KR20050016413A - 분리된 폴리뉴클레오타이드 및 균류에서 모폴로지 촉진 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 제 2 형태를 나타내는 네이티브 균류에 비해 상대적으로 제 1 형태를 나타내는 네이티브 균류에서 차별적으로 발현되는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 본 발명은 균류를 이용한 바이오프로세스 증진방법을 포함한다. 형질변형된 균류는 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자로 균류를 형질변형시켜 생성된다. 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자는 프로모터에 실시 가능하게 연결된 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 제 1 형태를 촉진하도록 발현된다. 제 1 형태의 형질변형된 균류는 제 2 형태의 형질변형된 균류를 이용한 바이오프로세스에 비해 상대적으로 바이오프로세스를 증진시킨다.

Description

분리된 폴리뉴클레오타이드 및 균류에서 모폴로지 촉진 방법{ISOLATED POLYNUCLEOTIDES AND METHODS OF PROMOTING A MORPHOLOGY IN A FUNGUS}

본 발명은 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자, 재조합 폴리뉴클레오타이드 구조물, 및 균류에서 모폴로지를 촉진하는 방법에 관한 것이다.

균류는 다수의 상업적으로 유용한 제품의 제조에 활용이 증가되고 있다. "필라멘트성" 균류로 알려진 균류의 타입은 현재 항생제(예, 페니실린 및 세팔로스포린) 및 유기산(예, 시트르산 및 퓨마르산)과 같은 대사물의 산업적규모 제조에 사용된다. 필라멘트성 균류는 또한 예를들어, 프로테아제 및 리파아제와 같은 효소의 산업적 생산에 유용하다.

원하는 화합물의 생산을 위한 필라멘트성 균류종의 활용은 균류의 수중 배양과 관련된다. 필라멘트성 균류는 수중 배양시 여러 형태를 나타낼 수 있으며, 그 중 하나는 필라멘트성 형태이다. 배양시 균류가 필라멘트성 형태를 나타내는 경우, 필라멘트 성장은 배지의 점도를 증가시킬 수 있다. 증가된 점도는 질량 수송 및 배양물의 통기 특성에 영향을 줄 수 있으며 바이오리액터에서 혼합문제를 야기할 수 있으며 그리고 전형적으로 감소된 생산성이 수반될 수 있다.

택일적으로, "필라멘트성" 균류는 펠렛 형태를 나타낼 수 있다. 필라멘트 형태를 나타내는 균류의 배양과 대조적으로, 펠렛 형태를 나타내는 균류 배양물의 점도는 상대적으로 낮아질 수 있으며 배양물의 혼합 및 통기시 보다 적은 힘이 이용될 수 있다. 예를들어, 시트르산, 이타콘산, 스태틴, 페니실린 및 여러 효소와 같은 다수의 생성물에서, 생산성은 필라멘트 형태를 나타내는 균류에 비해 펠렛 형태를 나타내는 균류를 이용하여 증가될 수 있다. 그러나, 적어도 특정 균류종에서, 예를들어, 소화 효소 혹은 퓨마르산의 생성은 필라멘트 형태를 나타내는 균류를 이용하여 증가될 수 있다.

균류에서 원하는 형태를 촉진시키는 방법을 개발하고 배양시 균류에 의해 나타나는 형태를 생산성이 최적화되도록 영향을 주거나 조절하는 방법을 개발하는 것이 요구될 수 있다.

일 견지로, 본 발명은 필라멘트 형태를 나타내는 네이티브 균류에 비해 상대적으로 펠렛 형태를 나타내는 네이티브 균류에서 차별적으로 발현되는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다.

일 견지로, 본 발명은 균류를 이용한 바이오프로세스를 증진시키는 방법을 포함한다. 변형된 균류는 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자로 륜류를 형질변형하여 생성된다. 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자는 프로모터에 실시가능하게 연결된 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드는 펠렛 형태를 촉진시키도록 발현된다. 형질변형된 균류의 펠렛 형태는 형질변형된 균류의 필라멘트 형태를 이용하는 바이오프로세스에 비해 상대적으로 바이오프로세스를 증진시킨다.

일 견지로, 본 발명은 균류의 형태를 촉진시키고 바이오프로세스의 생산성을 증진시키는 방법을 포함한다. 균류는 유전자 서열에 대해 상보적인 안티센스 배향 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질변형된다. 상기 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사물은 mRNA와 하이브리드되어 그 유전자의 발현을 억제한다. 이러한 유전자 억제는 모폴로지를 촉진시키고 다른 균류 형태에서의 바이오프로세스에 상대적으로 바이오프로세스를 증진시킨다.

도면의 간단한 설명

본 발명의 바람직한 구현은 하기 첨부된 도면을 참고로 이하 상세히 설명된다.

도 1은 SEQ ID NO.:1에 나타낸 Balu-4 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거(A. niger) 유전자 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 래인 1, 2 및 3은 펠렛 형태의 전사 수준을 나타낸다. 필라멘트 형태의 전사 수준은 필라멘트 형태 유도후 20분(래인 4), 40분(래인 5) 및 120분(래인 6)에 나타내어진다.

도 2는 A. 나이거(A. niger) Balu-4의 예측 아미노산 서열, SEQ ID NO.:2(상부 서열) 및 에머리셀라 니둘런스(Emericella nidulans) G-단백질 베타 서브유니트의 아미노산 서열, SEQ ID NO.:3(하부 서열)의 정렬 및 비교를 나타낸다.

도 3은 SEQ ID NO.:4에 나타낸 Balu-42 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거(A. niger) 유전자의 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 래인 1, 2 및 3은 펠렛 형태의 전사 수준을 나타낸다. 필라멘트 형태의 전사 수준은 필라멘트 형태 유도후 20분(래인 4), 40분(래인 5) 및 120분(래인 6)에 나타내어진다.

도 4는 SEQ ID NO.:6에 나타낸 Brsa-25 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거(A. niger) 유전자의 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 래인 1, 2 및 3은 펠렛 형태의 전사 수준을 나타낸다. 필라멘트 형태의 전사 수준은 필라멘트 형태 유도후 20분(래인 4), 40분(래인 5) 및 120분(래인 6)에 나타내어진다.

도 5는 SEQ ID NO.:8에 나타낸 Brsa-43 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거(A. niger) 유전자의 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 래인 1, 2 및 3은 펠렛 형태의 전사 수준을 나타낸다. 필라멘트 형태의 전사 수준은 필라멘트 형태 유도후 20분(래인 4), 40분(래인 5) 및 120분(래인 6)에 나타내어진다.

도 6은 A. 나이거(A. niger) Brsa-43의 예측 아미노산 서열, SEQ ID NO.:10(상부 서열) 및 호모 사피엔스(Homo sapiens) 리소좀 펩스태틴 무감지성 프로테아제의 아미노산 서열, SEQ ID NO.:11(하부 서열)의 정렬 및 비교를 나타낸다.

도 7은 SEQ ID NO.:12에 나타낸 Brsa-47 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거(A. niger) 유전자의 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 래인 1, 2 및 3은 펠렛 형태의 전사 수준을 나타낸다. 필라멘트 형태의 전사 수준은 필라멘트 형태 유도후 20분(래인 4), 40분(래인 5) 및 120분(래인 6)에 나타내어진다.

도 8은 A. 나이거(A. niger) Brsa-47의 예측 아미노산 서열, SEQ ID NO.:14(상부 서열) 및 세사멈 인디컴(Sesamum indicum) 미오-이노시톨 1-포스페이트 합성효소의 아미노산 서열, SEQ ID NO.:15(하부 서열)의 정렬 및 비교를 나타낸다.

도 9는 SEQ ID NO.:16에 나타낸 Brsa-109 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거(A. niger) 유전자의 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 래인 1, 2 및 3은 펠렛 형태의 전사 수준을 나타낸다. 필라멘트 형태의 전사 수준은 필라멘트 형태 유도후 20분(래인 4), 40분(래인 5) 및 120분(래인 6)에 나타내어진다.

도 10은 SEQ ID NO.:18에 나타낸 Brsa-118 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거(A. niger) 유전자의 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 래인 1, 2 및 3은 펠렛 형태의 전사 수준을 나타낸다. 필라멘트 형태의 전사 수준은 필라멘트 형태 유도후 20분(래인 4), 40분(래인 5) 및 120분(래인 6)에 나타내어진다.

도 11은 A. 나이거(A. niger) Brsa-118의 예측 아미노산 서열, SEQ ID NO.:20(상부 서열) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 히드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소로 추정되는 아미노산 서열, SEQ ID NO.:21(하부 서열)의 정렬 및 비교를 나타낸다.

도 12는 SEQ ID NO.:22에 나타낸 Arsa-7 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거(A. niger) 유전자의 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 래인 1, 2 및 3은 펠렛 형태의 전사 수준을 나타낸다. 필라멘트 형태의 전사 수준은 필라멘트 형태 유도후 20분(래인 4), 40분(래인 5) 및 120분(래인 6)에 나타내어진다.

도 13은 SEQ ID NO.:24에 나타낸 Arsa-48 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거(A. niger) 유전자의 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 래인 1, 2 및 3은 펠렛 형태의 전사 수준을 나타낸다. 필라멘트 형태의 전사 수준은 필라멘트 형태 유도후 20분(래인 4), 40분(래인 5) 및 120분(래인 6)에 나타내어진다.

도 14는 SEQ ID NO.:26에 나타낸 Brsa-118 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거(A. niger) 유전자의 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 래인 1, 2 및 3은 펠렛 형태의 전사 수준을 나타낸다. 필라멘트 형태의 전사 수준은 필라멘트 형태 유도후 20분(래인 4), 40분(래인 5) 및 120분(래인 6)에 나타내어진다.

도 15는 SEQ ID NO.:28에 나타낸 A-90 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거(A. niger) 유전자의 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 래인 1, 2 및 3은 펠렛 형태의 전사 수준을 나타낸다. 필라멘트 형태의 전사 수준은 필라멘트 형태 유도후 20분(래인 4), 40분(래인 5) 및 120분(래인 6)에 나타내어진다.

도 16은 SEQ ID NO.:33에 나타낸 Arsa-43 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거(A. niger) 유전자의 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 래인 1, 2 및 3은 펠렛 형태의 전사 수준을 나타낸다. 필라멘트 형태의 전사 수준은 필라멘트 형태 유도후 20분(래인 4), 40분(래인 5) 및 120분(래인 6)에 나타내어진다.

도 17은 A. 나이거(A. niger) Arsa-43의 예측 아미노산 서열, SEQ ID NO.:34(상부 서열) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 히드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소로 추정되는 아미노산 서열, SEQ ID NO.:35(하부 서열)의 정렬 및 비교를 나타낸다.

