KR20040103921A - 종양 치료용 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간을 비롯한 포유동물에서 신생물성 세포의 성장 및 증식의 진단 및 치료용 조성물, 및 진단 및 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종양 세포의 게놈에서 증폭된 유전자의 동정을 기초로 한다. 이러한 유전자 증폭은 동일한 조직 유형의 정상 세포에 비해 유전자 생성물이 과다 발현된 것과 관련되어 있으며, 종양발생의 원인이 되는 것으로 생각된다. 따라서, 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 특정 암의 진단 및(또는) 치료 (예방을 비롯하여)에 유용한 표적으로 생각되며, 종양 치료의 예후를 예측할 수 있는 것으로 생각된다. 본 발명은 신규 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본원에서는 그러한 핵산 서열을 포함하는 벡터와 숙주세포, 본 발명의 폴리펩티드를 이종 폴리펩티드 서열과 융합된 상태로 포함하는 키메라 폴리펩티드 분자, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체, 및 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

종양 치료용 조성물 및 방법 {Compositions and Methods for the Treatment of Tumor}
본 발명은 종양의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
악성 종양 (암)은 심장 질환에 이어 두 번째로 높은 사망 원인이다 [Boring et al., CA Cancer J. Clin., 43:7 (1993)].
암은 증식하여 종양 덩어리를 형성하는, 정상 조직으로부터 유래된 비정상 또는 신생물성 세포수의 증가, 상기 신생물성 종양 세포의 인접 조직으로의 침입, 및 혈액 또는 림프계를 통해 국부 림프절 및 원격 부위로 결국 퍼지는 악성 세포의 생성 (전이)을 특징으로 한다. 암 단계에서, 세포는 정상 세포가 성장하지 않는 조건하에서 증식한다. 암은 상이한 정도의 침입성 및 침습성을 특징으로 하는 다양한 형태로 나타난다.
유전자 발현의 변화는 모든 암의 통상적인 특징인 조절되지 않는 세포 성장 및 탈분화와 밀접하게 관련되어 있다. 잘 연구되어 있는 특정 종양의 게놈에서는 통상 종양 억제유전자로 불리며 정상적으로는 악성 세포 성장을 억제하는 기능을 하는 열성유전자의 발현이 감소되어 있고(거나), 악성 성장을 촉진시키는 기능을 하는 특정 우성유전자, 예를 들어, 종양유전자가 과다발현되어 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 각 유전적 변화는 총체적으로 완전한 신생물성 표현형을 나타내는 형질의 일부를 나타내는 원인이 되는 것으로 보인다 [Hunter, Cell, 64:1129 (1991) 및 Bishop, Cell, 64:235-248 (1991)].
암 세포에서의 유전자 (예를 들어, 종양유전자) 과다발현의 잘 공지된 메카니즘은 유전자 증폭이다. 이는 조상 세포의 염색체에서 특정 유전자의 다수 복제본이 생성되는 과정이다. 이 과정은 유전자를 포함하는 염색체 영역의 예정되지 않은 복제에 이어, 복제된 세그먼트가 염색체로 다시 재조합되는 과정을 수반한다 [Alitalo et al., Adv. Cancer Res., 47:235-281 (1986)]. 유전자의 과다발현은 유전자 증폭과 평행 관계가 되는 것, 즉 생성되는 복제본 수에 비례하는 것으로 생각된다.
성장 인자 및 성장 인자 수용체를 코딩하는 원종양유전자 (proto-oncogene)는 유방암을 비롯한 각종 인간 악성 질환의 병인에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 예를 들어, 상피 성장 인자 수용체 EGFR과 관련된 185 kd의 막횡단 당단백질 수용체 (p185HER2; HER2)를 코딩하는 인간 ErbB2 유전자 (또한 her2 또는 c-erbB-2로도 공지된 erbB2)는 인간 유방암의 약 25％ 내지 약 30％에서 과다발현된 것으로 밝혀졌다 [Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989)].
원종양유전자의 유전자 증폭은 전형적으로 보다 악성인 형태의 암과 관련된 현상이며, 임상 결과를 예측하는데 사용할 수 있는 것으로 보고되었다 [Schwab et al., Genes Chromosomes Cancer, 1:181-193 (1990); Alitalo et al., 상기 문헌]. 따라서, erbB2의 과다발현은 특히 액와 림프절과 관련된 원발성 질환의 환자에서 통상 불분명한 예후를 예측하는데 사용될 것으로 생각되며 [Slamon et al.,(1987) 및 (1989)의 상기 문헌; Ravdin and Chamness, Gene, 159:19-27 (1995); 및 Hynes and Stern, Biochim. Biophys. Acta. 1198:165-184 (1994)], 호르몬 치료 및 CMF (시클로포스파미드, 메토트렉세이트 및 플루오르우라실) 및 안트라시클린을 비롯한 화학요법 섭생에 대한 감수성 및(또는) 내성과 결부되어 있다 [Baselge et al., Oncology, 11 (3 Suppl 1):43-48 (1997)]. 그러나, 불분명한 예후를 보이는 erbB2 과다발현과 관련되어 있지만, 탁산 (taxane)을 사용한 치료에 임상적으로 반응하는 HER2-양성 환자의 이상 증상은 HER2-음성 환자보다 3 배 더 높았다 (동일 문헌). 재조합 인간화 항-ErB2 (항-HER2) 모노클로날 항체 (rhuMAb HER2 또는 상표명 헤르셉틴(상표명)(Herceptin)으로 언급되는 쥐 항-ErbB2 항체 4D5의 인간화 형태)는 앞서 항암 치료를 심하게 받은 ErbB2-과다발현 전이 유방암 환자에서 임상적으로 효과적이었다 [Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14:737-744 (1996)].
상기 기재된 바를 고려하면, 유전자 증폭과 관련된 종양의 진단 및 치료에 유용한 신규 방법 및 조성물을 동정하는데 분명한 관심을 갖게 된다.
본 발명은 인간을 포함하는 포유동물에서 신생물성 세포의 성장 및 증식의 진단 및 치료용 조성물과 그 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종양 세포의 게놈에서 증폭되는 유전자를 확인하는 것을 기초로 한다. 이러한 유전자 증폭은 유전자 생성물의 과다발현과 관련되어 있으며, 종양형성의 원인이 되는 것으로 생각된다. 따라서, 증폭된 유전자에 의해 코딩된 단백질은 특정 암의 진단 및(또는) 치료 (예방을 포함하여)에 있어 유용한 표적인 것으로 생각되며, 종양 치료의 예후를 예측하는데 사용할 수 있다.
도 1은 본원에서 DNA22780-1078로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO197을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 1)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 2는 도 1에 나타낸 서열번호 1의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO197 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 2)을 나타낸다.
도 3은 본원에서 DNA30879-1152로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO207을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 3)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 4는 도 3에 나타낸 서열번호 3의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO207 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 4)을 나타낸다.
도 5는 본원에서 DNA33460-1166으로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO226을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 5)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 6은 도 5에 나타낸 서열번호 5의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO226 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 6)을 나타낸다.
도 7은 본원에서 DNA34435-1140으로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO232를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 7)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 8은 도 7에 나타낸 서열번호 7의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO232 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 8)을 나타낸다.
도 9는 본원에서 DNA35917-1207로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO243을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 9)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 10은 도 9에 나타낸 서열번호 9의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO243 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 10)을 나타낸다.
도 11은 본원에서 DNA35880-1160으로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO256을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 11)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 12는 도 11에 나타낸 서열번호 11의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열PRO256 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 12)을 나타낸다.
도 13은 본원에서 DNA38260-1180으로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO269를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 13)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 14는 도 13에 나타낸 서열번호 13의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO269 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 14)을 나타낸다.
도 15는 본원에서 DNA39987-1184로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO274를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 15)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 16은 도 15에 나타낸 서열번호 15의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO274 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 16)을 나타낸다.
도 17은 본원에서 DNA39520-1217로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO304를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 17)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 18은 도 17에 나타낸 서열번호 17의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO304 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 18)을 나타낸다.
도 19는 본원에서 DNA43466-1225로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO339를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 19)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 20은 도 19에 나타낸 서열번호 19의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO339 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 20)을 나타낸다.
도 21 본원에서 DNA71282-1668로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO1558을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 21)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 22는 도 21에 나타낸 서열번호 21의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO1557 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 22)을 나타낸다.
도 23은 본원에서 DNA58801-1052로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO779를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 23)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 24는 도 23에 나타낸 서열번호 23의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO779 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 24)을 나타낸다.
도 25는 본원에서 DNA62881-1515로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO1185를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 25)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 26은 도 25에 나타낸 서열번호 25의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO1185 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 26)을 나타낸다.
도 27은 본원에서 DNA64884-1527로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO1245를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 27)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 28은 도 27에 나타낸 서열번호 27의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO1245 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 27)을 나타낸다.
도 29는 DNA76531-1701로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO1759를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 29)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 30은 도 29에 나타낸 서열번호 29의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO1759 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 30)을 나타낸다.
도 31은 DNA96869-2673으로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO5775를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 31)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 32는 도 31에 나타낸 서열번호 31의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열PRO5775 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 32)을 나타낸다.
도 33은 DNA128451-2739로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO7133을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 33)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 34는 도 33에 나타낸 서열번호 33의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO7133 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 34)을 나타낸다.
도 35는 DNA102846-2742로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO7168을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 35)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 36은 도 35에 나타낸 서열번호 35의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO7168 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 36)을 나타낸다.
도 37은 DNA92265-2669로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO5725를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 37)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 38은 도 37에 나타낸 서열번호 37의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO5725 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 38)을 나타낸다.
도 39는 DNA30869로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO202를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 39)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 40은 도 39에 나타낸 서열번호 39의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO202 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 40)을 나타낸다.
도 41은 본원에서 DNA34405로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO206을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 41)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 42는 도 41에 나타낸 서열번호 41의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO206 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 42)을 나타낸다.
도 43은 본원에서 DNA36995로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO264를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 43)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 44는 도 43에 나타낸 서열번호 43의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO264 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 44)을 나타낸다.
도 45는 본원에서 DNA43320으로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO313을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 45)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 46은 도 45에 나타낸 서열번호 45의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO313 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 46)을 나타낸다.
도 47은 본원에서 DNA38649로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO342를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 47)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 48은 도 47에 나타낸 서열번호 47의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO342 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 47)을 나타낸다.
도 49는 DNA56505로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO542를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 49)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 50은 도 49에 나타낸 서열번호 49의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO542 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 50)을 나타낸다.
도 51은 DNA48303으로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO773을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 51)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 52는 도 51에 나타낸 서열번호 51의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO773 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 52)을 나타낸다.
도 53은 DNA50798로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO861을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 53)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 54는 도 53에 나타낸 서열번호 53의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO861 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 54)을 나타낸다.
도 55는 DNA66489로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO1216을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 55)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 56은 도 55에 나타낸 서열번호 55의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO1216 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 56)을 나타낸다.
도 57은 DNA80896으로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO1686을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 57)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 58은 도 57에 나타낸 서열번호 57의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO1686 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 58)을 나타낸다.
도 59는 DNA35672-2508로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO1800을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 59)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 60은 도 59에 나타낸 서열번호 59의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO1800 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 60)을 나타낸다.
도 61 본원에서 DNA96791로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO3562를 코딩하는뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 61)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 62는 도 61에 나타낸 서열번호 61의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO3562 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 62)을 나타낸다.
도 63은 본원에서 DNA58725로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO9850을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 63)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 64는 도 63에 나타낸 서열번호 63의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO9850 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 64)을 나타낸다.
도 65는 본원에서 DNA47465-1561로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO539를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 65)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 66은 도 65에 나타낸 서열번호 65의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO539 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 66)을 나타낸다.
도 67은 본원에서 DNA94713-2561로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO4316을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 67)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 68은 도 67에 나타낸 서열번호 67의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO4316 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 67)을 나타낸다.
도 69는 DNA97003-2649로 명명된 클론인, 천연 서열 PRO4980을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 69)을 나타낸다. 또한, 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된 부분은 각각 개시 코돈 및 정지 코돈의 위치이다.
도 70은 도 69에 나타낸 서열번호 69의 코딩 서열로부터 유도된 천연 서열 PRO4980 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 70)을 나타낸다.
<발명의 요약>
A. 실시양태
본 발명은 인간을 포함하는 포유동물에서 신생물성 세포의 성장 및 증식의 진단 및 치료용 조성물과 그 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종양 세포의 게놈에서 증폭되는 유전자를 확인하는 것을 기초로 한다. 이러한 유전자 증폭은 유전자 생성물의 과다발현과 관련되어 있으며, 종양형성의 원인이 되는 것으로 생각된다. 따라서, 증폭된 유전자에 의해 코딩된 단백질은 특정 암의 진단 및(또는) 치료 (예방을 포함하여)에 있어 유용한 표적인 것으로 생각되며, 종양 치료의 예후를 예측하는데 사용할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드로 지칭되는 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체에 관한 것이다. 한 측면에서, 단리된 항체는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 다른 측면에서, 항체는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 발현하는 세포의 사멸을 유도한다. 종종, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316또는 PRO4980 폴리펩티드를 발현하는 세포는 동일한 조직 유형의 정상 세포에 비해 상기 폴리펩티드를 과다발현하는 종양 세포이다. 또다른 측면에서, 항체는 바람직하게는 비-인간 상보성 결정 영역 (complementarity determining region, CDR) 잔기 및 인간 프레임워크 (framework) 영역 (FR) 잔기를 갖는 모노클로날 항체이다. 항체는 표지될 수 있으며, 고상 지지체상에 고정될 수 있다. 또다른 측면에서, 항체는 바람직하게는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 단편, 단일쇄 항체 또는 인간화 항체이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 바람직하게는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 약제학상 허용되는 담체와 혼합된 형태로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 물질의 조성물은 치료 유효량의 항체를 포함한다. 다른 측면에서, 상기 조성물은 예를 들어, 추가의 항체 또는 세포독성제 또는 화학요법제일 수 있는 추가의 활성 성분을 포함한다. 조성물은 멸균된 것이 바람직하다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 재조합 숙주세포에 관한 것이다.
또다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체를 코딩하는 핵산으로 형질전환된 숙주세포를 항체의 발현에 충분한 조건하에 배양하고, 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는, 상기 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542,PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 및(또는) 면역학적 기능 또는 활성을 억제하는, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 길항제에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 그의 상보체에 혼성화되는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 단리된 핵산분자는 DNA가 바람직하고, 혼성화는 엄격한 혼성화 및 세척 조건에서 일어나는 것이 바람직하다. 상기 핵산 분자는 본원에서 확인된 증폭된 유전자의 안티센스 분자로 작용할 수 있으며, 이는 또한 각 증폭된 유전자의 전사 및(또는) 번역의 조절에 사용되거나 증폭 반응의 안티센스 프라이머로서 유용할 수 있다. 또한, 그러한 서열은 또한 증폭된 유전자의 조절에 사용할 수 있는 리보자임 및(또는) 삼중 나선 서열의 일부로 사용할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243,PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 함유할 것으로 의심되는 샘플을 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체에 노출시켜 상기 샘플에서 상기 항체와 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 결합 여부를 결정하는 것을 포함하는, 상기 샘플에서 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 존재를 결정하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본발명은 세포를 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체에 노출시켜 항체와 세포의 결합 여부를 결정하는 것을 포함하는, 세포에서 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 존재를 결정하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플 및 (b) 동일한 세포 유형의 공지된 정상 조직 세포인 대조용 샘플에서 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하며, 이 때 대조용 샘플에 비해 시험 샘플의 발현 수준이 더 높으면 시험 조직 세포를 얻은포유동물에 종양이 존재함을 나타내는 포유동물에서의 종양 진단 방법에 관한 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체를 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플과 접촉시키는 단계, 및 (b) 시험 샘플에서 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체와 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드와의 결합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 이 때 결합체의 형성이 상기 포유동물에 종양이 존재함을 나타내는 것인, 포유동물의 종양 진단 방법에 관한 것이다. 검출은 정성 또는 정량적일 수 있으며, 동일한 세포 유형의 공지된 정상 조직 세포인 대조용 샘플에서의 결합체 형성을 모니터한 결과를 비교하여 수행할 수 있다. 시험 샘플에 보다 다량의 결합체가 형성되었다는 것은 시험 조직 세포를 얻은 포유동물에 종양이 존재함을 나타내는 것이다. 항체는 검출가능한 표지를 포함하는 것이 바람직하다. 결합체 형성은 예를 들어, 광학현미경, 유동 세포계측법 (flow cytometry), 형광측정법 또는 당업계에 공지된 다른 기술로 모니터할 수 있다.
시험 샘플은 통상 신생물성 세포 성장 또는 증식으로 의심되는 환자의 세포 (예를 들어, 암 세포)로부터 얻는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 적합한 포장내에 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체 및 담체 (예를 들어, 완충제)를 포함하는 암 진단용 키트에 관한 것이다. 키트는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542,PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 함유할 것으로 의심되는 샘플에서 상기 폴리펩티드의 존재를 검출하는데 상기 항체를 사용하는 지침서를 포함하는 것이 바람직하다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포를 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역적 활성 및(또는) 발현을 억제하는 유효량의 제제에 노출시켜 종양 세포의 성장을 억제시키는 것을 포함하는, 종양 세포의 성장 억제 방법에 관한 것이다. 상기 제제는 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는항-PRO4980 항체, 작은 유기 및 무기 분자, 펩티드, 포스포펩티드, 안티센스 또는 리보자임 분자, 또는 삼중 나선 분자가 바람직하다. 구체적인 측면에서, 상기 제제, 예를 들어, 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체는 세포 사멸을 유도한다. 또다른 측면에서, 종양 세포는 방사선 치료 및(또는) 세포독성제 또는 화학요법제에 추가로 노출시킬 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은
용기, 용기상의 라벨, 및 상기 용기중에 함유된, 종양 세포의 성장을 억제하는데 효과적인 활성 제제를 포함하는 조성물을 포함하고, 상기 용기상의 라벨은 상기 조성물을 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드가 동일한 조직 유형의 정상 세포에 비해 과다발현되는 특징이 있는 질병의 치료에 사용할 수 있음을 나타내는 제품에 관한 것이다. 구체적인 측면에서, 상기 조성물 중의 활성 제제는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243,PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 활성 및(또는) 발현을 억제하는 것이다. 바람직한 측면에서, 활성 제제는 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명은 또한 후보 화합물을 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드와 이들 두 성분이 상호작용하기에 충분한 시간 및 조건하에서 접촉시켜, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850,PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역적 활성의 억제 여부를 결정하는 것을 포함하는, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 구체적인 측면에서, 후보 화합물 또는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드는 고상 지지체상에 고정된다. 다른 측면에서, 고정되지 않은 성분은 검출가능한 표지를 포함한다. 바람직한 측면에서, 상기 방법은 (a) PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 존재하에 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773,PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응을 유도하기에 적합한 조건에서 스크리닝할 후보 화합물과 세포를 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 세포 반응의 유도를 측정하여 시험 화합물이 효과적인 길항제인지 결정하기 위한 단계를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시켜 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 발현이 억제되는지 측정하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 상기 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 바람직한 측면에서, 이 방법은 (a) PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686,PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 세포와 스크리닝할 후보 화합물을 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 폴리펩티드의 발현이 억제되는지 측정하는 단계를 포함한다.
B. 추가의 실시양태
본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에서, 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 바와 같은 전장의 아미노산 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 결여된 아미노산 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 포함되거나 포함되지 않은 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 아미노산 서열의 구체적으로 한정된 임의의 기타 단편을 갖는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 (a) DNA 분자의 상보체와 약 80％ 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81％ 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 82％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상의 서열 동일성 및 보다 바람직하게는 약 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 측면에서, 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 바와 같은 전장 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 cDNA의 코딩 서열을 포함하는 DNA 분자, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 결여된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759,PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 코딩 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드를 포함하거나 포함하지 않는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 막횡단 세포외 도메인의 코딩 서열, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 아미노산 서열의 구체적으로 한정된 임의의 기타 단편의 코딩 서열, 또는 (b) 상기 (a) DNA 분자의 상보체와 약 80％ 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81％ 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 82％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 83％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상의 서열 동일성 및 보다 바람직하게는 약 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 바와 같이 ATCC에 기탁된 임의의 인간 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 동일한 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 (a) DNA 분자의 상보체와 약 80％ 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81％ 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 82％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상의 서열 동일성 및 보다 바람직하게는 약 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 본원에 개시된 바와 같은 막횡단 도메인이 결실되거나 막횡단 도메인이 불활성화된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243,PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과의 상보체를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 따라서, 본원에 기재된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 가용성 세포외 도메인이 고려된다.
또다른 실시양태는, 예를 들면 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 임의로 코딩할 수 있는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773,PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 코딩 단편에 대한 혼성화 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브로 사용할 수 있는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 코딩 서열의 단편 또는 그의 상보체에 관한 것이다. 그러한 핵산 단편은 통상 길이가 약 20 뉴클레오티드 이상, 바람직하게는 길이가 약 30 뉴클레오티드 이상, 더욱 바람직하게는 길이가 약 40 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 50 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 60 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 70 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 80 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 90 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 100 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 110 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 120 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 130 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 140 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 150 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 160 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 170 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 180 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 190 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 200 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 250 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 300 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 350 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 400 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 450 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 500 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 600 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 700 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 800 뉴클레오티드 이상, 보다 바람직하게는 길이가 약 900 뉴클레오티드 이상 및 보다 바람직하게는 길이가 약 1000 뉴클레오티드 이상이며, 이 때 "약"이란 용어는 해당 뉴클레오티드 길이의 10％를 가하거나 감한 길이를 의미한다. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레티드 서열의 신규 단편은 임의의 다수의 잘 공지된 서열 정렬 프로그램을 이용하여 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 다른 공지된 뉴클레오티드 서열과 정렬하여 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558,PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레티드 서열의 단편이 신규한지 측정함으로써 종래의 방식으로 결정할 수 있음을 알아야 한다. 상기 모든 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 고려된다. 또한, 고려되는 것은 이들 뉴클레오티드 서열 단편에 의해 코딩되는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 단편, 바람직하게는 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는항-PRO4980 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 단편이다.
또다른 실시양태에서, 본원의 상기에 확인된 임의의 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 단리된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 전장의 아미노산 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 결여된 아미노산 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 포함되거나 포함되지 않은 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 아미노산 서열의 구체적으로 한정된 임의의 기타 단편을 갖는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드와 약 80％ 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81％ 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 82％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상의 서열 동일성 및 보다 바람직하게는 약 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 ATCC에 기탁된 임의의 인간 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 약 80％ 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81％ 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 82％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상의 서열 동일성 및 보다 바람직하게는 약 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 전장의 아미노산 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 결여된 아미노산 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 포함되거나 포함되지 않은 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 아미노산 서열의 구체적으로 한정된 임의의 기타 단편을 갖는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교했을 때 약 80％ 이상의 양성, 바람직하게는 약 81％ 이상의 양성, 더욱 바람직하게는 약 82％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 83％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 84％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 85％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 86％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 87％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 88％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 89％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 91％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 92％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 93％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 94％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 95％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 96％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 97％ 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상의 양성 및 보다 바람직하게는 약 99％ 이상의 양성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 관한 것이다.
구체적인 측면에서, 본 발명은 N-말단 신호 서열 및(또는) 개시 메티오닌이 없으며 본원의 상기에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단리된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 제공한다. 또한, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 적합한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터가 포함된 숙주세포를 배양하여, 그 세포 배양물로부터 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드의 제조 방법이 본원에 기재되어 있다.
본 발명의 또다른 측면은 막횡단 도메인이 결실되거나 불활성화된, 단리된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304,PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 제공한다. 또한, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 적합한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터가 포함된 숙주세포를 배양하여, 그 세포 배양물로부터 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드의 제조 방법이 본원에 기재되어 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 천연 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의길항제에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 길항제는 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체 또는 작은 분자이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 후보 화합물과 접촉시켜 상기 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 의해 매개되는 생물학적 활성을 모니터하는 것을 포함하는, 상기 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773,PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 대한 길항제를 동정하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드는 천연 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드, 본원에 기재된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의길항제, 또는 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체를 담체와 함께 포함하는 조성물에 관한 것이다. 임의로 담체는 약제학상 허용되는 담체이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드, 그의 길항제, 또는 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체에 반응성인 질병의 치료에 유용한 의약 제조에 있어서, 상기 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168,PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드, 또는 본원에 기재된 바와 같은 그의 길항제, 또는 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체의 용도에 관한 것이다.
*본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 또한, 임의의 그러한 벡터를 포함하는 숙주세포도 제공된다. 예를 들면, 숙주세포는 CHO 세포, 이. 콜라이 (E. coli), 효모 또는 배큘로바이러스로 감염된 곤충 세포일 수 있다. 또한, 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드의 제조 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 목적하는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 숙주세포를 배양하여, 그 세포 배양물로부터 목적하는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된, 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 그러한 키메라 분자의 예에는 에피토프 태그 서열 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 융합된 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드가 포함된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 임의의 상기 또는 하기에 기재된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로, 항체는 모노클로날 항체, 인간화 항체, 항체 단편 또는 단일쇄 항체이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 또는 하기에 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열로부터 유도될 수 있는, 게놈 및 cDNA 뉴클레오티드 서열의 단리에 유용하거나 안티센스 프로브로서 유용한 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공한다.
Ⅰ . 정의
"유전자 증폭" 및 "유전자 복제"라는 어구는 서로 바꿔 사용할 수 있고, 특정 세포 또는 세포주에서 유전자 또는 유전자 단편의 다수 복제본이 형성되는 과정을 말한다. 복제된 영역 (증폭된 DNA 스트레치)는 종종 "앰플리콘 (amplicon)"으로 불린다. 통상, 생성되는 mRNA의 양, 즉 유전자 발현량은 발현되는 특정 유전자의 복제본 수에 비례하여 증가한다.
본원에 사용된 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 말한다.
"암" 및 "암성"이란 용어는 조절되지 않는 세포 증식이라는 전형적 특징을 갖는 포유동물의 생리 상태를 의미하거나 규정한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 암의 보다 구체적인 예로는 유방암, 전립선암, 결장암, 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위장암, 췌장암, 신경교아종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암,간종양, 결장직장암, 자궁내막암, 타액선 암종, 신장암, 간암, 외음부암, 갑상선암, 간암종 및 여러 종류의 두부 및 경부암이 포함된다.
"치료"란 질병의 발생을 예방하거나 질병의 병리를 변화시키기 위해 수행하는 중재 (intervention)를 의미한다. 따라서, "치료"는 치료 처치 및 예방 또는 방지 조치 모두를 가리킨다. 치료를 필요로 하는 대상에는 이미 질병에 걸린 대상 뿐만 아니라 질병을 예방하고자 하는 대상도 포함된다. 종양 (예를 들어, 암) 치료에서, 치료제는 종양 세포의 병리를 직접 감소시킬 수 있거나, 종양 세포를 다른 치료제, 예를 들어 방사선 및(또는) 화학요법제에 의한 처리에 보다 감응성이 되도록 할 수 있다.
암의 "병리"에는 환자의 건강에 손상을 주는 모든 현상이 포함된다. 이러한 것으로는 비정상 또는 조절 불가능한 세포 성장, 전이, 인접 세포의 정상적인 기능 방해, 비정상적인 수준으로 싸이토카인 또는 다른 분비물의 분비, 염증 또는 면역학적 반응의 억제 또는 악화 등이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
치료 목적상 "포유동물"은 인간, 가축 및 사육 동물, 및 동물원용, 경기용 또는 애완용 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소, 돼지, 양 등을 비롯하여 포유동물로 분류되는 모든 동물을 말한다. 바람직한 포유동물은 인간이다.
본원에서 사용된 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 약제학상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함함다. 생리학상 허용되는 담체는 흔히 pH 완충 수용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예로는 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 비롯한 산화방지제; 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈 (TWEEN, 상표명), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스 (PLURONICS, 상표명)가 포함된다.
하나 이상의 다른 치료제와 "조합하여" 투여한다는 것은 동시에 (동시다발적으로) 투여하거나 어떤 순서로든 연속하여 투여하는 것이 포함된다.
본원에 사용된 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 예방하고(하거나) 세포를 파괴시키는 물질을 말한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 I131, I125, Y90및 Re186), 화학요법제 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성을 갖는 독소 또는 그의 단편을 포함하여 말한다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화합물이다. 화학요법제의 예에는 아드리아마이신, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (상표명 탁솔 (Taxol), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재 브리스톨마이어스 스켑 오콜로지사 제품) 및 독세탁셀 (상표명 탁소테레 (Taxotere), 프랑스 안토니소재 롱플랑 로레아사 제품), 톡소테레, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호 참조), 5-FU, 6-티오구아닌, 6-머캅토푸린, 악티노마이신 D, VP-16, 클로람부실, 멜팔란 및 다른 관련 질소 머스타드가 포함된다. 또한, 타목시펜 및 오나프리스톤과 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 기능을 하는 호르몬 제제도 상기 화학요법제의 정의에 포함된다.
본원에 사용된 "성장 억제제"는 세포, 특히 본원에서 확인된 어떠한 유전자이든지 그를 과다발현하는 암세포의 시험관내 또는 생체내 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 말한다. 따라서, 성장 억제제는 S기에 그러한 유전자를 과다발현하는 세포의 비율을 크게 감소시키는 물질이다. 성장 억제제의 예에는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 시기에서) 차단하는 물질, 예를 들어 G1기 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질이 포함된다. 전형적인 M기 차단제로는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔, 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. 또한, G1을 정지시키는 물질, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 S기 정지에도 작용한다. 추가 정보는 문헌 [Murakami et al., The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., "Cell cycle regulation, oncogens, andantineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995), Chapter 1, 특히 13페이지]에 기재되어 있다.
"독소루비신"은 안트라시클린 항생제이다. 독소루비신의 완전한 화학명은 (8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-8-(히드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온이다.
"싸이토카인"이란 하나의 세포 군집에 의해 방출되는, 세포간 매개체로서 다른 세포에 대해 작용하는 단백질의 포괄적인 용어이다. 이러한 싸이토카인의 예로는 림포카인, 모노카인 및 전형적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 싸이토카인에는 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체 호르몬 (LH) 등의 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토젠; 종양 괴사 인자-α및 -β; 뮬러리안 억제 물질; 마우스 고나도트로핀 관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어, NGF-β; 혈소판 성장 인자; 형질전환 세포 성장 인자 (TGF), 예를 들어, TGF-α및 -β; 인슐린 유사 성장 인자-Ⅰ 및 -Π; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예를 들어, 인터페론-α, -β및 -γ;콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어, 대식세포-CSF (M-CSF); 과립세포-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립세포-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예를 들어, IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3,IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들어, TNF-α또는 TNF-β; 및 LIF-및 키트 리간드 (KL)를 비롯한 다른 폴리펩티드 인자가 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 싸이토카인이란 용어에는 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물중 단백질 및 천연 서열 싸이토카인의 생물학적 활성 등가물이 포함된다.
본원에서 사용된 "전구약물"이란 모약물에 비해 종양 세포에 대한 세포독성이 덜하며 효소적으로 활성화되거나 보다 활성인 모형태로 전환될 수 있는 약제학상 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 말한다 (문헌 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14:375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)] 및 [Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 147-267, Humana Press (1985)] 참조). 본 발명의 전구약물로는 보다 활성인 무세포독성 약물로 전환될 수 있는 포스페이트 함유 전구약물, 티오포스페이트 함유 전구약물, 술페이트 함유 전구약물, 펩티드 함유 전구약물, D-아미노산 개질 전구약물, 글리코실화된 전구약물, β-락탐 함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드 함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드 함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로유리딘 전구약물이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 전구약물로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물로는 상기 기재된 화학요법제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
신생물성 세포 성장, 종양 성장 또는 암 세포 성장과 관련하여 본원에 개시된 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 "유효량"은 표적 세포의 성장을 어느 정도까지 억제시킬 수 있는 양을 의미한다. 이 용어에는 표적 세포의 성장 억제, 세포 증식 억제성 및(또는) 세포 독성 효과 및(또는) 아팝토시스가 포함된다. 신생물성 세포 성장, 종양 성장 또는 암 세포 성장을 억제하기 위한 PRO 폴리펩티드 길항제의 "유효량"은 경험적으로 및 통상의 방식으로 결정할 수 있다.
종양의 치료와 관련하여 "치료 유효량"이란 하나 이상의 다음 효과, 즉 (1) 종양 성장의 지연 및 완전한 성장 정지를 비롯하여 종양 성장의 어느 정도까지의 억제, (2) 종양 세포 수의 감소; (3) 종양 크기의 감소; (4) 주위 기관으로의 종양 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지); (5) 전이의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지); (6) 종양의 퇴행 또는 거부를 일으킬 수 있는 (반드시 일으켜야 하는 것은 아님) 항종양 면역 반응의 증진; 및(또는) (7) 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 경감시킬 수 있는 양을 가리킨다. 종양 치료를 위한 PRO 폴리펩티드 길항제의 "치료 유효량"은 경험적으로 및 통상의 방식으로 결정할 수 있다.
PRO 길항제의 "성장 억제량"은 세포, 특히 종양 세포, 예를 들어 암세포의 성장을 시험관내 또는 생체내에서 억제할 수 있는 양이다. 신생물성 세포 성장을 억제하기 위한 길항제의 "성장 억제량"은 경험적으로 및 통상의 방식으로 결정할 수 있다.
PRO 길항제의 "세포독성량"은 세포, 특히 종양, 예를 들어 암세포의 파괴를 시험관내 또는 생체내에서 일으킬 수 있는 양이다. 신생물성 세포 성장을 억제하기 위한 PRO 길항제의 "세포독성량"은 경험적으로 및 통상의 방식으로 결정할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "PRO 폴리펩티드" 또는 "PRO" 및 숫자가 바로 이어서 표시되는 경우, 전체 명칭 (즉, PRO/수)은 본원에 기재된 특정 폴리펩티드 서열을 나타낸다. 용어 "PRO/수 폴리펩티드" 및 "PRO/수" (여기서, 용어 "수"는 본원에서 사용된 실제 숫자 명칭으로 제공함)는 천연 서열 PRO 폴리펩티드 및 PRO 폴리펩티드 변이체 (본원에 추가로 정의됨)를 포함한다. 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드는 인간 조직 유형 등의 각종 공급원 또는 또다른 공급원으로부터 단리할 수 있거나, 또는 재조합 및(또는) 합성 방법으로 제조할 수 있다.
"천연 서열 PRO 폴리펩티드"는 자연으로부터 유래된 상응하는 PRO 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 그러한 천연 서열 PRO 폴리펩티드는 자연으로부터 단리할 수 있거나, 재조합 및(또는) 합성 수단으로 제조할 수 있다. 용어 "천연 서열 PRO 폴리펩티드"는 구체적으로 PRO 폴리펩티드의 자연 발생 말단 절단형 또는 분비형 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 폴리펩티드의 자연 발생 변이체형 (예를 들어, 스플라이싱된 형태) 및 자연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 천연 서열 PRO 폴리펩티드는 수반된 도면에 나타낸 성숙 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다. 개시 및 종료 코돈은 굵은 글씨와 밑줄로 표시된 글씨로 나타낸다. 그러나, 도면에 나타낸 PR0 폴리펩티드는 아미노산 위치 1로 지칭된 메티오닌 잔기에서 시작하지만, 도면에서 아미노산 위치 1로부터 상류 또는 하류에 위치하는 다른 아미노산 잔기가 PR0 폴리펩티드의 개시 아미노산 잔기로 사용될 수 있다.
PRO 폴리펩티드 "세포외 도메인" 또는 "ECD"란 본질적으로 막횡단 및 세포질 도메인이 없는 PRO 폴리펩티드 형태를 의미한다. 통상적으로 PRO 폴리펩티드 ECD는 막횡단 및(또는) 세포질 도메인을 1 ％ 미만으로 포함할 것이며, 바람직하게는 상기 도메인들을 0.5 ％ 미만으로 포함할 것이다. 본 발명의 PRO 폴리펩티드에서 확인된 모든 막횡단 도메인은 당업계에서 소수성 도메인 유형을 밝히는데 통상적으로 사용되는 기준에 따라 확인된 것임을 이해해야 할 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계선은 달라질 수 있지만, 대부분은 본원에서 처음 확인된 바와 같이 막횡단 도메인의 어느쪽 말단이든지 약 5 개 아미노산 범위 내에 존재한다. 따라서, PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인은 경우에 따라 실시예 또는 상세한 설명에서 확인된 막횡단 도메인/세포외 도메인의 어느쪽 경계면이든지 약 5 개 이하의 아미노산을 포함할 수 있고, 수반되는 신호 펩티드가 있거나 없는 이러한 폴리펩티드, 및 이들을 코딩하는 핵산은 본 발명에 포함된다.
본원에 기재된 다양한 PRO 폴리펩티드의 "신호 펩티드"의 대략적인 위치는 본원 및(또는) 첨부된 도면에 나타나 있다. 그러나 염두해야 할 것은, 신호 펩티드의 C-말단 경계가 달라질 수 있지만, 대부분은 본원에서 처음 확인된 신호 펩티드 C-말단의 어느쪽 경계면이든지 약 5 개 아미노산 이하라는 점이며, 여기서 신호 펩티드의 C-말단 경계는 당업계에서 아미노산 서열 요소의 타입을 확인하는데 통상적으로 이용되는 기준에 따라 확인될 수 있다 (예를 들어, Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6 (1997) 및 von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690(1986)). 게다가, 일부 경우에는 분비 폴리펩티드의 신호 서열의 절단이 전체적으로 균일하지 않아 1종 이상의 분비된 폴리펩티드를 생성시킨다는 것을 인지해야 한다. 본원에서 확인된 신호 펩티드의 C-말단의 어느쪽 경계면이든지에 있는 약 5 개 이하의 아미노산 범위 내에서 신호 펩티드가 절단되는 이들 성숙 폴리펩티드, 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 포함된다.
"PRO 폴리펩티드 변이체"는 본원에 정의된 전장의 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 정의된 바와 같은 신호 펩티드가 결여된 PRO 폴리펩티드, 본원에 정의된 바와 같이 신호 펩티드가 포함되거나 포함되지 않는 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 정의된 바와 같은 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 임의의 기타 단편과 약 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 상기 또는 하기에 정의된 바와 같은 활성 PRO 폴리펩티드를 의미한다. 그러한 폴리펩티드 변이체에는, 예를 들면 전장의 천연 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에서 1개 이상의 아미노산 잔기가 부가되거나 결실된 PRO 폴리펩티드가 포함된다. 통상, PRO 폴리펩티드 변이체는 본원에 개시된 바와 같은 전장의 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 결여된 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 포함되거나 포함되지 않은 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 PRO 폴리펩티드의 임의의 단편과 약 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 약 81％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84％ 이상의 아미노산 서열동일성, 보다 바람직하게는 약 85％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상의 아미노산 서열 동일성 및 가장 바람직하게는 약 99％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 통상, PRO 변이체 폴리펩티드는 약 10개 이상의 아미노산 길이, 통상적으로 약 20개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 30개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 40개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 50개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 60개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 70개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 80개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 90개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 100개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 150개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 200개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 300개 이상의 아미노산 길이, 또는 이를 초과하는 아미노산 길이이다.
