KR20050003815A - 탄저균 치사독소에 의한 대식세포 반응 유전자 분석방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탄저균의 치사독소에 의하여 특이적으로 대식세포에서 발현이 증가 또는 감소되는 유전자를 마이크로 어레이에 의하여 분석하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 탄저균의 치사독소에 의하여 대식세포에서 특이적으로 증가 또는 감소되는 유전자를 마이크로 어레이 기술을 이용하여 탐색한 후 발현의 차이를 측정함으로써, 탄저균 치사독소에 의하여 반응하는 유전자를 바이오마커로서 활용할 수 있다.

Description

탄저균 치사독소에 의한 대식세포 반응 유전자 분석방법{Analysis of Bacillus anthracis Lethal Toxin}

본 발명은 탄저균의 치사독소에 의하여 대식세포에서 특이적으로 증가 또는 감소되는 유전자를 마이크로 어레이 기술을 이용하여 탐색한 후 발현의 차이를 측정하고 이를 이용한 DNA칩으로 탄저균의 감염을 간단하게 분석하는 방법에 관한 것이다.

탄저(Anthrax) 는 탄저균에 의해 발생되며, 인수 공통 전염병으로 폐 탄저(inhalation anthrax), 장 탄저(gastrointestinal anthrax), 피부탄저(cutaneous anthrax) 로 구분된다. 폐탄저는 탄저 아포(spore)가 폐의 대식세포에 들어가 발아하여 탄저균이 증식하고, 탄저균으로부터 생성된 독소 때문에 호흡곤란과 함께 패혈증 및 쇼크 증상이 온다. 이때 대식세포는 탄저균이 혈관을 통해 전신으로 퍼지게 하는 매개자 역할을 한다.

탄저균은 호기성 세균이며 그람 양성 세균으로 크기는 5 ㎛ x 5-8 ㎛이다. 탄저균은 운동성이 없고, 산소가 있을 때에는 아포를 형성한다. 탄저균의 독소 구성 단백질은 방어항원(protective antigen: PA, 83 kDa), 부종요소(edema factor: EF, 89 kDa) 및 치사요소(lethal factor:LF, 90 kDa)로 구성되어 있다. 치사요소 한 분자와 부종요소 한 분자는 각각 방어항원 7분자와 결합하여 치사독소(lethal toxin: LeTx)와 부종독소(edema toxin: EdTx)를 형성한다. 탄저균이 대식세포에 들어가 독성을 나타낼 때 치사독소(LeTx)는 세포사멸을 작동시키는 주된 역할을 하는 것으로 보인다.

치사독소의 활성은 세포막 수용체에 방어항원이 특이적으로 결합하면 furin-like protease에 의해 방어항원의 20 kDa이 절단되며, 절단되고 남은 방어항원의 63 kDa은 탄저독소 수용체(anthrax toxin receptor: ATR)에 결합하여 heptamer를 형성하며, 이후 방어항원 heptamer에 치사요소 한 분자가 결합하여 세포 안으로 들어가 활성을 나타낸다. 치사독소는 대식세포에 들어가 세포를 파괴하는데 저농도의 치사독소는 세포 사멸(apoptosis)를 일으키고 고농도의 치사독소는 활성산소종(reactive oxygen species: ROS)을 과다발현시켜 대식세포가 급사(sudden death)하게 한다.

고농도의 치사독소를 대식세포에 가한 후 45분까지를 초기단계라하고 60분후를 후기 단계라고 한다. 치사독소는 초기단계에서 Na+/K+의 막 투과성(membrane permeability)을 높이고 ATP를 소모한다. 후기 단계에서는 Ca2+, Cr2+, Cl-, SO42-, amino acid 및 uridine의 막 투과성 변형이 일어나며, 고분자 (macromolecule) 합성을 저해하여 세포의 형태적 변화(morphological change)를 초래한다. 치사독소와 함께 tyrosine kinase inhibitor를 가했을 때 대식세포의 생존율이 높아지는 것으로 보아 tyrosine kinase가 치사독소 기작에 관여할 것이라고 보고 되었다.