도 18은 SEQ ID NO.:36에 나타낸 Arsa-10 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거(A. niger) 유전자의 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 래인 1, 2 및 3은 펠렛 형태의 전사 수준을 나타낸다. 필라멘트 형태의 전사 수준은 필라멘트 형태 유도후 20분(래인 4), 40분(래인 5) 및 120분(래인 6)에 나타내어진다.

도 19는 SEQ ID NO.:37에 나타낸 Arsa-27 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거(A. niger) 유전자의 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 래인 1, 2 및 3은 펠렛 형태의 전사 수준을 나타낸다. 필라멘트 형태의 전사 수준은 필라멘트 형태 유도후 20분(래인 4), 40분(래인 5) 및 120분(래인 6)에 나타내어진다.

도 20은 Balu-4, Brsa-25, Brsa-43, Brsa-47, Brsa-109, 및 Brsa-118 유전자 각각에 대하여 네이티브 A. 나이거의 펠렛 형태(좌)에 상대적인 필라멘트 형태(우)에서의 증가된 발현 수준의 비교를 나타낸다.

도 21은 Arsa-7, Arsa-10, Arsa-27, A-27, Arsa-43 및 A-90 유전자 각각에 대하여 네이티브 A. 나이거의 필라멘트 형태(우)에 상대적인 펠렛 형태(좌)에서의 증가된 발현 수준의 비교를 나타낸다.

도 22는 각각 SEQ ID NOs.:1, 4, 6, 12, 16 및 18에 나타낸 Balu-4, Brsa-25, Brsa-43, Brsa-47, Brsa-109, 및 Brsa-118 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거 유전자의 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 패널(A)는 10ppb(Mn²⁺)(펠렛 형태)에서 14시간(래인 1), 24시간(래인 2), 48시간(래인 3), 72시간(래인 4), 96시간(래인 5) 및 120시간(래인 6)동안 성장된 네이티브 A. 나이거의 전사 수준을 나타낸다. 패널(B)는 1000ppb(Mn²⁺)(필라멘트 형태)에서 1시간(래인 1), 2시간(래인 2), 24시간(래인 3), 36시간(래인 4), 72시간(래인 5) 및 108시간(래인 6)동안 성장된 네이티브 A. 나이거의 전사 수준을 나타낸다.

도 23은 각각 SEQ ID NOs.:22, 24, 26 및 28에 나타낸 Arsa-7, A-37, Arsa-48 및 A-90 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거 유전자의 전사 수준의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 패널(A)는 10ppb(Mn²⁺)(펠렛 형태)에서 14시간(래인 1), 24시간(래인 2), 48시간(래인 3), 72시간(래인 4), 96시간(래인 5) 및 120시간(래인 6)동안 성장된 네이티브 A. 나이거의 전사 수준을 나타낸다. 패널(B)는 1000ppb(Mn²⁺)(필라멘트 형태)에서 1시간(래인 1), 2시간(래인 2), 24시간(래인 3), 36시간(래인 4), 72시간(래인 5) 및 108시간(래인 6)동안 성장된 네이티브 A. 나이거의 전사 수준을 나타낸다.

도 24는 본 발명의 특정 견지를 나타내는 흐름도이다.

도 25는 Balu-42(패널 A), Brsa-25(패널 B) 및 Brsa-118(패널 C)에 상보적인 안티센스 배향 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질변형된 A. 나이거에 대한 억제 결과를 나타낸다.

도 26은 rsa-7(패널 A), A-37(패널 B) 및 A-90(패널 C)에 상보적인 안티센스 배향 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질변형된 A. 나이거에 대한 억제 결과를 나타낸다.

도 27은 대조구 A. 나이거 및 Balu-42(스트레인 2805)에 상보적인 혹은 Brsa-118(스트레인 2808)에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 형질변형된 A. 나이거의 시트르산 생산을 나타낸다. 패널(A)는 각 형질변형 실험에 대하여 측정된 시트르산 생산을 나타낸다. 패널(B)는 패널(A)에서 나타낸 데이타의 평균값을 나타낸다.

바람직한 구현의 상세한 설명

본 발명은 네이티브 균류에서 다른 발현을 가질 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 설명을 위한 목적상, 용어 폴리뉴클레오타이드 서열의 "발현"은 전사 및 번역의 조합된 프로세스를 칭할 수 있으며 혹은 그 조합된 전사 및 번역 프로세스의 일부를 칭할 수 있다. 용어 "차별적 발현"은 발현의 둘 또는 그 이상의 다른 수준을 칭할 수 있으며, 혹은 첫번째 예에서는 발현이 존재하는 것에 비해 상대적으로 두번째 예에서는 발현이 부재하는 것을 칭할 수 있다.

본 발명은 네이티브 균류에 의해 나타내어지는 다른 형태들중에서 차별적으로 발현되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 본 발명의 설명을 위한 목적상, 용어 "네이티브"는 유전적으로 조작되지않은 유기체를 칭할 수 있다. 용어 "분리된"은 예를들어, 이를 생산하는 유기체로부터 회수된 폴리뉴클레오타이드 혹은 폴리펩타이드와 같이 자연적으로 발생하는 분자를 칭할 수 있으며, 혹은 택일적으로 합성 분자를 칭할 수 있다.

본 발명에 따른 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 필라멘트 형태의 균류에서 발현의 보다 낮은 수준 혹은 부재에 비해 상대적으로 펠렛 형태를 나타내는 균류에서 증가된 발현을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 택일적으로, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자는 펠렛 형태에서 발현의 보다 낮은 수준 혹은 부재에 비해 상대적으로 필라멘트 형태를 갖는 네이티브 균류에서 증가된 발현 수준을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 의해 포함되는 분리된 폴리뉴클레오타이드는 필라멘트 형태 및 펠렛 형태를 나타낼 수 있는 어떠한 소스의 균류로부터 분리될 수 있다. 소스 균류는 특정 그룹의 균류로 한정되지 않으며 주요 3가지 균류 그룹중 어느 멤버일 수 있다. 담자균류(Basidomycetes) 그룹의 예시적인 멤버는 파네로카에테 크리소포리움(Phanerochaete chrysosporium)이다. 자낭균류(Ascomycetes) 및 불완전 균류의 예시적인 멤버는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 에머리셀라 니둘란스(Emericella nidulans), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 페니실리움 크리소게넘(Penicillium chrysogenum) 및 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)를 포함한다. 접합균류(Zygomycetes) 그룹의 예시적인 멤버는 리조뮤코 미에헤이(Rhizomucor miehei) 및 리조퍼스 오리자에(Rhizopus oryzae)를 포함한다.

본 발명에 의해 포함되는 예시적인 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 펠렛 형태의 네이티브 A. 나이거에 상대적으로 필라멘트 형태의 네이티브 A. 나이거에서 차별적으로 발현되는 A. 나이거로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 차별적으로 발현되는 폴리뉴클레오타이드는 예를들어, SEQ ID NOs.:1, 4, 6, 8, 12, 18, 22, 24, 26, 28, 33, 36, 및 37중 어느 서열을 포함할 수 있으며, 혹은 이러한 서열중 어느 것에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. SEQ ID NOs.:1, 4, 6, 8, 12, 18, 22, 24, 26, 28, 33, 36, 및 37의 각 폴리뉴클레오타이드 서열은 전장 cDNA로부터 검출되는 부분 서열인 SEQ ID NOs.:36 및 37을 이용하여 하기 기술된 방법에 따라 제조된 전-장 cDNA 분자로부터 검출되는 서열에 상응한다. 본 명세서에 기술된 분리방법 및 기술은 예시적인 것이며 다수의 통상적인 기술이 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 생성하기위해 이용될 수 있는 것으로 이해된다.

SEQ ID NOs.:1, 4, 6, 8, 12, 18, 22, 24, 26, 28, 33, 36, 및 37의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 전-장 cDNA 분자는 PCR-SELECT^TM cDNA 서브트랙션 키트(CLONTECH, Palo Alto, California)와 함께 억제 서브트랙티브 하이브리드 기술(Diatchenko et al., Proceedings National Academy of Science U.S.A. Vol. 93, pp. 6025-6030, 1996)을 이용하여 A. 나이거 균주 ATCC11414로부터 획득된다. 2가지의 억제 서브트랙티브 cDNA 라이브러리가 구성된다. 첫번째 cDNA 라이브러리는 테스터로서 펠렛 타입 형태를 나타내는 A. 나이거로부터 획득된 cDNA 및 드라이버로서 필라멘트 형태를 나타내는 A. 나이거로부터 획득된 cDNA를 이용하여 구성된다. 드라이버/테스터 비율은 서브트랙션 키트 매뉴얼에 제시된 비율보다 3배 증가된다.

두번째 억제 서브트랙티브 cDNA 라이브러리는 테스터로서 필라멘트 형태를 나타내는 A. 나이거로부터 획득된 cDNA 및 드라이버로서 펠렛 형태를 나타내는 A. 나이거로부터 획득된 cDNA를 이용하여 생성된다. 첫번째 cDNA 풀은 첫번째 라이브러리로부터 생성되며 그리고 두번째 cDNA 풀은 두번째 라이브러리로부터 생성된다. 펠렛 형태에서 특이적으로 존재하거나 증가되는 차별적으로 발현되는 cDNAs는 탐침자로서 첫번째 cDNA 풀을 이용한 하이브리드화 및 탐침자로서 두번째 cDNA 풀을 이용한 독립적인 하이브리드화에 의해 첫번째 cDNA 라이브러리로부터 분리된다. 필라멘트 형태의 A. 나이거에서 증가되거나 특이적인 cDNA의 분리는 탐침자로서 첫번째 cDNA 풀 및 두번째 cDNA 풀을 이용하여 두번째 cDNA 라이브러리를 독립적으로 하이드리드화하여 이루어진다.

억제 서브트랙티브 하이브리드화에 의해 분리되는 차별적으로 발현되는 cDNAs의 세그먼트는 DNA 시퀀싱을 위해 선택된다. 상기 세그먼트의 시퀀싱은 T7-2 프라이머를 이용한 단일 패스 시퀀싱을 이용하여 수행된다. 억제 서브트랙티브 하이브리드에 의해 분리된 DNA 프레그먼트는 전-장 cDNAs 분리에 사용하기위한 유전자 특이 프라이머쌍을 디자인하는데 사용된다.

전-장 cDNA 분리는 마라톤 cDNA 증폭 키트 및 ADVANTAGE^® cDNA 중합효소(CLONTECH, Palo Alto, CA)를 이용하여 달성된다.