하기에 나타낸 바와 같이, 표 1은 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 위한 완전한 원시 코드를 제공한다. 이 원시 코드는 통상 UNIX 운용 체계에서 사용하기 위한 다른 부호로 번역되어 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 제공할 수 있다.
또한, 표 2a 내지 2d는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 아미노산 서열 동일성 (％) (표 2a-2b) 및 핵산 서열 동일성 (％) (표 2c-2d)을 측정하기 위해 하기 기재된 방법을 이론상으로 예시한 것이다. 이 때, "PRO"는 이론상의 해당 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 해당 "PRO" 폴리펩티드가 비교되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내며, "PRO-DNA"는 이론상의 해당 PRO-코딩 핵산 서열을 나타내고, "비교 DNA"는 해당 "PRO-DNA" 핵산 분자가 비교되는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, "X", "Y" 및 "Z"는 각각 이론상 상이한 아미노산 잔기를 나타내고, "N", "L" 및 "V"는 각각 이론상 상이한 뉴클레오티드를 나타낸다.
본원에서 확인된 PRO 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 (％)"은 PRO 폴리펩티드 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우 서열 동일성 (％)의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 PRO 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬법은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 용이하게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 연산법을 비롯하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적상 아미노산 서열 동일성 값 (％)은 하기에 기재된 바와 같이 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 표 1에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크사가 개발하였으며, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (미국 20559 워싱톤 D.C.에 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크사 (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재)를 통해 용이하게 구할 수 있거나, 표 1에 기재된 원시 코드로부터 번역될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운용 체계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 번역되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며, 변경하지 않는다.
본 발명에 이용하기 위해, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (％) (주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (％)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (％)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 이 방법을 이용한 아미노산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 2a 내지 2b는 "PRO"로 지칭되는 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 지칭되는 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성 (％)을 계산하는 방법을 나타낸다.
달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 값 (％)은 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻었다. 그러나, 아미노산 서열 동일성 (％)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 이용하여 계산할 수도 있다 [Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)]. NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정되어 있다.
NCBI-BLAST2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (％)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 NCBI-BLAST2 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (％)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (％)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
또한, 본원에 사용된 동일성 값 (％)은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-80 (1996)]을 이용하여 얻을 수 있다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정했다. 디폴트 값으로 설정하지 않은 것들, 즉 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정하였다. 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 점수 매트릭스 = BLOSUM62. 본 발명의 목적상, 아미노산 서열 동일성 값 (％)은 (a) 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 갖는 당해 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교되는 당해 아미노산 서열 (즉, 당해 PRO 폴리펩티드와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리펩티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 아미노산 잔기의 수를 WU-BLAST-2로 결정하여 얻고, (b) 이를 당해 PRO 폴리펩티드의 아미노산 총 잔기수로 나누어 결정한다. 예를 들어, 아미노산 서열 B와 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 A를 포함하는 폴리펩티드"라는 말에서, 아미노산 서열 A는 비교하는 당해 아미노산 서열이고, 아미노산 서열 B는 당해 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
"PRO 변이체 핵산 서열"은, 본원에 개시된 바와 같은 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 결여된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드를 포함하거나 포함하지 않는 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 임의의 기타 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 80％ 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는, 하기 정의된 바와 같은 활성 PRO 폴리펩티드를 코딩하는핵산 분자를 의미한다.
통상, PRO 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 바와 같은 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 결여된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 포함되거나 포함되지 않은 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 임의의 기타 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 81％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상의 핵산 서열 동일성 및 보다 바람직하게는 약 99％ 이상의 핵산 서열 동일성을 가질 것이다. 변이체는 천연 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
통상, PRO 변이체 폴리펩티드는 약 30개 이상의 뉴클레오티드 길이, 통상적으로 약 60개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 90개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 120개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 150개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 180개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 210개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 240개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 270개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 300개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 450개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 600개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 900개 이상의 뉴클레오티드 길이, 또는 이를 초과하는 뉴클레오티드 길이이다.
본원에서 확인된 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 서열에 대한 "핵산 서열 동일성 (％)"은 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우 서열 동일성 (％)의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오티드의 비율로서 정의된다. 핵산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬법은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 용이하게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 연산법을 비롯하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상핵산 서열 동일성 값 (％)은 하기에 기재된 바와 같이 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 표 1에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크사가 개발하였으며, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (미국 20559 워싱톤 D.C.에 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크사 (미국 캘리포니아주 싸우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 용이하게 구할 수 있거나, 표 1에 기재된 원시 코드로부터 번역할 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운용 체계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집하여 이용할 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며, 변경하지 않는다.
본 발명의 목적상, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (％) (주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (％)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
W/Z ×100
여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (％)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (％)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 이 방법을 이용한 핵산 서열 동일성 계산의 예로서,표 2c 내지 2d는 "PRO-DNA"로 지칭되는 핵산 서열에 대한 "비교 DNA"로 지칭되는 핵산 서열의 핵산 서열 동일성 (％)을 계산하는 방법을 나타낸다.
달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 핵산 서열 동일성 값 (％)은 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻었다. 그러나, 핵산 서열 동일성 (％)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 이용하여 계산할 수도 있다 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)]. NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정되어 있다.
NCBI-BLAST2가 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (％) (주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (％)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
W/Z ×100
여기서, W는 C 및 D의 프로그램 정렬에서 서열 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (％)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (％)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
또한, 본원에 사용된 동일성 값 (％)은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)]을 이용하여 얻을 수 있다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정했다. 디폴트값으로 설정되지 않은, 즉 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정하였다. 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 점수 매트릭스 = BLOSUM62. 본 발명의 목적상, 핵산 서열 동일성 값 (％)은 (a) 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 갖는 당해 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자와 비교되는 당해 핵산 서열 (즉, 당해 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자와 비교되는 서열로서 변이체 PRO 폴리뉴클레오티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 뉴클레오티드의 수를 WU-BLAST-2로 측정하여 얻고, (b) 이를 당해 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자의 총 뉴클레오티드 수로 나누어 측정한다. 예를 들어, 핵산 서열 B와 80％ 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 A를 포함하는 단리된 핵산 분자"라는 말에서, 핵산 서열 A는 비교하는 당해 핵산 분자이고 핵산 서열 B는 당해 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자의 핵산 서열이다.
다른 실시양태에서, PRO 변이체 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건하에서 도 2 (서열번호 2), 도 4 (서열번호 4), 도 6 (서열번호 6), 도 8 (서열번호 8), 도 10 (서열번호 10), 도 12 (서열번호 12), 도 14 (서열번호 14), 도 16 (서열번호 16), 도 18 (서열번호 18), 도 20 (서열번호 20), 도22 (서열번호 22), 도 24 (서열번호 24), 도 26 (서열번호 26), 도 28 (서열번호 28), 도 30 (서열번호 30), 도 32 (서열번호 32), 도 34 (서열번호 34), 도 36 (서열번호 36), 도 38 (서열번호 38), 도 40 (서열번호 40), 도 42 (서열번호 42), 도 44 (서열번호 44), 도 46 (서열번호 46), 도 48 (서열번호 48), 도 50 (서열번호 50), 도 52 (서열번호 52), 도 54 (서열번호 54), 도 56 (서열번호 56), 도 58 (서열번호 58), 도 60 (서열번호 60), 도 62 (서열번호 62), 도 64 (서열번호 64), 도 66 (서열번호 66), 도 68 (서열번호 68) 및 도 70 (서열번호 70)에 나타낸 전장의 PRO 폴리펩티드를 각각 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 활성 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다. PRO 변이체 폴리펩티드는 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것들일 수 있다.
상기한 바와 같이 수행되는 아미노산 서열 동일성 서열 비교와 관련하여 "양성"이란 용어는 동일하지는 않으나 성질이 유사한, 비교되는 서열의 아미노산 잔기를 포함한다. 당해 아미노산 잔기에 대해 양성값을 나타내는 아미노산 잔기는 당해 아미노산 잔기와 동일한 것이거나 당해 아미노산 잔기의 바람직한 치환 (하기 표 3에 기재되어 있음)이다.
본 발명의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 양성값 (％) (주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 양성값 (％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 상기에서 정의된 양성값을 나타내는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 양성값 (％)은 A에 대한 B의 양성값 (％)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된 "단리된"은 폴리펩티드가 확인되고, 그 자연 환경 성분으로부터 분리 및(또는) 회수되었음을 의미한다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩티드는 자연적으로 결합되는 모든 성분과 결합되어 있지 않다. 폴리펩티드의 자연 환경의 오염 성분은 이 폴리펩티드의 진단 또는 치료적 사용을 일반적으로 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질 등이 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝컵 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제될 수 있다. 단리된 폴리펩티드는 1 종 이상의 PRO 천연 환경 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내의 계내 (in situ)에 존재하는 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
PRO 폴리펩티드를 코딩하는 "단리된" 핵산 분자 또는 항-PRO 항체를 코딩하는 "단리된" 핵산은 PRO 코딩 핵산 또는 항-PRO 코딩 핵산의 천연 공급원에서 통상적으로 결합되어 있는 1종 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자라는 의미이다. 바람직하게는, 단리된 핵산은 자연적으로 결합되는 모든 성분과 결합되어 있지 않아야 한다. 단리된 PRO 코딩 핵산 분자 또는 항-PRO 코딩 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다르게 존재한다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 PRO 코딩 핵산 분자 또는 항-PRO 코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 예를 들어, PRO 폴리펩티드 또는 항-PRO 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자는 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하며 통상적으로 PRO 폴리펩티드 또는 항-PRO 항체를 발현하는 세포에 함유된, PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자 또는 항-PRO 코딩 핵산 분자를 포함된다.
"조절 서열"이란 용어는 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열로는 예컨데 프로모터, 경우에 따라 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 들 수 있다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열 (presequence) 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는 해당 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전단백질 (preprotein)로서 발현되는 경우 그 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩티드 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"다는 것은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 위치할 뿐만 아니라 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 반드시 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 종래의 방법에 따라 사용한다.
"항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 하나의 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 모노클로날 항체 (길항제 및 중화 항체 포함), 폴리에피토프 특이성이 있는 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체 조성물, 단일쇄 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274,항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체 및 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체의 단편 (하기 참조) 등을 통칭한다. 본원에서 사용된 "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외한, 한 집단을 이루는 동일한 개별 항체를 의미한다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로 보다 긴 프로브일수록 적합한 어닐링에 보다 높은 온도를 필요로 하며, 보다 짧은 프로브일수록 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 용융 온도보다 낮은 환경에 존재할 때 재어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 목적하는 상동성의 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 높아진다. 따라서, 상대적 온도보다 높아질수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 반면, 상대적 온도가 낮을수록 반응조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 더 자세한 정보 및 설명은 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995)]을 참조한다.
본원에서 정의된 "엄격 조건" 또는 "고도의 엄격 조건"이란 (1) 세척시 이온 세기가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산 나트륨/0.1％ 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 조건, (2) 혼성화시에 포름아미드, 예를 들어 42℃, 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)/0.1％ 소혈청 알부민/0.1％ 피콜/0.1％ 폴리비닐피롤리돈으로 제조한 50％(부피/부피) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, 또는 (3) 50％ 포름아미드, 5×SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산 나트륨, 5×덴하르트 (Denhardt) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/㎖), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 술페이트를 42℃에서 사용하고, 42℃에서 0.2×SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 그리고 55℃에서 50％ 포름아미드로 세척하며, 55℃에서 EDTA가 함유된 0.1×SSC를 이용한 고도로 엄격한 세척을 수행하는 것이다.
"적당한 엄격 조건"이란 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press 1989]에 기재된 바와 같고, 상기한 것보다 엄격도가 낮은 혼성화 조건 (예를 들어 온도, 이온 세기 및 SDS ％)의 이용을 말한다. 적당한 엄격 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5×SSC (150 mM염화나트륨, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5×덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트 및 20 mg/㎖의 절단된 연어 정자 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃로 밤새 인큐베이션한 후 필터를 약 37 내지 50℃에서 1×SSC로 세척하는 조건이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞추기 위해 필요한 온도, 이온 세기 등을 조절하는 방법을 잘 알 것이다.
본원에 사용된 "에피토프 태그가 부착된"이란 "태그 폴리펩티드"에 융합된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 융합되는 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 태그 폴리펩티드는 매우 독특해서 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 교차반응하지 않는 것이 바람직하다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기를 갖는다(약 10 내지 20개의 잔기가 바람직함).
본원에서 사용된 "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 자연 발생 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168,PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역적 활성을 보유하는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 형태(들)을 말하는데, 여기서 "생물학적" 활성이란 천연 또는 자연 발생 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 존재하는 항원성 에피토프에 대한 항체 생성을 유도하는 능력이외에 천연 또는 자연 발생 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 의한 생물학적 기능 (억제 또는 촉진 능력)을 말하며, "면역학적" 활성이란 천연 또는 자연 발생 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245,PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 존재하는 항원성 에피토프에 대한 항체 생성을 유도하는 능력을 말한다.
본원에 개시된 스크리닝 분석에 의해 확인될 수 있는 항체 또는 다른 길항제 (예를 들어, 유기 또는 무기 소분자, 펩티드 등)와 관련된 "생물학적 활성"은 상기 분자가 본원에서 확인된 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 결합하거나 결합체를 이루는 능력을 말하는데 이용하거나, 다르게는 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포 단백질과의 상호작용을 방해하거나 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 전사 또는 번역을 방해하는 능력을 말한다. 바람직한 생물학적 활성은 표적 종양 세포의 성장을 억제하는 것이다. 생물학적 활성으로서 다른 바람직한 것은 표적 종양 세포의 사멸을 일으키는 세포독성 활성이다.
본원에서 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316또는 PRO4980 폴리펩티드와 관련하여 "생물학적 활성"이란 용어는 신생물성 세포 성장 또는 조절되지 않는 세포 성장을 유도하는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 능력을 의미한다.
"면역적 활성"이란 어구는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프와의 면역학적 교차 반응성을 의미한다.
본원에서 "면역학적 교차 반응성"은 후보 폴리펩티드가 공지된 활성 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 대해 생성된 폴리클로날 항혈청과 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264,PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 정성적인 생물학적 활성을 경쟁적으로 억제할 수 있음을 의미한다. 그러한 항혈청은 염소 또는 토끼에, 예를 들어 완전 프로인트 보조제 중의 공지된 활성 유사체로 피하 주사한 후 불완전 프로인트 보조제 중의 것을 복강내 또는 피하 주사하여 면역화시키는 통상적인 방식으로 제조할 수 있다. 면역적 교차 반응성은 특이적인 것이 바람직한데, 이는 확인된 면역적 교차 반응성 분자 (예를 들어, 항체)의 상응하는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 대한 결합 친화성이 다른 어떠한 공지된 천연 폴리펩티드의 결합 친화성 보다도 훨씬 (바람직하게는 약 2 배 이상, 더 바람직하게는 약 4 배 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 8 배 이상, 가장 바람직하게는 약 10배 이상) 크다는 것을 의미한다.
"길항제"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 생물학적 활성, 또는 그의 전사 또는 번역을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 통칭한다. 적합한 길항제 분자로는 구체적으로 길항제 항체 또는 항체의 단편, 펩티드, 작은 유기 분자, 안티센스 핵산 등이 포함된다. 후보 길항제를 확인하는 방법은 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 후보 길항제 분자와 접촉시키고, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드와 정상적으로 관련된 하나 이상의 생물학적 활성에서의 검출가능한 변화를 측정하는 방법을 포함한다.
"소분자 (작은 분자)"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 미만인 것으로 정의된다.
"항체 (Ab)" 및 "면역글로불린 (Ig)"은 동일한 구조 특성을 갖는 당단백질이다. 항체는 특이 항원에 특이적으로 결합하는 반면, 면역글로불린은 항체 및 항원 특이성이 없는 다른 항체 유사 분자 둘 다를 포함한다. 면역글로불린 등의 폴리펩티드는 예를 들어, 림프계에 의해 낮은 농도로 생성되며 골수종에 의해 농도가 증가한다. "항체"라는 용어는 넓은 의미로, 구체적으로는 온전한 모노클로날 항체,폴리클로날 항체, 2개 이상의 온전한 항체에 의해 형성되는 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 가진다면 항체 단편까지 통칭하지만, 이에 제한되지는 않는다.
"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 일반적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성되는 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머의 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 결합의 개수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄 사이에서 변한다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적 간격으로 쇄 내부의 디술피드 결합을 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH) 및 이 도메인에 후속하는 많은 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VL) 및 다른 말단에 불변 도메인을 갖고, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 나란히 배열되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 나란히 배열된다. 특정 아미노산 잔기들이 경쇄 와 중쇄 가변 도메인 사이의 경계면을 형성하는 것으로 생각된다.
"가변"이란 용어는 항체들 간에 가변 도메인의 특정 영역의 서열이 크게 상이하고 그 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 말한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 과가변 영역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인에서 보존도가 보다 높은 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의가변 도메인은 루프 연결을 형성하며 어떤 경우에는 β-시트 구조의 일부를 이루는 3개의 CDR에 의해 연결되는, 주로 β-시트의 입체형태인 프레임워크 영역 4개를 포함한다. 각 쇄 내의 CDR은 FR 영역에 의해 서로 매우 근접하게 유지되고, 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 [Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 (1991) 참조]. 불변 도메인은 항체의 항원 결합시에 직접 관여하지 않지만, 항체 의존적 세포의 세포독성에서 항체의 관여와 같은 다양한 효과기 기능을 보인다.
본원에 사용된 "과가변 영역"이란 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 과가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" (경쇄 가변 도메인의 잔기 24 내지 34 (L1), 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 31 내지 35 (H1), 50 내지 65 (H2) 및 95 내지 102 (H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interests, 5th Ed. Public Health Services, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991)])의 아미노산 잔기 및(또는) "과가변 루프" (경쇄 가변 도메인의 잔기 26 내지 32 (L1), 50 내지 52 (L2) 및 91 내지 96 (L3) 및 중쇄 가변 영역에서의 잔기 26 내지 32 (H1), 53 내지 55 (H2) 및 96 내지 101 (H3); Clothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)]의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 상기의 정의된 과가변 영역 잔기외에 가변 도메인의 잔기이다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2및 Fv 단편; 디아바디 (diabody); 선형 항체 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 포함된다.
항체를 파파인 (papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 이름 붙여진 나머지 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')2단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성된다. 이 구조에서는 각 가변 도메인의 CDR 3개가 상호작용하여 VH-VL이량체의 표면에 항원 결합 부위를 형성한다. 결론적으로 보면, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합하는 능력을 갖는다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 (hinge) 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab' 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'을 지칭한다. F(ab')2항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인이 있는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
임의의 척추동물종으로부터 유래한 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 명백하게 상이한 유형 중의 하나로 분류될 수 있다.
면역글로불린은 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개 주요 클래스가 있고, 이들 중 몇 개는 서브클래스 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불리운다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 대한 서브유닛 구조와 3차원 구조는 잘 공지되어 있다.
본원에서 사용된 "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동종 항체 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외한, 한 집단을 이루는 동일한 개별 항체를 의미한다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 매우 특이적인 항체이다. 또한, 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와 달리, 각 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정군에 대한 것이다. 모노클로날 항체는 그 특이성 이외에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양물로합성할 수 있다는 장점이 있다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 얻은 항체 특성을 가리키는 것이며, 임의의 특별한 방법에 의한 항체 제조를 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 먼저 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본원에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 "키메라" 항체 (면역글로불린)를 포함한다 [미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)].
비-인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2또는 항체의 다른 항원 결합서열)이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종 (공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체, 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린 영역의 일부를 포함할 것이다 [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]. 인간화 항체로는 항체의 항원 결합 영역이 짧은 꼬리 원숭이를 목적 항원으로 면역화시켜 제조한 항체에서 유래한 PRIMATIZED(상표명) 항체를 들 수 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 VH및 VL도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 필요한 구조를 형성하도록 하는 VH및 VL도메인 사이에 폴리펩티드 링커도 포함한다 (sFv에 관해서는 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of MonoclonalAntibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)) 참조].
"디아바디(diabody)"라는 용어는 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편 (VH-VL)을 말한다. 동일한 쇄에 있는 2개의 도메인을 결합시키기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 결합시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어, 유럽 특허 제404,097호, 국제 공개 제93/11611호 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"단리된" 항체는 자신의 자연 환경 성분으로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 자연 환경 성분은 항체의 진단 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질이 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과의 항체로, (2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산의 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드로 정제될 것이다. 단리된 항체는 그 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 계내 (in situ)에 존재하는 항체를 포함한다. 그러나, 단리된 항체는 일반적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 정제될 것이다.
"표지"는 이 명세서에 사용될 때, 항체에 직간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체로 검출될 수 있거나 (방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다. 검출가능한 표지로 작용할 수 있는 방사성핵종으로는 예를 들어, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 및 Pd-109가 있다.
"고상"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고상의 예에는 부분적으로 또는 완전하게 형성된 유리 (예를 들어, 세공 조절된 유리), 폴리사카라이드 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘 등이 포함된다. 특정 실시양태에서, 내용에 따라 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 실시양태에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들어, 친화 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상도 포함한다.
"리포좀"은 약물 (예를 들어, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 또는 이에 대한 항체)을 포유동물에게 전달하는데 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 소낭 (小囊)이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생체막의 지질 배열과 유사하게 이중층 형태로 배열되어 있다.
본원에 사용된 "이뮤노어드헤신"이란 면역글로불린 불변 도메인의 효과기 기능과 이종 단백질 (어드헤신)의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로 보면 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌 (즉, "이종"임), 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 통상 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 중의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 아형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM 등 어떠한 면역글로불린으로부터든지 얻을 수 있다.
II . 본 발명의 조성물 및 방법
A. 전장 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342,PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980으로 언급된 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 하기 실시예에 보다 상세히 기재된 바와 같이, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. 별도의 발현 주기에서 생성된 단백질은 그의 PRO 숫자는 다를 수 있지만 UNQ 숫자는 임의의 주어진 DNA 및 코딩된 단백질 특유의 것이며 변하지 않을 것임을 알아야 한다. 그러나, 본원에서는 명료성을 위해, 본원에 개시된 전장의 천연 핵산 분자에 의해 코딩된 단백질, 및 상기 정의에 포함된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 다른 천연 동족체 및 변이체를 이들의 출처 및 제조 방식과 상관없이 "PRO197", "PRO207", "PRO226", "PRO232", "PRO243", "PRO256", "PRO269", "PRO274", "PRO304", "PRO339", "PRO1558"," PRO779", "PRO1185", "PRO1245", "PRO1759", "PRO5775", "PRO7133", "PRO7168", "PRO5725", "PRO202", "PRO206", "PRO264", "PRO313", "PRO342", "PRO542", "PRO773", "PRO861","PRO1216", "PRO1686", "PRO1800", "PRO3562", "PRO9850", "PRO539"," PRO4316" 또는 "PRO4980"으로 언급할 것이다.
하기 실시예에 기재된 바와 같이, 여러가지 cDNA 클론을 ATCC에 기탁하였다. 당업자라면 당업계의 일반적인 방법을 이용하여 기탁된 클론의 서열을 분석함으로써 상기 클론의 실제 뉴클레오티드 서열을 용이하게 결정할 수 있다. 일반적인 기술을 사용하여 뉴클레오티드 서열로부터 예상된 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 본원에 기재된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산의 경우, 본 발명자들은 당시 이용할 수 있었던 서열 정보를 사용하여 가장 잘 확인할 수 있는 리딩 프레임으로 여겨지는 것을 확인하였다.
B. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 변이체
본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185,PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 이외에, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 변이체를 제조할 수 있는 것으로 생각된다. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 DNA에 도입하고(하거나) 원하는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562,PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 합성함으로써 제조할 수 있다. 당업자라면 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경 또는 세포막 부착 특성의 변화와 같은 아미노산 변화가 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 번역후 프로세싱을 변화시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 설명된 전장 천연 서열 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 또는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 다양한 도메인에서의 변이는 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이 기술 및 지침을 사용하여 제조할 수 있다. 변이는 천연 서열 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245,PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980과 비교했을 때, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 아미노산 서열 변화를 초래하는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 하나 이상의 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 도메인에서 하나 이상의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환함으로써 생성된다. 목적 활성에 유해한 효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759,PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 서열을 공지의 상동 단백질 분자의 서열과 비교하고 상동성이 높은 영역에서 생성된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환 (예를 들어, 루이신의 세린으로의 치환), 즉 아미노산의 보존적 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시키고, 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타나는 생성된 변이체의 활성을 시험함으로써 정할 수 있다.
본원은 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 단편들을 제공한다. 예를 들어 전장 천연 단백질과 비교하는 경우, 이 단편들은 N-말단 또는 C-말단이 절단될 수 있으며 내부 잔기가 결여될 수 있다. 몇몇 단편은 본 발명의 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539,PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 목적하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여되어 있다.
PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 단편은 임의의 많은 통상의 기술에 의해 제조할 수 있다. 목적 펩티드 단편은 화학적으로 합성할 수 있다. 다른 방법으로는 효소적 분해 방법, 예를 들어 이 단백질을 특정 아미노산 잔기에 의해 정해진 부위에서 단백질을 절단하는 것으로 공지된 효소로 처리하거나 또는 이 DNA를 적합한 제한 효소로 절단함으로써 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 단편을 생성하고 이 목적 단편을 단리하는 것이 포함된다. 그러나, 또다른 적합한 기술은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 목적 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 증폭하고 단리하는 것을 포함한다. DNA 단편의 목적 말단부를 정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머로 사용된다. 바람직하게는, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133,PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 단편은 본원에서 개시된 천연 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드와 한가지 이상의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 공유한다.
구체적인 실시양태에서, 목적물의 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 3에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 3에서 치환예로서 명명되거나 아미노산 종류에 대해서 하기에서 보다 상세하게 설명된 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.
원래 잔기 치환예 바람직한 치환
Ala(A)Arg(R)Asn(N)Asp(D)Cys(C)Gln(Q)Glu(E)Gly(G)His(H)Ile(I)Leu(L)Lys(K)Met(M)Phe(F)Pro(P)Ser(S)Thr(T)Trp(W)Tyr(Y)Val(V) val, leu, ilelys, gln, asngln, his, lys, arggluserasnasppro, alaasn, gln, lys, argleu, val, met, ala, phe, 노르루이신노르루이신, ile, val, met, ala, phearg, gln, asnleu, phe, ileleu, val, ile, ala, tyralathrsertyr, phetrp, phe, thr, serile, leu, met, phe, ala, 노르루이신 vallysglngluserasnaspalaargleuileargleuleualathrsertyrpheleu
폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서 폴리펩티드 골격의 구조를 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 그의 효과를 상당히 변화시키는 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족; trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 상기 한 종류의 구성 성분을 다른 종류의 것으로 교환하는 것이다. 또한, 이렇게 치환되는 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.
변이는 올리고뉴클레오티드 매개 (위치 지정) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝법 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수있다. 위치 지정 돌연변이 유발법 [Carter et al., Nucl. Acids Res.,13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res.,10:6487 (1987)], 카세트 돌연변이 유발법 [Wells et al., Gene,34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이 유발법 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA,317:415 (1986)] 또는 다른 공지 기술을 클로닝된 DNA에 실시하여 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 변이 DNA를 제조할 수 있다.
또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 이용하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산에는 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인이 포함된다. 통상, 알라닌은 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 배열을 변화시킬 가능성이 적기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다 [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. 또한, 알라닌은 통상 가장 흔한 아미노산이기때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 빈번하게 발견된다 [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체 (isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
C. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 및 PRO4980의 변형
PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 및 PRO4980의 공유결합 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 변형의 한 형태는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N 말단 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269,PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는, 예를 들어 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체의 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 가교결합시키거나 그 반대로 가교결합시키는데 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제에는, 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드,및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질이 포함된다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 유형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 형태의 변화를 포함한다. 본원에서 "천연 글리코실화 형태의 변화"는 천연 서열 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 (글리코실화 가능 부위를 제거하거나 화학적 및(또는) 효소적 방법으로 글리코실화를 결실시킴으로써) 및(또는) 천연 서열 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256,PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 또한, 이 용어는 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 특성 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어 성질 변화를 포함한다.
PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열의 변화에 의해 달성될 수 있다. 변화는 예를 들어 천연 서열 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-결합 글리코실화 부위의 경우). PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542,PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 아미노산 서열은 특히 목적 아미노산으로 번역되는 코돈을 생성시키도록 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서의 변화에 의해 임의로 변화시킬 수 있다.
PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 방법은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 결합시키는 것이다. 이러한 방법은, 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 국제 공개 제87/05330호 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는PRO4980 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기는 화학적으로 또는 효소에 의해 또는 글리코실화 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 제거할 수 있다. 화학적 글리코실화 제거 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) 및 Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 효소에 의한 절단은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)].
PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 공유결합 변형의 다른 유형은 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 기재된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를연결시키는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980은 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방법으로 변형될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313,PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 아미노 또는 카르복실 말단에 위치한다. 상기 에피토프 태그가 부착된 형태의 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 종류의 친화성 매트릭스를 사용한 친화성 정제에 의해 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 용이하게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘 (poly-His) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-His-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)], c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)], 및 단순 포진 바이러스 (Herpes Simplex virus) 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553(1990)]를 들 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드에는 Flag-펩티드 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)], KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)], α-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)] 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]가 포함된다.
다른 한 실시양태에서, 키메라 분자는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980과 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역의 융합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태 ("이뮤노어드헤신"으로 언급하기도 함)의 경우, 이러한 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역일 수 있다. 이 Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자내 가변 영역의 적어도 일부를 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 가용성 (막횡단 도메인이 결실되거나 불활성화된) 형태로 치환한 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 면역글로불린 융합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 또한, 면역글로불린 융합체를 생산하는 방법으로는, 1995년 6월 27일에 허여된 미국 특허 제5,428,130호를 참조한다.
D. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 폴리펩티드의 제조
이하에 설명되는 내용은 주로 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양하여 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 제조하는 방법에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133,PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 제조할 수 있다. 예를 들어, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 서열 또는 그의 일부분은 고상 기술을 사용하는 직접 펩티드 합성법으로 제조할 수 있다 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. 시험관내 단백질 합성은 수동 방법 또는 자동화 방법으로 수행될 수 있다. 자동화 합성법은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 펩티드 합성기 (Applied Biosystems Peptide Synthesizer)(미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 상이한 부분은 별도로 화학적으로 합성하고 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합하여 전장 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133,PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 제조할 수 있다.
a. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 코딩하는 DNA 의 단리
PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 코딩하는 DNA는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 mRNA를 보유하여 그를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 생각되는 조직으로부터 제조한 cDNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 따라서, 인간 PRO197, 인간 PRO207, 인간 PRO226, 인간 PRO232, 인간 PRO243, 인간 PRO256, 인간 PRO269, 인간 PRO274, 인간 PRO304, 인간 PRO339, 인간 PRO1558, 인간PRO779, 인간 PRO1185, 인간 PRO1245, 인간 PRO1759, 인간 PRO5775, 인간 PRO7133, 인간 PRO7168, 인간 PRO5725, 인간 PRO202, 인간 PRO206, 인간 PRO264, 인간 PRO313, 인간 PRO342, 인간 PRO542, 인간 PRO773, 인간 PRO861, 인간 PRO1216, 인간 PRO1686, 인간 PRO1800, 인간 PRO3562, 인간 PRO9850, 인간 PRO539, 인간 PRO4316 또는 인간 PRO4980 DNA는 실시예에서 설명되는 바와 같이 인체 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 용이하게 수득할 수 있다. PRO197-, PRO207-, PRO226-, PRO232-, PRO243-, PRO256-, PRO269-, PRO274-, PRO304-, PRO339-, PRO1558-, PRO779-, PRO1185-, PRO1245-, PRO1759-, PRO5775-, PRO7133-, PRO7168-, PRO5725-, PRO202-, PRO206-, PRO264-, PRO313-, PRO342-, PRO542-, PRO773-, PRO861-, PRO1216-, PRO1686-, PRO1800-, PRO3562-, PRO9850-, PRO539-, PRO4316- 또는 PRO4980- 코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 수득하거나 또는 올리고뉴클레오티드 합성법으로 수득할 수 있다.
라이브러리는 목적 유전자 또는 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 설계한 프로브 (예를 들어, 목적하는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980에 대한 항체 또는 약 20 내지 80개 이상의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예를 들어 문헌 [Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 코딩하는 유전자를 단리하는 다른 수단은 PCR 방법을 사용하는 것이다 [Sambrook et al., 상기 문헌; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 프로브로 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성 결과를 최소화하기 위해서 충분한 길이를 갖고 충분히 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA에 혼성화시에 검출될 수 있도록 표지되는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고,32P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 들 수 있다. 적당한 엄격도 및 고도의 엄격도를 포함하는 혼성화 조건은 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 제공된다.
상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 진뱅크 (GenBank)와 같은 공개 데이타베이스 또는 다른 비공개 서열 데이타베이스에 기탁되고 입수할 수 있는 다른 공지의 서열과 비교하고 정렬시킬 수 있다. 분자의 한정된 영역 내 또는전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 선행 기술 공지된 방법 및 본원에서 설명된 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 먼저 본원에서 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하고 필요하다면 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 기재된 통상의 프라이머 연장 방법을 사용하여, 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, 전구체 및 cDNA로 역전사되지 않았을 수 있는 mRNA의 프로세싱 중간체를 검출하여 수득할 수 있다.
b. 숙주세포의 선택 및 형질전환
숙주세포는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 생성을 위해 본원에서 설명한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환시키고 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 목적 서열을 코딩하는 유전자 증폭에 적합하도록 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양한다. 당업자라면 과도한 실험을 수행하지 않고서도 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al., 상기 문헌]에서 찾을 수 있다.
진핵세포 형질감염 방법 및 원핵세포 형질전환 방법, 예를 들어 CaCl2, CaPO4, 리포솜-매개 방법 및 일렉트로포레이션 (electroporation)은 당업자에게 공지되어 있다. 사용하는 숙주세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 문헌 (상기 Sambrook et al.,)에 기재된 염화칼슘법을 이용하는 칼슘 처리, 또는 일렉트로포레이션은 일반적으로 원핵세포에 사용한다. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 문헌 [Shaw et al.,Gene,23:315 (1983) 및 1989년 6월 29일 공개된 국제 공개 제89/05859호]에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용한다. 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 내용은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact., 130:949 (1977) 및 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76:3829 (1979)]의 방법에 따라 수행한다. 그러나, 세포 내로 DNA를 도입하는 다른 방법, 예를 들어 핵내 미세주입법, 일렉트로포레이션, 원형 세포 (intact cell)와 세균 원형질체 융합법, 또는 다가양이온, 예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴도 사용할 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환을 위한 여러 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 및 Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주세포에는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포가 포함된다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어 장내세균과 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예를 들어 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 이. 콜라이 균주 K5 772 (ATCC 53,635)는 용이하게 입수할 수 있다. 다른 적합한 원핵생물 숙주세포는 에셔리키아 (Eshcerichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella) 등의 장내세균과 (Enterobacteriaceae), 및 바실러스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710호에 기재된 비. 리체니포르미스 (B. licheniformis) 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예는 단지 예시적인 것으로서 이에 제한되는 것은 아니다. 균주 W3110은 재조합 DNA 산물 발효에 공통적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주의내생 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 초래하도록 변형될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2, 완전한 유전자형tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4, 완전한 유전자형tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT kan r 를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244), 완전한 유전자형tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT rbs 7 ilvG kan r 를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성degP결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4 및 1990년 8월 7일 공포된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 페리플라즘 프로테아제 변이체를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응이 적합하다.
원핵세포 외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 일반적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 시키사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) [Beach and Nurse, Nature, 290: 140 (1981); 1985년 5월 2일 공개된 EP 139,383]; 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574) [Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)], 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), 케이. 써모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (유럽 특허 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) [유럽 특허 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)]; 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (유럽 특허 244,234); 뉴로스포라 크라싸 (Neurospora crassa )[Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)]; 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis) (1990년 10월 31일 공개된 유럽 특허 394,538); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라듐 (Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공개된 국제 공개 제91/00357호) 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans) [Ballance et al,, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984)] 및 에이. 니게르 (A. niger) [Kellyand Hynes, EMBO J., 4: 475-479 (1985)]가 포함된다. 메틸 영양 요구성 효모가 적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다 (Candida), 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아 (Pichia), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 토룰롭시스 (Torulopsis) 및 로도토룰라 (Rhodotorula)로 이루어지는 속으로부터 선택된, 메탄올에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이 종류의 효모의 예인 구체적인 종의 목록은 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에 기재되어 있다.
글리코실화된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 발현에 적합한 숙주세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예에는 드로소필라 S2 및 스포도프테라 Sf9와 같은 곤충 세포 및 식물 세포가 포함된다. 유용한 포유동물 숙주세포주의 예에는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 COS 세포가 포함된다. 보다 구체적인 예에는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 세포주 (293 세포 또는 현탁 배양액에서 배양하기 위해 서브클로닝된 293 세포) [Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1997)), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO) [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)], 마우스 세르톨리 세포 (TM4) [Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)], 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065) 및 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)이 포함된다. 당업자라면 적합한 숙주세포를 선택할 수 있다.
c. 복제가능 벡터의 선택 및 사용
PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입할 수 있다. 다양한 벡터를 용이하게 구할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법으로 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 DNA를 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)로 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 개시점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 성분을 하나 이상 포함하는 적합한 벡터의 제조는 당업자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 사용한다.
PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는PRO4980은 직접 재조합 방법으로 생산될 수 있을 뿐만 아니라 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 또는 벡터 내로 삽입된 PRO197-, PRO207-, PRO226-, PRO232-, PRO243-, PRO256-, PRO269-, PRO274-, PRO304-, PRO339-, PRO1558-, PRO779-, PRO1185-, PRO1245-, PRO1759-, PRO5775-, PRO7133-, PRO7168-, PRO5725-, PRO202-, PRO206-, PRO264-, PRO313-, PRO342-, PRO542-, PRO773-, PRO861-, PRO1216-, PRO1686-, PRO1800-, PRO3562-, PRO9850-, PRO539-, PRO4316- 또는 PRO4980-코딩 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더의 군 중에서 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모에서의 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces)의 α-인자 리더 (미국 특허 제5,010,182호)를 포함함) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공개된 유럽 특허 362,179) 또는 1990년 11월 15일 공개된 국제 공개 제90/13646호에 기재된 신호 서열일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열, 예를 들어 동일하거나 관련된 종의 분비 폴리펩티드의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더를 사용하여 단백질의 분비를 유도할 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 선택된 1 종 이상의 숙주세포에서 복제할 수 있도록 만드는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322의 복제 개시점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 복제 개시점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 복제 개시점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 선별가능한 마커로도 불리우는 선별 유전자를 함유할 것이다. 대표적인 선별 유전자, 예를 들어 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라싸이클린에 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩한다.
포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 예에는 DHFR 또는 티미딘 키나아제와 같이 PRO197-, PRO207-, PRO226-, PRO232-, PRO243-, PRO256-, PRO269-, PRO274-, PRO304-, PRO339-, PRO1558-, PRO779-, PRO1185-, PRO1245-, PRO1759-, PRO5775-, PRO7133-, PRO7168-, PRO5725-, PRO202-, PRO206-, PRO264-, PRO313-, PRO342-, PRO542-, PRO773-, PRO861-, PRO1216-, PRO1686-, PRO1800-, PRO3562-, PRO9850-, PRO539-, PRO4316- 또는 PRO4980-코딩 핵산을 수용할 수 있는 세포를 확인할 수 있게 하는 것이 있다. 야생형 DHFR이 이용될 경우, 적합한 숙주세포는 DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이고, 문헌 [Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조 및 증식된다. 효모에 사용하는데 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는trp 1유전자이다[Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)].trp 1유전자는 트립토판으로 성장하는 능력이 결여된 효모의 변이주 (예를 들어, ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선별 마커를 제공한다 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)].
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 mRNA 합성을 유도하는 PRO197-, PRO207-, PRO226-, PRO232-, PRO243-, PRO256-, PRO269-, PRO274-, PRO304-, PRO339-, PRO1558-, PRO779-, PRO1185-, PRO1245-, PRO1759-, PRO5775-, PRO7133-, PRO7168-, PRO5725-, PRO202-, PRO206-, PRO264-, PRO313-, PRO342-, PRO542-, PRO773-, PRO861-, PRO1216-, PRO1686-, PRO1800-, PRO3562-, PRO9850-, PRO539-, PRO4316- 또는 PRO4980-코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 여러가지 가능한 숙주세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터에는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel, Nucleic acid Res., 8:4057 (1980); EP 제36,776호], 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]를 포함한다. 또한, 세균 시스템에서 사용되는 프로모터는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686,PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(S.D.) 서열을 함유할 것이다.
효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나아제 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] 또는 다른 당분해 효소 [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나아제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프럭토키나아제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나아제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나아제의 프로모터가 포함된다.
배양 조건으로 조절되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터로는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사 관련 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이 있다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 유럽 특허 제73,657호에 더 기재되어 있다.
포유동물 숙주세포내의 벡터에서 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850,PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 전사는 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 (fowlpox) 바이러스 (1989년 7월 5일 공개된 UK 제2,211,504호), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 싸이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (Simian Virus 40) (SV40)의 게놈으로부터 얻어진 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터 및 열-충격 프로모터로부터 얻어진, 숙주세포 시스템에 적합한 프로모터에 의해 조절된다.
고등 진핵세포에 의한 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 코딩하는 DNA의 전사는 벡터에 인핸서 서열을 삽입하여 증가시킬 수 있다. 인핸서는 일반적으로 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 대해 작용하는, 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-액팅 성분이다. 많은 인핸서 서열은 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 유래하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예에는 복제 개시점의 뒷부분의 SV40 인핸서(bp 100-270), 싸이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 개시점의 뒷부분의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 인핸서는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339,PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
또한, 진핵생물 숙주세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래한 다핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 수 있을 것이다. 그러한 서열은 통상적으로 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역 영역에 확보된다. 이들 영역은 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 단편을 포함한다.
재조합 척추동물 세포 배양에서 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 합성에 적용하는데 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); 유럽 특허 제117,060호 및 동 제117,058호]에 기재되어 있다.
d. 유전자 증폭 및 발현의 검출
유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어 통상의 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블롯팅 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], 도트 블롯팅 (DNA 분석) 또는 본원에서 제공된 서열을 기초로 하여 적절하게 표지된 프로브를 사용한 계내 (in situ) 혼성화에 의해 시료에서 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중체 (duplex), RNA 이중체 및 DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 비롯한 특정 이중체를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 바꾸어 말하면, 항체를 표지하고, 이중체를 표면에 결합시켜, 표면 상에 결합체가 형성될 때 이중체에 결합한 항체의 존재를 검출할 수 있는 분석을 수행할 수 있다.
별법으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 단면의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 생성물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양액 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 이들은 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 용이하게는, 천연 서열 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725,PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 대한 항체, 본원에서 제공되는 DNA 서열 기재의 합성 펩티드에 대한 항체 또는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 DNA에 융합된 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외생성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.
e. 폴리펩티드의 정제
PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 형태는 배양 배지 또는 숙주세포 용해액으로부터 회수할 수 있다. 세포막에 결합된 경우, 적합한 세제 용액 (예를 들어, Triton-X 100)을 사용하거나 효소의 절단에 의해 세포막으로부터 방출될 수 있다. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686,PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 싸이클, 초음파 처리, 기계적 분쇄 또는 세포 용해제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 분쇄시킬 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 정제 방법의 예로는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지, 예를 들어 DEAE 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 세파덱스 (Sephadex) G-75를 사용한 겔 여과, IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼, 및 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 에피토프 태그 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이팅 컬럼이 있다. 다양한 단백질 정제 방법을 사용할 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York(1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 사용하는 생산 방법 및 생산하는 특정 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 특성에 따라 결정될 것이다.
E. 종양 조직 및 세포주에서 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 증폭
본 발명은 특정 암 세포에서 증폭된 유전자의 확인 및 특성 분류를 기초로 한 것이다.
원핵생물 및 진핵생물의 게놈은 표면상 모순되는 두 요구조건하에 놓인다. 하나는 여러 세대를 거치면서 안정한 유전성이 보존되도록 유전 정보인 DNA를 원형대로 보존 및 증식시켜야 한다는 것이며, 다른 하나는 세포 또는 유기체가 환경 변화를 견딜 수 있어야 한다는 것이다. 환경 변화를 견디는 메카니즘으로는 유전 물질의 정성 또는 정량적 변화가 있을 수 있다. 정성적 변화로는 코딩 서열이 변형되어 구조적 및(또는) 기능적으로 상이한 단백질을 생성시키는 DNA 돌연변이가 있다. 유전자 증폭은 완전한 코딩 서열, 즉 유전자, 예를 들어 유전자의 실질적인수가 증가하여 전사에 이용될 수 있는 주형의 수가 증가하고, 변역가능한 전사물 수의 증가 및 결국에는 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 풍부해진다.
유전자 증폭의 현상 및 그의 주요 메카니즘은 다수 원핵생물 및 진핵생물 배양 시스템에서 생체내 연구하였다. 유전자의 증폭의 가장 전형적인 예로는 세포독성 약물인 메토트렉세이트 (MTX)의 농도를 달리하여 함유하는 배지중 진핵세포의 배양액이 포함된다. MTX는 폴산 유사체이며, 효소 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 블록킹하여 DNA 합성을 방해하는 물질이다. 낮은 농도의 MTX에 초기 노출되는 동안, 대부분의 세포 (99.9％를 넘음)가 사멸된다. 소수의 세포만이 살아남고, 이들은 다량의 DFHR-RNA 및 단백질을 생성하여 증가되는 MTX 농도에서 성장할 수 있다. 이러한 과생성은 단일 DHFR 유전자의 증폭을 기초로 한다. 추가의 유전자 복제본은 작은 형태의 세포외염색체 복제본, 과잉 염색체 (이중 음성 가닥) 또는 통합된 염색체 복제본으로 발견된다.
유전자 증폭은 거의 대부분 세포독성 약물 (세균의 경우에는 항생제이고, 원핵세포의 경우에는 화학요법제)에 대한 내성의 발생 및 신생물성 형질전환 중에 일어난다. 자발적인 현상으로서 또는 바이러스 또는 화학 및 환경적 손상으로 인한 원핵세포의 형질전환은 통상 그 세포의 유전 물질의 변화와 관련되어 있다. 인간 악성 종양에서 관찰되는 가장 통상적인 유전적 변화중 하나는 p53 단백질의 돌연변이이다. p53은 세포가 정상기 (G1)에서 복제기 (S)로 전이되는 것을 조절하며, DNA가 손상된 상태에서는 이러한 전이가 저해된다. 즉, p53 돌연변이를 불능화시킨 결과로 주로 DNA 손상의 축적 및 증가, 즉 유전적 변화를 나타낸다. 점 돌연변이외에, 신생물성 세포에서 유전적 변화의 통상적인 유형은 증폭 및 전체적 구조 변형, 예를 들어 전좌이다.
DNA 서열의 증폭은 DHFR 실험계에서 예시된 바와 같이 특정 기능적 요건을 나타낼 수 있다. 따라서, 악성 종양에서의 특정 종양유전자의 증폭은 악성 형질전환 및 형질전환된 표현형의 유지 과정에서 원인이 되는 상기 유전자의 역할을 나타낸다. 이 이론은 최근 연구에 의해 지지되고 있다. 예를 들어,bcl -2단백질은 특정 유형의 비-호지킨 림프종에서 증폭되는 것으로 밝혀졌다. 이 단백질은 아팝토시스를 억제하고, 신생물성 세포를 점차적으로 축적시킨다. 성장 인자 수용체 유전자 족의 일부는 각종 유형의 암에서 증폭되는 것으로 밝혀졌는데, 이는 상기 수용체 과다 발현으로 신생물성 세포가 성장 인자의 이용 가능량을 제한하는데 대한 감수성이 낮아지게 된다는 것을 시사한다. 예로서 안드로겐 제거 치료시 빈발하는 전립선암에서 안드로겐의 증폭 및 유방암에서 ERB2와 상동성인 성장 인자 수용체의 증폭을 들 수 있다. 최근, 세포 주기 진행의 세포내 신호전달 및 조절에 관련된 유전자가 악성 형질전환시 증폭될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이는 각종 상피 및 림프 신생물에서의bcl -1및ras유전자의 증폭으로 예시된다.
초기 연구에서는 그러한 연구를 통해 악성 형질전환에 중요한 유전자를 동정할 수 있기 때문에 신생물에서 증폭된 DNA 서열의 확인 가능성을 예시하였다. ERB2의 경우에는 형질전환 단백질이 종양 치료 요법에 신규하며 특이적인 표적이기 때문에 치료 관점에서의 실행가능성도 보여준다.
증폭된 게놈 서열을 증명하는데 상이한 다수의 기술을 이용할 수 있다. 암세포로부터 제조된 염색체 스프레드의 고전적인 세포유전적 분석은 전체적 구조 변형, 예를 들어, 전좌, 결실 및 전위를 확인하는데 적합하다. 증폭된 게놈 영역은 많은 수의 복제본을 갖는 영역을 수반하거나 염색체외 물질로 존재하는 경우에만 가시화될 수 있다. 세포유전학은 특정 신생물과 특이적 염색체 변화가 일정한 관계에 있음을 보여준 최초의 기술이지만, 취급이 용이한 DNA 서열의 확인 및 단리에 부적합한다. 비교 게놈 혼성화 (CGH)라는 보다 최근에 개발된 기술은 신생물에서 광범위한 게놈 증폭 현상을 예시하고 있다. 종양 및 정상 DNA는 정상 세포의 세포분열 중기에 동시에 혼성화시키고, 종양에서 높은 빈도수가 증가한 DNA 서열을 영상 분석하여 스크리닝할 수 있다 (국제 공개 93/1,186호; Gray et al., Radiation Res., 137:275-289 (1994)]. 스크리닝 방법으로서, 이러한 유형의 분석은 각종 인간 신생물에 존재하는 많은 수의 빈발하는 앰플리콘 (복제된 DNA 스트레치)을 밝혀낸다. CGH는 증폭된 DNA 스트레치를 확인하는데 있어 전형적인 세포유전적 분석보다 더 민감하지만, 표준 분자 유전적 분석으로 앰플리콘 내의 코딩 서열을 신속하게 확인 및 단리할 수는 없다.
유전자 앰플리콘을 검출하는 가장 민감한 방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction; PCR) 분석이다. 이 분석법은 매우 소량의 종양 DNA를 출발 물질로 사용하며, 매우 민감하고, 서열분석 등 추가 분석이 가능한 DNA를 제공하며, 고처리량을 분석하기에 적합하다.
상술한 분석법은 상호 배타적이지만, 종종 신생물내 증폭을 확인하는데 함께 사용하기도 한다. 세포유전적 분석법 및 CGH는 증폭된 영역을 위해 전체 게놈을조사하는 방법을 대표하지만, PCR을 기초한 분석법은 증폭된 영역내 코딩 서열, 즉 유전자의 최종 확인을 위해서는 가장 적합하다.
본 발명에 따라, 상기 유전자는 유방암, 폐암, 결장암, 전립선암, 뇌암, 간암, 신장암, 췌장암, 비장암, 흉선암, 고환암, 난소암, 자궁암 등을 비롯한 원발성 암, 종양 또는 종양 세포주의 DNA와 건강한 공여자로부터 수집한 DNA를 비교하여 정량적 PCR [S. Gelmini et al., Clin. Chem., 43:752 (1997)]로 확인하였다. 정량적 PCR은 TaqMan 장치 (ABI)를 이용하여 수행하였다. 유전자 특이적 프라이머 및 형광 프로브는 DNA의 코딩 서열을 기초로 설계하였다.
인간 폐 암종 세포주로는 A549 (SRCC768), Calu-1 (SRCC769), Calu-6 (SRCC770), H157 (SRCC771), H441 (SRCC772), H460 (SRCC773), SKMES-1 (SRCC774), SW900 (SRCC775), H522 (SRCC832) 및 H810 (SRCC833)이 있으며, 이들 모두는 ATCC로부터 입수할 수 있다. 원발성 인간 폐 종양 세포는 통상 선암종, 편평세포 암종, 대세포 암종, 비소세포 암종, 소세포 암종 및 기관지 폐포 암종으로부터 유래되며, 그의 예로는 SRCC724 (선암종, 약어 "AdenoCa") (LT1), SRCC725 (편평세포 암종, 약어 "SqCCa") (LT1a), SRCC726 (선암종) (LT2), SRCC727 (선암종) (LT3), SRCC728 (선암종) (LT4), SRCC729 (편평세포 암종) (LT6), SRCC730 (선암종/편평세포 암종) (LT7), SRCC731 (선암종) (LT9), SRCC732 (편평세포 암종 (LT10), SRCC733 (편평세포 암종) (LT11), SRCC734 (선암종) (LT12), SRCC735 (선암종/편평세포 암종) (LT13), SRCC736 (편평세포 암종) (LT15), SRCC737 (편평세포 암종) (LT16), SRCC738 (편평세포 암종) (LT17), SRCC739 (편평세포 암종) (LT-18),SRCC740 (편평세포 암종) (LT19), SRCC741 (폐세포 암종, 약어 "LCCa") (LT21), SRCC811 (선암종) (LT22), SRCC825 (선암종) (LT8), SRCC886 (선암종) (LT25), SRCC887 (편평세포 암종) (LT26), SRCC888 (선-BAC 암종) (LT27), SRCC889 (편평세포 암종) (LT28), SRCC890 (편평세포 암종) (LT29), SRCC891 (선암종) (LT30), SRCC892 (편평세포 암종) (LT31), SRCC894 (선암종) (LT33)이 있다. 또한, SRCC1125 [HF-000631], SRCC1127 [HF-000641], SRCC1129 [HF-000643], SRCC1133 [HF-000840], SRCC1135 [HF-000842], SRCC 1227 [HF-001291], SRCC 1229 [HF-001293], SRCC 1230 [HF-001294], SRCC 1231 [HF-001295], SRCC1232 [HF-001296], SRCC1233 [HF-001297], SRCC1235 [HF-001299] 및 SRCC1236 [HF-001300]으로 표시되는 인간 폐 종양도 있다.
결장 암 세포주로는 예를 들어, ATCC 세포주 SW480 (선암종, SRCC776), SW620 (결장 선암종의 림프절 전이, SRCC777), Colo320 (암종, SRCC778), HT29 (선암종, SRCC779), HM7 (UCSF 로버트 워렌으로부터 얻은 ATCC 결장 선암종 세포주의 뮤신 다생성 변이체, SRCC780), CaWiDr (선암종, SRCC781), HCT116 (선암종, SRCC782), SKCO1 (선암종, SRCC783), SW403 (선암종, SRCC 784), LS174T (선암종, SRCC785), Colo205 (선암종, SRCC828), HCT15 (선암종, SRCC829), HCC2998 (선암종, SRCC830) 및 KM12 (선암종, SRCC831)가 있다. 원발성 결장 종양으로는 CT2 (SRCC742), CT3 (SRCC743), CT8 (SRCC744), CT10 (SRCC745), CT12 (SRCC746), CT14 (SRCC747), CT15 (SRCC748), CT16 (SRCC749), CT17 (SRCC750), CT1 (SRCC751), CT4 (SRCC752), CT5 (SRCC753), CT6 (SRCC754), CT7 (SRCC755), CT9 (SRCC756), CT11(SRCC757), CT18 (SRCC758), CUT19 (선암종, SRCC906), CT20 (선암종, SRCC907), CT21 (선암종, SRCC908), CT22 (선암종, SRCC909), CT23 (선암종, SRCC910), CT24 (선암종, SRCC911), CT25 (선암종, SRCC912), CT26 (선암종, SRCC913), CT27 (선암종, SRCC914), CT28 (선암종, SRCC915), CT29 (선암종, SRCC916), CT30 (선암종, SRCC917), CT31 (선암종, SRCC918), CT32 (선암종, SRCC919), CT33 (선암종, SRCC920), CT35 (선암종, SRCC921) 및 CT36 (선암종, SRCC922)로 표시되는 결장 선암종이 있다. 또한, SRCC1051 [HF-000499], SRCC1052 [HF-000539], SRCC1053 [HF-000575], SRCC1054 [HF-000698], SRCC1142 [HF-000762], SRCC1144 [HF-000789], SRCC1146 [HF-000795] 및 SRCC1148 [HF-000811]로 표시되는 인간 결장암 중심부가 있다.
인간 유방 암종 세포주로는 예를 들어, HBL100(SRCC759), MB435s(SRCC760), T47D(SRC761), MB468(SRCC762), MB175 (SRCC763), MB361 (SRCC764), BT20 (SRCC765), MCF7 (SRCC766) 및 SKBR3 (SRCC767) 및 SRCC1057 [HF-000545]로 표시되는 인간 유방 종양 중심부도 있다. 또한, SRCC1094, SRCC1095, SRCC1096, SRCC1097, SRCC1098, SRCC1099, SRCC1100 및 SRCC1101로 표시되는 인간 유방 종양, 및 SRCC893 [LT32]으로 표시되는 인간 유방-전이-폐-NS 종양이 있다.
인간 직장 종양에는 SRCC981 [HF000550] 및 SRCC982 [HF-000551]을 들 수 있다.
인간 신장 종양 중심부로는 SRCC989 [HF-000611] 및 SRCC1014 [HF-000613]이 있다.
고환 종양 중심부로는 SRCC1001 [HF-000733], 고환 종양 주변부로는 SRCC999 [HF-000716]이 있다.
인간 부갑상선 종양으로는 SRCC1002 [HF-000831] 및 SRCC1003 [HF-000832]가 있다.
인간 림프절 종양으로는 SRCC1004 [HF-000854], SRCC1005 [HF-000855] 및 SRCC1006 [HF-000856]이 있다.
F. 조직 분포
본원의 유전자 증폭 분석 결과는 추가의 연구, 예를 들어, 각종 인간 조직에서의 mRNA 발현을 측정하여 입증할 수 있다.
상기한 바와 같이, 각종 조직에서의 유전자 증폭 및(또는) 유전자 발현은 본원에 제공된 서열을 기초로 하여 적절히 표지된 프로브를 사용하여 통상의 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하는 노던 블롯팅 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77:5201-5205 (1980)], 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 계내 혼성화로 측정할 수 있다. 또한, DNA 이중체, RNA 이중체 및 DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 비롯한 특이적 이중체를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다.
별법으로, 여러 조직에서 유전자 발현은 세포 또는 조직 단면의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 생성물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양액 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 이들은 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 용이하게는, 천연 서열PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 대한 항체, 본원에서 제공되는 DNA 서열 기재의 합성 펩티드에 대한 항체 또는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 DNA에 융합된 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외생성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다. 항체를 제조하는 일반 기술 및 노던 블롯팅 및 계내 혼성화에 대한 구체적인 방법은 하기에 제시하였다.
G. 염색체 지도 작성
소정의 유전자의 증폭이 기능적으로 관련되어 있는 경우, 그 유전자는 종양 생존에 중요하지 않은 인접 게놈 영역보다 더 많이 증폭된다. 이를 시험하기 위해, 유전자는 예를 들어, 방사성-하이브리드 분석으로 특정 염색체 지도를 작성할 수 있다. 이어서, 증폭 정도는 확인된 위치 및 인접 게놈 영역에서 측정한다. 유전자 지도가 작성된 게놈 영역에서의 선택적 또는 우선적 증폭은 관찰된 유전자 증폭이 종양 성장 또는 생존을 촉진시킬 수 있다. 염색체 지도 작성법에는 프레임워크 및 에피센터 지도 작성법이 있다. 보다 상세한 설명은 예를 들어, 문헌[Stewart et al., Genome Research, 7:422-433 (1997)]을 참조한다.
H. 항체 결합 연구
유전자 증폭 연구 결과는 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체가 종양(암) 세포상에서 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 발현을 억제하는 능력을 시험하는 항체 결합 연구로 더 입증할 수 있다. 항체의 예로는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종접합 항체가 있으며, 그 제조 방법은 하기와 같다.
항체 결합 연구는 임의의 공지된 분석 방법, 예를 들어 경쟁 결합 분석법, 직접 및 간접 샌드위치 분석법 및 면역침전 분석법으로 수행할 수 있다 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRS Press, Inc., 1987)].
경쟁 결합 분석법은 제한된 양의 항체와 결합하는데 있어 시험 샘플 분석물과 경쟁하는 표지된 표준 물질의 능력에 따라 좌우된다. 시험 샘플중 표적 단백질 (종양 세포에서 증폭된 유전자에 의해 코딩됨)의 양은 항체에 결합하게 되는 표준 물질의 양에 반비례한다. 결합하게 되는 표준 물질량의 측정을 용이하게 하기 위해, 항체는 경쟁전 또는 후에 불용화시켜 항체에 결합하는 표준 물질 및 분석물이 결합되지 않은 채로 남아있는 표준 물질 및 분석물로부터 용이하게 분리될 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
샌드위치 분석은 각각 검출할 단백질의 상이한 면역원 부분 또는 에피토프에 결합할 수 있는 두 항체를 사용하는 방법을 포함한다. 샌드위치 분석에서 시험 샘플 분석물은 고상 지지체상에 고정되는 제1 항체에 의해 결합되고, 그후 분석물에 제2 항체가 결합됨에 따라, 불용성 3부 결합체를 형성한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,376,110호를 참조한다. 제2 항체는 그 자체로 검출가능한 잔기로 표지 (직접 샌드위치 분석)할 수 있거나, 또는 검출가능한 부분에 의해 표지된 항-면역글로불린 항체를 사용하여 (간접 샌드위치 분석) 측정할 수 있다. 예를 들어, 샌드위치 분석의 한 유형은 ELISA 분석이며, 이 경우 검출가능한 잔기는 효소이다.
면역조직화학에서, 종양 샘플은 신선한 상태이거나 또는 냉동시킬 수 있으며, 또는 파라핀에 매몰시키거나 포르말린과 같은 방부제로 고정시킬 수 있다.
I. 세포 기재의 종양 분석
세포 기재 분석 및 동물 모델은 유전자 증폭 분석에서 발견된 사항을 입증하며, 본원에서 확인된 유전자와 신생물성 세포 성장의 발달 및 병인 사이의 관계를 더 이해하는데 이용할 수 있다. 종양 세포 또는 암의 발생 및 병인에 있어 본원에서 확인된 유전자 생성물의 역할은 본원에서 유전자를 증폭하기 위해 확인된 원발성 종양 세포 또는 세포를 사용하여 시험할 수 있다. 그러한 세포로는 예를 들어, 유방, 결장 및 폐 암세포 세포주 및 상기 열거된 세포주가 있다.
또다른 연구에서, 특정 종양에 관련된 것으로 공지된 세포 유형의 세포는 본원의 cDNA로 형질감염시키고, cDNA가 과도한 성장을 유도하는 능력을 분석한다. 적합한 세포로는 예를 들어, B104-1 세포주 (neu원종양유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주) 및ras로 형질감염된 NIH-3T3 세포가 있으며, 이들은 목적하는 유전자로 형질감염될 수 있고, 종양원성 성장을 모니터할 수 있다. 이어서, 상기 형질감염된 세포주는 형질전환된 세포의 성장에 세포성장 억제 또는 세포독성 활성을 발휘하거나, 또는 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC)을 발휘하는 폴리- 또는 모노클로날 항체 또는 항체 조성물의 능력을 시험하는데 사용할 수 있다. 또한, 본원에서 확인된 코딩 서열로 형질감염된 세포는 암 치료를 위한 후보 약물을 확인하는데 사용할 수 있다.
또한, 트랜스제닉 동물 (transgenic animal, 하기 기재된 바와 같음)의 종양으로부터 유래된 1차 배양물이 세포 기재의 분석에서 사용될 수 있지만, 안정한 세포주가 바람직하다. 트랜스제닉 동물로부터 연속성 세포주를 유도하는 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Small et al., Mol. Cell. Biol., 5:642-648 (1985)] 참조).
J. 동물 모델
잘 공지되어 있는 각종 동물 모델은 종양의 발생 및 병인에 있어서 본원에서확인된 유전자의 역할을 더 이해하고, 항체를 비롯한 후보 치료제 및 소분자 길항제를 비롯한 천연 폴리펩티드의 다른 길항제의 효능을 시험하는데 사용할 수 있다. 상기 분자의 생체내 특성으로 인해 특히 인간 환자에서의 반응을 예측할 수 있다. 종양 및 암 (예를 들어, 유방암, 결장암, 전립선암, 폐암 등)의 동물 모델로는 비-재조합 및 재조합 (트랜스제닉) 동물이 있다. 비-재조합 동물로는 설치류 모델, 예를 들어 쥐 모델이 있다. 상기 모델은 표준 기술, 예를 들어 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신장 캡슐의 이식, 또는 오르토핀 (orhtopin) 이식, 예를 들어, 결장 조직에 이식된 결장 암 세포를 사용하여 종양 세포를 순계 마우스에 도입하여 제조한다 (예를 들어, 1997년 9월 18일에 공개된 PCT 국제 출원 국제 공개 제97/33551호 참조).
종양 연구에 가장 흔히 사용되는 동물은 면역결핍 마우스, 특히 누드 마우스이다. 저형성증/형성부전증을 갖는 누드 마우스는 인간 종양 이종이식을 위한 숙주로서 성공적으로 작용할 수 있다는 것을 확인되어 상기 목적에 광범위하게 사용되었다. 열성의 상염색체nu유전자는 다수의 상이한 유사유전형의 누드 마우스 종, 예를 들어 ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII 및 SJL에 도입되었다. 또한, 누드 마우스 외에 유전적으로 면역학적 결함을 갖는 다른 다양한 동물도 교배하여 종양 이종 이식의 수여자 사용하였다. 더 상세한 내용은 문헌 [예,The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven and B. Winograd, eds. (CRC Press, Inc., 1991)]을 참고한다.
상기 동물로 유도된 세포는 공지된 종양/암 세포주, 예를 들어 상기에 열거된 임의의 종양 세포주 및 예를 들어 B104-1-1 세포주 (nu원종양유전자로 트랜스펙션된 안정한 NIH-3T3 세포주), ras 트랜스펙션된 NIH-3T3 세포, Caco-2 (ATCC HTB-37) 또는 중간정도로 잘 분화된 단계 II 인간 결장 선암종 세포주 HT-29 (ATCC HTB-38), 또는 종양 및 암으로부터 유래될 수 있다. 종양 또는 암의 샘플은 표준 방법을 이용하여 환자로부터 외과적으로 수득하여 냉동하여 액체 질소 내에 저장할 수 있다 [Karmali et al.,Br . J. Cancer, 48: 689-696 (1983)].
종양 세포는 여러 방법으로 누드 마우스와 같은 동물에 도입할 수 있다. 마우스의 피하 (s.c.) 공간은 종양 이식에 매우 적합하다. 종양은 고체 블록, 투관침을 이용한 생검침 또는 세포 현탁액으로서 피하로 이식할 수 있다. 고체 블록 또는 투관침 이식의 경우, 적합한 크기의 종양 조직 단편은 피하 공간으로 도입한다. 세포 현탁액은 1차 종양 또는 안정한 종양 세포주로부터 제조하여 피하 이식으로 주입한다. 또한, 종양세포는 피하 이식편으로 주입할 수 있다. 상기 위치에서 접종물은 피부 결합 조직의 하부와 피하 조직 사이에 침착한다. 상기 문헌 [Boven and Winograd (1991)]을 참조한다.
유방암의 동물모델은 예를 들어 랫트 신경모세포종 (neu 종양 유전자가 처음 단리된 세포) 또는 neu 형질전환된 NIH-3T3 세포를 문헌 [Drebin et al.,Proc. Natl. Acad . Sci . USA,83: 9129-9133 (1986)]의 기재에 따라 누드 마우스에 이식함으로써 제조할 수 있다.
이와 유사하게, 결장암 동물 모델은 동물, 예를 들어 누드 마우스에서 결장암 세포를 계대하여 상기 동물 내에 종양 발현을 유도함으로써 제조할 수 있다. 누드 마우스에서 인간 결장암의 동소이식 모델은 예를 들어 문헌 [Wang et al.,Cancer Research,54: 4726-4728 (1994) and Too et al.,Cancer Rearch,55: 681-684 (1995)]에 기재되어 있다. 상기 모델은 시판되는 AntiCancer Inc.(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 제품의 소위 메타마우스 (METAMOUSE)를 기초로 하였다.
동물 모델에서 발생한 종양을 채취하여 시험관내에서 배양할 수 있다. 이어서, 시험관내 배양된 세포는 동물에 계대 (passage)할 수 있다. 상기 종양은 추가의 시험 또는 약물 스크리닝을 위한 표적으로 이용할 수 있다. 또한, 계대로 생성된 종양은 단리할 수 있고, 계대전 세포의 RNA 및 계대후 1 주기 이상에 단리한 세포의 RNA를 관심있는 유전자의 차등적 발현에 대해 분석한다. 상기 계대 기술은 공지된 어떠한 종양 또는 암 세포에서든지 수행할 수 있다.
예를 들어 Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 및 WEHI-164는 BALB/c 마우스 암컷의 화학적으로 유도된 섬유육종으로서 여러 제제의 항 종양활성을 연구하기 위해 조절가능한 모델 시스템을 제공한다 [Palladino et al.,J. Immunol . 138: 4023-4032 (1987)]. 간략하게, 종양 세포는 시험관에서 세포 배양으로 증식된다. 동물주사전에 세포주를 세척하고 10×106내지 10 ×107세포/㎖의 세포 밀도로 완충액에 재현탁시킨다. 이어서 동물에 10 내지 100 ㎕의 세포 현탁액을 피하주사하여 종양이 생기도록 1 내지 3주를 방치한다.
또한, 가장 완전하게 연구된 실험 종양인 마우스의 루이스 폐 (3LL) 암종은종양 연구 모델로서 이용될 수 있다. 이 종양 모델의 효능은 폐 소세포암 (SCLL)으로 진단된 인간 환자의 치료에서 유리한 효과와 관련이 있다. 이 종양은 이환된 마우스 또는 배양에서 유지된 세포에서 얻은 종양 단편을 주사하여 정상 마우스에 유도될 수 있으며 [Zupi et al.,Br . J. Cancer 41: suppl. 4, 309 (1980)], 종양은 심지어 단일 세포의 주사로부터 시작될 수 있으며 감염된 종양세포의 많은 부분이 생존할 수 있음을 입증하는 것이다. 이 종양 모델의 추가적인 정보는 문헌 [Zacharski,Haemostasis 16: 300-320 (1986)]을 참조한다.
동물 모델에서 시험 화합물의 효능을 평가하는 한 방법은 처리 전후의 이식된 종양의 크기를 측정하는 것이다. 전형적으로, 이식된 종양의 크기는 2 또는 3차원으로 슬라이드 캘리퍼스로 측정한다. 이차원으로 한정된 측정은 종양의 정확한 크기를 반영하지 못하므로 일반적으로 수학식을 이용하여 해당하는 부피로 환산된다. 그러나, 종양 크기의 측정은 매우 정확하지 않았다. 약물 후보 물질의 치료 효과는 처리시 유도된 성장 지연 및 특이적 성장 지연으로 더 잘 나타낼 수 있다. 종양 성장을 나타내는 또다른 중요한 변수는 종양 부피 배가 시간이다. 문헌 [Rygaard and Spang-Thomson,Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds.(Basel, 1989, 301)]에 보고된 프로그램과 같이 종양 성장의 계산 및 표시를 위한 컴퓨터 프로그램 이용이 가능하다. 그러나, 치료에 따른 괴사 및 염증 반응은 실제로 적어도 초기에 종양 크기의 증가시킬 수 있음을 알아야한다. 그러므로 이러한 변화는 형태 측정 방법 및 유동 세포측정법을 조합하여 주의있게 모니터하여야 한다.
재조합(트랜스제닉) 동물 모델은 트랜스제닉 동물을 생산하기 위한 표준 기술을 이용하여 본원에서 동정된 유전자의 코딩 부위를 목적하는 동물의 게놈에 도입시킴으로써 조작될 수 있다. 트랜스제닉 조작을 위한 표적으로 마우스, 랫트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 비인간 영장류, 즉 개코 원숭이, 침팬지 및 원숭이 등에 제한없이 사용될 수 있다. 트랜스진을 상기의 동물에 도입하는 공지된 기술은 전핵 미세주입법 (미국 특허 제 4,873,191호), 생식세포주 내로 레트로 바이러스 매개된 유전자 전달법 [예, Van der Putten et al.,Proc. Natl . Acad . Sci. USA,82: 6148-615 (1985)], 배아 간세포에서의 유전자 표적법 [Thompson et al.,Cell,56: 313-32 (1989)], 배아의 일렉트로포레이션 [Lo,Mol . Cell. Biol .,3: 1803-1814 (1983)]; 정자 매개된 유전자 전달법 [Lavitrano et al.,Cell. 57: 717-73 (1989)]가 포함된다. 더 많은 정보를 위해서 예를 들어 미국 특허 제 4,736,866호를 참조한다.
본 발명의 목적을 위해, 트랜스제닉 동물은 세포의 일부에만 트랜스진을 지니고 있는 동물 ("모자이크 동물")을 포함한다. 트랜스진은 단일 트랜스진 또는 콘카타머 (concatamer), 즉 머리-머리 또는 머리-꼬리 배열로 통합할 수 있다. 트랜스진의 특정 세포종으로의 선택적인 도입은 예를 들어 문헌 [Lasko et al.Proc. Natl. Acd . Sci . USA. 89: 6232-636 (1992)]의 기술에 의해 또한 가능하다.
트랜스제닉 동물 내에서 트랜스진의 발현은 표준 기술에 의해 모니터할 수 있다. 예를 들어 서던 블롯 분석 또는 PCR 증폭이 트랜스진의 융합을 확인하는 데 사용할 수 있다. 이어서 mRNA 발현 수준은 계내 혼성화, 노던 블롯 분석, PCR 또는면역세포화학과 같은 기술을 이용하여 분석할 수 있다. 또한 동물들은 종양 또는 암의 발생의 징후에 대해 조사할 수 있다.
또한, 본원에서 확인된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 내생성 유전자와 동물의 배세포로 도입된 상기 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA사이의 상동성 재조합 결과 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 결함이 있거나 변형된 "낙 아웃 (knock out)" 동물을 제작할 수 있다. 예를 들어, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA을 사용하여 확립된 기술에 따라 상기 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. 특정 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 코딩하는 게놈 DNA의 일부를 결실시키거나 다른 유전자, 예를 들어 통합을 모니터하는데 사용될 수 있는 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자로 치환할 수 있다. 전형적으로, (5' 및 3' 말단 모두에) 수 킬로베이스 (kb)의 비변형된 플랭킹 (flanking) DNA가 벡터에 포함되어 있다 (상동성 재조합 벡터의 설명에 대해서는 예를 들어 문헌 [Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)] 참조]. 벡터를 배아 간세포 세포주로 (예를 들어, 일렉트로포레이션에 의해) 도입시키고, 도입된 DNA가 내생성 DNA와 함께 상동성 재조합된 세포를 선별한다 (예를 들어, 문헌 [Li et al., Cell, 69:915 (1992] 참조). 이어서, 선별된 세포는 동물 (예를 들어, 마우스 또는 쥐)의 포배로 주사하여 응집체 키메라를 형성한다 (예를 들어, 문헌 [Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed.(IRL, Oxford, 1987], pp. 113-152) 참조). 이어서, 키메라 배는 적합한 가임 암컷 대리모 동물로 이식하고 배아가 성장하여 "낙 아웃" 동물을 생성하였다. 생식 세포에 상동성 재조합 DNA를 함유하는 자손은 표준 기술로 확인할 수 있고, 동물의 모든 세포가 상동성 재조합 DNA를 함유하는 동물을 교배하는데 사용할 수 있다. 낙 아웃 동물은 예를 들어 특정 병리학적 질병을 방어하는 능력 및 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 부재로 인한 병리학적 질병의 발생을 특징으로 한다.
