (small interfering) RNA
snRNA: 소핵성 (small nuclear) RNA
snoRNA: 소 핵소체 (small nucleolar) RNA
srpRNA: 신호 인식 입자 RNA
stRNA: 소 일시 (small temporal) RNA (miRNA의 아군)
tRNA: 트랜스퍼 RNA
tmRNA: 트랜스퍼-메신저-유사 RNA (멈춘 리보좀에서 신생 폴리펩티드의 마킹, 후속적인 분해를 위한)
vRNA: 바이러스 (및(또는) 파지) RNA
검색
정보를 조사하는 데에 대해 본원에 사용된 바와 같이, "검색"이라는 용어는 동일하거나 동일하지 않은 정보 스트링을 동정하기 위해 공지된 정보 스트링과 기타 정보 스트링 간에 1회 이상의 비교를 수행 (수동적, 시각적, 또는 자동화 방법으로)하는 것을 의미한다.
서열 기록
본원에 사용된 바와 같이, "서열 기록"이라는 구절은 하나 이상의 정보 스트링의 저장된 태양, 예를 들어 컴퓨터로 판독가능한 기록 또는 문서 기록을 의미한다.
-10 변이체 프로모터 명명
"-10con": 천연의 -10 영역이 공통 -10 영역의 서열 'tataat'로 치환된 변이체 프로모터를 나타낸다.
"-10ben": 천연의 -10 영역이 P. 플루오레센스의 -10 영역 Pben 'tacggt'로 치환된 변이체 프로모터를 나타낸다.
"-10benAc": 천연의 -10 영역이 아시네토박터 (Acinetobacter)의 -10 영역 Pben 'taaggt'로 치환된 변이체 프로모터를 나타낸다.
"-10wt": 야생형 -10 서열을 보유하는 절단된 천연 프로모터를 나타낸다.
~ (틸드)
~ 기호 (틸드)는 본원에서 "약"을 나타내기 위해 사용된다.
x (배)
x 기호 (배 기호)는 용액의 농도에 대해 본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어 5x 조제물은 동일한 용액 조성 (즉, 그 안의 모든 성분들의 상대량이 동일함)의 1x 조제물에 비해 5배 농축된 것임을 의미한다.
트리스
본원에 사용된 바와 같이, "트리스"라는 용어는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (피셔 사이언티픽 (Fisher Scientific), 펜실베니아주 피츠버그로부터 입수가능)을 의미한다.
X-gal
5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드
통상적인 물질 & 방법
다르게 나타나지 않으면, 핵산 조작, 형질전환 및 발현을 위해 표준 기술, 벡터, 조절 서열 요소, 및 분자 생물학 분야에 공지된 기타 발현 시스템 요소가 사용된다. 상기 표준 기술, 벡터 및 요소들은 예를 들어, 문헌 [Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1995) (John Wiley & Sons); Sambrook, Fritsch, & Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Berger & Kimmel, Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) (Academic Press); 및 Bukhari et al. (eds.), DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes (1977) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 프로모터는 슈도모나스 플루오레센스로부터의 벤조에이트 프로모터, 슈도모나스 플루오레센스로부터의 안트라닐레이트 프로모터, 및 그의 유도체들을 포함한다. 본 발명의 프로모터는 또한, 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터의 상류에 연결된 비-이화대사산물-억제된 프로모터를 갖는 직열 프로모터 (여기서, 전자 프로모터의 이화대사산물 억제는 극복되고(되거나) 상이한 개선된 프로모터 성질이 나타난다)를 포함한다.
본 발명의 프로모터는 통상적으로, 발현 시스템 내에서 사용될 경우 DNA의 형태이다. 그러나, 프로모터의 핵염기 서열은 DNA, RNA, 또는 당 분야에 공지된 임의의 핵산 유사체, 예를 들어 펩티드 핵산 (PNA)의 형태로 존재할 수 있다.
벤조에이트 프로모터
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 벤조에이트 프로모터는 슈도모나스 플루오레센스 천연 벤조에이트 프로모터, 또는 그의 개선된 돌연변이이다. 본원 발명자들은 이 프로모터가 벤조산, 벤조산 유사체 (예를 들어, m-톨루익산), 및 그의 생물학상 허용되는 염 (예를 들어, 소듐 벤조에이트)에 의해 유도될 수 있다는 것을 발견했다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 벤조에이트 프로모터는 슈도모나스 플루오레센스 천연 벤조에이트 프로모터의 -10 영역의 상류에 15-20 뉴클레오티드 링커로 결합된, 슈도모나스 플루오레센스 천연 벤조에이트 프로모터의 -35 영역을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 링커는 15 뉴클레오티드 길이이다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 벤조에이트 프로모터는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1296-1301의 상류에 15-20 뉴클레오티드 링커로 결합된, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1275-1280을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 링커는 15 뉴클레오티드 길이이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 링커는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1281-1295이므로, 본원의 바람직한 실시태양의 벤조에이트 프로모터는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1275-1301을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 벤조에이트 프로모터는 약 6 뉴클레오티드, 바람직하게는 6 뉴클레오티드 길이의 스페이서 분절의 바로 상류에 결합되고, 전사 개시 부위로서 기능하는 뉴클레오티드로 종결되는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1275-1301을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 스페이서 분절은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1302-1307이므로, 본 발명의 바람직한 실시태양의 벤조에이트 프로모터는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1275-1307을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 벤조에이트 프로모터는 "-35 내지 -10 영역" 및 벤조에이트 프로모터 활성자 (또는 억제자) 단백질 결합 부위, 바람직하게는 활성자 단백질 결합 부위를 모두 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 벤조에이트 프로모터는 약 50 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1275-1301을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 벤조에이트 프로모터는 약 45 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1275-1301을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 스페이서 영역은 뉴클레오티드 1275의 약 50 뉴클레오티드 상류에서 시작해서 뉴클레오티드 1274로 끝나는, 서열 번호 1에 나타낸 영역의 서열을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 스페이서 영역은 뉴클레오티드 1275의 약 45 뉴클레오티드 상류에서 시작해서 뉴클레오티드 1274로 끝나는, 서열 번호 1에 나타낸 영역의 서열을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 스페이서 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1228-1274의 서열을 가지므로, 본 바람직한 실시태양의 벤조에이트 프로모터는 뉴클레오티드 1228-1301의 서열을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 벤조에이트 프로모터는 상기 스페이서 분절의 바로 상류에 결합되고 상기 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1275-1301을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 벤조에이트 프로모터는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1228-1307을 포함한다.
바람직한 실시태양에서는, 본 발명에 따른 벤조에이트 프로모터가 사용되는 발현 시스템에서 숙주 세포는 벤조에이트 프로모터 활성자 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산도 포함하고 발현할 것이다. 거기에 이러한 Pben 활성자 단백질-코딩 핵산의 다수 발현된 카피를 사용하는 것이 더욱 더 바람직하다. 바람직한 실시태양에서, Pben 활성자 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열 또는 그의 잔기 152 (Asn) 변이체, 또는 서열 번호 2의 잔기 21-335의 아미노산 서열 또는 그의 잔기 152 (Asn) 변이체를 가질 것이다. 바람직한 실시태양에서, Pben 활성자 단백질을 코딩하는 핵산은 서열 번호 1의 염기 285-1229 또는 그의 염기 679 돌연변이체의 서열, 또는 서열 번호 1의 염기 225-1229 또는 그의 염기 679 돌연변이체의 서열; 또는 이들 중 임의의 것의 상보체; 또는 이들 중 임의의 것의 RNA 동등체를 포함할 것이다.
안트라닐레이트 프로모터
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 슈도모나스 플루오레센스 천연 안트라닐레이트 프로모터, 또는 그의 개선된 돌연변이이다. 본원 발명자들은 이 프로모터가 안트라닐산, 안트라닐산 유사체 (예를 들어, 할로안트라닐산), 및 그의 생물학상 허용되는 염 (예를 들어, 소듐 안트라닐레이트); 및 o-톨루에이트(o-톨루에이트는 안트라닐레이트가 그러하듯이 이 프로모터를 유도하는 것으로 밝혀졌다)에 의해 유도될 수 있다는 것을 발견했다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 슈도모나스 플루오레센스 천연 안트라닐레이트 프로모터 -10 영역의 상류에 15-20 뉴클레오티드 링커로, 보다 바람직하게는 16-19 뉴클레오티드 링커로 결합된, 슈도모나스 플루오레센스 천연 안트라닐레이트 프로모터의 -35 영역을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 링커는 19 뉴클레오티드 길이이다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1264-1268의 상류에 15-20 뉴클레오티드 링커로 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1244를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 링커는 19 뉴클레오티드 길이이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 링커는 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1245-1263이므로, 본 바람직한 실시태양의 안트라닐레이트 프로모터는 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 약 6 뉴클레오티드, 바람직하게는 6 뉴클레오티드 길이의 스페이서 분절의 바로 상류에 결합되고, 전사 개시 부위로서 기능하는 뉴클레오티드로 종결되는, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 스페이서 분절은 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1269-1274이므로, 본 바람직한 실시태양의 안트라닐레이트 프로모터는 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1274를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 "-35 내지 -10 영역" 및 안트라닐레이트 프로모터 활성자 (또는 억제자) 단백질 결합 부위, 바람직하게는 활성자 단백질 결합 부위를 모두 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 약 250 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 약 200 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 약 150 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 약 120 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 약 110 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 약 100 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 약 85 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 약 80 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 약 75 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 약 70 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 약 65 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 약 60 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 약 55 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 약 50 뉴클레오티드 길이의 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 스페이서 영역은 뉴클레오티드 1239의 약 100 뉴클레오티드 상류에서 시작해서 뉴클레오티드 1238로 끝나는, 서열 번호 7에 나타낸 영역의 서열을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 스페이서 영역은 뉴클레오티드 1239의 약 85 뉴클레오티드 상류에서 시작해서 뉴클레오티드 1238로 끝나는, 서열 번호 7에 나타낸 영역의 서열을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 스페이서 영역은 뉴클레오티드 1239의 약 80 뉴클레오티드 상류에서 시작해서 뉴클레오티드 1238로 끝나는, 서열 번호 7에 나타낸 영역의 서열을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 스페이서 영역은 뉴클레오티드 1239의 약 75 뉴클레오티드 상류에서 시작해서 뉴클레오티드 1238로 끝나는, 서열 번호 7에 나타낸 영역의 서열을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 스페이서 영역은 뉴클레오티드 1239의 약 70 뉴클레오티드 상류에서 시작해서 뉴클레오티드 1238로 끝나는, 서열 번호 7에 나타낸 영역의 서열을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 스페이서 영역은 뉴클레오티드 1239의 약 65 뉴클레오티드 상류에서 시작해서 뉴클레오티드 1238로 끝나는, 서열 번호 7에 나타낸 영역의 서열을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 스페이서 영역은 뉴클레오티드 1239의 약 60 뉴클레오티드 상류에서 시작해서 뉴클레오티드 1238로 끝나는, 서열 번호 7에 나타낸 영역의 서열을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 스페이서 영역은 뉴클레오티드 1239의 약 55 뉴클레오티드 상류에서 시작해서 뉴클레오티드 1238로 끝나는, 서열 번호 7에 나타낸 영역의 서열을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 스페이서 영역은 뉴클레오티드 1239의 약 50 뉴클레오티드 상류에서 시작해서 뉴클레오티드 1238로 끝나는, 서열 번호 7에 나타낸 영역의 서열을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 스페이서 영역은 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1139-1238의 서열을 갖고, 본 바람직한 실시태양의 안트라닐레이트 프로모터는 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1139-1238을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 상기 스페이서 분절의 바로 상류에 결합되고 상기 스페이서 영역의 바로 하류에 결합된, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1274를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 안트라닐레이트 프로모터는 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1139-1274를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 안트라닐레이트 프로모터가 사용되는 발현 시스템에서 숙주 세포는 안트라닐레이트 프로모터 활성자 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산도 포함하고 발현할 것이다. 상기 Pant 활성자 단백질-코딩 핵산의 다수 발현된 카피를 사용하는 것이 더욱 더 바람직하다. 바람직한 실시태양에서, Pant 활성자 단백질은 서열 번호 9의 아미노산 서열 또는 그의 잔기 268 (Ala) 변이체를 가질 것이다. 바람직한 실시태양에서, Pant 활성자 단백질을 코딩하는 핵산은 서열 번호 8의 염기 1-990 또는 그의 염기 802 변이 서열; 또는 이들 중 임의의 것의 상보체; 또는 이들 중 임의의 것의 RNA 동등체를 포함할 것이다.
돌연변이 및 밀접하게 관련된 활성자 단백질, 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
돌연변이 프로모터를 얻는데 사용하기 위한 하기 기술된 것과 동일한 방법은, 돌연변이 활성자 단백질 및 그의 코딩 서열과 유전자를 얻는데 유사하게 사용될 수 있다. 이 경우, 주어진 활성자 단백질을 코딩하는 유전자의 적어도 일부, 예를 들어 그의 코딩 서열의 전체 또는 부분은 혼성화 프로빙 (probing)에 사용하기 위한 프로브로서, 또는 혼성화 프로빙에 사용하기 위한 프로브 형성에 사용될 수 있거나; 테스트를 위해 구조적으로 관련된 서열에 대한 데이터베이스를 검색하기 위해 정보 스트링 형태로 사용될 염기 서열, 그와 동일하거나 90% 이상 동일한 염기 서열을 제공할 수 있다. 이와 마찬가지로, 활성자 단백질 아미노산 서열의 전체 또는 부분은 이러한 검색을 수행하기 위한 정보 스트링으로서 사용될 수 있다. 그 다음, 혼성화 또는 생물정보 검색에 의해 동정된 결과 서열은 프로모터 활성화 활성 및(또는) 개선된 특성에 대해 검사된다.
따라서, 서열 번호 2의 잔기 1-335, Asn152를 포함하는 서열 번호 2의 잔기 1-335, 서열 번호 2의 잔기 21-335, 및 Asn152를 포함하는 서열 번호 7의 잔기 21-335 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 갖는 Pben 활성자 단백질; 및 서열 번호 9의 잔기 1-330 및 Ala268을 포함하는 서열 번호 9의 잔기 1-330 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 갖는 Pant 활성자 단백질의 아미노산 서열과 90% 이상 동일하고 그에 대해 이종성인 아미노산 서열을 갖는 전사 활성자 단백질도 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한, 상기 돌연변이 및 밀접하게 관련된 전사 활성자 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
직열 프로모터
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 직열 프로모터는 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터의 상류에 결합된 (천연적으로) 비-이화대사산물-억제된 프로모터를 포함하고, 여기서 이화대사산물-억제된 프로모터의 이화대사산물 억제는 극복되고(되거나) 상이한 개선된 프로모터 성질이 나타난다.
바람직한 실시태양에서, 비-이화대사산물-억제된 프로모터 및 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터 모두 원핵생물로부터 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 비-이화대사산물-억제된 프로모터 및 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터 모두 박테리아로부터 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 비-이화대사산물-억제된 프로모터 및 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터 모두 프로테오박테리아; 바람직하게는 그람 음성 프로테오박테리아로부터 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 비-이화대사산물-억제된 프로모터 및 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터는 모두, 하기 정의되는 바와 같은 "슈도모나드 및 밀접하게 관련된 박테리아" 또는 그의 아군으로부터 선택된다.
바람직한 실시태양에서, 두 프로모터 모두 동일한 종으로부터 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 두 프로모터 모두 하기 정의되는 바와 같은 "슈도모나드 및 밀접하게 관련된 박테리아" 또는 그의 아군으로부터 선택된 속 중의 동일한 종으로부터 얻어진다. 바람직한 실시태양에서, 두 프로모터 모두 슈도모나스 속의 유기체로부터 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 두 프로모터 모두 슈도모나스 속 중의 동일한 종으로부터 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 두 프로모터 모두 슈도모나스 플루오레센스로부터 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 두 프로모터 모두 슈도모나스 플루오레센스 바이오타입 A로부터 선택된다.
본 발명에 따른 직열 프로모터에 사용하기 위해 선택된 각각의 프로모터는 활성화성 프로모터, 억제성 프로모터, 또는 그의 조합일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 각각의 프로모터 중 하나 이상, 바람직하게는 두 프로모터 모두가 활성화성 프로모터일 것이다. 억제성 프로모터가 이러한 직열 프로모터 내에 프로모터 요소로서 존재하는 경우, 바람직하게는 직열 프로모터가 사용되는 세포는 프로모터의 조절을 매개하는 억제자 단백질에 대한 발현성 코딩 서열도 적어도 1카피, 바람직하게는 1카피 이상 포함할 것이다. 활성화성 프로모터가 상기 직열 프로모터 내에 프로모터 요소로서 존재하는 경우, 바람직하게는 직열 프로모터가 사용되는 세포는 프로모터의 조절을 매개하는 활성자 단백질에 대한 발현성 코딩 서열도 적어도 1카피, 바람직하게는 1카피 이상 포함할 것이다.
바람직한 실시태양에서, 두 프로모터는 모두 세포가 대체 탄소원(들)을 이용 (예를 들어, 내수송, 외수송, 운반 또는 대사)할 수 있도록 하는 효소(들) 및(또는) 경로(들)을 코딩하는 유전자 또는 오페론의 천연 프로모터로서 얻어진다. 바람직한 실시태양에서, 비-이화대사산물-억제된 프로모터는 안트라닐레이트를 생촉매적으로 분해할 수 있는 효소(들) 및(또는) 경로(들)을 코딩하는 유전자 또는 오페론의 천연 프로모터, 즉 "안트라닐레이트 프로모터"이다. 바람직한 실시태양에서, 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터는 벤조에이트를 생촉매적으로 분해할 수 있는 효소(들) 및(또는) 경로(들)을 코딩하는 유전자 또는 오페론의 천연 프로모터, 즉 "벤조에이트 프로모터"이다. 바람직한 실시태양에서, 안트라닐레이트 프로모터는 상기 기술된 바와 같은 안트라닐레이트 프로모터이다. 바람직한 실시태양에서, 벤조에이트 프로모터는 상기 기술된 바와 같은 벤조에이트 프로모터이다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 직열 프로모터는 슈도모나스 플루오레센스 천연 안트라닐레이트 프로모터를 슈도모나스 플루오레센스 천연 벤조에이트 프로모터에, 그리고 그의 상류에 연결시켜 형성된 구조물이다. 본원 발명자들은 이러한 프로모터 배열이 안트라닐산, 안트라닐산 유사체 (예를 들어, 할로안트라닐산), 및 그의 생물학상 허용되는 염 (예를 들어, 소듐 안트라닐레이트)으로; 벤조산 및 그의 생물학상 허용되는 염으로; 그리고 o-톨루에이트로 유도될 수 있다는 것을 발견했다 (o-톨루에이트는 안트라닐레이트가 그러하듯이, 이 프로모터를 유도하는 것으로 밝혀졌다).
바람직한 실시태양에서, 비-이화대사산물-억제된 프로모터는 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터의 바로 상류에 결합된다. 이 결합은 프로모터 간에 직접 (또는, 프로모터를 포함하는 천연 핵산 분절 간에 직접), 또는 예를 들어, 프로모터 (또는 분절)를 서로 연결시키는 폴리뉴클레오티드 링커에 의해 이루어질 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 비-이화대사산물-억제된 프로모터는 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터의 상류에 프로모터간 링커로 결합된다. 바람직하게는, 프로모터간 링커는 폴리뉴클레오티드 링커가 전사 종결 신호로서 기능하는 서열을 포함하지 않는 한, 폴리뉴클레오티드일 것이다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터간 링커는 약 100 뉴클레오티드 길이의 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터간 링커는 100 뉴클레오티드 길이 미만이다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터간 링커는 90 뉴클레오티드 이하 길이의 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터간 링커는 80 뉴클레오티드 이하 길이의 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터간 링커는 70 뉴클레오티드 이하 길이의 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터간 링커는 60 뉴클레오티드 이하 길이의 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터간 링커는 50 뉴클레오티드 이하 길이의 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터간 링커는 40 뉴클레오티드 이하 길이의 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터간 링커는 30 뉴클레오티드 이하 길이의 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터간 링커는 20 뉴클레오티드 이하 길이의 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터간 링커는 10 뉴클레오티드 이하이다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터간 링커는 약 5 뉴클레오티드 이상, 또는 약 10 뉴클레오티드 이상, 또는 약 20 뉴클레오티드 이상, 또는 약 30 뉴클레오티드 이상, 또는 약 40 뉴클레오티드 이상 길이의 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터간 링커는 약 5 내지 약 50 뉴클레오티드, 또는 약 10 내지 약 50 뉴클레오티드, 또는 약 20 내지 약 50 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 약 50 뉴클레오티드 길이의 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터간 링커는 43 뉴클레오티드의 길이를 갖는 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터간 링커는 서열 번호 14의 서열을 갖는다.
바람직한 실시태양에서, 직열 프로모터는 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1430-1503, 1430-1509, 1477-1503 및 1477-1509로 구성되는 군으로부터 선택된 벤조에이트 프로모터 서열의 상류에 결합된, 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1221-1365, 1221-1371, 1329-1365 및 1329-1371로 구성된 군으로부터 선택된 안트라닐레이트 프로모터 서열을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 직열 안트라닐레이트-벤조에이트 프로모터는 벤조에이트 프로모터 부분에 대해 "-35 내지 -10 영역" 및 벤조에이트 프로모터 활성자 (또는 억제자) 단백질 결합 부위, 바람직하게는 활성자 단백질 결합 부위를 모두 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 직열 프로모터는 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1329-1503을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 직열 프로모터는 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1329-1509를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 직열 프로모터는 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1221-1503을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 직열 프로모터는 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1221-1509를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 직열 프로모터는 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1329-1544를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 직열 프로모터는 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1221-1544를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 안트라닐레이트 활성자 단백질 코딩 서열 또는 벤조에이트 활성자 단백질 코딩 서열은, 본 발명의 Pant-포함 또는 Pben-포함 직열 프로모터를 각각 사용하는 시스템 내에 포함되고 그 안에서 발현된다. 직열 프로모터가 Pant 및 Pben 모두를 포함하는 경우, 바람직하게는 안트라닐레이트 프로모터 활성자 단백질, 예를 들어 Pant 프로모터에 대해 상기 기술된 안트라닐레이트 활성자 단백질 (AntR)의 코딩 서열이 선택된다. 임의의 발현 시스템에서 더욱 더 바람직한 것은, 이러한 발현된 코딩 서열이 다수 카피 존재하는 것이다.
직열 프로모터를 구성하는데 사용하기 위한 천연 프로모터의 근원
본 발명에 따른 직열 프로모터는, 예를 들어 원핵세포, 바람직하게는 박테리아 세포로부터 대체 탄소원, 즉 글루코스 이외의 탄소원을 사용하도록 해 주는 효소(들)을 코딩하는 유전자 또는 오페론의 천연 프로모터를 얻음으로써 구성될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 박테리아 세포는 "슈도모나드 및 밀접하게 관련된 박테리아", 또는 하기 정의되는 바와 같은 그의 19 아군 중 임의의 하나에 속하는 박테리아 세포로부터 선택될 것이다.
박테리아는 광범위한 대체 탄소원을 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 바람직한 실시태양에서, 직열 프로모터를 구성하는데 사용하기 위해 선택된 천연 프로모터는
● 직쇄, 분지쇄, 환형 및 지환식 동종- 및 이종-탄화수소 (포화 또는 불포화) 및 그의 유도체;
● 방향족 및 알킬아릴 화합물 및 그의 유도체, 예를 들어 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 페난트렌, 톨루엔, 크실렌, 비페닐 (biphenyl);
● 헤테로시클릭 화합물 및 그의 유도체, 예를 들어 스테로이드, 스테롤, 알란토인, 시클릭 테르펜, 요힘빈, 인돌, 이미다졸, 옥사진, 퀴놀린, 페나진, 크산텐;
● 알코올 & 폴리올 및 그의 유도체, 예를 들어 에탄올, 페놀, 나프톨, 크레졸, 카테콜, 글리세롤, 벤질 알코올, 메탄올;
● 산, 에스테르, 무수물, 및 그의 유도체, 예를 들어 아세테이트, 살리실레이트, 벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 안트라닐레이트, 프탈레이트, 벤질알카노에이트, 젠티세이트, 아미노산 (예를 들어, 글루타메이트); 모노-, 디- 및 트리-카르복실산; 지방산, 지질, 및 관련 화합물;
● 알데히드, 케톤, 에테르 및 그의 유도체;
● 할로겐화 유기 화합물 및 그의 유도체, 예를 들어 클로로벤조에이트, 클로로페놀, 요오도나프탈렌, 브로모크실렌, 플루오로펜탄, 트리클로로프로판;
● 유기-인 화합물 및 그의 유도체, 예를 들어 유기포스포네이트, 유기포스페이트, 유기포스파이트, 포스파-화합물, 포스포-화합물;
● 유기-황 화합물 및 그의 유도체, 예를 들어 유기술포네이트, 유기술페이트, 유기술파이트, 티아-화합물, 티오-화합물;
● 유기-질소 화합물 및 그의 유도체, 예를 들어 유기니트레이트, 니트로- 유기물 (예를 들어, 니트로벤조에이트, 니트로페놀), 시아노 화합물, 히드라진, 아민, 이민, 아미드, 이미드, 푸린, 피리미딘, 아자-화합물, 아조-화합물;
● 기타 헤테로-유기 화합물, 예를 들어 유기-붕소 화합물, 유기-규소 화합물, 유기금속 화합물, 다중-이종원소-유기 화합물; 및
● 다관능성 유기 화합물들
로부터 선택된 하나 이상의 대체 탄소원에 대해 분해 활성을 갖는 효소(들)을 발현하는 유전자 또는 오페론으로부터 얻어질 것이다.
이러한 분해 활성을 코딩하는 유전자 및 오페론은, 상기 기술된 바와 같이 이화대사산물-억제되거나 비-이화대사산물-억제될 수 있다. 그의 천연 프로모터는 당 분야에 잘 알려진 방법, 예를 들어 상응하는 DNA 유전자의 존재에 대해 박테리아 게놈 (또는 그의 게놈 서열의 기록)을 프로빙하기 위해 상기 효소를 코딩하는 mRNA를 단리하고 그로부터 생성된 mRNA 또는 cDNA의 핵산 서열을 사용함으로써, 당업자에 의해 용이하게 얻어질 수 있다. 그 다음, 코딩 서열의 바로 상류 (즉, 5')의 DNA 분절에 위치한 전사 개시 부위를 포함하는 조절 영역이 동정된다. 그리고, 이러한 조절 영역 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물이 형성되어, 발현 구조물(들)은 글루코스의 존재시 및 부재시 하나 이상의 대체 탄소원 화합물에 의한 박테리아 숙주 세포에서의 유도에 대해 시험된다. 이는 본 발명에 따른 직열 프로모터를 구성하는데 사용될 수 있는 이화대사산물-억제된 프로모터 및 비-이화대사산물-억제된 프로모터를 제공한다.
다양한 이화대사산물 억제된 유전자 및 오페론, 및 비-이화대사산물-억제된 유전자 및 오페론은 (a) 대체 탄소원을 사용 (예를 들어 운반, 동화 또는 이화)하는 효소를 코딩하거나, (b) 그러한 효소-코딩 유전자(들) 및 오페론(들)로부터의 발현을 조절하는 조절 유전자를 코딩하는 것으로 알려져 있다. 이러한 형태의 통상적인 유전자 또는 오페론의 프로모터는, 그로부터의 전사가 관련된 대체 탄소원 또는 그의 유사체 화합물의 존재에 의해 좌우, 즉 유도되거나 억제된다는 점에서 조절 (즉, 프로모터는 유도 또는 억제해제)된다.
이러한 이화대사산물 억제된 유전자 및 오페론은 예를 들어
● 스티렌의 페닐아세테이트로의 전환에 필요한 효소를 코딩하는 슈도모나스 플루오레센스 ST의 styABCD 오페론 [참고문헌 8];
● 톨루엔의 벤조에이트로의 전환 및 크실렌의 톨루에이트로의 전환에 필요한 효소를 코딩하는 P. 푸티다 mt-2의 xylCMABN 오페론 [참고문헌 9];
● 알칸 및 알켄의 대사에 필요한 알칸 히드록실라제를 포함하는 효소를 코딩하는, 부르크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia)의 alkBFGHJKL 오페론 [참고문헌 10];
● 염기성 아미노산, 및 카르바페넴 항생제, 이미페넴, 티에나마이신 유도체의 흡수를 용이하게 하는 특정 포린을 코딩하는 P. 에어루지노사 (P. aeruginosa) 유전자, oprD [참고문헌 11];
● 아르기닌 및 오르니틴의 운반에 필요한 오페론 코딩 효소의 일부인 P. 에어루지노사 유전자, aotJ [참고문헌 12]; 및
● 분지쇄 아미노산의 대사에 필요한 분지쇄 케토산 디히드로게나제 복합체를 코딩하는 오페론의 발현을 조절하는 단백질을 코딩하는 P. 푸티다 및 P. 에어루지노사 유전자, bkdR [참고문헌 13]
을 포함한다.
상기 비-이화대사산물-억제된 유전자 및 오페론은 예를 들어
● 2차 톨루엔 유출 시스템의 효소를 코딩하는 P. 푸티다 DOT-T1E의 ttgDEF 오페론 [참고문헌 14];
● 아르기닌-유도성 NAD(+)-의존성 글루타메이트 디히드로게나제를 코딩하는 P. 에어루지노사 유전자, gdhB [참고문헌 15]; 및
● 프롤린 이용에 필요한 효소를 코딩하는 P. 푸티다 mt-2의 putA 및 putP 유전자 [참고문헌 16]
를 포함한다.
프로모터 및 폴리펩티드의 돌연변이 및 밀접하게 관련된 서열
본원의 바람직한 실시태양의 프로모터(들)로부터 제조된 돌연변이 프로모터는 또한, 당 분야에 공지된 다양한 무작위 및(또는) 지정 (directed) 돌연변이 생성 기술 중 임의의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 위치-특이적 돌연변이 생성이 수행될 것이다 (예를 들어, 돌연변이성 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이 생성에 의해). 바람직한 실시태양에서, 개선된 돌연변이 프로모터는 프로모터 폴리뉴클레오티드 상에서 수행된 오류-빈발 중합효소 연쇄반응 (EP-PCR)에 의해 제조된 돌연변이체 라이브러리로부터 선택될 것이다. 다수 라운드의 돌연변이 생성은 이전 라운드로부터 생성된 폴리뉴클레오티드의 풀 (pool), 또는 그로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이 프로모터 상에서 수행될 수 있다. 개선된 프로모터에서 동정된 바람직한 돌연변이는, 개선점의 추가적인 증가 (예를 들어, 누적적인 개선)를 얻기 위해 조합될 수도 있다.
비-돌연변이 직열 프로모터 (즉, 각각의 프로모터 요소가 천연 서열 자체인 직열 프로모터)에 대해 상기 기술된 하나 이상의 기술을 수행함으로써 돌연변이 직열 프로모터를 생성하는 것 이외에, 각각의 돌연변이 프로모터는 본 발명에 따른 직열 프로모터(들)의 형성에 사용될 수 있다. 예를 들어, 2개의 돌연변이 프로모터가 함께 연결되거나, 돌연변이 프로모터 및 비-돌연변이 프로모터가 함께 연결되어 본 발명에 따른 직열 프로모터를 형성할 수 있다. 또한, 주어진 라운드에서 다수 프로모터-프로모터 조합을 생성하기 위해, 지정 돌연변이 생성 및(또는) 재조합이 수행될 수 있다 (예를 들어, WO 91/16427에 기술된 것과 같은 기술을 사용하여).
밀접하게 관련된 프로모터는 당 분야에 공지된 다양한 프로토콜 중 임의의 프로토콜에 따라, 엄격한 혼성화 조건하에서 혼성화 프로브로서 직열 및(또는) 천연 프로모터 구조물 및(또는) 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 얻어질 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 프로토콜은 이하 기술한다. 벌볍으로, 펩티드 핵산 (PNA), 또는 상기 프로모터의 염기 서열을 갖는 기타 핵산 유사체가 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 프로브는 약 6 이상, 약 8 이상, 약 10 이상, 약 15 이상, 약 20 이상, 약 25 이상, 약 30 이상, 약 35 이상, 약 40 이상, 약 45 이상, 또는 약 50 이상의 염기 길이의 염기 서열을 포함할 것이다. 바람직한 실시태양에서, 프로브는 약 100 이하, 약 80 이하, 약 60 이하, 또는 약 50 이하의 염기 길이의 염기 서열을 포함할 것이다. 바람직한 실시태양에서, 프로브는 약 20 내지 약 50, 약 25 내지 약 45, 또는 약 30 내지 약 40 염기 길이의 염기 서열을 포함할 것이다.
표적 핵산, 예를 들어 적어도 프로모터를 포함하고 있는 것으로 추측되는 표적 DNA의 혼성화 프로빙을 수행하기 위해, 프로빙되는 표적 DNA는 변성되고 표준 프로토콜에 따라 니트로셀룰로스 또는 나일론 막 상에 블롯팅되며 가교된다 (Sambrook et al. [Cold Spring Harbor Press], Current Protocols in Molecular Biology [John Wiley and Sons, Inc.] 참조). 그 다음, 블롯은 샘브룩 등 (Sambrook et al.) 또는 Current Protocols에 기술된 바와 같이 표준 완충액을 사용하거나, EXPRESSHYB (BD 바이오사이언시즈 클론테크 (BD Biosciences Clontech), 캘리포니아 팔로 알토)와 같은 시판되는 혼성화 완충액을 사용하여 예비-혼성화된다. 예비-혼성화는 50-65℃ 범위의 온도에서 수행될 수 있다.