상기 억제 서브트랙티브 하이브리드 클론으로부터 디자인된 유전자 특이 프라이머는 신속한 증폭의 cDNA 엔드 PCR(RACE-PCR)를 수행하는데 사용된다. 전-장 cDNAs의 서열은 통상적인 자동화 DNA 시퀀싱법을 이용하여 검출된다.

12가지 전-장 cDNA 클론 및 두가지 부분 cDNA 클론이 상기한 바와 같은 방법에 따라 생성되고 시퀀싱된다. 이에 따라 얻어진 서열은 다음과 같다. Balu-4 cDNA의 서열은 SEQ ID NO.:1으로 나타내어지며; Brsa-42 cDNA의 서열은 SEQ ID NO.:4로 나타내어지며; Brsa-25 cDNA의 서열은 SEQ ID NO.:6으로 나타내어지며; Brsa-43 cDNA의 서열은 SEQ ID NO.:8로 나타내어지며; Brsa-47 cDNA의 서열은 SEQ ID NO.:12로 나타내어지며; Brsa-109 cDNA의 서열은 SEQ ID NO.:16로 나타내어지며; Brsa-118 cDNA의 서열은 SEQ ID NO.:18로 나타내어지며; Arsa-7 cDNA의 서열은 SEQ ID NO.:22로 나타내어지며; Arsa-48 cDNA의 서열은 SEQ ID NO.:24로 나타내어지며; A-37 cDNA의 서열은 SEQ ID NO.:26으로 나타내어지며; A-90의 서열은 SEQ ID NO.:28로 나타내어지며; Arsa-43 cDNA의 서열은 SEQ ID NO.:28로 나타내어지며; Arsa-10 cDNA의 부분 서열은 SEQ ID NO.:36으로 나타내어지며; 그리고 Arsa-27 cDNA의 부분 서열은 SEQ ID NO.:37로 나타내어진다.

조사된 14가지 각 폴리뉴클레오타이드 서열의 아미노산 서열은 알려진 유전암호를 이용하여 예측된다. 상동성 조사는 예측된 아미노산 서열과 NCBI 비-중복 GenBank CDS의 서열 사이의 상동성을 조사하기위해 BLASTP를 이용하여 수행된다. 모든 상동성 조사는 E=0.005의 출발 E 값을 이용하여 수행된다. 따라서, 각 BLAST 상동성 조사의 결과(하기 기술됨)는 이러한 초기 출발 값에 기초한다.

노던 블롯 분석은 각 14가지 cDNA 클론에 따른 네이티브 A. 나이거에서 유전자의 발현수준을 분석하기위해 이용된다. 필라멘트 형태를 나타내는 A. 나이거에 의한 각 유전자의 발현은 펠렛 형태를 나타내는 A. 나이거에서 동일한 유전자의 발현과 비교된다. 발현 분석을 위해, A. 나이거는 초기에 약 12ppb(part per billion) Mn²⁺이하를 함유하는 배지에서 12시간동안 배양된다. 초기의 배양 12시간후, 배양물은 반씩 나누어져, 반은 저 Mn²⁺ 농도(약 12ppb이하)로 유지되고 나머지 반은 약 1000ppb Mn²⁺의 최종농도를(또는 일부 경우에는 약 15ppb Mn²⁺이상의 최종농도를) 갖도록 한다. A. 나이거는 Mn²⁺ 농도에 상당히 민감할 수 있다. 약 12ppb이하의 Mn²⁺ 농도에서, 네이티브 A. 나이거는 펠렛 형태를 나타내는 반면에 약 12ppb보다 높은 Mn²⁺ 농도에서는 필라멘트 형태를 나타낸다. 본 설명을 단순화하기위해, 배양물이 반으로 나누어지는 시점(초기 배양의 12시간후)은 0시간(t=0)으로 칭하여진다. 또한, 12ppb이상의 최종농도에 Mn²⁺의 첨가는 필라멘트 형태를 촉진시키기때문에, Mn²⁺의 첨가는 필라멘트 유도로 간주될 수 있다.

배양 시료는 0시간후 비-유도된 배양물(펠렛 형태) 및 유도된 배양물(필라멘트 형태) 모두에서 20, 40, 60 및 120분에 수집된다. 시료는 원심분리되어 배양 펠렛으로 형성되고 이는 액체 질소로 동결되고 토탈 RNA 추출을 위해 -80℃에 보관된다.

토탈 RNA는 통상의 방법을 이용하여 동결된 배양 펠렛으로부터 분리될 수 있다. 통상의 겔 전기영동기술 및 후속적인 블로팅 멤브레인으로의 트랜스퍼에 의한 토탈 RNA 시료의 크기 분획화 후, 각 시점에서 수집된 토탈 RNA 시료는 상기 분리된 억제 서브트랙티브 하이브리드 cDNA 프레그먼트를 무작위로 프라이밍하여 합성된 혹은 제한효소로 다이제스팅된 전-장 cDNA의 프레그먼트를 무작위로 프라이밍하여 합성된 탐침자의 하이브리드화를 이용하여 분석된다. 탐침자 합성은 [³²P]-α-dCTP의 통합을 포함한다. 노던 블롯의 하이브리드 결과는 블롯을 x-선 필름에 노출시켜 가시화될 수 있다.

도 1은 Balu-4 SEQ ID NO.:1에 상응하는 A. 나이거(A. niger) 유전자 발현의 노던 블롯 분석의 x-선 필름 노출을 나타낸다. 증가된 하이브리드는 펠렛 형태(래인 1-3)에서 생성된 mRNA에 비해 필라멘트 배양물(래인 4, 5 및 6)로부터 취한 mRNA 시료에서 명백히 나타난다. 토탈 RNA 15㎍이 각 래인마다 사용된다. 사용된 RNA 시료는 t=0 이후의 펠렛 배양물로부터, t=20분(래인 1), t=40분(래인 2) 및 t=120분(래인 3)에 획득되며; 그리고 유도후 필라멘트 배양물로부터, t=20분(래인 4), t=40분(래인 5) 및 t=120분(래인 6)에 획득된다. 각 래인에 사용된 토탈 RNA 및 하기 기술된 각 노던 블롯에 대한 래인 식별은 도 1에 나타낸 바와 같다. 도 1의 결과는 Balu-4는 네이티브 A. 나이거에서 다르게 발현되며 필라멘트 형태에서 증가된 발현 수준이 검출되었음을 나타낸다.

Balu-4의 예측 아미노산 서열은 SEQ ID NO.:2에 나타낸다. Balu-4 아미노산 서열은 Balu-4 cDNA 서열(SEQ ID NO.:1)로부터 예측된다. 도 2에 나타낸 바와 같이, BLASTP를 이용한 아미노산 서열 상동성은 SEQ ID NO.:2(상부 서열)이 에머리셀라 니둘란스(Emericella nidulans)의 G-단백질 베타 서브유니트의 아미노산 서열, SEQ ID NO.:3(하부 서열)과 97% 동일성을 가짐을 나타낸다. 서열 동일 위치는 SEQ ID NO.2:(상부)와 SEQ ID NO.3:(하부)사이에 그에 상응하는 동일 아미노산 기호를 배치하여 나타낸다. 중간물 SEQ ID NO.:2 및 SEQ ID NO.:3에 나타낸 기호 "+"는 보존성 아미노산 차이를 나타낸다. 본 발명의 목적상 보존성 아미노산 차이 혹은 보존성 아미노산 치환은 한 아미노산이 유사한 화학 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환되는 것을 칭할 수 있다. 또한, 용어 "상동성"은 일부 경우에 동일한 혹은 보존성 아미노산을 칭할 수 있다.

도 2에서 SEQ ID NO.:2 및 SEQ ID NO.:3내의 해당 위치사이의 오픈 스페이스의 표시는 정렬된 두 서열사이의 비-보존성 아미노산 차이를 나타낸다. SEQ ID NO.:3과 상대적으로 최소의 동일성을 갖는 SEQ ID NO.:2의 3 섹션은 SEQ ID NOs.:30, 31 및 32에 나타낸 바와 같다. SEQ ID NO.:30은 SEQ ID NO.:2의 아미노산 28-49에 상응된다. SEQ ID NO.:31은 SEQ ID NO.:2의 아미노산 194-209에 상응된다. SEQ ID NO.:32는 SEQ ID NO.:2의 아미노산 260-288에 상응된다.

도 3은 Balu-42, SEQ ID NO.:4에 상응하는 네이티브 유전자 발현의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 필라멘트 형태에서 Balu-42에 상응하는 mRNA의 증가된 검출은 Balu-42가 펠렛 형태의 네이티브 A. 나이거에 비해 필라멘트 형태의 네이티브 A. 나이거에서 증가된 발현을 갖는 것으로 다르게 발현됨을 나타낸다.

SEQ ID NO.:5는 SEQ ID NO.:4로부터 예측된 Balu-42 아미노산 서열에 상응한다. BLASTP 상동성 검색은 SEQ ID NO.:5와 조사되는 데이타베이스의 어느 서열과의 상동성을 확인할 수 없었다.

도 4는 SEQ ID NO.:6에 나타낸 Brsa-25 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 유전자 발현의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 그 결과는 Brsa-25가 펠렛 형태의 네이티브 A. 나이거에 비해 필라멘트 형태의 네이티브 A. 나이거에서 증가된 발현을 갖는 것으로 다르게 발현됨을 나타낸다.

Brsa-25 SEQ ID NO.:6의 예측 아미노산 서열은 SEQ ID NO.:7에 나타낸다. BLASTP 상동성 검색은 SEQ ID NO.:7과 조사되는 데이타베이스의 어느 서열과의 상동성을 확인할 수 없었다.

도 5는 SEQ ID NO.:8에 나타낸 Brsa-43 cDNA에 상응하는 네이티브 유전자 발현의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 이 노던 블롯 결과는 Brsa-43이 펠렛 형태의 네이티브 A. 나이거에 비해 필라멘트 형태의 네이티브 A. 나이거에서 증가된 발현을 갖는 것으로 다르게 발현됨을 나타낸다.

SEQ ID NO.:8로부터 예측된 Brsa-43 아미노산 서열은 SEQ ID NO.:9에 나타낸다. SEQ ID NO.:10은 SEQ ID NO.:9의 아미노산 29-594에 상응한다. 도 6은 사람 트레펩티딜펩티다아제 I 전구체(리소조멀 펩스태틴 무감응성 프로테아제)의 아미노산 서열, SEQ ID NO.:11(하부 서열)과 31% 동일성을 갖는 Brsa-43 SEQ ID NO.:10(상부 서열)의 BLASTP 정렬 및 비교를 나타낸다. 서열사이의 동일성 및 상동성의 확인은 도 2에 대해 앞서 설명된 바와 같다.