유전자 발현(gene expression)을 연구하는 방법에는 differential display PCR(DD-PCR)[Liang et al., Science, 258, 967-971, 1992], serial analysis gene expression(SAGE)[Velculescu et al., Science, 270, 484-487], expressed sequence tags(EST) database comparison [Vasmatizis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 , 300-304, 1998]의 방법들이 이용되고 있으나 이들 방법들의 가장 큰 문제점은 시간이 많이 걸리고, 비용이 많이 든다는 점으로 시간적·경제적 부담이 크다는 사실이다. 또한 수행과정이 복잡하고 많은 유전자를 동시에 다루기가 어려운 단점을 가지고 있다.

본 발명에서는 상기의 방법들의 단점을 보완하는 방법으로 DNA microarray 방법을 사용하였다. DNA microarray는 특정 세포에서 발현되는 유전자의 발현양상을 동시 다발적으로 분석할 수 있는 장점을 가진 기술로서, 특이적으로 발현이 유도되거나 저해되는 유전자들을 대량으로 분석할 수 있다.

본 발명은 탄저균 치사독소에 의하여 대식세포에서 차별적으로 발현이 증가 또는 감소되는 유전자가 스폿팅된 마이크로어레이 칩을 이용한 대식세포의 유전자 발현양상을 생물학적으로 분석하고 탄저균 감염에 대한 바이오마커로서 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1은 치사독소를 처리한 다음 역전사 효소를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다. (a) NEK 6, (b) RPL10A, (c) JAK1, (d) ATP1B1, (e) BACE. PA는 100ng/ml, LF 16ng/ml을 처리하여 얻은 결과이다.

본 발명은 탄저균 치사독소에 의하여 대식세포에서의 반응을 분석하는 방법에 있어서, (1) 탄저균 치사독소에 의하여 차별적으로 증가 또는 감소되는 유전자 및 그 유전자로부터 유래된 DNA 단편이 고정화된 DNA칩: (2) 탄저균에 의하여 대식세포에서 차별적으로 발현되는 유전자를 스폿팅한 DNA 칩을 이용하여 탄저균의 치사독소를 함유한 시료로 부터 증가 또는 감소되는 유전자 발현을 측정함으로써, 탄저균의 감염을 간단하고 경제적으로 분석하는 방법을 제공한다.

탄저균의 치사독소에 의하여 영향을 받게되면 유전자 발현의 변화가 생기게된다. DNA 칩은 3 내지 4만개의 유전자중 탄저균에 의하여 영향을 받는 일부 유전자를 유리 슬라이드위에 스폿팅한 것을 말한다. 탄저균의 치사독소를 처리하지 않은 대식세포(대조그룹)와 탄저균의 치사독소를 처리한 대식세포(샘플그룹)로부터 전체 mRNA를 분리하여, 샘플그룹과 대조그룹에 2가지 형광물질 (Cy-3, Cy-5형광)중 각각 하나씩만 결합시켜 프로브를 제조한다. 각각의 형광물질이 결합된 유전물질을 cDNA 칩에 혼성화시키면, 대조그룹과 샘플그룹으로 부터 제조된 프로브는 경쟁적으로 1개의 스폿에 결합하게 되며, 상대적인 유전자 발현양상의 차이를 형광의 세기를 통해 구분할 수 있다.

본 발명에서 탄저균의 치사독소에 의해 영향을 받은 유전자는 이의 발현이 탄저균 치사독소에 의해 촉진 또는 억제되는 유전자로서 정의된다. 이러한 유전자의 수는 하나 이상일 수 있다. 따라서, 발현이 탄저균의 치사독소에 의해 직접ㆍ 간접적으로 영향을 받은 작용물질의 유전자 또는 관련 유전자가 본 발명의 DNA 어레이상에 고정화되는 유전자로 사용될 수 있다.