본원에서 동정한 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 및 다른 후보 약물의 효능은 또한 특발성 동물 종양의 치료에서도 시험할 수 있다. 이같은 연구의 적합한 표적은 고양이의 구강 편평상피 세포 암종 (SCC)이다. 고양이 구강 SCC는 이 종에서 보고된 구강 종양의 60%를 차지하는 것이 설명해 주듯이 가장 흔한 고양이의 구강 악성 종양으로 매우 침입성이 강한 악성 종양이다. 낮은 전이 발생률은 단지 이 종양을 갖는 고양이의 생존 기간이 짧은 것을 반영한다고 하더라도, 이것은 원발 부위로 거의 전이되지 않는다. 주로 고양이 구강의 해부로 인해 이들 종양에 대해 일반적으로 외과 수술을 실시할 수 없다. 현재, 이 종양의 효과적인 치료법은 없다. 연구에 도입하기에 앞서, 각 고양이는 완벽한 임상 검사, 생체 검사를 하고 컴퓨터 단층 촬영 (CT)한다. 설하 구강 편평상피 세포 종양으로 진단된 고양이는 연구에서 제외한다. 이같은 종양으로 혀가 마비될 수 있으며 처치로 종양을 제거한다고 해도 동물은 스스로 음식을 섭취할 수가 없다. 각 고양이를 장기간에 걸쳐 반복적으로 처치한다. 치료 기간 동안 매일 및 이후의 재검토시에 종양의 사진을 촬영한다. 치료후 각 고양이를 컴퓨터 단층 촬영하고, 그 후 8주마다 컴퓨터 단층 촬영 및 흉부 라디오그램을 평가한다. 자료를 대조군과 비교하여 생존, 반응 및 독성에 있어서 차이에 대해 평가한다. 양성 반응은 바람직하게는 삶의 질의 향상 및(또는) 수명 연장과 함께 종양의 퇴화의 증거를 필요로 한다.
또한, 다른 특발성 동물 종양, 예를 들어 개, 고양이 및 비비의 섬유육종, 선암, 림프종, 연골종, 평활근육종도 실험할 수 있다. 이들 포유류 중에 개 및 고양이의 선암종은 인간과 매우 비슷한 형태와 반응을 보이기 때문에 바람직한 모델이다. 그러나, 동물에서 상기 유형의 종양이 드물게 발생하기 때문에 이 모델을사용하는 것은 제한을 받는다.
K. 후보 약물의 스크리닝 분석법
후보 약물에 대한 스크리닝 분석법은 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 결합하거나 그와 결합체를 이루거나, 또는 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포 단백질의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하도록 고안된다. 이러한 스크리닝 분석법은 화학 물질 라이브러리에 대해 고처리 스크리닝할 수 있는 분석법을 포함하며, 이는 작은 분자의 후보 약물을 동정하는데 특히 적합할 것이다. 고려되는 작은 분자에는 펩티드, 바람직하게는 가용성 펩티드, (폴리)펩티드-면역글로불린 융합체, 및 특히 항체 (폴리- 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-이디오타입 항체, 상기 항체 또는 단편의 키메라 형태 또는 인간화 형태뿐 아니라 인간 항체 및 단편을 포함하나 이에 한정되지는 않음)를 포함하는 합성 유기 또는 무기 화합물이 포함된다. 분석법은 당업계에서 잘 특성화된 단백질-단백질 결합 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역분석법 및 세포 기초 분석법을 비롯한 다양한 포맷으로 수행할 수 있다.
모든 분석법은 일반적으로 후보 약물과 본원에서 동정된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 이들 두 성분이 상호작용하기에 충분한 시간 및 조건하에서 접촉시키는 것을 요구한다.
결합 분석법에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 형성된 결합체는 단리하거나 반응 혼합물에서 검출할 수 있다. 특정 실시태양에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 후보 약물은 공유적 부착 또는 비공유적 부착에 의해 고상, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트에 고정된다. 비공유적 부착은 일반적으로 고상 표면을 폴리펩티드 용액으로 코팅하고 건조함으로써 달성된다. 별법으로, 고정시킬 폴리펩티드에 특이적인 고정 항체, 예를 들어 모노클로날 항체를 사용하여 상기 폴리펩티드를 고상 표면에 앵커링할 수 있다. 분석은 검출가능한 표지로 표지할 수 있는 비고정 성분을 고정 성분, 예를 들어 앵커링된 성분을 포함하는 코딩된 표면에 부가함으로써 수행할 수 있다. 반응이 종결되었을 때, 반응하지 않은 성분은 예를 들어 세척하여 제거하고, 고상 표면에 앵커링된 결합체를 검출한다. 본래 고정되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 포함하는 경우, 표면에 고정된 표지의 검출은 결합체 형성 반응이 일어났음을 나타낸다. 본래 고정되지 않은 성분이 표지를 포함하지 않는 경우, 예를 들어 고정된 결합체와 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 복합체 형성 반응을 검출할 수 있다.
후보 화합물이 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 특정 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드와 상호작용을 하지만 결합하지 않는 경우, 후보 화합물과 이 폴리펩티드의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위한 공지된 방법으로 분석할 수 있다. 이러한 분석법에는 통상의 방법, 예를 들어 가교형성법, 동시면역침전법, 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시정제법이 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 [Chevary and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9789-5793 (1991)]에 개시된 바와 같이 필드 (Field)와 그의 공동 연구자의 문헌 [Fields and Song, Nature, 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:9578-9582 (1991)]에 기재된 효모에 기재한 유전자 시스템을 사용하여 모니터할 수 있다. 많은 전사 활성 인자, 예를 들어 효모 GAL4는 물리적으로 구별되는 2가지 모듈의 도메인으로 이루어져 있는데, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 나머지 한 도메인은 전사-활성 도메인으로 작용한다. 상기 문헌에 기재된 효모 발현계 (일반적으로, "2-하이브리드계"로 언급됨)는 이러한 특성을 이용하고, 2가지 하이브리드 단백질을 사용하는데, 이 중 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인과 융합되며, 다른 하나는 후보 활성 단백질이 활성 도메인과 융합된다. GAL4에 의해 활성화된 프로모터의 조절하에 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용으로 인한 GAL4 활성의 재구성에 따라 좌우된다. 상호작용하는 폴리펩티드를 포함하는 콜로니는 β-갈락토시다제의 발색 기질을 사용하여 검출한다. 2-하이브리드 기술을 사용하여 2종의 특이적인 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 완성형 킷트 (MATCHMAKERTM)는 클론테크사에서 구입할 수 있다. 또한, 이 시스템을 확장하여 특이적 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인 지도를 작성할 수 있을 뿐 아니라, 이러한 상호작용에 결정적인 아미노산 잔기의 위치를 정확하게 나타낼 수 있다.
본원에서 확인된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269,PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 코딩 유전자와 다른 세포내- 및 세포외 성분사이의 상호작용을 방해하는 화합물은 다음과 같이 시험할 수 있다. 통상, 증폭된 유전자의 생성물 및 세포간- 또는 세포외 성분이 상호작용하고 결합할 수 있는 충분한 시간 및 조건하에서 이들 두 성분을 포함하는 혼합물을 제조한다. 시험화합물의 결합 억제능을 시험하기 위해, 반응을 시험 화합물의 존재 및 부재하에 실행한다. 또한, 제3 반응 혼합물에 위약을 가하여 양성 대조용으로 이용한다. 혼합물중에 존재하는 시험 화합물과 세포간- 또는 세포외 성분 사이의 결합 (결합체 형성)은 상기한 바와 같이 모니터한다. 대조 반응물(들)에서는 결합체가 형성되나 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에서는 결합체가 형성되지 않으면 시험 화합물과 그의 반응 파트너 사이의 상호작용을 방해한다는 것을 나타낸다.
길항제를 분석하기 위해, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 특정 활성에 대해 스크링하고자 하는 화합물과 함께 첨가할 수 있고, 화합물이 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759,PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 존재하에서 관심있는 활성을 억제할 수 있다는 것은 상기 화합물이 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 길항제임을 나타낸다. 또한, 길항제는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 및 가능성 있는 길항제를 막에 결합된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 수용체 또는 재조합 수용체와 경쟁적 억제 분석 조건하에 결합시켜 검출할 수 있다. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202,PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드는 방사능 등으로 표지하여 수용체에 결합된 상기 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 분자의 수로 가능성 있는 길항제의 유효성을 결정하는데 사용할 수 있다. 수용체를 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 많은 방법, 예를 들어 리간드 패닝 및 FACS 소팅 [Coligan et al., Current Protocols in Immune., 1(2); Chapter 5 (1991)]으로 확인할 수 있다. 바람직하게는, 발현 클로닝은 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 반응성인 세포로부터 폴리아데닐화 RNA를 제조하고, 이 RNA로부터 제작된 cDNA 라이브러리 풀로 분배하여, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 반응하지않은 COS 세포 또는 다른 세포를 형질감염시키는데 사용하는 경우에 발현 클로닝을 이용한다. 유리 슬라이드상에서 배양한 형질감염된 세포를 표지된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 노출시킨다. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드는 요오드화 또는 부위 특이적 단백질 키나아제에 대한 인식 부위를 포함시키는 등 각종 수단으로 표지할 수 있다. 고정시키고 인큐베이션한 후, 슬라이드는 방사성자동사진법으로 분석한다. 양성 풀을 확인하여 서브풀을 제조한 후, 상호작용성 서브풀 제조 및 재스크리닝 방법을 이용하여 재형질감염시킴으로써 최종적으로 추정 수용체를 코딩하는 단일 클론을 수득한다.
수용체 확인을 위한 또다른 연구법으로서, 표지된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드는 수용체분자를 발현하는 세포막 또는 추출물 제제와 광친화성-결합시킬 수 있다. 가교결합된 물질은 PAGE로 분석하고, X-선 필름에 노출시킨다. 수용체를 함유하는 표지된 결합체를 절단하여 펩티드 단편으로 분해할 수 있고, 단백질 미량 서열분석 (micro-sequencing)을 할 수 있다. 미량 서열분석으로부터 얻은 아미노산 서열을 이용하여 추정의 수용체를 코딩하는 유전자를 도입하기 위한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위해 다의성 (degenerate)의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 설계할 수 있다.
길항제에 대한 다른 분석법에서, 수용체를 발현하는 포유동물 세포 또는 막 제제를 표지된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드와 후보 화합물 존재하에 인큐베이션시킨다. 이이서, 이러한 상호작용을 증진시키거나 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있다.
가능성 있는 길항제의 보다 구체적인 예로는 면역글로불린과 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드와의 융합체에 결합하는 펩티드, 및 특히 항체 (폴리- 및 모노클로날 항체및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-이디오타입 항체, 상기 항체 또는 단편의 키메라 형태 또는 인간화 형태뿐 아니라 인간 항체 및 단편을 포함하나 이에 한정되지는 않음)가 포함된다. 또한, 가능성 있는 길항제는 단백질, 예를 들어 수용체를 인식하지만 효과를 부여하지 않아 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제하는 매우 유사한 단백질, 예를 들어 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 돌연변이형일 수 있다.
가능성 있는 다른 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 길항제는 안티센스 기술을 이용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 작제물이며, 여기서 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적 mRNA에 혼성화하고 단백질 번역을 방해함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술은 삼중 나선 형성 또는 안티센스 RNA 또는 DNA를 통한 유전자 발현을 억제하는데 사용할 수 있으며, 이들 두 방법은 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합을 기초로 한다. 예를 들어, 본원에서의 성숙 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩 부분은 길이가 약 10 내지 40 bp인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계하는데 사용된다. DNA 뉴클레오티드는 전사에 관련된 유전자 영역에 상보적이도록 설계하여 (삼중 나선에 대해서는 문헌 [Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)] 참조), PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 전사 및 생성을 억제시킨다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA에 혼성화하여, mRNA 분자가 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342,PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드로 번역되는 것을 억제한다 (안티센스에 대해서는 문헌 [Okano, Neuochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)] 참조). 상기한 올리고뉴클레오티드는 또한 세포로 전달되어 안티센스 RNA 또는 DNA가 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 생성을 억제하도록 생체내 발현될 수 있게 된다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 번역 개시 부위로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10에서 +10 위치 사이가 바람직하다.
안티센스 DNA 또는 RNA 분자는 일반적으로 길이가 약 5개 염기 이상, 약 10개 염기 이상, 약 15개 염기 이상, 약 20개 염기 이상, 약 25개 염기 이상, 약 30개 염기 이상, 약 35개 염기 이상, 약 40개 염기 이상, 약 45개 염기 이상, 약 50개 염기 이상, 약 55개 염기 이상, 약 60개 염기 이상, 약 65개 염기 이상, 약 70개 염기 이상, 약 75개 염기 이상, 약 80개 염기 이상, 약 85개 염기 이상, 약 90개 염기 이상, 약 95개 염기 이상, 약 100개 염기 이상이다.
가능성 있는 길항제로는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759,PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 활성 부위, 수용체 결합 부위, 또는 성장 인자 또는 다른 관련 결합 부위에 결합하여 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 소분자가 포함된다. 소분자의 예로는 작은 펩티드 또는 펩티드 유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드 및 합성 비-펩티딜 유기 또는 무기 화합물이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매화할 수 있는 효소 RNA 분자이다. 리보자임은 그와 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적으로 혼성화한 다음, 엔도뉴클레아제 활성으로 절단함으로써 작용한다. 공지된 기술로 가능성 있는 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있다. 보다 상세한 내용은, 예를 들어 문헌 [Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) 및 1997년 9월에 공개된 국제 공개 제97/33551호]을 참조한다.
전사를 억제하는데 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일 가닥이어야하며, 데옥시뉴클레오티드로 이루어져야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 일반적으로 이중쇄 중 한 가닥에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치를 필요로 하는 호그스틴 (Hoogsteen) 염기쌍 규칙을 통해 삼중나선 형성을 촉진하도록 설계되어 있다. 보다 자세한 사항은, 예를 들어 문헌 (상기 국제 공개 제97/33551호)을 참조한다.
상기 작은 분자들은 상기 기재된 한가지 이상의 임의의 스크리닝 분석법 및(또는) 당업자에게 잘 알려진 임의의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인할 수 있다.
L. 종양의 치료용 조성물 및 치료 방법
본원에서 확인된 유전자의 증폭과 관련된 종양의 치료에 유용한 조성물로는 표적 유전자 생성물의 발현 및(또는) 활성을 억제하는 항체, 작은 유기 및 무기 분자, 펩티드, 포스포펩티드 안티센스 및 리보자임 분자, 삼중 나선 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적 mRNA에 혼성화하여 단백질 번역을 방해하여, mRNA의 번역을 직접 저해하는 작용을 한다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 번역 개시 부위, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10에서 +10 위치 사이로부터 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적으로 혼성화한 다음, 엔도뉴클레아제 활성으로 절단함으로써 작용한다. 공지된 기술로 가능성 있는 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌 [Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) 및 1997년 9월 18일에 공개된 국제 공개 제97/33551호]을 참조한다.
전사를 억제하는데 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일 가닥이어야하며, 데옥시뉴클레오티드로 이루어져야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 일반적으로 이중쇄 중 한 쇄에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치를 필요로 하는 호그스틴 염기쌍 규칙을 통해 삼중나선 형성을 촉진하도록 설계되어 있다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌 (상기 국제 공개 제97/33551호)을 참조한다.
M. 항체
본 발명에 따라 몇가지 후보 약물로 가장 유망한 것은 본원에서 확인된 증폭된 유전자의 생성물 또는 유전자 생성물을 억제하고(하거나) 유전자 생성물의 활성을 감소시키는 항체 또는 항체 단편이다.
1.폴리클로날 항체
폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 포유동물에 1회 이상 면역화제를 주입, 필요한 경우 면역보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및(또는) 면역보강제는 포유동물에 피하 주사 또는 복강내 주사로 수회 주입될 것이다. 면역화제는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성이 있는 것으로공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 효과적일 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예에는 키홀 림펫 (keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소의 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 사용할 수 있는 면역보강제에는 프로인트 완전 보조제 (Freund's complete adjuvant) 및 MPL-TDM 보조제 (모노포스포릴 지질 A (monophosphoryl Lipid A), 합성 트레할로오스 디코리노미콜레이트)가 포함된다. 면역화 방법은 과도한 실험없이 당업자가 선택할 수 있다.
2.모노클로날 항체
다른 방법으로, 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기재된 바와 같은 하이브리도마 (hybridoma) 방법을 사용하여 제조한다. 하이브리도마 방법에서, 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해, 상기 면역화제로 마우스, 햄스터 또는 다른 적합한 숙주 동물을 면역화시킨다. 다른 방법으로, 림프구는 시험관내에서 면역화시킬 수 있다.
면역화제는 통상 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드, 이들의 단편, 또는 이러한 단백질들이나 이들 단편의 융합 단백질을 포함한다. 통상, 인간에서 유래한 세포가 요구되는 경우에는 말초 혈관 림프구 ("PBL")를 사용하고, 인간이 아닌 포유동물에서 유래한 세포가 요구되는 경우에는 비장 세포 또는 림프절 세포를 이용한다. 이어서, 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 무한증식 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 무한증식 세포주는 통상 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간에서 유래한 골수종 세포이다. 통상, 랫트 또는 마우스의 골수종 세포를 사용한다. 하이브리도마 세포는 융합되지 않은 무한증식 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1 종 이상의 물질을 포함하는 적합한 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모세포에 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마의 배지는 통상 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방해하는 물질인 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함 ("HAT 배지")할 것이다.
바람직한 무한증식 세포주는 효과적으로 융합되고, 선별된 항체를 생산하는 세포에 의해 높은 수준의 항체 발현을 안정하게 유지하면서, HAT 배지와 같은 배지에 감응성이 높은 것이다. 보다 바람직한 무한증식 세포주는 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center) 및 버지니아주 매나서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 입수가능한 쥐과 골수종 세포이다. 또한, 인간의 골수종 세포 및 마우스-인간 이종골수종 세포도 인간 모노클로날 항체 생성에 사용되었다 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984) ; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63)].
하이브리도마 세포가 배양된 배지를 사용하여 원하는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 모노클로날 항체의 존재 여부를 분석할 수 있다. 바람직하게는 하이브리도마 세포에서 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침강법이나, 방사성면역분석법 (radioimmunoassay: RIA)이나 효소-결합 면역흡착 분석법 (enzyme-linked immunoadsorbent assay: ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석으로 결정할 수 있다. 상기 기술 및 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 문헌 [Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980)]에 기재된 스캐쳐드 (Scatchard) 분석법으로 결정할 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포를 찾아낸 후, 그 클론을 제한 희석법으로 서브클로닝하여 표준 방법 (Goding, 상기 문헌)으로 배양한다. 이러한 목적에 적합한 배지에는 둘벨코 개질 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지가 포함된다. 다른 방법으로, 하이브리도마 세포는 포유동물의 복수에서 생체내 배양할 수 있다.
서브클론에서 분비된 모노클로날 항체는 종래의 면역글로불린 정제 방법, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피에 의해 배지나 복수액으로부터 단리 또는 정제할 수 있다.
모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 종래의 방법 (예를 들어, 쥐과 동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 사용)을 사용하여 용이하게 단리하고 서열 분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 출처로 사용된다. 일단 분리된 DNA를 발현 벡터로 클로닝하고, 형질감염되기 전에 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포를 형질감염시킨 후, 재조합 세포에서 합성된 모노클로날 항체를 수득할 수 있다. 인간의 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인의 코딩 서열로 쥐과 동물의 상동성 서열을 치환하거나 (미국 특허 제4,816,567호 및 모리슨 (Morrison) 등의 상기 문헌 참조), 또는 비-면역글로불린 코딩 서열의 전체 또는일부분을 면역글로불린 코딩 서열과 공유결합시키는 등의 방법으로 상기 DNA를 변화시킬 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명 항체의 불변 도메인으로 치환하거나, 또는 2가 키메라 항체의 생성을 위해 본 발명 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인으로 치환할 수 있다.
상기 항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 한 가지 방법은 면역글로불린의 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄의 가교결합을 방지하기 위해 통상 Fc 영역의 임의의 지점에서 중쇄의 말단을 절단한다. 다른 방법으로, 관련 시스테인 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하거나 제거하여 가교결합을 방지한다.
또한, 시험관내 방법도 1가 항체의 제조에 적합하다. 항체를 분해하여 그 단편, 특히 Fab 단편을 제조하는 것은 당업계에 공지된 통상의 기술을 이용하여 수행할 수 있다.
3.인간 항체 및 인간화 항체
본 발명의 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체는 또한 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 인간화 형태는 키메라 면역글로불린, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 포함하는 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 인간화 항체는, 수용체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 비-인간 종의 CDR의 잔기 (공여 항체)로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 통상 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 면역글로불린의 영역에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 영역에 상응한다. 또한, 최적의 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 통상적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 [Jones et al.,Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature,332: 323-327 (1988); 및 Presta,Curr . Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992)].
비인간 항체의 인간화 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인체 기원으로부터 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트(import)" 잔기로 부르며, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 인간 항체의 대응하는 서열 대신 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 [Jones et al.,Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature,332: 323-329 (1988); Verhoeyen et al.,Science,239: 1534-1536 (1988)]에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 완전한 인간 가변 도메인보다 적은 부분이 비-인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체에서 유사한 부위의 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.
또한, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 당업계에 공지된 여러 기술을 사용하여 제조할 수 있다 [Hoogenboom and Winter,J. Mol . Biol .,227: 381 (1991), Marks et al.,J. Mol . Biol .,222: 581 (1991)]. 또한, 코울 등 및 보에르너 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다 [Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) 및 Boerner et al.,J. Immunol .,147(1): 86-95 (1991)]. 마찬가지로, 내생성 면역글로불린 유전자의 부분 또는 전체가 불활성화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스에 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 인간 항체를 제조할 수 있다. 항원 투여 후에, 인간 항체 생산이 관찰되었는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 종류를 비롯한 모든 점에서 인간에서 관찰되는 항체와 매우 유사하였다. 상기 사항은 예를 들어 문헌 (미국 특허 제 5,545,807호, 제 5,545,806호, 제 5,569,825호, 제 5,625,126호, 제 5,633,425호, 제 5,661,016호) 및 과학 문헌[Marks et al.,Bio /Technology 10, 779-783 (1992), Lonberg et al.,Nature 368, 856-859 (1994), Morrison,Nature 368, 812-13 (1994), Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996), Neuberger,Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Lonberg and Huszar,Intern. Rev. Immunol . 1365-93 (1995)]에 기재되어 있다.
4.항체 의존성 효소 매개 전구약물 치료법 (ADEPT)
또한, 전구약물 (예들 들면, 펩티딜 화학요법제, 국제 공개 제81/01145호 참조)을 활성 항암제로 전환시키는 전구약물-활성화 효소에 항체를 접합시킴으로써 본 발명의 항체를 ADEPT에 사용할 수 있다 (국제 공개 제88/07378호 및 미국 특허 제4,975,278호 참조).
ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분에는 전구약물을 더 활성적이고 세포독성인 형태로 전환시킬 수 있는 임의의 효소가 포함된다.
본 발명의 방법에 유용한 효소에는 글리코시다제, 글루코스 옥시다제, 인간 리소자임, 인간 글루쿠로니다제, 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리 포스파타제; 술페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 무독성 5-플루오로시토신을 항암제 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 디아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 세라티아 프로테아제, 써모리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 (예를 들어, 카르복시펩티다제 G2 및 카르복시펩티다제 A) 및 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B 및 L)과 같은 프로테아제; D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물의전환에 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제와 같은 탄수화물-절단 효소; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소 위치에서 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 각각 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 방법으로, 당업계에 "아브자임 (abzyme)"으로 공지된, 효소 활성을 갖는 항체는 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시키는데 사용될 수 있다 (문헌 [Massey, Nature, 328:457-458 (1987)] 참고). 항체-아브자임 접합체는 종양 세포군에 아브자임의 전달을 위해 본원에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
본 발명의 효소는 상기 논의된 이종 이관능성 가교결합제의 이용과 같이 당업계에 공지된 기술에 의해 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 항체에 공유결합 될 수 있다. 다른 방법으로, 본 발명 효소의 적어도 기능적 활성인 부분에 결합된, 본 발명 항체의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은 당업계에 잘 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다 [Neuberger et al., Nature,312:604-608 (1984)].
5.이중특이적 항체
이중특이적 항체는 상이한 두 가지 이상의 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 이 경우에, 결합 특이성 중 하나는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는 세포-표면 단백질, 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중 특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄/경쇄-중쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [Millstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열로 인해 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 일반적으로 친화 크로마토그래피 단계로 수행된다. 유사한 방법이 국제 공개 제93/08829호 (1993년 5월 13일에 공개됨) 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.
원하는 결합 특이성을 갖는 항체의 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 내에서 이루어진다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체를 코딩하는 DNA, 및 원하는 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 생물로 동시 형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은 예를 들어, 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121: 210 (1986)]을 참조한다.
국제 공개 제96/27011호에 개시된 다른 방법에 따르면, 한쌍의 항체 분자 사이의 접촉 영역을 조작하여 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종 이량체의 비율을 최대화할 수 있다. 바람직한 접촉 영역은 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 접촉 영역으로부터 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체하였다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄와 동일하거나 유사한 크기의 보상성 "공동 (cavity)"을 제2 항체 분자의 접촉 영역에 생성시켰다. 이는 이종 이량체의 수율을 동종 이량체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물보다 높게 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2이중특이적 항체)으로서 제조할 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학 결합을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]은 온전한 항체를 단백질 가수분해로 절단하여 F(ab')2단편을 생성하는 방법을 기재하고 있다. 이러한 단편은 디티올 착화제인 소듐 아르세니트의 존재하에 환원시켜 근처 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 결합의 형성을 방지한다. 그 후에, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시켰다. 그 후에, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민을 사용하여 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고 동몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시켰다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로 사용할 수 있다.
이. 콜라이로부터 Fab' 단편을 직접 회수하여 화학적으로 연결시킴으로써 이중특이적 항체를 형성시켰다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]에는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2분자를 기재하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 별도로 분비되었으며 시험관내에서 지시된 화학적 방법으로 연결하여 이중특이적 항체를 형성시켰다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과다 발현시키는 세포 및 정상적인 인간 T 세포와 결합할 수 있을뿐 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용균 활성을 개시할 수 있었다.
또한, 재조합 세포 배양으로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하는 여러 기술이 기재되어 있다. 예를 들어, 루이신 지퍼를 사용하여 이중 특이적 항체를 제조하였다 [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질의 루이신 지퍼 펩티드를 2종의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결하였다. 항체 동종 이량체의 힌지 영역을 환원시켜 단량체를 형성한 다음, 재산화시켜 항체 이종 이량체를 형성시켰다. 또한, 이 방법은 항체 동종 이량체를 생산하기 위한 방법으로 이용할 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디 (diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편을 만드는 다른 메카니즘을 제공한다. 단편은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는데, 이 링커는 너무 짧아서 동일 쇄에 존재하는 두 도메인이 쌍을 이룰 수 없다. 따라서, 한 단편의 VH및 VL도메인은 다른 단편의 상보적인 VL및 VH도메인과 쌍을 이루게 되며, 그 결과 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 만드는 또다른 전략이 보고되었다 [문헌 (Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)] 참조].
2가 이상의 결합가를 갖는 항체도 고려 대상이다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 만들 수 있다 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].
전형적인 이중특이적 항체는 본원에 기재된 폴리펩티드의 두 가지 상이한 에피토프와 결합할 수 있다. 또는, 특정 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대한 세포내 방어 메카니즘에 초점을 맞추기 위해, 항-폴리펩티드 팔 (arm) 영역을 백혈구의 유발 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2, CD3, CD28 또는 B7), 또는 IgG의 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)와 결합하는 팔 영역과 연결시킬 수 있다. 또한, 이중특이적 항체를 사용하여 세포독성제를 특정 폴리펩티드를 발현하는 세포에 국소화할 수 있다. 이러한 항체는 폴리펩티드-결합 팔 영역과 세포독성제 또는 방사성핵종 킬레이트제, 예를 들어 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA와 결합하는 팔 영역을 가지고 있다. 목적하는 또다른 이중특이적 항체는 폴리펩티드와 결합하며 추가로 조직 인자 (TF)와 결합한다.
6.이종접합 항체
이종접합 항체는 2개의 공유결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화하고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염을 치료 (국제 공개 제91/00360호, 동 제92/200373호, 및 EP 제03089호)하기 위해 제안되었다. 이종접합 항체는 가교결합제를 사용하는 방법을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응에 의해 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약에는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트 및 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 시약이 포함된다.
7.효과기 기능 조작
효과기 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형하여, 예를 들어 암치료에 있어 항체의 효과를 증대하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 Fc영역에 도입하여 이 영역내 쇄간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 생성된 동종 이량체 항체는 내재화 능력이 향상시키고(거나) 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포내 세포독성 (ADCC)이 증대시킨다 (문헌 [Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)] 참조). 또한, 문헌 [Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)]에 기재된 이종 이관능성 가교결합제를 사용하여 항암 활성이 증대된 동종 이량체 항체를 제조할 수 있다. 또는, 이중의 Fc 영역을 갖는 항체를 조작하여 보체 용균성 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있다 (문헌 [Stevenson et al.,Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)] 참조).
8.면역접합체
또한, 본 발명은 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 독소 (예를 들어, 효소 활성의 세균, 진균, 식물 또는 동물성 독소, 또는 그의 단편 또는 소분자 독소) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)와 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
상기 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소 활성의 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 콜레라 독소, 보툴리누스 독소, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 (ricin) A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및PAP-S), 모모르디카 카란티아 (Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 사포린, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테세네스가 포함된다. 여러 방사성핵종을 방사능 접합된 항체의 제조에 이용할 수 있다. 예에는212Bi,131I,131In,90Y 및186Re가 포함된다.
다양한 이관능성 단백질 결합제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 접합체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14로 표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오디드를 항체에 결합시키는 전형적인 킬레이트제이다 (국제 공개 제94/11026호 참조).
또다른 실시양태로, 항체를 종양 예비표적화에 이용되는 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있는데, 여기서 항체-수용체 접합체를 환자에게투여한 다음, 킬레이트제를 사용하여 순환계로부터 결합하지 않은 접합체를 제거하고 세포독성제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
9.면역리포좀
본원에서 개시된 항체를 면역리포좀으로 제제화할 수도 있다. 이 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호)]에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 순환 시간이 증대된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 함유하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법으로 생성할 수 있다. 정해진 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 밀어내어 소정의 직경을 갖는 리포좀을 수득하였다. 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 접합시킬 수 있다. 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신 (Doxorubicin))은 임의로 리포좀내에 포함된다 (문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989)] 참조).
N.제약 조성물
암을 포함하는 각종 질환을 치료하기 위해, 본원에서 확인되어 증폭된 유전자에 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 기재된 스크리닝 분석에 의해 확인된 다른 분자를 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.
증폭된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 세포내에 있고 항체 전체가 억제제로 사용되는 경우, 내재화 항체가 바람직하다. 그러나, 또한 리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 항체 또는 항체 단편을 세포내에 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 억제성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 기초로 하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 지닌 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성하고(하거나) 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993)] 참조).
항체의 치료 제제는 저장을 위해, 원하는 순도를 갖는 항체를 임의의 약제학상 허용되는 담체, 부형체 또는 안정화제 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)]와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조하였다. 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도가 환자에 무독성이어야하며, 인산, 시트르산 및 기타 유기산의 완충액과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 방부제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 소수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 일당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터 이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및(또는) TWEEN(상표명), PLURONICS(상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 들 수 있다.
본 발명의 스크리닝 분석에 의해 확인된 비항체 화합물도 당업계에 공지된 표준 기술을 이용하여 유사한 방법으로 제제화할 수 있다.
또한, 본원의 제제는 치료할 특정 증상에 필요한 1 종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부작용을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물을 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 이 조성물은 세포독성제, 싸이토카인 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 배합된다.
활성 성분은 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에, 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)]에개시되어 있다.
체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
서방형 제제도 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이 매트릭스는 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 성형품 형태이다. 서방형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT(상표명) (락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출시킬 수 있지만, 어떤 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 장기간 체내에 남아있는 경우, 항체는 37 ℃에서 습기에 노출된 결과, 변성 또는 응집되어 생물학적 활성을 감소시키고 면역원성을 변화시킬 수 있다. 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자내 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액에서의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화시킬 수 있다.
O.치료 방법
본 발명의 항체 및 기타 항암 화합물을, 본원에서 확인되어 증폭된 유전자의 과다 발현 및(또는) 활성화의 특징을 갖는 질병을 포함한 다양한 질병의 치료에 사용할 수 있음을 고려할 수 있다. 이러한 항체 및 기타 화합물(작은 유기 및 무기 분자, 펩티드, 안티센스 분자 등을 포함하나 이에 제한되지 않음)로 치료되는 대표적인 질병 또는 질환에는 양성 또는 악성 종양(예를 들어, 신세포암, 간암, 신장암, 방광암, 유방암, 위암, 난소암, 결직장암, 전립선암, 췌장암, 폐암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종; 육종; 교모세포종; 및 다양한 두부 및 경부 종양); 백혈병 및 림프 악성종양; 신경 질환, 신경교 질환, 성상세포 질환, 시상하부 질환, 및 기타 분비선 질환, 대식세포성 질환, 상피성 질환, 간질성 (stromal) 질환 및 포배강성 질환; 및 면역성 질환, 혈관성 질환 및 면역성 질환이 포함된다.
본 발명의 항암제 (예를 들어, 항체)는 볼루스로서의 정맥내 투여, 또는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하내, 관절내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의한 장기간의 연속 관주와 같은 공지된 방법 의해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 항체의 정맥내 투여가 바람직하다.
다른 치료법이 본 발명의 항체와 같은 항암제의 투여와 병행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항암제로 치료되는 환자는 또한 방사선 치료를 받을 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 환자에게 화학요법제를 투여할 수 있다. 이러한 화학요법제의 제조 및 투여 일정은 제조자의 지시를 따르거나 당업계 전문 숙련인에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 이러한 화학요법제의 제조 및 투여 일정은 문헌[Chemotherapy Service Ed., M.C.Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기재되어 있다. 화학요법제는 항체와 같은 항암제의 투여 전 또는 후에 투여되거나, 동시에 투여될 수 있다. 타목시펜과 같은 항-에스트로겐 화합물 또는 오나프리스톤과 같은 항-프로게스테론 화합물 (EP 제616812호 참조)에 대해 공지된 투여량의 상기 분자와 항체를 조합하여 투여할 수 있다.
또한, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 혈관 내피 인자 (VEGF)에 결합하는 항체와 같은 기타 종양 관련 항체를 투여하는 것도 바람직하다. 별법으로, 또는 추가로, 본원에 개시된 동일하거나 2종 이상의 상이한 항원에 결합하는 2종 이상의 항체를 환자에 동시 투여할 수 있다. 때로는, 환자에게 1 종 이상의 싸이토카인을 투여하는 것도 유익할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원의 항체를 성장 억제제와 동시에 투여할 수 있다. 예를 들어, 우선 성장 억제제를 투여한 후에 본 발명의 항체를 투여할 수 있다. 그러나, 동시 투여나 본 발명의 항체를 먼저 투여하는 것도 고려할 수 있다. 성장 억제제의 적합한 투여량은 현재 사용되는 투여량이며, 성장 억제제와 본원 항체의 복합 작용(상승)으로 인하여 투여량을 낮출 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원의 항체와 같은 항암제의 적합한 투여량은 상기 정의한 바와 같이 치료되는 질환의 유형, 심각성 및 질환의 진행 과정, 투여되는 항암제가 예방 목적인지 치료 목적인지, 이전의 치료법, 환자의 임상 병력 및 약제에 대한 반응, 및 재량 및 주치의에 따라 달라질 것이다. 이 제제는 일시에 또는 일련의 치료를 통해 환자에 적합하게 투여된다.
예를 들어, 질환의 유형 및 심각성에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 내지 20 mg/kg)의 항체가 1회 이상의 분리된 투여 또는 연속 관주에 의한 환자에의 투여에 대한 초기 후보 투여량이다. 통상적인 일일 투여량은 상기 언급한 인자에 의존하여 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상이다. 증상에 따라 며칠 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 원하는 질환 징후가 억제될 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투여량이 효과적일 수도 있다. 이 치료법의 진행은 종래의 기술 및 분석법으로 용이하게 모니터할 수 있다.
P.제품
본 발명의 또다른 실시양태에서, 질환의 진단 또는 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 이 제품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기에는 증상의 진단 또는 치료에 효과적인 조성물이 들어 있으며, 멸균 채취구 (access port)가 있을 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥 주사액 백 (bag)이거나, 피하 주사기 바늘이 관통할 수 있는 마개가 달린 바이알일 수 있음). 상기 조성물의 활성 성분은 통상 본원에서 확인된 유전자 생성물의 활성을 방해할 수 있는 항암제, 예를 들어 항체이다. 용기 상 또는 용기에 부착된 라벨은 조성물이 선택된 증상의 진단 또는 치료에 사용된다는 것을 지시한다. 이 제품은 또한 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 제2의 용기를 더 포함할 수 있다. 이 제품은 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지침이 들어있는 포장 삽입물을 포함하는, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 재료를 추가로 포함할 수 있다.
Q.종양의 진단 및 예후
특정 종양에서 과다 발현되는 성장 수용체와 같은 세포 표면 단백질은 약물 후보 또는 종양 (예를 들어, 암) 치료에 대한 훌륭한 표적인 반면, 상기 단백질은 종양 세포에서 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 분비 단백질과 함께 종양의 진단 및 예후에 부가적인 용도를 나타낸다. 예를 들어, 종양 세포에서 증폭된 유전자의 단백질 생성물에 대한 항체는 종양 진단제 또는 예후제로서 사용할 수 있다.
예를 들어, 항체 단편을 포함하는 항체는 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 단백질 ("마커 유전자 생성물")의 발현을 정성 또는 정량 검출하는데 사용할 수 있다. 항체는 형광 표지와 같이 검출 가능한 표지물이 부착되어 있는 것이 바람직하며, 항체의 결합은 광학 현미경법, 유동 세포 분석법, 형광법, 또는 당업계에 공지된 다른 기술에 의해 모니터할 수 있다. 이 기술은, 증폭된 유전자가 성장 인자와 같은 세포 표면 단백질을 코딩하는 경우에 특히 적합하다. 이러한 결합 분석법은 상기 5 단락에 기재된 바와 같이 수행된다.
마커 유전자 생성물에 대한 항체 결합의 계내 (in situ) 검출은 예를 들어 면역형광현미경법 또는 면역전자현미경법으로 수행할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 환자로부터 조직학적 시료를 분리하여, 바람직하게는 상기 생물학적 샘플에 항체를 올려놓음으로써 표지된 항체를 반응시킨다. 또한, 이 방법은 조사하는 조직에서 마커 유전자 생성물의 분포를 결정하게 해준다. 계내 검출에 다양한 조직학적 방법을 용이하게 사용할 수 있음은 당업자들에게 명백할 것이다.
하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다.