사용되는 프로브 (예를 들어, 안트라닐레이트 또는 벤조에이트 프로모터 단편을 나타내거나 포함하는 DNA)는 특이적으로 결합된 표적 DNA를 동정하기 위해 표지화될 수 있고(있거나), 프로브 핵산은 특이적으로 결합된 표적 DNA를 효소적으로 카피하기 위한 프라이머로서 사용될 수 있다. 프로브는 당 분야에 공지된 기술 중 임의의 기술에 따라 표지화될 수 있다. 예를 들어, 프로브는 펩티드 태그, 면역원성 잔기, 아비딘, 비오틴, 형광 또는 색소 잔기, 검출가능한 킬레이트, 또는 방사성 핵종 잔기를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 임의의 검출가능한 표지로 표지화될 수 있다. 바람직한 실시태양에서 핵산, 바람직하게는 DNA가 프로브로서 사용된다. 바람직한 실시태양에서, 프로브의 DNA는 표지화된다. 바람직한 실시태양에서, 표지는 방사성 잔기, 예를 들어 방사성 핵종-함유 화합물, 예를 들어 γ-32P dATP이다. 상기 표지화를 수행하기 위한 키트는 시판되는데, 예를 들어 γ-32P dATP와 같은 방사성 핵종-함유 뉴클레오시드-5'-트리포스페이트와 함께 HIGH PRIME DNA 표지화 키트 (로슈 몰레큘라 바이오케미칼스 (Roche Molecular Biochemicals), 인디애나주 인디애나폴리스)가 사용될 수 있다. 그 다음, 프로브 또는 표지화된 프로브를 끓이고 예비-혼성화 완충액에 첨가한다. 블롯은 50-65℃에서 밤새 프로브와 인큐베이션한 다음, 실온에서 세척 당 5분 동안 2x SSC/0.5% SDS로 2회 세척한다. 그리고, 블롯을 50-65℃에서 세척 당 15분 동안 0.1x SSC/0.1% SDS로 2회 세척한다. 그 다음, 특이적으로 결합된 표지화된 프로브를 시각화하기 위해 블롯을 적절하게 현상한다. 예를 들어, 만일 방사성 핵종 잔기가 프로브 상에서 표지로서 사용된다면, 시각화를 위해 필름 또는 인 스크린을 노출시키는 방법이 사용된다.
별법으로, 올리고 또는 일련의 올리고들은 공지된 프로모터 요소 (즉, 개재 서열을 갖는 -35 및 -10 서열), 또는 공지된 활성자 단백질 결합 부위에 혼성화되도록 설계될 수 있고; 하나 이상은 관심 대상인 표적 서열에 혼성화할 수 있는 일련의 축퇴성 (degenerate) 올리고가 설계될 수 있다. 이는 상기 기술한 바와 같은 서던 블롯 분석에 대한 프로브로서 사용될 수 있거나, 관심 대상인 프로모터에 상동성일 수 있는 단일 (하나의 올리고) 또는 이중 (두 개의 올리고) 가닥 DNA의 합성을 개시하는데 사용될 수 있다. DNA 합성은 예를 들어, Taq 폴리머라제 (신장은 72℃에서, 또는 제조자의 프로토콜에 지시된 대로 수행됨) 또는 기타 폴리머라제로, 그리고 제조업자에 의해 공급되는 완충액, 1-5 mM 농도의 프라이머, 및 최종 농도 0.2-1 mM의 dNTP 믹스로 수행될 수 있다. 어닐링 온도는 최적의 증폭을 달성하기 위해 변화될 수 있다. 폴리머라제에 대한 신장 시간은 목적 생성물의 길이에 따라 20-60초일 수 있다. 필요에 따라, 제2 가닥을 합성 및 증폭시키기 위해 링커가 단일가닥 단편에 첨가될 수 있다. 그 다음, 이중가닥 단편은 신장/증폭을 위해 설계된 프라이머를 사용하여 시퀀싱될 수 있다. 만일 올리고 상에 제한 부위도 설계된다면, 이 단편은 예를 들어, 서열 분석을 위해 후속적으로 표준 벡터, 예를 들어 pUC 18로 직접적으로 클로닝될 수 있다.
그 다음, 프로브가 특이적으로 결합된 표적 핵산은 시각화된 프로브-표적 하이브리드를 선택함으로써 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 선택된 표적 핵산은 프로브 또는 그의 상보적인 염기 서열과 염기 서열상 90% 이상의 상동성, 즉 90% 이상 동일할 것이다 (여기서, 이러한 목적을 위해 T와 U는 동등한 염기로 간주된다). 바람직한 실시태양에서, 선택된 표적 핵산은 그와 약 95% 이상의 상동성을 가질 것이다. 바람직한 실시태양에서, 선택된 표적 핵산은 그와 약 98% 이상의 상동성을 가질 것이다. 상기 표적 핵산이 보다 큰 폴리뉴클레오티드 분자 내에 일부분으로서 위치하는 경우, 표적 핵산, 또는 상기 표적 핵산을 포함하는 단편은 예를 들어, 엔도뉴클레아제 분해 및 엑소뉴클레아제 분해를 비롯한 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 큰 폴리뉴클레오티드 분자로부터 회수될 수 있다.
별법으로, 프로브의 염기 서열은 뉴클레오티드 서열 기록, 예를 들어 폴리뉴클레오티드원에 포함된 폴리뉴클레오티드 내에 존재하는 뉴클레오티드 서열의 문서 또는 전자적 데이터베이스 기록의 검색을 수행하기 위한 정보 스트링의 형태로 사용될 수 있다. 검색 매개변수는 성공적인 매치 (match)가 프로브 정보 스트링과 100% 동일 (100% 상동)이거나 100% 미만으로 동일 (이종성)이어야만 하는 것으로 지정할 수 있다. 바람직하게는, 검색 매개변수는 성공적인 매치가 프로브 정보 스트링과 90% 이상 상동, 95% 이상 상동, 또는 98% 이상 상동이어야만 하도록 선택될 것이다. 바람직하게는, 검색 매개변수는 성공적인 매치가 프로브 정보 스트링에 이종성이어야만 하도록 선택될 것이다. 일단 성공적인 매치가 동정되면, 그에 상응하는 폴리뉴클레오티드원이 선택된다.
별법으로, 프로브 정보 스트링은 주어진 프로모터의 핵염기 서열을 나타내는 제1 정보 스트링을, 90% 이상 상동성인 이종성 핵염기 서열을 나타내는 변형된 정보 스트링으로부터 상기 주어진 프로모터의 핵염기 서열로 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 그 다음, 이러한 변형된 정보 스트링은 그의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 합성하는데 사용될 수 있거나, 상기 기술된 바와 같은 동일한 정보 스트링에 대한 뉴클레오티드 서열 기록의 검색을 수행하는데 사용될 수 있다. 성공적인 매치시, 그에 상응하는 폴리뉴클레오티드원이 선택된다.
일단 프로브 서열에 90% 이상 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 얻어지면, 그 다음 이를 갖는 발현 구조물을 형성하고, 이 발현 구조물을 전사 시스템 (또는 전사 및 번역 시스템), 예를 들어 원핵생물 숙주 세포에 삽입하여, 그 결과 형성된 시스템, 예를 들어 형질전환된 세포가 폴리뉴클레오티드를 전사시킬 수 있는 능력을 스크리닝함으로써 폴리뉴클레오티드를 시험한다. 바람직하게는, 스크리닝은 원래 프로모터의 특성에 대해 개선된 하나 이상의 프로모터 성질을 동정하는 것도 포함한다.
상동성인 서열에 대한 정렬 및 검색은 미국 국립 생물공학 정보 센터 (U.S. National Center for Biotechnology Information (NCBI)) 프로그램, MegaBLAST (현재 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 사용 가능)를 사용하여 수행될 수 있다. 90%로 세팅된 동일성 백분율 옵션을 갖는 이러한 프로그램의 사용은, 질의 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열들을 동정할 것이다. 당 분야에 공지된 기타 소프트웨어도 상동성인 서열, 예를 들어 본 발명에 따른 프로모터 염기 서열 또는 활성자-단백질-코딩 염기 서열을 포함하는 정보 스트링과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열에 대한 정렬 및(또는) 검색에 사용될 수 있다. 예를 들어, 질의 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 서열을 동정하는 비교를 위한 서열 정렬은 예를 들어, 본원에 지정된 디폴트 매개변수에 더하여 90%로 세팅된 상동성 정도에 대한 매개변수를 갖는 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지 (제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group, 위스콘신 대학 생물공학 센터, 위스콘신주 53705, 매디슨, 1710 유니버시티 애비뉴)로부터 입수가능)에서 사용가능한 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA 프로그램을 사용하서 수행될 수 있다. 또한 예를 들어, CLUSTAL 프로그램 (인텔리제네틱스 (캘리포니아주, 마운틴 뷰)의 PC/Gene 소프트웨어 패키지)이 사용될 수 있다.
상기 및 기타 서열 정렬 방법들은 당 분야에 잘 공지되어 있고, 수동 정렬, 시각적 검사, 또는 상기 기술된 프로그램에 의해 구현되는 것 중 임의의 것과 같은 서열 정렬 알고리즘의 수동 또는 자동 적용에 의해 수행될 수 있다. 다양하고 유용한 알고리즘은 예를 들어, 문헌 [W. R. Pearson & D. J. Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988. 4.)]에 기술된 유사성 검색법; 문헌 [T. F. Smith & M. S. Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482-89 (1981) 및 J. Molec. Biol. 147:195-97 (1981)]에 기술된 국부 상동성법; 문헌 [S. B. Needleman & C. D. Wunsch, J. Molec. Biol. 48(3):443-53 (1970. 3.)]에 기술된 상동성 정렬법; 및 문헌 [W. R. Pearson, Genomics 11(3):635-50 (1991. 11.); W. R. Pearson, Methods Molec. Biol. 24:307-31 및 25:365-89 (1994); 및 D. G. Higgins & P. M. Sharp, Comp. Appl'ns in Biosci. 5:151-53 (1989) 및 Gene 73(1):237-44 (1988. 12. 15)]에 예를 들어 기술된 다양한 방법들을 포함한다.
바람직한 실시태양에서 이종성인, 즉 염기 서열이 주어진 프로모터, 프로모터 영역, 또는 기타 비-코돈- 또는 비-항-코돈-함유 폴리뉴클레오티드 분절의 염기 서열에 대해 이종성인 핵염기 중합체 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유사체)는 그와 90% 이상의 상동성; 바람직하게는 그와 약 또는 적어도 93%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 95%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 96%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 97%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 98%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 99%의 상동성을 가질 것이다.
바람직한 실시태양에서 이종성인, 즉 아미노산 서열이 주어진 폴리펩티드 (또는 그의 분절)의 아미노산 서열에 대해 이종성인 폴리펩티드 (또는 그의 분절)는 그와 90% 이상의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 93%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 95%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 96%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 97%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 98%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 99%의 상동성을 가질 것이다.
바람직한 실시태양에서 이종성인, 즉 염기 서열이 주어진 코돈- 또는 항-코돈-함유 폴리뉴클레오티드 (또는 그의 분절)의 염기 서열에 대해 이종성인 핵염기 중합체 (또는 그의 분절)는 그와 90% 이상의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 93%의 상동성; 심지어 더욱 바람직하게는 약 또는 적어도 95%의 상동성; 더욱 더 바람직하게는 약 또는 적어도 96%의 상동성을 가질 것이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 핵염기 중합체는 주어진 코돈- 또는 항-코돈-함유 폴리뉴클레오티드와 이러한 정도의 상동성을 가져, 핵염기 중합체에 의해 코딩된 아미노산 서열이 주어진 폴리뉴클레오티드의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 93%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 95%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 96%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 97%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 98%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 99%의 상동성을 가질 것이다.
바람직한 실시태양에서 이종성인, 즉 염기 서열이 주어진 코돈- 또는 항-코돈-함유 폴리뉴클레오티드 (또는 그의 분절)의 염기 서열과 이종성인 핵염기 중합체 (또는 그의 분절)는, 그와 약 또는 적어도 97%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 98%의 상동성; 바람직하게는 약 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는다.
발현 구조물
발현 구조물, 예를 들어 본 발명에 따른 유전자 또는 오페론에서, 전사 생성물-코딩 서열을 포함하는 핵산은 본 발명에 따른 프로모터, 스페이서에 조작가능하게 연결될 것이다. 전사 생성물이 mRNA 또는 그에 대한 전구체 분자인 경우, 스페이서는 리보좀-결합-부위-포함 스페이서 ("RBS 스페이서")일 것이다.
"전사 생성물-코딩 폴리뉴클레오티드"는 전사 생성물-코딩 서열을 포함하는 임의의 폴리뉴클레오티드이고, 여기서 상기 전사 생성물은 예를 들어 mRNA, rRNA, tRNA, cRNA, gRNA, hnRNA, miRNA, mtRNA, nRNA, ncRNA, pRNA, satRNA, scRNA, siRNA, snRNA, snoRNA, srpRNA, stRNA, tmRNA, vRNA, 안티센스 RNA ("aRNA"라고도 불림), 앱타머 (aptamer) RNA, 염색체 RNA, 효소-억제자 RNA, 유전적-조절-요소 RNA, 플라스티드 (plastid) RNA, 리보자임 RNA, 자가-절단 RNA, 자가-스플라이싱 RNA, 텔로머라제 RNA (TER 또는 TERC), X-염색체-불활성자 RNA (XIST RNA), 또는 상기 임의의 RNA 분자의 전구체 RNA를 포함하는 (이에 한정되지는 않음) 임의의 관능적 또는 구조적 RNA 분자이다. 바람직한 실시태양에서, 전사 생성물은 mRNA 또는 그에 대한 전구체 RNA 분자일 것이다.
발현 구조물에는 기타 요소들이 포함될 수 있다. 이러한 요소들은 예를 들어, 전사 인핸서 서열; 번역 인핸서 서열; 예를 들어, 세포내-표적화-펩티드 또는 분비 신호 펩티드에 대한 선도 (leader) 펩티드-코딩 서열; 프로-펩티드-, 전구-펩티드-, 및 전구-프로-펩티드-코딩 서열; 기타 프로모터; 번역 개시 및 정지 신호; 폴리아데닐화 신호; 전사 종결자; 인트론; 및 태그 서열, 예를 들어 뉴클레오티드 서열 "태그" 및 "태그" 펩티드 코딩 서열 ("태그"는 뉴클레오티드 서열 태그가 사용되는 발현된 폴리뉴클레오티드, 또는 "태그" 펩티드 코딩 서열이 사용되는 발현된 폴리펩티드의 동정, 분리, 정제 또는 단리를 용이하게 한다)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
최소한, 본 발명에 따른 발현 구조물은 (전사 생성물-코딩 서열에 조작가능하게 연결된 프로모터 및 스페이서 또는 RBS-스페이서 이외에) 전사 종결자를 포함할 것이다. 전사 생성물이 mRNA 또는 전구-mRNA인 경우, 발현 구조물은 최소한 전사 생성물-코딩 서열에 조작가능하게 연결된 번역 시작 및 정지 신호를 추가로 포함할 것이다. "조작가능하게 연결된"이라는 용어는 본원에 사용된 바와 같이, 전사 및 임의의 번역 조절 요소가 코딩 서열에 대해 숙주 세포 내에서, 그리고 숙주 세포의 작용에 의해 조절 요소가 코딩 서열을 발현시킬 수 있는 배치(들)로 코딩 서열에 공유적으로 결합되는 임의의 배위를 나타낸다. 발현 구조물의 모든 조절 요소는 전사 생성물-코딩 서열에 "조작가능하게 연결"되어야 한다. 세포가 전사 전에 발현 구조물을 처리하거나 발현 구조물로부터 전사된 전구체 RNA를 처리하는 경우, 조절 요소(들)은 세포의 처리 시스템이 발현 구조물 또는 전구-RNA가 그 안의 조절 요소(들)을 조작 가능하게 연결하도록 조작할 수 있도록 위치되어야 한다. 이와 마찬가지로, 발현 구조물이 별개의 폴리뉴클레오티드(들)의 분절로 세포 내에 존재하는 경우, 상기 분절, 즉 조절 요소(들) 및 전사 생성물-코딩 서열(들)을 총괄적으로 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 영역은, 세포가 분절을 조작하여 조절 요소가 전사 생성물-코딩 서열에 조작 가능하게 연결된 발현 구조물을 생성 또는 재연결할 수 있도록 위치되어야만 하고(하거나), 세포의 처리 시스템이 전사될 전구-RNA를 조작하여 조절 요소(들)을 거기에 조작가능하게 연결시킬 수 있도록 위치된다.
임의의 원핵세포 리보좀 결합 부위 (RBS)는 이러한 발현 구조물에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 박테리아 RBS가 사용된다. 바람직한 실시태양에서, 그람 양성 박테리아에서 작동성인 RBS가 사용되고; 더욱 더 바람직하게는 그람 음성 박테리아에서 작동성인 RBS가 사용된다. 다수의 특이적이고 다양한 공통 (consensus) RBS가 공지되어 있는데, 예를 들면 문헌 [D. Frishman et al., Starts of bacterial genes: estimating the reliability of computer predictions, Gene 234(2):257-65 (1999. 7. 8); 및 B. E. Suzek et al., A probabilistic method for identifying start codons in baeterial genomes, Bioinformatics 17(12):1123-30 (2001. 12)]에 기술되고 인용된 것들이다. 또한, 천연 또는 합성 RBS, 예를 들면 EP 0207459 (합성 RBSs); 문헌들 [O. Ikehata et al., Primary structure of nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence of a Rhodococcus species and its expression in Escherichia coli, Eur. J. Biochem. 181(3):563-70 (1989) (AAGGAAG의 천연 RBS 서열); 또는 J. A. Wells et al., Cloning, sequencing, and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis, Nucl. Acids Res. 11(22):7911-25 (1983) (GAGAGG의 천연 RBS 서열)]에 기술된 것들을 사용할 수 있다.
또한, 발현을 확인하기 위해 하나 이상의 마커 유전자 또는 리포터 유전자가 발현 시스템 내에서 사용될 수 있다. 이러한 다수의 유용한 마커 또는 리포터 유전자는 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국특허 제4,753,876호 (Hemming et al.), 및 문헌 [DL Day et al., J. Bact. 157(3):937-39 (1984. 3)] 참조. 바람직한 실시태양에서, 마커 유전자는 항생제 내성-부여 마커 유전자로부터 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 마커 유전자는 테트라사이클린 및 카나마이신 내성 유전자로부터 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 리포터 유전자는 (1) 형광 단백질 (예를 들어, GFP); (2) 유색 단백질; 및 (3) 형광- 또는 색깔-촉진 또는 -유도 단백질을 코딩하는 것들로부터 선택되고, 후자의 군인 (3)은 예를 들어 루미나제, 알칼리성 포스파타제 및 베타-갈락토시다제를 포함한다. 알칼리성 포스파타제는 BCIP를 가수분해하여 청색을 생성하고, PNPP를 가수분해하여 황색을 생성한다. 베타-갈락토시다제는 X-gal을 가수분해하여 청색 유도체를 생성하고, ONPG를 가수분해하여 황색을 생성한다. 형광 기질도 알칼리성 포스파타제 및 β-갈락토시다제에 대해 사용될 수 있다.
방법, 벡터, 및 번역 및 전사 요소, 및 본 발명에 유용한 기타 요소들에 대한 추가의 예는, 미국특허 제5,055,294호 (Gilroy) 및 미국특허 제5,128,130호 (Gilroy et al.); 미국특허 제5,281,532호 (Rammler et al.); 미국특허 제4,695,455호 및 제4,861,595호 (Barnes et al.); 미국특허 제4,755,465호 (Gray et al.); 및 미국특허 제5,169,760호 (Wilcox)에 예를 들어 기술되어 있다.
벡터
매우 많은 박테리아 벡터가 박테리아에서의 단백질 발현에 유용한 것으로 당 분야에 공지되어 있고, 이들 중 임의의 것은 본 발명에 따른 유전자를 발현하는데 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드 및 파지 발현 벡터를 포함한다. 유용한 플라스미드 벡터는 예를 들어 발현 플라스미드 pMB9, pBR312, pBR322, pML122, RK2, RK6 및 RSF1010를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 유용한 벡터에 대한 기타의 예는, 문헌 [N. Hayase, Appl. Envir. Microbiol. 60(9):3336-42 (1994. 9); A. A. Lushnikov et al., Basic Life Sci. 30:657-62(1985); S. Graupner & W. Wackernagel, Biomolec. Eng. 17(1):11-16. (2000. 10); H. P. Schweizer, Curr. Opin. Biotech. 12(5):439-45 (2001. 10); M. Bagdasarian & K. N. Timmis, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:47-67 (1982); T. Ishii et al., FEMS Microbiol. Lett. 116(3):307-13 (1994. 3. 1); I. N. Olekhnovich & Y.K. Fomichev, Gene 140(1):63-65 (1994. 3. 11); M. Tsuda & T. Nakazawa, Gene 136(1-2):257-62 (1993. 12. 22); C. Nieto et al., Gene 87(1):145-49 (1990. 3. 1); J. D. Jones & N. Gutterson, Gene 61(3):299-306 (1987); M. Bagdasarian et al., Gene 16(1-3): 237-47 (1981. 12); H. P. Schweizer et al., Genet. Eng. (NY) 23:69-81 (2001); P. Mukhopadhyay et al., J Bact. 172(1):477-80 (1990. 1); D. O. Wood et al., J. Bact. 145(3):1448-51 (1981. 3); 및 R. Holtwick et al., Microbiology 147(Pt 2):337-44 (2001. 2)]에 예를 들어 기술된 것들을 포함한다.
유용한 슈도모나드 발현 벡터의 추가의 예는 하기 표 3에 열거된 것들을 포함한다.
유용한 발현 벡터의 일부 예시
레플리콘 벡터(들)
pPS10 PCN39, pCN51
RSF1010 PKT261-3
PMMB66EH
PEB8
PPLGN1
RK2/RP1 PRK415
PJB653
pRO1600 PUCP
PBSP
발현 플라스미드, RSF1010은 예를 들어, 문헌 [F. Heffron et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 72(9):3623-27 (1975. 9), 및 K. Nagahari & K. Sakaguchi, J. Bact. 133(3):1527-29 (1978. 3)]에 기술되어 있다. 플라스미드 RSF1010 및 그의 유도체는 특히 본 발명에 유용한 벡터이다. 당 분야에 공지된 RSF1010의 유용한 예시적 유도체는, 예를 들어 pKT212, pKT214, pKT231 및 관련 플라스미드, 및 pMYC1050 및 관련 플라스미드 (예를 들어, 미국특허 제5,527,883호 및 제5,840,554호 (Thompson et al.)), 예를 들어 pMYC1803을 포함한다. 기타 유용한 예시적 벡터는 미국특허 제4,680,264호 (Puhler et al.)에 기술된 것들을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 발현 플라스미드는 발현 벡터로서 사용된다. 바람직한 실시태양에서, RSF1010 또는 그의 유도체는 발현 벡터로서 사용된다. 바람직한 실시태양에서, pMYC1050 또는 그의 유도체, 또는 pMYC1803 또는 그의 유도체는 발현 벡터로서 사용된다.
그 다음, 벡터는 박테리아 숙주 세포 내로 형질전환될 수 있다.
형질전환
숙주 세포의 벡터(들)로의 형질전환은 당 분야에 공지된 임의의 형질전환 방법을 사용하여 수행될 수 있고, 박테리아 숙주 세포는 완전한 세포 또는 원형질체 (즉, 세포질체를 포함)로서 형질전환될 수 있다. 예시적인 형질전환 방법은 천공법 (poration), 예를 들어 전기천공, 원형질체 융합, 박테리아 컨쥬게이션 및 이가 양이온 처리, 예를 들어 염화칼슘 처리 또는 CaCl/Mg2+ 처리를 포함한다.
발현 구조물의 상기 요소 이외에, 박테리아 숙주 세포는 프로모터의 활성자 또는 억제자 단백질의 코딩 서열을 포함하는 유전자도 적어도 하나, 바람직하게는 한 카피 이상 포함할 것이다. 이 유전자는 발현 구조물에 결합될 수 있거나, 별도의 핵산의 일부일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 서열 번호 7의 뉴클레오티드 4-993에 나타낸 코딩 서열의 상보체에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 안트라닐레이트 활성자 단백질이 사용될 것이고; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 225-1229 또는 뉴클레오티드 285-1229에 의해 코딩되는 벤조에이트 활성자 단백질이 사용될 것이다. 바람직하게는, 활성자- (또는 억제자-) 코딩 유전자는 박테리아 숙주 세포 내에서 항시발현적으로 발현될 것이다. (예를 들어, 외인성) 코딩 서열의 발현이 요구되는 경우, 숙주 세포는 활성자 (또는 억제해제자) 화합물과 접촉되어 발현을 유도할 것이다. 바람직한 실시태양에서, 박테리아 숙주 세포는 안트라닐레이트 및 벤조에이트 프로모터의 경우 각각, 안트라닐산 또는 벤조산, 또는 그의 생물학상 허용되는 염 (바람직하게는, 나트륨염)과 접촉될 것이다. 직열 프로모터에 대한 바람직한 실시태양에서, 박테리아 숙주 세포는 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터 요소 또는 그의 (천연적으로) 비-이화대사산물-억제된 프로모터 요소를 유도하는 유도자 화합물과 접촉될 것이다. 직열 프로모터의 바람직한 실시태양에서, 벤조산, 안트라닐산, 또는 그의 생물학상 허용되는 염(들) (바람직하게는, 나트륨염)이 유도자 (활성자) 화합물로서 사용될 것이다.
숙주 세포
바람직한 실시태양에서, 프로모터가 사용되는 숙주 세포는 원핵생물로부터 선택될 것이다. 바람직한 실시태양에서, 숙주 세포는 박테리아로부터 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 숙주 세포는 프로테오박테리아로부터 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 숙주 세포는 하기 정의되는 바와 같은 "슈도모나드 및 밀접하게 관련된 박테리아" 또는 그의 아군으로부터 선택된다. 바람직한 실시태양에서, 숙주 세포는 슈도모나스 속으로부터 선택된다. 슈도모나드의 특히 바람직한 종은 P. 플루오레센스이고; 더욱 더 바람직한 것은 슈도모나스 플루오레센스 바이오타입 A이다.
바람직한 실시태양에서, 천연 프로모터(들)이 얻어지는 유기체 및 본 발명에 따른 프로모터가 사용되는 숙주 세포는 모두 원핵생물로부터 선택될 것이다. 바람직한 실시태양에서, 천연 프로모터(들)이 얻어지는 유기체 및 본 발명에 따른 프로모터가 사용되는 숙주 세포는 모두 박테리아로부터 선택될 것이다. 바람직한 실시태양에서, 천연 프로모터(들)이 얻어지는 박테리아 및 본 발명에 따른 프로모터가 사용되는 박테리아 숙주 세포는 모두 프로테오박테리아로부터 선택될 것이다. 바람직한 실시태양에서, 천연 프로모터(들)이 얻어지는 박테리아 및 본 발명에 따른 프로모터가 사용되는 박테리아 숙주 세포는 모두, 하기 정의되는 바와 같은 슈도모나드 및 밀접하게 관련된 박테리아 또는 그의 아군으로부터 선택될 것이다.
바람직한 실시태양에서, 프로모터원 유기체 및 숙주 세포는 모두 동일한 종으로부터 선택될 것이다. 바람직하게는, 종은 원핵생물; 보다 바람직하게는 박테리아, 또한 보다 바람직하게는 프로테오박테리아일 것이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 프로모터원 유기체 및 숙주 세포는 모두 하기 정의되는 바와 같은 슈도모나드 및 밀접하게 관련된 박테리아 또는 그이 아군; 보다 바람직하게는 슈도모나스 속으로부터 선택된 속 내의 동일한 종들로부터 선택될 것이다. 특히 바람직한 것은 슈도모나스 플루오레센스 종; 보다 더 바람직하게는 슈도모나스 플루오레센스 바이오타입 A이다.
바람직한 실시태양에서, 프로모터가 사용된 숙주 세포는 유도자 화합물: 예를 들어, 벤조에이트 또는 안트라닐레이트 또는 그의 유사체를 분해하는데 효과적인 생촉매(들); 및(또는) 만일 있다면, 유도의 직접적 원인이 되는 그의 분해 생성물(들); 및(또는) 무상 유도자 화합물이 없을 것이다. 이러한 숙주 세포는 녹아웃 돌연변이로서 용이하게 얻어진다. 예를 들어, 본원 발명자들은 안트라닐레이트 프로모터의 경우, 숙주 세포 antABC 오페론의 적어도 antA 부분의 불활성화가 안트라닐레이트 유도자의 소비를 억제시킴으로써, 유도자가 영구적으로 유도하도록 한다는 것을 발견했다. antA 오픈 리딩 프레임은 안트라닐레이트 분해 경로에 사용되는 제1 효소의 큰 서브유닛을 코딩한다. 이와 유사하게, 벤조에이트 프로모터의 경우, 발명자들은 숙주 세포 benABCD 오페론 benAB 부분의 예를 들면 결실 또는 돌연변이에 의한 불활성화가, 벤조에이트 유도자의 소비를 억제시킴으로써 유도의 수준을 개선시키고; benA 부분이 벤조에이트 분해 경로에 사용되는 제1 효소의 큰 서브유닛을 코딩하기 때문에, 적어도 benA 부분의 불활성화가 이와 유사하게 작용할 것이라는 것을 발견했다.
유전자 녹아웃은 당 분야에서 유효한 것으로 공지된 임의의 방법에 따라 구성될 수 있다. 유전자의 삽입에 의한 유전자 불활성화는 이미 문헌에 기재되었다. 예를 들어, 문헌[DL Roeder & A Collmer, Marker-exchange mutagenesis of a pectate lyase isozyme gene in Erwinia chrysanthemi, J Bacteriol. 164(1): 51-56 (1985)]을 참고할 수 있다. 요약하면, 붕괴될 유전자 부분은 표적 숙주에서 복제할 수 없는 선택가능한 마커, 예를 들면 항생제 내성 유전자를 함유하는 벡터 내로 증폭되고 클로닝된다. 플라스미드에 함유된 표적 유전자 부분과 상기 유전자의 염색체 카피 사이의 상동성 재조합은 유전자의 염색체 카피를 붕괴시키고 항생제 내성 마커를 혼입시킨다. 별법으로, 트란스포존(transposon) 변이 및 원하는 표현형(예를 들면, 벤조에이트 또는 안트라닐레이트 물질대사 불능)의 선택은 표적 유전자가 삽입으로 불활성화된 박테리아 균주를 단리시키는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[K Nida & PP Cleary, Insertional Inactivation of streptolysin S expression in Streptococcus pyogenes, J Bacteriol. 155 (3): 1156-61 (1983)]을 참고할 수 있다. 특정 유전자의 특이적 돌연변이 또는 결실은 예를 들어, 문헌[JA Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34 (2-3): 315-23 (1985)]에 기재된 카세트 변이를 사용하여 구성될 수 있으며, 이로써 직접 또는 랜덤 돌연변이는 유전자의 선택된 부분에서 만들어진 후 상동성 재조합에 의해 유전자의 염색체 카피로 혼입된다.
슈도모나드류 및 밀접하게 관련된 박테리아
본 명세서에 사용된 "슈도모나드류 및 밀접하게 관련된 박테리아"는 본 명세서에 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 1"로 정의된 군과 동일한 범위 내에 있다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 1"은 더욱 구체적으로 문헌[R.E. Buchanan and N.E. Gibbons (eds.), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 217-289 (8th ed., 1974) (The Williams & Wilkins Co., Baltimore, MD, USA) (이하 "버게이 (1974)")]에 의해 "그람-음성 호기성 간균 및 구균(Gram-Negative Aerobic Rods and Cocci)"으로 명명된 분류 "파트(Part)", 및 아시네토박터(Acinetobacter)속으로서 기재된 과(family) 및(또는) 속에 속하는 프로테오박테리아의 군으로서 정의되고 있다. 하기 표 4는 버게이의 분류 "파트"에 나열된 유기체들의 과 및 속을 나타낸다.
"그람 음성 호기성 간균 및 구균" 파트 (버게이(Bergey) (1974))에 나열된 과 및 속
패밀리 I. 슈도모나다세에 (Pseudomonadaceae) 글루코노박터(Gluconobacter)슈도모나스(Pseudomonas)크산토모나스(Xanthomonas)주글로에아(Zoogloea)
패밀리 II. 아조토박터라세에(Azotobacteraceae) 아조모나스(Azomonas)아조토박터(Azotobacter)베이저린키아(Beijerinckia)데륵시아(Derxia)
패밀리 III. 리조비아세에(Rhizobiaceae) 아그로박테리움(Agrobacterium)리조비움(Rhizobium)
패밀리 IV. 메틸로모나다세에(Methylomonadaceae) 메틸로코쿠스(Methylococcus)메틸로모나스(Methylomonas)
패밀리 V. 할로박테리아세에(Halobacteriaceae) 할로박테리움(halobacterium)할로코쿠스(halococcus)
다른 속 아세토박터(Acetobacter)알칼리제네스(Alcaligenes)보르데텔라(Bordetella)부르셀라(Brucella)프란시셀라(Francisella)써머스(Thermus)
"그람 (-) 프로테오박테리아 아군 1"은 그 하위로 분류된 모든 프로테오박테리아, 뿐만 아니라 분류 "파트"를 형성하는 데 사용되는 기준들에 따라 그 하위로 분류되는 모든 프로테오박테리아를 함유한다. 그 결과, "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 1"에는 예를 들어: 모든 그람 양성 박테리아; 이러한 버게이 (1974) 분류 19 개의 "파트" 밖인 그람 음성 박테리아, 예를 들면 엔테로박테리아세에 (Enterobacteriaceae); 이 버게이 (1974) "파트"의 전체 "패밀리 V. 할로박테리아세에"(이 과는 아카에아(Archaea)의 비-박테리아과로 인식되었음); 및 이 버게이 (1974) "파트"에 나열된 써머스속(이 속은 박테리아의 비-프로테오박테리아 속으로 인식되었음)이 제외된다.