도 7은 SEQ ID NO.:12에 나타낸 cDNA에 상응하는 네이티브 Brsa-47 유전자 발현의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 그 결과는 Brsa-47이 펠렛 형태의 네이티브 A. 나이거에 비해 필라멘트 형태의 네이티브 A. 나이거에서 증가된 발현을 갖는 것으로 다르게 발현됨을 나타낸다.

SEQ ID NO.:12로부터 예측된 Brsa-47 아미노산 서열은 SEQ ID NO.:13에 나타낸다. 도 8은 SEQ ID NO.:13의 아미노산 26-530에 상응하는 SEQ ID NO.:14(상부 서열)에 대한 BLASTP 상동성 검색 결과를 나타낸다. BLASTP 결과는 SEQ ID NO.:14가 세사멈 인디컴(Sesamun indicum), SEQ ID NO.:15(하부 서열)의 미오-이노시톨 1-포스페이트 합성효소의 아미노산 서열과 56% 동일성을 갖는 것으로 보여준다.

SEQ ID NO.:16에 나타낸 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거의 Brsa-109 유전자의 발현의 노던 블롯 분석 결과를 도 9에 나타낸다. 그 결과는 Brsa-109 유전자는 펠렛 형태에 비해 필라멘트 형태에서 증가된 발현을 갖는 것으로 다르게 발현됨을 나타낸다.

SEQ ID NO.:16으로부터 예측된 Brsa-109 아미노산 서열은 SEQ ID NO.:17에 나타낸다. BLASTP 상동성 검색은 SEQ ID NO.:19와 데이타베이스내의 어느 서열사이의 상동성을 확인할 수 없었다.

도 10은 SEQ ID NO.:18에 나타낸 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거의 Brsa-118 유전자 발현의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 그 결과는 Brsa-118 유전자가 펠렛 형태의 네이티브 A. 나이거에 비해 필라멘트 형태의 네이티브 A. 나이거에서 증가된 발현을 갖는 것으로 다르게 발현됨을 나타낸다.

SEQ ID NO.:18로부터 예측된 Brsa-118의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.:19에 나타낸다. 도 11은 Brsa-118에 대한 BLASTP 상동성 검색결과를 나타낸다. 그 결과는 Brsa-118의 예측 아미노산 서열, SEQ ID NO.:20(상부 서열)은 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)의 추정 히드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소의 아미노산 서열, SEQ ID NO.:21(하부 서열)과 66% 동일성을 가짐을 나타낸다.

도 12는 SEQ ID NO.:22에 나타낸 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거의 Arsa-7 유전자 발현의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 그 결과는 Arsa-7 유전자가 필라멘트 형태에서의 발현수준에 비해 펠렛 형태에서 증가된 발현수준을 갖는 것으로 다르게 발현됨을 나타낸다.

SEQ ID NO.:22로부터 예측된 Arsa-7의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.:23에 나타낸다. BLASTP 상동성 검색은 상기 Arsa-7의 예측된 아미노산 서열과 어느 서열사이의 상동성을 확인할 수 없었다.

도 13은 SEQ ID NO.:24에 나타낸 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거의 Arsa-48 유전자 발현의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 그 결과는 Arsa-48 유전자가 필라멘트 형태에 비해 펠렛 형태에서 발생되는 증가된 발현수준을 갖는 것으로 다르게 발현됨을 나타낸다.

SEQ ID NO.:24로부터 예측된 Arsa-48 아미노산 서열은 SEQ ID NO.:25에 나타낸다. BLASTP 상동성 검색은 상기 Arsa-48 아미노산 서열과 조사되는 데이타베이스의 어느 다른 아미노산 서열사이의 상동성을 확인할 수 없었다.

도 14는 SEQ ID NO.:26에 나타낸 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거의 A-37 유전자 발현의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 그 결과는 A-37 유전자가 필라멘트 형태에서 검출된 발현수준에 비해 펠렛형태에서 발생되는 증가된 발현수준을 갖는 것으로 다르게 발현됨을 나타낸다.

SEQ ID NO.:26으로부터 예측된 A-37 아미노산 서열은 SEQ ID NO.:27에 나타낸다. BLASTP 상동성 검색은 상기 A-37 아미노산 서열과 조사되는 데이타베이스의 다른 아미노산 서열사이의 상동성을 확인할 수 없었다.

도 15는 SEQ ID NO.:28에 나타낸 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거의 A-90 유전자 발현의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 그 결과는 A-90 유전자가 필라멘트 형태에서 검출된 발현 수준에 비해 펠렛 형태에서 발생되는 증가된 발현수준을 갖는 것으로 다르게 발현됨을 나타낸다.

SEQ ID NO.:28로부터 예측된 A-90 아미노산 서열은 SEQ ID NO.:29에 나타낸다. BLASTP 상동성 검색은 상기 A-37 아미노산 서열과 조사되는 데이타베이스의 다른 아미노산 서열사이의 상동성을 확인할 수 없었다.

도 16은 SEQ ID NO.:33에 나타낸 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거의 A-90 유전자 발현의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 그 결과는 Arsa-43 유전자가 필라멘트 형태에 비해 펠렛 형태에서 증가된 발현수준을 갖는 것으로 다르게 발현됨을 나타낸다.

SEQ ID NO.:33으로부터 예측된 Arsa-43 아미노산 서열은 SEQ ID NO.:34에 나타낸다. 도 17은 Arsa-43에 대한 BLASTP 상동성 검색 결과를 나타낸다. 그 결과는 Arsa-43의 예측 아미노산 서열, SEQ ID NO.:34(상부 서열)이 아스퍼질러스 니둘런스(Aspergillus nidulans)의 폴리유비퀴틴 단백질의 아미노산 서열, SEQ ID NO.:35(하부 서열)과 96% 동일성을 가짐을 나타낸다.

도 18은 SEQ ID NO.:36에 나타낸 cDNA 부분 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거의 Arsa-10 유전자 발현의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 그 결과는 Arsa-43 유전자가 필라멘트 형태에 비해 펠렛 형태에서 증가된 발현수준을 갖는 것으로 다르게 발현됨을 나타낸다. 상동성 검색은 SEQ ID NO.:36과 조사된 데이타베이스내의 다른 폴리뉴클레오타이드 서열사이의 어떠한 상동성도 검출할 수 없다.

도 19는 SEQ ID NO.:37에 나타낸 cDNA 서열에 상응하는 네이티브 A. 나이거의 Arsa-27 유전자 발현의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸다. 그 결과는 Arsa-43 유전자가 필라멘트 형태에 비해 펠렛 형태에서 증가된 발현수준을 갖는 것으로 다르게 발현됨을 나타낸다. 상동성 검색은 SEQ ID NO.:37과 조사된 데이타베이스내의 다른 폴리뉴클레오타이드 서열사이의 어떠한 상동성도 검출할 수 없다.

도 20 및 21과 관련하여, 이는 여러가지 A. 나이거 유전자의 다른 발현의 막대-차트 비교를 나타낸다. 도 20은 유전자 Balu-4, Brsa-25, Brsa-43, Brsa-47, Brsa-109 및 Brsa-118에 대한 전사수준을 나타내며, 이는 필라멘트 A. 나이거에서 증가된 발현을 나타낸다. 도 21은 유전자 Arsa-7, Arsa-10, Arsa-27, A-37, Arsa-43, 및 A-90에 대한 전사수준을 나타내며, 이는 펠렛 형태의 A. 나이거에서 증가된 발현을 나타낸다.

추가적인 발현 분석은 t=0(상기에서 정의된 바와 같음) 이후 최고 5일간 성장된 배양물을 이용하여 수행된다. 도 22는 펠렛 조건(패널 A)에서 성장된 A. 나이거의 전사수준에 비교하여 필라멘트 조건(패널 B)에서 성장된 네이티브 A. 나이거의 유전자 Balu-4, Balu-42, Brsa-25, Brsa-47, Brsa-109 및 Brsa-118에 대한 증가된 전사수준을 나타낸다. 도 23은 필라멘트 배양물(패널 B)에서 그에 상응하는 전사의 수준에 비해 펠렛조건(패널 A)에서 성장된 네이티브 A. 나이거에서 유전자 Arsa-7, A-37, Arsa-48, 및 A-90에 대한 증가된 전사수준을 나타낸다.

특정 구현예로, 본 발명은 SEQ ID NOs.: 2, 5, 7, 9, 13, 17, 19, 23, 25, 27, 29 및 34중 어느 것으로 나타낸 아미노산 서열 및 이들의 기능적 등가물(functional equivalents)을 포함하는 분리된 폴리펩타이드 분자를 포함한다. 본 발명의 목적상, 용어 기능적 등가물은 생략되지않고 치환되지않은 폴리펩타이드에 비해 실질적으로 동등한 기능적 특성 및/또는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열의 생략된 형태 혹은 보존적으로 치환된 형태를 가리킬 수 있다. 당해 기술분야의 숙련자에의해 이해되는 바와 같이, 보존성 아미노산 치환을 상기 서열목록에 나타낸 아미노산 서열내로 트렁케이팅 혹은 도입하기위해 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 본 발명의 분리된 폴리펩타이드를 생산하기위해 통상적인 방법이 이용될 수 있다.

상기한 바와 같이 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자에 부가적으로, 본 발명은 SEQ ID NOs.:2, 5, 7, 9, 13, 17, 19, 23, 25, 27, 29 및 34에 나타낸 아미노산 서열을 암호하거나 혹은 이들 아미노산 서열의 기능적 등가물을 암호하는 택일적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명은 또한 SEQ ID NOs.:36 및 37에 의해 암호화된 아미노산 서열 및 기능적 등가물, 및 SEQ ID NOs.:36 및 37에 의해 암호화된 아미노산 서열을 암호하는 택일적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 당해 분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 여러가지 변형이 그 결과물인 아미노산 서열에 유전 암호의 퇴행적 특성을 야기하는 것 없이 폴리뉴클레오타이드 서열내로 도입될 수 있다.