<실시예>
실시예에서 언급한 시판 시약들은 달리 지시하지 않는 한 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 명세서 전반에서 ATCC 기탁 번호로 확인되는 세포들의 입수원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불바드 10801 소재)이다. 본 출원에 대한 모든 원기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 (부다페스트 조약의) 규칙의 규정하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시 (이 중 먼저인 때) 일반인에게 기탁물의 배양 프로제니를 영구적이고 비제한적으로 분양함을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장이 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙 (37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 자격이 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.
달리 언급이 없는 한, 본 발명은 상기 및 문헌 [Sambrook et al., MolecularCloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y., 1990; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R. I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; 및 Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991]에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 기술의 표준 방법을 이용한다.
실시예 1: 신규 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 cDNA를 동정하기 위한 세포외 도메인 상동성 스크리닝
스위스-프롯 (Swiss-Prot) 공개 데이타베이스로부터 약 950 개의 공지된 분비 단백질로부터의 세포외 도메인 (ECD) 서열 (분비 신호 서열이 존재하는 경우에는 이를 포함함)을 사용하여 EST 데이타베이스를 검색하였다. EST 데이타베이스에는 공개 데이타베이스 (예를 들면, 데이호프 (Dayhoff), 진뱅크 (GenBank))와 비공개 데이타베이스 (예를 들면, LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈 (Incyte Pharmaceuticals))를 포함시켰다. EST 서열의 6개 프레임 번역물과 ECD 단백질 서열의 비교 검색은 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST-2 [Altschul et al.,Methods in Enzymology266: 460-480 (1996)]를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 어떤 경우 90) 이상의 BLAST 스코어를 나타내는 비교물을 클러스터하고, 프로그램 "phrap" (Phil Green,University of Washington, 미국 워싱턴주 시애틀 소재)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다.
상기 세포외 도메인 상동성 스크리닝을 이용하여, 컨센서스 DNA 서열을 phrap을 사용하여 확인된 다른 EST 서열에 대해 어셈블리하였다. 또한, 수득된 컨센서스 DNA 서열을 종종 (항상은 아니지만) 상기 논의한 EST 서열원을 사용하여 가능한 한 컨센서스 서열을 연장시키기 위해 BLAST 또는 BLAST-2와 phrap의 반복 사이클을 이용하여 이 컨센서스 서열을 연장시켰다.
이어서, 상기한 바와 같이 수득된 컨센서스 서열을 기초로 올리고뉴클레오티드를 합성하여, PCR에 의해 목적 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 동정하는데 사용하고 PRO 폴리펩티드에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로 사용하였다. 정방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30개 뉴클레오티드 범위이고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하도록 설계한다. 프로브 서열의 길이는 통상적으로 40 내지 55 bp이다. 경우에 따라, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 큰 경우 추가의 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 전장 클론을 위해 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 라이브러리 DNA를 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology)에 따라 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 사용하였다.
cDNA 클론을 단리하는데 사용한 cDNA 라이브러리는 시판 시약, 예를 들어 인비트로젠 (Invitrogen, San Diego, CA)사에서 구입한 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. NotI 부위를 포함한 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, 헤미키나제 처리된 SalI 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기에 따라 적절하게 분류하고, 적합한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조) 내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
실시예 2: 신호 연산법 분석을 이용한 cDNA 클론의 단리
제넨테크, 인크 (Genentech, Inc., 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재)사에서 개발한 독점적인 신호 서열 검색 연산법을 사용하여, 공개 (예를 들어, 진뱅크) 및(또는) 비공개 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈) 데이타베이스로부터의 EST 및 클러스터되고 어셈블리된 EST 단편에서 다양한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 확인하였다. 신호 서열 연산법은 고려 대상의 서열 또는 서열 단편의 5'-말단에서 첫번째 및 임의로 두번째 메티오닌 코돈 (ATG) 주변의 DNA 뉴클레오티드의 특성을 토대로 분비 신호 점수를 계산하였다. 첫번째 ATG 다음의 뉴클레오티드는 어떠한 정지 코돈도 없이 35개 이상의 분명한 아미노산을 코딩해야 한다. 첫번째 ATG가 필요한 아미노산을 갖는 경우, 두번째 ATG는 조사하지 않았다. 상기 두가지 요건을 모두 충족시키지 못하는 경우, 후보 서열의 점수는 계산하지 않았다. EST 서열이 분명한 신호 서열을 포함하는지를 결정하기 위해, 분비 신호와 관련된 것으로 알려진 7개의 센서 (평가파라미터) 한 세트를 사용하여 이 DNA 및 ATG 코돈 주변의 아미노산 서열의 점수를 매겼다. 이 연산법을 사용하여 많은 폴리펩티드-코딩 핵산 서열을 확인하였다.
실시예 3: 인간 PRO197을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
PRO197은 컴퓨터 프로그램 BLAST [Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]를 진뱅크 데이타베이스를 스크리닝하여 확인하였다. PRO197 서열은 공지된 EST 서열 T08223, AA122061 및 M62990과 상동성을 나타내었다. 공지된 EST 서열에서 전장 서열로 확인되지 않았으며, TIE 수용체와 관련된 리간드로 기재되어 있지 않았다. 확인한 후에 클론테크사 (Clontech, Inc, 미국 캘리포니아 팔로 알토 소재, 제품 번호 #6528-1)에서 구입한 mRNA로 제조사의 지시에 따라 제조된 인간 태아 폐 라이브러리로부터 PRO197을 클로닝하였다. 라이브러리는 합성 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화에 의해 스크리닝하였다.
진뱅크 데이타베이스에서 확인된 EST를 기초로 하여, 다음의 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하였다.
5'-ATGAGGTGGCCAAGCCTGCCCGAAGAAAGAGGC-3' (서열번호 71)
5'-CAACTGGCTGGGCCATCTCGGGCAGCCTCTTTCTTCGGG-3' (서열번호 72)
5'-CCCAGCCAGAACTCGCCGTGGGGA-3' (서열번호 73)
cDNA 클론을 동정하여 전체를 서열분석하였다. DNA22780-1078의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 1 (서열번호 1)에 나타낸다. 클론 DNA22780-1078은 뉴클레오티드 위치 23 내지 25의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1382 내지 1384의 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 1, 서열번호 1). 예상된폴리펩티드 전구체는 아미노산 553개 길이이다. 전장 PRO197 단백질을 도 2 (서열번호 2)에 나타낸다.
도 2 (서열번호 2)에 나타낸 전장 PRO197 서열 분석은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 2에 나타낸 전장 PRO197 서열 분석은 약 아미노산 51 내지 약 아미노산 70의 막횡단 도메인; 약 아미노산 224 내지 약 아미노산 228의 N-글리코실화 부위 ; 약 아미노산 46 내지 약 아미노산 50 및 약 아미노산 118 내지 약 아미노산 122의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위; 약 아미노산 50 내지 약 아미노산 56, 약 아미노산 129 내지 약 아미노산 135, 약 아미노산 341 내지 약 아미노산 347, 및 약 아미노산 357 내지 약 아미노산 363의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 396 내지 약 아미노산 409의 피브리노겐 베타 및 감마쇄 C-말단 도메인 특징 부위의 존재를 입증한다.
클론 DNA22780-1078은 1997년 9월 18일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209284를 배정받았다. 기탁된 클론은 본원에서 제공된 대표물이 아닌 실제 정확한 서열을 갖는 것으로 이해된다.
도 (서열번호 2)에 나타낸 전장 서열의 ALIGN-2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 (Dayhoff) 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO197 아미노산 서열과 TIE 수용체 관련 리간드 사이의 상동성을 입증한다. TIE는 Ig 및 EGF 상동성 도메인을 함유하는 티로신 키나제 (tyrosine kinase containingIg andEGF homology domains)를 나타내는 약자이며 수용체 티로신 키나제의 신규 족 (family)을 지칭하기 위해 만들어졌다.
실시예 4: 인간 PRO207을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
발현 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈)를 검색하여, 인간 아포-2 리간드에 상동성을 나타내는 EST를 확인하였다. 이어서, 인간 태아 신장 태아 신장 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 인간 태아 신장 조직에서 단리된 mRNA (클론테크 (Clontech))를 사용하여 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 이 mRNA를 사용하여 pRK5D 벡터 내에 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 라이프 테크놀로지 (Life Technologies, 미국 메릴랜드주 게터스버그 소재)사에서 구입한 시약 및 방법 (Super Script Plasmid System)을 사용하여 제조하였다. 이 방법에서, 이중 가닥 cDNA는 1000 bp보다 크게 만들고, SalII/NotI 링커가 연결된 cDNA 클론을 XhoI/NotI로 절단된 벡터에 클로닝하였다. pRK5D는 sp6 전사 개시 부위, SfiI 제한 부위 및 XhoI/NotI 클로닝 부위를 순서대로 포함하는 벡터이다. 라이브러리는 EST를 기초로 한 하기 합성 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화시켜 스크리닝하였다.
5'-CCAGCCCTCTGCGCTACAACCGCCAGATCGGGGAGTTTATAGTCACCCGG-3' (서열번호 74)
cDNA 클론 전체를 서열 분석하였다. 전장 DNA30879-1152의 뉴클레오티드 서열은 도 3 (서열번호 3)에 나타낸다. 클론 DNA30879-1152는 뉴클레오티드 위치 58 내지 60의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 805 내지 807의 분명한 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 3, 서열번호 3). 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 249개 길이이다.
도 4 (서열번호 4)에 나타낸 전장 PRO207 서열 분석은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 4에 나타낸 전장 PRO207 서열의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 40의 신호 펩티드; 약 아미노산 139 내지 약 아미노산 143의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 27 내지 약 아미노산 33, 약 아미노산 29 내지 약 아미노산 35, 약 아미노산 36 내지 약 아미노산 42, 약 아미노산 45 내지 약 아미노산 51, 약 아미노산 118 내지 약 아미노산 124, 약 아미노산 121 내지 약 아미노산 127, 약 아미노산 125 내지 약 아미노산 131, 및 약 아미노산 128 내지 약 아미노산 134의 N-미리스토일화 부위 ; 약 아미노산 10 내지 약 아미노산 14 및 약 아미노산 97 내지 약 아미노산 101의 아미드화 부위; 및 약 아미노산 24 내지 약 아미노산 35의 원핵막 지단백질 지질 부착 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA30879-1152는 1997년 10월 10일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209358을 배정받았다.
도 4 (서열번호 4)에 나타낸 전장 PRO207 서열의 (ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용한) BLAST 및 FastA 서열 정렬 분석을 기초로 하여 PRO207이 여러가지 CNF 사이토카인 족, 특히 인간 림프독소 베타 (23.4%) 및 인간 CD40 리간드 (19.8%)와 아미노산 서열 동일성을 나타낸다.
실시예 5: 인간 PRO226을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 phrap을 이용하여 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 어셈블리하였다. 이렇게 어셈블리한 EGF 유사 상동체를 코딩하는 컨센서스 서열은 본원에서 DNA28744로 지칭한다. DNA28744 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하고, 2) PRO226의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머 (정방향 및 역방향)를 합성하였다.
정방향 PCR 프라이머 (28744.f) ( OLI 556):
5'-ATTCTGCGTGAACACTGAGGGC-3' (서열번호 75)
역방향 PCR 프라이머 (28744.r) ( OLI 557):
5'-ATCTGCTTGTAGCCCTCGGCAC-3' (서열번호 76)
또한, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA28744 컨센서스 서열로부터 제조하였다.
혼성화 프로브 (28744.p) ( OLI 555):
5'-CCTGGCTATCAGCAGGTGGGCTCCAAGTGTCTCGATGTGGATGAGTGTGA-3' (서열번호 77)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 여러가지 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머들 중 하나로 PRO226 유전자를 코딩하는 클론을 단리하였다. cDNA 라이브러리 제조하기 위한 RNA를 인간 태아 폐 조직으로부터 단리하였다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 서열을 분석하여 DNA33460-1166 (도 5, 서열번호 5)의 전장 DNA 및 이로부터 유도된 PRO226의 단백질 서열을 수득하였다.
DNA33460-1166의 전체 코딩 서열은 도 5 (서열번호 5)에 포함되어 있다. 클론 DNA33460-1166은 뉴클레오티드 위치 62 내지 64의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1391 내지 1393의 분명한 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 443개 길이이다. 도 6 (서열번호 6)에 나타낸 전장 PRO226 서열 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 6에 나타낸 전장 PRO226 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 25의 신호 펩티드; 약 아미노산 198 내지 약 아미노산 202 및 약 아미노산 394 내지 약 아미노산 398의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 76 내지 약 아미노산 82, 약 아미노산 145 내지 약 아미노산 151, 약 아미노산 182 내지 약 아미노산 188, 약 아미노산 222 내지 약 아미노산 228, 약 아미노산 290 내지 약 아미노산 296, 약 아미노산 305 내지 약 아미노산 311, 약 아미노산 371 내지 약 아미노산 377 및 약 아미노산 381 내지 약 아미노산 387의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 140 내지 약 아미노산 152, 약 아미노산 177 내지 약 아미노산 189, 약 아미노산 217 내지 약 아미노산 229, 및 약 아미노산 258 내지 약 아미노산 270의 아스파르트산 및 아스파라긴 히드록실화 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA33460-1166은 1997년 10월 16일에 ATCC에 기탁하여, ATCC 기탁 번호 209376을 배정받았다.
도 6 (서열번호 6)에 나타낸 전장 PRO226 서열의 BLAST 및 FastA 서열 정렬 분석을 기초로 하여, EGF-유사 동족체 DNA33460-1166은 HT 단백질 및(또는) 피불린과 아미노산 서열 동일성 (각각, 49% 및 38%)을 나타낸다.
실시예 6: 인간 PRO232 을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 phrap을 이용하여 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 어셈블리하였다. 이렇게 어셈블리한 EGF 유사 상동체를 코딩하는 컨센서스 서열은 본원에서 DNA30935로 지칭하며, 폴리펩티드는 1종 이상의 간상세포 (stem cell) 항원과 유사성을 보였다. DNA30935 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하고, 2) PRO232의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머 (정방향 및 역방향)를 합성하였다.
정방향 PCR 프라이머 :
5'-TGCTGTGCTACTCCTGCAAAGCCC-3' (서열번호 78)
역방향 PCR 프라이머 :
5'-TGCACAAGTCGGTGTCACAGCACG-3' (서열번호 79)
또한, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA30935 컨센서스 서열로부터 제조하였다.
혼성화 프로브 :
5'-AGCAACGAGGACTGCCTGCAGGTGGAGAACTGCACCCAGCTGGG-3' (서열번호 80)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 몇 개의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머들 중 하나를 사용하여 PRO232 유전자를 코딩하는 클론을 단리하였다. cDNA 라이브러리 제조하기 위한 RNA를 인간 태아 신장 조직으로부터 단리하였다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 서열을 분석하여 DNA34435-1140 (도 7, 서열번호 7)의 전장 DNA 및 이로부터 유도된 PRO232의 단백질 서열을 수득하였다.
DNA34435-1140의 전체 코딩 서열은 도 7 (서열번호 7)에 포함되어 있다. 클론 DNA34435-1140은 뉴클레오티드 위치 359 내지 361의 분명한 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 119개 길이이다. 도 8 (서열번호 8)에 나타낸 전장 PRO232 서열의 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 8에 나타낸 전장 PRO232 폴리펩티드의 전체 코딩 서열은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 16의 신호 펩티드; 약 아미노산 36 내지 약 아미노산 40, 약 아미노산 79 내지 약 아미노산 83, 및 약 아미노산 89 내지 약 아미노산 93의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 61 내지 약 아미노산 67의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 75 내지 약 아미노산 79의 아미드화 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA34435-1140은 1997년 9월 16일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209250을 배정받았다.
도 8 (서열번호 8)에 나타낸 전장 PRO232의 분석은 PRO232가 닭 (Gallus gallus)의 간상 세포의 표면 항체와 35% 서열 동일성을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 7 : 게놈 워킹에 의한 인간 PRO243을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
서론:
인간 트롬보포이에틴 (THPO)은 2개의 도메인으로 이루어진 352 아미노산의 글리코실화된 호르몬이다. 에리트로포이에틴과 50% 유사성을 공유하는 N-말단 도메인이 생물학적 활성에 기능을 한다. C-말단 영역은 분비에 필요하다. 트롬보포이에틴 (THPO) 유전자는 인간 염색체 3q27-q28에 맵핑되었으며, 이 유전자의 6개의 엑손은 게놈 DNA의 7 kb 염기쌍에 이른다 [Gurneyet al .,Blood,85:981-988 (1995)]. THPO에 매우 인접하게 위치한 THPO 상동체를 코딩하는 임의의 유전자가 존재하는 지를 결정하기 위해서 이 영역의 게놈 DNA 단편을 동정하여 서열분석하였다. THPO 유전자좌를 포함하는 3개의 P1 클론 및 1개의 PAC 클론 (Genome Systems, Inc., 미국 미저리주 세이트 루이스 소재; 제품 번호 P1-2535 및 PAC-6539)를 단리하고 140 kb 영역은 정렬 샷건 방법 (ordered shotgun strategy) [Chenet al . Genomics,17:651-656 (1993)]을 이용하여 서열분석하고, PCR에 기초한 갭 필링 (gap filling) 접근법과 결합하였다. 분석은 상기 영역이 THPO에 매우 인접하게 위치한 4개의 추가 유전자, 즉 종양 괴사 인자 수용체 타입 1 관련 단백질 2 (TRAP2) 및 신장 개시 인자 감마 (e1F4g), 염소 채널 2 (CLCN2) 및 RNA 폴리머라제 II 서브유닛 hRPB17이 존재하는 유전자 풍부 영역임을 밝혔다. 이 영역에서 THPO 동족체는 발견되지 않았지만, 컴퓨터 보조 유전자 검출법 (GRAIL) [Xuet al ., Gen. Engin .,16:241-253 (1994)], CpG 아일랜드 (islands)의 존재 [Cross, S. 및 Bird, A.,Curr . Opin . Genet . & Devel .,5:109-314 (1995)], 및 공지된 유전자에 대한 상동성 (WU-BLAST2.0에 의해 발견됨) [Altschul and Gish,Methods Enzymol .,266:460-480 (1996)]으로 4개의 신규 유전자를 추정하였다.
방법:
P1 및 PAC 클론:
최초 인간 P1 클론을 THPO 게놈 서열 [A. L. Gurney,et al .,Blood,85:981-988 (1995)]로부터 설계한 PCR 프라이머를 사용하여 P1 게놈 라이브러리 (Genome Systems, Inc., 미국 미저리주 세인트 루이스 소재, 제품 번호 P1-2535)로부터 단리하였다. PCR 프라이머를 P1 클론에서 유래한 말단 서열로부터 설계한 후 이것을 사용하여 P1 및 PAC 라이브러리 (Genome Systems, 제품 번호 P1-2535 & PAC-6539)를 스크리닝하여 중첩되는 클론을 동정하였다.
정렬 샷건 방법:
정렬 샷건 방법 (OSS) [Chenet al ., Genomics,17:651-656 (1993)]은 계층적 접근법으로 거대한 게놈 DNA 클론의 지도작성 및 서열 분석을 수반한다. P1 또는 PAC 클론을 초음파 분쇄하여 단편을 람다 벡터 (λBluestar) (Novagen, Inc., 미국 위스콘신주 소재, 제품 번호. 69242-3)에 서브클로닝하였다. 람다 서브클론 삽입물을 광범위 (long-range) PCR [Barnes, W.,Proc. Natl . Acad . Sci . USA,91:2216-2220 (1994)]에 의해 단리하고 말단을 서열분석하였다. 람다 말단 서열을 중첩시켜 최초 클론의 부분 지도를 제작하였다. 겹쳐진 말단 서열을 갖는 람다 클론을 동정하고, 삽입물을 플라스미드 벡터 (pUC9 또는 pUC18)에 서브클로닝하고 플라스미드 서브클론 말단을 서열분석하고 어셈블리하여 인접한 서열을 생성하였다. 이렇게 지정된 서열 분석 방법은 관심 영역을 스캐닝하고 집중시키면서 반복성에 대한 요구를 최소화한다.
THPO 유전자좌을 더 잘 동정하고 헤마토포이에틴 족과 관련된 다른 유전자를 동정하기 위해서, 4개의 게놈 클론을 인간 P1 및 PAC 라이브러리 (Genome System, Inc., 제품 번호. P1-2535 및 PAC-6539)를 PCR 스크리닝함으로써 상기 영역으로부터 단리하였다. 게놈 단편의 크기는 P1.t가 40 kb이고, P1.g가 70 kb이고, P1.u가 70 kb이고, PAC.z가 200 kb였다. 200 kb의 게놈 DNA 영역의 약 80%를 정렬 샷건 방법 (OSS) [Chenet al., Genomics,17:651-56 (1993)]으로 서열분석하고 오토어셈블러 (AutoAssemblerTM)(Applied Biosystems, Perkin Elmer, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재, 제품 번호. 903227)를 이용하여 컨티그 (contig)로 어셈블리하였다. 이들 컨티그의 순서를 수동 분석으로 미리 결정하였다. 46개의 컨티그가 있었으며 갭 필링을 이용하였다. 표 4에 갭의 수와 크기를 요약하였다.
140 kb 영역 내의 갭에 대한 요약
갭의 크기 수
< 50 bp 13
50 - 150 bp 7
150 - 300 bp 7
300 - 1000 bp 10
1000 - 5000 bp 7
> 5000 bp 2 (~15,000 bp)
DNA 서열분석:
ABI DYE-primerTMchemistry (PE Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재, 제품 번호. 402112)를 사용하여 람다 말단 및 플라스미드 서브클론 말단을 서열 분석하였다. ABI DYE-terminatorTM chemistry (PE Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재, 제품 번호. 403044)를 사용하여 각각의 PCR 프라이머를 사용하여 PCR 생성물을 서열분석하였다. 서열을 ABI377기로 수집하였다. 1 kb보다 큰 PCR 생성물의 경우, 워킹 프라이머를 사용하였다. 오토어셈블러 (AutoAssemblerTM) (PE Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재, 제품 번호. 903227)의 OSS 방법에 의해 생성된 컨티그의 서열 및 갭-필링 서열분석 추적 파일은 중첩 및 편집을 위해 시퀀셔 (SequencherTM)(Gene Codes Corp., 미국 미시건주 앤 아버 소재)로 보냈다.
PCR 에 기초한 갭 필링 방법:
각 컨티그의 5'-말단 및 3'-말단 서열을 기초로 하여 반복적이고 불량한 서열 영역을 피하여 프라이머를 설계하였다. 모든 프라이머는 50% 내지 70% G/C 함량을 갖는 19 내지 24개의 올리고머로 설계하였다. 올리고머를 합성하여 표준 방법에 의해 겔 정제하였다.
컨티그의 방향 및 순서를 알지 못하기 때문에 과돌연변이 프라이머를 증폭 반응에 사용하였다. 2가지 PCR 키트를 사용하였다. 하나는 신장 시간이 약 10분인 XL PCR 키트 (Perkin Elmer, 미국 커네티컷 노르워크 소재, 제품 번호. N8080205)이고, 다른 하나는 Taq 폴리머라제 PCR 키트 (Qiagen, Inc., 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재, 제품 번호. 201223)로 XL PCR 키트를 사용하여 PCR 생성물이 구분되지 않거나 여러개의 PCR 생성물이 관찰되는 경우에 고엄격도 조건하에서 사용하였다. 성공적인 각 반응의 주요 PCR 생성물을 0.9% 저융점 아가로스 겔로 추출하고 진클린 (Geneclean) DNA 정제 키트로 정제하고 서열분석하였다.
분석:
코딩 영역을 다음과 같이 확인하고 특성조사하였다. 첫째로, 반복 인자 라이브러리에 대해 FastA 포맷의 DNA 서열을 스크리닝하고 마스킹한 질의 서열을 복구시키는 리피트마스커 (RepeatMasker) (A.F.A. Smit & P.Green,http://ftp.genome.washington.edu/RM/RM_details.ht ㎖)를 사용하여 반복서열을 마스킹하였다. 마스킹되지 않은 반복체를 WUBLAST [Altschul, S. & Gish, W.,Methods Enzymol .,266:460-480 (1996)]를 이용하여 진뱅크 데이타베이스와 서열을 비교하여 동정하고 수동으로 마스킹하였다.
다음으로, 공지된 유전자를 WUBLAST2.0 연산법을 이용하여 제넨테크사의 단백질 데이타베이스와 게놈 영역을 비교하여 확인한 후 니들만-운치 (Needleman-Wunsch [Needleman and Wunsch,J. Mol . Biol ., 48:443-453 (1970)] 연산법을 이용하여 각 유전자의 게놈 및 cDNA 서열을 각각 정렬함으로써 주석을 첨가하여 서열들 사이에 부분적으로 동일성을 갖는 영역 (그외 영역은 크게 상이함)을 찾아내었다. 그 결과 영역 내에서 공지된 5개의 유전자, 즉 THPO, TRAP2, e1F4g, CLCN2 및 hRPB17의 모든 엑손을 발견하였다 (표 5).
분석한 140 kb 영역 내에 위치한 공지된 유전자에 대한 요약
공지된 유전자 지도상 위치
진핵 번역 개시 인자 4 감마 3q27-qter
트롬보포이에틴 3q26-q27
염소 채널 2 3q26-qter
TNF 수용체 관련 단백질 2 이전에 지도화되지 않음
RNA 폴리머라제 II 서브유닛 hRPB17 이전에 지도화되지 않음
마지막으로, 여러가지 방법을 이용하여 신규 전사 단위를 예측하였다. CpG 아일랜드 [S. Cross & Bird, A.,Curr . Opin . Genet . Dev .,5:109-314 (1995)]를 사용하여 프로모터 영역을 정하고 GC가 풍부한 6 또는 8 올리고머의 팔린드롬 서열을 인지하는 효소로 절단된 부위의 클러스트임을 확인하였다. 짧은 게놈 영역 (10 내지 20 kb)와 진뱅크의 WUBLAST2.0 분석으로 EST와 일치되는 부분을 밝혔다. 각 EST 서열 (또는 가능한 경우 이들의 서열 크로마토그램 파일)을 검색하여 시퀀셔 (Sequencher)로 어셈블리하여 이론상의 cDNA 서열 (DNA34415)을 제공하였다. GRAIL2 (ApoCom, Inc., 미국 테네시주 녹스빌 소재, DEC 알파의 명령어 라인 버전)을 이용하여 신규 엑손을 추정하였다. 영역 내의 5개의 공지된 유전자는 GRAIL 연산법 결과의 내부 콘트롤로 사용하였다.
단리:
코르딘 cDNA 클론을 올리고-dT-프라이밍된 인간 태아 폐 라이브러리로부터 단리하였다. 인간 태아 폐의 폴리A+RNA는 클론테크사 (cat#6528-1, lot#43777)에서 구입하여 5 mg을 pRK5B의 cDNA 라이브러리 (제넨테크, LIB26) 제작에 사용하였다.
3'-프라이머:
pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT (서열번호 81)
및 5'-링커:
pCGGACGCGTGGGGCCTGCGCACCCAGCT (서열번호 82)
는 SalI 및 NotI 제한부위를 도입하도록 설계하였다. 클론을 제안된 유전자의 게놈 엑손과 수동 스플라이싱으로 추정한 인간 코르딘 cDNA 가능 서열 (DNA34415)로부터 설계한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 스크리닝하였다. 프로브에 인접한 PCR 프라이머를 사용하여 cDNA 클론의 존재를 확인하고 서열분석하였다.
스크리닝 올리고뉴클레오티드 프로브는 다음과 같고,
OLI5640 34415.p1:
5'-GCCGCTCCCCGAACGGGCAGCGGCTCCTTCTCAGAA-3' (서열번호 83)
OLI5642 34415.p2:
5'-GGCGCACAGCACGCAGCGCATCACCCCGAATGGCTC-3' (서열번호 84)
인접 프로브로는 다음을 사용하였다.
OLI5639 34415.f1:
5'-GTGCTGCCCATCCGTTCTGAGAAGGA-3' (서열번호 85)
OLI5643 34415.r:
5'-GCAGGGTGCTCAAACAGGACAC-3' (서열번호 86)
DNA-35917-1207의 전체 코딩 서열은 도 9 (서열번호 9)에 포함되어 있다. 클론 DNA35917-1207은 뉴클레오티드 위치 137 내지 139의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 2999 내지 3001의 분명한 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 954개 길이이다. 도 10 (서열번호 10)에 나타낸 전장 PRO243 서열의 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 10에 나타낸 전장 PRO243 폴리펩티드의분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 23의 신호 펩티드; 약 아미노산 217 내지 약 아미노산 221, 약 아미노산 351 내지 약 아미노산 355, 약 아미노산 365 내지 약 아미노산 369, 및 약 아미노산 434 내지 약 아미노산 438의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 145 내지 약 아미노산 153 및 약 아미노산 778 내지 약 아미노산 786의 티로신 키나제 인산화 부위; 약 아미노산 20 내지 약 아미노산 26, 약 아미노산 47 내지 약 아미노산 53, 약 아미노산 50 내지 약 아미노산 56, 약 아미노산 69 내지 약 아미노산 75, 약 아미노산 73 내지 약 아미노산 79, 약 아미노산 232 내지 약 아미노산 238, 약 아미노산 236 내지 약 아미노산 242, 약 아미노산 390 내지 약 아미노산 396, 약 아미노산 422 내지 약 아미노산 428, 약 아미노산 473 내지 약 아미노산 479, 약 아미노산 477 내지 약 아미노산 483, 약 아미노산 483 내지 약 아미노산 489, 약 아미노산 489 내지 약 아미노산 495, 약 아미노산 573 내지 약 아미노산 579, 약 아미노산 576 내지 약 아미노산 582, 약 아미노산 580 내지 약 아미노산 586, 약 아미노산 635 내지 약 아미노산 641, 약 아미노산 670 내지 약 아미노산 676, 약 아미노산 773 내지 약 아미노산 779, 약 아미노산 807 내지 약 아미노산 813, 약 아미노산 871 내지 약 아미노산 877, 및 약 아미노산 905 내지 약 아미노산 911의 N-미리스토일화 부위; 약 아미노산 87 내지 약 아미노산 91의 아미드화 부위; 약 아미노산 165 내지 약 아미노산 168의 세포 부착 서열; 및 약 아미노산 315 내지 약 아미노산 337의 루이신 지퍼 형태의 존재를 입증한다. 클론 DNA35917-1207은 1997년 9월 3일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209508을 배정받았다. 도 10에 나타낸 전장 PRO243 단백질의 추정 분자량은 약 101,960 달톤이고 추정 pI는 약 8.21이다.
실시예 8: 인간 PRO256을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 phrap을 이용하여 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 어셈블리하였다. 이렇게 어셈블리한 컨센서스 서열은 본원에서 DNA28725로 지칭한다. DNA28725 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하고, 2) PRO256의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
1쌍의 PCR 프라이머 (정방향 및 역방향)를 합성하였다:
정방향 PCR 프라이머 :
5'-TGTCCACCAAGCAGACAGAAG-3' (서열번호 87)
역방향 PCR 프라이머 :
5'-ACTGGATGGCGCCTTTCCATG-3' (서열번호 88)
또한, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA28725 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브 :
5'-CTGACAGTGACTAGCTCAGACCACCCAGAGGACACGGCCAACGTCACAGT-3' (서열번호 89)
5'-GGGCTCTTTCCCACGCTGGTACTATGACCCCACGGAGCAGATCTG-3' (서열번호 90)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 여러가지 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드및 PCR프라이머들 중 하나로 PRO256 유전자를 코딩하는 클론을 단리하였다.
cDNA 라이브러리 제조하기 위한 RNA를 인간 태반 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하는데 사용한 cDNA 라이브러리는 시판 시약, 예를 들어 인비트로젠 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)사에서 구입한 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. NotI 부위를 포함한 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, 헤미키나제 처리된 SalI 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기에 따라 적절하게 분류하고, 적합한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조) 내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기한 바와 같이 단리된 클론을 서열분석하여 DNA35880-1160 (도 11, 서열번호 11)로 지칭된 DNA256의 전장 DNA 서열 및 이로부터 유도된 PRO256의 단백질 서열을 수득하였다.
DNA35880-1160의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 11 (서열번호 11)에 나타내었다. 클론 DNA35880-1160은 뉴클레오티드 위치 188 내지 190의 분명한 번역 개시 부위를 가지며 뉴클레오티드 위치 1775 내지 1777의 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 529개 길이이다 (도 12). 도 12 (서열번호 12)에 나타낸 전장 PRO256 서열 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 12에 나타낸 전장 PRO256 폴리펩티드의분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 35의 신호 펩티드; 약 아미노산 466 내지 약 아미노산 483의 막횡단 도메인; 약 아미노산 66 내지 약 아미노산 70, 약 아미노산 235 내지 약 아미노산 239, 및 약 아미노산 523 내지 약 아미노산 527의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 29 내지 약 아미노산 35, 약 아미노산 43 내지 약 아미노산 49, 약 아미노산 161 내지 약 아미노산 167, 약 아미노산 212 내지 약 아미노산 218, 약 아미노산 281 내지 약 아미노산 287, 약 아미노산 282 내지 약 아미노산 288, 약 아미노산 285 내지 약 아미노산 291, 약 아미노산 310 내지 약 아미노산 316, 약 아미노산 313 내지 약 아미노산 319, 약 아미노산 422 내지 약 아미노산 428, 약 아미노산 423 내지 약 아미노산 429, 및 약 아미노산 426 내지 약 아미노산 432의 N-미리스토일화 부위; 약 아미노산 193 내지 약 아미노산 199의 세포 부착 서열; 약 아미노산 278 내지 약 아미노산 298 및 약 아미노산 419 내지 약 아미노산 438의 췌장 트립신 억제제 (쿠니츠 (Kunitz) 족 특징 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA35880-1160은 1997년 10월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209379를 배정받았다.
전장 PRO256 폴리펩티드의 아미노산 서열의 분석은 그 일부분이 인간 비쿠닌 단백질과 상당한 상동성을 갖는다는 것을 보여줌으로써 PRO256이 신규 프로테이나제 억제제일 수 있음을 나타낸다.
실시예 9: 인간 PRO269를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 phrap을 이용하여 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 어셈블리하였다. 컨센서스 서열은 본원에서 DNA35705로 지칭한다. 어셈블리한 DNA35705 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하고, 2) PRO269의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
다음 PCR 프라이머 (정방향 및 2개의 역방향)를 합성하였다:
정방향 PCR 프라이머 1:
5'-TGGAAGGAGATGCGATGCCACCTG-3' (서열번호 91)
정방향 PCR 프라이머 2:
5'-TGACCAGTGGGGAAGGACAG-3' (서열번호 92)
정방향 PCR 프라이머 3:
5'-ACAGAGCAGAGGGTGCCTTG-3' (서열번호 93)
역방향 PCR 프라이머 1
5'-TCAGGGACAAGTGGTGTCTCTCCC-3' (서열번호 94)
역방향 PCR 프라이머 2:
5'-TCAGGGAAGGAGTGTGCAGTTCTG-3' (서열번호 95)
또한, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 다음과 같은 DNA35705 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브 :
5'-ACAGCTCCCGATCTCAGTTACTTGCATCGCGGACGAAATCGGCGCTCGCT-3' (서열번호 96)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 여러가지 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드및 PCR 프라이머들 중 하나로 PRO269 유전자를 코딩하는 클론을 단리하였다. cDNA 라이브러리 제조하기 위한 RNA를 인간 태아 신장 조직으로부터 단리하였다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 서열을 분석하여 DNA38260-1180 (도 13, 서열번호 13)의 전장 DNA 및 이로부터 유도된 PRO269의 단백질 서열을 수득하였다. DNA38260-1180의 전체 코딩 서열은 도 13 (서열번호 13)에 포함되어 있다. 클론 DNA38260-1180은 뉴클레오티드 위치 314 내지 316의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1784 내지 1786의 분명한 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 분자량이 약 51,636 달톤인 아미노산 490개 길이이고, 추정된 pI는 약 6.29이다. 도 14 (서열번호 14)에 나타낸 전장 PRO269 서열의 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 14에 나타낸 전장 PRO269 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 16의 신호 펩티드; 약 아미노산 397 내지 약 아미노산 418의 막횡단 도메인; 약 아미노산 189 내지 약 아미노산 193, 및 약 아미노산 381 내지 약 아미노산 385의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 289 내지 약 아미노산 293의 글리코사미노글리칸 부착 부위; 약 아미노산 98 내지 약 아미노산 102, 및 약 아미노산 434 내지 약 아미노산 438의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위; 약 아미노산 30 내지 약 아미노산 36, 약 아미노산 35 내지 약 아미노산 41, 약 아미노산 58 내지 약 아미노산 64, 약 아미노산 59 내지 약 아미노산 65, 약 아미노산 121내지 약 아미노산 127, 약 아미노산 151 내지 약 아미노산 157, 약 아미노산 185 내지 약 아미노산 191, 약 아미노산 209 내지 약 아미노산 215, 약 아미노산 267 내지 약 아미노산 273, 약 아미노산 350 내지 약 아미노산 356, 약 아미노산 374 내지 약 아미노산 380, 약 아미노산 453 내지 약 아미노산 459, 약 아미노산 463 내지 약 아미노산 469, 및 약 아미노산 477 내지 약 아미노산 483의 N-미리스토일화 부위; 및약 아미노산 262 내지 약 아미노산 274의 아스파르트산 및 아스프라긴 히드록실화 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA38260-1180은 1997년 10월 17일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209397을 배정받았다.