또한, 이 정의에 따라, "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 1"은 이 버게이 (1974) "파트"에서 정의된 속 및 과에 속하는 (이전에는 이의 종으로 불리웠음) 다른 프로테오박테리아 분류 명칭이 주어졌던 프로테오박테리아를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 이들 재명명은 완전히 신규한 프로테오박테리아속을 생성하였다. 예를 들어, 아시도보락스(Acidovorax)속, 브레분디모나스(Brevundimonas)속, 부르크홀데리아(Burkholderia)속, 히드로게노파가(Hydrogenophaga)속, 오세아니모나스(Oceanimonas)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 및 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas)속은 버게이 (1974)에 정의된 슈도모나스속에 속하는 (이전에는 이의 종으로 불리웠음) 유기체를 재편성함으로써 형성되었다. 마찬가지로, 예를 들어, 스핀고모나스(Sphingomonas)속 (및 이로부터 유도된 블라스토모나스(Blastomonas)속)은 버게이 (1974)에 정의된 크산토모나스속에 속하는 (이전에는 이의 종으로 불리웠음) 유기체를 재편성함으로써 형성되었다. 유사하게, 예를 들어, 아시도모나스(Acidomonas)속은 버게이 (1974)에 정의된 아세토박터속에 속하는 (이전에는 이의 종으로 불리웠음) 유기체를 재편성함으로써 형성되었다. 이와 같이 추후에 다시 지정된 종들도 본 명세서에 정의된 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 1"에 포함된다.
다른 경우들에서, 이러한 버게이 (1974) "파트"에서 정의된 속 및 과에 속하는 프로테오박테리아 종들은 다른 존재하는 프로테오박테리아속 하에서 단순히 재분류되었다. 예를 들어, 슈도모나스속의 경우, 슈도모나스 에날리아(Pseudomonas enalia) (ATCC 14393), 슈도모나스 니그리파시엔(Pseudomonas nigrifaciens) (ATCC 19375), 및 슈도모나스 푸트레파시엔(Pseudomonas putrefaciens) (ATCC 8071)은 각각 알테로모나스 할로플란크티스(Alteromonas haloplanktis), 알테로모나스 니그리파시엔, 및 알테로모나스 푸트레파시엔으로 재분류되었다. 유사하게, 예를 들어, 슈도모나스 아시도보란(Pseudomonas acidovorans) (ATCC 15668) 및 슈도모나스 테스토스테로니(Pseudomonas testosteroni) (ATCC 11996)는 각각 코마모나스(Comamonas) 아시도보란 및 코마모나스 테스토스테로니로 재분류되었고, 슈도모나스 니그리파시엔 (ATCC 19375) 및 슈도모나스 피스시시아(Pseudomonas piscicida) (ATCC 15057)는 각각 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas) 니그리파시엔 및 슈도알테로모나스 피스시시아로 재분류되었다. 이와 같이 추후에 다시 지정된 프로테오박테리아 종들도 본 명세서에 정의된 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 1"에 포함된다.
마찬가지로 이 정의에 따라, "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 1"은 발견되었거나 또는 이 버게이 (1974) "파트"의 프로테오박테리아과 및(또는) 속 내에 속하는 것으로 재분류된 프로테오박테리아 종을 추가로 포함한다. 프로테오박테리아과와 관련하여, "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 1"은 또한 슈도모나다세에과, 아조토박터라세에과 (현재 종종 유의어인 슈도모나다세에의 "아조토박터군"으로 불리움), 리조비아세에과, 및 메틸로모나다세에과 (현재 종종 유의어인 "메틸로코카세에(Methylococcaceae)") 중 어느 하나에 속하는 것으로 분류된 프로테오박테리아를 포함한다. 결과적으로, 본 명세서에 달리 기재된 속들 외에도, "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 1" 내 프로테오박테리아속은 하기의 것을 추가로 포함한다: 1) 아조르히조필러스(Azorhizophilus)속의 아조토박터 군 박테리아; 2) 셀비브리오(Cellvibrio)속, 올리겔라(Oligella)속 및 테레디니박터 (Teredinibacter)속의 슈도모나다세에과 박테리아; 3) 첼라토박터(Chelatobacter)속, 엔시퍼(Ensifer)속, 리베리박터(Liberibacter)속 ("칸디다터스(Candidatus) 리베리박터"로도 불림), 및 시노르히조비움(Sinorhizobium)속의 리조비아세에과 박테리아; 및 4) 메틸로박터(Methylobacter)속, 메틸로칼둠(Methylocaldum)속, 메틸로미크로비움(Methylomicrobium)속, 메틸로사르시나(Methylosarcina)속 및 메틸로스파에라(Methylosphaera)속의 메틸로코카세에과 박테리아.
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 앞서 정의한 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 1"로부터 선택된다.
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 2"로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 2"는 하기 속의 프로테오박테리아군으로 정의된다(카탈로그에 나열되고, 공개적으로 입수가능하며, 기탁된 균주의 총 수를 괄호 안에 기재하였으며, 달리 언급이 없는 한, 모두 ATCC에 기탁된 것임): 아시도모나스 (2); 아세토박터 (93); 글루코노박터 (37); 브레분디모나스 (23); 베이저린키아 (13); 데륵시아 (2); 부르셀라 (4); 아그로박테리움(79); 첼라토박터 (2); 엔시퍼 (3); 리조비움 (144); 시노르히조비움 (24); 블라스토모나스 (1); 스핀고모나스 (27); 아칼리진(Alcaligene) (88); 보르데텔라 (43); 부르크홀데리아 (73); 랄스토니아 (33); 아시도보락스 (20); 히드로게노파가 (9); 주글로에아 (9); 메틸로박터 (2); 메틸로칼둔즈 (NCIMB에 1 개); 메틸로코쿠스 (2); 메틸로미크로비움 (2); 메틸로모나스 (9); 메틸로사르시나 (1); 메틸로스파에라; 아조모나스 (9); 아조르히조필러스 (5); 아조토박터 (64); 셀비브리오 (3); 올리겔라 (5); 슈도모나스 (1139); 프란시셀라 (4); 크산토모나스 (229); 스테노트로포모나스 (50); 오세아니모나스 (4); 및 아시네토박터 (160).
"그람 (-) 프로테오박테리아 아군 2"의 예시적인 종들은 하기 박테리아 (예시적인 균주(들)의 ATCC 또는 다른 기탁 번호는 괄호에 나타냄)를 포함하며 이에 한정되지 않는다: 아시도모나스 메탄올리카(methanolica) (ATCC 43581); 아세토박터 아세티(aceti) (ATCC 15973); 글루코노박터 옥시단스(oxydans) (ATCC 19357); 브레분디모나스 디미누타(diminuta) (ATCC 11568); 베이저린키아 인디카(indica) (ATCC 9039 및 ATCC 19361); 데륵시아 굼모사(gummosa) (ATCC 15994); 부르셀라 멜리텐시스(melitensis) (ATCC 23456), 부르셀라 아보르터스(abortus) (ATCC 23448); 아그로박테리움 투메파시엔스(tumefaciens) (ATCC 23308), 아그로박테리움 라디오박터(radiobacter) (ATCC 19358), 아그로박테리움 리조겐스(rhizogenes) (ATCC 11325); 첼라토박터 헤인트지(heintzii) (ATCC 29600); 엔시퍼 아드하에렌스(adhaerens) (ATCC 33212); 리조비움 레구미노사룸(leguminosarum) (ATCC 10004); 시노르히조비움 프레디(fredii) (ATCC 35423); 블라스토모나스 나타토리아(natatoria) (ATCC 35951); 스핀고모나스 파우시모빌리스(paucimobilis) (ATCC 29837); 알칼리제네스 파에칼리스(faecalis) (ATCC 8750); 보르데텔라 페르투시스(pertussis) (ATCC 9797); 부르크홀데리아 세파시아(cepacia) (ATCC 25416); 랄스토니아 피켓티(pickettii) (ATCC 27511); 아시도보락스 파실리스(facilis) (ATCC 11228); 히드로게노파가 플라바(flava) (ATCC 33667); 주글로에아 라미게라(ramigera) (ATCC 19544); 메틸로박터 루테우스(luteus) (ATCC 49878); 메틸로칼둠 그라실(gracile) (NCIMB 11912); 메틸로코쿠스 캡슐라터스 (capsulatus) (ATCC 19069); 메틸로미크로비움 아질(agile) (ATCC 35068); 메틸로모나스 메타니카(methanica) (ATCC 35067); 메틸로사르시나 피브라타(fibrata) (ATCC 700909); 메틸로스파에라 한소니(hansonii) (ACAM 549); 아조모나스 아질리스(agilis) (ATCC 7494); 아조르히조필러스 파스팔리(paspali) (ATCC 23833); 아조토박터 크루코쿰(chroococcum) (ATCC 9043); 셀비브리오 믹스터스(mixtus) (UQM 2601); 올리겔라 우레트랄리스(urethralis) (ATCC 17960); 슈도모나스 에어루기노사(aeruginosa) (ATCC 10145), 슈도모나스 플루오레센스 (ATCC 35858); 프란시셀라 툴라렌시스(tularensis) (ATCC 6223); 스테노트로포모나스 말토필리아(maltophilia) (ATCC 13637); 크산토모나스 캄페스트리스(campestris) (ATCC 33913); 오세아니모나스 두도로피(doudoroffii) (ATCC 27123); 및 아시네토박터 칼코아세티쿠스(calcoaceticus) (ATCC23055).
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 3"으로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 3"은 하기 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다: 브레분디모나스; 아그로박테리움; 리조비움; 시노르히조비움; 블라스토모나스; 스핀고모나스; 아칼리진; 부르크홀데리아; 랄스토니아; 아시도보락스; 히드로게노파가; 메틸로박터; 메틸로칼둠; 메틸로코쿠스; 메틸로미크로비움; 메틸로모나스; 메틸로사르시나; 메틸로스파에라; 아조모나스; 아조르히조필러스; 아조토박터; 셀비브리오; 올리겔라; 슈도모나스; 테레디니박터; 프란시셀라; 스테노트로포모나스; 크산토모나스; 오세아니모나스; 및 아시네토박터.
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 4"로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 4"는 하기 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다: 브레분디모나스; 블라스토모나스; 스핀고모나스; 부르크홀데리아; 랄스토니아; 아시도보락스; 히드로게노파가; 메틸로박터; 메틸로칼둠; 메틸로코쿠스; 메틸로미크로비움; 메틸로모나스; 메틸로사르시나; 메틸로스파에라; 아조모나스; 아조르히조필러스; 아조토박터; 셀비브리오; 올리겔라; 슈도모나스; 테레디니박터; 프란시셀라; 스테노트로포모나스; 크산토모나스; 오세아니모나스; 및 아시네토박터.
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 5"로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 5"는 하기 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다: 메틸로박터; 메틸로칼둠; 메틸로코쿠스; 메틸로미크로비움; 메틸로모나스; 메틸로사르시나; 메틸로스파에라; 아조모나스; 아조르히조필러스; 아조토박터; 셀비브리오; 올리겔라; 슈도모나스; 테레디니박터; 프란시셀라; 스테노트로포모나스; 크산토모나스; 오세아니모나스; 및 아시네토박터.
바람직한 실시태양에서, 숙주 세포는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 6"으로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 6"은 하기 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다: 브레분디모나스; 블라스토모나스; 스핀고모나스; 부르크홀데리아; 랄스토니아; 아시도보락스; 히드로게노파가; 아조모나스; 아조르히조필러스; 아조토박터; 셀비브리오; 올리겔라; 슈도모나스; 테레디니박터; 스테노트로포모나스; 크산토모나스; 오세아니모나스; 및 아시네토박터.
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 7"로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 7"은 하기 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다: 아조모나스; 아조르히조필러스; 아조토박터; 셀비브리오; 올리겔라; 슈도모나스; 테레디니박터; 스테노트로포모나스; 크산토모나스; 오세아니모나스; 및 아시네토박터.
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 8"로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 8"은 하기 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다: 브레분디모나스; 블라스토모나스; 스핀고모나스; 부르크홀데리아; 랄스토니아; 아시도보락스; 히드로게노파가; 슈도모나스; 스테노트로포모나스; 크산토모나스; 오세아니모나스; 및 아시네토박터.
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 9"로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 9"는 하기 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다: 브레분디모나스; 부르크홀데리아; 랄스토니아; 아시도보락스; 히드로게노파가; 슈도모나스; 스테노트로포모나스; 오세아니모나스; 및 아시네토박터.
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 10"으로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 10"은 하기 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다: 부르크홀데리아; 랄스토니아; 슈도모나스; 스테노트로포모나스; 크산토모나스; 및 아시네토박터.
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 11"로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 11"은 하기 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다: 슈도모나스; 스테노트로포모나스; 크산토모나스; 및 아시네토박터.
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 12"로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 12"는 하기 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다: 부르크홀데리아; 랄스토니아; 슈도모나스.
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 13"으로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 13"은 하기 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다: 부르크홀데리아; 랄스토니아; 슈도모나스; 크산토모나스; 및 아시네토박터.
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 14"로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 14"는 하기 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다: 슈도모나스 및 크산토모나스.
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 15"로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 15"는 슈도모나스속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다.
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 16"으로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 16"은 하기 슈도모나스 종 (예시적인 균주(들)의 ATCC 또는 다른 기탁 번호는 괄호에 나타냄)의 프로테오박테리아 군으로 정의된다: 슈도모나스 아비에타니필라(abietaniphila) (ATCC 700689); 슈도모나스 에어루기노사 (ATCC. 10145); 슈도모나스 아칼리진 (ATCC 14909); 슈도모나스 안귈리셉티카(anguilliseptica) (ATCC 33660); 슈도모나스 시트로넬로리스(citronellolis) (ATCC 13674); 슈도모나스 플라베센스(flavescens) (ATCC 51555); 슈도모나스 멘도시나(mendocina) (ATCC 25411); 슈도모나스 니트로레두센스(nitroreducens) (ATCC 33634); 슈도모나스 올레오보란스(oleovorans) (ATCC 8062); 슈도모나스 슈도아칼리진 (ATCC 17440); 슈도모나스 레지노보란스(resinovorans) (ATCC 14235); 슈도모나스 스트라미네아(straminea) (ATCC 33636); 슈도모나스 아가리시(agarici) (ATCC 25941); 슈도모나스 알칼리필라(alcaliphila); 슈도모나스 알기노보라(alginovora); 슈도모나스 안데르소니(andersonii); 슈도모나스 아스플레니(asplenii) (ATCC 23835); 슈도모나스 아젤라이카(azelaica) (ATCC 27162); 슈도모나스 베이제린키(beijerinckii) (ATCC 19372); 슈도모나스 보레알리스(borealis); 슈도모나스 보레폴리스(boreopolis) (ATCC 33662); 슈도모나스 브라시카시룸(brassicacearum); 슈도모나스 부타노보라(butanovora) (ATCC 43655); 슈도모나스 셀루로사(cellulosa) (ATCC 55703); 슈도모나스 오란티아카(aurantiaca) (ATCC 33663); 슈도모나스 클로로라피스(chlororaphis) (ATCC 9446, ATCC 13985, ATCC 17418, ATCC 17461); 슈도모나스 프라지(fragi) (ATCC 4973); 슈도모나스 룬덴시스(lundensis) (ATCC 49968); 슈도모나스 타에트롤렌스(taetrolens) (ATCC 4683); 슈도모나스 시시콜라(cissicola) (ATCC 33616); 슈도모나스 코로나파시엔스(coronafaciens); 슈도모나스 디테르페니필라(diterpeniphila); 슈도모나스 에론가타(elongata) (ATCC 10144); 슈도모나스 플렉텐스(flectens) (ATCC 12775); 슈도모나스 아조토포르만스(azotoformans); 슈도모나스 브레너(brenner); 슈도모나스 세드렐라(cedrella); 슈도모나스 코루가타(corrugata) (ATCC 29736); 슈도모나스 익스트레모리엔탈리스(extremorientalis); 슈도모나스 플루오레센스 (ATCC 35858); 슈도모나스 게사르디(gessardii); 슈도모나스 리바넨시스(libanensis); 슈도모나스 느잔델리(nzandelii) (ATCC 700871); 슈도모나스 마르기날리스(marginalis) (ATCC 10844); 슈도모나스 미굴레(migulae); 슈도모나스 뮤시돌렌스(mucidolens) (ATCC 4685); 슈도모나스 오리엔탈리스(orientalis); 슈도모나스 로데시에(rhodesiae); 슈도모나스 신잔타(synxantha) (ATCC9890); 슈도모나스 톨라아시(tolaasii) (ATCC 33618); 슈도모나스 베로니(veronii) (ATCC 700474); 슈도모나스 프레데릭스베르젠시스(frederiksbergensis); 슈도모나스 제니쿨라타(geniculata) (ATCC 19374); 슈도모나스 진제리(gingeri); 슈도모나스 그라미니스(graminis); 슈도모나스 그리몬티(grimontii); 슈도모나스 할로데니트리피칸스 (halodenitrificans); 슈도모나스 할로필라(halophila); 슈도모나스 히비스시콜라 (hibiscicola) (ATCC 19867); 슈도모나스 후티엔시스(huttiensis) (ATCC 14670); 슈도모나스 히드로게노보라(hydrogenovora); 슈도모나스 제쎄니(jessenii) (ATCC 700870); 슈도모나스 킬로넨시스(kilonensis); 슈도모나스 란세오라타(lanceolata) (ATCC 14669); 슈도모나스 리니(lini); 슈도모나스 마르기나타(marginata) (ATCC25417); 슈도모나스 메피티카(mephitica) (ATCC 33665); 슈도모나스 데니트리피칸스(denitrificans) (ATCC 19244); 슈도모나스 페르투시노제나(pertucinogena) (ATCCl90); 슈도모나스 픽토룸(pictorum) (ATCC 23328); 슈도모나스 사이크로필라(psychrophila); 슈도모나스 풀바(fulva) (ATCC 31418); 슈도모나스 몬테일리(monteilii) (ATCC 700476); 슈도모나스 모셀리(mosselii); 슈도모나스 오리지하비탄스(oryzihabitans) (ATCC 43272); 슈도모나스 플레코글로씨시다 (plecoglossicida) (ATCC 700383); 슈도모나스 푸티다(putida) (ATCC 12633); 슈도모나스 릭탄스(reactans); 슈도모나스 스피노사(spinosa) (ATCC 14606); 슈도모나스 발레아릭(balearic); 슈도모나스 루테오라(luteola) (ATCC 43273); 슈도모나스 스투트제리(stutzeri) (ATCC 17588); 슈도모나스 아미그달리(amygdali) (ATCC 33614); 슈도모나스 아벨라네(avellanae) (ATCC 700331); 슈도모나스 카리카파파야(caricapapayae) (ATCC 33615); 슈도모나스 시초리(cichorii) (ATCC 10857); 슈도모나스 피쿠세렉테(ficuserectae) (ATCC 35104); 슈도모나스 프스코바지네(fuscovaginae); 슈도모나스 멜리에(meliae) (ATCC 33050); 슈도모나스 시리네(syringae) (ATCC 19310); 슈도모나스 비리디플라바 (viridiflava) (ATCC 13223); 슈도모나스 써모카르복시도보란스 (thermocarboxydovorans) (ATCC 35961); 슈도모나스 써모톨레란스 (thermotolerans); 슈도모나스 티베르발렌시스 (thivervalensis); 슈도모나스 반코우베렌시스 (vancouverensis) (ATCC 700688); 슈도모나스 위스콘시넨시스 (wisconsinensis); 및 슈도모나스 지아메넨시스 (xiamenensis).
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 17"로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 17"은 예를 들어, 하기 슈도모나스 종에 속하는 것들을 비롯한 "형광(fluorescent) 슈도모나드류"로 당 분야에 공지된 프로테오박테리아 군으로 정의된다: 슈도모나스 아조토포르만스; 슈도모나스 브렌네리(brenneri); 슈도모나스 세드렐라(cedrella); 슈도모나스 코루가타(corrugata); 슈도모나스 익스트레모리엔탈리스; 슈도모나스 플루오레센스; 슈도모나스 게사르디(gessardii); 슈도모나스 리바넨시스(libanensis); 슈도모나스 니안델리(niandelii); 슈도모나스 마르기날리스(marginalis); 슈도모나스 미굴레; 슈도모나스 뮤시돌렌스; 슈도모나스 오리엔탈리스; 슈도모나스 로데시에(rhodesiae); 슈도모나스 신잔타; 슈도모나스 톨라아시; 및 슈도모나스 베로니.
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 18"로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 18"은 모든 하위종, 변형체, 균주, 및 예를 들어, 하기 (예시적인 균주(들)의 ATCC 또는 다른 기탁 번호는 괄호에 나타냄)에 속하는 것들을 비롯한 슈도모나스 플루오레센스종의 다른 하위의 세부적 단위의 군으로 정의된다: 슈도모나스 플루오레센스 바이오타입(biotype) A(바이오바르(biovar) 1 또는 바이오바르 I (ATCC 13525)로도 지칭됨); 슈도모나스 플루오레센스 바이오타입 B(바이오바르 2 또는 바이오바르 II (ATCC 17816)로도 지칭됨); 슈도모나스 플루오레센스 바이오타입 C(바이오바르 3 또는 바이오바르 III (ATCC 17400)으로도 지칭됨); 슈도모나스 플루오레센스 바이오타입 F(바이오바르 4 또는 바이오바르 IV (ATCC 12983)로도 지칭됨); 슈도모나스 플루오레센스 바이오타입 G(바이오바르 5 또는 바이오바르 V (ATCC17518)로도 지칭됨); 및 슈도모나스 플루오레센스 하위종(subsp.) 셀루로사 (NCIMB 10462).
바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 19"로부터 선택된다. "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 19"는 슈도모나스 플루오레센스 바이오타입 A의 모든 균주의 군으로 정의된다. 이 바이오타입 중 특히 바람직한 균주는 P. 플루오레센스 균주 MB101 (윌콕스(Wilcox)의 미국특허 제5,169,760호 참조), 및 그의 유도체이다.
특히 바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 1"로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 2"로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 3"으로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 5"로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 7"로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 12"로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 15"로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 17"로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 18"로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 박테리아는 "그람 (-) 프로테오박테리아 아군 19"로부터 선택된다.
본 발명에 따른 발현 시스템은 임의의 발효 형태에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 임의의 부피의 배치, 공급-배치, 반연속식, 및 연속식 발효 모드가 본 명세서에서 사용될 수 있다.
본 발명에서, 숙주 세포의 성장, 배양, 및(또는) 발효는 숙주 세포가 생존가능한 온도 범위 내, 바람직하게는 약 4 ℃ 내지 약 55 ℃의 온도 범위 내에서 수행된다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 숙주 세포에 관하여 본 명세서에 사용된 용어 "성장" (및 "성장하다(grow)," "성장하는(growing)"), "배양" (및 "배양하다 (culture)"), 및 "발효" (및 "발효시키다(ferment)", "발효시키는(fermenting)")은 본질적으로, 반드시 약 4 ℃ 내지 약 55 ℃의 온도 범위 내의 "성장," "배양," 및 "발효"를 의미한다. 또한, "성장"은 활발한 세포 분화 및(또는) 증대의 생물학적 상태, 뿐만 아니라 비분화 및(또는) 비증대 세포가 대사로 유지되는 생물학적 상태 모두를 지칭하는 데에 사용되며, 용어 "성장"의 뒷쪽 사용은 용어 "유지"와 유사한 의미이다. 또한, 본 발명의 박테리아 숙주 세포 및 발현 시스템에 관하여 사용될 때 "발현이 가능한 조건하에서"의 성장은, 본 명세서에서 (1) 코딩 서열에 조작가능하게 연결된 제어 서열에 사용된 프로모터가 항시발현성 프로모터인, 재조합 박테리아 숙주 세포 자체의 성장; 및 (2) 코딩 서열에 조작가능하게 연결된 제어 서열에 사용된 프로모터가 피조절 프로모터인, 재조합 박테리아 숙주 세포 자체의 성장, (a) 그의 유도자의 존재 하의 (즉, 유도자와 접촉하는) 재조합 박테리아 숙주 세포의 성장, 및 (b) 그의 유도자 없이 재조합 박테리아 숙주 세포의 성장 후, 이 유도자를 시스템에 첨가함으로써, 세포와 유도자 사이의 접촉을 일으키는 것을 의미하는 것으로 정의된다.
생촉매 제조
프로모터의 제어 하에 코딩 서열(들)이 발현되면, 유전자 생성물(들)의 발현으로부터 생성되는 유전자 생성물(들) 및(또는) 부산물 (예를 들어, 대사 산물)을, 이러한 생성물, 예를 들어 단백질, 핵산, 또는 다른 분자에 유용한 것으로 당 분야에 공지된 임의의 회수 및(또는) 정제 방법을 사용하여 분리시키고, 단리시키고(시키거나) 정제할 수 있다. 별법으로, 숙주 세포 자체는 예를 들어, 전 세포 생물 반응기 또는 다른 분야에서 사용될 수 있다.
재료 & 방법
프로모터 및 프로모터-플라스미드 구조물
하기 프로모터 뉴클레오티드 서열들이 본 명세서에 사용된다.
Pben509: 서열 번호 1의 뉴클레오티드 c994-c1502.
Pben278: 서열 번호 1의 뉴클레오티드 g1228-c1502.
Pben88: g1306이 결실된 서열 번호 1의 뉴클레오티드 gl228-c1316.
Pant713: 서열 번호 7의 뉴클레오티드 c592-c1304.
Pant705: 서열 번호 7의 뉴클레오티드 c592-gl296.
Pant311: 서열 번호 7의 뉴클레오티드 c994-c1304.
Pant289: gl269 및 tl278이 결실된 서열 번호 7의 뉴클레오티드 994-1283.
AntR + Pant (또한, Pant + AntR): 서열 번호 13의 a1-c1395.
Ptandem: 서열 번호 13.
하기 프로모터결여(promoterless) 플라스미드 구조물들이 본 명세서에서 사용된다.
pDOW1017: 프로모터가 없지만, 프로모터결여 lacZ 리포터 유전자 운반.
pDOW1033: 프로모터가 없지만, 프로모터결여 phoA 리포터 유전자 운반.
표 5 및 6에 나열된 플라스미드 프로모터 구조물이 본 명세서에서 하기와 같이 지칭된다.
플라스미드 개별의 프로모터 구조물
프로모터 타입 플라스미드 명칭 프로모터 또는 활성자-프로모터 서열 식별기호 구조물 설명
벤조에이트 pDOW1028 서열 번호 1 N1228-N1502 Pben278::lacZ
pDOW1041 서열 번호 1 N1228-N1502 Pben278::phoA
pDOW1019 서열 번호 1 N994-N1502 Pben 509::lacZ
pDOW1102 g1306이 결실된 서열 번호 1 N1228-N1316 Pben88::lacZ
pDOW1081 g1306이 결실된 서열 번호 1 N1228-N1316 Pben88::phoA
pDOW1083 g1306이 결실되고 천연 -10 'tacggt' 1296-1301이 'tataat'로 치환된 서열 번호 1 N1228-N1316 Pben88(-10con)::phoA
pDOW1126 g1306이 결실된 서열 번호 1 N1-N1316 BenR-Pben88(-10con)::lacZ
pDOW1090 g1306이 결실된 서열 번호 1 N1-N1316 BenR-Pben88(-10con)::phoA
pDOW1100 g1306이 결실되고 천연 -10 'tacggt' 1296-1301이 'taaggt'로 치환된 서열 번호 1 N1228-N1316 Pben88(-10benAc)::lacZ
pDOW1084 g1306이 결실되고 천연 -10 'tacggt' 1296-1301이 'taaggt'로 치환된 서열 번호 1 N1228-N1316 Pben88(-10benAc)::phoA
안트라닐레이트 pDOW1039 서열 번호 7 N1-N1304 AntR-Pant
pDOW1101 서열 번호 7 N994-N1304 Pant311::lacZ
pDOW1035 서열 번호 7 N1-N1304 AntR-Pant::lacZ
pDOW1056 서열 번호 7 N1-N1304 AntR-Pant::phoA
pDOW1029 서열 번호 7 N592-N1304 Pant713::lacZ
pDOW1095 t1278이 결실된 서열 번호 7 N1-N1283 AntR-Pant(-10wt)::phoA
pDOW1082 g1269 및 t1278이 결실되고 천연 -10 영역 'ttaat' 1264-1268이 공통 영역 -10 영역 'tataat'로 치환된 서열 번호 7 N994-N1283 Pant289(-10con)::phoA
pDOW1098 g1269 및 t1278이 결실되고 천연 -10 영역 'ttaat' 1264-1268이 공통 영역 -10 영역 'tataat'로 치환된 서열 번호 7 N1-N1283 AntR-Pant289(-10con)::phoA
모자이크(Mosaic) pDOW1099 g1269 및 t1278이 결실되고 천연 Pant -10 영역 'ttaat' 1264-1268이 천연 Pben -10 영역 'tacggt'로 치환된 서열 번호 7 N1-N1283 AntR-Pant289(-10ben)::phoA
플라스미드 직열 프로모터 구조물
플라스미드 명칭 프로모터 또는 활성자-프로모터 서열 식별기호 구조물 설명
pDOW1057 서열 번호 13 AntR-Ptandem::lacZ
pDOW1111 서열 번호 13 N1085-N1541 Pant311-Pben278::lacZ
pDOW1107 g1508에서 결실된 서열 번호 13 N1-N1518 AntR-Ptandem[Pben88(-10wt)]::lacZ
pDOW1108 g1508에서 결실되고 Pben 천연 -10 'tacggt' 1498-1503이 'tataat'로 치환된 서열 번호 13 N1-N1518 AntR-Ptandem[Pben88(-10con)]::lacZ
pDOW1109 g1508이 결실되고 Pben 천연 -10 'tacggt' 1498-1503이 'taaggt'로 치환된 서열 번호 13 N1-N1518 AntR-Ptandem[Pben88(-10benAc)]::lacZ
표 7에 나열된 올리고뉴클레오티드들은 하기 실시예에 사용된다.
숙주 세포:
대장균 JM109 (프로메가 코퍼레이션(Promega Corp.)으로부터 입수), 대장균 TOP10 (인비트로겐 코퍼레이션(Invitrogen Corp.)으로부터 입수), 및 슈도모나스 플루오레센스 바이오타입 A (균주 MB101 및 MB214). P. 플루오레센스 MB214는 균주 MB101 (야생형 독립영양성 P. 플루오레센스 바이오바르 A)의 유도체이다. MB214는 대장균 lacIZYA 오페론 (lacZ 프로모터 영역 삭제)을 균주 MB101의 염색체 내로 통합시켜 lac 프로모터 및 그의 유도체가 락토스 또는 IPTG에 의해 조절되어 목적하는 형질전환 유전자의 유도성 발현을 일으킬 수 있도록 하는 숙주 세포를 제공함으로써 제조되었다. MB101 균주는 Lac (-)이나 MB214 균주는 Lac (+)이다.
유도자 화합물
하기 실시예에서 사용되는 바와 같이, "안트라닐레이트" 유도자는 소듐 안트라닐레이트를 의미하고, "벤조에이트" 유도자는 소듐 벤조에이트를 의미한다.
형질전환 프로토콜
대장균: 프로메가사(위스콘신주 메디슨 소재)로부터의 균주 JM109 화학적으로 적격 세포를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 대장균의 형질전환을 수행하였다.
P. 플루오레센스: 1 mL의 밤샘 배양물 (풍부(rich) 배지에서 성장; 본 실시예는 밀러(Miller)의 Luria-Bertani 배지 (즉 LB 배지, 밀러) (미시간주 디트로이트 소재의 디프코(Difco)로부터 입수가능함) 사용)을 50 mL LB 배지(밀러)로 계대배양하고, A600 측정값이 0.4-0.6의 범위가 될 때까지 진탕하면서 30 ℃에서 인큐베이션함으로써, P. 플루오레센스의 전기천공(Electroporation)을 수행하였다. 생성되는 세포를 50 mL 냉 ddH20로 2 회 세척하고 1 mL 냉 ddH20 중에서 재현탁시켰다. 0.2cm 갭(gap) 전기천공 큐벳(cuvette) (캘리포니아주 헤르쿨레스 소재의 바이오-라드 라보라토리즈(Bio-Rad Laboratories))에서 적격 세포 (competent cell)의 100 μL 분액 (aliquot)에 대략 1O ng의 목적하는 플라스미드를 첨가하였다. 전기천공을 하기 조건하에서 수행하였다: 200 Ohms, 25 μF, 2.25 kV. 그 다음, 1 mL 냉 LB 배지를 첨가하였다. 세포를 2분 동안 얼음 위에서 둔 후 진탕하지 않고 30 ℃에서 2 시간 내지 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 선택 배지 상에서 플레이팅하였으며, 본 실시예는 LB 아가(agar) 밀러 루리아-베르타니(Luria-Bertani) (미시간주 데트로이트 소재의 디프코로부터 입수가능함)를 사용하고, 선택 배지로서 15 μg/mL 테트라사이클린 (펜실베니아주 피트버그 소재의 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))으로 보충하였다.