여러가지 재조합 폴리뉴클레오타이드 구조물이 본 발명에 의해 포함된다. 특정 구현예로, 본 발명에 따른 재조합 폴리뉴클레오타이드 구조물은 상기한 바와 같은 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열중 어느 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열중 어느 것의 전체 혹은 일부가 프로모터에 연결될 수 있으며, 바람직하게 프로모터에 실시 가능하게 연결된다. 재조합 폴리뉴클레오타이드 구조물을 형성하기위한 폴리뉴클레오타이드와 프로모터의 실시 가능한 연결은 그 프로모터에 의해 조절되어지는 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능케한다. 택일적으로, SEQ ID NOs.:1, 4, 6, 8, 12, 16, 18, 22, 24, 26, 28, 33, 36 및 37중 어느 하나에 나타낸 서열의 적어도 일부와 상보적인 서열이 재조합 폴리뉴클레오타이드를 형성하기위해 이용될 수 있으며 안티센스 방향으로 통합될 수 있다.

특정 견지로, 상기 상보적 서열은 억제 하이브리드(하기에 기술됨)가 가능하기에 충분한 길이를 갖는 상보적 서열의 일부를 포함할 수 있다. 30보다 작은 소수의 폴리뉴클레오타이드 서열의 사용이 예측되지만, 억제 하이브리드는 전형적으로 30이상의 길이를 갖는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드의 사용을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NOs.:1, 4, 6, 8, 12, 16, 18, 22, 24, 26, 28, 33, 36 및 37중 어느 하나에 나타낸 서열의 프레그먼트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 상보적 프레그먼트를 포함한다. 이러한 프레그먼트는 바람직하게 적어도 30뉴클레오타이드 길이의 그에 상응하는 서열 혹은 상보적 서열을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열중 어느 것을 포함하는 벡터를 포함한다. 본 발명에 의해 포함되는 벡터는 특정 타입의 벡터로 한정되지않으며 예를들어, 플라스미드, 코스미드 혹은 바이러스 벡터일 수 있다. 본 발명에 따른 벡터는 숙주세포내로 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 하나 또는 그 이상 도입하는데 이용될 수 있다. 숙주세포는 특정 세포타입으로 한정되는 것은 아니며 예를들어, 박테리아, 균류, 혹은 보다 고등의 진핵 세포일 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 포함되는 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터 및/또는 통합 벡터일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자중 어느 것을 포함하도록 형질변형된, 형질변형 숙주 세포 및 세포 배양물을 포함한다. 통상의 세포 형질변형 기술이 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드를 원하는 숙주세포내로 도입하는데 이용될 수 있다.

본 발명은 균류에서 모폴로지를 촉진하는 방법을 포함한다. 균류에서 모폴로지를 촉진하는 방법은 도 24의 흐름도를 참고로 설명된다. 초기 단계 100에서, 분리된 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 단계 100으로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드는 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드중 어느 것을 포함할 수 있다.

단계 100으로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드는 단계 100에서 재조합 폴리뉴클레오타이드를 형성하는데 사용될 수 있다. 상기한 바와 같이, 재조합 폴리뉴클레오타이드의 형성은 프로모터와 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 실시 가능하게 연결하는 것을 포함할 수 있다. 부가적으로, 재조합 뉴클레오타이드의 형성 단계 110은 단계 120에서 균류를 형질변형하는데 이용될 수 있는 벡터의 형성을 포함할 수 있다. 다수의 균류가 형질변형 단계 120에 이용될 수 있다. 바람직하게 형질변형되어지는 균류는 필라멘트 형태를 나타낼 수 있으며 부가적으로 펠렛 형태를 나타낼 수 있다. 단계 120의 목적상 예시적인 균류는 예를들어, 상기에서 소스 균류와 관련하여 기술된 균류중 어느 것일 수 있다.

형질변형 단계 120 후에, 재조합 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리뉴클레오타이드는 단계 130에서 형질변형된 균류로부터 발현될 수 있다. 단계 130에서의 발현은 균류의 특정 형태 형성을 촉진할 수 있다. 발현에 의해 촉진된 특정 형태는 단계 100에서 제공된 분리된 폴리뉴클레오타이드의 서열에 의해 검출될 수 있다. 예를들어, 필라멘트 형태는 SEQ ID NOs.:2, 5, 9, 13, 17 및 19중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열, 및 이들의 기능적 등가물을 포함하는 폴리펩타이드를 암호하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공함으로써 촉진될 수 있다. 택일적으로, 펠렛 형태는 SEQ ID NOs.:23, 25, 27, 29, 및 34중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열, 및 이들의 기능적 등가물을 포함하는 폴리펩타이드를 암호하거나 혹은 폴리뉴클레오타이드 SEQ ID NO.:36 또는 37에 의해 암호화된 아미노산 서열을 암호하는 단계 100에서 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공함으로써 촉진될 수 있다.

본 발명의 택일적인 구현예로, (상기한 바와 같은)안티센스 배향 상보적 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드가 형질변형 단계 120에 이용될 수 있다. 억제 단계 140에서, 안티센스 DNA의 전사로부터 생성된 RNA는 네이티브 mRNA와 RNA 이중가닥(dsRNA)을 형성할 수 있어 이에 따라 RNA 분해를 촉진하며 그리고/또는 그 mRNA의 번역을 억제 혹은 차단할 수 있다. 따라서, 단계 120에서 유도된 재조합 안티센스 구조물은 원하는 형태로 형성을 촉진하기위해 상기 상보적 유전자의 발현을 억제 혹은 차단할 수 있다. 예를들어, SEQ ID NOs.:1, 4, 8, 12, 16 또는 18중 어느 것의 프레그먼트나 그 전체에 상보적인 서열이 단계 120에서 도입될 수 있다. 단계 140에서, 상기 안티센스 상보적 서열로부터 생성된 전사물은 각각 유전자 Balu-4, Balu-42, Brsa-25, Brsa-43, Brsa-47, Brsa-109 또는 Brsa-118로부터 전사된 mRNA와 하이브리드될 수 있으며, 이에 상응하는 단백질 생성물의 생산을 억제 또는 차단할 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 의한 하나 또는 그 이상의 Balu-4, Balu-42, Brsa-25, Brsa-43, Brsa-47, Brsa-109 또는 Brsa-118의 억제는 형질변형된 숙주에서 펠렛 형태를 촉진시킬 수 있다. 마찬가지로, SEQ ID NOs.:22, 24, 26, 28, 33, 36, 및 37중 어느 것의 프레그먼트나 그 전체에 상보적인 하나 또는 그 이상의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드가 단계 120에 도입될 수 있으며, 그에 상응하는 유전자 Arsa-7, Arsa-48, A-37, A-90, Arsa-43, Arsa-10 및 Arsa-27의 발현을 억제 혹은 차단할 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 의한 하나 또는 그 이상의 Arsa-7, Arsa-48, A-37, A-90, Arsa-43, Arsa-10 및 Arsa-27의 억제는 형질변형된 숙주에서 필라멘트 형태를 촉진시킬 수 있다.

도 24에 나타낸 프로세스는 단계 100에서 단일의 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것으로 기술되었지만, 본 발명은 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드를 둘 또는 그 이상으로 제공하는 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열은 단계 100에서 제공될 수 있으며, 여기서 제공된 적어도 하나의 분리된 폴리뉴클레오타이드는 발현시 펠렛 형태를 촉진할 수 있으며 그리고 제공된 적어도 하나의 다른 분리된 폴리뉴클레오타이드는 발현시 필라멘트 형태를 촉진할 수 있는 것으로 이해된다. 단계 110에서 다르게 유도가능한(differing inducible) 프로모터에 다르게 분리된(differing isolated) 폴리뉴클레오타이드를 실시 가능하게 연결시키고, 형질변형 단계 120을 위해 다중 재조합 폴리뉴클레오타이드를 사용함으로써, 단계 130 혹은 140에서 발현을 유도하여 필라멘트 형태 혹은 펠렛 형태를 선택적으로 촉진하는 것이 가능할 수 있다.

특정 균류 형태의 사용은 균류 배양시 바이오프로세스를 증진시킬 수 있기때문에, 균류에서 특정 형태 형성을 촉진하는 것은 이득적일 수 있다. 예를들어, 펠렛 형태의 균류 사용은 예를들어, 헤미셀룰라아제 발현, 셀룰라아제 발현, 리그나아제 발현, 바이오매스의 알코올 전환, 유기산 생성, 글루코아밀라아제 생성, 페니실린 생성 및 로바스태틴 생성과 같은 여러가지 바이오프로세스를 증진시킬 수 있다. 택일적으로, 필라멘트 균류 배양물의 사용은 퓨마르산 생성 혹은 소화 효소 생성과 같은 바이오프로세스를 증진시킬 수 있다.

도 24에 나타낸 프로세스는 형질변형된 균류를 생성하고 형질변형된 균류에서 펠렛 형태를 촉진시키는데 이용될 수 있으며, 이는 동일한 조건하에 비-변형된 균류 배양물에 상대적으로 상기 형질변형된 균류를 함유하는 배양물에서 원하는 생성물의 생성을 증진시키는데 활용될 수 있다. 택일적으로, 상기 프로세스는 형질변형된 균류를 생성하고 형질변형된 균류에서 필라멘트 형태를 촉진시키는데 이용될 수 있다. 촉진된 필라멘트 형태는 동일한 조건하에 비-변형된 균류 배양물에 상대적으로 상기 형질변형된 균류를 함유하는 배양물에서 원하는 생성물의 생성을 증진시킬 수 있다.

본 발명은 또한 상기 형태 촉진 구조물과 함께 하나 또는 그 이상의 관심대상의 단백질을 암호하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드의 동시-도입을 포함한다. 관심대상의 단백질은 숙주에 대하여 네이티브일 수 있으며 혹은 다른 균류나 비-균류종의 것일 수 있다. 관심대상의 단백질이 제2 형태에 비해 제1 형태에서 증가된 발현 및/또는 활성을 갖는 경우, 동시-도입된 형태 촉진 구조물은 바람직하게 제1 형태를 촉진할 수 있다. 관심대상의 단백질은 배양물로부터 수집될 수 있는 것이거나 원하는 생성물 혹은 화합물을 생성하는 바이오프로세스와 관련된 것일 수 있다.

실시예 1: DNA 분리 및 기능 분석에 대한 일반적 방법.

에스케리차 콜라이(Escherichia coli)(E. coli) 균주 DH5α 및 JM109가 클로닝 실험용 숙주로 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 AGL0가 바이너리 벡터 및 A. 나이거의 형질변형용 숙주로 사용된다.

억제 서브트랙티브 하이브리드(SSH)에 의한 모폴로지 관련 유전자의 분리를 위해, 토탈 RNA는 Chomczynski 및 Sacch(Anal. Biochem. 162:156-159(1987))에 의해 기술된 변형된 산 페놀-구아니디움 이소티오시아네이트-클로로포름 추출법에 따라 A. 나이거로부터 분리된다. SSH는 PCR-SELECT^TM cDNA 서브트랙션 키트(CLONTECH, Palo Alto CA)를 이용하여 사용된 테스터에 대한 드라이버 cDNA의 양을 제1 및 제2 하이브리드 각각에 세배로 한 것을 제외하고 제조자에 의해 기술된 바와 같이 수행된다.