도 14 (서열번호 14)에 나타낸 전장 PRO269 서열의 아미노산 서열 분석은 서열의 일부분이 인간 트롬보모듈린 단백질과 상당한 상동성을 갖는다는 것을 보여줌으로써 하나 이상의 트롬보모듈린 유사 도메인을 가질 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 10: 인간 PRO274를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 phrap을 이용하여 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 어셈블리하였다. 이 컨센서스 서열을 본원에서 DNA36469로 지칭하였다. 이어서, DNA36469 컨센서스 서열을 상기 논의한 EST 서열의 공급원을 사용하여 가능한 한 컨센서스 서열을 연장시키기 위해 BLAST와 phrap의 반복 사이클을 이용하여 이 컨센서스 서열을 연장시켰다. 연장 및 어셈블리한 컨센서스 서열은 본원에서 "<consen01>"이라고 지칭하였다. 제넨테크사 독점의 EST를 2차 컨센서스 어셈블리에 이용하였으며, 본원에서 DNA17873, DNA36157 및 DNA28929로 지칭하였다. 어셈블리한 DNA36469 및 <consen01> 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1)목적 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하고, 2) PRO274의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머 쌍 (정방향 및 역방향)을 합성하였다:
정방향 PCR 프라이머 1 (36469.f1):
5'-CTGATCCGGTTCTTGGTGCCCCTG-3' (서열번호 97)
정방향 PCR 프라이머 2 (36469.f2):
5'-GCTCTGTCACTCACGCTC-3' (서열번호 98)
정방향 PCR 프라이머 3 (36469.f3):
5'-TCATCTCTTCCCTCTCCC-3' (서열번호 99)
정방향 PCR 프라이머 4 (36469.f4):
5'-CCTTCCGCCACGGAGTTC-3' (서열번호 100)
역방향 PCR 프라이머 1 (36469.r1):
5'-GGCAAAGTCCACTCCGATGATGTC-3' (서열번호 101)
역방향 PCR 프라이머 2 (36469.r2):
5'-GCCTGCTGTGGTCACAGGTCTCCG-3' (서열번호 102)
또한, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA36469 및 <consen01> 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브 (36469.p1):
5'-TCGGGGAGCAGGCCTTGAACCGGGGCATTGCTGCTGTCAAGGAGG-3' (서열번호 103)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 여러가지 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머들 중 하나로 PRO274 유전자를 코딩하는 클론을 단리하였다. cDNA 라이브러리 제조하기 위한 RNA를 인간 태아 간 조직 (LIB229)으로부터 단리하였다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 서열을 분석하여 DNA39987-1184 (도 15, 서열번호 15)의 전장 DNA 및 이로부터 유도된 PRO274의 단백질 서열을 수득하였다.
DNA39987-1184의 전체 코딩 서열은 도 15 (서열번호 15)에 포함되어 있다. 클론 DNA39987-1184는 뉴클레오티드 위치 83 내지 85의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1559 내지 1561의 분명한 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 분자량이 약 5,241 달톤인 아미노산 492개 길이이고 pI는 약 8.21로 추정되었다. 도 16 (서열번호 16)에 나타낸 전장 PRO274의 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 16에 나타낸 전장 PRO274 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 86 내지 약 아미노산 105, 약 아미노산 162 내지 약 아미노산 178, 약 아미노산 327 내지 약 아미노산 345, 약 아미노산 359 내지 약 아미노산 374, 및 약 아미노산 403 내지 약 아미노산 423의 막횡단 도메인; 약 아미노산 347 내지 약 아미노산 351, 및 약 아미노산 461 내지 약 아미노산 465의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 325 내지 약 아미노산 329의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위; 및 약 아미노산53 내지 약 아미노산 59, 약 아미노산 94 내지 약 아미노산 100, 약 아미노산 229 내지 약 아미노산 235, 약 아미노산 267 내지 약 아미노산 273, 약 아미노산 268 내지 약 아미노산 274, 약 아미노산 358 내지 약 아미노산 364, 약 아미노산 422 내지 약 아미노산 428, 약 아미노산 425 내지 약 아미노산 431, 및 약 아미노산 431 내지 약 아미노산 437의 N-미리스토일화 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA39987-1184는 1998년 4월 21일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209786을 배정받았다.
도 16 (서열번호 16)에 나타낸 전장 PRO274 서열의 전장 PRO274의 아미노산 서열 분석은 서열의 일부분이 Fn54 단백질과 상당한 상동성을 가진다는 것을 보여준다. 보다 구체적으로, 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO274 아미노산 서열과 데이호프 서열 MMFN54S2_1, MMFN54S1_1, CELF48C1_8, CEF38B7_6, PRP3_RAT, INL3_PIG, MTCY07A7_13, YNAX_KLEAE, A47234 및 HME2_MOUSE 사이에 상당한 상동성을 입증하였다.
실시예 11: 인간 PRO304를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 phrap을 이용하여 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 어셈블리하였다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 DNA35958로 지칭한다. DNA35958 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하고, 2) PRO304의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머쌍 (정방향 및 역방향)을 합성하였다:
정방향 PCR 프라이머 1:
5'-GCGGAAGGGCAGAATGGGACTCCAAG-3' (서열번호 104)
정방향 PCR 프라이머 2:
5'-CAGCCCTGCCACATGTGC-3' (서열번호 105)
정방향 PCR 프라이머 3:
5'-TACTGGGTGGTCAGCAAC-3' (서열번호 106)
역방향 PCR 프라이머 1:
5'-GGCGAAGAGCAGGGTGAGACCCCG-3' (서열번호 107)
또한, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA35958 컨센서스 서열로부터 제조하였다.
혼성화 프로브 :
5'-GCCCTCATCCTCTCTGGCAAATGCAGTTACAGCCCGGAGCCCGAC-3' (서열번호 108)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 여러가지 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머들 중 하나로 PRO304 유전자를 코딩하는 클론을 단리하였다. cDNA 라이브러리 제조용 RNA는 인간 태아의 뇌 조직 (LIB153)으로부터 단리하였다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 서열을 분석하여 DNA39520-1217 (도 17, 서열번호 17)의 전장 DNA 서열 및 이로부터 유도된 PRO304의 단백질 서열을 수득하였다.
DNA39520-1217의 전체 코딩 서열은 도 17 (서열번호 17)에 포함되어 있다. 클론 DNA39520-1217은 뉴클레오티드 위치 34 내지 36의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1702 내지 1704의 분명한 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 556개 길이이다. 도 18 (서열번호 18)에 나타낸 전장 PRO304의 서열 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 18에 나타낸 전장 PRO304 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 16의 신호 서열; 약 아미노산 210 내지 약 아미노산 214, 약 아미노산 222 내지 약 아미노산 226, 약 아미노산 286 내지 약 아미노산 290, 약 아미노산 313 내지 약 아미노산 317, 및 약 아미노산 443 내지 약 아미노산 447의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 361 내지 약 아미노산 365, 약 아미노산 408 내지 약 아미노산 412, 및 약 아미노산 538 내지 약 아미노산 542의 글리코사미노글리칸 부착 부위; 및 약 아미노산 2 내지 약 아미노산 8, 약 아미노산 107 내지 약 아미노산 113, 약 아미노산 195 내지 약 아미노산 201, 약 아미노산 199 내지 약 아미노산 205, 약 아미노산 217 내지 약 아미노산 223, 약 아미노산 219 내지 약 아미노산 225, 약 아미노산 248 내지 약 아미노산 254, 약 아미노산 270 내지 약 아미노산 276, 약 아미노산 284 내지 약 아미노산 290, 약 아미노산 409 내지 약 아미노산 415, 약 아미노산 410 내지 약 아미노산 416, 약 아미노산 473 내지 약 아미노산 479, 약 아미노산 482 내지 약 아미노산 488, 약 아미노산 521 내지 약 527, 약 아미노산 533 내지 약 아미노산 539, 및 약 아미노산 549 내지 약 아미노산 555의 N-미리스토일화 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA39520-1217은 1997년 11월 21일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 209482를 배정받았다.
실시예 12: 인간 PRO339를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
발현 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈)를 검색하여 EST를 확인하였다. Incyte 클론 및 컨센서스 서열의 어셈블리를 형성하고, 이로부터 4개의 정방향 프라이머, 2개의 역방향 프라이머 및 또다른 프라이머를 형성하였다. 인간 태아 간 cDNA 라이브러리는 확인된 EST를 기초로 한 하기 합성 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화시켜 스크리닝하였다. 인간 PRO339를 코딩하는 cDNA 클론을 단리하는데 사용한 cDNA 라이브러리는 시판 시약, 예를 들어 인비트로젠 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)사에서 구입한 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. NotI 부위를 포함한 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, 헤미키나제 처리된 SalI 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기에 따라 적절하게 분류하고, 적합한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조) 내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
다음의 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하였다.:
정방향 PCR 프라이머 1:
5'-GGGATGCAGGTGGTGTCTCATGGGG-3' (서열번호 109)
정방향 PCR 프라이머 2:
5'-CCCTCATGTACCGGCTCC-3' (서열번호 110)
정방향 PCR 프라이머 3:
5'-GTGTGACACAGCGTGGGC-3' (서열번호 111)
정방향 PCR 프라이머 4:
5'-GACCGGCAGGCTTCTGCG-3' (서열번호 112)
역방향 PCR 프라이머 1:
5'-CAGCAGCTTCAGCCACCAGGAGTGG-3' (서열번호 113)
역방향 PCR 프라이머 2:
5'-CTGAGCCGTGGGCTGCAGTCTCGC-3' (서열번호 114)
프라이머:
5'-CCGACTACGACTGGTTCTTCATCATGCAGGATGACACATATGTGC-3' (서열번호 115)
전장의 클론 DNA43466-1225 (도 19, 서열번호 19)를 동정하여 전체를 서열분석하였더니 뉴클레오티드 위치 333 내지 335의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 2649 내지 2651의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다 (도 19, 서열번호 19). 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 772개 길이이고, 추정된 분자량은 약 86,226 달톤이다. 도 20 (서열번호 20)에 나타낸 전장 PRO339 서열 분석은 여러 가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 20에 나타낸 전장 PRO339 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 15의 신호 서열; 약 아미노산 489 내지 약 아미노산 510의 막횡단 도메인; 약 아미노산 121 내지 약 아미노산 125 및 약 아미노산 342 내지 약 아미노산 346의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 319 내지 약 아미노산 323 및 약 아미노산 464 내지 약 아미노산 468의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위; 약 아미노산 736 내지 약 아미노산 743의 티로신 키나제 인산화 부위; 약 아미노산 19 내지 약 아미노산 25, 약 아미노산 23 내지 약 아미노산 29, 약 아미노산 136 내지 약 아미노산 142, 약 아미노산 397 내지 약 아미노산 403, 약 아미노산 441 내지 약 아미노산 447, 약 아미노산 544 내지 약 아미노산 550, 약 아미노산 558 내지 약 아미노산 564, 약 아미노산 651 내지 약 아미노산 657, 약 아미노산 657 내지 약 아미노산 663, 및 약 아미노산 672 내지 약 아미노산 678의 N-미리스토일화 부위; 약 아미노산 14 내지 약 아미노산 25의 원핵막 지단백질 지질 부착 부위; 및 약 아미노산 247 내지 약 아미노산 250의 세포 부착 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA43466-1225는 1997년 11월 21일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209490을 배정받았다.
도 20 (서열번호 20)에 나타낸 BLAST 및 FastA 서열 정렬 분석을 기초로 하여, PRO339가 씨. 엘레간스 (C. elegans) 단백질 및 콜라겐 유사 중합체 서열뿐 아니라 그 주변과도 아미노산 동일성을 보이며, 이로써 PRO339가 발생 또는 조직 성장에 관련될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 13: 인간 PRO1558을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 2에 기재된 독점 신호 서열 검색 알고리즘을 사용하여 DNA71282-1668을 찾아내었다. 상기 기재된 신호 서열 알고리즘을 이용하여LIFESEQ™ (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈) 데이타베이스로부터 Incyte EST 클러스터 제86390호로 지칭되는 EST 클러스터 서열을 확인하였다. 이어서, 존재하는 상동성을 확인하기 위해, 이 클러스터 서열을 공개 EST 데이타베이스 (예를 들어, 진뱅크) 및(또는) 비공개 EST 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈)를 포함하는 발현 서열 태그 (EST) 데이타베이스와 비교하였다. 상동성 검색은 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 어떤 경우 90) 이상의 BLAST 스코어를 나타내는 비교물을 클러스터하고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, 미국 워싱턴주 시애틀 소재)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이로부터 얻은 컨센서스 서열을 본원에서 DNA58842로 명명하였다.
DNA58842 서열과 Incyte EST 클론 제3746964호 사이에 확인된 서열 상동성을 고려하여, Incyte EST 제3746974호를 구입하고, cDNA 삽입체를 수득하여 서열 분석하였다. 이 cDNA 삽입체의 서열은 도 21 (서열번호 21)에 나타내었고 본원에서 DNA71282-1668로 명명하였다.
DNA71282-1668의 전체 코딩 서열은 도 21 (서열번호 21)에 포함되어 있다. 클론 DNA71282-1668은 뉴클레오티드 위치 84 내지 86의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 870 내지 872의 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 21). 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 262개 길이이다 (도 22, 서열번호 22). 도 22에 나타낸 전장 PRO1558 단백질의 추정 분자량은 약 28,809 달톤이고 pI는 약 8.80이다. 도 22 (서열번호 22)에 나타낸 전장 PRO1558의 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 22에 나타낸 전장 PRO1558 서열의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 25의 신호 펩티드; 약 아미노산 8 내지 약 아미노산 30 및 약 아미노산 109 내지 약 아미노산 130의 막횡단 도메인; 약 아미노산 190 내지 약 아미노산 194의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 238 내지 약 아미노산 247의 티로신 키나제 인산화 부위; 약 아미노산 22 내지 약 아미노산 28, 약 아미노산 28 내지 약 아미노산 34, 약 아미노산 110 내지 약 아미노산 116, 약 아미노산 205 내지 약 아미노산 211, 및 약 아미노산 255 내지 약 아미노산 261의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 31 내지 약 아미노산 35 및 약 아미노산 39 내지 약 아미노산 43의 아미드화 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA71282-1668은 1998년 10월 6일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203312를 배정받았다.
도 22 (서열번호 22)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1558 아미노산 서열과 데이호프 서열 AF075724_2, MXU24657_3, CAMT_EUCGU, MSU20736_1, P_R29515, B70431, JC4004, CEY32B12A_3, CELF53B3_2 및 P_R13543 사이에 상당한 서열 동일성이 있음을 입증하였다.
실시예 14: 인간 PR779를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
인간 태아 심장 및 인간 태아 폐 lgt10 박테리오파아지 cDNA 라이브러리 (모두 클론테크사에서 구입)는 EST (진 뱅크 유전자좌 W71984)를 기초로 한 합성 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화시켜 스크리닝하였으며, 그 결과 인간 TNFR1 및 CD95의 세포내 도메인 (ICD)에 어느 정도의 상동성을 나타내었다. W71984는 523 bp EST로 그의 -1 리딩 프레임은 인간 INFR1의 ICD 내의 43개의 아미노산 길이와 27개의 동일성을 갖는다. 스크리닝에 사용된 올리고뉴클레오티드 프로브는 하기 서열을 갖는 각각 27 및 25 bp 길이이다.
5'-GGCGCTCTGGTGGCCCTTGCAGAAGCC-3' (서열번호 116)
5'-TTCGGCCGAGAAGTTGAGAAATGTC-3' (서열번호 117)
20% 포름아미드, 5×SSC, 10% 덱스트란 설페이트, 0.1% NaPiPO4, 0.05 M NaPO4, 0.05 mg 연어 정자 DNA, 및 0.1% 나트륨 도데실 설페이트 (SDS)를 포함하는 완충액 중에서 두개의 프로브의 1:1 혼합물로 실온에서 밤새 혼성화한 후, 6×SSC로 실온에서 1회 세척, 1×SSC/0.1% SDS로 37℃에서 2회 세척, 0.5×SSC/0.1% SDS로 37℃에서 2회 세척, 및 0.2×SSC/0.1% SDS로 37℃ 2회 세척하였다. 태아 심장 (FH20A.57) 및 태아 폐 (FL8A.53)의 각 라이브러리 중 한개의 양성 클론이 프라이머로 각각의 상기 혼성화 프로브로 이용한 PCR에 의해 특이적임을 확인하였다. 각 양성 클론을 포함하는 단일 파지 플라크를 제한 희석법으로 단리하고 DNA를 위자드 람다 프렙 (Wizard lambda prep) DNA 정제 키트 (Promega)를 사용하여 정제하였다.
cDNA 삽입물을 EcoRI으로 절단하여 람다 벡터 암 (arm)으로부터 절제하여 겔정제하고 EcoRI로 미리 절단된 pRK5에 서브클로닝하였다. 이어서, 클론 전체를 서열분석 하였다.
클론 (FH20A.57) DNA58801-1052 (하기에 지시한 바와 같이 ATCC 55820로 기탁된 Apo 3 클론 FH20.57로도 지칭됨)는 뉴클레오티드 위치 103 내지 105의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1354 내지 1356의 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 23, 서열번호 23). 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 417개 길이이다 (도 24, 서열번호 24). 도 24에 나타낸 전장 PRO779 단백질의 추정 분자량은 약45,000 달톤이고 pI는 약 6.40이다. 도 24 (서열번호 24)에 나타낸 전장 PRO779 서열의 분석은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 24에 나타낸 전장 PRO779 서열의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 24의 신호 펩티드; 약 아미노산 199 내지 약 아미노산 219의 막횡단 도메인; 약 아미노산 67 내지 약 아미노산 71 및 약 아미노산 106 내지 약 아미노산 110의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 157 내지 약 아미노산 161의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위; 약 아미노산 370 내지 약 아미노산 377의 티로신 키나제 인산화 부위; 약 아미노산 44 내지 약 아미노산 50, 약 아미노산 50 내지 약 아미노산 56, 약 아미노산 66 내지 약 아미노산 72, 약 아미노산 116 내지 약 아미노산 122, 약 아미노산 217 내지 약 아미노산 223, 약 아미노산 355 내지 약 아미노산 361, 약 아미노산 391 내지 약 아미노산 397, 및 약 아미노산 401 내지 약 아미노산 407의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 177 내지 약 아미노산 188의 원핵막 지단백질 지질 부착 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA58801-1052는 1996년 9월 5일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 55820을 배정받았다.
ECD는 인간 TNFR1 (4 반복체), CD95 (3 반복체) 및 공지된 다른 TNFR족 일원의 상응하는 영역과 유사한 4개의 시스테인 풍부 반복체를 포함한다. ICD는 TNFR 및 CD95의 ICD 및 세포질 사멸 신호 전달 단백질, 예를 들어 인간 FADD/MORT1, TRADD, RIP, 및 드로소필라 레퍼 (Drosophila Reaper)에서 발견되는 사멸 도메인과 유사한 사멸 서열을 포함한다. 전체적으로나 각 영역 모두에서, PRO779 (Apo 3)는 CD95보다는 TNFR1과 더 밀접하게 관련된다. 사멸 도메인과 TNFR1 및 CD95의 아미노산 동일성은 각각 전체적으로 29.3% 및 22.8%, ECD에서 28.2% 및 24.7%, ICD에서 31.6% 및 18.3%, 사멸 도메인에서 47.5% 및 20%이다.
실시예 15: 인간 PR1185를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 2에 기재된 독점 신호 서열 검색 알고리즘을 사용하여 DNA62881-1515를 찾아내었다. 상기 기재된 신호 서열 알고리즘을 이용하여 LIFESEQ™ (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈) 데이타베이스로부터 Incyte EST 클러스터 서열을 확인하였다. 이어서, 존재하는 상동성을 확인하기 위해, 이 클러스터 서열을 공개 EST 데이타베이스 (예를 들어, 진뱅크) 및(또는) 비공개 EST 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈)를 포함하는 여러가지 발현 서열 태그 (EST) 데이타베이스와 비교하였다. 상동성 검색은 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 어떤 경우 90) 이상의 BLAST 스코어를 나타내는 비교물을 클러스터하고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, 미국 워싱턴주 시애틀 소재)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이로부터 얻은 컨센서스 서열을 본원에서 DNA56426으로 명명하였다.
DNA56426 서열과 Incyte EST 제3284411호 사이에 확인된 서열 상동성을 고려하여, 대동맥 조직의 RNA로 제작된 라이브러리로부터의 Incyte EST 제3284411호를 포함하는 클론을 구입하고, cDNA 삽입체를 수득하여 서열 분석하였다. 이 cDNA 삽입체의 서열은 도 25 (서열번호 25)에 나타내었고 본원에서 DNA62881-1515로 명명하였다.
DNA62881-1515의 전체 코딩 서열은 도 25 (서열번호 25)에 포함되어 있다. 클론 DNA62881-1515는 뉴클레오티드 위치 4 내지 6의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 598 내지 600의 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 25). 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 198개 길이이다 (도 26, 서열번호 26). 도 26에 나타낸 전장 PRO1185 단백질의 추정 분자량은 약 22,105 달톤이고 pI는 약 7.73이다. 도 26 (서열번호 26)에 나타낸 전장 PRO1185 서열의 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 26에 나타낸 전장 PRO1185 서열의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 21의 신호 펩티드; 및 약 아미노산 46 내지 약 아미노산 52, 약 아미노산 51 내지 약 아미노산 57, 및 약 아미노산 78 내지 약 아미노산 84의 N-미리스토일화 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA62881-1515는 1998년 8월 4일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203096을 배정받았다.
도 26 (서열번호 26)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1185 아미노산 서열과 데이호프 서열 TUP1_YEAST, AF041382_1, MAOM_SOLTU, SPPBPHU9_1, EPCPLCFAIL_1, HSPLEC_1, YKL4_CAEEL, A44643, 및 TGU65922_1 사이에 상당한 서열 동일성이 있음을 입증하였다.
실시예 16: 인간 PR1245를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 2에 기재된 독점 신호 서열 검색 알고리즘을 사용하여 DNA64884-1527을 찾아내었다. 상기 기재된 신호 서열 알고리즘을 이용하여 LIFESEQ™ (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈) 데이타베이스로부터 Incyte EST 클러스터 번호 제 46370호로 지칭된 Incyte EST 클러스터 서열을 확인하였다. 이어서, 존재하는 상동성을 확인하기 위해, 이 클러스터 서열을 공개 EST 데이타베이스 (예를 들어, 진뱅크) 및(또는) 비공개 EST 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈)를 포함하는 여러가지 발현 서열 태그 (EST) 데이타베이스와 비교하였다. 상동성 검색은 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 어떤 경우 90) 이상의 BLAST 스코어를 나타내는 비교물을 클러스터하고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, 미국 워싱턴주 시애틀 소재)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 어셈블리에 사용한 하나 이상의 EST는 이하선 암을 보유한 인간의 이하선 (타액선)에서 얻은 조직으로부터 제작한 라이브러리로부터 유래하였다. 이로부터 얻은 컨센서스 서열을 본원에서 DNA56019로 명명하였다.
DNA56019 서열과 Incyte EST 제3127836호 사이에 확인된 서열 상동성을 고려하여, Incyte EST 제3127836호를 구입하고, cDNA 삽입체를 수득하여 서열 분석하였다. 이 cDNA 삽입체의 서열은 도 27 (서열번호 27)에 나타내었고 본원에서 DNA64884-1527로 명명하였다.
DNA64884-1527의 전체 코딩 서열은 도 27 (서열번호 27)에 포함되어 있다. 클론 64884-1527는 뉴클레오티드 위치 79 내지 81의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 391 내지 393의 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 27). 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 104개 길이이다 (도 28, 서열번호 28). 도 28에 나타낸 전장 PRO1245 단백질의 추정 분자량은 약 10,100 달톤이고 pI는 약 8.76이다. 도 28 (서열번호 28)에 나타낸 전장 PRO1245의 서열 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 28에 나타낸 전장 PRO1245 서열의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 18의 신호 펩티드; 약 아미노산 8 내지 약 아미노산 14, 약 아미노산 65 내지 약 아미노산 71, 약 아미노산 74 내지 약 아미노산 80, 및 약 아미노산 88 내지 약 아미노산 94의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 5 내지 약 아미노산 16의 원핵막 지단백질 지질 부착부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA64884-1527은 1998년 8월 25일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203155를 배정받았다.
도 28 (서열번호 28)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1245 아미노산 서열과 데이호프 서열 SYA_THETH, GEN11167, MTV044_4, AB011151_1, RLAJ2750_3, SNELIPTRA_1, S63624, C28391, A37907, 및 S14064 사이에 약간의 서열 동일성이 있음을 입증하였다.
실시예 17: 인간 PR1759를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 2에 기재된 독점 신호 서열 검색 알고리즘을 사용하여 DNA76531-1701을 찾아내었다. 상기 기재된 신호 서열 알고리즘을 이용하여 LIFESEQ™ (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈) 데이타베이스로부터 DNA105711로 지칭된 EST 클러스터 서열을 확인하였다. 이어서, 존재하는 상동성을 확인하기 위해, 이 클러스터 서열을 공개 EST 데이타베이스 (예를 들어, 진뱅크) 및(또는) 비공개 EST 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈)를 포함하는 여러가지 발현 서열 태그 (EST) 데이타베이스와 비교하였다. 상동성 검색은 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 어떤 경우 90) 이상의 BLAST 스코어를 나타내는 비교물을 클러스터하고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, 미국 워싱턴주 시애틀 소재)을 사용하여 컨센서스 DNA서열로 어셈블리하였다. 이로부터 얻은 컨센서스 서열을 본원에서 DNA57313으로 명명하였다.
DNA57313 서열과 Incyte EST 제2434255호 사이에 확인된 서열 상동성을 고려하여, Incyte EST 제2434255호를 포함하는 클론을 구입하고, cDNA 삽입체를 수득하여 서열 분석하였다. 이 cDNA 삽입체의 서열은 도 29 (서열번호 29)에 나타내고 본원에서 DNA76531-1701로 명명하였다.
DNA76531-1701의 전체 코딩 서열은 도 29 (서열번호 29)에 포함되어 있다. 클론 DNA76531-1701은 뉴클레오티드 위치 125 내지 127의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1475 내지 1477의 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 29). 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 450개 길이이다 (도 30, 서열번호 30). 도 30에 나타낸 전장 PRO1759 단백질의 추정 분자량은 약 49,765 달톤이고 pI는 약 8.14이다. 도 30 (서열번호 30)에 나타낸 전장 PRO1759의 서열 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 30에 나타낸 전장 PRO1759 서열의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 18의 신호 펩티드; 약 아미노산 41 내지 약 아미노산 55, 약 아미노산 75 내지 약 아미노산 94, 약 아미노산 127 내지 약 아미노산 143, 약 아미노산 191 내지 약 아미노산 213, 약 아미노산 249 내지 약 아미노산 270, 약 아미노산 278 내지 약 아미노산 299, 약 아미노산 314 내지 약 아미노산 330, 약 아미노산 343 내지 약 아미노산 359, 약 아미노산 379 내지 약 아미노산 394, 및 약 아미노산 410 내지 약 아미노산 430의 막횡단 도메인; 약 아미노산 104 내지 약 아미노산 108의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위; 약 아미노산 11 내지 약 아미노산 17, 약 아미노산 18 내지 약 아미노산 24, 약 아미노산 84 내지 약 아미노산 90, 약 아미노산 92 내지 약 아미노산 98, 약 아미노산 137 내지 약 아미노산 143, 약 아미노산 138 내지 약 아미노산 144, 약 아미노산 238 내지 약 아미노산 244, 약 아미노산 253 내지 약 아미노산 259, 약 아미노산 278 내지 약 아미노산 284, 및 약 아미노산 282 내지 약 아미노산 288의 N-미리스토일화 부위; 약 아미노산 102 내지 약 아미노산 106의 아미드화 부위; 및 약 아미노산 6 내지 약 아미노산 17의 원핵막 지단백질 지질 부착 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA76531-1701은 1998년 11월 17일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 203465를 배정받았다.
도 30 (서열번호 30)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1759 아미노산 서열과 데이호프 서열 OPDE_PSEAE, TH11_TRYBB, S67684, RGT2_YEAST, S68362, ATSUGTRPR_1, P_W17836 (특허 출원 WO9715668-A2), F69587, A48076, 및 A45611 사이에 서열 동일성이 있음을 입증하였다.
실시예 18: 인간 PRO5775를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 2에 기재된 독점 신호 서열 검색 알고리즘을 사용하여 DNA96869-2673을 찾아내었다. 상기 기재된 신호 서열 알고리즘을 이용하여 LIFESEQ™ (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈) 데이타베이스로부터 CLU86443으로 지칭된 EST 클러스터 서열을 확인하였다. 이어서, 존재하는 상동성을 확인하기 위해, 이 클러스터 서열을 공개 EST 데이타베이스 (예를 들어, 진뱅크) 및(또는) 비공개 EST 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈)를 포함하는 여러가지 발현 서열 태그 (EST) 데이타베이스와 비교하였다. 상동성 검색은 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 어떤 경우 90) 이상의 BLAST 스코어를 나타내는 비교물을 클러스터하고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, 미국 워싱턴주 시애틀 소재)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이로부터 얻은 컨센서스 서열을 본원에서 DNA79860으로 명명하였다.
DNA79860 서열과 LIFESEQ™(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈) 데이타베이스의 클론 제1614726H1 내에 포함된 Incyte EST 서열 사이에 확인된 서열 상동성을 고려하여, 클론 제1614726H1을 구입하고, cDNA 삽입체를 수득하여 서열 분석하였다. 이 cDNA 삽입체의 서열은 도 31 (서열번호 31)에 나타내고 본원에서 DNA96869-2673으로 명명하였다.
DNA96869-2673의 전체 코딩 서열은 도 31 (서열번호 31)에 포함되어 있다. 클론 DNA96869-2673은 뉴클레오티드 위치 193 내지 195의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1660 내지 1662의 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 31). 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 489개 길이이다 (도 32, 서열번호 32). 도 32에 나타낸 전장 PRO1185 단백질의 추정 분자량은 약 53,745달톤이고 pI는 약 8.36이다. 도 32 (서열번호 32)에 나타낸 전장 PRO5775서열의 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 32에 나타낸 전장 PRO5775 서열의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 29의 신호 펩티드; 약 아미노산 381 내지 약 아미노산 399의 막횡단 도메인; 약 아미노산 133 내지 약 아미노산 137, 약 아미노산 154 내지 약 아미노산 158, 약 아미노산 232 내지 약 아미노산 236, 약 아미노산 264 내지 약 아미노산 268, 약 아미노산 386 내지 약 아미노산 390, 약 아미노산 400 내지 약 아미노산 404, 약 아미노산 410 내지 약 아미노산 414, 및 약 아미노산 427 내지 약 아미노산 431의 N-글리코실화 부위; 및 약 아미노산 58 내지 약 아미노산 64, 약 아미노산 94 내지 약 아미노산 100, 약 아미노산 131 내지 약 아미노산 137, 약 아미노산 194 내지 약 아미노산 200, 약 아미노산 251 내지 약 아미노산 257, 약 아미노산 277 내지 약 아미노산 283, 약 아미노산 281 내지 약 아미노산 287, 약 아미노산 361 내지 약 아미노산 367, 약 아미노산 399 내지 약 아미노산 405, 약 아미노산 440 내지 약 아미노산 446, 약 아미노산 448 내지 약 아미노산 454, 및 약 아미노산 478 내지 약 아미노산 484의 N-미리스토일화 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA96869-2673은 1999년 6월 22일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 PTA-255를 배정받았다.
도 32 (서열번호 32)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO5775 아미노산 서열과 데이호프 서열 U94848_12, P_W57899, CV41KBPL_33, HSU60644_1, CVORF1L5L_3,VK04_VACCV, CVGRI90_41, VK04_VACCC, 및 AF026124_1 사이에 서열 동일성이 있음을 입증하였다.
실시예 19: 인간 PRO7133을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
클론 DNA128450-2739를 CARD 동족체 스크리닝에 의해 찾아내고 그 서열을 프로브로 사용하여, 통상의 저엄격도 및 혼성화를 사용하여 PRO7133의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하였다. PRO7133 cDNA의 전체 ORF를 동정하기 위해서, CARD 도메인 함유 분자, SOCA-1의 N-말단 부분을 코딩하는 cDNA 단편을 사용하여 인간 태아 신장 라이브러리를 스크리닝하였다. 몇몇 양성 클론을 선별하여 DAN를 제조하고 서열분석하였다.
정방향 프라이머 :
5'-GCCGGATCCACAATGGCTACCGAGAGTACTCC-3' (서열번호 118)
역방향 프라이머 :
5'-GCGGAATTCACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTCTGTTCCTCCTCCAATGAAAGGC-3'
(서열번호 119)
프로브 DNA (soca-1)는 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
5'CGCGTACGTAAGCTCGGAATTCGGCTCGAGGGAACAATGGCTACCGAGAGTACTCCCTCAGAGATCATAGAACTGGTGAAGAACCAAGTTATGAGGGATCAGAAACCAGCCTTTCATTGGAGGAGGAACAGGAGAAAAGTATAAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGCCGACTAGTGAGCTCGTCGACCCGGGAATTAATTCCGGACCGGTACCTGCAGGCGTACCAGCTTTCCCTATAGTAGTG-3' (서열번호 120)
DNA 서열분석은 한 cDNA 클론이 인간 Sab 단백질과 거의 상동성인 단백질,PRO7133 폴리펩티드 (본원에서 DNA128451-2739 (도 33, 서열번호 33)으로 지칭) 및 PRO7133 폴리펩티드의 유도 단백질 서열을 코딩하는 전장 ORF를 포함한다는 것을 확인하였다.
클론 DNA128451-2739는 뉴클레오티드 위치 501 내지 503의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1680 내지 1682의 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 33). 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 393개 길이이다 (도 34, 서열번호 34). 도 34에 나타낸 전장 PRO7133 단백질의 추정 분자량은 약 43,499 달톤이고 pI는 약 5.75이다. 도 34 (서열번호 34)에 나타낸 전장 PRO7133의 서열 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 34에 나타낸 전장 PRO7133 서열의 분석은 약 아미노산 287 내지 약 아미노산 291 및 약 아미노산 375 내지 약 아미노산 379의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위; 약 아미노산 37 내지 약 아미노산 43, 약 아미노산 38 내지 약 아미노산 44, 약 아미노산 39 내지 약 아미노산 45, 약 아미노산 40 내지 약 아미노산 46, 약 아미노산 103 내지 약 아미노산 109, 약 아미노산 307 내지 약 아미노산 313, 약 아미노산 310 내지 약 아미노산 316, 약 아미노산 315 내지 약 아미노산 321, 약 아미노산 365 내지 약 아미노산 371, 약 아미노산 369 내지 약 아미노산 375, 약 아미노산 373 내지 약 아미노산 379, 약 아미노산 377 내지 약 아미노산 383, 약 아미노산 380 내지 약 아미노산 386, 및 약 아미노산 381 내지 약 아미노산 387의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 373 내지 약 아미노산 377의 아미드화 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA128451-2739는 1999년 8월 31일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 PTA-618을 배정받았다.
실시예 20: 인간 PRO7158을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 2에 기재된 독점 신호 서열 검색 알고리즘을 사용하여 DNA102846-2742를 찾아내었다. 상기 기재된 신호 서열 알고리즘을 이용하여 LIFESEQ™데이타베이스로부터 CLU122441로 지칭된 EST 클러스터 서열을 확인하였다. 이어서, 존재하는 상동성을 확인하기 위해, 이 클러스터 서열을 공개 EST 데이타베이스 (예를 들어, 진뱅크) 및(또는) 비공개 EST 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈)를 포함하는 여러가지 발현 서열 태그 (EST) 데이타베이스와 비교하였다. 상동성 검색은 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 어떤 경우 90) 이상의 BLAST 스코어를 나타내는 비교물을 클러스터하고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, 미국 워싱턴주 시애틀 소재)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이로부터 얻은 컨센서스 서열을 본원에서 DNA57953으로 명명하였다.
DNA57953 서열과 LIFESEQ™(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈) 데이타베이스의 클론 제4181351호 내에 포함된 Incyte EST 사이에 확인된 서열 상동성을 고려하여, 클론 제4181351호를 구입하고, cDNA 삽입체를 수득하여 서열 분석하였다. 이 cDNA 삽입체의 서열은 도 35 (서열번호 35)에 나타내고 본원에서 DNA102846-2742로 명명하였다.
DNA102846-2742의 전체 코딩 서열은 도 35 (서열번호 35)에 포함되어 있다. 클론 DNA102846-2742는 뉴클레오티드 위치 23 내지 25의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 2540 내지 2542의 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 35). 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 839개 길이이다 (도 36, 서열번호 36). 도 36에 나타낸 전장 PRO7168 단백질의 추정 분자량은 약 87,546 달톤이고 pI는 약 4.84이다. 도 36 (서열번호 36)에 나타낸 전장 PRO7168의 서열 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 36에 나타낸 전장 PRO7168 서열의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 25의 신호 펩티드; 약 아미노산 663 내지 약 아미노산 686의 막횡단 도메인; 약 아미노산 44 내지 약 아미노산 48, 약 아미노산 140 내지 약 아미노산 144, 약 아미노산 198 내지 약 아미노산 202, 약 아미노산 297 내지 약 아미노산 301, 약 아미노산 308 내지 약 아미노산 312, 약 아미노산 405 내지 약 아미노산 409, 및 약 아미노산 520 내지 약 아미노산 524의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 490 내지 약 아미노산 494, 약 아미노산 647 내지 약 아미노산 651 및 약 아미노산 813 내지 약 아미노산 817의 글리코사미노글리칸 부착 부위; 약 아미노산 655 내지 약 아미노산 659의 a cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위; 약 아미노산 154 내지 약 아미노산 163 및 약 아미노산 776 내지 약 아미노산 783의 티로신 키나제 인산화 부위; 약 아미노산 57 내지 약 아미노산 63, 약 아미노산 102 내지 약 아미노산 108, 약아미노산 255 내지 약 아미노산 261, 약 아미노산 294 내지 약 아미노산 300, 약 아미노산 366 내지 약 아미노산 372, 약 아미노산 426 내지 약 아미노산 432, 약 아미노산 441 내지 약 아미노산 447, 약 아미노산 513 내지 약 아미노산 519, 약 아미노산 517 내지 약 아미노산 523, 약 아미노산 530 내지 약 아미노산 536, 약 아미노산 548 내지 약 아미노산 554, 약 아미노산 550 내지 약 아미노산 556, 약 아미노산 581 내지 약 아미노산 587, 약 아미노산 592 내지 약 아미노산 598, 약 아미노산 610 내지 약 아미노산 616, 약 아미노산 612 내지 약 아미노산 618, 약 아미노산 623 내지 약 아미노산 629, 약 아미노산 648 내지 약 아미노산 654, 약 아미노산 666 내지 약 아미노산 672, 약 아미노산 667 내지 약 아미노산 673, 약 아미노산 762 내지 약 아미노산 768, 약 아미노산 763 내지 약 아미노산 769, 약 아미노산 780 내지 약 아미노산 786, 약 아미노산 809 내지 약 아미노산 815, 약 아미노산 821 내지 약 아미노산 827, 및 약 아미노산 833 내지 약 아미노산 839의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 112 내지 약 아미노산 123의 캐드헤린 세포외 반복 도메인 특징 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA102846-2742는 1999년 8월 17일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 PTA-545를 배정받았다.
도 36 (서열번호 36)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO7168 아미노산 서열과 데이호프 서열 CELT22D1_9, B48013, AF100960_1, MUC2_HUMAN, PRP3_MOUSE, S53363, A39066, HUMSPRPA_1, AF053091_1, 및 S80905_1 사이에 서열 동일성이 있음을 입증하였다.