세포 성장 프로토콜:
유도를 위한 세포 성장: 목적하는 균주를 1 x M9 최소 염 배지 (펜실베니아주 피트버그 소재의 피셔 사이언티픽으로부터 구입한 제제를 5 배 희석) 중에서 밤새 성장 (30 ℃, 250 rpm에서 진탕하면서)시키고, 0.5% 또는 1% (w/v) 글루코스, 1mM MgSO4, 및 미량 원소(미량 원소에 대하여, 본 실시예는 나트륨, 마그네슘, 망간, 철, 및 코발트의 염을 함유하는 용액을 사용, 모두 0.5mg/mL 미만의 최종 농도)로 보충하였다. 그 다음, 균주를 10 또는 20 mL의 부피로 동일한 배지에서 1:4 계대배양한 다음, 지시된 바와 같이 0-lO mM 농도의 안트라닐레이트 또는 벤조에이트를 사용하여 유도시켰다.
플라스미드 증식을 위한 세포 성장: 목적하는 플라스미드를 함유하는 대장균 세포를 37℃, 250 rpm에서, 진탕하면서 15 μg/mL 테트라사이클린 또는 100 μg/mL 암피실린 (단리될 플라스미드에 따라)으로 보충되는, 50-200 mL의 LB 배지(밀러)에서 밤새 성장시켰다. NucLEOSPiN 키트 (5 mL 이하의 배양물 부피에 사용하기 위한 플라스미드 DNA 정제 "미니프렙(miniprep)" 키트; 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 BD 바이오사이언시스 클론테크(BD Biosciences Clontech)로부터 입수가능함) 또는 NUCLEOBOND 키트 (200ml 이하의 배양물 부피에 사용하기 위한 플라스미드 DNA 정제 "미디프렙(midiprep)" 키트; 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 BD 바이오사이언시스 클론테크로부터 입수가능함)를 사용하여 플라스미드 제조를 수행하였다.
유도 프로토콜:
목적하는 균주를 밤새 30 ℃에서, 0.5% 또는 1% (w/v)글루코스, 1mM MgSO4, 및 5L/L 미량 원소(앞서 기재한 바와 같음), 및 임의로 테트라사이클린 15 μg/mL로 보충되는 1 x M9 배지 중에서 성장시켰다. 그 다음, 이들을 동일한 배지 중에서 1:4 또는 1:5 계대배양한 다음, 원하는 시간 동안 (예를 들어, 2, 4, 6, 8, 12, 또는 24 시간, 또는 밤새) 안트라닐레이트, 벤조에이트, 또는 다른 유도자의 지시된 농도를 사용하여 유도시켰다. 샘플을 지시된 시간에서 취하고 이 샘플들을 리포터 유전자 활성에 대해 분석 시험하였다. 정해진 일정한 유도후(post-induction) 시간들에서 취한 시점(time point)에서 결과를 기록하고, 시점은 시간(hr)에 대한 숫자로 표시되며, 일부 경우에서 이 수의 바로 앞에는 유도 후를 표시하는 기호 "I"가 위치하기도 한다.
EP-PCR 프로토콜
오류 빈발(error-prone) PCR 변이 (문헌 ["Mutagenesis of Cloned DNA," in F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology on CD-ROM (2002)(John Wiley & Sons, New York, NY)] 참조)를 위해 하기 프로토콜을 사용하였다. 하기 시약들을 한 데 합쳤다: 63 μL 물, 10 μL 0.1M Tris (pH 8.3), 5 μL 1M KCl, 0.7 μL 1 M MgCl2, 4 μL dNTP 혼합물(mix) (혼합물 #1 [25mM dCTP, 25mM dTTP, 5mM dATP, 5mM dGTP] 또는 혼합물 #2 [20mM dCTP, 20mM dTTP; 2mM dATP, 2mM dGTP]), 2μL 100 μM M13 포워드(forward) 프라이머 (GTAAAACGACGGCCAGT) (서열 번호 16), 2 μL 100 μM M13 리버스(reverse) 프라이머 (AACAGCTATGACCATG) (서열 번호 17), 1 μL(~5ng) 주형 (메사츄세츠주 비버리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs)로부터 입수가능한 플라스미드인 pNEB193으로 클로닝되는 Pant 또는 Pben 프로모터 폴리뉴클레오티드로 이루어짐), 2 μL 25 mM MnCl2, 및 1 μL Taq 폴리머라제 (인비트로겐 코퍼레이션으로부터 입수한 5 유닛(Units)/μL). PCR 조건은 다음과 같다: 94 ℃ 3 분; 94 ℃, 30 초, 50 ℃에서 30 초, 및 72 ℃에서 90 초로 30 주기; 4 ℃에서 방치. AMICON 장치에 대한 제조자 지시사항에 따라 MICROCON YM-100 또는 MICROCON-PCR 칼럼 (핵산 정제 칼럼, 메사추세츠 베드포드 소재의 밀리포어 코퍼레이션(Millipore Corp.))을 사용하여 PCR 생성물을 정제하였다. 생성물을 1 x NE Buffer BAMH I + BSA (BamH I 제한 엔도뉴클레아제 완충액, 뉴 잉글랜드 바이오랩스로부터 입수가능함) 중에서 BamHI 및 HindIII (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 분해시키고, 300bp 이하의 단편용 QIAEX II (캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아겐으로부터의 겔 추출 키트) 또는 300bp를 초과하는 단편용 PREP-A-GENE (바이오-라드 라보라토리즈로부터의 DNA 정제 키트)를 사용하여 겔 추출에 의해 정제하였다. 그 다음, 단편을 각각 pDOW1017 또는 pDOW1033의 lacZ 또는 phoA 리포터 유전자의 상류에서 클로닝하였다.
녹아웃 프로토콜
AntA 녹아웃의 구성. antA 유전자의 내부 단편을 P. 플루오레센스 게놈 DNA (각각 EcoRI 및 BamHI 부위, 이탤릭체로 표시함)으로부터 프라이머 AntAK05 (GGAATTCTTCGTGACGATGCG) (서열 번호 12) 및 AntAK03 (CGGGATCCGCTCGCGATGCTGC) (서열 번호 13)를 사용하여 증폭시켰다. 5 μL 10 x 완충액 (즉, 상기 완충액은 Taq 폴리머라아제와 함께 인비트로겐사로부터 공급된 것이며, 상기 완충액은 200 mM Tris-HCl (pH 8.4) 및 500 mM KCl을 함유함), 2.5μL 50 mM MgCl2, 1 μL 10 mM dNTPs, 0.5 μL 100 μM AntKO3, 0.5 μL 100 μM AntKO5, 1 μL (5 유닛/μL) Taq 폴리머라제 (캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐 코퍼레이션), 0.5 μL P. 플루오레센스 MB214 게놈 DNA (~50ng), 및 39 μL ddH20를 한데 합침으로써 반응 혼합물을 형성하였다. 사용된 PCR 주기 조건은 다음과 같다: 96 ℃에서 2 분; 96 ℃에서 30 초, 52 ℃에서 30 초, 및 72 ℃에서 30 초의 30 주기. 생성되는 PCR 생성물을 P. 플루오레센스 (pUC 타입 플라스미드 사용하였지만, 예를 들어 pBR 타입 플라스미드도 적합할 것임)를 복제할 수 없는 플라스미드로 클로닝하였다. 생성되는 플라스미드를 전기적격(electrocompetent) P. 플루오레센스 세포로 형질전환시키고, 적합한 항생제를 사용하여 형질전환체를 선택하였다. 플라스미드는 P. 플루오레센스에서 복제할 수 없기 때문에, 플라스미드 골격에 의해 분리된 두개의 절단된 antA ORF가 되는, antA 위치에서 통합된 플라스미드를 갖는 박테리아만이 선택될 수 있다. 30 ℃에서 진탕하면서 24 시간 동안 M9 배지 + 1.0% 글루코스, 5mM 안트라닐레이트 중에서 몇몇 형질전환체를 배양하고, 배양 상청액을 안트라닐레이트 농도에 대해 HPLC에 의해 분석하였다.
BenAB 녹아웃의 구성. 일반적으로, P. 플루오레센스에서 AntA 유전자의 결실에 대한 상기 방법 후에, 다음과 같이 플라스미드 pDOW1139를 구성하여 benAB 유전자의 결실을 용이하게 하였다. benR 유전자의 3' 부분 및 benC 유전자의 5' 부분을 주형으로서 P. 플루오레센스 MB214 게놈 DNA를 사용하여 증폭시켰다. benR 영역을 프라이머 H3_5'benAK0clean 및 BenKOmega를 사용하여 증폭시켰다. benC 영역을 프라이머 H3_3'BenBKOclean 및 InvbenKOmega를 사용하여 증폭시켰다. 상기 모두의 반응에 대해, 주기 조건은 35 회 동안 95 ℃에서 5 분; (94 ℃, 30 초; 55 C, 30 초; 72 ℃, 1 분) 후, 5분 동안 72 ℃였다. 이 반응을 제조자의 프로토콜에 따라 Taq 폴리머라제 (인비트로겐)를 사용하여 수행하였다. 주형으로서 양쪽 단편을 갖는 프라이머 H3_5'benAK0clean 및 H3_3'benBKOclean을 사용하여 benR 및 benC 단편을 융합시켰다. 이 융합 반응은 35 회 동안 94 ℃ 2분; (94 ℃, 30 초; 50 ℃, 30 초; 68 ℃, 1.5분) 후, 5 분간 68 ℃의 조건하에서 KOD HOTSTART DNA 폴리머라제 (노바겐(Novagen))를 사용하였다. 예상되는 1.1 kb 단편을 QIAEX II (퀴아겐(Qiagen))을 사용하여 겔 정제하고 SrfI-분해 플라스미드 DNA로 클로닝하여 플라스미드, pDOW1139를 형성하였다. 그 다음, pDOW1139를 P. 플루오레센스로 형질전환시켰다. 선택을 위해 테트라사이클린를 갖는 LB 배지 상에서 플레이팅함으로써 형질전환체를 선택하였다. 플라스미드는 P. 플루오레센스에서 복제될 수 없으므로, 테트라사이클린에 대해 내성이 있는 콜로니가 염색체로 통합된 플라스미드로부터 비롯되었다. 플라스미드의 통합 부위를 PCR에 의해 분석하였다. 상동성인 영역들 간의 재조합에 의해 통합된 플라스미드를 상실한 균주를 얻기 위해, 첫번째 형질전환체의 단일 콜로니를 액체 LB 배지에 접종하고, 밤새 성장시킨 다음, 선택 배지 상에서 플레이팅하여 플라스미드 상실에 대해 역선택(counterselect)하였다(데이터는 도시하지 않음). 예상되는 표현형을 갖는 단리물을 선택하였다. 생성되는 균주로부터의 DNA를 PCR에 의해 분석하여 5'Ben_Aseq, Seq_3'BenB, M13R21, 1261-8378F 및 1261-103R을 사용하여 benAB 영역의 프라이머가 제거되었음을 확인하였다.
P. 플루오레센스 염색체 BenR 유전자의 불활성화. benA 유전자(도 참조)의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 상류. ORF 부분을 함유하는 DNA 단편을 주형으로서 BenactKOfor 및 BenactKOrev 프라이머, 및 P. 플루오레센스 MB214 게놈 DNA를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 재조합 Taq 폴리머라제(인비트로겐 코퍼레이션)를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하였다. 주기 프로파일 [2 분 동안 94 ℃; 30 주기에 대해 (30 초 동안 94 ℃, 30 초 동안 62 ℃, 30 초 동안 72 ℃) 다음, 7 분 동안 72 ℃]을 사용하였다. 생성되는 생성물을 pCR2.1 벡터 (인비트로겐 코퍼레이션)로 클로닝하고 대장균 Top 10 세포로 형질전환시켰다. 형질전환체를 상기 프라이머/조건을 사용하여 콜로니 PCR에 의해 삽입물에 대해 스크리닝하고, 양성 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 추가로 확인하였다. 그 다음, 생성되는 플라스미드를 사용하여 대응하는 염색체 ORF를 삽입으로 불활성화하였다. DNA 샘플을 NUCLEOBOND 플라스미드 미디프렙 키트 (클론테크 코퍼레이션(Clontech Corp.))를 사용하여 제조하고 4 μg의 플라스미드 DNA를 P. 플루오레센스 균주 MB101로 형질전환시켰다. 생성되는 형질전환체를 콜로니 PCR에 의해 또다시 스크리닝하였다. 이를 행하기 위해, 추정되는 녹아웃 클론들을 20 μl H20에 넣고 100 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 생성되는 용균 세포의 DNA에 대해 하기 PCR 반응조건을 사용하여 PCR을 수행하였다. 20 μl 예비-인큐베이션된 클론, 5 μl 10X 완충액, 3 μl 25 mM MgCl2, 1 μl 10 mM dNTP, 5 μl 5 μM BenactKO-for, 5 μl 5 μM M13F (-40) 및 M13R (-21), 0.5 μl Taq 폴리머라아제(5U/μl; 프로메가 코퍼레이션으로부터 입수), 및 5.5 μl H20. 사용된 PCR 반응 주기 조건은 1 분 동안 94 ℃; 30 회 (94 ℃, 1 분; 50 ℃, 30 초; 72 ℃, 2 분); 그 다음, 10 분 동안 72 ℃에 이어서 4 ℃에서 방치하였다. MB101 게놈 DNA 및 pDOW1125를 대조군으로서 사용하였다. 이 BenR 유전자의 불활성화는 녹아웃 숙주 세포가 트랜스제닉 Pben-리포터 유전자 구조물을 활성화시키지 못하도록 할 뿐만 아니라 벤조에이트를 대사하지 못하게 하였다.
위치-지정 (site-directed) 변이 프로토콜
위치 지정 변이를 위해 사용된 올리고뉴클레오티드를 서열 번호 16-41에 나열한다. Pben -10 프로모터 변이체 의 구성을 다음과 같이 수행하였다. 1 μM 프라이머 benL278 및 1 μM의 banbenconshort, bambenwtshort, 또는 bambenAcshort를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 하기 위해 플라스미드 pDOW1022를 주형으로서 사용하였다. 제조자의 지시사항에 따라 재조합 Taq 폴리머라제 (인비트로겐 코퍼레이션)를 사용하였다. 반응 주기 프로토콜은 2 분 동안 94 ℃; 25 회 동안 (94 ℃에서 30 초, 62 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 30 초); 그 다음 7 분 동안 72 ℃였다. 생성되는 생성물을 pCR2.1 벡터 (인비트로겐 코퍼레이션)로 클로닝하고 대장균 TOP 10에 형질전환시켰다. 돌연변이된 프로모터를 함유하는 삽입물을 BamHI 및 PacI을 사용하여 분해시킨 후 동일한 제한 효소를 사용하여 분해시킨 pDOW1033에 라이게이션시켜 프로모터::phoA 전사 융합을 갖는 플라스미드 pDOW1081 및 1083-1084를 얻었다. 이들 플라스미드를 주형으로서 사용하여 프라이머 1803H3seq 및 bambenconshort, bambenwtshort 또는 bambenAcshort를 사용하고 제조자의 지시사항에 따라 재조합 Taq 폴리머라제 (프로메가 코퍼레이션)를 사용하여 변이체 프로모터를 재증폭하였다. 반응 주기 조건은 1 분간 94 ℃, (94 ℃에서 1 분, 50 ℃에서 30 초, 및 72 ℃에서 1 분) (30 회); 그 다음 7 분 동안 72 ℃였다. 생성되는 생성물을 HindIII 및 BamHI으로 분해시킨 후 동일한 제한 효소로 분해시켰던 pDOW1017로 라이게이션시켰다. 이는 프로모터::lacZ 융합체 pDOW1102, 1106 및 1100을 생성시켰다.
Pant-10 프로모터 변이체 의 구성을 다음과 같이 수행하였다. 1 μM 프라이머 3'Antactiv 및 1 μM 프라이머 bamantwtshort 또는 bamantconshort를 사용하는 PCR에 대해 플라스미드 pDOW1039를 주형으로서 사용하였다. 제조자의 지시사항에 따라 재조합 Taq 폴리머라제 (인비트로겐 코퍼레이션)를 사용하였다. 반응 주기 프로토콜은 94 ℃ 2 분; 25 회 동안 (94 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 30 초, 및 72 ℃에서 30 초); 그 다음 7 분 동안 72 ℃였다. 생성되는 생성물을 HindIII 및 BamHI을 사용하여 분해시키고, 프로모터의 -10 영역이 변형된 antR-Pant: phoA 융합체를 함유하는 pDOW1033:플라스미드 pDOW1095 및 1098의 동일한 부위들로 클로닝하였다.
DNA 시퀀싱 프로토콜
클로닝된 삽입물을 (캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템, 인크.(Applied Biosystem, Inc.))로부터의 ABI PRISMBIGDYE V2.0 또는 V3.0 DNA 시퀀싱 키트를 사용하여 다음과 같이 시퀀싱하였다: 4 μL의 프리믹스 (어플라이드 바이오시스템 키트에서 제공되는 완충액, Taq 폴리머라아제, 및 염료 종결제(dye terminator) 함유), 50 fmol의 플라스미드 주형, 3.2-5 pmol의 원하는 시퀀싱 프라이머, 및 2 μL의 5x 완충액 (어플라이드 바이오시스템 키로에서 공급)을 한데 합쳤다(최종 부피 20 μL). 사용된 PCR 주기 프로파일은 95 ℃에서 30 초, 50 ℃에서 20 초, 및 60 ℃에서 4 분의 45 주기였다. 샘플을 SEPHADEX G-50(미소우리 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Company)로부터의 핵산의 크로마토그래피 정제용 비드형, 덱스트란 겔)을 사용하여 정제하고, 건조시키고, 포름아미드 중에서 재현탁시킨 다음, ABI3100 자동화 DNA 시퀀싱기(sequencer) (16 모세관 어레이, 자동화된 DNA 시퀀싱기(어플라이드 바이오시스템, 인크.))에서 가동시켰다.
프라이머 연장 프로토콜
RNA 단리. P. 플루오레센스 Pant 및 Pben 프로모터의 제어 하에서 전사 개시 부위를 동정하기 위해 RNA 단리 절차를 따랐다. 사용된 상기 절차는 다음과 같다. 적합한 플라스미드를 운반하는 P. 플루오레센스 MB101의 밤샘 배양물을 1% 글루코스 (w/v), 1mM MgSO4, 및 미량 원소(앞서 기재한 바와 같음)로 보충되는 1 x M9 배지 중에서 성장시키고, 최종 부피 50 mL가 되도록 동일한 배지 중에서 1:4 (v/v) 계대배양하였다. 적합하게 8 또는 24 시간 동안 5mM 벤조에이트 또는 안트라닐레이트를 사용하여 배양물을 유도시켰다. 세포를 펠릿화하고 총 RNA를 RNEASY 키트 (캘리포니아주 발렌시아 소제의 퀴아겐으로부터의 "맥시(maxi)"박테리아 RNA 단리 키트)를 사용하여 단리시켰다. RNA를 최종 부피 200 μL로 재현탁시키고 제조자의 프로토콜에 따라 10 유닛의 DNAse I (리보뉴클레아제-비함유, 텍사스 오스틴 소재의 암비온 인크.(Ambion, Inc.)로부터 입수)으로 처리하였다. DNAseI 처리 후, RNA를 적합하게 (1 mg 이하의 양의 RNA의 경우 RNEASY "미디" 칼럼 사용; 100 μg 이하의 양의 RNA의 경우 RNEASY "미니" 칼럼 사용), RNEASY 칼럼 ("미디(midi)" 또는 "미니(mini)" RNA 정제 칼럼, 퀴아겐으로부터 입수)을 사용하여 정제하였다. 일단 정제된 후, 제조자의 프로토콜에 따라 RIBOGREEN (RNA 정량 키트, 오레곤주 유겐 소재의 몰레큘라 프로브스, 인크.(Molecular Probes, Inc.)로부터 입수)을 사용하여 RNA 농도를 측정하였다.
프라이머 표지화: 이는 1 μL 10 μM 프라이머 (lacZPE, GGATGTGCTGCAAGGC (서열 번호 14), 또는 lacZPE2, GTAACCATGGTCATCGC (서열 번호 15)), 1 μL 1Ox T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 완충액 (700mM Tris-HCl (pH 7.6), 100mM MgCl2, 50mM 디티오트레이톨 (DTT)), 5 μL 32P-γATP (50μCi, 아머샴-파마시아(Amersham-Pharmacia)), 1 μL T4 키나아제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스), 및 2 μL ddH20을 혼합하고 생성되는 반응 혼합물을 37℃에서 30-60 분 동안 인큐베이션함으로써 수행하였다. 인큐베이션 후, 5 μL의 반응 혼합물을 "시퀀싱 사다리" 분석에 사용하기 위해 보유하였다. 20 μL TE (lOmM Tris, 1 mM EDTA (pH8.0))를 다른 5μL에 첨가하고 혼합하고 결과물을 MICROSPIN G-25 칼럼 (뉴 저리주 피스카타웨이 소재의 아머샴-파마시아)을 통하여 교반시켜 혼입되지 않은 뉴클레오티드를 제거함으로써 최종 농도 0.2 μM의 표지화된 프라이머를 수득하였다.
시퀀싱 사다리: 이는 FMOL 키트 (프로메가 코퍼레이션으로부터의 DNA 시퀀싱 키트)에 따르는 프로토콜에 따라, 1 피코몰 (pmol)의 앞서 기재한 표지화된 프라이머를 사용하여 수행하였다. 사용된 플라스미드 주형은 연장 반응을 위한 RNA가 단리된 균주와 대응한다.
프라이머 연장 반응: 10-20 μg의 총 RNA와 0.2 pmol 프라이머를 혼합하여 최종 부피 12 μL를 수득한 후, 70 ℃에서 10 분간 인큐베이션함으로써 프라이머 연장 반응을 수행하였다. 그 다음, 하기의 것들을 첨가하고:4 μL 5x SUPERSCRIPT II 완충액 (250mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15mM MgCl2, (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 현재는 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐 코퍼레이션으로부터 입수가능), 2 μL 1M DTT, 1 μL 1OmM dNTP, 및 1 μL SUPERSCRIPT II (역전사효소, 라이프 테크놀로지스, 현재 인비트로겐), 이어서 42 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 생성되는 혼합물을, 5 μL 시퀀싱 정지 용액 (프로메가(Promega) FMOL 키트에서 공급된 추적 염료(tracking dye) 및 포름아미드 함유)을 첨가하거나 또는 신호가 약한 경우, 2 μL 3M 소듐 아세테이트/40 μL 100% 에탄올로 침전시킨 후, 10 분 동안 현탁된 물질을 원심분리하여 펠릿화하고, 펠릿을 건조시키고, 4μL H20 + 2 μL 시퀀싱 정지 용액에서 재현탁시킴으로써 처리하였다. 그 다음, 프라이머 연장 반응으로부터 생성되는 생성물 혼합물을 전기영동 "러닝(running)" 완충액으로서 0.6x TBE를 사용하여 시퀸싱 사다리 옆의 8M 우레아(Urea) 및 1.2 x TBE (즉, Tris-보레이트-EDTA, 펜실베니아주 피트스버그 소재의 피셔 사이언티픽으로부터 입수한 TBE를 10 배 희석)를 함유하는 LONG RANGER 겔 (6% 예비 혼합된 겔 용액으로부터 제조, 메인 록랜드 소재의 바이오휘트테이커 몰레큘라 어플리케이션스(Biowhittaker Molecular Applications)) 상에서 전기영동시켰다. 겔을 건조시키고, 인 스크린 (뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 몰레큘라 다이나믹스(Molecular Dynamics), 현재 아머샘 바이오사이언시스, 인크.(Amersham Biosciences, Inc.))에 노출시켜 방사표지화된 DNA 단편을 검출하고, TYPHOON PHOSPHORIMAGER (뉴 저지주 피스카타웨이 소재의 몰레큘라 다이나믹스, 현재 아머샘 바이오사이언시스, 인크.)에서 영상화하였다.
터모스크립트(Thermoscript) 역전이효소를 사용한 프라이머 연장: 최종 부피가 12 μL가 되도록 30 ng의 총 RNA, 1 μL 0.2 μM 프라이머, 및 ddH20를 혼합한 다음, 70 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 이 혼합물에 4 μL 5×cDNA 합성 완충액 (250mM Tris 아세테이트 (pH 8.4), 375 mM 아세트산 칼륨, 40 mM 아세트산 마그네슘), 1 μL 0.1M DTT, 2 μL lOmM dNTP, 1 μL THERMOSCRIPT RT (인비트로겐 코퍼레이션으로부터의 역전사효소)을 첨가하고, 생성되는 혼합물을 55 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 생성물을 침전시키고, 건조시키고, 4μL ddH20 + 2 μL 정지 용액 (앞서 기재함)에서 재현탁시켰다. 앞서 기재한 겔에 로딩시키기 직전에 모든 반응물을 70 ℃에서 2분 동안 가열시켰다. 상기 겔을 앞서 기재한 바와 같이 러닝(running)하였다.
마이크로타이터(microtiter) β-갈락토시다제 분석시험
96-웰 플레이트의 각 샘플 웰(즉, 각 샘플에 대해 반응 코스 동안 측정된 각 시점에 사용되는 하나 이상의 웰을 구비하는 사용되는 모든 웰)을 제공하기 위해 하기 분석시험 배지를 충분히 제조하였다: 152 μL Z 완충액 (0.06M Na2HPO4ㆍ7H2 O, 0.04M NaH2PO4ㆍH2O, 0.01M KCl, 0.001M MgSO4ㆍ7H2O) +8 μL 1M β- 멀캅토에탄올. 각 900 μL의 생성되는 혼합물에 대해, 한 방울의 0.1 % SDS 및 두 방울의 CHCl3를 첨가하고, 혼합(볼텍스형 혼합기 사용)한 다음, 이들의 144 μL를 각 웰에 첨가하였다. 그 다음, 16 μL의 세포를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 플라스틱 플레이트 밀봉제로 밀봉하였다. 그 다음, 플레이트를 10 초간 혼합(볼텍스에 의해)한 다음, 인큐베이션 온도 (실온)로 5분 동안 평형상태로 유지하였다. 그 다음, 50 μL 4mg/mL ONPG를 첨가하였다. 진한 황색이 발현되는 때에, 90 μL 정지 용액(1M Na2CO3)를 첨가하고 반응 시간을 기록하였다. 그 다음, 각 샘플에 대한 생성되는 색 강도를 A420 및 A550에서 읽었다. 또한, 각 샘플에 사용된 16 μL의 세포를 제공하는 각 배양물의 세포 밀도를 A600에서 읽었다. 밀러 유닛(Miller Unit)을 다음과 같이 계산하였다:
1000 *((A420 - (1.75 * A550))/ (시간(분) * 0.1 * A600)).
알칼리성 포스파타제 분석시험
이 분석시험을 위해, SIGMA FAST (미소우리 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 코퍼레이션(Sigma-Aldrich Corp.)으로부터의 p-니트로페닐 포스페이트 (PNPP) 기질)를 제조자 (한 정제 당 각 PNPP 및 Tris; -20 ℃에서 저장)에 의해 제공된 각 정제 20 mL ddH2O에 첨가하고, 최종 농도 1 mg/mL PNPP 및 0.2M Tris를 제공함으로써 제조하였다. 각 시점에서, 각 샘플에 대해, 50 μL SIGMA FAST 기질을 5 μL의 세포와 한데 합쳤다. 그 다음, 결과물을 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 각 샘플에 대해 생성되는 색 강도를 A410에서 읽었다. 또한, 각 시험 샘플에 사용된 5 μL의 세포를 제공하는 각 배양물의 세포 밀도를 A600에서 읽었다 (즉, 세포 배양물들을 96 웰 플레이트에서 읽음). 그 다음, 알칼리성 포스파타제 활성/세포를 표시하는 A410값/(0.1 * A600)을 계산하였다.
실시예 1. 벤조에이트-유도성 프로모터의 클로닝 및 분석
벤조에이트는 저렴하고 본질적으로 비독성인 화합물이며, 이러한 점이 이를유도자의 이상적인 후보가 되게 한다. P. 플루오레센스 DNA의 509bp 영역을 클로닝하였다. 이 영역은 벤조에이트 디옥시게나제의 서브유닛의 코딩 서열의 일부인, 추정되는 benA 번역 개시 부위 (도 5)의 상류에 위치하는 것으로 발견되었다. 클로닝된 영역은 벤조에이트-유도성 프로모터 (Pben)를 함유하는 것으로 발견되었고 "Pben509"으로 명명하였다.
Pben509, 또는 Pben278의 추정되는 프로모터 서열(하기와 같음), 용이하게 분석시험가능한 리포터 유전자 (즉 lacZ, 이는 β-갈락토시다제를 코딩하며 주요(chief) 리포터 유전자, 또는 phoA로서 사용되었음)의 상류를 함유하는 DNA 단편을 융합시킴으로써 벤조에이트-유도성 프로모터 활성을 시험하였다. 생성되는 플라스미드를 P.플루오레센스 MB101 내로 형질전환시켰다. 소듐 벤조에이트 첨가 후, 발색성 기질 o-니트로페놀-p-D-갈락토피라노시드 (ONPG)를 사용하여 β-갈락토시다제 활성의 유도를 측정하였다(도 6 참조). phoA 리포터 유전자 및 발색성 기질 p-니트로페닐 포스페이트 (PNPP)를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 이들 구조물을 운반하는 P. 플루오레센스 균주는 1-1O mM 소듐 벤조에이트의 첨가시 각각 β-갈락토시다제 또는 알칼리성 포스파타제 활성을 나타낸다. 유도자의 농도 및(또는) 유도 시간을 변화시킴으로써 리포터 유전자 발현 수준을 변화시켰다 (데이터는 도시하지 않음).
그 부분이 "Pben278"로 명명된, 예상되는 번역 개시 부위의 275bp 부분 상류(도 5)를 함유하는 프로모터-플러스-리포터 유전자 구조물의 절단된 이형은 Pben509와 유사한 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다(도 6 참조).
Pben 509 및 Pben278 모두의 프로모터 활성은 적지만 상당한 글루코스 농도의 존재로 인해 발효 중에 억제되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 프로모터는 이화대사산물이 억제된 것이다.
노던(northern) 분석은 Pben으로부터의 발현이 유도자 화합물 (예를 들어, 소듐 벤조에이트)의 첨가시에만 발생하였음을 나타내며, 이는 Pben의 유도성 발현이 프로모터의 lac과의 경우와 같이 누출되지 않는다는 것을 증명하였다(데이터는 도시하지 않음). lacZ에 융합된 Pben509 또는 Pben278을 운반하는 MB101의 유도된 배양물로부터 단리된 총 RNA의 프라이머 연장 분석은 전사 개시 부위가 예상되는 benA 번역 개시 부위의 196 뉴클레오티드 (nt) 상류라는 것을 보여주었다. 이는 프로모터 서열 및 양성 조절 cis 작용 요소가 Pben278 클론에서 전사 개시점의 82bp 상류 내에 함유된다는 것을 보여준다.
문헌은 벤조에이트 대사 산물인 cis, cis-뮤코네이트가 다른 박테리아, 예를 들면 아시네토박터 sp. 및 P. 투티다의 benABCD 오페론 유도에 작용한다는 것을 교시하고 있다. 그러나, 벤조에이트 분해, 즉 카테콜에 대해 공지된 대사 경로에서 cis, cis-뮤코네이트 및 가정된 상기 화합물 모두는 Pben509 또는 Pben278 활성을 유도하지 못한다(데이터는 도시하지 않음). 그 결과, 벤조에이트 또는 출발 벤조에이트 유도체, 예를 들어, 2-히드로-1,2-디히드록시벤조에이트는 벤조에이트 프로모터 유도를 직접적으로 담당할 수 있다.
실시예 2. 안트라닐레이트-유도성 프로모터의 클로닝 및 분석
벤조에이트와 같이 안트라닐레이트도 P. 플루오레센스에 의해 사용될 수 있는 저렴하고 저독성인 화합물이며, 이러한 점이 유도자로서 조사하기에 이상적인 화합물이게 한다. 4 개의 프로모터 구조물은 lacZ 또는 phoA 리포터의 상류에서 클로닝되었고 안트라닐레이트로 유도시 유사한 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다: Pant713, Pant705, Pant311, 및 Pant + antR 코딩 서열 (CDS) (도 7). Pant713 및 Pant705는 동일한 5' 말단을 가지며, Pant713은 antA 유전자의 예상되는 리보좀 결합 부위를 함유하는 반면 Pant705는 그렇지 않다(Pant713에 대해 나타낸 최종 팔량체(octamer)에서 밑줄친 CCTCC 참조). 안트라닐레이트-유도 활성화에 필요한 최소 영역의 DNA를 결정하기 위한 노력으로, Pben713 구조물을 5' 말단에서 311 염기쌍 (bp)으로 절단시켰다. Pant311 구조물은 Pant713과 유사한 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다(데이터는 도시하지 않음). antA 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 전사 활성자 유전자 5'를 포함하는 프로모터 클론의 확장은 lacZ 융합체의 발현 수준을 높였다. Pant713, 및 전사 활성자 AntR을 포함하는 확장된 클론 양쪽 모두에 대해 예상되는 antA 번역 개시 부위의 31 개의 뉴클레오티드 상류에서 전사 개시 부위를 맵핑하였다(데이터는 도시되지 않음; 또한, 도 7 참조). lacZ 융합체를 갖는 멀티-카피(multi-copy)에서의 antR의 존재가 유도를 더 신속하고 강하게 할 수 있다는 점이 밝혀졌다(도 8 참조).