탄저균의 치사독소에 의해 영향을 받은 유전자는 하기와 같이 검출할 수 있다. DNA 어레이는 유전자 또는 그 유전자로부터 유래된 cDNA 단편이 고정화되는 지지체를 언급하고 예로써 DNA 칩을 포함한다. 혼성화를 위해 사용될 수 있는 지지체는 일반적으로 슬라이드 글라스, 실리콘 칩, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 막 등이 사용되며 탄저균의 치사독소에 의해 영향을 받은 유전자 또는 유전자로부터 유래된 cDNA 단편이 고정화된다.

탄저균의 치사독소에 처리된 대식세포에 대한 결과를 대조 대식세포에 대한 결과와 비교하여, 두 샘플사이에서 시그날 세기가 현저하게 상이한 유전자를 검출할 수 있다. 혼성화된 어레이에 대한 방사선, 형광, 발광 등의 시그날 세기를 이미지 분석기와 같은 특수 측정 기기를 사용하여 측정한다. 이로써 탄저균의 치사독소에 의해 발현이 현저히 변경된 유전자를 시그날 세기의 차이에 기초하여 검출할 수 있다.

2개 타입의 형광 라벨을 동시에 탐지할 수 있는 다중 파장 탐지 형광 분석기를 사용하여, 동일한 DNA 어레이상에서 탄저균의 치사독소에 노출된 대식세포에 대한 유전자 발현은 대조 대식세포에 대한 유전자 발현과 비교할 수 있다. 예를 들면, 탄저균 치사독소의 영향을 받은 세포로부터 유래된 핵산 샘플은 Cy3-dUTP로, 대조 핵산 샘플은 Cy5-dUTP로 형광-라벨링시킨다. 동일한 양의 두 핵산 샘플을 혼합하고 혼합물을 DNA 어레이와 혼성화시켜 두 핵산 샘플사이의 유전자 발현의 차이를 색의 차이로 측정하여 이에 기초하여 탄저균의 치사독소에 의해 발현 수준이 현저하게 변경된 유전자를 검출할 수 있다.

발현 수준 인덱스로써 탄저균 치사독소를 포함하는 것으로 예상되는 샘플에 대해 측정된 시그날 세기를 대조 샘플에 대한 것과 비교하여, 탄저균 치사독소에 의해 영향을 받은 유전자를 선별한다. 예를 들어, 이 값은 탄저균 치사독소를 포함하는 샘플에 대한 형광 시그날 값을 대조 샘플에 대한 형광 시그날 값으로 나누어 계산한다. 1.00보다 큰 값은 유전자 발현이 시험 물질의 처리에 의해 촉진되었음을 의미한다. 1.00보다 작은 값은 유전자 발현이 시험 물질의 처리에 의해 억제되었음을 의미한다. 1.00과 동일한 값은 유전자가 시험물질의 처리에 의해 아무런 영향을 받지 않았음을 나타낸다. 발현이 촉진된 경우, 값은 1.5, 바람직하게는 2.0보다 크게 나타난다. 발현이 억제된 경우, 값은 0.9, 바람직하게는 0.8보다 작게 나타난다.

본 발명에서는 탄저균의 치사독소를 대식세포에 처리하여 유전자 발현양상의 차이를 측정하였다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명이 이에 한정된 것은 아니다.

  실시예1

생쥐 대식세포 RAW 264.7 세포는 10 % 송아지 태아 혈청(fetal bovine serum: FBS)과 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂배양기에서 배양하였다.

보유하고 있는 방어항원, 치사요소의 생리학적 활성을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. MTT assay는 미토콘드리아의 탈수소효소와 반응하여 세포 생존율을 측정하는 방법이다. 생쥐 대식세포 RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트에 각각 6×10⁴개 분주하여 37 ℃, 5 % CO₂배양기에서 하루 밤 배양하였다. 방어항원 농도는 100 ng/㎖로 고정하였고, 치사요소는 농도별로(2, 4, 8, 16, 32, 64 및 100 ng/㎖) 플레이트에 처리하였다. 시간별(0, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 180 및 240분)로 플레이트를 CO₂배양기에서 꺼내어 PBS(pH 7.2) 완충액으로 5회 세척하였다. DMEM 배지(10 % FBS, 1X PS) 100 ㎕을 첨가하고 25 ㎕ MTT(5 ㎎/㎖ in PBS)를 가한 후 37 ℃, 5 % CO₂배양기에서 3시간 배양하였다. 배양이 끝난 플레이트에 정지 용액(20 % SDS, 50 % dimethyl formamide, pH 4.7) 100 ㎕를 첨가하고 상온에서 천천히 교반하였다. 3시간 후 파장 570 nm에서 ELISA reader로 측정하여 그래프를 작성하였다.