실시예 21: 인간 PRO5725를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
발현 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스(LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈)를 검색하여, 뉴리틴 (Neuritin)에 상동성을 나타내는 EST를 확인하였다. 이어서, Incyte EST 클론 제3705684호를 LIFESEQ™ (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈) 데이타베이스로부터 구입하고, 이 클론의 cDNA 삽입체 (본원에서 지칭된 DNA92265-2669)를 얻어 전체를 서열분석하였다 (도 37, 서열번호 37).
전장 클론 (DNA92265-2669, 서열번호 37)은 뉴클레오티드 위치 27 내지 29의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 522 내지 524의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 37, 서열번호 37). 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 165개 길이이며 추정 분자량은 17,786 달톤이고 추정 pI는 8.43이다. 도 38 (서열번호 38)에 나타낸 전장 PRO5725 서열의 분석은 도 38에 나타낸 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 38에 나타낸 전장 PRO5725 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 35의 신호 서열; 약 아미노산 141 내지 약 아미노산 157의 막횡단 도메인; 약 아미노산 127 내지 약 아미노산 133의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 77 내지 약 아미노산 88의 원핵막 지단백질 지질 부착 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA92265-2669는 1999년 6월 22일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 PTA-256을 배정받았다.
도 38 (서열번호 38)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO5725 아미노산 서열과 데이호프 서열 RNU88958_1, P_W37859, P_W37858, JC6305, HGS_RE778, HGS_RE777, P_W27652, P_W44088, HGS_RE776, 및 HGS_RE425 사이에 서열 동일성이 있음을 입증하였다.
실시예 22: 인간 PRO1800을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 phrap을 이용하여 컨센서스 DNA 서열을 다른 EST 서열에 대해 어셈블리하였다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 DNA30934로 지칭한다. DNA30934 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하고, 2) PRO1800의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PCR 프라이머 (정방향 및 역방향)를 합성하였다:
정방향 PCR 프라이머 (30934.f1):
5'-GCATAATGGATGTCACTGAGG-3' (서열번호 121)
역방향 PCR 프라이머 (30934.r1):
5'-AGAACAATCCTGCTGAAAGCTAG-3' (서열번호 122)
또한, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA30934 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브 (30934.p1):
5'-GAAACGAGGAGGCGGCTCAGTGGTGATCGTGTCTTCCATAGCAGCC-3' (서열번호 123)
전장 클론의 공급원을 찾을 목적으로 여러가지 라이브러리를 스크리닝하기 위해 상기 확인한 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭에 의해 라이브러리의 DNA를 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하여 프로브 올리고뉴클레오티드 및 PCR 프라이머들 중 하나로 PRO1800 유전자를 코딩하는 클론을 단리하였다. cDNA 라이브러리 제조하기 위한 RNA를 인간 태아 간 조직으로부터 단리하였다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 서열을 분석하여 DNA35672-2508 (도 59, 서열번호 59)의 전장 DNA 서열 및 이로부터 유도된 PRO1800의 단백질 서열을 수득하였다.
DNA35672-2508 전체 코딩 서열은 도 59 (서열번호 59)에 포함되어 있다. 클론 DNA35672-2508은 뉴클레오티드 위치 36 내지 38의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 870 내지 872의 분명한 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 278개 길이이고, 추정 분자량은 29,537 달톤이고, pI는 약 8.97이다. 도 60 (서열번호 60)에 나타낸 전장 PRO1800 서열 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 60에 나타낸 전장 PRO1800 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 15의 신호 서열; 약 아미노산 183 내지 약 아미노산 187의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 43 내지 약 아미노산 49, 약 아미노산 80 내지 약 아미노산 86, 약 아미노산 191 내지 약 아미노산 197, 약 아미노산 213 내지 약 아미노산 219, 및 약 아미노산 272 내지 약 아미노산 278의 N-미리스토일화 부위 ; 약 아미노산 276 내지 약 아미노산 280의 미소체 C-말단 표적 신호; 및 약 아미노산 162 내지 약 아미노산 199의 단쇄 알콜 디히드로게나제 서열의 존재를 입증한다. 클론DNA35672-2508은 1998년 12월 15일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 203538을 배정받았다.
도 60 (서열번호 60)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO1800 아미노산 서열과 데이호프 서열 HE27_HUMAN, CELF36H9_1, CEF54F3_3, A69621, AP000007_227, UCPA_ECOLI, F69868, Y4LA_RHISN, DHK2_STRVN, 및 DHG1_BACME 사이에 상당한 서열 동일성이 있음을 입증하였다.
실시예 23: 인간 PRO539를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
발현 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈)를 검색하여, 드로소필라 멜라노개스터 (Drosophilar Melanogaster)의 코스탈-2 (Costal-2) 단백질에 상동성을 나타내는 EST (1299359)를 확인하였다. 이어서, 이 EST 서열을 공개 EST 데이타베이스 (예를 들어, 진뱅크) 및(또는) 비공개 EST 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈)를 포함하는 여러가지 발현 서열 태그 (EST) 데이타베이스와 비교하였다. 상동성 검색은 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]를 이용하여 수행하였다. 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle Washington)을 사용하여 클러스터하고 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이 EST 서열을 본원에서 "컨센서스"라고 지칭하였다.
"컨센서스" 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하고, 2) PRO539의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 정방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30개 뉴클레오티드 범위이고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하도록 설계한다. 프로브 서열의 길이는 통상적으로 40 내지 55 bp이다. 경우에 따라, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 큰 경우 추가의 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 전장 클론을 위해 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 라이브러리 DNA를 문헌 (Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology)에 따라 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 이용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 사용하였다.
PCR 프라이머 (정방향 및 역방향)를 합성하였다:
정방향 PCR 프라이머 ( hcos 2.F):
5'-GATGAGGCCATCGAGGCCCTGG-3' (서열번호 124)
역방향 PCR 프라이머 ( hcos 2.R):
5'-TCTCGGAGCGTCACCACCTTGTC-3' (서열번호 125)
또한, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브 ( hcos 2.P):
5'-CTGGATGCTGCCATTGAGTATAAGAATGAGGCCATCACA-3' (서열번호 126)
cDNA 라이브러리 제작을 위한 RNA를 인간 신장 조직에서 단리하였다. cDNA 클론을 단리하는데 사용한 cDNA 라이브러리는 시판 시약, 예를 들어 인비트로젠 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)사에서 구입한 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. NotI 부위를 포함한 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, 헤미키나제 처리된 SalI 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기에 따라 적절하게 분류하고, 적합한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조) 내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기한 바와 같이 단리된 클론의 서열을 분석하여 DNA47465-1561 (도 65, 서열번호 65)의 전장 DNA 서열 및 이로부터 유도된 PRO539의 단백질 서열을 수득하였다.
DNA47465-1561 전체 코딩 서열은 도 65 (서열번호 65)에 포함되어 있다. 클론 DNA47465-1561은 뉴클레오티드 위치 186 내지 188의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 2676 내지 2678의 분명한 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 830개 길이이며, 추정 분자량은 약 95,029 달톤이고 pI는 약 8.26이다. 도 66 (서열번호 66)에 나타낸 전장 PRO539 서열 분석은 여러가지 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 66에 나타낸 전장 PRO539 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 557 내지 약 아미노산 579 및 약 아미노산 794 내지 약 아미노산 816의 루이신 지퍼 형태; 약 아미노산 133 내지 약 아미노산 137 및 약 아미노산 383 내지 약 아미노산 387의N-글리코실화 부위; 및 약 아미노산 231 내지 약 아미노산 672의 키네신 관련 단백질 Kif-4 코일된-코일-도메인의 존재를 입증한다. 클론 DNA47465-1561은 1999년 2월 9일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 203661을 배정받았다.
도 66 (서열번호 66)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO539 아미노산 서열과 데이호프 서열 AF019250_1, KIF4_MOUSE, TRHY_HUMAN, A56514, G02520, MYSP_HUMAN, AF041382_1, A45592, HS125H2_1, 및 HS6802_2 사이에 상당한 서열 동일성이 있음을 입증하였다.
실시예 24: 인간 PRO4316을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
1차 cDNA 클론의 5' 말단을 우선적으로 나타내는 인간 부신 cDNA에서 이스트 스크리닝에 의해 본원에서 DNA80935로 지칭한 cDNA 클론을 찾아내었다. 이어서, 이 cDNA를 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]를 이용하여 공지된 EST 서열과 비교하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 어떤 경우 90) 이상의 BLAST 스코어를 나타내는 비교물을 클러스터하고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, 미국 워싱턴주 시애틀 소재)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이로부터 얻은 컨센서스 서열을 본원에서 DNA83527로 명명하였다.
DNA83527 서열을 기초로 하여 PCR 프라이머 (정방향 및 역방향)를 합성하였다:
정방향 PCR 프라이머 :
5'-TGGACGACCAGGAGAAGCTGC-3' (서열번호 127)
역방향 PCR 프라이머 :
5'-CTCCACTTGTCCTCTGGAAGGTGG-3' (서열번호 128)
또한, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA83527 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브 :
5'-GCAAGAGGCAGAAGCCATGTTAGATGAGCCTCAGGAACAAGCGG-3' (서열번호 129)
cDNA 라이브러리 제조하기 위한 RNA를 인간 부신 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하는데 사용한 cDNA 라이브러리는 시판 시약, 예를 들어 인비트로젠 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)사에서 구입한 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. NotI 부위를 포함한 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, 헤미키나제 처리된 SalI 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기에 따라 적절하게 분류하고, 적합한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조) 내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
이렇게 얻어진 전장 DNA94713-2561 클론을 도 67 (서열번호 67)에 나타내었으며, 뉴클레오티드 위치 293 내지 295의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1934 내지 1936의 분명한 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 547개 길이이다 (도 68). 도 68에 나타낸전장 PRO4316 단백질의 추정 분자량은 약 61,005 달톤이고 pI는 약 6.34이다. 도 68 (서열번호 68)에 나타낸 전장 PRO4316 서열의 분석은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다 도 68에 나타낸 전장 PRO4316 폴리펩티드의 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 23의 신호 펩티드; 약 아미노산 42 내지 약 아미노산 60 및 약 아미노산 511 내지 약 아미노산 530의 막횡단 도메인; 약 아미노산 259 내지 약 아미노산 263 및 약 아미노산 362 내지 약 아미노산 366의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 115 내지 약 아미노산 119, 약 아미노산 186 내지 약 아미노산 190, 약 아미노산 467 내지 약 아미노산 471, 및 약 아미노산 488 내지 약 아미노산 494의 카제인 키나제 II 인산화 부위; 약 아미노산 255 내지 약 아미노산 261, 약 아미노산 304 내지 약 아미노산 310, 및 약 아미노산 335 내지 약 아미노산 341의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 7 내지 약 아미노산 11 및 약 아미노산 174 내지 약 아미노산 178의 아미드화 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA94713-2561은 1999년 3월 9일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 203835를 배정받았다.
도 68 (서열번호 68)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO4316 아미노산 서열과 데이호프 서열 YDA9_SCHPO, S67452, S69714, DP27_CAEEL, S47053, CEY43F8C_4, VP2_BRD, 및 SPCC895_9 사이에 상당한 서열 동일성이 있음을 입증하였다.
실시예 25: 인간 PRO4980을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
1차 cDNA 클론의 5' 말단을 우선적으로 나타내는 인간 cDNA 라이브러리에서 이스트 스크리닝에 의해 DNA81573으로 지칭된 초기 DNA 서열을 찾아내었다. 이어서, 이 cDNA을 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2 [Altschulet al ., Methods in Enzymology,266:460-480 (1996)]를 이용하여 공개 데이타베이스 (예, 진뱅크), 및 비공개 EST 데이타베이스 (LIFESEQ™, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 인사이트 파마슈티컬즈)의 EST와 비교하였다. EST를 클러스터하고, 프로그램 "phrap" (Phil Green, University of Washington, 미국 워싱턴주 시애틀 소재)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 컨센서스 서열을 본원에서 DNA90613으로 명명하였다.
DNA90613 서열을 기초로 하여 PCR 프라이머 (정방향 및 역방향)를 합성하여 이것을 프로브로 사용하여 인간 대동맥 내피 세포 cDNA 라이브러리로부터 PRO4980의 전장 코딩 서열의 클론을 단리하였다.
정방향 PCR 프라이머 :
5'-CAACCGTATGGGACCGATACTCG-3' (서열번호 130)
역방향 PCR 프라이머 :
5'-CACGCTCAACGAGTCTTCATG-3' (서열번호 131)
혼성화 프로브 :
5'-GTGGCCCTCGCAGTGCAGGCCTTCTACGTCCAATACAAGTG-3' (서열번호 132)
cDNA 라이브러리 제조하기 위한 RNA를 인간 대동맥 내피 세포 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하는데 사용한 cDNA 라이브러리는 시판 시약, 예를들어 인비트로젠 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)사에서 구입한 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. NotI 부위를 포함한 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, 헤미키나제 처리된 SalI 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기에 따라 적절하게 분류하고, 적합한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al.,Science,253: 1278-1280 (1991)) 참조) 내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기 스크리닝에서 얻은 전장 DNA97003-2649 클론은 도 69 (서열번호 69)에 나타내었으며, 이 클론은 뉴클레오티드 위치 286 내지 288의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1900 내지 1992의 분명한 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 예상된 폴리펩티드 전구체는 아미노산 538개 길이이다 (도 70). 도 70에 나타낸 전장 PRO4980 단백질의 추정 분자량은 약 59,268 달톤이고 pI는 약 8.94이다. 도 70 (서열번호 70)에 나타낸 전장 PRO4980 서열의 분석은 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하며, 여기서 중요한 폴리펩티드 도메인에 부여한 위치는 상기에 기재한 바와 같이 대략적이다. 도 70에 나타낸 전장 PRO4980 폴리펩티드 서열 분석은 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 36의 신호 펩티드; 약 아미노산 77 내지 약 아미노산 95, 약 아미노산 111 내지 약 아미노산 133, 약 아미노산 161 내지 약 아미노산 184, 약 아미노산 225 내지 약 아미노산 248, 약 아미노산 255 내지 약 아미노산 273, 약 아미노산 299 내지 약 아미노산 314, 약 아미노산 348 내지 약 아미노산 373, 약 아미노산 406 내지 약 아미노산 421, 약 아미노산435 내지 약 아미노산 456, 및 약 아미노산 480 내지 약 아미노산 497의 막횡단 도메인; 약 아미노산 500 내지 약 아미노산 504의 N-글리코실화 부위; 약 아미노산 321 내지 약 아미노산 325의 cAMP- 및 cGMP-의존성 단백질 키나제 인산화 부위; 약 아미노산 13 내지 약 아미노산 19, 약 아미노산 18 내지 약 아미노산 24, 약 아미노산 80 내지 약 아미노산 86, 약 아미노산 111 내지 약 아미노산 117, 약 아미노산 118 내지 약 아미노산 124, 약 아미노산 145 내지 약 아미노산 151, 약 아미노산 238 내지 약 아미노산 244, 약 아미노산 251 내지 약 아미노산 257, 약 아미노산 430 내지 약 아미노산 436, 약 아미노산 433 내지 약 아미노산 439, 약 아미노산 448 내지 약 아미노산 454, 약 아미노산 458 내지 약 아미노산 464, 약 아미노산 468 내지 약 아미노산 474, 약 아미노산 475 내지 약 아미노산 481, 약 아미노산 496 내지 약 아미노산 502, 및 약 아미노산 508 내지 약 아미노산 514의 N-미리스토일화 부위; 및 약 아미노산 302 내지 약 아미노산 313의 원핵막 지단백질 지질 부착 부위의 존재를 입증한다. 클론 DNA97003-2649는 1999년 5월 11일에 ATCC에 기탁하여 기탁번호 PTA-43을 배정받았다.
도 70 (서열번호 70)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스 (버전 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PRO4980 아미노산 서열과 데이호프 서열 SC59_YEAST, S76857, CELF31F4_12, AC002464_1, NU5M_CHOCR, S59109, SAY10108_2, AF055482_2, F69049, 및 G70433 사이에 상당한 서열 동일성이 있음을 입증하였다.
실시예 27: 유전자 증폭
본 실시예는 인간의 특정 폐암, 결장암, 유방암 및(또는) 세포주의 게놈에서 PRO197-, PRO207-, PRO226-, PRO232-, PRO243-, PRO256-, PRO269-, PRO274-, PRO304-, PRO339-, PRO1558-, PRO779-, PRO1185-, PRO1245-, PRO1759-, PRO5775-, PRO7133-, PRO7168-, PRO5725-, PRO202-, PRO206-, PRO264-, PRO313-, PRO342-, PRO542-, PRO773-, PRO861-, PRO1216-, PRO1686-, PRO1800-, PRO3562-, PRO9850-, PRO539-, PRO4316- 또는 PRO4980-코딩 유전자가 증폭된다는 것을 보여준다. 유전자의 증폭은 유전자 산물의 과다 발현과 관련되어 있으며, 이는 상기 폴리펩티드들이 결장암, 폐암, 유방암 및 기타 암과 같은 특정 암의 치료에 있어서 유용한 표적임을 나타낸다. 치료제는, 예를 들어 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 대한 쥐-인간 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체와 같은, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 대한 길항제의 형태로 얻을 수 있다.
스크리닝을 위한 출발 물질은 다양한 암으로부터 단리된 게놈 DNA였다. DNA는 형광법과 같은 방법으로 정확하게 정량하였다. 음성 대조용으로서, 10명의 건강한 정상 개체로부터 DNA를 단리하여 이를 모은 후, 건강한 개체의 유전자 복제본에 대한 분석 대조용으로 사용하였다 (나타내지 않음). 5' 뉴클레아제 분석 (예를 들어, TaqMan™) 및 실시간 정량 PCR (예를 들어, ABI 프리즘 7700 서열 검출 시스템 (상표명) (ABI Prizm Sequence 7700 Detection Sestem™, Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)을 이용하여 특정 암에서 가능하게 증폭되는 유전자를 찾아냈다. 이 결과를 이용하여, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 코딩하는 DNA가 스크리닝된 원발성 폐암 또는 결장암이나 암세포주 또는 유방암 세포주에서 과다 발현되는지 여부를 결정하였다. 표 6에 그 유형 및 단계가 기재된 종양이 있는 개체로부터 원발성 폐암을 수득하였다. 표 6에 기재된 원발성 종양을 지칭하기 위해 사용되는 약어, 및 본 실시예 전체에 걸쳐 언급되는 원발성 종양 및 세포주에 대한 설명은 본원의 상기에 기재되어 있다.
택맨 (상표명) (TaqMan™)의 결과는 델타(Δ)Ct 단위로 기록된다. 1 단위는 1 PCR 싸이클 또는 정상에 비해 2배 증폭된 것에 상응하며, 2 단위는 4배, 3단위는 8배가 증폭된 것에 상응한다. PRO197-, PRO207-, PRO226-, PRO232-, PRO243-, PRO256-, PRO269-, PRO274-, PRO304-, PRO339-, PRO1558-, PRO779-, PRO1185-, PRO1245-, PRO1759-, PRO5775-, PRO7133-, PRO7168-, PRO5725-, PRO202-, PRO206-,PRO264-, PRO313-, PRO342-, PRO542-, PRO773-, PRO861-, PRO1216-, PRO1686-, PRO1800-, PRO3562-, PRO9850-, PRO539-, PRO4316- 또는 PRO4980-코딩 유전자로부터 유도된 프라이머 및 택맨 (상표명) 형광 프로브를 사용하여 정량하였다. 고유한 핵산 서열을 가지며 스플라이싱으로 제거되는 인트론을 거의 갖지 않은 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 영역 (예를 들어, 3'-비번역 영역)이 프라이머 및 프로브를 유도하는데 바람직하다. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 유전자 증폭 분석에 사용된 프라이머 및 프로브 (정방향, 역방향 및 프로브)의 서열은 하기와 같다:
PRO197 ( DNA 22780-1078):
22780.tm.f:
5'-GCCATCTGGAAACTTGTGGAC-3' (서열번호 133)
22780.tm.p:
5'-AGAAGACCACGACTGGAGAAGCCCCC-3' (서열번호 134)
22780.tm.r:
5'-AGCCCCCCTGCACTCAG-3' (서열번호 135)
PRO207 ( DNA 30879-1152):
30879.tm.f:
5'-GACCTGCCCCTCCCTCTAGA-3' (서열번호 136)
30879.tm.p:
5'-CTGCCTGGGCCTGTTCACGTGTT-3' (서열번호 137)
30879.tm.r
5'-GGAATACTGTATTTATGTGGGATGGA-3' (서열번호 138)
PRO226 ( DNA 33460-1166):
33460.3utr-5:
5'-GCAATAAAGGGAGAAAGAAAGTCCT-3' (서열번호 139)
33460.3utr-probe.rc:
5'-TGACCCGCCCACCTCAGCCA-3' (서열번호 140)
33460.3utr-3b:
5'-GCCTGAGGCTTCCTGCAGT-3' (서열번호 141)
PRO232 ( DNA 34435-1140):
34435.3utr-5:
5'-GCCAGGCCTCACATTCGT-3' (서열번호 142)
34435.3utr-probe:
5'-CTCCCTGAATGGCAGCCTGAGCA-3' (서열번호 143)
34435.3utr-3:
5'-AGGTGTTTATTAAGGGCCTACGCT-3' (서열번호 144)
PRO243 ( DNA 35917-1207):
35917.tm.f:
5'-CCAGTGCCTTTGCTCCTCTG -3' (서열번호 145)
35917.tm.p:
5'-TGCCTCTACTCCCACCCCCACTACCT-3' (서열번호 146)
35917.tm.r:
5'-TGTGGAGCTGTGGTTCCCA -3' (서열번호 147)
PRO256 ( DNA 35880-1160):
35880.3utr-5:
5'-TGTCCTCCCGAGCTCCTCT-3' (서열번호 148)
35880.3utr-probe:
5'-CCATGCTGTGCGCCCAGGG-3' (서열번호 149)
35880.3utr-3:
5'-GCACAAACTACACAGGGAAGTCC-3' (서열번호 150)
PRO269 ( DNA 38260-1180):
38260.tm.f:
5'-CAGAGCAGAGGGTGCCTTG-3' (서열번호 151)
38260.tm.p:
5'-TGGCGGAGTCCCCTCTTGGCT-3' (서열번호 152)
38260.tm.r:
5'-CCCTGTTTCCCTATGCATCACT-3' (서열번호 153)
PRO274 ( DNA 39987-1184):
39987.tm.f:
5'-GGACGGTCAGTCAGGATGACA-3' (서열번호 154)
39987.tm.p:
5'-TTCGGCATCATCTCTTCCCTCTCCC-3' (서열번호 155)
39987.tm.r:
5'-ACAAAAAAAAGGGAACAAAATACGA-3' (서열번호 156)
PRO304 ( DNA 39520-1217):
39520.tm.f:
5'-TCAACCCCTGACCCTTTCCTA-3' (서열번호 157)
39520.tm.p:
5'-GGCAGGGGACAAGCCATCTCTCCT-3' (서열번호 158)
39520.tm.r:
5'-GGGACTGAACTGCCAGCTTC -3' (서열번호 159)
PRO339 ( DNA 43466-1225):
43466.tm.f1:
5'-GGGCCCTAACCTCATTACCTTT-3' (서열번호 160)
43466.tm.p1:
5'-TGTCTGCCTCAGCCCCAGGAAGG-3' (서열번호 161)
43466.tm.r1:
5'-TCTGTCCACCATCTTGCCTTG -3' (서열번호 162)
PRO1558 ( DNA 71282-1668):
71282.tm.f1:
5'-ACTGCTCCGCCTACTACGA -3' (서열번호 163)
71282.tm.p1:
5'-AGGCATCCTCGCCGTCCTCA -3' (서열번호 164)
71282.tm.r1:
5'-AAGGCCAAGGTGAGTCCAT -3' (서열번호 165)
71282.tm.f2:
5'-CGAGTGTGTGCGAAACCTAA -3' (서열번호 166)
71282.tm.p2:
5'-TCAGGGTCTACATCAGCCTCCTGC -3' (서열번호 167)
71282.tm.r2:
5'-AAGGCCAAGGTGAGTCCAT -3' (서열번호 168)
PRO779 ( DNA 58801-1052):
58801.tm.f1:
5'-CCCTATCGCTCCAGCCAA -3' (서열번호 169)
58801.tm.p1:
5'-CGAAGAAGCACGAACGAATGTCGAGA -3' (서열번호 170)
58801.tm.r1:
5'-CCGAGAAGTTGAGAAATGTCTTCA-3' (서열번호 171)
PRO1185 ( DNA 62881-1515):
62881.tm.f1:
5'-ACAGATCCAGGAGAGACTCCACA -3' (서열번호 172)
62881.tm.p1:
5'-AGCGGCGCTCCCAGCCTGAAT -3' (서열번호 173)
62881.tm.r1:
5'-CATGATTGGTCCTCAGTTCCATC -3' (서열번호 174)
PRO1245 ( DNA 64884-1527):
64884.tm.f1:
5'-ATAGAGGGCTCCCAGAAGTG -3' (서열번호 175)
64884.tm.p1:
5'-CAGGGCCTTCAGGGCCTTCAC-3' (서열번호 176)
64884.tm.r1:
5'-GCTCAGCCAAACACTGTCA-3' (서열번호 177)
64884.tm.f2:
5'-GGGGCCCTGACAGTGTT -3' (서열번호 178)
64884.tm.p2:
5'-CTGAGCCGAGACTGGAGCATCTACAC-3' (서열번호 179)
64884.tm.r2:
5'-GTGGGCAGCGTCTTGTC-3' (서열번호 180)
PRO1759 ( DNA 76531-1701):
76531.tm.f1:
5'-CCTACTGAGGAGCCCTATGC -3' (서열번호 181)
76531.tm.p1:
5'-CCTGAGCTGTAACCCCACTCCAGG -3' (서열번호 182)
76531.tm.r1:
5'-AGAGTCTGTCCCAGCTATCTTGT -3' (서열번호 183)
PRO5775 ( DNA 96869-2673):
96869.tm.f1:
5'-GGGGAACCATTCCAACATC -3' (서열번호 184)
96869.tm.p1:
5'-CCATTCAGCAGGGTGAACCACAG -3' (서열번호 185)
96869.tm.r1:
5'-TCTCCGTGACCATGAACTTG-3' (서열번호 186)
PRO7133 ( DNA 128451-2739):
128451.tm.f1:
5'-TTAGGGAATTTGGTGCTCAA -3' (서열번호 187)
128451.tm.p1:
5'-TTGCTCTCCCTTGCTCTTCCCC -3' (서열번호 188)
128451.tm.r1:
5'-TCCTGCAGTAGGTATTTTCAGTTT -3' (서열번호 189)
PRO7168 ( DNA 102846-2742):
102846.tm.f1:
5'-GAGCCGGTGGTCTCAAAC-3' (서열번호 190)
102846.tm.p1:
5'-CCGGGGGTCCTAGTCCCCTTC-3' (서열번호 191)
102846.tm.r1:
5'-TTTACTGCTGCGCTCCAA-3' (서열번호 192)
PRO5725 ( DNA 92265-2669):
92265.tm.f1:
5'-CAGCTGCAGTGTGGGAAT -3' (서열번호 193)
92265.tm.p1:
5'-CACTACAGCAAGAAGCTCGCCAGG -3' (서열번호 194)
92265.tm.r1:
5'-CGCACAGAGTGTGCAAGTTAT -3' (서열번호 195)
PRO202 ( DNA 30869):
30869.tm.f:
5'-CGGAAGGAGGCCAACCA-3' (서열번호 196)
30869.tm.p:
5'-CGACAGTGCCATCCCCACCTTCA-3' (서열번호 197)
30869.tm.r:
5'-TTCTTTCTCCATCCCTCCGA-3' (서열번호 198)
PRO206 ( DNA 34405):
34405.tm.f:
5'-GCATGGCCCCAACGGT -3' (서열번호 199)
34405.tm.p:
5'-CACGACTCAGTATCCATGCTCTTGACCTTGT-3' (서열번호 200)
34405.tm.r:
5'-TGGCTGTAAATACGCGTGTTCT-3' (서열번호 201)
PRO264 ( DNA 36995):
36995.3trn-5:
5'-CCTGTGAGATTGTGGATGAGAAGA-3' (서열번호 202)
36995.3trn-probe:
5'-CCACACCAGCCAGACTCCAGTTGACC-3' (서열번호 203)
36995.3trn-3:
5'-GGGTGGTGCCCTCCTGA-3' (서열번호 204)
PRO313 ( DNA 43320):
43320.tm.f:
5'-CCATTGTTCAGACGTTGGTCA-3' (서열번호 205)
43320.tm.p:
5'-CTCTGTTAACTCTAAGATTCCTAAGGCATGCTGTGTC -3' (서열번호 206)
43320.tm.r:
5'-ATCGAGATAGCACTGAGTTCTGTCG -3' (서열번호 207)
PRO342 ( DNA 38649):
38649.tm.f:
5'-CTCGGCTCGCGAAACTACA-3' (서열번호 208)
38649.tm.p:
5'-TGCCCGCACAGACTTCTACTGCCTG-3' (서열번호 209)
38649.tm.r:
5'-GGAGCTACATATCATCCTTGGACA-3' (서열번호 210)
38649.tm.f2:
5'-GAGATAAACGACGGGAAGCTCTAC-3' (서열번호 211)
38649.tm.p2:
5'-ACGCCTACGTCTCCTACAGCGACTGC-3' (서열번호 212)
38649.tm.r2:
5'-GCTGCGGCTTTAGGATGAAGT-3' (서열번호 213)
PRO542 ( DNA 56505):
56505.tm.f1:
5'-CCTTGGCCTCCATTTCTGTC -3' (서열번호 214)
56505.tm.p1:
5'-TGCTGCTCAGGCCCATGCTATGAGT -3' (서열번호 215)
56505.tm.r1:
5'-GGGTGTAGTCCAGAACAGCTAGAGA-3' (서열번호 216)
PRO773 ( DNA 48303):
48303.tm.f1:
5'-CCCATTCCCAGCTTCTTG-3' (서열번호 217)
48303.tm.p1:
5'-CTCAGAGCCAAGGCTCCCCAGA -3' (서열번호 218)
48303.tm.r1:
5'-TCAAGGACTGAACCATGCTAGA -3' (서열번호 219)
PRO861 ( DNA 50798):
50798.tm.f1:
5'-ACCATGTACTACGTGCCAGCTCTA -3' (서열번호 220)
50798.tm.p1:
5'-ATTCTGACTTCCTCTGATTTTGGCATGTGG -3' (서열번호 221)
50798.tm.r1:
*5'-GGCTTGAACTCTCCTTATAGGAGTGT-3' (서열번호 222)
PRO1216 ( DNA 66489):
66489.tm.f1:
5'-CTAACTGCCCAGCTCCAAGAA -3' (서열번호 223)
66489.tm.p1:
5'-TCACAGCACTCTCCAGGCACCTCAA -3' (서열번호 224)
66489.tm.r1:
5'-TCTGGGCCACAGATCCACTT-3' (서열번호 225)
PRO1686 ( DNA 80896):
80896.tm.f1:
5'-GCTCAGCCCTAGACCCTGACTT -3' (서열번호 226)
80896.tm.p1:
5'-CAGGCTCAGCTGCTGTTCTAACCTCAGTAATG -3' (서열번호 227)
80896.tm.r1:
5'-CGTGGACAGCAGGAGCCT-3' (서열번호 228)
PRO1800 ( DNA 35672-2508):
35672.tm.f1:
5'-ACTCGGGATTCCTGCTGTT-3' (서열번호 229)
35672.tm.r1:
5'-GGCCTGTCCTGTGTTCTCA-3' (서열번호 230)
35672.tm.p1:
5'-AGGCCTTTACCCAAGGCCACAAC-3' (서열번호 231)
PRO3562 ( DNA 96791):
96791.tm.f1:
5'-GACCCACGCGCTACGAA -3' (서열번호 232)
96791.tm.p1:
5'-CGGTCTCCTTCATGGACGTCAACAG -3' (서열번호 233)
96791.tm.r1:
5'-GGTCCACGGTTCTCCAGGT -3' (서열번호 234)
PRO9850 ( DNA 58725):
58725.tm.f1:
5'-ATGATTGGTAGGAAATGAGGTAAAGTACT-3' (서열번호 235)
58725.tm.p1:
5'-CCATCTTTCTCTGGCACATTGAGGAACTG -3' (서열번호 236)
58725.tm.r1:
5'-TGATCTAGAACTTAAACTTTGGAAAACAAC-3' (서열번호 237)
PRO539 ( DNA 47465-1561):
47465.tm.f1:
5'-TCCCACCACTTACTTCCATGAA-3' (서열번호 238)
47465.tm.r1:
5'-ATTGTCCTGAGATTCGAGCAAGA-3' (서열번호 239)
47465.tm.p1:
5'-CTGTGGTACCCAATTGCCGCCTTGT-3' (서열번호 240)
PRO4316 ( DNA 94713-2561):
94713.tm.f1:
5'-GGTCACCTGTGGGACCTT-3' (서열번호 241)
94713.tm.r1:
5'-TGCACCTGACAGACAAAGC-3' (서열번호 242)
94713.tm.p1:
5'-TCCCTCACTCCCCTCCCTCCTAGT-3' (서열번호 243)
PRO4980 ( DNA 97003-2649):
97003.tm.f1:
5'-AAGCCTTTGGGTCACACTCT-3' (서열번호 244)
97003.tm.r1:
5'-TGGTCCACTGTCTCGTTCA-3' (서열번호 245)
97003.tm.p1:
5'-CGGAGCTTCCTGTCCCTTTTTCTG-3' (서열번호 246)
5' 뉴클레아제 분석 반응은 실시간으로 증폭을 모니터하기 위해 Taq DNA 폴리머라제의 5' 엑소뉴클레아제 활성을 이용하는, 형광 PCR-기재의 기술이다. PCR 반응을 대표하는 앰플리콘을 생성하기 위해 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한다. 3번째 올리고뉴클레오티드, 즉 프로브는 상기 2개의 PCR 프라이머 사이에 위치한 뉴클레오티드 서열을 검출하도록 설계한다. 이 프로브는 Taq DNA 폴리머라제에 의해 연장될 수 없으며, 리포터 형광 염료 및 켄처 (quencher) 형광 염료로 표지되어 있다. 리포터 염료와 켄칭 염료가 프로브 상에 매우 가깝게 위치할 경우에 켄칭 염료에 의해 리포터 염료에서 임의의 레이저-유도 방출이 켄칭된다. 증폭 반응시, Taq DNA 폴리머라제는 주형에 의존적인 방식으로 프로브를 절단한다. 생성된 프로브 단편은 용액 중에서 해리되어, 방출된 리포터 염료의 신호는 제2 형광단 (fluorophore)의 켄칭 효과를 받지 않는다. 리포터 염료 1 분자는 합성된 새로운 각 분자에 대해 유리되고, 켄칭되지 않은 염료의 검출은 데이타의 정량 분석에 대한 기초를 제공한다.
5' 뉴클레아제 분석의 방법은 ABI 프리즘 7700TM 서열 검출기와 같은 실시간 정량 PCR 장치에서 수행한다. 이 시스템은 열순환기 (thermocycler), 레이저, 전하 결합 소자 (CCD) 카메라 및 컴퓨터로 이루어져 있다. 이 시스템은 열순환기 상의 96-웰 포맷에서 샘플을 증폭시킨다. 증폭시 레이저-유도된 형광 신호는 모든 96 웰의 섬유 광학 케이블을 통해 실시간으로 수집되어 CCD에서 검출된다. 이 시스템에는 장치 구동 및 데이타 분석을 위한 소프트웨어가 포함되어 있다.
5' 뉴클레아제 분석 데이타는 처음에 Ct, 즉 역치 싸이클 (threshold cycle)로 표현된다. 이것은 리포터 신호가 배경의 형광 수준을 초과하여 측정되는 싸이클로서 정의한다. ΔCt 값은 정상 인간 DNA의 결과와 암 DNA의 결과를 비교할 때, 핵산 샘플에서 특정 표적 서열의 상대적인 출발 복제본 수의 정량 측정값으로 사용된다.
표 6에는 본 발명의 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 화합물을 스크리닝하는데 사용한 다양한 원발성 종양의 단계, T 단계 및 N 단계를 기재하고 있다.
원발성 폐 및 결장 종양 프로파일
원발성 종양 단계 기타 단계 듀크 단계 T 단계 N 단계
인간 폐 종양 AdenoCa (SRCC724) [LT1]인간 폐 종양 SqCCa (SRCC725) [LT1a]인간 폐 종양 AdenoCa (SRCC726) [LT2]인간 폐 종양 AdenoCa (SRCC727) [LT3]인간 폐 종양 AdenoCa (SRCC728) [LT4]인간 폐 종양 SqCCa (SRCC729) [LT6]인간 폐 종양 Aden/SqCCa (SRCC730) [LT7]인간 폐 종양 AdenoCa (SRCC731) [LT9]인간 폐 종양 SqCCa (SRCC732) [LT10]인간 폐 종양 SqCCa (SRCC733) [LT11]인간 폐 종양 AdenoCa (SRCC734) [LT12]인간 폐 종양 AdenoSqCCa (SRCC735)[LT13]인간 폐 종양 SqCCa (SRCC736) [LT15]인간 폐 종양 SqCCa (SRCC737) [LT16]인간 폐 종양 SqCCa (SRCC738) [LT17]인간 폐 종양 SqCCa (SRCC739) [LT18]인간 폐 종양 SqCCa (SRCC740) [LT19]인간 폐 종양 LCCa (SRCC741) [LT21]인간 폐 AdenoCa (SRCC811) [LT22]인간 결장 AdenoCa (SRCC742) [CT2]인간 결장 AdenoCa (SRCC743) [CT3]인간 결장 AdenoCa (SRCC 744) [CT8]인간 결장 AdenoCa (SRCC745) [CT10]인간 결장 AdenoCa (SRCC746) [CT12]인간 결장 AdenoCa (SRCC747) [CT14]인간 결장 AdenoCa (SRCC748) [CT15]인간 결장 AdenoCa (SRCC749) [CT16]인간 결장 AdenoCa (SRCC750) [CT17]인간 결장 AdenoCa (SRCC751) [CT1]인간 결장 AdenoCa (SRCC752) [CT4]인간 결장 AdenoCa (SRCC753) [CT5]인간 결장 AdenoCa (SRCC754) [CT6]인간 결장 AdenoCa (SRCC755) [CT7]인간 결장 AdenoCa (SRCC756) [CT9]인간 결장 AdenoCa (SRCC757) [CT11]인간 결장 AdenoCa (SRCC758) [CT18] IIAIIBIBIIIAIBIBIAIBIIBIIAIVIBIBIBIIBIBIBIIB1A M1MO, R1pMO, ROM1, R2pMOMO, R1G2pMO, ROG1G3MO, RO DBBABBDBC1BBC1BADBB T1T3T2T1T2T2T1T2T2T1T2T2T2T2T2T2T2T3T1pT4pT3T3pT2T3pT3T4pT3pT3pT3pT3pT3pT3pT2pT4T3pT3 N1N0N0N2N0N0N0N0N1N1N0N0N0N0N1N0N0N1N0N0N0N0N0N0pN0N2pN0pN1N0M0pN0pN0pN0pN2N0pN0
DNA 제조:
배양된 세포주, 원발성 종양 및 정상 인간의 혈액으로부터 DNA를 제조하였다. 키아젠 (Qiagen)사의 정제 키트, 완충액 세트 및 프로테아제를 사용하여, 제조자의 지시 및 하기 기재 내용에 따라 DNA를 단리하였다.