또한, 더욱 증가하는 AntR의 발현은 Pant 프로모터에 의해 더욱 개선된 안트라닐레이트-유도성 발현을 일으킨다는 것이 밝혀졌다. 예를 들어, 도 8에 도시한 바와 같이, pDOW1029- 및 pDOW1035-구조물을 P. 플루오레센스 숙주 세포에서 유도시켰다. 도 8은 24 시간의 연구 코스 동안 이들 프로모터 각각에 대해 달성된 유도 속도 및 유도의 최대 수준에서 상당한 차이가 있음을 증명한다. pDOW1029은 AntR 코딩 서열이 없는 Pant713 프로모터를 함유하고, pDOW1035는 전체 활성자 CDS를 함유한다. 사용된 P. 플루오레센스 숙주 세포는 AntR CDS의 활발하게 발현된 염색체 카피를 함유한다. 따라서, pDOW1029에 대해 도 8에 나타낸 결과는 AntR 유전자가 단일 카피에 존재하는 시스템에 대한 것이며, pDOW1035에 대한 결과는 2 개의 카피 시스템을 나타낸다. 이들 결과는 AntR 유전자의 여분의 카피의 존재가 Pant 프로모터의 속도 및 반응 수준 모두를 극적으로 개선한다는 점을 증명한다. 이러한 개선된 발현은 별법으로 얻을 수 있거나, 또는 매우 강한 프로모터를 사용하여 antR 발현을 일으킴으로써 추가로 향상될 수 있다. 또한, 유도자 화합물 (예를 들어, 안트라닐레이트)의 분해를 담당하는 핵심 유전자 (예를 들어, antA)가 불활성화된 숙주 세포를 사용함으로써 하기와 같이 개선된 유도/발현이 얻어질 수 있다. 또한, 활성자 및(또는) 프로모터 서열을 돌연변이시키는 것 (및 활성이 증간된 변이체 를 선택하는 것)도 활성자/프로모터 상호작용을 향상시킴으로써 Pant에 의한 더욱 개선된 안트라닐레이트-유도성 발현을 일으킬 수 있다.
또한, 안트라닐레이트 프로모터는 할로-치환된 안트라닐산 유도체: 3-클로로-, 4-클로로-, 5-클로로- 및 6- 클로로-안트라닐레이트를 비롯한 안트라닐레이트 유사체에 의해 유도성인 것으로 밝혀졌다. 6-클로로안트라닐레이트는 안트라닐레이트 대사의 불필요한 유도자로서 작용하며, 즉 이는 P. 플루오레센스에 의해 대사되지 않지만 안트라닐레이트 프로모터로부터 발현되는 것으로 밝혀지고 있다. 예를 들어, 6-클로로안트라닐레이트는 Pant713 및 antR/Pant 구조물을 유도하는 것으로 밝혀졌다(도 8). 종합하면, 이들 결과는 안트라닐레이트 자체가 대사 경로를 유발하며, 이로써 숙주 유기체의 안트라닐레이트 대사 경로를 불활성화시키는 대체물로서의 불필요한 유도자로서 치환된 안트라닐레이트 화합물을 사용하는 것이 가능하다는 것을 보여준다.
실시예 3. 융합된, Pant-Pben 직열 프로모터의 구성 및 시험
멀티-카피 antR을 갖는 Pant 프로모터의 상대 강도는 Pben278 프로모터의 대략 1/5인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이화대사산물-억제된 Pben 프로모터와는 달리, Pant 프로모터의 활성은 발효 도중 억제되지 않았다. 이들 두 개의 프로모터를 서열 번호 3에 나타낸 바와 같이 이들을 서로 연결함으로써, 즉 단편 antR 및 Pant, lacZ에 융합된 Pben278 프로모터의 상류를 클로닝함으로써 융합을 형성하였다.
안트라닐레이트로 유도한 경우, 안트라닐레이트로 유도된 직열 "'antR/Pant'-'Pben278"' 구조물의 강도는 놀랍게도 단독의 "antR/Pant"에 비해 개선된 것으로 밝혀졌다. 벤조에이트로 유도한 경우 프로모터의 강도는 Pben278 단독의 경우와 유사한 것으로 밝혀졌다(도 9). 글루코스의 존재 하에서의 안트라닐레이트 첨가시 직열 프로모터로부터 β-갈락토시다제 활성 유도가 더 증가되었음은 천연적으로 이화대사산물-억제된 Pben이 코딩 서열에 근접하여 위치하는 직열 프로모터로부터의 전사가 놀랍게도 Pben의 이화대사산물 억제에 의해 저해되지 않는다는 것을 나타낸다. 이는 (1) 직열 프로모터에서 Pben 및 Pant 요소의 박테리아 공급원 및 (2) 유도가 시험된 숙주 세포의 양쪽 모두가 동일한 것: 슈도모나스 플루오레센스 바이오타입 A라는 점에서 더욱 놀랍다. 따라서, 비록 Pben 요소가 숙주 세포에 고유한 것일지라도, 상류에 존재하는 천연적으로 비-이화대사산물-억제된 프로모터 (Pant)는 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터 (Pben)의 이화대사산물 억제를 극복할 수 있다. 또한, Pben 프로모터의 상류에서의 antR 및 Pant의 존재는, 글루코스의 존재 하에서 발효 중 직열 프로모터가 활성이 있기 때문에 Pben의 이화대사산물 억제를 경감시키는 것으로 보인다(도 12 및 13 참조).
실시예 4. Pben509의 개선된 변이체
Pben 프로모터를 개선하기 위한 노력으로, 오류 빈발성 PCR에 의해 Pben509 프로모터에 변이를 일으켰다. 진탕 플라스크 규모(shake flask scale)에서 1OmM 벤조에이트를 사용하여 유도시킨 후 변이체를 개선된 활성을 위해 스크리닝하였다. 동정된 변이체는 야생형 프로모터에 비해 대략 2 배의 개선을 나타내었다(도 10). 긍정 적중(positive hit)을 P. 플루오레센스로 재형질변환시키고 개선된 활성이 사실상 신규한 구조물로 인한 것임을 확인하기 위해 재시험하였다.
서열 분석 (도 11)은 변이체 2d3에서의 한 변화 및 변이체 21b5에서의 두 개의 변화가 있었음을 밝혀내었다. 첨부한 도면에서 도시하는 바와 같이, 단리체 2d3에서의 돌연변이 및 21b5의 돌연변이 중 하나는 상류 ORF의 코딩 영역에 존재한다. 이 영역은 Pben278 구조물 내에 함유되지 않는다. 이들 돌연변이가 개선된 프로모터 변이체 에서 단리되었다는 사실은 상류 영역이, 활성화된 전사에 반드시 필요한 것은 아니지만 전사에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 21b5에서 확인된 두번째 돌연변이는 전사 개시 부위의 다섯개의 염기쌍 상류에 위치한다.
실시예 5. 합리적으로 변이된(Rationally Mutated) Pben 및 Pant 프로모터
Pben-10 변이체 의 구성 및 분석. 프로모터 활성을 개선시키기 위해 천연 Pben 예상 -10 영역을 변이시켰다. 재료 및 방법에 기재한 바와 같이, 프로모터 자체를 88 bp로 절단시키고, -10의 3가지 유도체를 구성하였다: 야생형 (TACGGTT, 공통 영역 (TATAAT), 및 Acinetobacter (Ac) Pben-10 (TAAGGT). 이전에 동정된 전사 개시 부위의 한 bp (G:C) 상류가 제거되고 이전에 동정된 전사 개시 부위의 9bp 하류가 포함되도록 프라이머를 구성하였다. 이들 프로모터를 phoA 리포터 유전자에 융합시키고 P. 플루오레센스 MB101에서 활성을 시험하였다. 도 14는 비록 아시네토박터 Pben 프로모터의 -10 서열 또는 공통 영역 TATAAT로 -10 영역을 바꾸는 것이 벤조에이트 유도 프로모터 활성을 현저히 개선하는 것으로 보이진 않지만 88bp로의 Pben 프로모터의 절단이 벤조에이트-활성화된 발현을 제공하기에 충분하다는 것을 보여준다.
Pant -10 변이체 의 구성 및 분석. Pben에 대해 앞서 기재한 바와 같이, 프로모터 활성을 개선하기 위해 Pant 프로모터의 예상되는 -10 영역을 변이시켰다. 두 개의 Pant-10 변이체 의 구성에서, 프로모터를 289bp로 절단시켰다. 안트라닐레이트 전사 활성자 및 변이체 프로모터를 함유하는 DNA 및 단편을 phoA 리포터 유전자로 융합시켰다. 생성되는 플라스미드를 antA 유전자가 삽입으로 불활성화된 MB101의 유도체로 형질전환하였다. 도 15는 안트라닐레이트를 사용한 유도 후, 289bp로의 프로모터의 3' 절단이 활성(pDOW1095)에 영향을 미치지 않았음을 보여준다. 추정되는 -10 영역을 공통 영역 -10 (pDOW1098)으로 바꾼 결과 프로모터가 유도 화합물의 부재 하에서도 발현을 일으킬 수 있었다. 안트라닐레이트는 더 높은 발현을 제공하지 못했으며, 이는 프로모터가 역시 유도성이라는 것을 시사하였다.
실시예 6. 변이체 Ptandem 프로모터
pDOW1057 (서열 번호 13)에 나타낸 서열을 갖는 직열 프로모터를 Pben-10 영역에서 다음과 같이 변이시켜 Ptandem 프로모터를 구성하였다. HindIII 및 SmaI로 분해시킨 pDOW1039에의해 수득한 antR 및 Pant를 함유하는 1.6 kb DNA 단편을 겔 정제(퀴아겐 코퍼레이션으로부터의 QIAEX II 겔 칼럼 사용)하고, HindIII 및 PmeI으로 각각 분해시킨 pDOW1102 (Pben88wt-10), pDOW1106 (Pben88con-10), 및 pDOW1100 (Pben88Ac-10)으로 라이게이션시켰다. 숙주 세포로 형질전환한 후, 콜로니 PCR에 의해 양성 클론을 각 플라스미드에 대해 동정한 다음, DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 생성되는 플라스미드를 각각 pDOW1107, pDOW1108, 및 pDOW1109으로 명명하였다.
Ptandem 활성에 대한 Pben 변이체 의 영향을 진탕 플라스크 규모에서 평가하였다. 도 16에 도시한 바와 같이, 돌연변이는 벤조에이트- 또는 안트라닐레이트-유도 Ptandem 활성에 큰 영향을 미치지 않았다. pDOW1107-1109 모두는 원래의 구조물, pDOW1057에 의해 나타나는 것에 2 배 이내의 β-갈락토시다제 활성을 나타내었다. 한가지 흥미로운 발견은 단독 또는 직열 프로모터의 일부로서의 Pben88-10공통 영역 변이체가 벤조에이트 또는 안트라닐레이트를 사용한 유도 전에 발현된 것으로 보인다는 것이었다. 유도자로서의 벤조에이트 첨가는 Pben88-lO공통 영역 단독(pDOW1106)으로부터의 발현, 또는 직열(pDOW1108)의 일부로서의 발현을 증가시켰다 (도 16A). 그러나, 안트라닐레이트를 첨가로는 Pben88-10공통 영역 직열 구조물 pDOW1108로부터 lacZ 발현을 증가시키지 못했다(도 16B).
20L 규모에서의 pDOW1108 분석은, 24시간 동안 2 mM 또는 5 mM 벤조에이트 적용량으로 유도된 pDOW1108을 운반하는 MB101이 활성을 가질 뿐만 아니라 벤조에이트를 대사한다(데이터는 도시하지 않음)는 것을 밝혀내었다. 상대적으로 높은 양의 β-갈락토시다제 활성은 진탕 플라스크 규모에서 검촐되었던 바와 같이 "누출성" 발현의 가장 적합한 결과인 I0에서 검출되었다(도 16A 참조). 벤조에이트를 사용한 유도시 활성의 초기 감소가 계속 검출되었으나 그 후, 활성은 I0에서 검출된 것 보다 높은 수준으로 상승하였다. 24시간 동안 매 4 시간 마다 2 mM 안트라닐레이트를 사용한 20L 규모에서의 pDOW1108의 유도는, 비록 안트라닐레이트가 유효하게 대사되었지만 β-갈락토시다제 활성에 의해 측정된 바와 같이 클로닝된 직열 프로모터 발현이 진탕 플라스크 규모에서 관찰된 바와 같이 누출성이며, 실제로는 안트라닐레이트의 첨가 후 감소한다는 것을 보여주었다(도 18 참조). 20L 규모에서 벤조에이트를 갖는 원래의 직열 프로모터 구조물 pDOW1057을 운반하는 P. 플루오레센스의 비교 유도는 벤조에이트가 pDOW1108과 마찬가지로 대사된다는 것을 보여주었다. 그러나, 30 시간 내지 48시간 유도 후에서와는 반대로 4 시간 내지 24시간에서 증가된 활성이 검출되었던 pDOW1108 구조물의 유사한 2mM 용량 유도에 비해 β-갈락토시다제 활성의 유도는 지연된 것으로 보인다(데이터는 도시하지 않음).
실시예 7. 발효 중 제어된 유전자 발현을 위한 벤조에이트- 및 안트라닐레이트-유도 프로모터의 용도
20L 규모에서의 Pben509 lacZ 융합 시험은 전사 조절이 진탕 플라스크 규모에서는 검출되지 않음을 밝혀냈다. 5 또는 1O mM 벤조에이트와의 융합의 유도는 계속 관찰되지 않았다(데이터는 도시하지 않음). 또한, 벤조에이트 소비와 Pben509의 활성화의 상관관계가 관찰되었다. 글루코스의 존재는 리포터 유전자 발현의 억제를 담당하는 것으로 생각된다. 이들 실험 후, 진탕 플라스크 실험에서는 벤조에이트 대사가 글루코스를 고갈시킨다는 것이 관찰되었다. 벤조에이트-유도성 시스템은 글루코스 외의 탄소원을 사용하는 발효 공정에 유용할 수 있다. 진탕 플라스크 실험은 시트레이트가 탄소원으로서 사용되는 경우에 가장 높은 수준의 유도가 관찰된다는 것을 보여주고 있다. 이 관찰은 발효 규모에 대하여 유효하다.
20L 규모에서 AntR Pant 구조물 및 직열 프로모터 구조물의 시험은 진탕 플라스크 규모에서 관찰된 것과 유사한 활성을 나타내었다. 유도자가 배양에 의해 소비되기 때문에, 안트라닐레이트를 유도 코스 동안 공급하였다. 시간에 따른 활성을 관찰하였다. 유도자를 대사할 수 없는 균주에서 보다 높은 활성이 관찰될 것이다. 진탕 플라스크 및 20L 발효 실험에서 관찰된 바와 같이, 직열 프로모터 구조물은 AntR Pant 구조물보다 활성이 높다(도 12). antA 유전자의 삽입 불활성화에 의한 안트라닐레이트 대사의 불활성화는 20L 규모에서 직열 프로모터:lacZ 융합체를 더 많이 발현시켰다. 도 13에 도시한 바와 같이, 안트라닐레이트는 유도 코스 동안 대사되지 않고 관찰되는 β-갈락토시다제 활성 수준은 안트라닐레이트를 대사하는 균주에서 관찰되는 것보다 훨씬 높다.
실시예 8. BenAB 녹아웃 균주의 특성화
어떤 벤조에이트가 사실상 Pben 프로모터의 유도자이며 그의 하류 대사 산물이 아닌지 확인하기 위해, P. 플루오레센스의 benAB 유전자 녹아웃 균주를 더 특성화하였다. benA 및 benB 유전자는 벤조에이트 1, 2 디옥시게나제 각각의 크고 작은 서브유닛들을 코딩한다. 두 가지 단리된 benAB 녹아웃 균주를 다음과 같이 벤조에이트 대사 능력에 대해 더 시험하였다. 세포를 LB-프롤린-우라실 중에서 고밀도로 성장시킨 다음, 벤조에이트를 다시 24 시간 동안 인큐베이션하기 전에 배양물에 최종 농도 ~ 5 mM로 첨가하였다. HPLC에 의해 측정된 세포가 없는 배지에 잔존하는 벤조에이트의 농도는, 모, 비-녹아웃 균주는 유효하게 벤조에이트를 대사시키지만 benAB 결실 변이체 가 벤조에이트를 대사시킬 수 없음을 나타내었다. 어떤 Pben 프로모터가 benAB 녹아웃 균주에서 여전히 활성을 가지는지 평가하기 위해, Pben278::lacZ 구조물을 함유하는 플라스미드를 상기 균주 중 하나로 형질전환시키고 형질전환체를 LB 배지에서 성장시켰다. 형질전환체를 0 또는 5mM 벤조에이트를 사용하여 유도시키고, lacZ 활성은 하류 대사 산물보다는 실제로 벤조에이트가 Pben의 유도자임을 입증하였다. 도 19 참조.
실시예 9. BenR의 멀티-카피 발현의 영향
Pben 프로모터와 함께 benA의 BenR ORF 상류를 함유하는 DNA 단편을 P. 플루오레센스 MB214 게놈 DNA로부터 프라이머 Benact5' 및 Bambenconshort를 사용하여 하기 조건하에서 증폭시켰다: 94 ℃ 1 분; 30 주기 (94 ℃, 1 분; 50 ℃, 30 초; 72 ℃, 90 초); 그 다음, 10 분 동안 72 ℃, 및 4 ℃에서 방치. PCR 생성물을 pCR2.1 벡터로 라이게이션시키고 서열을 확인하였다. 삽입물 단편을 PmeI 및 BamHI으로 분해시키고, pDOW1033으로 라이게이션시켰다. 생성되는 플라스미드를 pDOW1090으로서 비축(stock)하였다. pDOW1090을 BamHI 및 XhoI으로 분해시킴으로써 phoA 리포터를 제거하고, 이를 lacZ 리포터 유전자를 함유하는 pDOW1035의 3Kb BamHI-XhoI 단편으로 대체함으로써 동일한 프로모터 구조물을 lacZ 리포터에 융합시켰다.
phoA 리포터 유전자의 Pben 프로모터 상류와 함께 benR ORF를 클로닝하여 멀티카피 중에서 전사 활성자 유전자의 발현이 벤조에이트 활성화된 전자 발현을 개선시키는지 여부를 측정하였다. 진탕 플라스크 규모에서, 멀티카피에서 benR을 사용한 프로모터 활성에서는 별다른 차이가 관찰되지 않았다. 전사 활성자를 과다발현시키는 것이 이화대사산물 억제를 극복할 수 있다고 문헌에서 시사하였기 때문에, pDOW1090을 운반하는 P. 플루오레센스 MB101의 20L 발효를 시험하였다. 이전의 연구들은 Pben::lacZ 융합체를 운반하는 MB101이 옥수수 시럽 공급물을 사용한 발효 도중에 벤조에이트를 대사하지 못한다고 하였다. 본 발명자들은 pDOW1090을 운반하는 MB101이 20L 규모에서 벤조에이트를 대사할 수 있음을 발견하였다. 벤조에이트는 3배(triplicate) 20L 발효에서 일관되게 대사되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 염색체 Pben 프로모터가 활성이 있음을 시사하였다. 따라서, BenR의 멀티-카피 발현의 존재는 이화대사산물 억제를 극복하였다. 도 17 참조.
그 결과, benR의 과다발현은, P. 플루오레센스가 단독의 Pben을 함유하는 구조물을 시험한 경우 20L 규모에서 벤조에이트 대사에 대해 관찰되는 이화대사산물 억제를 극복하게 한다는 것을 발견하였다. 비록 Ptandem의 제어 하에서 안트레라닐레이트-유도 활성은 이미 Pant의 안트라닐레이트-유도 활성보다 강하지만 직열 프로모터의 벤조에이트-유도 활성화가 진탕 플라스크 규모에서의 안트라닐레이트-유도 활성의 경우보다 크기 때문에, 20L 규모에서의 벤조에이트-유도 프로모터 활성의 입증은 중요한 개선이다. pDOW1057 및 pDOW1108 모두는 20L 규모에서 벤조에이트-유도성인 것으로 발견되었다. 비록 pDOW1108 구조물이 유도자의 첨가 전에 상당한 발현이 일어난다는 점에서 "누출성"이지만, 이는 단백질 발현에서 사용시 큰 문제점을 제공하지 않아야 한다. 또한, Pben이 benAB 녹아웃 균주에서 활성이 있다는 것이 밝혀졌기 때문에, 이러한 녹아웃 균주의 사용은 Pben 뿐만 아니라 Ptandem에 대한 벤조에이트-유도 프로모터 활성을 개선시킬 것이다. 마찬가지로, 지금, 안트라닐레이트를 사용한 직열 프로모터 구조물 pDOW1057의 유도가 염색체 antA 유전자를 운반하는 균주 및 삽입으로 불활성화된 염색체 antA 유전자에서 개선된다는 점을 증명하였기 때문에, 개선된 안트라닐레이트-유도 프로모터 활성은 Pant 뿐만 아니라 Ptandem에 대해서도 향상될 것이다.
결과적으로, 안트라닐레이트- 및 벤조에이트-유도성 프로모터는 현재, 박테리아 발현 시스템에 사용하기 위해 개발되었다. 이들 프로모터는 전사의 빈틈없는 조절을 가능케하고 저가 화합물, 예를 들면 벤조에이트 및 안트라닐레이트를 사용하여 유도가능하다는 점이 밝혀졌으며, 또한 멀티-카피에서의 antR의 존재는 현재, Pant 프로모터의 활성을 상당히 개선하는 것으로 밝혀졌다. 또한 현재, 신규한 타입의 직열 프로모터는 Pant 자체에 대해 안트라닐레이트-유도 유전자 발현 수준이 증가된 것으로 발견되었고, 벤조에이트-유도성 (즉 Pben 자체로서 동일한 수준으로)인 것으로 발견되었으며, 놀랍게도 단독의 Pben가 이화대사산물 억제를 극복할 수 있는 것으로 발견된 Pant-Pben 직열 프로모터로 예증되는 박테리아 발현 시스템에 사용하기 위해 개발되었다. 또한, 본 발명의 연구는 Pant 프로모터 (antR을 가짐) 및 직열 프로모터 구조물 양쪽 모두가 발효-규모 조건 (예를 들어, 20L 규모) 하에서 안트라닐레이트-유도성 유전자 발현을 일으킴을 입증하였으며, 직열 프로모터 구조물도 발효-규모 조건하에서 벤조에이트 유도성 유전자 발현을 일으킴을 보여주었다.
앞서 기재한 바람직한 실시태양은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 그 안에 사용된 용어는 오직 이들 바람직한 실시태양을 설명하기 위한 목적으로 사용되는 것이므로 상기 기재를 위해 선택된 바람직한 실시태양은 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니라는 점을 이해해야 할 것이다. 이와 같이 기재된 본 발명, 다른 실시태양, 대체물, 변형, 및 명백한 변화들은 특히 본 명세서에서 기재된 바람직한 실시태양, 방법론, 프로토콜, 벡터, 시약들, 요소, 및 조합물에 대한 등가물로서, 단지 통상적인 실험을 사용함으로써 당업자에게 명백히 이해될 것이다. 이러한 등가물은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 이해되어야 할 것이고 본 발명의 기술사상 및 범위에서 벗어나는 것으로 간주되지 않아야 한다. 모든 이러한 등가물은 하기 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 의도되며, 본 발명의 진정한 범위는 하기 청구범위에 의해 정해진다.