그 결과 치사독소의 치사요소 농도가 8 ng/㎖을 넘어설 때 90분을 기준으로 세포가 사멸함을 알 수 있었다. 본 발명에서는 세포 급사에서의 치사독소에 대한 유전자 발현 변화를 보고자 하는 것이므로 상기 결과를 바탕으로 방어항원 농도는 100 ng/㎖, 치사요소 농도는 16 ng/㎖로 하여 시행하였다.

  실시예2

RNA 분리는 GibcoBRL사가 제공하는 방법으로 수행하였다. DMEM 배지(10 % FBS, 1X PS)를 사용하여 생쥐 대식세포 RAW 264.7 세포를 플레이트에 6×10⁶개 되도록 분주한 후 37 ℃, 5 % CO₂배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 세포가 플레이트 바닥에 잘 붙었는지 확인하고 PBS(pH 7.2) 완충액으로 2회 세척 후 방어항원 100 ng/㎖, 치사요소 16 ng/㎖을 첨가하였다. 다시 37 ℃, 5 % CO₂배양기에서 30분 동안 배양 후 플레이트를 PBS(pH 7.2) 완충액으로 2회 세척하였다. 세척 후에는 Trizol 시약 2 ㎖를 첨가하고 pipeting 50-70회하여 세포를 파괴하였다. 세포 파괴가 끝난 시료를 튜브에 1 ㎖씩 분주 후 200 ㎕ 클로로포름을 첨가하였다. 튜브 뚜껑을 닫고 15초 정도 와류(vortexing)하고 얼음에 15분 정도 방치하였다. 후에 12,000 g, 15분, 4 ℃에서 원심분리 하였다. 이 후 조심스럽게 상층액을 수거한 후 새로운 튜브에 옮기고 동량의 이소프로필 알코올을 넣어주어 얼음에 1시간동안 방치하였다. 그 후에 4 ℃에서 12,000 ×g로 15분간 원심분리 하였다. 젤 같은 응집체 형성을 확인하고 상층액을 제거하였다. 에탄올 75 %(DEPC 처리 증류수) 1㎖를 첨가한 후 교반하고 4 ℃에서 12,000 ×g로 15분간 원심분리 하여 상층액을 제거하고 다시 동일한 조건으로 원심분리 하여 남아있는 상층액을 모두 제거하였다. 응집체를 5분에서 10분 동안 상온에서 건조하고 DEPC 처리된 3차 증류수 30 ㎕를 가하여 녹였다. 분광광도계(Spectrophotometer)에서 파장 260 ㎚와 280 ㎚로 시료를 측정하여 A260/A280의 값이 1.7 이상인지 확인하였다. 전기영동으로 RNA가 잘 분리되었는지도 확인하였다.