모폴로지 관련 클론은 SSH cDNA 라이브러리의 미분 스크리닝에 의해 확인된다. 새로이 분리된 클론 서열에 대하여 두 올리고뉴클레오타이드가 디자인된다. 각 cDNA 클론의 5'-말단 및 3'-말단을 분리하기위해 cDNA 및 PCR(RACE-PCR)의 신속한 증폭이 수행된다.

균류 형질변형은 바이너리 벡터 pGA482(An et al., "Binary Vectors" in Plant Molecular Biology Manual, Gelvin and Schilperolands(1988), pp A3/1-19)내로 삽입된 pAN7-1의 Bgl II/Xba I pGpdA-hph-TtrpC 프레그먼트(Punt and van der Hondel, Methods Enzymol. 216: 447-57(1992))를 사용하여 달성된다. pGA482에 기초한 구조물을 아그로박테리움 터메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 AGLO내로 도입하는 것은 동결-및-해동 방법(Ebert et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84: 5745-5749(1987))을 이용하여 수행된다. 플라스미드는 형질변형된 A. 터메파시엔스(A. tumefaciens)로부터 분리되고, 여러가지 제한효소로 다이제스팅되고, 형질변형을 확인하기위해 아가로즈 겔 전기영동을 이용하여 분석된다. 균류 형질변형은 Groot et al.(Nat. Biotechnol. 18:839-42(1998))에 의해 기술된 바와 같이 수행된다. 적어도 15개의 독립적으로 형질변형된 균류가 선택되고 각 유전자도입 이벤트에 대하여 히그로마이신 250㎍/ml 및 세포택신 250㎍/ml을 함유하는 아가 최소 배지에서 배양된다.

실시예 2: 안티센스 발현을 이용한 모폴로지 촉진.

각 조작 유전자(transgene) 발현 벡터는 하기중 하나와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 구성된다: Balu-42(SEQ ID No.:4); Brsa-25(SEQ ID No.:6); Brsa-118(SEQ ID No.:18); Arsa-7(SEQ ID No.:22); A-37(SEQ ID No.:26); 및 A-90(SEQ ID No.:28). 상보적 서열은 A. 니둘런스(A. nidulans) 포스포글리세릴 디하이드로게나아제(gpdA) 프로모터 및 A. 니둘런스(A. nidulans) trpC 터미네이터의 조절하에 안티센스 방향으로 벡터내에 편입된다. 구성된 벡터는 아그로박테리움 터메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개 형질변형을 이용하여 A. 나이거내로 독립적으로 도입된다. 대조구 A. 나이거는 편입된 안티센스 서열없이 바이너리 벡터로 형질변형되어 제조된다.

도 25는 동일한 조건하에서 배양된 대조구 A. 나이거와 비교된, 안티센스 Balu-42, Brsa-25 및 Brsa-119를 발현하는 유전자도입 A. 나이거(우)에서의 펠렛 형태의 촉진을 나타낸다. 도 26은 동일한 조건하에서 배양된 대조구 A. 나이거와 비교된, 안티센스 Arsa-7, A-37 및 A-90을 발현하는 유전자도입 A. 나이거(우)에서의 필라멘트 형태의 촉진을 나타낸다.

실시예 3: 모폴로지가 증가된 바이오-프로덕션.

Balu-42(스트레인 2805) 또는 Brsa-118(스트레인 2808)에 상보적인 안티센스를 포함하는 유전자도입 A. 나이거를 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조한다. 각 균주의 다중 독립적으로 형질변형된 배양물 및 다중 대조구 배양물(상기한 바와 같이 제조됨)을 30℃에서 50시간 배양하였다. 도 26과 관련하여, 패널 A는 형질변형된 균주 2805(Balu-42) 및 2808(Brsa-118)의 각 배양물 및 대조구 A. 나이거에 대한 시트르산 생산성을 나타낸다. 패널 B는 대조구 배양물에 상대적인 균주 2805 및 2808의 배양물에 대한 평균 시트르산 생산성을 나타낸다.

그 결과는 본 발명의 방법 및 서열은 균류에서 모폴로지를 촉진하는데 이용될 수 있음을 보여준다. 본 발명의 방법에 의한 모폴로지의 촉진은 단백질의 생성 증가 및/또는 유전자도입 균류를 이용한 바이오프로세스 증진에 이용될 수 있다.

상황에 따라, 본 발명은 구조적 및 방법적 특성에 대하여 다소 특이적인 언어로 기술되었다. 그러나, 본 명세서에서 개시된 그 의미는 효과와 관련된 본 발명의 바람직한 형태를 포함하기때문에, 본 발명은 이와 같이 나타내고 설명된 특이적 특성으로 제한되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 균등론에 따라 적절히 해석되는 첨부된 청구항의 적절한 견지내에 있는 어느 형태나 변형으로 청구된다.