SEQUENCE LISTING <110> Retallack, Diane M. Subramanian, Venkiteswaran <120> Benzoate- and Anthranilate-Inducible Promoters <130> 62033A WO <150> US 60/393,422 <151> 2002-07-03 <160> 41 <170> Microsoft Word 97 SR-2 <210> 1 <211> 5006 <212> DNA <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> misc_feature <222> 1..5006 <223> Benzoate Operon controlling expression of benABCD <220> <221> CDS <222> 225..284 <223> Alternative amino-terminal-portion-encoding CDS, starting from alternative putative initator codon (ttg225-227) of CDS encoding BenR, giving Met1->Arg335 as the amino acid sequence of the Pben activator protein <220> <221> CDS <222> 285..1229 <223> Sense strand of ORF encoding the putative Pben activator protein, starting from putative initiator codon (atg285-287) of CDS encoding BenR, giving Met21->Arg335 as the full amino acid sequence of the Pben activator protein <220> <221> mutation <222> 679..679 <223> An expressed mutation of g679->a679, changing agc->aac and giving Ser152->Asn152 upon expression <220> <221> misc_feature <222> 1106..1106 <223> A mutation of a1106->t1106, found in Pben509 mutant 2d3 <220> <221> misc_feature <222> 1223..1223 <223> A mutation of c1223->t1223, found in Pben509 mutant 21b5 <220> <221> misc_signal <222> 1228..1274 <223> Approximate region estimated to contain the BenR binding site <220> <221> promoter <222> 1275..1307 <223> Putative promoter (Pben) from benzoate operon (benABCD) <220> <221> -35_signal <222> 1275..1280 <223> Putative -35 region of Pben promoter <220> <221> -10_signal <222> 1296..1301 <223> Putative -10 region of Pben promoter <220> <221> misc_feature <222> 1296..1301 <223> Substitution mutation of Pben -10 region by tataat to form -10con mutants, and by taaggt to form -10benAc mutants <220> <221> misc_feature <222> 1302..1302 <223> A mutation of g1302->a1302, found in Pben509 mutant 21b5 <220> <221> misc_feature <222> 1306..1306 <223> A deletion of g1306 found in mutant promoter variants herein <220> <221> misc_signal <222> 1307..1307 <223> Putative transcription start site under control of Pben <220> <221> misc_signal <222> 1340..1342 <223> Putative native translation initiator codon <220> <221> CDS <222> 1340..2713 <223> BenA open reading frame encoding benzoate 1,2-dioxygenase alpha subunit <220> <221> misc_signal <222> 2714..2716 <223> BenA stop codon <220> <221> CDS <222> 2713..3198 <223> BenB open reading frame encoding benzoate 1,2-dioxygenase beta subunit <220> <221> misc_signal <222> 3199..3201 <223> BenB stop codon <220> <221> CDS <222> 3212..4231 <223> BenC open reading frame encoding benzoate 1,2-dioxygenase electron transfer component <220> <221> misc_signal <222> 4232..4234 <223> BenC stop codon <220> <221> CDS <222> 4224..5003 <223> BenD open reading frame encoding cis-1,2-dihydroxycyclohexa-3,5- diene-1-carboxylate dehydrogenase <220> <221> misc_signal <222> 5004..5006 <223> BenD stop codon <400> 1 gcatgacgtt gttgatttct catcgattct ccagcgtgcg caatgccgac cacatcatcg 60 tgctggacgg cgggcgaatc ctggaggagg gcagtcatca ccaactgatg gcggcgggtg 120 gacgctatgc cgagttgttc gatgttcagg cgcgggggta tcgctaggtc ccgagcgcca 180 cgcccgacga tacctccagg gtatccctcc agactttatc cata ttg gac gcc ccc 236 Met Asp Ala Pro 1 cta ccc aag cgt cag cct gag ccc aat aac gat aaa aga gtc gcg acc 284 Leu Pro Lys Arg Gln Pro Glu Pro Asn Asn Asp Lys Arg Val Ala Thr 5 10 15 20 atg acc gtg cta ttg agt gag cgc agc cag att ttc cag ggc gcc gat 332 Met Thr Val Leu Leu Ser Glu Arg Ser Gln Ile Phe Gln Gly Ala Asp 25 30 35 gcc tac gcg gtg tcg gac tac gtc aac cag cat gtg ggc agc cac tgc 380 Ala Tyr Ala Val Ser Asp Tyr Val Asn Gln His Val Gly Ser His Cys 40 45 50 att cgc ctg cct ccc agg ggc cag ccc cgg gca agt atc agc cat cgc 428 Ile Arg Leu Pro Pro Arg Gly Gln Pro Arg Ala Ser Ile Ser His Arg 55 60 65 acc ttc gcc agc ctg gac ctg tgc cgc atc agc tac ggc gca ccg gtg 476 Thr Phe Ala Ser Leu Asp Leu Cys Arg Ile Ser Tyr Gly Ala Pro Val 70 75 80 cgg gtc acg tcg gtg gcg ctg gag acc atc tac cac ctg cag atc ctc 524 Arg Val Thr Ser Val Ala Leu Glu Thr Ile Tyr His Leu Gln Ile Leu 85 90 95 100 ttg agc ggg cat tgc cgc tcc aac tcc cgt ggc gag gat gat gtg ttc 572 Leu Ser Gly His Cys Arg Ser Asn Ser Arg Gly Glu Asp Asp Val Phe 105 110 115 ggg ccg ggg gaa atc ctg ctg atc aat ccg gac gac ccg gta gac ctg 620 Gly Pro Gly Glu Ile Leu Leu Ile Asn Pro Asp Asp Pro Val Asp Leu 120 125 130 acc tat tcc gcc gac tgc gaa aaa ttc atc atc aaa ctg ccg gtg cgc 668 Thr Tyr Ser Ala Asp Cys Glu Lys Phe Ile Ile Lys Leu Pro Val Arg 135 140 145 ctg ctg gaa agc gcc tgc ctg gag cag cac tgg agc ctg ccg cgg gcg 716 Leu Leu Glu Ser Ala Cys Leu Glu Gln His Trp Ser Leu Pro Arg Ala 150 155 160 ggg gtc cgc ttc acg acg gcc cgc cac gcg ctc agt gaa atg ggc ggc 764 Gly Val Arg Phe Thr Thr Ala Arg His Ala Leu Ser Glu Met Gly Gly 165 170 175 180 ttc ctg ccg ttg ctc ggg ttg atc tgc cat gag gcg gaa aac gct gcc 812 Phe Leu Pro Leu Leu Gly Leu Ile Cys His Glu Ala Glu Asn Ala Ala 185 190 195 gag ccc cac atg caa ggc ctg tac gaa cgc atc gtg gcc aac aag ctg 860 Glu Pro His Met Gln Gly Leu Tyr Glu Arg Ile Val Ala Asn Lys Leu 200 205 210 ctg gca ttg ctg ggc agc aat gtg tcg cgg gtg acc ccc cgg gct gcc 908 Leu Ala Leu Leu Gly Ser Asn Val Ser Arg Val Thr Pro Arg Ala Ala 215 220 225 cac ggc ggt ggg ttt gaa gcg gtg cac gaa ttt atc cag cag cac ctg 956 His Gly Gly Gly Phe Glu Ala Val His Glu Phe Ile Gln Gln His Leu 230 235 240 ggc gat gac atc agc gtc gag cag ttg atg gcc gtg gcc aac gtc agt 1004 Gly Asp Asp Ile Ser Val Glu Gln Leu Met Ala Val Ala Asn Val Ser 245 250 255 260 gaa cgt tcg ctg tac agc ctg ttt gag cgc cag gtg ggg ctg tcg ccg 1052 Glu Arg Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Glu Arg Gln Val Gly Leu Ser Pro 265 270 275 cgc gat tac gta tgc cgc tgc aag ctc gaa cgc gta cat gca cgc ttg 1100 Arg Asp Tyr Val Cys Arg Cys Lys Leu Glu Arg Val His Ala Arg Leu 280 285 290 caa cta agc agc acg cgc agc gtg acc gag gtg gct ttg gac cat ggg 1148 Gln Leu Ser Ser Thr Arg Ser Val Thr Glu Val Ala Leu Asp His Gly 295 300 305 ttc atg cac cta ggg cgg ttt tcc gaa gcc tat cgc aaa cgc ttc ggc 1196 Phe Met His Leu Gly Arg Phe Ser Glu Ala Tyr Arg Lys Arg Phe Gly 310 315 320 gaa ctg ccg tcg cag acc tgg aaa cgc cat cgt taagcgacgt gcgcctggcg 1249 Glu Leu Pro Ser Gln Thr Trp Lys Arg His Arg 325 330 335 gatagcgatg tgcaggcagc ggatattgac gggcagggcg agcacgtacg gtgagggcgc 1309 ctgatacaag aacaacggag ggcccgcccc atg atc agt aca ccc gac cga ctc 1363 Met Ile Ser Thr Pro Asp Arg Leu 1 5 gcc tgc caa ttg cgc gag tcc gta cag gaa gac ccc gcc act ggg gtg 1411 Ala Cys Gln Leu Arg Glu Ser Val Gln Glu Asp Pro Ala Thr Gly Val 10 15 20 ttc cgc tgc cgc cgc gac atc ttc acc gac ccc gac ctg ttt gcc ctg 1459 Phe Arg Cys Arg Arg Asp Ile Phe Thr Asp Pro Asp Leu Phe Ala Leu 25 30 35 40 gag atg aaa cac atc ttc gaa ggc ggg tgg atc tac ctg gcc cat gaa 1507 Glu Met Lys His Ile Phe Glu Gly Gly Trp Ile Tyr Leu Ala His Glu 45 50 55 agc cag gtg ccg cag atc aac gat tac ttc acc acc tgg atc ggc cgc 1555 Ser Gln Val Pro Gln Ile Asn Asp Tyr Phe Thr Thr Trp Ile Gly Arg 60 65 70 cag ccg gtg gtc atc acc cgt gac aag cac ggc gcg ctg cat ggc ctg 1603 Gln Pro Val Val Ile Thr Arg Asp Lys His Gly Ala Leu His Gly Leu 75 80 85 gtc aac gcc tgc gcg cat cgc ggc gcc atg ttg tgc cgg cgc aaa caa 1651 Val Asn Ala Cys Ala His Arg Gly Ala Met Leu Cys Arg Arg Lys Gln 90 95 100 ggc aac aag ggc tca ttc act tgc ccc ttc cat ggc tgg acg ttc agc 1699 Gly Asn Lys Gly Ser Phe Thr Cys Pro Phe His Gly Trp Thr Phe Ser 105 110 115 120 aac gcc ggc aag ctg ctc aag gta aag gac gca aag acc ggc gcc tac 1747 Asn Ala Gly Lys Leu Leu Lys Val Lys Asp Ala Lys Thr Gly Ala Tyr 125 130 135 ccg gac agc ttc gac tgc gac ggc tcc cat gac ctc aag cgc ctg gcg 1795 Pro Asp Ser Phe Asp Cys Asp Gly Ser His Asp Leu Lys Arg Leu Ala 140 145 150 cgc ttt gaa aac tac cgc ggt ttc ctg ttc gcc agc ctc agc gat gcg 1843 Arg Phe Glu Asn Tyr Arg Gly Phe Leu Phe Ala Ser Leu Ser Asp Ala 155 160 165 gtg ccg gaa ctc agc gat tac ttg ggt gaa acc cgc gtc atc atc gac 1891 Val Pro Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Gly Glu Thr Arg Val Ile Ile Asp 170 175 180 cag atg gtc gac cag gcc cct ttg ggc ctg gag gtg ctg cgc ggc agc 1939 Gln Met Val Asp Gln Ala Pro Leu Gly Leu Glu Val Leu Arg Gly Ser 185 190 195 200 tct tcc tat gtc tat gac ggc aac tgg aag ctg caa atc gaa aac ggc 1987 Ser Ser Tyr Val Tyr Asp Gly Asn Trp Lys Leu Gln Ile Glu Asn Gly 205 210 215 gcc gac ggt tac cac gtc agc tcc gtg cac tgg aac tac tcg gcg acc 2035 Ala Asp Gly Tyr His Val Ser Ser Val His Trp Asn Tyr Ser Ala Thr 220 225 230 atg ggc cgg cgc aac tac gac gcc gaa ggc acg cgc acc gtc gac gcc 2083 Met Gly Arg Arg Asn Tyr Asp Ala Glu Gly Thr Arg Thr Val Asp Ala 235 240 245 aat ggc tgg tcg aaa agc ctg ggc ggc gtc tac gcc ttc gac cac ggg 2131 Asn Gly trp Ser Lys Ser Leu Gly Gly Val Tyr Ala Phe Asp His Gly 250 255 260 cat atc ctg ctg tgg acg cgc ctg ctt aac ccc caa gtg cgc ccg gtg 2179 His Ile Leu Leu Trp Thr Arg Leu Leu Asn Pro Gln Val Arg Pro Val 265 270 275 280 cac gct cac cgc gag gcc ttg gcc gaa cgc ctg ggc caa gcg cgc gcc 2227 His Ala His Arg Glu Ala Leu Ala Glu Arg Leu Gly Gln Ala Arg Ala 285 290 295 gac ttt atc gtc gac cag acc cgc aac ctc tgt ctc tac ccc aat gtg 2275 Asp Phe Ile Val Asp Gln Thr Arg Asn Leu Cys Leu Tyr Pro Asn Val 300 305 310 tac ctg atg gac cag ttc tcg acc cag atc cgc gtg gtg cgg ccc ctc 2323 Tyr Leu Met Asp Gln Phe Ser Thr Gln Ile Arg Val Val Arg Pro Leu 315 320 325 gcc gtg gat aaa acc gaa gtg aca atc tat tgc atg gcg ccc atc ggc 2371 Ala Val Asp Lys Thr Glu Val Thr Ile Tyr Cys Met Ala Pro Ile Gly 330 335 340 gaa agc gcc cag gag cgc gcc acg cgg att cgc cag tac gaa gac ttc 2419 Glu Ser Ala Gln Glu Arg Ala Thr Arg Ile Arg Gln Tyr Glu Asp Phe 345 350 355 360 ttc aat gtc agc ggc atg ggc acc ccg gat gac ctc gag gag ttc cgc 2467 Phe Asn Val Ser Gly Met Gly Thr Pro Asp Asp Leu Glu Glu Phe Arg 365 370 375 gcc tgc cag acc ggt tac cag ggc gcg agc acc ctg tgg aat gac ttg 2515 Ala Cys Gln Thr Gly Tyr Gln Gly Ala Ser Thr Leu Trp Asn Asp Leu 380 385 390 agc cgt ggc gcc aag cag tgg gtc gag ggt gcg gac gaa aat gcc ttg 2563 Ser Arg Gly Ala Lys Gln Trp Val Glu Gly Ala Asp Glu Asn Ala Leu 395 400 405 gcc atg ggt atg caa ccg cag ctc agc ggg gtc aag acc gag gac gag 2611 Ala Met Gly Met Gln Pro Gln Leu Ser Gly Val Lys Thr Glu Asp Glu 410 415 420 ggc ttg ttt gtg cgc cag cat gcg cac tgg gcc caa agc ctg cag cgt 2659 Gly Leu Phe Val Arg Gln His Ala His Trp Ala Gln Ser Leu Gln Arg 425 430 435 440 gca atc gag cgc gaa cag caa ggg ctg ata gcc agc gac tgt gag gtg 2707 Ala Ile Glu Arg Glu Gln Gln Gly Leu Ile Ala Ser Asp Cys Glu Val 445 450 455 ctg cca tg agc ctt gcc cgg gac cac ctg ctg gat ttt ctt tac cgt 2754 Leu Pro Ser Leu Ala Arg Asp His Leu Leu Asp Phe Leu Tyr Arg 5 10 gaa gcg cgc ctg ctc gac gac cgc caa tgg gat gaa tgg ctg gcc tgc 2802 Glu Ala Arg Leu Leu Asp Asp Arg Gln Trp Asp Glu Trp Leu Ala Cys 15 20 25 30 tat tcg ccc aag gcc gag ttc tgg atg ccc gcc tgg gac gat cac gac 2850 Tyr Ser Pro Lys Ala Glu Phe Trp Met Pro Ala Trp Asp Asp His Asp 35 40 45 act ctt acc gaa gac ccg cag cgc gaa atc tcg ctg atc tac tac ccc 2898 Thr Leu Thr Glu Asp Pro Gln Arg Glu Ile Ser Leu Ile Tyr Tyr Pro 50 55 60 aac cgt gac ggc ctg gaa gac cgc atc ttt cgc atc aag act gag cgc 2946 Asn Arg Asp Gly Leu Glu Asp Arg Ile Phe Arg Ile Lys Thr Glu Arg 65 70 75 tcc agc gcc agc acg ccc gag ccg cgc acc gtg cac atg ctg tgc aac 2994 Ser Ser Ala Ser Thr Pro Glu Pro Arg Thr Val His Met Leu Cys Asn 80 85 90 ctc gaa gtg ctg gcc gac gac ggc gcg cag gtg gac ctg cgt ttc aac 3042 Leu Glu Val Leu Ala Asp Asp Gly Ala Gln Val Asp Leu Arg Phe Asn 95 100 105 110 tgg cac acc ctc agc cac cgc tac aaa acc acc gac agt tat ttc ggt 3090 Trp His Thr Leu Ser His Arg Tyr Lys Thr Thr Asp Ser Tyr Phe Gly 115 120 125 acc tcc ttc tat cgc ctc gac atc cgt gcc gag cag ccg ttg ata acg 3138 Thr Ser Phe Tyr Arg Leu Asp Ile Arg Ala Glu Gln Pro Leu Ile Thr 130 135 140 cgc aag aag gtg gtg ctg aaa aac gat tac atc cac cag gtc atc gac 3186 Arg Lys Lys Val Val Leu Lys Asn Asp Tyr Ile His Gln Val Ile Asp 145 150 155 atc tac cat atc tgaggacacc gcc atg acg tat gcc atc gcc ttg aac 3235 Ile Tyr His Ile Met Thr Tyr Ala Ile Ala Leu Asn 160 1 5 ttc gag gat gga gtg acc cgc ttc atc gac tgc aag gtg gga gaa aag 3283 Phe Glu Asp Gly Val Thr Arg Phe Ile Asp Cys Lys Val Gly Glu Lys 10 15 20 gtg ctc gat gcg gcc ttc cgc caa cgc atc aac ctg ccc atg gac tgc 3331 Val Leu Asp Ala Ala Phe Arg Gln Arg Ile Asn Leu Pro Met Asp Cys 25 30 35 40 tcg gac ggc gtg tgc ggc acc tgc aaa tgc cgc tgt gaa acc ggc gcc 3379 Ser Asp Gly Val Cys Gly Thr Cys Lys Cys Arg Cys Glu Thr Gly Ala 45 50 55 tac gac ctg ggc gac gac ttt atc gac gac gcc ctg agc gcc gac gaa 3427 Tyr Asp Leu Gly Asp Asp Phe Ile Asp Asp Ala Leu Ser Ala Asp Glu 60 65 70 gcg cag gcg cgc cgg gtg ctg acc tgc caa atg gtg ccg cag tcc gac 3475 Ala Gln Ala Arg Arg Val Leu Thr Cys Gln Met Val Pro Gln Ser Asp 75 80 85 tgc gtg atc gcc gtg ccg gtg ccg tcc agc gcc tgc aag acc ggc acc 3523 Cys Val Ile Ala Val Pro Val Pro Ser Ser Ala Cys Lys Thr Gly Thr 90 95 100 acg cac ttt gcc gcg acg ctg gcc ggc atc acc cga cat gcc gat gcg 3571 Thr His Phe Ala Ala Thr Leu Ala Gly Ile Thr Arg His Ala Asp Ala 105 110 115 120 gcg ctg gag gtg agt ttc gaa ctg gac cag gcg ccg gta ttc ctg ccc 3619 Ala Leu Glu Val Ser Phe Glu Leu Asp Gln Ala Pro Val Phe Leu Pro 125 130 135 ggc cag tac gtg aat atc agc gtg ccc gac agt ggg cag act cgt gct 3667 Gly Gln Tyr Val Asp Ile Ser Val Pro Asp Ser Gly Gln Thr Arg Ala 140 145 150 tac tcc ttc agc agt ccc ccg ggc gac ccg cgc gcc agc ttc ctg atc 3715 Tyr Ser Phe Ser Ser Pro Pro Gly Asp Pro Arg Ala Ser Phe Leu Ile 155 160 165 aag cac gtg ccc ggc ggg ttg atg agc ggt tgg ctc gag cgc gcc cag 3763 Lys His Val Pro Gly Gly Leu Met Ser Glu Trp Leu Glu Arg Ala Gln 170 175 180 ccg ggc gac agc gtg gcg atc acc ggc cca ctg ggg agt ttc tac ctg 3811 Pro Gly Asp Ser Val Ala Ile Thr Gly Pro Leu Gly Ser Phe Tyr Leu 185 190 195 200 cgt gag gtg gcg cgg ccg ctg ctg tta ctg gcc ggt ggt acc ggc ctg 3859 Arg Glu Val Ala Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ala Gly Gly Thr Gly Leu 205 210 215 gcg ccg ttc ctg tcg atg ctt gaa gtg ctc gcg cag cgc cag gaa acc 3907 Ala Pro Phe Leu Ser Met Leu Glu Val Leu Ala Gln Arg Gln Glu Thr 220 225 230 cgc ccg atc cgg ttg atc tac ggc gta acg cgg gat cag gac ctg gtg 3955 Arg Pro Ile Arg Leu Ile Tyr Gly Val Thr Arg Asp Gln Asp Leu Val 235 240 245 atg att gag gcg ttg cag gct ttt acc gcg cgt ttg ccc gac ttc aac 4003 Met Ile Glu Ala Leu Gln Ala Phe Thr Ala Arg Leu Pro Asp Phe Asn 250 255 260 ctg gtg acc tgc gtg gct gat ccg cac acc act cac ccg cgc cag ggc 4051 Leu Val Thr Cys Val Ala Asp Pro His Thr Thr His Pro Arg Gln Gly 265 270 275 280 tat gtg acc cag cac atg gcc gac gaa gcc ctc aat ggc ggc gat gtc 4099 Tyr Val Thr Gln His Met Ala Asp Glu Ala Leu Asn Gly Gly Asp Val 285 290 295 gac gtg tac ctg tgc ggc ccg ccg ccg atg gtc gat gcg gtg cgc gag 4147 Asp Val Tyr Leu Cys Gly Pro Pro Pro Met Val Asp Ala Val Arg Glu 300 305 310 cac ttc aag cag caa agc gtg acc ccg gcc agc ttc cat tac gag aaa 4195 His Phe Lys Gln Gln Ser Val Thr Pro Ala Ser Phe His Tyr Glu Lys 315 320 325 ttc acc cct aac gcc gtc gcc acg tgc gat gcc gcc t gag gac tgc cgc 4244 Phe Thr Pro Asn Ala Val Ala Thr Cys Asp Ala Ala Glu Asp Cys Arg 330 335 340 5 atg act caa cgg ttt aac aac aag gtc gcg ctg gtt acc ggc gct gcg 4292 Met Thr Gln Arg Phe Asn Asn Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Ala 10 15 20 caa ggc atc ggc cga cgt gtc gcc gaa cgc ttg ctg gag gag ggg gcc 4340 Gln Gly Ile Gly Arg Arg Val Ala Glu Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ala 25 30 35 tgg ctg gtc gcg gtg gat cgc tcc gag ctc gtg cat gaa ttg cag cat 4388 Trp Leu Val Ala Val Asp Arg Ser Glu Leu Val His Glu Leu Gln His 40 45 50 55 gag cga gcg cta ctg ctg acc gcc gac ctg gaa caa tac agc gag tgc 4436 Glu Arg Ala Leu Leu Leu Thr Ala Asp Leu Glu Gln Tyr Ser Glu Cys 60 65 70 gca cgg gta atg gcc gcc gcc acg gcg cgt ttc ggg cgc ata gac gtg 4484 Ala Arg Val Met Ala Ala Ala Thr Ala Arg Phe Gly Arg Ile Asp Val 75 80 85 ctg gtc aat aac gtc ggc ggg acc atc tgg gcc aag cct ttt gag cat 4532 Leu Val Asn Asn Val Gly Gly Thr Ile Trp Ala Lys Pro Phe Glu His 90 95 100 tat gcc gag gct gaa atc gag gcc gaa gtg cgc cgc tcg ctg ttc cct 4580 Tyr Ala Glu Ala Glu Ile Glu Ala Glu Val Arg Arg Ser Leu Phe Pro 105 110 115 acg ttg tgg tgc tgc cat tgc gtg ctg ccc tat atg ctg gag cag ggc 4628 Thr Leu Trp Cys Cys His Cys Val Leu Pro Tyr Met Leu Glu Gln Gly 120 125 130 135 gcg ggc gcg atc gtc aac gtg tct tcc gtg gcc acg cgc ggg gtc aat 4676 Ala Gly Ala Ile Val Asn Val Ser Ser Val Ala Thr Arg Gly Val Asn 140 145 150 cgc gtg ccc tat ggc gca gcc aag ggc ggc gtg aat gcc ttg acg gcc 4724 Arg Val Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Gly Gly Val Asn Ala Leu Thr Ala 155 160 165 tgc ctg gcc ctg gag act gca ggc agc ggg att cgc gtc aac gcc acc 4772 Cys Leu Ala Leu Glu Thr Ala Gly Ser Gly Ile Arg Val Asn Ala Thr 170 175 180 gcg ccc ggc ggc acc gag gca ccg cca cgg cgc atc ccg cgc aac agc 4820 Ala Pro Gly Gly Thr Glu Ala Pro Pro Arg Arg Ile Pro Arg Asn Ser 185 190 195 cag ccg cag agc gag cag gaa cgt gtg tgg tac cag cag atc gtc gac 4868 Gln Pro Gln Ser Glu Gln Glu Arg Val Trp Tyr Gln Gln Ile Val Asp 200 205 210 215 cag acc ctc gag agc agc tcg atg aaa cgc tac ggc agc atc gac gaa 4916 Gln Thr Leu Glu Ser Ser Ser Met Lys Arg Tyr Gly Ser Ile Asp Glu 220 225 230 caa gct ggc gca att ctg ttc ctg gcc tgc gac gag gcc tcc tac atc 4964 Gln Ala Gly Ala Ile Leu Phe Leu Ala Cys Asp Glu Ala Ser Tyr Ile 235 240 245 acc ggc gtg acc ttg ccg gtg ggc ggc ggc gac ctc ggc taa 5006 Thr Gly Val Thr Leu Pro Val Gly Gly Gly Asp Leu Gly 250 255 260 <210> 2 <211> 335 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> INIT_MET <222> 1..1 <223> Alternative putative initiator methionine for BenR, giving Met1- >Arg335 as the amino acid sequence of the Pben activator protein <220> <221> INIT_MET <222> 21..21 <223> Putative initiator methionine of BenR, giving Met21->Arg335 as the amino acid sequence of the Pben activator protein <220> <221> VARIANT <222> 152..152 <223> A mutation of Ser152->Asn152 <400> 2 Met Asp Ala Pro Leu Pro Lys Arg Gln Pro Glu Pro Asn Asn Asp Lys 1 5 10 15 Arg Val Ala Thr Met Thr Val Leu Leu Ser Glu Arg Ser Gln Ile Phe 20 25 30 Gln Gly Ala Asp Ala Tyr Ala Val Ser Asp Tyr Val Asn Gln His Val 35 40 45 Gly Ser His Cys Ile Arg Leu Pro Pro Arg Gly Gln Pro Arg Ala Ser 50 55 60 Ile Ser His Arg Thr Phe Ala Ser Leu Asp Leu Cys Arg Ile Ser Tyr 65 70 75 80 Gly Ala Pro Val Arg Val Thr Ser Val Ala Leu Glu Thr Ile Tyr His 85 90 95 Leu Gln Ile Leu Leu Ser Gly His Cys Arg Ser Asn Ser Arg Gly Glu 100 105 110 Asp Asp Val Phe Gly Pro Gly Glu Ile Leu Leu Ile Asn Pro Asp Asp 115 120 125 Pro Val Asp Leu Thr Tyr Ser Ala Asp Cys Glu Lys Phe Ile Ile Lys 130 135 140 Leu Pro Val Arg Leu Leu Glu Ser Ala Cys Leu Glu Gln His Trp Ser 145 150 155 160 Leu Pro Arg Ala Gly Val Arg Phe Thr Thr Ala Arg His Ala Leu Ser 165 170 175 Glu Met Gly Gly Phe Leu Pro Leu Leu Gly Leu Ile Cys His Glu Ala 180 185 190 Glu Asn Ala Ala Glu Pro His Met Gln Gly Leu Tyr Glu Arg Ile Val 195 200 205 Ala Asn Lys Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ser Asn Val Ser Arg Val Thr 210 215 220 Pro Arg Ala Ala His Gly Gly Gly Phe Glu Ala Val His Glu Phe Ile 225 230 235 240 Gln Gln His Leu Gly Asp Asp Ile Ser Val Glu Gln Leu Met Ala Val 245 250 255 Ala Asn Val Ser Glu Arg Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Glu Arg Gln Val 260 265 270 Gly Leu Ser Pro Arg Asp Tyr Val Cys Arg Cys Lys Leu Glu Arg Val 275 280 285 His Ala Arg Leu Gln Leu Ser Ser Thr Arg Ser Val Thr Glu Val Ala 290 295 300 Leu Asp His Gly Phe Met His Leu Gly Arg Phe Ser Glu Ala Tyr Arg 305 310 315 320 Lys Arg Phe Gly Glu Leu Pro Ser Gln Thr Trp Lys Arg His Arg 325 330 335 <210> 3 <211> 458 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> misc_feature <222> 1..458 <223> BenA expression product, benzoate 1,2-dioxygenase alpha subunit <400> 3 Met Ile Ser Thr Pro Asp Arg Leu Ala Cys Gln Leu Arg Glu Ser Val 1 5 10 15 Gln Glu Asp Pro Ala Thr Gly Val Phe Arg Cys Arg Arg Asp Ile Phe 20 25 30 Thr Asp Pro Asp Leu Phe Ala Leu Glu Met Lys His Ile Phe Glu Gly 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Leu Ala His Glu Ser Gln Val Pro Gln Ile Asn Asp 50 55 60 Tyr Phe Thr Thr Trp Ile Gly Arg Gln Pro Val Val Ile Thr Arg Asp 65 70 75 80 Lys His Gly Ala Leu His Gly Leu Val Asn Ala Cys Ala His Arg Gly 85 90 95 Ala Met Leu Cys Arg Arg Lys Gln Gly Asn Lys Gly Ser Phe Thr Cys 100 105 110 Pro Phe His Gly Trp Thr Phe Ser Asn Ala Gly Lys Leu Leu Lys Val 115 120 125 Lys Asp Ala Lys Thr Gly Ala Tyr Pro Asp Ser Phe Asp Cys Asp Gly 130 135 140 Ser His Asp Leu Lys Arg Leu Ala Arg Phe Glu Asn Tyr Arg Gly Phe 145 150 155 160 Leu Phe Ala Ser Leu Ser Asp Ala Val Pro Glu Leu Ser Asp Tyr Leu 165 170 175 Gly Glu Thr Arg Val Ile Ile Asp Gln Met Val Asp Gln Ala Pro Leu 180 185 190 Gly Leu Glu Val Leu Arg Gly Ser Ser Ser Tyr Val Tyr Asp Gly Asn 195 200 205 Trp Lys Leu Gln Ile Glu Asn Gly Ala Asp Gly Tyr His Val Ser Ser 210 215 220 Val His Trp Asn Tyr Ser Ala Thr Met Gly Arg Arg Asn Tyr Asp Ala 225 230 235 240 Glu Gly Thr Arg Thr Val Asp Ala Asn Gly trp Ser Lys Ser Leu Gly 245 250 255 Gly Val Tyr Ala Phe Asp His Gly His Ile Leu Leu Trp Thr Arg Leu 260 265 270 Leu Asn Pro Gln Val Arg Pro Val His Ala His Arg Glu Ala Leu Ala 275 280 285 Glu Arg Leu Gly Gln Ala Arg Ala Asp Phe Ile Val Asp Gln Thr Arg 290 295 300 Asn Leu Cys Leu Tyr Pro Asn Val Tyr Leu Met Asp Gln Phe Ser Thr 305 310 315 320 Gln Ile Arg Val Val Arg Pro Leu Ala Val Asp Lys Thr Glu Val Thr 325 330 335 Ile Tyr Cys Met Ala Pro Ile Gly Glu Ser Ala Gln Glu Arg Ala Thr 340 345 350 Arg Ile Arg Gln Tyr Glu Asp Phe Phe Asn Val Ser Gly Met Gly Thr 355 360 365 Pro Asp Asp Leu Glu Glu Phe Arg Ala Cys Gln Thr Gly Tyr Gln Gly 370 375 380 Ala Ser Thr Leu Trp Asn Asp Leu Ser Arg Gly Ala Lys Gln Trp Val 385 390 395 400 Glu Gly Ala Asp Glu Asn Ala Leu Ala Met Gly Met Gln Pro Gln Leu 405 410 415 Ser Gly Val Lys Thr Glu Asp Glu Gly Leu Phe Val Arg Gln His Ala 420 425 430 His Trp Ala Gln Ser Leu Gln Arg Ala Ile Glu Arg Glu Gln Gln Gly 435 440 445 Leu Ile Ala Ser Asp Cys Glu Val Leu Pro 450 455 <210> 4 <211> 162 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> misc_feature <222> 1..162 <223> BenB expression product, benzoate 1,2-dioxygenase beta subunit <400> 4 Met Ser Leu Ala Arg Asp His Leu Leu Asp Phe Leu Tyr Arg Glu Ala 1 5 10 15 Arg Leu Leu Asp Asp Arg Gln Trp Asp Glu Trp Leu Ala Cys Tyr Ser 20 25 30 Pro Lys Ala Glu Phe Trp Met Pro Ala Trp Asp Asp His Asp Thr Leu 35 40 45 Thr Glu Asp Pro Gln Arg Glu Ile Ser Leu Ile Tyr Tyr Pro Asn Arg 50 55 60 Asp Gly Leu Glu Asp Arg Ile Phe Arg Ile Lys Thr Glu Arg Ser Ser 65 70 75 80 Ala Ser Thr Pro Glu Pro Arg Thr Val His Met Leu Cys Asn Leu Glu 85 90 95 Val Leu Ala Asp Asp Gly Ala Gln Val Asp Leu Arg Phe Asn Trp His 100 105 110 Thr Leu Ser His Arg Tyr Lys Thr Thr Asp Ser Tyr Phe Gly Thr Ser 115 120 125 Phe Tyr Arg Leu Asp Ile Arg Ala Glu Gln Pro Leu Ile Thr Arg Lys 130 135 140 Lys Val Val Leu Lys Asn Asp Tyr Ile His Gln Val Ile Asp Ile Tyr 145 150 155 160 His Ile <210> 5 <211> 340 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> misc_feature <222> 1..340 <223> BenC expression product, benzoate 1,2-dioxygenase electron transfer component <400> 5 Met Thr Tyr Ala Ile Ala Leu Asn Phe Glu Asp Gly Val Thr Arg Phe 1 5 10 15 Ile Asp Cys Lys Val Gly Glu Lys Val Leu Asp Ala Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Arg Ile Asn Leu Pro Met Asp Cys Ser Asp Gly Val Cys Gly Thr Cys 35 40 45 Lys Cys Arg Cys Glu Thr Gly Ala Tyr Asp Leu Gly Asp Asp Phe Ile 50 55 60 Asp Asp Ala Leu Ser Ala Asp Glu Ala Gln Ala Arg Arg Val Leu Thr 65 70 75 80 Cys Gln Met Val Pro Gln Ser Asp Cys Val Ile Ala Val Pro Val Pro 85 90 95 Ser Ser Ala Cys Lys Thr Gly Thr Thr His Phe Ala Ala Thr Leu Ala 100 105 110 Gly Ile Thr Arg His Ala Asp Ala Ala Leu Glu Val Ser Phe Glu Leu 115 120 125 Asp Gln Ala Pro Val Phe Leu Pro Gly Gln Tyr Val Asp Ile Ser Val 130 135 140 Pro Asp Ser Gly Gln Thr Arg Ala Tyr Ser Phe Ser Ser Pro Pro Gly 145 150 155 160 Asp Pro Arg Ala Ser Phe Leu Ile Lys His Val Pro Gly Gly Leu Met 165 170 175 Ser Glu Trp Leu Glu Arg Ala Gln Pro Gly Asp Ser Val Ala Ile Thr 180 185 190 Gly Pro Leu Gly Ser Phe Tyr Leu Arg Glu Val Ala Arg Pro Leu Leu 195 200 205 Leu Leu Ala Gly Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Leu Ser Met Leu Glu 210 215 220 Val Leu Ala Gln Arg Gln Glu Thr Arg Pro Ile Arg Leu Ile Tyr Gly 225 230 235 240 Val Thr Arg Asp Gln Asp Leu Val Met Ile Glu Ala Leu Gln Ala Phe 245 250 255 Thr Ala Arg Leu Pro Asp Phe Asn Leu Val Thr Cys Val Ala Asp Pro 260 265 270 His Thr Thr His Pro Arg Gln Gly Tyr Val Thr Gln His Met Ala Asp 275 280 285 Glu Ala Leu Asn Gly Gly Asp Val Asp Val Tyr Leu Cys Gly Pro