  실시예3

Labeling kit는 마크로젠사(한국)의 것을 구입하여 그 회사에서 제공하는 방법으로 수행하였다. PCR(Polymerase chain reaction) 튜브에 대조군의 총 RNA와 실험군의 총 RNA로 각각 결합(annealing)반응 혼합물(총 RNA 18 ㎕, control mRNA(1 ng) 1 ㎕, oligo dT 시발체 3 ㎕)을 준비한 후 70 ℃에서 5분간 방치하고 즉시 튜브를 얼음으로 옮겼다. 새로운 0.2 ㎖ PCR 튜브를 실험군과 대조군 반응으로 구분한 후 표지 혼합물(5X AMV RT buffer 8 ㎕, low dT dNTP 4 ㎕, 1 mM Cy3, Cy5-dUTP 3 ㎕, RNase inhibitor(40 u/㎕) 1 ㎕, AMV RT 2 ㎕(50 units))을 준비하였다. 결합반응 혼합물을 표지 혼합물에 각각 첨가하고 PCR 기기에서 42 ℃, 1시간 동안 방치하였다. 후에 0.5 M EDTA 5 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 각 튜브에 1 N NaOH 10 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 10분간 방치하였다. 후에 튜브에 1 M Tris.Hcl(pH 7.5) 완충액 25 ㎕를 첨가하였다. Chromaspin 컬럼(마크로젠사)을 2 ㎖ 튜브에 넣은 후 실온에서 1,300 ×g로 3분간 원심분리 하여 컬럼안의 완충액을제거하였다. 완충액이 제거된 spin 컬럼을 새 튜브에 넣고, 준비된 대조군과 실험군 반응 시료를 각각 컬럼의 중앙에 넣은 후 실온에서 1,300 ×g로 5분간 원심분리 하였다. 각각의 시료에 100 % 에탄올 300 ㎕와 3 M NaOAc 10 ㎕를 첨가하고 -70 ℃에 30분 동안 방치하였다. 후에 실온에서 12,000 ×g로 20분간 원심분리를 수행하여 에탄올을 제거하였다. 그 후에 70 % 에탄올 1㎖를 첨가하고 동일한 조건으로 원심분리 하여 에탄올을 제거하였다. 응집체를 빛을 차단하여 공기 중에서 건조하였다. 건조한 응집체를 각각 45 ㎕의 3차 증류수에 녹이고 12,000 ×g로 2분간 원심분리 하였다. Cy3(대조군) 와 Cy5(샘플군) 혼합물에서 각각 5 ㎕을 취한 후 1/20 희석하여 분광광도계로 흡광도(OD)값을 측정하였다. 측정된 값을 기준으로 각각의 cDNA 양을 계산하여 실험군과 대조군의 cDNA가 동량이 되면서 부피가 80 ㎕되도록 하여 하나의 튜브에 첨가하였다. 후에 5× 분절화 용액 20 ㎕를 첨가하여 전체 부피 100 ㎕가 되도록 하였다. 그 후에 95 ℃에서 15분간 방치하여 얼음으로 옮기고 진공가속건조기(Speed-Vac)로 분절된 cDNA 혼합물을 건조하여 응집체를 생성하였다.

cDNA microarray pre-hybridization 방법은 디지털지노믹스사(한국)에서 제공하는 방법으로 수행하였다. Pre-hybridization 완충액(25 % formamide, 5X SSC, 0.1 % SDS, 10 ㎎/㎖ BSA)을 미리 42 ℃로 가열하였다. 슬라이드를 pre-hybridization 완충액이 채워진 50 ㎖ 튜브에 넣고 42 ℃에서 45분간 방치하였다. 후에 slide를 꺼내어 3차 증류수로 5회 정도 세척하고 실온에서 60 ×g로 5분간 원심분리 하여 microarray 위의 수분을 제거하였다.

프로브 제조과정에서 만든 시료 응집체를 15 ㎕ hybridization 완충액(25 % formamide, 5×SSC, 0.1 % SDS)에 녹이고 95 ℃에서 5분간 가열하였다. 그 후 2분 동안 가볍게 원심분리 하였다. 슬라이드를 chamber에 옮기고 준비된 시료를 슬라이드 표면에 부하한 후 커버 글라스를 덮어주었다. 이 후 42 ℃에서 16-20시간 동안 방치하였다.

세척 완충액 I(2X SSC, 0.1 % SDS)를 42 ℃로 가열한 후 슬라이드를 넣고 흔들어주어 커버 글라스를 제거하였다. 세척 완충액 I(2×SSC, 0.1 % SDS)에 슬라이드를 넣고 42 ℃에서 5분간 방치하였다. 세척 완충액 II(0.1×SSC, 0.1×SDS)에 슬라이드를 넣고 실온에서 1분간 방치하고 이 과정을 4회 반복하였다. 이 후 실온에서 60 ×g로 5분간 원심분리 하여 microarray를 건조시켰다.