<110> Battelle Memorial Institute <120> Isolated Polynucleotides and Methods of Promoting a Morphology In a Fungus <150> US60/382132 <151> 2002-05-20 <150> US10/442017 <151> 2003-05-19 <160> 37 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2208 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 1 accgtcaact caatttctcc ccctcaggcc cgtcctccgt ttcacaattg acatcttccc 60 tctccagggg cttgttccgt caagatggcc gacatgtccg gcgaacagat gcaggctaag 120 attaccgcgg ctaggcgcga agccgaaggc ctgaaggaca agatcaagcg cagaaaggat 180 gagttggccg atacgactct ccgtcaagtc gcgcagaacc aaactgaaac cttgcctcgt 240 attggtatga agccccggcg gacgctcaag ggacatttgg ccaagatcta cgccatgcat 300 tggtcgaccg accgccgaca tctcgtctca gcctctcagg acggaaagct catcatctgg 360 gacgcctaca ccacgaacaa ggtccatgcg atcccgctga ggtcatcatg ggtcatgacc 420 tgtgcctatg ccccgagtgg aaactacgtc gcctgcggtg gtctcgacaa catttgctcg 480 atctacaacc tctcctctcg cgagggtccg acccgtgtcg cgcgtgagct ctccggacac 540 tctggctacc tctcttgctg ccggttcatc aacgatcgca gaatcatcac gtcttccggc 600 gacatgactt gcatgctgtg 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1 5 10 15 Arg Arg Glu Ala Glu Gly Leu Lys Asp Lys Ile Lys Arg Arg Lys Asp 20 25 30 Glu Leu Ala Asp Thr Thr Leu Arg Gln Val Ala Gln Asn Gln Thr Glu 35 40 45 Thr Leu Pro Arg Ile Gly Met Lys Pro Arg Arg Thr Leu Lys Gly His 50 55 60 Leu Ala Lys Ile Tyr Ala Met His Trp Ser Thr Asp Arg Arg His Leu 65 70 75 80 Val Ser Ala Ser Gln Asp Gly Lys Leu Ile Ile Trp Asp Ala Tyr Thr 85 90 95 Thr Asn Lys Val His Ala Ile Pro Leu Arg Ser Ser Trp Val Met Thr 100 105 110 Cys Ala Tyr Ala Pro Ser Gly Asn Tyr Val Ala Cys Gly Gly Leu Asp 115 120 125 Asn Ile Cys Ser Ile Tyr Asn Leu Ser Ser Arg Glu Gly Pro Thr Arg 130 135 140 Val Ala Arg Glu Leu Ser Gly His Ser Gly Tyr Leu Ser Cys Cys Arg 145 150 155 160 Phe Ile Asn Asp Arg Arg Ile Ile Thr Ser Ser Gly Asp Met Thr Cys 165 170 175 Met Leu Trp Asp Ile Glu Ser Gly Ser Lys Val Thr Glu Phe Ala Asp 180 185 190 His Leu Gly Asp Val Met Ser Ile Ser Ile Asn Pro Thr Asn Gln Asn 195 200 205 Val Phe Val Ser Gly Ala Cys Asp Ala Phe Ala Lys Leu Trp Asp Ile 210 215 220 Arg Thr Gly Lys Ala Val Gln Thr Phe Ala Gly His Glu Ser Asp Ile 225 230 235 240 Asn Ala Ile Gln Phe Phe Pro Asp Gly Asn Ala Phe Gly Thr Gly Ser 245 250 255 Asp Asp Thr Ser Cys Arg Leu Phe Asp Ile Arg Ala Asp Arg Glu Leu 260 265 270 Asn Thr Tyr Gln Ser Asp Gln Ile Leu Cys Gly Ile Thr Ser Val Ala 275 280 285 Phe Ser Val Ser Gly Arg Leu Leu Phe Ala Gly Tyr Asp Asp Phe Glu 290 295 300 Cys Lys Val Trp Asp Val Leu Arg Gly Asp Lys Val Gly Ser Leu Ser 305 310 315 320 Gly His Glu Asn Arg Val Ser Cys Leu Gly Val Ser Asn Asp Gly Ile 325 330 335 Ser Leu Cys Thr Gly Ser Trp Asp Ser Leu Leu Lys Val Trp Ala Trp 340 345 350 <210> 3 <211> 352 <212> PRT <213> Emericella nidulans <400> 3 Met Ala Asp Met Ser Gly Glu Gln Met Gln Ala Lys Ile Thr Ala Ala 1 5 10 15 Arg Arg Glu Ala Glu Gly Leu Lys Asp Lys Ile Arg Arg Arg Lys Asp 20 25 30 Asp Leu Ala Asp Thr Thr Leu Arg Asp Val Ala Gln Asn Gln Thr Asp 35 40 45 Ala Leu Pro Arg Ile Gly Met Lys Pro Arg Arg Thr Leu Lys Gly His 50 55 60 Leu Ala Lys Ile Tyr Ala Met His Trp 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Val Pro Ala Gly Lys Pro Phe 35 40 45 Glu Ile Thr Trp Asp Pro Thr Thr Ser Gly Thr Val Ser Leu Val Leu 50 55 60 Leu Arg Gly Pro Ser Thr Asn Val Val Pro Ile Gln Thr Ile Val Glu 65 70 75 80 Asp Ile Asp Asn Ser Gly Ser Tyr Ser Trp Thr Pro Ser Thr Thr Leu 85 90 95 Glu Pro Asp Thr Thr His Tyr Gly Ile Leu Leu Val Val Glu Gly Thr 100 105 110 Gly Gln Tyr Gln Tyr Ser Val Gln Phe Gly Ile Ser Asn Pro Tyr Tyr 115 120 125 Ser Ser Ser Ser Ser Val Ala Ala Ala Thr Ser Thr Thr Ala Ala Ala 130 135 140 Ala Val Ser Ser Asp Ala Ser Glu Thr Ser Val Ile Ile Ser Lys Ile 145 150 155 160 Thr Ser Thr Ile Cys Pro Glu Thr Ala Thr Ala Thr Ala Asp Val Lys 165 170 175 Pro Thr Ser Val Pro Val Val Gly Gly Asn Lys Pro Thr Ser Phe Val 180 185 190 Val Ala Pro Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Leu Ile Arg Ser Ser Ala 195 200 205 Thr Pro Ser Gly Thr Pro Ala Ala Ser Ser Ser Ser Val Ser Pro Val 210 215 220 Phe Thr Gly Ala Ala Asp Arg Asn Ala Ile Ser Leu Gly Ala Val Ala 225 230 235 240 Val Gly Val Ala Ala Val Leu Ala Phe 245 <210> 6 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gcccatggtc caccccaatg 720 atctcgctat tggtggctgg gacattagca gcctgaacct tgccgattcc atggaccgtg 780 cccaggtcct ggagcctacc ctcaagcagc aggttcgtaa ggagatggcc gagatgaagc 840 ccctgcctag tatctactac ccggacttta tcgctgccaa ccaggaggac cgggccgaca 900 atgtgctcga gggctccaag gcatgctggg ctcatgttga gaagatccag caggacattc 960 gcgacttcaa ggctcagaac ggcctcgaca aggtcatcgt gatgtggact gccaacaccg 1020 agcgttacgc cgacatcctg cctggcgtca atgacacggc cgacaacctc ctcaacgcta 1080 tcaagaccgg ccacctggag gtgtccccgt ccactgtctt tgctgtggcc tgtatcctgg 1140 acaacgttcc cttcatcaac ggctctcccc agaacacctt tgttcccggt gccatccagt 1200 tggctgagca gcacaaggcc ttcattggcg gagacgactt caagtctggc cagaccaaaa 1260 tgaagtcggc tctggttgac ttcttgatca acgccggtat caagctcacc tcgattgcca 1320 gctacaacca cctgggcaac aacgacggca agaacttgag ctcccagaag cagttccggt 1380 ccaaggagat ctccaagtcc aacgtggtgg acgacatggt cgcggctaac aagatcctct 1440 acgccgagga cgagcacccc gaccacaccg tggtgatcaa gtacatgcct gcggtgggcg 1500 acaacaagcg cgcgctcgac gagtactacg cggagatctt catgggtggc caccagacca 1560 tcagtctgtt caacatctgc gaggactccc tgctggcgtc tcccttgatc attgatctgg 1620 tgctgattgc ggagatgatg acccgcatca gctggaagtc ggacgaggcg gccgagtaca 1680 agggcttcca cagcgtgctc agcgtgctca gctacatgct caaggcgcct ctgactcccc 1740 ctggcactcc tgtggtcaac tcgctgacca agcagcgcag tgccttgacc aacatcttcc 1800 gggcgtgcgt tggactgcag cctgaatccg agatgactct ggagcacaag ctgttctaga 1860 cacccaccta gtaatgctta gccatcatgc taggcgttga tcacacttta cccattgtca 1920 gccaactaca gccactcttt gaatatcagt gactaccttc gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa a 1991 <210> 13 <211> 532 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 13 Met Ala Pro His Ala Ser Ser Asp Val Ala Ala Asn Gly Ala Val Asn 1 5 10 15 Gly Ser Ala Arg Ala Asn Ala Pro Leu Phe Thr Val Asn Ser Pro Asn 20 25 30 Val Val Tyr Thr Asp Asn Glu Ile Arg Ser Gln Tyr Ala Tyr His Thr 35 40 45 Thr Asp Ile Thr Arg Thr Ala Asp Asn Lys Leu Val Ala Thr Pro Lys 50 55 60 Ala Thr Asn Tyr His Phe Lys Val Asp Arg Lys Val Gly Lys Val Gly 65 70 75 80 Val Met Met Val Gly Trp Gly Gly Asn 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tcacgatgca gtggacgaac tttctgtgcc ctctgattgc catgcaggct 120 agcctgagtg ctgcctgggg cacccacgtc aagagaggat cggagaccaa tgccaccctg 180 tttgcctatg gacagaactc ttccgcttac cccattgctt atgggctcag tgacggtctt 240 ctctacattg cccaagatcc ggagaacacc gcggcggacc tgacacccat gtcctgggat 300 ctgccctcca tcactgatga gtgctggatt gtcaacggca cgtttatgaa tggcactcgt 360 gcaggatctc tctatatccg accggatagc aacaactgtc ttggcgtgct gccttttgcc 420 caggctaaag gggtgaatgg cgtggtcacg ggctttggcc tctttgcatc gcagctggtc 480 tataacaacg atacccagct ggaagcacag ttctgggcgt cgaagacaga cactgaagat 540 gtctacaaac tggtgtgggt ggaggactct tcgcaaattg cgagcgaaag ctttcccgtc 600 gtggtgaaag cgtccgagga ctcgacctga aaagaacagc gatccaggga ggtgtgactt 660 gggttgttgg ggtggtgctc cgagcatgat gttgttcatt gccattgcgt ggtaatatat 720 ataatagtca ctcgtttata tttgacaaaa aaaaaaaaaa aaa 763 <210> 25 <211> 184 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 25 Met Gln Trp Thr Asn Phe Leu Cys Pro Leu Ile Ala Met Gln Ala Ser 1 5 10 15 Leu Ser Ala Ala Trp Gly Thr His Val Lys Arg Gly Ser 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ccagaaggag tctactctcc atcttgtcct 300 ccgcctgcgt ggtggtatgc agattttcgt caagaccctg accggaaaga ccatcaccct 360 tgaggtggag tcttctgaca ccatcgacaa tgtgaagacc aagattcagg acaaggaggg 420 cattcccccg gaccagcagc gtctgatctt cgctggaaag cagctggagg atggccgtac 480 cctgtctgac tacaacattc aaaaggaatc cacccttcac ctcgtccttc gtctgcgtgg 540 tggtatgcag atcttcgtca agactctcac gggaaagacg atcacattgg aagttgaatc 600 ttccgacaca attgataacg ttaagaccaa gattcaagac aaggaaggca tccccccgga 660 ccagcagcgt ttgatcttcg ctggtaagca gttggaggat ggccgtacct tgtccgacta 720 caacatccag aaagaatcca ctcttcacct tgtccttcgt ctccgtggtg gtatgcagat 780 cttcgtgaag actcttaccg gcaagacgat tacgctggag gtggagagct cggataccat 840 tgataacgtc aagactaaga ttcaagataa ggagggcatt cccccggacc agcagcgtct 900 catcttcgct ggtaagcagt tggaagatgg acgtacgctc tccgattaca acatccagaa 960 ggagagcact ctgcacctgg tgctccgtct ccgtggcgga aactaatgcc ttattttgat 1020 ctttcttctt tagcacggct catctacggt tgagtggcct gcatggcgtt gggacggttg 1080 ttttcatcgg tttttatgat acggataaat tgggcatacc ttagggtcac catcttccat 1140 ggtgccttgc gtcattcttt tacctaggaa tcaattcaat aatcatattc cacctgatat 1200 ctaaaaaaaa aaaaaaaacc t 1221 <210> 34 <211> 236 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 34 Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr 1 5 10 15 Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn 20 25 30 Val Lys Thr Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln 35 40 45 Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser 50 55 60 Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu 65 70 75 80 Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile 85 90 95 Thr Leu Glu Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Thr Lys 100 105 110 Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe 115 120 125 Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile 130 135 140 Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met 145 150 155 160 Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val 165 170 175 Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Thr Lys Ile Gln Asp Lys 180 185 190 Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln 195 200 205 Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser 210 215 220 Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Asn 225 230 235 <210> 35 <211> 235 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 35 Val Leu Arg His Ala Asn Asn Leu Ala Val Val Lys Thr Leu Thr Gly 1 5 10 15 Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val 20 25 30 Lys Thr Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg 35 40 45 Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp 50 55 60 Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg 65 70 75 80 Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr 85 90 95 Leu Glu Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ser Lys Ile 100 105 110 Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala 115 120 125 Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln 130 135 140 Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln 145 150 155 160 Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu 165 170 175 Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Thr Lys Ile Gln Asp Lys Glu 180 185 190 Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu 195 200 205 Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr 210 215 220 Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Asn 225 230 235 <210> 36 <211> 404 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 36 tcgagcggcc gccgggcagg tacctccctt atgctgctgg atgaagacgt ggttactgcc 60 tactatgcgc aagttcccaa ctcggtctac gtgagcagtg ccggtggtta catctacccc 120 tgcaacacca ctcttcccag cttctcgctt gtcctcggcg agtcgagcct ggccacgatc 180 cccggtaacc tgatcaattt ctccaaggtt ggcaccaaca ccaccaccgg acaggccttg 240 tgctttggcg gcattcaatc caacggaaac acctcgctgc agattctggg cgatattttc 300 ctgaaggcct ttttcgttgt cttcgacatg cgcggcccct cgcttggtgt tgcctctccc 360 aagaactagt ttccttttcc tgtacctcgg ccgcgaccac gcta 404 <210> 37 <211> 334 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 37 acaaagaatt ctccaggact cttgtctgac gtaaaatagg aagaaaagga aaactgaggt 60 gatatcgcct gtgtagtgcg gcgattgacg tccttcctcc gcttgcccag cggtggtggg 120 tcgagctgag gtgtccgttt atacgtgatg gtagtggtca cgatatggcg cacacaaaag 180 gtgtttccat tctcactgac gggtgattcg aagaagcgct gtccccggtc tgatggagta 240 aaaggggaac ggagggggtg cgcactccgc ggggacgcag acactggggt aatagaggta 300 tggtgcagga aggcgcatgc gctgggcatg aata 334

Claims (45)

1. 필라멘트 형태를 나타내는 네이티브 균류에 비해 상대적으로 펠렛 형태를 나타내는 네이티브 균류에서 차별적으로 발현되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
2. 제 1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현은 필라멘트 형태의 네이티브 균류에 비해 상대적으로 펠렛 형태의 네이티브 균류에서는 부재하거나 혹은 보다 낮은 수준인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
3. 제 1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현은 펠렛 형태의 네이티브 균류에 비해 상대적으로 필라멘트 형태의 네이티브 균류에서는 부재하거나 혹은 보다 낮은 수준인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
4. 제 1항에 있어서, 상기 균류는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
5. 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공하는 단계;