Pro 290 295 300 Pro Met Val Asp Ala Val Arg Glu His Phe Lys Gln Gln Ser Val Thr 305 310 315 320 Pro Ala Ser Phe His Tyr Glu Lys Phe Thr Pro Asn Ala Val Ala Thr 325 330 335 Cys Asp Ala Ala 340 <210> 6 <211> 260 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> misc_feature <222> 1..260 <223> BenD expression product, cis-1,2-dihydroxycyclohexa-3,5-diene-1- carboxylate dehydrogenase <400> 6 Met Pro Pro Glu Asp Cys Arg Met Thr Gln Arg Phe Asn Asn Lys Val 1 5 10 15 Ala Leu Val Thr Gly Ala Ala Gln Gly Ile Gly Arg Arg Val Ala Glu 20 25 30 Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ala Trp Leu Val Ala Val Asp Arg Ser Glu 35 40 45 Leu Val His Glu Leu Gln His Glu Arg Ala Leu Leu Leu Thr Ala Asp 50 55 60 Leu Glu Gln Tyr Ser Glu Cys Ala Arg Val Met Ala Ala Ala Thr Ala 65 70 75 80 Arg Phe Gly Arg Ile Asp Val Leu Val Asn Asn Val Gly Gly Thr Ile 85 90 95 Trp Ala Lys Pro Phe Glu His Tyr Ala Glu Ala Glu Ile Glu Ala Glu 100 105 110 Val Arg Arg Ser Leu Phe Pro Thr Leu Trp Cys Cys His Cys Val Leu 115 120 125 Pro Tyr Met Leu Glu Gln Gly Ala Gly Ala Ile Val Asn Val Ser Ser 130 135 140 Val Ala Thr Arg Gly Val Asn Arg Val Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Gly 145 150 155 160 Gly Val Asn Ala Leu Thr Ala Cys Leu Ala Leu Glu Thr Ala Gly Ser 165 170 175 Gly Ile Arg Val Asn Ala Thr Ala Pro Gly Gly Thr Glu Ala Pro Pro 180 185 190 Arg Arg Ile Pro Arg Asn Ser Gln Pro Gln Ser Glu Gln Glu Arg Val 195 200 205 Trp Tyr Gln Gln Ile Val Asp Gln Thr Leu Glu Ser Ser Ser Met Lys 210 215 220 Arg Tyr Gly Ser Ile Asp Glu Gln Ala Gly Ala Ile Leu Phe Leu Ala 225 230 235 240 Cys Asp Glu Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Val Thr Leu Pro Val Gly Gly 245 250 255 Gly Asp Leu Gly 260 <210> 7 <211> 4330 <212> DNA <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> misc_feature <222> 1..4330 <223> Anthranilate Operon controlling expression of antABC <220> <221> misc_signal <222> 1..3 <223> Anticodon of stop codon for the CDS of AntR <220> <221> CDS <222> 4..993 <223> Antisense strand of ORF encoding AntR <220> <221> variation <222> 192..192 <223> Mutation to A235 from native C235; resulting in the anticodon mutation CGC->CGA shown at 233..235, thus codon mutation GCG->TCG and amino acid mutation of Ala268 to Ser268 <220> <221> misc_signal <222> 1130..1237 <223> Approximate region estimated to contain the AntR binding site <220> <221> promoter <222> 1239..1274 <223> Putative promoter (Pant) from anthranilate operon (antABC) <220> <221> -35_signal <222> 1239..1244 <223> Putative -35 region of Pant promoter <220> <221> -10_signal <222> 1264..1268 <223> Putative -10 region of Pant promoter <220> <221> misc_feature <222> 1264..1268 <223> Substitution mutation of Pant -10 region by tataat to form -10con mutants <220> <221> misc_feature <222> 1269..1269 <223> A deletion of g1269 found in mutant promoter variants herein <220> <221> misc_signal <222> 1274..1274 <223> Putative transcription start site under control of Pant <220> <221> misc_feature <222> 1278..1278 <223> A deletion of t1278 found in mutant promoter variants herein <220> <221> misc_signal <222> 1305..1307 <223> Putative native translation initiator codon <220> <221> CDS <222> 1305..2693 <223> AntA open reading frame encoding anthranilate dioxygenase large subunit <220> <221> misc_signal <222> 2694..2696 <223> AntA stop codon <220> <221> CDS <222> 2696..3184 <223> AntB open reading frame encoding anthranilate dioxygenase small subunit <220> <221> misc_signal <222> 3185..3187 <223> AntB stop codon <220> <221> CDS <222> 3323..4327 <223> AntC open reading frame encoding anthranilate dioxygenase reductase <220> <221> misc_signal <222> 4328..4330 <223> AntC stop codon <400> 7 tca agt aat gcg cag gcg ctt gcg ctg caa tgt ctg gct ggg cga ctc 48 Thr Ile Arg Leu Arg Lys Arg Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Glu -330 -325 -320 atc gaa cag ctt gcg gta ctc cgc cga aaa ccg ccc caa atg cgt aaa 96 Asp Phe Leu Lys Arg Tyr Glu Ala Ser Phe Arg Gly Leu His Thr Phe -315 -310 -305 -300 ccc cca acc cag ggc gat ttc aga gat ggt gcg gat cga gcc ctg ctc 144 Gly Trp Gly Leu Ala Ile Glu Ser Ile Thr Arg Ile Ser Gly Gln Glu -295 -290 -285 cag aat ttc ttg gcg cac cgc ccc caa ccg atg ctt ctt caa ata cgc 192 Leu Ile Glu Gln Arg Val Ala Gly Leu Arg His Lys Lys Leu Tyr Ala -280 -275 -270 cat ggg cga cag tgc gaa gta ctt gcg aaa cgc atc gaa cag ttt gaa 240 Met Pro Ser Leu Ala Phe Tyr Lys Arg Phe Ala Asp Phe Leu Lys Phe -265 -260 -255 acg cga cac gcc cgc cgc cgc ttc cag gtc ttc cag gtg cag cgc ttc 288 Arg Ser Val Gly Ala Ala Ala Glu Leu Asp Glu Leu His Leu Ala Glu -250 -245 -240 acg ggc gtt gtc gtg gat aaa ttg ccg cgc gcg gat cag gta gtg cgg 336 Arg Ala Asn Asp His Ile Phe Gln Arg Ala Arg Ile Leu Tyr His Pro -235 -230 -225 -220 cag ttt cac ccc cag cac gtc gcg cag ttc ttc gga gta gtt att cgg 384 Leu Lys Val Gly Leu Val Asp Arg Leu Glu Glu Ser Tyr Asn Asn Pro -215 -210 -205 ttg ggc cag gat cag gcc ctt gat cag cga gct ttc cag gtc gcg agt 432 Gln Ala Leu Ile Leu Gly Lys Ile Leu Ser Ser Glu Leu Asp Arg Thr -200 -195 -190 aaa cgc cgc ctg ctc gta cag ttc gct gct gcg ctc cag ttc ggc gat 480 Phe Ala Ala Gln Glu Tyr Leu Glu Ser Ser Arg Glu Leu Glu Ala Ile -185 -180 -175 gaa ata acg cgc cat gcg cca cca cga agc cgg tgc tcc gtc cac agc 528 Phe Tyr Arg Ala Met Arg Trp Trp Ser Ala Pro Ala Gly Asp Val Ala -170 -165 -160 atc cat cac cga ctc aaa gcg cag cgg cgc atc aat ggg ccg ttg cag 576 Asp Met Val Ser Glu Phe Arg Leu Pro Ala Asp Ile Pro Arg Gln Leu -155 -150 -145 -140 caa acc ttc cag cga ctc gct cat cgc cgc acg ggt gat tac cac ctg 624 Leu Gly Glu Leu Ser Glu Ser Met Ala Ala Arg Thr Ile Val Val Gln -135 -130 -125 caa ctt gcg gca gtc acc gga aat cgc cag cac ctg atg ctc att ggg 672 Leu Lys Arg Cys Asp Gly Ser Ile Ala Leu Val Gln His Glu Asn Pro -120 -115 -110 cga aat gat cac gcc ttg gtc gcg gtt gga act gag acg ttc acc gtt 720 Ser Ile Ile Val Gly Gln Asp Arg Asn Ser Ser Leu Arg Glu Gly Asn -105 -100 -95 ctt gct cag ctc ctg ctc gcc cac cag tgg cag gct caa gct gta gct 768 Lys Ser Leu Glu Gln Glu Gly Val Leu Pro Leu Ser Leu Ser Tyr Ser -90 -85 -80 gct gaa gtg ctc ggc gtc ttc gat gtc gat ggt cac atc agt gcc gta 816 Ser Phe His Glu Ala Asp Glu Ile Asp Ile Thr Val Asp Thr Gly Tyr -75 -70 -65 -60 ctc gat cac gcc cag ggt ggt ggc gcg gga ttt gaa cac gtt ggc gct 864 Glu Ile Val Gly Leu Thr Thr Ala Arg Ser Lys Phe Val Asn Ala Ser -55 -50 -45 gtg gtg aaa gcg cag gcg ctc ggg ggt tgc cgt cgc cag gcg atg ggg 912 His His Phe Arg Leu Arg Glu Pro Thr Ala Thr Ala Leu Arg His Pro -40 -35 -30 ccc gca gat gcc gga cat cca gct gcg cgc gcc ttc cag gtc gaa gcg 960 Gly Cys Ile Gly Ser Met Trp Ser Arg Ala Gly Glu Leu Asp Phe Arg -25 -20 -15 ttg aat atg aat atc gcg tgt ctg act agt cat cagggtgcac ccacggcggt 1013 Gln Ile His Ile Asp Arg Thr Gln Ser Thr Met -10 -5 -1 taggcgtttg cgcgctctga cggcgcgtcg ttgaacctcg acagcaagtt ccaggccacg 1073 ccagtgcagt tctcactggg tggatagcaa cggtcgacta tgtggataaa ccccagagtt 1133 ttgcgaccat cgcccgccat cacagtagcg catgccgtca ccggcgcgca ccgtcatggg 1193 tatttgccgc ccaactttgc ggcctacgtt cccccattaa gcggatagcc cgccaccgca 1253 tcgcagccgc ttaatggctc accgtttagc catgatcaaa aggtgcctcc c atg agt 1310 Met Ser 1 ggt gca aga acc gtc gag caa tgg aaa tcc ttt atc gaa agc tgc ctg 1358 Gly Ala Arg Thr Val Glu Gln Trp Lys Ser Phe Ile Glu Ser Cys Leu 5 10 15 gac ttt cgc ccg gcg gat gaa gtg ttc cgc atc gcc cgc gac atg ttc 1406 Asp Phe Arg Pro Ala Asp Glu Val Phe Arg Ile Ala Arg Asp Met Phe 20 25 30 acc gag ccc gag ttg ttc gac ctg gag atg gag ctg atc ttc gag aag 1454 Thr Glu Pro Glu Leu Phe Asp Leu Glu Met Glu Leu Ile Phe Glu Lys 35 40 45 50 aac tgg atc tac gcc tgc cac gaa agc gaa ctg gcc aat aac cac gac 1502 Asn Trp Ile Tyr Ala Cys His Glu Ser Glu Leu Ala Asn Asn His Asp 55 60 65 ttc gtg acg atg cgc gcc ggc cgc cag ccg atg atc atc acc cgt gac 1550 Phe Val Thr Met Arg Ala Gly Arg Gln Pro Met Ile Ile Thr Arg Asp 70 75 80 ggc gaa ggc cga ctc aac gcg ttg atc aac gcc tgc cag cat cgc ggt 1598 Gly Glu Gly Arg Leu Asn Ala Leu Ile Asn Ala Cys Gln His Arg Gly 85 90 95 acc acc ctc acc cgc gtg ggc aag ggt aac cag tcc acc ttc acc tgc 1646 Thr Thr Leu Thr Arg Val Gly Lys Gly Asn Gln Ser Thr Phe Thr Cys 100 105 110 ccg ttc cac gcc tgg tgc tac aag agc gat ggc cga ctg gta aag gtc 1694 Pro Phe His Ala Trp Cys Tyr Lys Ser Asp Gly Arg Leu Val Lys Val 115 120 125 130 aag gcg ccg ggg gaa tac ccg gaa ggt ttc gac aag gcc acc cgc ggc 1742 Lys Ala Pro Gly Glu Tyr Pro Glu Gly Phe Asp Lys Ala Thr Arg Gly 135 140 145 ctg aaa aaa gcg cgc atc gaa agc tac agg ggc ttt gtg ttt atc agc 1790 Leu Lys Lys Ala Arg Ile Glu Ser Tyr Arg Gly Phe Val Phe Ile Ser 150 155 160 ctg gac gtg aac ggc acc aac agc ctg gag gac ttc ctg ggc gat gcc 1838 Leu Asp Val Asn Gly Thr Asn Ser Leu Glu Asp Phe Leu Gly Asp Ala 165 170 175 aaa gtg ttc ttc gac atg atg gtg gcg caa tcg gcc acc ggt gag ctg 1886 Lys Val Phe Phe Asp Met Met Val Ala Gln Ser Ala Thr Gly Glu Leu 180 185 190 gaa gtg ctg ccg ggc aag tcc gcc tac acc tac gac ggc aac tgg aag 1934 Glu Val Leu Pro Gly Lys Ser Ala Tyr Thr Tyr Asp Gly Asn Trp Lys 195 200 205 210 ctg caa aac gaa aac ggc ctg gac ggt tat cac gtc agc acc gtg cac 1982 Leu Gln Asn Glu Asn Gly Leu Asp Gly Tyr His Val Ser Thr Val His 215 220 225 tac aac tac gtg gcc acc gtg cag cat cgc gag cag gtc aac acc gaa 2030 Tyr Asn Tyr Val Ala Thr Val Gln His Arg Glu Gln Val Asn Thr Glu 230 235 240 aac ggc gca ggt tcc agc acg acg ttg gac tac agc aag ctc ggc gcc 2078 Asn Gly Ala Gly Ser Ser Thr Thr Leu Asp Tyr Ser Lys Leu Gly Ala 245 250 255 ggc gac gcc aat acc gac gac ggc tgg ttc gcc ttc aac aac ggc cac 2126 Gly Asp Ala Asn Thr Asp Asp Gly Trp Phe Ala Phe Asn Asn Gly His 260 265 270 agc gtg ttg ttt agc gac atg ccc aac ccc agc gtg cgc tcc ggc tac 2174 Ser Val Leu Phe Ser Asp Met Pro Asn Pro Ser Val Arg Ser Gly Tyr 275 280 285 290 gcc acc atc atg ccg cgc ctg gta gaa gaa cac ggc cag cag aag gcc 2222 Ala Thr Ile Met Pro Arg Leu Val Glu Glu His Gly Gln Gln Lys Ala 295 300 305 gag tgg atg atg cac cgc ctg cgc aac ctg aat atc tac ccc agc ctg 2270 Glu Trp Met Met His Arg Leu Arg Asn Leu Asn Ile Tyr Pro Ser Leu 310 315 320 ttt ttc ctc gac cag atc agc tcg cag ttg cgc atc atc cgc ccg gtg 2318 Phe Phe Leu Asp Gln Ile Ser Ser Gln Leu Arg Ile Ile Arg Pro Val 325 330 335 gcc tgg aac aag acc gag atc atc agc cag tgc ctg ggg gtt aag ggc 2366 Ala Trp Asn Lys Thr Glu Ile Ile Ser Gln Cys Leu Gly Val Lys Gly 340 345 350 gag tcc gac gcc gac cgc gaa aac cgg att cgt cag ttc gaa gac ttc 2414 Glu Ser Asp Ala Asp Arg Glu Asn Arg Ile Arg Gln Phe Glu Asp Phe 355 360 365 370 ttc aac gtt tca ggc atg ggc acg ccc gat gac ctg gtg gag ttt cgc 2462 Phe Asn Val Ser Gly Met Gly Thr Pro Asp Asp Leu Val Glu Phe Arg 375 380 385 gaa gcc cag cgt ggc ttt cag ggc cgc ctg gaa cgc tgg agc gac atc 2510 Glu Ala Gln Arg Gly Phe Gln Gly Arg Leu Glu Arg Trp Ser Asp Ile 390 395 400 tca cgg ggc agc cat cgc tgg gag acc ggg ccg acg cca aac agc gag 2558 Ser Arg Gly Ser His Arg Trp Glu Thr Gly Pro Trp Pro Asn Ser Glu 405 410 415 gcc atc ggc atc caa ccg gcg atg acc ggt acc gaa ttc acc cat gaa 2606 Ala Ile Gly Ile Gln Pro Ala Met Thr Gly Thr Glu Phe Thr His Glu 420 425 430 ggc ctg tac gtc aac cag cat cgc aac tgg cag cag ttc ctg cta aag 2654 Gly Leu Tyr Val Asn Gln His Arg Asn Trp Gln Gln Phe Leu Leu Lys 435 440 445 450 ggt ttg gac cag cga gcc ctg gca ctg cgg gag gtg aag tg atg aat 2701 Gly Leu Asp Gln Arg Ala Leu Ala Leu Arg Glu Val Lys Met Asn 455 460 1 gcg caa ttg cag tac cag atc gag cag ttc ttc tat cgc aag tcc gag 2749 Ala Gln Leu Gln Tyr Gln Ile Glu Gln Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Glu 5 10 15 ctg tgc gac gcc cag gac tgg gac gcc tac gtg cag ttg ttc gac ccg 2797 Leu Cys Asp Ala Gln Asp Trp Asp Ala Tyr Val Gln Leu Phe Asp Pro 20 25 30 cag agt gaa ttc cac ctg ccg caa tgg gac tcc gaa cac gtc tac acc 2845 Gln Ser Glu Phe His Leu Pro Gln Trp Asp Ser Glu His Val Tyr Thr 35 40 45 50 caa gac ccc aag cgc gag atg tca ttg atc tac tac gcc aac cgt tcg 2893 Gln Asp Pro Lys Arg Glu Met Ser Leu Ile Tyr Tyr Ala Asn Arg Ser 55 60 65 ggc ctg gaa gac cgt gtg ttc cgc ctg cgc acc ggc aaa gcc gcc tct 2941 Gly Leu Glu Asp Arg Val Phe Arg Leu Arg Thr Glu Lys Ala Ala Ser 70 75 80 gcc acg ccg atg ccg cgc act ttg cac ctg atc aat aac gta cgc att 2989 Ala Thr Pro Met Pro Arg Thr Leu His Leu Ile Asn Asn Val Arg Ile 85 90 95 gcc gag cag gcc gat ggc acg ttg gag gtg cgt ttg aac tgg cac aca 3037 Ala Glu Gln Ala Asp Gly Thr Leu Glu Val Arg Leu Asn Trp His Thr 100 105 110 ttg ttt tat cgc ctg gcc acg tcc gag cag ttt tac ggg cat gcc acg 3085 Leu Phe Tyr Arg Leu Ala Thr Ser Glu Gln Phe Tyr Gly His Ala Thr 115 120 125 130 tac cgc ctc aag cct gcg ggc gac agc tgg ttg atc atg cgc aag cac 3133 Tyr Arg Leu Lys Pro Ala Gly Asp Ser Trp Leu Ile Met Arg Lys His 135 140 145 gcc ttg ttg ctc aac gac acc atc aac tcg gtg ctg gat ttc tac cac 3181 Ala Leu Leu Leu Asn Asp Thr Ile Asn Ser Val Leu Asp Phe Tyr His 150 155 160 ctg taacggtggt gcatcgccct gtaggagcga gcttgctcgc gaaaaacgta 3234 Leu agtacgccgc gttcattcag gatgtcccgc gtcatcgttg acgtttttcg cgagcaaggg 3294 gttcatacct attcacggag ttatgtga atg aat cac aaa gtg gcc ttc agc 3346 Met Asn His Lys Val Ala Phe Ser 1 5 ttt gcc gat ggc aag acc ctg ttc ttc ccg gtg ggc gcc cat gaa atc 3394 Phe Ala Asp Gly Lys Thr Leu Phe Phe Pro Val Gly Ala His Glu Ile 10 15 20 ctc ctg gac gcg gcc ctg cgc aac ggc atc aag atc ccg ctc gat tgc 3442 Leu Leu Asp Ala Ala Leu Arg Asn Gly Ile Lys Ile Pro Leu Asp Cys 25 30 35 40 cgc gaa ggc gtg tgc ggc acc tgc cag ggg cgc tgt gag tcc ggc gag 3490 Arg Glu Gly Val Cys Gly Thr Cys Gln Gly Arg Cys Glu Ser Gly Glu 45 50 55 tac acc cag gac tat gtc gat gag gaa gcc ctc tcc agc ctc gac ctg 3538 Tyr Thr Gln Asp Tyr Val Asp Glu Glu Ala Leu Ser Ser Leu Asp Leu 60 65 70 caa caa cgc aag atg ctc agt tgc caa acc cgg gtg aag tcc gac gcc 3586 Gln Gln Arg Lys Met Leu Ser Cys Gln Thr Arg Val Lys Ser Asp Ala 75 80 85 acg ttt tat ttc gac ttt gac tca agc ctg tgc aac gcc cca ggc ccc 3634 Thr Phe Tyr Phe Asp Phe Asp Ser Ser Leu Cys Asn Ala Pro Gly Pro 90 95 100 gtg cag gtg cgc ggc act gtg agc gcg gtg cag cag gta tcg acc agc 3682 Val Gln Val Arg Gly Thr Val Ser Ala Val Gln Gln Val Ser Thr Ser 105 110 115 120 acc gcc att ttg cag gtg caa ctg gac cag cct ctg gat ttt ttg ccg 3730 Thr Ala Ile Leu Gln Val Gln Leu Asp Gln Pro Leu Asp Phe Leu Pro 125 130 135 ggc caa tac gcg cgt ctg tcg gtg ccc ggc acc gat agc tgg cgc tcc 3778 Gly Gln Tyr Ala Arg Leu Ser Val Pro Gly Thr Asp Ser Trp Arg Ser 140 145 150 tac tcc ttc gcc aac cgg ccg ggt aat cag ttg cag ttc ctg gta cgc 3826 Tyr Ser Phe Ala Asn Arg Pro Gly Asn Gln Leu Gln Phe Leu Val Arg 155 160 165 ctg ctg ccc gac gga gtc atg agc aac tac ctg cgt gaa cgc tgc cag 3874 Leu Leu Pro Asp Gly Val Met Ser Asn Tyr Leu Arg Glu Arg Cys Gln 170 175 180 gtg ggt gat gaa atg ctg atg gag gcg ccc ttg ggt gcg ttt tat ctg 3922 Val Gly Asp Glu Met Leu Met Glu Ala Pro Leu Gly Ala Phe Tyr Leu 185 190 195 200 cgg cac gtc acc caa ccg ctg gta ctg gtg gcg ggc ggc acc ggg ttg 3970 Arg His Val Thr Gln Pro Leu Val Leu Val Ala Gly Glu Thr Gly Leu 205 210 215 tcg gcg ttg ttg ggc atg ctc gat gag ctg gtc gtc aac ggc tgc aca 4018 Ser Ala Leu Leu Gly Met Leu Asp Glu Leu Val Val Asn Glu Cys Thr 220 225 230 caa cct gtg cac ctg tac tac ggc gtg cgc ggc gcc gaa gac tta tgt 4066 Gln Pro Val His Leu Tyr Tyr Gly Val Arg Gly Ala Glu Asp Leu Cys 235 240 245 gaa gcg gca cgt atc cac gcc tac gcg acg aaa atc ccg aac ttt cgc 4114 Glu Ala Ala Arg Ile His Ala Tyr Ala Thr Lys Ile Pro Asn Phe Arg 250 255 260 tac acc gaa gtg ctg agc gac gcc tca gtc gag tgg acg ggc aaa cgc 4162 Tyr Thr Glu Val Leu Ser Asp Ala Ser Val Glu Trp Thr Gly Lys Arg 265 270 275 280 ggc tac ctg acc gaa cat ttt gac ctg gcc gaa ttg cgg gac aga tcg 4210 Gly Tyr Leu Thr Glu His Phe Asp Leu Ala Glu Leu Arg Asp Arg Ser 285 290 295 gcg gat atg tac gtg tgc ggc ccc cct cca atg gtc gaa tcc atc caa 4258 Ala Asp Met Tyr Val Cys Gly Pro Pro Pro Met Val Glu Ser Ile Gln 300 305 310 caa tgg ctg gcg gat cag aca ctt gat ggc gtt cag ttg tat tac gaa 4306 Gln Trp Leu Ala Asp Gln Thr Leu Asp Gly Val Gln Lys Tyr Tyr Glu 315 320 325 aag ttt acc cag agt aat atc tga 4330 Lys Phe Thr Gln Ser Asn Ile 330 335 <210> 8 <211> 993 <212> DNA <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> CDS <222> 1..990 <223> Coding sequence for AntR <220> <221> variation <222> 802..802 <223> Mutation to T802 from native G802; resulting in the codon mutation GCG->TCG shown at 802..804, and the amino acid mutation of Ala268 to Ser268 <220> <221> misc_signal <222> 991..993 <223> Stop codon for the CDS of AntR <400> 8 atg act agt cag aca cgc gat att cat att caa cgc ttc gac ctg gaa 48 Met Thr Ser Gln Thr Arg Asp Ile His Ile Gln Arg Phe Asp Leu Glu 1 5 10 15 ggc gcg cgc agc tgg atg tcc ggc atc tgc ggg ccc cat cgc ctg gcg 96 Gly Ala Arg Ser Trp Met Ser Gly Ile Cys Gly Pro His Arg Leu Ala 20 25 30 acg gca acc ccc gag cgc ctg cgc ttt cac cac agc gcc aac gtg ttc 144 Thr Ala Thr Pro Glu Arg Leu Arg Phe His His Ser Ala Asn Val Phe 35 40 45 aaa tcc cgc gcc acc acc ctg ggc gtg atc gag tac ggc act gat gtg 192 Lys Ser Arg Ala Thr Thr Leu Gly Val Ile Glu Tyr Gly Thr Asp Val 50 55 60 acc atc gac atc gaa gac gcc gag cac ttc agc agc tac agc ttg atc 240 Thr Ile Asp Ile Glu Asp Ala Glu His Phe Ser Ser Tyr Ser Leu Ser 65 70 75 80 ctg cca ctg gtg ggc gag cag gag ctg agc aag aac ggt gaa cgt ctc 288 Leu Pro Leu Val Gly Glu Gln Glu Leu Ser Lys Asn Gly Glu Arg Leu 85 90 95 agt tcc aac cgc gac caa ggc gtg atc att tcg ccc aat gag cat cag 336 Ser Ser Asn Arg Asp Gln Gly Val Ile Ile Ser Pro Asn Glu His Gln 100 105 110 gtg ctg gcg att tcc ggt gac tgc cgc aag ttg cag gtg gta atc acc 384 Val Leu Ala Ile Ser Gly Asp Cys Arg Lys Leu Gln Val Val Ile Thr 115 120 125 tgc gcg gcg atg agc gag tcg ctg gaa ggt ttg ctg caa cgg ccc att 432 Arg Ala Ala Met Ser Glu Ser Leu Glu Gly Leu Leu Gln Arg Pro Ile 130 135 140 gat gcg ccg ctg cgc ttt gag tcg gtg atg gat gct gtg gac gga gca 480 Asp Ala Pro Leu Arg Phe Glu Ser Val Met Asp Ala Val Asp Gly Ala 145 150 155 160 ccg gct tcg tgg tgg cgc atg gcg cgt tat ttc atc gcc gaa ctg gag 527 Pro Ala Ser Trp Trp Arg Met Ala Arg Tyr Phe Ile Ala Glu Leu Glu 165 170 175 cgc agc agc gaa ctg tac gag cag gcg gcg ttt act cgc gac ctg gaa 576 Arg Ser Ser Glu Leu Tyr Glu Gln Ala Ala Phe Thr Arg Asp Leu Glu 180 185 190 agc tcg ctg atc aag ggc ctg atc ctg gcc caa ccg aat aac tac tcc 624 Ser Ser Leu Ile Lys Gly Leu Ile Leu Ala Gln Pro Asn Asn Tyr Ser 195 200 205 gaa gaa ctg cgc gac gtg ctg ggg gtg aaa ctg ccg cac tac ctg atc 672 Glu Glu Leu Arg Asp Val Leu Gly Val Lys Leu Pro His Tyr Leu Ile 210 215 220 cgc gcg cgg caa ttt atc cac gac aac gcc cgt gaa gcg ctg cac ctg 720 Arg Ala Arg Gln Phe Ile His Asp Asn Ala Arg Glu Ala Leu His Leu 225 230 235 240 gaa gac ctg gaa gcg gcg gcg ggc gtg tcg cgt ttc aaa ctg ttc gat 768 Glu Asp Leu Glu Ala Ala Ala Gly Val Ser Arg Phe Lys Leu Phe Asp 245 250 255 gcg ttt cgc aag tac ttc gca ctg tcg ccc atg tcg tat ttg aag aag 816 Ala Phe Arg Lys Tyr Phe Ala Leu Ser Pro Met Ser Tyr Leu Lys Lys 260 265 270 cat cgg ttg ggg gcg gtg cgc caa gaa att ctg gag cag ggc tcg atc 864 His Arg Leu Gly Ala Val Arg Gln Glu Ile Leu Glu Gln Gly Ser Ile 275 280 285 cgc acc tac tct gaa atc gcc ctg ggt tgg ggg ttt acg cat ttg ggg 912 Arg Thr Ile Ser Glu Ile Ala Leu Gly Trp Gly Phe Thr His Leu Gly 290 295 300 cgg ttt tcg gcg gag tac cgc aag ctg ttc gat gag tcg ccc agc cag 960 Arg Phe Ser Ala Glu Tyr Arg Lys Leu Phe Asp Glu Ser Pro Ser Gln 305 310 315 320 aca ttg cag cgc aag cgc ctg cgc att act tga 993 Thr Leu Gln Arg Lys Arg Leu Arg Ile Thr 325 330 <210> 9 <211> 330 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> INIT_MET <222> 1..1 <223> Putative initiator methionine for AntR, giving Met1->Thr330 as the amino acid sequence of the putative Pant activator protein <220> <221> VARIANT <222> 268..268 <223> Mutation to Ser268 from Ala268 <400> 9 Met Thr Ser Gln Thr Arg Asp Ile His Ile Gln Arg Phe Asp Leu Glu 1 5 10 15 Gly Ala Arg Ser Trp Met Ser Gly Ile Cys Gly Pro His Arg Leu Ala 20 25 30 Thr Ala Thr Pro Glu Arg Leu Arg Phe His His Ser Ala Asn Val Phe 35 40 45 Lys Ser Arg Ala Thr Thr Leu Gly Val Ile Glu Tyr Gly Thr Asp Val 50 55 60 Thr Ile Asp Ile Glu Asp Ala Glu His Phe Ser Ser Tyr Ser Leu Ser 65 70 75 80 Leu Pro Leu Val Gly Glu Gln Glu Leu Ser Lys Asn Gly Glu Arg Leu 85 90 95 Ser Ser Asn Arg Asp Gln Gly Val Ile Ile Ser Pro Asn Glu His Gln 100 105 110 Val Leu Ala Ile Ser Gly Asp Cys Arg Lys Leu Gln Val Val Ile Thr 115 120 125 Arg Ala Ala Met Ser Glu Ser Leu Glu Gly Leu Leu Gln Arg Pro Ile 130 135 140 Asp Ala Pro Leu Arg Phe Glu Ser Val Met Asp Ala Val Asp Gly Ala 145 150 155 160 Pro Ala Ser Trp Trp Arg Met Ala Arg Tyr Phe Ile Ala Glu Leu Glu 165 170 175 Arg Ser Ser Glu Leu Tyr Glu Gln Ala Ala Phe Thr Arg Asp Leu Glu 180 185 190 Ser Ser Leu Ile Lys Gly Leu Ile Leu Ala Gln Pro Asn Asn Tyr Ser 195 200 205 Glu Glu Leu Arg Asp Val Leu Gly Val Lys Leu Pro His Tyr Leu Ile 210 215 220 Arg Ala Arg Gln Phe Ile His Asp Asn Ala Arg Glu Ala Leu His Leu 225 230 235 240 Glu Asp Leu Glu Ala Ala Ala Gly Val Ser Arg Phe Lys Leu Phe Asp 245 250 255 Ala Phe Arg Lys Tyr Phe Ala Leu Ser Pro Met Ser Tyr Leu Lys Lys 260 265 270 His Arg Leu Gly Ala Val Arg Gln Glu Ile Leu Glu Gln Gly Ser Ile 275 280 285 Arg Thr Ile Ser Glu Ile Ala Leu Gly Trp Gly Phe Thr His Leu Gly 290 295 300 Arg Phe Ser Ala Glu Tyr Arg Lys Leu Phe Asp Glu Ser Pro Ser Gln 305 310 315 320 Thr Leu Gln Arg Lys Arg Leu Arg Ile Thr 325 330 <210> 10 <211> 463 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> misc_feature <222> 1..463 <223> AntA expression product, anthranilate dioxygenase large subunit <400> 10 Met Ser Gly Ala Arg Thr Val Glu Gln Trp Lys Ser Phe Ile Glu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Asp Phe Arg Pro Ala Asp Glu Val Phe Arg Ile Ala Arg Asp 20 25 30 Met Phe Thr Glu Pro Glu Leu Phe Asp Leu Glu Met Glu Leu Ile Phe 35 40 45 Glu Lys Asn Trp Ile Tyr Ala Cys His Glu Ser Glu Leu Ala Asn Asn 50 55 60 His Asp Phe Val Thr Met Arg Ala Gly Arg Gln Pro Met Ile Ile Thr 65 70 75 80 Arg Asp Gly Glu Gly Arg Leu Asn Ala Leu Ile Asn Ala Cys Gln His 85 90 95 Arg Gly Thr Thr Leu Thr Arg Val Gly Lys Gly Asn Gln Ser Thr Phe 100 105 110 Thr Cys Pro Phe His Ala Trp Cys Tyr Lys Ser Asp Gly Arg Leu Val 115 120 125 Lys Val Lys Ala Pro Gly Glu Tyr Pro Glu Gly Phe Asp Lys Ala Thr 130 135 140 Arg Gly Leu Lys Lys Ala Arg Ile Glu Ser Tyr Arg Gly Phe Val Phe 145 150 155 160 Ile Ser Leu Asp Val Asn Gly Thr Asn Ser Leu Glu Asp Phe Leu Gly 165 170 175 Asp Ala Lys Val Phe Phe Asp Met Met Val Ala Gln Ser Ala Thr Gly 180 185 190 Glu Leu Glu Val Leu Pro Gly Lys Ser Ala Tyr Thr Tyr Asp Gly Asn 195 200 205 Trp Lys Leu Gln Asn Glu Asn Gly Leu Asp Gly Tyr His Val Ser Thr 210 215 220 Val His Tyr Asn Tyr Val Ala Thr Val Gln His Arg Glu Gln Val Asn 225 230 235 240 Thr Glu Asn Gly Ala Gly Ser Ser Thr Thr Leu Asp Tyr Ser Lys Leu 245 250 255 Gly Ala Gly Asp Ala Asn Thr Asp Asp Gly Trp Phe Ala Phe Asn Asn 260 265 270 Gly His Ser Val Leu Phe Ser Asp Met Pro Asn Pro Ser Val Arg Ser 275 280 285 Gly Tyr Ala Thr Ile Met Pro Arg Leu Val Glu Glu His Gly Gln Gln 290 295 300 Lys Ala Glu Trp Met Met His Arg Leu Arg Asn Leu Asn Ile Tyr Pro 305 310 315 320 Ser Leu Phe Phe Leu Asp Gln Ile Ser Ser Gln Leu Arg Ile Ile Arg 325 330 335 Pro Val Ala Trp Asn Lys Thr Glu Ile Ile Ser Gln Cys Leu Gly Val 340 345 350 Lys Gly Glu Ser Asp Ala Asp Arg Glu Asn Arg Ile Arg Gln Phe Glu 355 360 365 Asp Phe Phe Asn Val Ser Gly Met Gly Thr Pro Asp Asp Leu Val Glu 370 375 380 Phe Arg Glu Ala Gln Arg Gly Phe Gln Gly Arg Leu Glu Arg Trp Ser 385 390 395 400 Asp Ile Ser Arg Gly Ser His Arg Trp Glu Thr Gly Pro Trp Pro Asn 405 410 415 Ser Glu Ala Ile Gly Ile Gln Pro Ala Met Thr Gly Thr Glu Phe Thr 420 425 430 His Glu Gly Leu Tyr Val Asn Gln His Arg Asn Trp Gln Gln Phe Leu 435 440 445 Leu Lys Gly Leu Asp Gln Arg Ala Leu Ala Leu Arg Glu Val Lys 450 455 460 <210> 11 <211> 163 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> misc_feature <222> 1..163 <223> AntB expression product, anthranilate dioxygenase small subunit <400> 11 Met Asn Ala Gln Leu Gln Tyr Gln Ile Glu Gln Phe Phe Tyr Arg Lys 1 5 10 15 Ser Glu Leu Cys Asp Ala Gln Asp Trp Asp Ala Tyr Val Gln Leu Phe 20 25 30 Asp Pro Gln Ser Glu Phe His Leu Pro Gln Trp Asp Ser Glu His Val 35 40 45 Tyr Thr Gln Asp Pro Lys Arg Glu Met Ser Leu Ile Tyr Tyr Ala Asn 50 55 60 Arg Ser Gly Leu Glu Asp Arg Val Phe Arg Leu Arg Thr Glu Lys Ala 65 70 75 80 Ala Ser Ala Thr Pro Met Pro Arg Thr Leu His Leu Ile Asn Asn Val 85 90 95 Arg Ile Ala Glu Gln Ala Asp Gly Thr Leu Glu Val Arg Leu Asn Trp 100 105 110 His Thr Leu Phe Tyr Arg Leu Ala Thr Ser Glu Gln Phe Tyr Gly His 115 120 125 Ala Thr Tyr Arg Leu Lys Pro Ala Gly Asp Ser Trp Leu Ile Met Arg 130 135 140 Lys His Ala Leu Leu Leu Asn Asp Thr Ile Asn Ser Val Leu Asp Phe 145 150 155 160 Tyr His Leu <210> 12 <211> 335 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> misc_feature <222> 1..335 <223> AntC expression product, anthranilate dioxygenase reductase <400> 12 Met Asn His Lys Val Ala Phe Ser Phe Ala Asp Gly Lys Thr Leu Phe 1 5 10 15 Phe Pro Val Gly Ala His Glu Ile Leu Leu Asp Ala Ala Leu Arg Asn 20 25 30 Gly Ile Lys Ile Pro Leu Asp Cys Arg Glu Gly Val Cys Gly Thr Cys 35 40 45 Gln Gly Arg Cys Glu Ser Gly Glu Tyr Thr Gln Asp Tyr Val Asp Glu 50 55 60 Glu Ala Leu Ser Ser Leu Asp Leu Gln Gln Arg Lys Met Leu Ser Cys 65 70 75 80 Gln Thr Arg Val Lys Ser Asp Ala Thr Phe Tyr Phe Asp Phe Asp Ser 85 90 95 Ser Leu Cys Asn Ala Pro Gly Pro Val Gln Val Arg Gly Thr Val Ser 100 105 110 Ala Val Gln Gln Val Ser Thr Ser Thr Ala Ile Leu Gln Val Gln Leu 115 120 125 Asp Gln Pro Leu Asp Phe Leu Pro Gly Gln Tyr Ala Arg Leu Ser Val 130 135 140 Pro Gly Thr Asp Ser Trp Arg Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Arg Pro Gly 145 150 155 160 Asn Gln Leu Gln Phe Leu Val Arg Leu Leu Pro Asp Gly Val Met Ser 165 170 175 Asn Tyr Leu Arg Glu Arg Cys Gln Val Gly Asp Glu Met Leu Met Glu 180 185 190 Ala Pro Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Arg His Val Thr Gln Pro Leu Val 195 200 205 Leu Val Ala Gly Glu Thr Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gly Met Leu Asp 210 215 220 Glu Leu Val Val Asn Glu Cys Thr Gln Pro Val His Leu Tyr Tyr Gly 225 230 235 240 Val Arg Gly Ala Glu Asp Leu Cys Glu Ala Ala Arg Ile His Ala Tyr 245 250 255 Ala Thr Lys Ile Pro Asn Phe Arg Tyr Thr Glu Val Leu Ser Asp Ala 260 265 270 Ser Val Glu Trp Thr Gly Lys Arg Gly Tyr Leu Thr Glu His Phe Asp 275 280 285 Leu Ala Glu Leu Arg Asp Arg Ser Ala Asp Met Tyr Val Cys Gly Pro 290 295 300 Pro Pro Met Val Glu Ser Ile Gln Gln Trp Leu Ala Asp Gln Thr Leu 305 310 315 320 Asp Gly Val Gln Lys Tyr Tyr Glu Lys Phe Thr Gln Ser Asn Ile 325 330 335 <210> 13 <211> 1544 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..1544 <223> Construct containing the pDOW1057 Pant-Pben tandem promoter <220> <221> misc_feature <222> 95..1395 <223> Portion containing Pant with activator CDS <220> <221> misc_signal <222> 92..94 <223> Anticodon of stop codon for the CDS of AntR <220> <221> CDS <222> 95..1084 <223> Antisense strand of ORF encoding AntR <220> <221> variation <222> 283..283 <223> Mutation to A235 from native C235; resulting in anticodon mutation CGC->CGA, thus codon mutation GCG->TCG and amino acid mutation of Ala268 to Ser268 <220> <221> misc_signal <222> 1221..1327 <223> Approximate region estimated to contain the AntR binding site <220> <221> misc_feature <222> 1329..1509 <223> Pant-Pben tandem promoter construct <220> <221> promoter <222> 1329..1365 <223> Putative promoter (Pant) from anthranilate operon (antABC) <220> <221> -35_signal <222> 1329..1333 <223> Putative -35 region of Pant promoter <220> <221> -10_signal <222> 1355..1359 <223> Putative -10 region of Pant promoter <220> <221> misc_signal <222> 1371..1371 <223> Putative native transcription start site under control of Pant <220> <221> misc_feature <222> 1396..1429 <223> linker <220> <221> misc_feature <222> 1430..1541 <223> Portion containing Pben <220> <221> misc_signal <222> 1430-1476 <223> Approximate region estimated to contain the BenR binding site <220> <221> promoter <222> 1477-1509 <223> Putative promoter (Pben) from benzoate operon (benABCD) <220> <221> -35_signal <222> 1477-1482 <223> Putative -35 region of Pben promoter <220> <221> -10_signal <222> 1498-1503 <223> Putative -10 region of Pben promoter <220> <221> misc_feature <222> 1498-1503 <223> Substitution mutation of Pben -10 region by tataat to form -10con mutants, and by taaggt to form -10benAc mutants <220> <221> misc_feature <222> 1508..1508 <223> A deletion of g1508 found in mutant promoter variants herein <220> <221> misc_signal <222> 1509..1509 <223> Putative transcription start site <220> <221> misc_signal <222> 1542..1544 <223> Putative native translation initiator codon attached to Pben <400> 13 agcttgcatg cctgcaggtt taaacagtcg actctagact taattaacta tcgcaggcaa 60 gccagctccc acagattgtt tttcatccag ttca agt aat gcg cag gcg ctt gcg 115 Thr Ile Arg Leu Arg Lys Arg -330 -325 ctg caa tgt ctg gct ggg cga ctc atc gaa cag ctt gcg gta ctc cgc 163 Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Glu Asp Phe Leu Lys Arg Tyr Glu Ala -320 -315 -310 cga aaa ccg ccc caa atg cgt aaa ccc cca acc cag ggc gat ttc aga 211 Ser Phe Arg Gly Leu His Thr Phe Gly Trp Gly Leu Ala Ile Glu Ser -305 -300 -295 gat ggt gcg gat cga gcc ctg ctc cag aat ttc ttg gcg cac cgc ccc 259 Ile Thr Arg Ile Ser Gly Gln Glu Leu Ile Glu Gln Arg Val Ala Gly -290 -285 -280 caa ccg atg ctt ctt caa ata cga cat ggg cga cag tgc gaa gta ctt 307 Leu Arg His Lys Lys Leu Tyr Ser Met Pro Ser Leu Ala Phe Tyr Lys -275 -270 -265 -260 gcg aaa cgc atc gaa cag ttt gaa acg cga cac gcc cgc cgc cgc ttc 355 Arg Phe Ala Asp Phe Leu Lys Phe Arg Ser Val Gly Ala Ala Ala Glu -255 -250 -245 cag gtc ttc cag gtg cag cgc ttc acg ggc gtt gtc gtg gat aaa ttg 403 Leu Asp Glu Leu His Leu Ala Glu Arg Ala Asn Asp His Ile Phe Gln -240 -235 -230 ccg cgc gcg gat cag gta gtg cgg cag ttt cac ccc cag cac gtc gcg 451 Arg Ala Arg Ile Leu Tyr His Pro Leu Lys Val Gly Leu Val Asp Arg -225 -220 -215 cag ttc ttc gga gta gtt att cgg ttg ggc cag gat cag gcc ctt gat 499 Leu Glu Glu Ser Tyr Asn Asn Pro Gln Ala Leu Ile Leu Gly Lys Ile -210 -205 -200 cag cga gct ttc cag gtc gcg agt aaa cgc cgc ctg ctc gta cag ttc 547 Leu Ser Ser Glu Leu Asp Arg Thr Phe Ala Ala Gln Glu Tyr Leu Glu -195 -190 -185 -180 gct gct gcg ctc cag ttc ggc gat gaa ata acg cgc cat gcg cca cca 595 Ser Ser Arg Glu Leu Glu Ala Ile Phe Tyr Arg Ala Met Arg Trp Trp -175 -170 -165 cga agc cgg tgc tcc gtc cac agc atc cat cac cga ctc aaa gcg cag 643 Ser Ala Pro Ala Gly Asp Val Ala Asp Met Val Ser Glu Phe Arg Leu -160 -155 -150 cgg cgc atc aat ggg ccg ttg cag caa acc ttc cag cga ctc gct cat 691 Pro Ala Asp Ile Pro Arg Gln Leu Leu Gly Glu Leu Ser Glu Ser Met -145 -140 -135 cgc cgc acg ggt gat tac cac ctg caa ctt gcg gca gtc acc gga aat 739 Ala Ala Arg Thr Ile Val Val Gln Leu Lys Arg Cys Asp Gly Ser Ile -130 -125 -120 cgc cag cac ctg atg ctc att ggg cga aat gat cac gcc ttg gtc gcg 787 Ala Leu Val Gln His Glu Asn Pro Ser Ile Ile Val Gly Gln Asp Arg -115 -110 -105 -100 gtt gga act gag acg ttc acc gtt ctt gct cag ctc ctg ctc gcc cac 835 Asn Ser Ser Leu Arg Glu Gly Asn Lys Ser Leu Glu Gln Glu Gly Val -95 -90 -85 cag tgg cag gct caa gct gta gct gct gaa gtg ctc ggc gtc ttc gat 883 Leu Pro Leu Ser Leu Ser Tyr Ser Ser Phe His Glu Ala Asp Glu Ile -80 -75 -70 gtc gat ggt cac atc agt gcc gta ctc gat cac gcc cag ggt ggt ggc 931 Asp Ile Thr Val Asp Thr Gly Tyr Glu Ile Val Gly Leu Thr Thr Ala -65 -60 -55 gcg gga ttt gaa cac gtt ggc gct gtg gtg aaa gcg cag gcg ctc ggg 979 Arg Ser Lys Phe Val Asn Ala Ser His His Phe Arg Leu Arg Glu Pro -50 -45 -40 ggt tgc cgt cgc cag gcg atg ggg ccc gca gat gcc gga cat cca gct 1027 Thr Ala Thr Ala Leu Arg His Pro Gly Cys Ile Gly Ser Met Trp Ser -35 -30 -25 -20 gcg cgc gcc ttc cag gtc gaa gcg ttg aat atg aat atc gcg tgt ctg 1075 Arg Ala Gly Glu Leu Asp Phe Arg Gln Ile His Ile Asp Arg Thr Gln -15 -10 -5 act agt cat cagggtgcac ccacggcggt taggcgtttg cgcgctctga 1124 Ser Thr Met -1 cggcgcgtcg ttgaacctcg acagcaagtt ccaggccacg ccagtgcagt tctcactggg 1184 tggatagcaa cggtcgacta tgtggataaa ccccagagtt ttgcgaccat cgcccgccat 1244 cacagtagcg catgccgtca ccggcgcgca ccgtcatggg tatttgccgc ccaactttgc 1304 ggcctacgtt cccccattaa gcggatagcc cgccaccgca tcgcagccgc ttaatggctc 1364 accgtttagc catgatcaaa aggtgcctcc cggatcccca aacagtcgac tctagactta 1424 attaagttaa gcgacgtgcg cctggcggat agcgatgtgc aggcagcgga tattgacggg 1484 cagggcgagc acgtacggtg agggcgcctg atacaagaac aacggagggc ccgcccc 1541 atg 1544 Met 1 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..20 <223> Alternative Inter-promoter linker for tandem promoter <400> 14 ggatccggcg cgcccccatc 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..18 <223> Linker used to connect promoters to reporter genes <400> 15 actagtagga ggtaactt 18 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..21 <223> Knock-out primer AntAKO5 <220> <221> misc_feature <222> 2..7 <223> EcoRI recognition site <400> 16 ggaattcttc gtgacgatgc g 21 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..22 <223> Knock-out primer AntAKO3 <220> <221> misc_feature <222> 3..8 <223> BamHI recognition site <400> 17 cgggatccgc tcgcgatgct gc 22 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..16 <223> Labeling primer lacZPE <400> 18 ggatgtgctg caaggc 16 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..17 <223> Labeling primer lacZPE2 <400> 19 gtaaccatgg tcatcgc 17 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..17 <223> M13forward primer <400> 20 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..16 <223> M13reverse primer <400> 21 aacagctatg accatg 16 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..35 <223> Oligonucleotide Bambenwtshort <400> 22 cgggatccgt atcaggcgcc tcaccgtacg tgctc 35 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..35 <223> Oligonucleotide Bambenconshort <400> 23 cgggatccgt atcaggcgcc tcattatacg tgctc 35 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..35 <223> Oligonucleotide BambenAcshort <400> 24 cgggatccgt atcaggcgcc tcaccttacg tgctc 35 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..35 <223> Oligonucleotide Bamantwtshort <400> 25 cgggatccgc taacggtgag ccattaagcg gctgc 35 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..35 <223> Oligonucleotide Bamantconshort <400> 26 cgggatccgc taacggtgag cattatagcg gctgc 35 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..20 <223> Primer BenactKO-for <400> 27 cgcgacacat tgctgcccag 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..20 <223> Primer BenactKO-rev <400> 28 agtatcagcc atcgcacctt 20 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..19 <223> Primer 1803H3seq <400> 29 gtcctgcaat ttcagccga 19 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..26 <223> Oligonucleotide BenL278 <400> 30 ccttaattaa gttaagcgac gtgcgc 26 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..26 <223> Oligonucleotide 3'Antactiv <400> 31 cccaagcttc tatcgaggca agccag 26 <210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..32 <223> Oligonucleotide Benact5' <400> 32 agctttgttt aaacgcatga cgttgttgat tc 32 <210> 33 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..31 <223> Oligonucleotide H3_5'BenAKOclean <400> 33 cccaagcttg ccatgaggcg gaaaacgctg c 31 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..30 <223> Oligonucleotide H3_3'BenBKOclean <400> 34 cccaagcttc ggtgatcgcc acgctgtcgc 30 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..25 <223> Oligonucleotide BenKOmega <400> 35 catacgtcat ggccctccgt tgttc 25 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..25 <223> Oligonucleotide InvbenKOmega <400> 36 gaacaacgga gggccatgac gtatg 25 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..24 <223> Oligonucleotide 5'BenA_seq <400> 37 ctgctggaaa acgcctgcct ggag 24 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..25 <223> Oligonucleotide Seq_3'BenB <400> 38 gagcacttca agcatcgaca ggaac 25 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..21 <223> Primer 1261-8378F <400> 39 cttcagatcc agactcacca g 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..21 <223> Primer 1261-103R <400> 40 gaccatgatt acgccaagcg c 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..21 <223> Primer M13R21 <400> 41 cacacaggaa acagctatga c 21

Claims (72)

15-20 뉴클레오티드 링커를 통해 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) 천연 벤조에이트 프로모터의 -10 영역의 상류에 결합된 상기 천연 프로모터의 -35 영역을 포함하는 단리된 벤조에이트 프로모터 핵산.
제 1 항에 있어서, 상기 프로모터가 벤조에이트 프로모터 활성자 단백질 결합 부위를 추가로 포함하는 것인 벤조에이트 프로모터 핵산.
제 1 항에 있어서, 상기 프로모터가 상기 천연 프로모터의 상류에 천연적으로 인접하여 위치한 대략 50 뉴클레오티드 부분의 천연 서열을 추가로 포함하며 상류에 인접하여 결합된 것인 벤조에이트 프로모터 핵산.
제 1 항에 있어서, 상기 프로모터가 15-20 뉴클레오티드 링커를 통해 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1296-1301의 상류에 결합된 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1275-1280을 포함하는 것인 벤조에이트 프로모터 핵산.
제 1 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1275-1301, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 벤조에이트 프로모터 핵산.
제 1 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1275-1307, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 벤조에이트 프로모터 핵산.
제 1 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1228-1301, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 벤조에이트 프로모터 핵산.
제 1 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1228-1307, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 벤조에이트 프로모터 핵산.
뉴클레오티드 서열이 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 프로모터의 서열과 90% 이상의 상동성을 갖고 이종성인 돌연변이 프로모터를 수득하기 위해, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 벤조에이트 프로모터 핵산의 돌연변이에 의해 생성된 돌연변이 프로모터 핵산.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 벤조에이트 프로모터 활성자 단백질 코딩 서열을 추가로 포함하는 벤조에이트 프로모터 핵산.
제 10 항에 있어서, 상기 벤조에이트 프로모터 활성자 단백질 코딩 서열이 서열 번호 2의 잔기 1-335, Asn152를 함유하는 서열 번호 2의 잔기 1-335, 서열 번호 2의 잔기 21-335, 및 Asn152를 함유하는 서열 번호 2의 잔기 21-335, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이 중 어느 하나와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 벤조에이트 프로모터 활성자 단백질을 코딩하는 것인 벤조에이트 프로모터 핵산.
15-20 뉴클레오티드 링커를 통해 슈도모나스 플루오레센스 천연 안트라닐레이트 프로모터의 -10 영역의 상류에 결합된 상기 천연 프로모터의 -35 영역을 포함하는 단리된 안트라닐레이트 프로모터 핵산.
제 12 항에 있어서, 상기 프로모터가 안트라닐레이트 프로모터 활성자 단백질 결합 부위를 추가로 포함하는 것인 안트라닐레이트 프로모터 핵산.
제 12 항에 있어서, 상기 프로모터가 상기 천연 프로모터의 상류에 천연적으로 인접하여 위치한 대략 110 뉴클레오티드 부분의 천연 서열 (상류에 인접하여 결합된)을 추가로 포함하는 것인 안트라닐레이트 프로모터 핵산.
제 12 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1244 및 1264-1268, 15-20 뉴클레오티드 링커를 통해 뉴클레오티드 1264-1268의 상류에 결합된 뉴클레오티드 1239-1244, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 안트라닐레이트 프로모터 핵산.
제 12 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1268, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 안트라닐레이트 프로모터 핵산.
제 12 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1239-1274, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 안트라닐레이트 프로모터 핵산.
제 12 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1130-1268, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 안트라닐레이트 프로모터 핵산.
제 12 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열 번호 7의 뉴클레오티드 1130-1274, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 안트라닐레이트 프로모터 핵산.
뉴클레오티드 서열이 제 12 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 프로모터의 서열과 90% 이상의 상동성을 가지며 이종성인 돌연변이 프로모터를 수득하기 위해, 제 12 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 안트라닐레이트 프로모터 핵산의 돌연변이에 의해 생성된 돌연변이 안트라닐레이트 프로모터 핵산.
제 12 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 안트라닐레이트 프로모터 활성자 단백질 코딩 서열을 추가로 포함하는 안트라닐레이트 프로모터 핵산.
제 21 항에 있어서, 상기 안트라닐레이트 프로모터 활성자 단백질 코딩 서열이 서열 번호 9의 잔기 1-330, 및 Ala268을 함유하는 서열 번호 9의 잔기 1-330 중 어느 하나와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 안트라닐레이트 프로모터 활성자 단백질을 코딩하는 것인 안트라닐레이트 프로모터 핵산.
천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터의 상류에 결합된 비-이화대사산물-억제된 프로모터를 포함하며, 이 때 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터의 이화대사산물 억제가 극복되거나 상이한 개선된 프로모터 성질이 나타나거나, 또는 양쪽 모두인 직열 프로모터.
제 23 항에 있어서, 상기 비-이화대사산물-억제된 프로모터 및 상기 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터 양쪽 모두가 슈도모나드류(Pseudomonads) 및 밀접하게 관련된 박테리아로부터 수득된 것인 직열 프로모터.
제 24 항에 있어서, 상기 비-이화대사산물-억제된 프로모터 및 상기 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터 모두가 슈도모나스속으로부터 수득된 것인 직열 프로모터.
제 24 항에 있어서, 상기 비-이화대사산물-억제된 프로모터 및 상기 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터 모두가 동일한 종으로부터 수득된 것인 직열 프로모터.
제 25 항에 있어서, 상기 비-이화대사산물-억제된 프로모터 및 상기 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터 모두가 동일한 종으로부터 수득된 것인 직열 프로모터.
제 27 항에 있어서, 상기 비-이화대사산물-억제된 프로모터 및 상기 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터 모두가 슈도모나스 플루오레센스로부터 수득된 것인 직열 프로모터.
제 23 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-이화대사산물-억제된 프로모터 및 상기 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터 모두가 대체 탄소원 사용 효소(들) 또는 경로(들)을 코딩하는 유전자(들) 또는 오페론(들) 으로부터 수득된 것인 직열 프로모터.
제 23 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-이화대사산물-억제된 프로모터가 안트라닐레이트 분해 경로를 코딩하는 오페론으로부터 수득되고, 상기 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터가 벤조에이트 분해 경로를 코딩하는 오페론으로부터 수득된 것인 직열 프로모터.
제 23 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-이화대사산물-억제된 프로모터가 상기 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터의 상류에 인접하여 결합된 것인 직열 프로모터.
제 23 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-이화대사산물-억제된 프로모터가 폴리뉴클레오티드 링커를 통해 상기 천연적으로 이화대사산물-억제된 프로모터로부터의 상류에 결합된 것인 직열 프로모터.
제 32 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 링커가 서열 번호 13의 g1396-a1429의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 직열 프로모터.
제 28 항에 있어서, 상기 비-이화대사산물-억제된 프로모터가 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1221-1359, 1221-1371, 1328-1359, 및 1328-1371, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된 안트라닐레이트 프로모터이고, 상기 이화대사산물-억제된 프로모터가 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1430-1503, 1430-1509, 1477-1503, 1477-1509, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된 벤조에이트 프로모터 서열인 직열 프로모터.
제 23 항에 있어서, 벤조에이트 "-35 내지 -10 영역"으로부터 상류이고 벤조에이트 "-35 내지 -10 영역"에 근접한 벤조에이트 활성자 단백질 결합 부위, 및 안트라닐레이트 "-35 내지 -10 영역"으로부터 상류이고 안트라닐레이트 "-35 내지 -10 영역"에 근접한 안트라닐레이트 활성자 단백질 결합 부위를 추가로 포함하는 직열 프로모터.
제 34 항에 있어서, 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1329-1503, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 직열 프로모터.
제 34 항에 있어서, 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1329-1509, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 직열 프로모터.
제 34 항에 있어서, 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1121-1503, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 직열 프로모터.
제 34 항에 있어서, 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1121-1509, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 직열 프로모터.
제 34 항에 있어서, 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1329-1541, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 직열 프로모터.
제 34 항에 있어서, 서열 번호 13의 뉴클레오티드 1121-1541, 및 임의로 여기에 나열된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 직열 프로모터.
(A)(1) 제 1 항, 제 12 항, 제 23 항 또는 제 30 항에 따른 프로모터;
(2) 적어도 서열 번호 1의 염기 1275-1307;
(3) 적어도 서열 번호 7의 염기 1239-1274; 또는
(4) 적어도 서열 번호 13의 염기 1329-1509
중 어느 하나의 염기 서열과 90% 이상 일치하고 이종성인 염기 서열을 갖는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계;
(B) 상기 폴리뉴클레오티드(들)을, 발현 구조물에서 전사 생성물-코딩 폴리뉴클레오티드에 조작가능하게 결합된 경우 원핵생물 숙주 세포에서 직접 전사할 수 있는 능력, 및 임의로 하나 이상의 프로모터 성질에 대해 스크리닝하는 단계; 및
(C) 상기 스크리닝 결과에 기초하여, 발현 구조물에서 전사 생성물-코딩 폴리뉴클레오티드에 조작가능하게 결합된 경우 원핵생물 숙주 세포에서 직접 전사하는 능력, 및 임의로 단계 (A)(1)-(A)(4)의 프로모터에 비해 개선된 하나 이상의 프로모터 성질을 갖는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 제조된 변화된 프로모터.
(A)(1)(a)(i) 제 1 항, 제 12 항, 제 23 항 또는 제 30 항에 따른 프로모터; (ii) 적어도 서열 번호 1의 염기 1275-1307; (iii) 적어도 서열 번호 7의 염기 1239-1274; 또는 (iv) 적어도 서열 번호 13의 염기 1329-1509 중 어느 하나의 염기 서열을 갖고;
(b) 전사 생성물-코딩 폴리뉴클레오티드에 조작가능하게 결합된 경우 원핵생물 숙주 세포에서 직접 전사할 수 있는 능력을 갖는
프로모터 폴리뉴클레오티드, 또는
(2) 상기 프로모터 폴리뉴클레오티드의 염기 서열를 나타내는 정보 스트링 (information string)
을 제공하는 단계;
(B)(1) 상기 프로모터 폴리뉴클레오티드가 하나 이상의 서열-변화된 폴리뉴클레오티드를 생성할 때에 하나 이상의 돌연변이 생성 기술 또는 하나 이상의 재조합 기술 또는 양쪽 모두를 수행하거나, 또는
(2) 상기 정보 스트링을 개질시켜 상기 정보 스트링과 90% 이상 일치하고 하나 이상의 변화된 서열을 나타내는 하나 이상의 개질된 스트링을 생성하고,
(a) 상기 변화된 서열을 갖는 하나 이상의 서열-변화된 폴리뉴클레오티드를 합성하거나, 또는
(b) (i) 상기 개질된 스트링과 일치하는 하나 이상의 동일한 스트링에 대한, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 공급원에 대응하는 하나 이상의 서열 기록을 찾고, (ii) 여기에 1 회 이상 출현한 하나 이상의 상기 동일한 스트링을 동정하고, (iii) 상기 동정된, 출현하는 동일한 스트링이 대응하는 폴리뉴클레오티드 공급원을 선택함으로써, 상기 개질된 스트링을 사용하여 하나 이상의 서열-변화된 폴리뉴클레오티드를 수득하거나, 또는
(3) (a) 상기 정보 스트링 또는 그의 상보체에 90% 이상 일치하며 하나 이상의 변화된 서열을 나타내는 하나 이상의 이종성 스트링에 대한, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 공급원에 대응하는 하나 이상의 서열 기록을 찾고,
(b) 여기에 1 회 이상 출현한 하나 이상의 상기 이종성 스트링을 동정하고,
(c) 상기 동정된, 출현하는 이종성 스트링이 대응하는 폴리뉴클레오티드 공급원을 선택함으로써 상기 정보 스트링을 사용하여 하나 이상의 서열-변화된 폴리뉴클레오티드를 수득하거나, 또는
(4) 상기 프로브의 상보체와 90% 이상 일치하는 하나 이상의 이종성 시험 폴리뉴클레오티드 내에서 상기 프로브가 표적 서열에 혼성화할 수 있는 엄격한 조건하에서 상기 프로브와 상기 시험 폴리뉴클레오티드를 한데 합치고, 상기 프로브가 혼성화하는 시험 폴리뉴클레오티드를 선택함으로써 상기 프로모터 폴리뉴클레오티드를 프로브로서 사용하여 하나 이상의 서열-변화된 폴리뉴클레오티드를 수득함으로써,
하나 이상의 서열-변화된 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계;
(C) 하나 이상의 서열-변화된 폴리뉴클레오티드를, 하나 이상의 프로모터 성질, 및 발현 구조물에서 전사 생성물-코딩 폴리뉴클레오티드에 조작가능하게 결합된 경우 원핵생물 숙주 세포에서 직접 전사할 수 있는 능력에 대해 스크리닝하는 단계; 및
(D) 상기 스크리닝 결과에 기초하여,
(1) 단계 (A)(1)의 프로모터 폴리뉴클레오티드에 비해 개선된 하나 이상의 프로모터 성질을 갖고,
(2) 전사 생성물-코딩 폴리뉴클레오티드에 조작가능하게 결합된 경우 원핵생물 숙주 세포에서 직접 전사할 수 있는 능력을 갖는
하나 이상의 서열-변화된 폴리뉴클레오티드를 동정하는 단계
에 의해 개선된 프로모터를 얻는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 개선된 프로모터.
발현 카세트를 형성하기 위해 제 43 항에 따른 개선된 프로모터를 전사 생성물-코딩 폴리뉴클레오티드에 조작가능하게 결합시키는 단계를 포함하는, 제 43 항에 따른 개선된 프로모터의 사용 방법.
제 44 항에 있어서, 벡터 내에 상기 발현 카세트를 포함시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 45 항에 있어서, 상기 발현 카세트로부터 발현을 일으킬 수 있는 숙주 세포를 상기 벡터로 형질변환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 46 항에 있어서, 개선된 프로모터를 유도하는 성장 조건하에서 상기 숙주 세포를 유지시킴으로써 상기 발현 카세트에 의해 코딩되는 발현 생성물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 43 항에 있어서, 상기 단계 (B)(4)에서 프로브로서 상기 프로모터 폴리뉴클레오티드를 사용하는 단계가 염기 길이가 10 개 이상인 상기 프로모터 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유사체 분자를 수득하고, 상기 분자를 표지화함으로써, 상기 프로브를 제공하는 것을 포함하는 개선된 프로모터.
제 43 항에 있어서, 상기 단계 (B)(4)에서 프로브로서 상기 프로모터 폴리뉴클레오티드를 사용하는 단계가 염기 길이가 10 개 이상인 상기 프로모터 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 분자를 수득하고, 임의로 상기 분자를 표지화함으로써, 상기 프로브를 제공하고, 상기 프로브를 표적 서열(들)과 혼성화시킨 후, 상기 프로브가 프라이머로서 기능하는 핵산 중합을 수행하는 것을 포함하는 개선된 프로모터.
핵산 서열, 및 엄격한 혼성화 및 세척 조건하에서
(A) 제 1 항, 제 12 항, 제 23 항 또는 제 30 항에 따른 프로모터;
(B) 적어도 서열 번호 1의 염기 1275-1307;
(C) 적어도 서열 번호 7의 염기 1239-1274; 또는
(D) 적어도 서열 번호 13의 염기 1329-1509
중 어느 하나의 염기 서열을 갖는 핵염기 중합체 분자와 혼성화하는 핵산 서열의 전체-길이 (full-length) 상보체를 포함하며, 여기서 상기 단리된 핵산 분자가 원핵세포에서 프로모터로서 기능할 수 있는 것인 단리된 핵산 분자.
원핵세포에서 프로모터로서 기능할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자의 염기 서열을 가지며,
(A) 제 1 항, 제 12 항, 제 23 항 또는 제 30 항에 따른 프로모터;
(B) 적어도 서열 번호 1의 염기 1275-1307;
(C) 적어도 서열 번호 7의 염기 1239-1274; 또는
(D) 적어도 서열 번호 13의 염기 1329-1509
중 어느 하나의 염기 서열과 90% 이상 일치하는 염기 서열을 함유하는 단리된 핵염기 중합체 분자.
(A) 제 1 항, 제 12 항, 제 23 항 또는 제 30 항에 따른 프로모터;
(B) 적어도 서열 번호 1의 염기 1275-1307;
(C) 적어도 서열 번호 7의 염기 1239-1274; 또는
(D) 적어도 서열 번호 13의 염기 1329-1509
중 어느 하나의 염기 서열과 90% 이상 일치하는 염기 서열을 함유하는 프로모터를 포함하고, 원핵세포에서 발현 구조물로서 기능할 수 있는 재조합 핵산 분자.
제 52 항에 있어서, 상기 발현 구조물이 mRNA-코딩 서열을 포함하는 것인 재조합 발현 구조물.
제 52 항에 있어서, 상기 발현 구조물이 벡터인 재조합 발현 구조물.
제 54 항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드, 트란스포존 또는 인공 염색체인 재조합 발현 구조물.
제 53 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 발현 구조물을 함유하는 유전공학적으로 조작된 원핵생물 숙주 세포.
제 56 항에 따른 유전공학적으로 조작된 원핵생물 숙주 세포를 포함하는 발현 시스템.
제 56 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 상기 재조합 발현 구조물의 프로모터에 대한 관련 활성자 단백질 코딩 유전자를 1 카피 이상, 바람직하게는 1 개 초과의 카피를 추가로 포함하는 것인 유전공학적으로 조작된 원핵생물 숙주 세포.
재 57 항에 있어서, 상기 유전공학적으로 조작된 원핵생물 숙주 세포가 상기 재조합 발현 구조물의 프로모터에 대한 관련 활성자 단백질 코딩 유전자를 1 카피 이상, 바람직하게는 1 개 초과의 카피를 추가로 포함하는 것인 발현 시스템.
제 58 항에 따른 유전공학적으로 조작된 원핵생물 숙주 세포를 성장시키고, 여기에서 재조합 발현 구조물을 유도시킴으로써 재조합 발현 생성물에 의해 코딩되는 전사 생성물이 발현되는 것을 포함하는 전사 생성물의 제조 방법.
제 60 항의 방법에 의한 mRNA 전사 생성물을 발현시키고, 추가로 상기 원핵생물 숙주 세포가, 상기 mRNA가 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 번역하도록 하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
제 61 항에 따른 방법에 의해 제조된 폴리펩티드.
(A)(1) 비-이화대사산물-억제된 원핵세포 프로모터 폴리뉴클레오티드, 및
(2) 이화대사산물-억제된 원핵세포 프로모터 폴리뉴클레오티드
를 제공하는 단계; 및
(B) 상기 이화대사산물-억제된 프로모터 및 이의 상류에 상기 비-이화대사산물-억제된 프로모터를 공유적으로 결합시키는 단계
를 포함하는 방법에 의해 제조된 직열 프로모터.
제 63 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 프로모터간 (inter-promoter) 링커가 상기 비-이화대사산물-억제된 프로모터를 상기 이화대사산물-억제된 프로모터 및 이의 상류에 공유 결합시키는 직열 프로모터.
제 64 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로모터간 링커의 길이가 약 100 개 이하의 뉴클레오티드인 직열 프로모터.
서열 번호 2의 잔기 1-335 서열, 또는 Asn152를 함유하는 서열 번호 2의 잔기 1-335의 아미노산 서열을 갖는 단리된 전사 활성자 단백질.
서열 번호 2의 잔기 21-335, 또는 Asn152를 함유하는 서열 번호 2의 잔기 21-335의 아미노산 서열을 갖는 단리된 전사 활성자 단백질.
서열 번호 9의 잔기 1-330, 또는 Ala268을 함유하는 서열 번호 9의 잔기 1-330의 아미노산 서열을 갖는 단리된 전사 활성자 단백질.
제 66 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항에 따른 전사 활성자 단백질 서열과 90% 이상 일치하며 이종성인 아미노산 서열을 갖는 단리된 전사 활성자 단백질.
제 66 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항에 따른 전사 활성자 단백질을 코딩하는 염기 서열을 함유하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제 70 항에 따른 전사 활성자 단백질을 코딩하는 염기 서열을 함유하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제 59 항에 있어서,
(A) 상기 활성자 단백질이
(1) 서열 번호 2의 잔기 1-335,
(2) Asn152를 함유하는 서열 번호 2의 잔기 1-335,
(3) 서열 번호 2의 잔기 21-335, 및
(4) Asn152를 함유하는 서열 번호 2의 잔기 21-335
중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 벤조에이트 프로모터 활성자 단백질이고, 상기 프로모터가 벤조에이트-유도성 프로모터이거나, 또는
(C) 상기 활성자 단백질이
(1) 서열 번호 9의 잔기 1-330, 및
(2) Ala268을 함유하는 서열 번호 9의 잔기 1-330
중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 안트라닐레이트 프로모터 활성자 단백질이고, 상기 프로모터가 안트라닐레이트-유도성 프로모터
인 발현 시스템.
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