Axon GenePix scanarray 4000(Axon 4000, USA) 프로그램을 실행해서 슬라이드를 hybridization된 부분이 아래로 가게 하여 스테이지에 밀어 넣었다. Scan parameter, 슬라이드, wavelength 532 ㎚(Cy5), 및 635 ㎚(Cy3) 등의 값을 기입하였다. 2개의 형광 이미지(Cy3, Cy5)를 각각 wavelength 532 ㎚, 635 ㎚로 스캐닝하고, 각각 background값이 올라가지 않고 시그널이 최대로 취해질 수 있는 레이저 강도(laser intensity)와 PMT 감도를 설정하였다. Cy3와 Cy5의 normalization 대조군 유전자의 값을 살펴본 후 스캐닝하였다. 이미지를 저장하고 취한 화상으로 지정된 각 spot 위치의 형광 시그널 강도와 background 강도를 취하여 엑셀 파일로 전환하였다.

Cy3와 Cy5의 시그널 강도를 비교해 보면 Cy3가 Cy5보다 병합(incorporation)되는 정도가 크기 때문에 이를 비슷하게 조절해 주는 normalization을 해주었다. 이 경우 여러 번의 실험을 통하여 데이터를 비교, 분석하고 normalization한다. 그 후에 대조군 유전자의 Cy3와 Cy5의 형광비가 1로 보고 그것과 비교해서 Cy3와 Cy5의 형광비가 2배 이상이면 유전자 발현이 저해되는 유전자로 보고, 0.5 이하이면 유전자 발현이 유도되는 유전자로 보았다.

역전사 PCR(Reverse trascription-polymerase chain reaction)은 Invitrogen사(미국)가 제공하는 방법으로 수행하였다. 방어항원 농도 100 ng/㎖, 치사요소 농도 16 ng/㎖로 30분간 처리해 준 생쥐 대식세포 RAW 264.7 세포의 총 RNA을 분리하였다. PCR 튜브에 total RNA 2 ㎕, oligo dT 시발체 1 ㎕, 10 mM dNTP 1 ㎕, DEPC 처리된 3차 증류수 9 ㎕를 첨가하고 PCR 기기에서 65 ℃, 5분간 방치하였다. 후에 5 ×first-strand 완충액 4 ㎕, 0.1M DTT 2 ㎕, recombinant ribonuclease inhibitor 1 ㎕를 가하고 42 ℃에서 2분간 방치하였다. 그 후 SuperScript II RNase H-reverse transcriptase 1 ㎕를 첨가하고 42 ℃에서 50분간 방치하여 cDNA를 합성했다. 후에 70 ℃, 15분간 가열하여 잔류 단백질들을 불활성화 시켰다. 튜브에 3차 증류수 30 ㎕를 넣어 다음 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

전술한 바와 같이 MTT assay 결과를 바탕으로 방어항원 농도 100 ng/㎖, 치사요소 농도 16 ng/㎖에 30분으로 조건을 설정하였다. 생쥐 대식세포 RAW 264.7 세포 6×10⁶개에 방어항원 농도 100 ng/㎖와 치사요소 16 ng/㎖를 가하고 30분 후에총 RNA를 분리하여 cDNA microarray에 시료를 하이브리드 한 후에 스캐닝했다. 데이타 분석 결과 226개의 유전자 발현 변화를 확인하였다. 그 중 32개 유전자의 발현이 저해되었고, 194개의 유전자 발현이 유발되었다.

분석 결과 단백질 생합성에 관여하는 RPL10A, ARBP, RPL30, RPS3, RPL3, RPS16 및 MPRS17 유전자와 세포 유사분열 개시를 조절하는 NEK6 유전자의 발현이 저해되는 것으로 판명되었으며 그 결과는 표 1에 나타낸 것과 같다.