   상기 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자로 균류를 형질변형시키는 단계; 및

   상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 발현시켜 균류 형성을 촉진하는 단계;

   를 포함하는 균류에서 모폴로지를 촉진하는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 촉진된 모폴로지는 펠렛 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
7. SEQ ID NOs.:1, 4, 6, 8, 12, 16, 18, 22, 24, 26, 28, 33, 36 및 37중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
8. 제 7항의 폴리뉴클레오타이드로부터 전사된 폴리뉴클레오타이드 분자.
9. SEQ ID NOs.:1, 4, 6, 8, 12, 16, 18, 22, 24, 26, 28, 33, 36 및 37, 및 SEQ ID NOs.:1, 4, 6, 8, 12, 16, 18, 22, 24, 26, 28, 33, 36 및 37에 대한 상보적 서열중 어느 하나의 적어도 30 연속 뉴클레오타이드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 구조물.
10. 제 9항의 재조합 폴리뉴클레오타이드 구조물을 포함하는 벡터.
11. 제 9항의 재조합 폴리뉴클레오타이드 구조물을 포함하는 형질변형된 숙주세포.
12. SEQ ID NOs.:1, 4, 6, 8, 12, 16, 18, 22, 24, 26, 28, 33, 36 및 37중 어느 하나의 적어도 30 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계;

    상기 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자로 균류를 형질변형시키는 단계; 및

    상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 발현시켜 균류 형성을 촉진하는 단계;

    를 포함하는 균류에서 모폴로지를 촉진하는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NOs.:22, 24, 26, 28, 33, 36 및 37중 어느 하나의 서열을 포함하며, 그리고 여기서 촉진된 균류 형태는 펠렛 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 12항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NOs.:1, 4, 6, 8, 12, 16 및 18중 어느 하나의 서열을 포함하며, 그리고 여기서 촉진된 균류 형태는 필라멘트 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 유전자의 적어도 일부와 상보적인 안티센스 배향 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계;

    상기 재조합 폴리뉴클레오타이드로 균류를 형질변형시키는 단계; 및

    상기 재조합 폴리뉴클레오타이드의 발현에 의해 생성되는 전사 산물을 이용하여 상기 유전자의 발현을 억제하며, 이에 따른 억제는 모폴로지를 촉진하는 단계;

    를 포함하는 균류에서 모폴로지를 촉진하는 방법.
16. 제 15항에 있어서, 상기 안티센스 배향 서열은 SEQ ID NOs.:1, 4, 6, 8, 12, 16, 18, 22, 24, 26, 28, 33, 36 및 37중 어느 하나와 상보적인 적어도 30 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 상기 상보적인 서열은 SEQ ID NOs.:22, 24, 26, 28, 33, 36 및 37중 어느 하나와 상보적이며, 그리고 여기서 촉진된 균류 형태는 필라멘트 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 16항에 있어서, 상보적인 서열은 SEQ ID NOs.:1, 4, 6, 8, 12, 16 및 18중 어느 하나와 상보적이며, 그리고 여기서 촉진된 균류 형태는 펠렛 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
19. SEQ ID NOs.:2, 5, 7, 9, 13, 17, 19, 23, 25, 27, 29 및 34중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호하는 분리된 폴리펩타이드 분자.
20. 프로모터에 실시 가능하게 연결된 제 19항의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 구조물.
21. 제 20항의 재조합 폴리뉴클레오타이드 구조물을 포함하는 벡터.
22. 제 20항의 재조합 폴리뉴클레오타이드 구조물을 포함하는 형질변형 숙주세포.
23. SEQ ID NOs.:2, 5, 7, 9, 13, 17, 19, 23, 25, 27, 29 및 34중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계;

    상기 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자로 균류를 형질변형시키는 단계; 및

    상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 발현시켜 균류 형성을 촉진하는 단계;

    를 포함하는 균류에서 모폴로지를 촉진하는 방법.
24. 제 23항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NOs.:23, 25, 27, 29 및 34중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호하며, 그리고 촉진된 균류 형태는 펠렛 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 23항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NOs.:2, 5, 7, 9, 13, 17 및 19중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호하며, 그리고 촉진된 균류 형태는 필라멘트 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
26. 프로모터에 실시 가능하게 연결된 SEQ ID NOs.:22, 24, 26, 28, 33, 36 및 37중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자로 균류를 형질변형하여 형질변형된 균류를 생성하는 단계; 및

    상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 발현시키고, 상기 폴리펩타이드는 펠렛 모폴로지를 촉진하며, 이에 따라 형성된 펠렛 형태의 형질변형된 균류는 필라멘트 형태의 형질변형된 균류를 이용한 바이오프로세스에 비해 상대적으로 바이오프로세스를 증진시키는 단계;

    를 포함하는 균류를 이용한 바이오프로세스 증진 방법.
27. 제 26항에 있어서, 상기 바이오프로세스는 셀룰라아제 발현, 헤미셀룰라아제 발현, 리그나아제 발현, 바이오매스의 알코올 전환, 유기산 생성, 글루코아밀라아제 생성, 페니실린 생성 및 로바스태틴 생성으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 26항에 있어서, 상기 균류는 파네로카에테 크리소포리움(Phanerochaete chrysosporium), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 에머리셀라 니둘란스(Emericella nidulans), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 페니실리움 크리소게넘(Penicillium chrysogenum) 및 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei), 리조뮤코 미에헤이(Rhizomucor miehei) 및 리조퍼스 오리자에(Rhizopus oryzae)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 균류를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 26항에 있어서, 펠렛 형태의 형질변형된 균류에 의해 증진된 바이오프로세스는 동일한 조건하에서 비-형질변형된 균류에 비해 상대적으로 증진되는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 프로모터에 안티센스 방향으로 실시 가능하게 연결된 SEQ ID NOs.:1, 4, 6, 8, 12, 16 및 18중 어느 하나와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자로 균류를 형질변형하여 형질변형된 균류를 생성하는 단계; 및

    상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 전사시켜 폴리뉴클레오타이드 전사물을 생성하는 단계; 및

    상기 전사물을 mRNA와 하이브리드하여 유전자 발현을 억제시키고 펠렛 모폴로지를 촉진시키며, 이에 따라 형성된 펠렛 형태의 형질변형된 균류는 필라멘트 형태의 형질변형된 균류를 이용한 바이오프로세스에 비해 상대적으로 바이오프로세스를 증진시키는 단계;

    를 포함하는 균류를 이용한 바이오프로세스 증진 방법.
31. 제 30항에 있어서, 상기 균류는 파네로카에테 크리소포리움(Phanerochaete chrysosporium), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 에머리셀라 니둘란스(Emericella nidulans), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 페니실리움 크리소게넘(Penicillium chrysogenum) 및 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei), 리조뮤코 미에헤이(Rhizomucor miehei) 및 리조퍼스 오리자에(Rhizopus oryzae)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 균류를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 30항에 있어서, 상기 바이오프로세스는 셀룰라아제 발현, 헤미셀룰라아제 발현, 리그나아제 발현, 바이오매스의 알코올 전환, 유기산 생성, 글루코아밀라아제 생성, 페니실린 생성 및 로바스태틴 생성으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 프로모터에 안티센스 방향으로 실시 가능하게 연결된 SEQ ID NOs.:22, 24, 26, 28, 33, 36 및 37중 어느 하나와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자로 균류를 형질변형하여 형질변형된 균류를 생성하는 단계; 및

    상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 전사시켜 폴리뉴클레오타이드 전사물을 생성하는 단계; 및

    상기 전사물을 mRNA와 하이브리드하여 유전자 발현을 억제시키고 필라멘트 모폴로지를 촉진시키며, 이에 따라 형성된 필라멘트 형태의 형질변형된 균류는 펠렛 형태의 형질변형된 균류를 이용한 바이오프로세스에 비해 상대적으로 바이오프로세스를 증진시키는 단계;

    를 포함하는 균류를 이용한 바이오프로세스 증진 방법.
34. 제 33항에 있어서, 상기 균류는 파네로카에테 크리소포리움(Phanerochaete chrysosporium), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 에머리셀라 니둘란스(Emericella nidulans), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 페니실리움 크리소게넘(Penicillium chrysogenum) 및 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei), 리조뮤코 미에헤이(Rhizomucor miehei) 및 리조퍼스 오리자에(Rhizopus oryzae)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 균류를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 33항에 있어서, 상기 바이오프로세스는 소화 효소 생성 및 퓨마르산 생성으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
36. SEQ ID NO.1 서열의 적어도 10 뉴클레오타이드 세그먼트를 포함하며, 상기 적어도 10 뉴클레오타이드 세그먼트는 SEQ ID NO.3의 이에 상응하는 코돈에 비해 상대적으로 다른 아미노산에 대해 암호하는 적어도 하나의 코돈을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
37. 필라멘트 형태를 나타내는 균류에서 제 1 발현 수준을 가지며 그리고 펠렛 형태를 나타내는 균류에서 감소된 발현 수준 혹은 무발현을 갖는 단백질을 암호하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
38. 제 37항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NOs. 5, 7, 10 및 17중 어느 하나와 31%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
39. 제 37항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NOs. 5, 7, 10, 14 및 17중 어느 하나와 56%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
40. 제 37항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NOs. 5, 7, 10, 14, 17 및 19중 어느 하나와 66%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
41. 제 37항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NOs. 2, 5, 7, 10, 14, 17 및 19중 어느 하나와 66%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
42. 펠렛 형태를 나타내는 균류에서 제 1 발현 수준을 가지며 그리고 필라멘트 형태를 나타내는 균류에서 감소된 발현 수준 혹은 무발현을 갖는 단백질을 암호하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
43. SEQ ID NO.10과 31%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열; SEQ ID NO.14와 56%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열; SEQ ID NO.20과 66%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열; SEQ ID NO.2와 97%이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열; SEQ ID NOs. 5, 7, 10, 17, 19, 23, 25, 27 및 29중 어느 하나의 적어도 10 연속 아미노산을 함유하는 아미노산 서열; SEQ ID NO.14의 16이상의 연속 아미노산을 함유하는 아미노산 서열; SEQ ID NO.14의 25이상의 연속 아미노산을 함유하는 아미노산 서열; SEQ ID NOs.30, 31 및 32중 어느 하나의 아미노산 서열; 및 SEQ ID NOs.:2, 5, 7, 9, 13, 17, 19, 23, 27, 29, 29 및 34의 서열중 어느 하나와 동종성 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
44. 제 43항의 폴리펩타이드를 암호하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
45. 제 44항의 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.