탄저균 치사독소를 대식세포에 처리를 하였을때 유전자의 발현이 감소되는 유전자 리스트

유전자	생성물	생물학적 기능
RPL10A	Ribosomal protein L10A	Protein biosynthesis
NOC4	Neighbor of Cox4
SORT1	Sortilin 1
SERPIN1	Serine(or cystein) proteasenhibitor
ARBP	Acidic ribosomal phosphoprotein P	Protein biosynthesis
MPRS17	Mitochondria ribosomal protein S1	Protein biosynthesis
RPL30	Ribosomal protein L30	Protein biosynthesis
RPS3	Ribosomal protein S3	Protein biosynthesis
TPM3	Tropomyosin 3 gamma	Muscle development
CREM	cAMP responsive element modulator	Regulation ofranscription
TLN	Talin
Ube2i	Ubiquitin-conjugating enzyme E21	Ubiquitin dependentrotein catabolism
MSH6	MutS homolog 6 (E.coli)	DNA repair
PTDSS2	Phosphatidylserine synthase 2
SELENBP1	Selenium binding protein 1
RPL3	Ribosomal protein L3	Protein biosynthesis
GNB2-RS1	Guanine nucleotide bindingrotein β-2
ROBO1	Roundabout homolog 1
NEK6	NIMA-related expressed kinase 6
RPS16	Ribosomal protein S16	Protein biosynthesis
HIST2	Histone protein 4

반면 발현이 유도되는 유전자 중에는 표2에 나타낸 것과 같이 시그널에 관여하는 STAT4, STAT5A, JAK1 및 CNIH 유전자, 분아(분열)에 관여하는 BTG1 유전자, 조직 재구성/응고에 관여하는 SERPINB2 유전자, 단백질분해에 관여하는 CTSW1, BACE 및 MCPT5 유전자, 세포주기를 저지하는 GAS1 유전자, 세포사멸에 관여하는 BIRC1E와 CAP8AP2 유전자, 전자전달에 관여하는 GLRX1, CYP7B1, AOX1 및 CYP4A10 유전자, 이동에 관여하는 AQP3, FXC1, ATP1A1, SLC16A1, APOM 및 KCNE4 유전자, 면역감응에 관여하는 SCYB9와 PSMB9 유전자가 있다.

탄저균 치사독소를 대식세포에 처리를 하였을때 유전자의 발현이 증가되는 유전자의 리스트

유전자	생성물	생물학적 기능
JAK1	Janus kinase	Intracellular signalcascade
STAT4	Signal transducer and activatiorof transcription 4	Intracellular signalcascade
BTG1	B-cell translocation gene 1,nti-proliferative	Prolierating
SERPINB2	Serine(or cysteine) proteaseinhibitor, clade B	Tissueremodeling/cloting
STAT5A	Signal transducer and activatorf transcriptor5A	Intracellular signalcascade
CTSW1	Cathepsin W	Proteolysis
GAS1	Growth arrest specific 1	Cell cycle arrest
CNIH	Cornichon homolog(Drosophila)	Intracellular signalcascade
GLRX1	Glutaredoxin 1(thiol transferase)	Electron transport
AQP3	Aquaporin 3	Transport
FXC1	Fractured callus expressedranscript 1	Transport
CYP7B1	Cytochrome p-450,7b1	Electron transport
ATP1A1	ATPase, NA+/K+ transportingeta 1 polypeptide	Na+/K+ transport
AOX1	Aldehyde oxidase 1	Electron transport
CYP4A10	Cytochrome p-450,4a10	Electron transport
BIRC1E	Baculoviral IAP repeat-containing1e	Apoptosis
SLC16A1	Solute carrier family 16	Transport
BACE	Beta-site APP cleaving enzyme	Proteolysis
CAMK4	Calcium/calmodulin-dependentrotein kinase IV	Amino acidhosphorylation
APOM	Apolipoprotein M	Transport
MCPT5	Mast cell protease 5	Proteolysis
SCYB9	Small inducible cytokinesubfamily(cys-x-cys)	Immune response
KCNE4	Potassium voltage-gated channel	Ion transport
PSMB9	Proteasome subunit, beta type 9	Immune response
CASP8AP2	Caspase 8 associated protein 2	Apoptosis

  실시예4

생쥐 대식세포 RAW 264.7 세포에 방어항원 100 ng/㎖과 치사요소 16 ng/㎖를 처리하고 30분 경과한 세포에서 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA로 합성한 cDNA 2 ㎕,10X PCR 완충액 5 ㎕, 50 mM MgCl₂1.5 ㎕, 전 시발체 1 ㎕, 후 시발체 1 ㎕,TaqDNA polymerase(5 U/㎕, Biotool사) 1 ㎕, 3차 증류수 37.5 ㎕를 0.2 ㎖ PCR 튜브에 첨가하여 전체 부피가 50 ㎕되도록 하였다. 그 후 94 ℃에서 5분간 사전 변성하고, 94 ℃에서 1분간 변성, 각각의 시발체에 맞는 융해 온도에서 1분간 결합, 72 ℃에서 1분간 신장 과정을 30주기 수행하였다. 그 후에 72 ℃에서 10분간 신장시키고 결과를 2 % TAE 아가로스 젤에서 확인하였다. 사용한 각 유전자의 시발체 서열은 다음과 같다.

NEK6: 5'-TTCTGAAGGGGTGACAG-3', 5'-CTGTCTTCCAGATGGCT-3'

RPL10A: 5'-GCTCATCATCGGTCATC-3', 5'-AAGTTGGTCAAGAAGCT-3'

JAK1: 5'-GCGAGACACAGGTTTGACG-3', 5'-CGGACAGTGGCGTAAACAG-3'

ATP1B1: 5'-GGAAAAGCCAAGGAGGAAGG-3', 5'-TTGGATGGTCCCGATGAAG-3'

BACE: 5'-GAATAGGGGAAAAAGCCAG-3', 5'-ATTTGCCTCTGCCTGGATT-3'

생물학적 기능에 따라 관여하는 유전자에 대한 시발체를 상기와 같이 구상하여 RT-PCR을 수행하였다. 즉, 세포성장에 관여하는 유전자 NEK6, 단백질 생합성에 관여하는 유전자 RPL10A , 세포내 시그날링에 관여하는 유전자 JAK1, 이동에 관여하는 유전자 ATP1A1 유전자, 단백질 분해에 관여하는 유전자 BACE에 대한 것으로 그 결과는 도면 1에 나타내었다. 이 결과로서 급사수준의 탄저균 치사독소를 대식세포에 가하였을 때 일어나는 유전적인 발현의 변화를 측정함으로써 치사독소가 대식세포의 외부 물질 분해기능을 더욱 자극하여 세포급사를 더 촉진하는 것을 알 수 있으며, 이를 이용하여 탄저균의 감염을 쉽게 측정할 수 있게 됨을 확인하였다.

본 발명은 탄저균의 치사독소에 의하여 대식세포에서 특이적으로 증가 또는 감소되는 유전자를 마이크로 어레이 기술을 이용하여 탐색한 후 발현의 차이를 측정함으로써, 탄저균 치사독소에 의하여 반응하는 유전자를 바이오마커로서 활용하여 탄저균의 치사독소 존재시에 간단하고 경제적으로 분석할 수 있다.

Claims (3)

1. 탄저균의 치사독소에 의하여 발현이 증가 또는 감소되는 유전자를 포함하는 DNA 칩
2. 탄저균의 치사독소에 의하여 발현이 증가 또는 감소되는 유전자를 슬라이드 위에 고정화시켜 DNA 칩을 제조하는 방법
3. 탄저균의 치사독소에 의하여 증가 또는 감소되는 유전자를 포함하는 DNA칩을 탄저균의 치사독소에 의하여 영향을 받을 것으로 예기되는 시료의 핵산과 혼성화 시켜 탄저균의 치사독소에 의해 영향을 받은 물질을 감별하는 방법