세포 배양물의 용해:
세포를 세척하고 각 팁 (tip)당 7.5×108의 농도로 트립신을 처리한 후, 4℃, 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 1/2 부피의 PBS로 세척한 다음 다시 원심분리하였다. 펠릿을 3회째 세척하고, 현탁된 세포를 수집하여 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 PBS 10 ㎖에 현탁하였다. 4℃에서 C1 완충액으로 평형화시켰다. 키아젠 프로테아제 #19155를 차가운 ddH2O 6.25 ㎖로 희석하여 최종 농도를 20 mg/㎖로 맞춘 후, 4℃에서 평형화시켰다. 키아젠 RNase A 원액 (100mg/㎖)을 최종 농도 200㎍/㎖로 희석하여 G2 완충액 10 ㎖를 제조하였다.
이어서, 세포 현탁액 10 ㎖에 C1 완충액 (10 ㎖, 4℃) 및 ddH2O (40 ㎖, 4℃)를 가하고, 인버팅 (inverting)에 의해 혼합한 후, 빙상에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 4℃의 베크만 스윙 버킷 (Beckman swing bucket) 로터 2500 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 세포 핵을 펠릿화시켰다. 상층액을 버리고, C1 완충액 (4℃) 2 ㎖ 및 ddH2O 6 ㎖ 중에서 볼텍싱하여 핵을 현탁한 후, 4℃에서 2500 rpm에서 15분 동안 2회째 원심분리하였다. 이어서, 200 ㎕ 팁을 이용하여 잔류 완충액에 핵을 재현탁하였다. 부드럽게 볼텍싱하면서 현탁된 핵에 G2 완충액 (10 ㎖)을 가하였다. 완충액을 모두 가한 후에 30초 동안 격렬하게 볼텍싱하였다. 키아젠 프로테아제 (200 ㎕, 상기와 같이 제조함)를 가하고, 50℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해물이 투명해질 때까지 인큐베이션 및 원심분리를 반복하였다 (예를 들어, 30 내지 60분 동안 추가로 인큐베이션 후, 4℃에서 3000 ×g에서 10분동안 펠릿화함).
인간 고형성 종양 샘플 준비 및 용해:
종양 샘플을 계량하고, 50 ㎖ 원추형 튜브에 넣어 빙상에 보관하였다. 공정은 각 제조 샘플당 조직 250 mg 이하로 제한하였다 (1 팁/제조 샘플). 최종 농도 20mg/㎖로 냉각된 ddH2O 6.25 ㎖에 희석하여 프로테아제 용액을 새로이 제조하여, 4℃에 보관하였다. DNase A를 (100mg/㎖ 원액으로부터) 최종 농도 200 ㎍/㎖로 희석하여 G2 완충액 (20 ㎖)을 제조하였다. 에어로졸을 흡입하지 않기 위해 층류 (laminar-flow) TC 후드에서 폴리트론의 큰 팁을 사용하여, G2 완충액 19 ㎖ 중에서 종양 조직을 균질화시켜 실온에서 보관하였다. 샘플들 사이에서, ddH2O 2L 중에서 30초씩 2회에 이어 G2 완충액 (50 ㎖) 중에서 회전시켜 폴리트론을 씻었다. 조직이 팁에 여전히 존재하는 경우에는 장치를 분해하여 씻었다.
키아젠 프로테아제 (상기와 같이 제조함, 1.0 ㎖)를 가한 후, 볼텍싱하고 50℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해물이 투명해질 때까지 인큐베이션 및 원심분리를 반복하였다 (예를 들어, 30 내지 60분 동안 추가로 인큐베이션 후, 4℃에서 3000 ×g로 10분동안 펠릿화함).
인간 혈액 준비 및 용해:
표준 감염제 방법을 이용하여 건강한 지원자로부터 혈액을 채취하여 시트르산염 용액 10 ㎖에 넣었다. 냉각된 ddH2O 6.25 ㎖에 최종 농도 20 mg/㎖로 희석하여 프로테아제 용액을 새로이 제조하여, 4℃에 보관하였다. RNase A를 100 mg/㎖ 원액으로부터 최종 농도 200 ㎍/㎖로 희석하여 G2 완충액을 제조하였다. 혈액 (10㎖)을 50 ㎖ 원추형 튜브에 넣고, C1 완충액 10 ㎖ 및 ddH2O 30 ㎖ (모두 4℃로 미리 평형화시킴)을 가한 후, 인버팅하여 성분을 혼합하여 빙상에서 10분 동안 방치하였다. 4℃의 베크만 스윙 버킷 로터에서 2500 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 핵을 펠릿화시킨 후, 상층액을 버렸다. 핵을 C1 완충액(4℃) 2 ㎖ 및 ddH2O 6 ㎖ (4℃) 중에서 볼텍싱하여 현탁하였다. 펠릿이 백색이 될 때까지 볼텍싱을 반복하였다. 이어서, 200 ㎕ 팁을 사용하여 잔류 완충액에 핵을 재현탁하였다. 부드럽게 볼텍싱하면서 현탁된 핵에 G2 완충액(10 ㎖)을 가한 후, 30초 동안 격렬하게 볼텍싱하였다. 키아젠 프로테아제 (200 ㎕)를 가하고, 50℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해물이 투명해질 때까지 인큐베이션 및 원심분리를 반복하였다 (예를 들어, 30 내지 60분 동안 추가로 인큐베이션 후, 4℃에서 3000 ×g에서 10분동안 펠릿화함).
투명한 용해물의 정제:
(1)게놈 DNA 의 단리:
게놈 DNA를 QBT 완충액 10 ㎖에 평형화시켰다 (맥시 팁 (maxi tip) 당 1 샘플). QF 용출 완충액을 50℃에서 평형화시켰다. 샘플을 30초 동안 볼텍싱한 후, 평형화된 팁에 로딩하여 중력으로 배출시켰다. 팁을 QC 완충액 15 ㎖로 2회 세척하였다. QF 완충액 (50℃) 15 ㎖를 사용하여 , 실란화 및 멸균된 30 ㎖ 코렉스 (Corex) 튜브에 DNA를 용출시켰다. 이소프로판올 (10.5 ㎖)을 각 샘플에 가하고, 튜브를 파라핀으로 덮은 후, DNA가 침전될 때까지 인버젼 (inversion)을 계속 반복하여 혼합하였다. 4℃의 SS-34 로터 15,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 샘플을 펠릿화시켰다. 펠릿 위치를 표시하고, 상층액을 버린 후, 70% 에탄올 10 ㎖ (4℃)를 가하였다. 4℃의 SS-34 로터 10,000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하여 샘플을 펠릿화시켰다. 펠릿의 위치를 표시하고, 상층액을 버렸다. 이어서, 샘플이 과도하게 건조되지 않도록 주의하면서 튜브를 건조대에 넣고 37℃에서 10분 동안 건조시켰다.
건조 후, 펠릿을 TE(pH 8.5) 1.0 ㎖에 용해시키고, 50℃에 1 내지 2시간 동안 방치하였다. 계속 용해되도록 샘플을 4℃에 밤새 방치하였다. 이어서, 투베르쿨린 (tuberculin) 주사기 26 게이지 바늘을 사용하여 DNA 용액을 1.5 ㎖ 튜브에 옮겼다. 상기와 같이 옮기는 과정을 5회 반복하여 DNA를 절단하였다. 이어서, 샘플을 50℃에 1 내지 2시간 동안 방치하였다.
(2)게놈 DNA 의 정량 분석 및 유전자 증폭 분석을 위한 준비:
베크만 DU640 분광 광도계에서 0.1 ㎖ 석영 큐벳을 사용하여, 1:20 희석 (5 ㎕ DNA + 95 ㎕ ddH2O)된 샘플의 표준 A260/A280분광 분석법으로 각 튜브의 DNA 양을 정량하였다. A260/A280의 비율은 1.8 내지 1.9 사이였다. 이어서, 각 DNA 샘플을 TE (pH 8.5)중에 약 200 ng/㎖로 더 희석하였다. 원래의 재료가 매우 고농도 (약 700ng/㎕)인 경우에는 DNA가 재현탁될 때까지 50℃에 수시간 방치하였다.
하기와 같이 변형된 제조자의 안내서를 이용하여, 희석된 재료 (20 내지 600 ng/㎖)의 형광 DNA 정량법을 수행하였다. 이는 호퍼 (Hoeffer) DyNA 퀀트 (Quant)200 형광 광도계를 약 15분 동안 예열한 후 수행하였다. 획스트 (Hoechst) 염료 활성 용액 (#H33258, 10 ㎕, 사용 12시간 내에 제조)을 1 ×TNE 완충액 100 ㎖로 희석하였다. 2 ㎖ 큐벳을 형광 광도계 용액으로 채우고 기계에 넣은 후, 기계를 영점으로 조정하였다. pGEM2Zf(+) (2 ㎕, 로트번호 360851026)을 형광 광도계 용액 2 ㎖에 가하여 200 단위로 조정하였다. 추가의 pGEM2Zf(+) DNA 2 ㎕를 시험하여 값이 400±10 단위인지 확인하였다. 이어서, 각 샘플 값을 3회 이상 측정하였다. 3회의 샘플 측정값이 서로 10% 이내의 범위일 때, 이들의 평균을 취하여 정량치로 사용하였다.
이어서, 형광 광도계에 의해 측정된 농도를 이용하여 각 샘플의 농도가 10 ng/㎕가 되도록 ddH2O로 희석하였다. 단일 택맨 플레이트 분석용 주형의 모든 샘플에 대해 동시에 이를 수행하였으며, 500 내지 1000회 분석할 수 있는 충분한 재료로 수행하였다. 단일 플레이트상에서 택맨 (상표명) 프라이머 및 B-액틴과 GAPDH 프로브를 이용하여, 정상 인간 DNA 및 주형이 없는 대조용과 함께 시험을 3회 수행하였다. 시험 DNA로부터 감해진 정상 인간 DNA의 Ct 값이 ±1 Ct인 경우에 희석된 샘플을 사용하였다. 희석된 고품질의 게놈 DNA를 1.0 ㎖씩 분취하여 -80℃에 보관하였다. 이후에 유전자 증폭 분석에 사용될 분취액은 4℃에 보관하였다. 각 1 ㎖의 분취액은 8 내지 9 플레이트 또는 64회 시험에 충분하였다.
유전자 증폭 분석:
본 발명의 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269,PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 화합물을 하기의 원발성 종양에서 스크리닝하여, 얻어진 ΔCt 값을 표 7a 내지 7c에 기록하였다.
고찰 및 결론:
PRO197 ( DNA 22780-1078)
다양한 종양에서의 DNA22780-1078에 대한 ΔCt 값은 표 7a에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7a는 PRO197을 코딩하는 핵산 DNA22780-1078이 원발성 폐 종양 LT13, LT3, LT9, LT21, LT6, LT10, LT11, LT15 및 LT17에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA22780-1078은 다양한 폐 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA22780-1078에 의해 코딩되는 단백질 (PRO197)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO207 ( DNA 30879-1152):
다양한 종양에서의 DNA30879-1152에 대한 ΔCt 값은 표 7a에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7a는 PRO207을 코딩하는 핵산 DNA30879-1152가 (1) 원발성 폐 종양 LT13, LT3, LT21, LT11, LT15, LT17 및 LT19; (2) 원발성 결장 종양 CT3, CT10, CT15, CT1, CT4, CT5 및 CT11; 및 (3) 결장 종양 세포주 SW480, SW620, Colo320, HCT116 및 SKCO1에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA30879-1152는 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA30879-1152에 의해 코딩되는 단백질 (PRO207)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO226 ( DNA 33460-1166):
다양한 종양에서의 DNA33460-1166에 대한 ΔCt 값은 표 7a에 기록하였다. 통상,유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7a는 PRO226을 코딩하는 핵산 DNA33460-1166이 (1) 원발성 폐 종양 LT7, LT13, LT3, LT4, LT9, LT21, LT1a, LT11, LT15, LT17 및 LT19; (2) 원발성 결장 종양 CT2, CT3, CT12, CT14, CT15, CT4, CT5 및 CT11; 및 (3) 결장 종양 세포주 SW480, SW620, HT29, HM7, WiDr, HCT116, SKCO1 및 SW403에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA33460-1166은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA33460-1166에 의해 코딩되는 단백질 (PRO226)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO232 ( DNA 34435-1140):
다양한 종양에서의 DNA34435-1140에 대한 ΔCt 값은 표 7a에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7a는 PRO232를 코딩하는 핵산 DNA34435-1140이 (1) 원발성 폐 종양 LT12, LT15, LT17, LT18 및 LT19; 및 (2) 원발성 결장 종양 CT1, CT4, CT5, CT7, CT9, CT11 및 CT18에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA34435-1140은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA34435-1140에 의해 코딩되는 단백질 (PRO232)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO243 ( DNA 35917-1207):
다양한 종양에서의 DNA35917-1207에 대한 ΔCt 값은 표 7a에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7a는 PRO243을 코딩하는 핵산 DNA35917-1207이 (1) 원발성 폐 종양 LT13, LT3, LT12, LT11, LT15, LT16, LT17 및 LT19; 및 (2) 원발성 결장 종양 CT14 및 CT5에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA35917-1207은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA35917-1207에 의해 코딩되는 단백질 (PRO243)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO256 ( DNA 35880-1160):
다양한 종양에서의 DNA35880-1160에 대한 ΔCt 값은 표 7a에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7a는 PRO256을 코딩하는 핵산 DNA35880-1160이 결장 종양 세포주 SW620, HT29, WiDr 및 HCT116에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA35880-1160은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA35880-1160에 의해 코딩되는 단백질 (PRO256)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO269 ( DNA 38260-1180):
다양한 종양에서의 DNA38260-1180에 대한 ΔCt 값은 표 7a에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7a는 PRO269를 코딩하는 핵산 DNA38260-1180이 원발성 폐 종양 LT7, LT13, LT9, LT12, LT11, LT15, LT17 및 LT19에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA38260-1180은 다양한 폐 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA38260-1180에 의해 코딩되는 단백질 (PRO269)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO274 ( DNA 39987-1184):
다양한 종양에서의 DNA39987-1184에 대한 ΔCt 값은 표 7a에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7a는 PRO274를 코딩하는 핵산 DNA39987-1184가 원발성 폐 종양 LT4, LT16 및 LT18에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA39987-1184는 다양한 폐 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA39987-1184에 의해 코딩되는 단백질 (PRO274)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO304( DNA 39520-1217):
다양한 종양에서의 DNA39520-1217에 대한 ΔCt 값은 표 7a에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7a는 PRO304를 코딩하는 핵산 DNA39520-1217이 원발성 폐 종양 LT13, LT12, LT11, LT15, LT16, LT17 및 LT19에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA39520-1217은 다양한 폐 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA39520-1217에 의해 코딩되는 단백질 (PRO304)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO339 ( DNA 43466-1225):
다양한 종양에서의 DNA43466-1225에 대한 ΔCt 값은 표 7c에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7a는 PRO339를 코딩하는 핵산 DNA43466-1225가 원발성 폐 종양 LT7, LT13, LT3, LT9, LT12, LT11 및 LT17에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA43466-1225는 다양한 폐 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA43466-1225에 의해 코딩되는 단백질 (PRO339)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO1558 ( DNA 71282-1668):
다양한 종양에서의 DNA71282-1668에 대한 ΔCt 값은 표 7c에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7c는 PRO1558을 코딩하는 핵산 DNA71282-1668이 (1) 원발성 폐 종양 HF-000840, HF-000842, HF-001294, HF-001296 및 HF-001299; 및 (2) 결장 종양 센터 HF-000795에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA71282-1668은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA71282-1668에 의해 코딩되는 단백질 (PRO1558)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO779 ( DNA 58801-1052):
다양한 종양에서의 DNA58801-1052에 대한 ΔCt 값은 표 7a에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7a는 PRO779를 코딩하는 핵산 DNA58801-1052가 (1) 원발성 폐 종양 LT13, LT3, LT9, LT12, LT21, LT1-a, LT6, LT10, LT11, LT15, LT16, LT17, LT18, LT19 및 HF-000840; (2) 원발성 결장 종양 CT2, CT3, CT8, CT10, CT12, CT14, CT15, CT16, CT17, CT1, CT4, CT5, CT6, CT7, CT9 및 CT11; 및 (3) 결장 종양 세포주 SW480, SW620, Colo320, HT29, HM7, WiDr, HCT116, SKCO1 및 LS174T에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA58801-1052는 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA58801-1052에 의해 코딩되는단백질 (PRO779)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO1185 ( DNA 62881-1515):
다양한 종양에서의 DNA62881-1515에 대한 ΔCt 값은 표 7a에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7a는 PRO1185를 코딩하는 핵산 DNA62881-1515가 (1) 원발성 폐 종양 LT3, LT30 및 LT26; 및 (2) 원발성 결장 종양 CT2에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA62881-1515는 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA62881-1515에 의해 코딩되는 단백질 (PRO1185)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO1245 ( DNA 64884-1527):
다양한 종양에서의 DNA64884-1527에 대한 ΔCt 값은 표 7a에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7a는 PRO1245를 코딩하는 핵산 DNA64884-1527이 (1) 원발성 폐 종양 LT13, LT15 및 LT16; (2) 폐 종양 세포주 H522; 및 (3) 원발성 결장 종양 CT15에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA64884-1527은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA64884-1527에 의해 코딩되는단백질 (PRO1245)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO1759 ( DNA 76531-1701):
다양한 종양에서의 DNA76531-1701에 대한 ΔCt 값은 표 7b에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7b는 PRO1759를 코딩하는 핵산 DNA76531-1701이 (1) 원발성 폐 종양 HF-000840 및 HF-001296; 및 (2) 원발성 결장 종양 센터 HF-000795에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA76531-1701은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA76531-1701에 의해 코딩되는 단백질 (PRO1759)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO5775 ( DNA 96869-2673):
다양한 종양에서의 DNA96869-2673에 대한 ΔCt 값은 표 7b에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7b는 PRO5775를 코딩하는 핵산 DNA96869-2673이 (1) 원발성 폐 종양 HF-000631, HF-000641, HF-000643, HF-000840, HF-000842, HF-001293, HF-001294, HF-001295, HF-001296 및 HF-001299; 및 (2) 원발성 결장 종양 센터 HF-000762, HF-000789 및 HF-000811에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA96869-2673은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA96869-2673에 의해 코딩되는 단백질 (PRO5775)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO7133 ( DNA 128451-2739):
*다양한 종양에서의 DNA128451-2739에 대한 ΔCt 값은 표 7b에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7b는 PRO7133을 코딩하는 핵산 DNA128451-2739가 (1) 원발성 폐 종양 HF-000840 및 HF-001296; 및 (2) 원발성 결장 종양 센터 HF-000795 및 HF-000811에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA128451-2739는 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA128451-2739에 의해 코딩되는 단백질 (PRO7133)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO7168 ( DNA 102846-2742):
다양한 종양에서의 DNA102846-2742에 대한 ΔCt 값은 표 7b에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7b는 PRO7168을 코딩하는 핵산 DNA102846-2742가 원발성 폐 종양 HF-000631, HF-000840 및 HF-000842에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA102846-2742는 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA102846-2742에 의해 코딩되는 단백질 (PRO7168)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO5725 ( DNA 92265-2669):
다양한 종양에서의 DNA92265-2669에 대한 ΔCt 값은 표 7b에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7b는 PRO5725를 코딩하는 핵산 DNA92265-2669가 (1) 원발성 폐 종양 HF-000641, HF-000840, HF-001295 및 HF-001296; 및 (2) 원발성 결장 종양 센터 HF-000762 및 HF-000795에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA92265-2669는 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA92265-2669에 의해 코딩되는 단백질 (PRO5725)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO202 ( DNA 30869):
다양한 종양에서의 DNA30869에 대한 ΔCt 값은 표 7b에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7b는 PRO202를 코딩하는 핵산 DNA30869가 원발성 폐 종양 LT7, LT13, LT1, LT3, LT4, LT9, LT12, LT1a, LT6, LT11, LT15, LT16, LT17및 LT19에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA30869는 다양한 폐 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA30869에 의해 코딩되는 단백질 (PRO202)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO206 ( DNA 34405):
다양한 종양에서의 DNA34405에 대한 ΔCt 값은 표 7b에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7b는 PRO206을 코딩하는 핵산 DNA34405가 원발성 결장 종양 CT2, CT10, CT12, CT14, CT15, CT16, CT5 및 CT18에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA34405는 다양한 결장 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA34405에 의해 코딩되는 단백질 (PRO206)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO264 ( DNA 36995):
다양한 종양에서의 DNA36995에 대한 ΔCt 값은 표 7b에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7b는 PRO264를 코딩하는 핵산 DNA36995가 원발성 폐 종양 LT3, LT4, LT9, LT1a, LT6 및 LT17에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA36995는 다양한 폐 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA36995에 의해 코딩되는 단백질(PRO264)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO313 ( DNA 43320):
다양한 종양에서의 DNA43320에 대한 ΔCt 값은 표 7b에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7b는 PRO313을 코딩하는 핵산 DNA43320이 (1) 원발성 폐 종양 LT9, LT12, LT16 및 LT19; (2) 원발성 결장 종양 CT2, CT1, CT4, CT5, CT9 및 CT11; 및 (3) 결장 종양 세포주 SW620에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA43320은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA43320에 의해 코딩되는 단백질 (PRO313)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO342 ( DNA 38649):
다양한 종양에서의 DNA38649에 대한 ΔCt 값은 표 7b에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7b는 PRO342를 코딩하는 핵산 DNA38649가 (1) 원발성 폐 종양 LT7, LT13, LT3, LT9, LT12, LT21, LT1a, LT6, LT10, LT11, LT15, LT16, LT17, LT19, HF-000840, HF-000842, HF-001294 및 HF-001296; (2) 원발성 결장 종양 CT2, CT3, CT8, CT10, CT12, CT14, CT15, CT16, CT17, CT1, CT4, CT5, CT6, CT9 및 CT11; (3) 폐 종양 세포주 Calu-1 및 H441; 및 (4) 결장 종양 세포주 SW620 및 LS174T에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA38649는 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA38649에 의해 코딩되는 단백질 (PRO342)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO542 ( DNA 56505):
다양한 종양에서의 DNA56505에 대한 ΔCt 값은 표 7b에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7b는 PRO542를 코딩하는 핵산 DNA56505가 (1) 원발성 폐 종양 LT7, LT13, LT12, LT21, LT10, LT16, LT17, LT18 및 LT19; (2) 원발성 결장 종양 CT10, CT12, CT14, CT5 및 CT9; (3) 폐 종양 세포주 H441; (4) 결장 종양 세포주 SW480, SW620, HT29, WiDr, HCT116, SKCO1, SW403 및 LS174T; 및 (5) 유방 종양 세포주 HBL100 및 MCF7에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA56505는 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA56505에 의해 코딩되는 단백질 (PRO542)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO773 ( DNA 48303):
다양한 종양에서의 DNA48303에 대한 ΔCt 값은 표 7b에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7b는 PRO773을 코딩하는 핵산 DNA48303이 (1) 원발성 폐 종양 LT13 및 LT16; (2) 원발성 결장 종양 CT15, CT16 및 CT17; (3) 결장 종양 세포주 Colo320, HT29 및 Colo205; 및 (4) 폐 종양 세포주 H441에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA48303은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA48303에 의해 코딩되는 단백질 (PRO773)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO861 ( DNA 50798):
다양한 종양에서의 DNA50798에 대한 ΔCt 값은 표 7b에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7b는 PRO861을 코딩하는 핵산 DNA50798이 (1) 원발성 폐 종양 LT13, LT12, LT8, LT1a, LT11, LT15 및 LT16; (2) 원발성 결장 종양 CT2, CT3, CT8, CT10, CT12, CT14, CT15, CT16, CT17, CT1, CT4, CT5, CT7, CT9 및 CT11; 및 (3) 폐 종양 세포주 H441 및 H522에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA50798은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA50798에 의해 코딩되는 단백질 (PRO861)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO1216 ( DNA 66489):
다양한 종양에서의 DNA66489에 대한 ΔCt 값은 표 7b에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7b는 PRO1216을 코딩하는 핵산 DNA66489가 (1) 원발성 폐 종양 LT7 및 LT12; (2) 원발성 결장 종양 CT12 및 CT5; 및 (3) 결장 종양 세포주 WiDr, HCT116, SW403 및 LS174T에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA66489는 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA66489에 의해 코딩되는 단백질 (PRO1216)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO1686 ( DNA 80896):
다양한 종양에서의 DNA80896에 대한 ΔCt 값은 표 7c에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7c는 PRO1686을 코딩하는 핵산 DNA80896이 (1) 원발성 폐 종양 LT13, LT11, LT15, LT17, LT18, HF-000840, HF-000842, HF-001294, HF-001296 및 HF-001299; (2) 원발성 결장 종양 CT2, CT10, CT12, CT1, CT4, CT5, CT6 및 CT11; 및 (3) 결장 종양 센터 HF-000795에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA80896은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA80896에 의해 코딩되는 단백질 (PRO1686)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO1800 ( DNA 35672-2508):
다양한 종양에서의 DNA35672-2508에 대한 ΔCt 값은 표 7c에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7c는 PRO1800을 코딩하는 핵산 DNA35672-2508이 (1) 원발성 폐 종양 LT13, LT12, LT21, LT11, LT15, LT16, LT17, LT18 및 LT19; (2) 원발성 결장 종양 CT2, CT14, CT15, CT5 및 CT11; 및 (3) 결장 종양 세포주 Colo320에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA35672-2508은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA35672-2508에 의해 코딩되는 단백질 (PRO1800)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO3562 ( DNA 96791):
다양한 종양에서의 DNA96791에 대한 ΔCt 값은 표 7c에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7a는 PRO3562를 코딩하는 핵산 DNA96791이 (1) 원발성 폐 종양 LT13, LT16 및 HF-000840; (2) 원발성 결장 종양 CT15; (3) 결장 종양 센터 HF-000539; (4) 폐 종양 세포주 H522; (5) 결장 종양 세포주 SW620 및 HCT116; (6) 유방 종양 HF-000545; 및 (7) 고환 종양 HF-000733 및 HF-000716에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA96791은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA96791에 의해 코딩되는 단백질 (PRO3562)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO9850 ( DNA 58725):
다양한 종양에서의 DNA58725에 대한 ΔCt 값은 표 7c에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7c는 PRO9850을 코딩하는 핵산 DNA58725가 (1) 원발성 폐 종양 LT13, LT12, LT11 및 LT15; 및 (2) 원발성 결장 종양 CT10, CT15, CT16, CT1, CT4, CT5, CT6, CT7 및 CT11에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA58725는 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA58725에 의해 코딩되는 단백질 (PRO9850)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO539 ( DNA 47465-1561):
다양한 종양에서의 DNA47465-1561에 대한 ΔCt 값은 표 7c에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7c는 PRO539를 코딩하는 핵산 DNA47465-1561이 (1) 원발성 폐 종양 LT13, LT12, LT21, LT15, LT17 및 LT19; 및 (2) 원발성 결장 종양 CT3, CT10, CT12, CT15 및 CT11에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA47465-1561은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA47465-1561에 의해 코딩되는 단백질 (PRO539)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO4316 ( DNA 94713-2561):
다양한 종양에서의 DNA94713-2561에 대한 ΔCt 값은 표 7c에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7a는 PRO4316을 코딩하는 핵산 DNA94713-2561이 (1) 원발성 폐 종양 HF-000840; 및 (2) 원발성 결장 종양 센터 HF-000795에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA94713-2561은 다양한 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA94713-2561에 의해 코딩되는 단백질 (PRO4316)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
PRO4980 ( DNA 97003-2649):
다양한 종양에서의 DNA97003-2649에 대한 ΔCt 값은 표 7c에 기록하였다. 통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 7c는 PRO4980을 코딩하는 핵산 DNA97003-2649가 원발성 폐 종양 HF-000840, HF-001294, HF-001296 및 HF-001299에서 상당히 증폭되었음을 나타낸다.
DNA97003-2649는 다양한 폐 종양에서 증폭되었기 때문에 종양 형성 또는 성장에 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다. 결과적으로, DNA97003-2649에 의해 코딩되는 단백질 (PRO4980)에 대한 길항제 (예, 항체)는 암 치료에 용도를 가질 것으로 예상된다.
실시예 27: 계내 혼성화
계내 혼성화는 세포 및 조직 표본 내의 핵산 서열을 검출하고 위치를 파악하게 하는 강력한 다용도 기술이다. 예를 들어, 유전자 발현 부위의 확인, 전사되는 조직의 분포, 바이러스 감염 확인 및 그 위치 파악, 특정 mRNA 합성에 따른 변화 및 염색체 지도화의 보조에 유용할 수 있다.
PCR로 생성된33P-표지 리보프로브를 이용하여 문헌 [Lu and Gillett, CellVision 1:169-176 (1994)]의 최적 버전의 방법으로 계내 혼성화를 수행하였다. 요컨대, 포르말린으로 고정되어 파라핀에 매몰된 인간 조직을 절단하고, 파라핀을 제거한 후, 37℃에서 15분 동안 프로테이나제 K (20 ng/㎖)로 단백질을 제거하고, 상기 문헌 (Lu and Gillett)에 기재된 바와 같이 계내 혼성화로 추가 처리하였다. PCR 생성물로부터 (33P)-UTP로 표지된 안티센스 리보프로브를 생성하고 55℃에서 밤새 혼성화하였다. 슬라이드를 Kodak NTB2 (상표명) 핵 트랙 에멀젼 (nuclear track emulsion) 중에 담그고 4주 동안 노출시켰다.
33 P- 리보프로브 합성
33P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000Ci/mmol) 6.0 ㎕ (125 mCi)를 고속 진공기 (speed vac)에서 건조시켰다. 건조된33P-UTP를 포함하는 각 튜브에 하기 성분을 가하였다.
2.0 ㎕ 5×전사 완충액
1.0 ㎕ DTT (100 mM)
2.0 ㎕ NTP 혼합물 (2.5 mM: 각각 10 mM인 GTP, CTP 및 ATP 10 ㎕ + 10 ㎕ H2O)
1.0 ㎕ UTP (50 μM)
1.0 ㎕ RNasin
1.0 ㎕ DNA 주형 (1 ㎍)
1.0 ㎕ H20
1.0 ㎕ RNA 폴리머라제 (PCR 생성물의 경우에 통상 T3 = AS, T7 = S)
37℃에서 1시간 동안 상기 튜브를 인큐베이션하였다. RQ1 DNase 총 1.0 ㎕를 가한 후에 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. TE (10 mM Tris pH 7.6/1 mM EDTA pH 8.0) 총 90 ㎕를 가하고, 피펫으로 상기 혼합물을 DE81 페이퍼에 가하였다. MICROCON-50 (상표명) 한외여과 유닛에 잔류 용액을 로딩하고 프로그램 10을 이용하여 6분 동안 회전시켰다. 제2 튜브 위에 여과 유닛을 거꾸로 올려놓고 프로그램 2를 이용하여 3분 동안 회전시켰다. 최종 회수를 위해 회전시킨 후에, TE 100 ㎕를 가한 후, DE81 페이퍼 상에 최종 생성물 1 ㎕를 피펫으로 가하고 6 ㎖의 Biofluor Ⅱ (상표명)로 계수하였다.
TBE/요소 겔 상에 프로브를 전개시켰다. 로딩 완충액 3 ㎕에 프로브 1 내지 3 ㎕ 또는 RNA Mrk Ⅲ 5 ㎕를 가하였다. 95℃ 가열 블록 (heat block)에서 3분 동안 가열한 후에, 겔을 즉시 빙상에 놓았다. 겔의 웰을 세척한 후, 샘플을 로딩하고 180 내지 250 볼트에서 45분 동안 전개하였다. 플라스틱 랩 (SARAN (상표명) 브랜드)으로 겔을 싸고, -70℃ 냉동고에서 1시간 내지 밤새의 시간 동안 신호 증강 스크린 상에서 XAR 필름에 노출시켰다.
33 P- 혼성화
A.동결 단편의 예비처리:
냉동고로부터 슬라이드를 꺼내 알루미늄 트레이에 놓고 실온에서 5분 동안 해동시켰다. 응축 감소를 위해, 트레이를 55℃ 배양기에 5분 동안 놓아 두었다. 발연 후드 (fume hood) 내의 빙상의 4% 파라포름알데히드 중에서 10분 동안 슬라이드를 고정시키고, 실온에서 0.5×SSC (25 ㎖ 20×SSC + 975 ㎖ SQ H2O)로 5분 동안 세척하였다. 프로테이나제 K 0.5 ㎍/㎖ (예열된, RNAse가 없는 RNAse 완충액 250 ㎖ 중의 10 mg/㎖ 원액 12.5 ㎕)로 37℃에서 10분 동안 단백질 제거한 후에, 실온에서 10분 동안 0.5×SSC로 단편을 세척하였다. 70%, 95%, 100% 에탄올 중에서 각각 2분 동안 단편을 탈수하였다.
B.파라핀에 매몰된 단편의 예비처리:
슬라이드를 파라핀 제거하고 SQ H2O 중에 놓고 실온에서 2×SSC로 5분씩 2회 세척하였다. 인간 배 (embryo)의 경우 프로테이나제 K (RNase가 없는 RNase 완충액 250 ㎖ 중의 10 mg/㎖ 용액 500 ㎕, 37℃, 15분) 20 ㎕/㎖ 중에서, 또는 포르말린 조직의 경우 8×프로테이나제 K (RNase 완충액 250 ㎖ 중의 100 ㎕, 37℃, 30분) 중에서 단편을 단백질 제거하였다. 이어서, 상기 기재된 바와 같이 0.5×SSC로 세척하고 탈수하였다.
C.예비혼성화:
Box 완충액 (4×SSC, 50% 포름아미드)으로 포화된 여과지에 의해 구획이 나뉜 플라스틱 상자에 슬라이드를 놓았다. 50 ㎕ 혼성화 완충액 (덱스트란 술페이트 3.75 g + SQ H2O 6 ㎖)으로 조직를 덮고, 볼텍싱 후, 뚜껑을 느슨하게 한 상태로 2분 동안 극초단파로 가열하였다. 빙상에서 냉각시킨 후에, 포름아미드 18.75 ㎖, 20×SSC 3.75 ㎖ 및 SQ H2O 9 ㎖를 가하고 조직을 잘 볼텍싱한 후, 42℃에서 1내지 4시간 동안 인큐베이션하였다.
D.혼성화:
슬라이드 당 1.0 ×106cpm의 프로브 및 tRNA (50 mg/㎖ 원액) 1.0 ㎕를 95℃에서 3분 동안 가열하였다. 빙상에서 슬라이드를 냉각하고, 슬라이드 당 혼성화 완충액 48 ㎕를 가하였다. 볼텍싱한 후에, 슬라이드 상의 예비혼성화 시료 50 ㎕에33P 혼합물 50 ㎕를 가하였다. 슬라이드를 55℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
E.세척:
실온에서 2×SSC, EDTA (20×SSC 400 ㎖ + 0.25M EDTA 16 ㎖, 최종 부피=4L)로 10분씩 2회 세척한 후에, 37℃에서 30분 동안 RNAse A로 처리하였다 (Rnase 완충액 250 ㎖ 중 10 mg/㎖ 농도의 RNase 500 ㎕ = 20㎍/㎖). 실온에서 2×SSC, EDTA로 10분씩 2회 슬라이드를 세척하였다. 엄격한 세척 조건은 55℃, 0.1×SSC, EDTA (20×SSC 20 ㎖ + EDTA 16 ㎖, 최종 부피 = 4L)에서 2시간이다.
F.올리고뉴클레오티드
본원에 개시된 6개의 DNA 서열에 대해 계내 분석을 수행하였다. 이 분석에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다:
(1)PRO197 ( DNA 22780-1078):
DNA22780.p1:
5'-GAA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CGC CAC CGC CGT GCT ACT GA-3'
(서열번호 247)
DNA22780.p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TGC AGG CGG CTG ACA TTG TGA-3'
(서열번호 248)
(2)PRO207 ( DNA 30879-1152):
DNA30879.p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TCC TGC GCC TTT CCT GAA CC-3'
(서열번호 249)
DNA30879.p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GAC CCA TCC TTG CCC ACA GAG-3'
(서열번호 250)
(3)PRO226 ( DNA 33460-1166):
DNA33460.p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CAG CAC TGC CGG GAT GTC AAC-3'
(서열번호 251)
DNA33460.p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GTT TGG GCC TCG GAG CAG TG-3'
(서열번호 252)
(4)PRO232 ( DNA 34435-1140):
DNA34435.p1:
5'-GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC ACC CAC GCG TCC GGC TGC TT-3'
(서열번호 253)
DNA34435.p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CGG GGG ACA CCA CGG ACC AGA-3'
(서열번호 254)
(5)PRO243 ( DNA 35917-1207):
DNA35917.p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AAG GAG CCG GGA CCC AGG AGA-3'
(서열번호 255)
DNA35917.p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GGG GGC CCTTGG TGC TGA GT-3'
(서열번호 256)
(6)PRO342 ( DNA 38649):
DNA38649.p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGG GCC TTC ACC TGC TCC ATC-3'
(서열번호 257)
DNA38649.p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GCT GCG TCT GGG GGT CTC CTT-3'
(서열번호 258)
7. 결과
(1)PRO197 ( DNA 22780-1078) ( NL 2):
중간 내지 강한 신호가 염증이 발생한 충수의 양성이나 반응성인 간질세포에서 발견되었다. 이들 세포는 통상 현저한 핵인을 갖는 거대한 핵을 갖는다. 강한 신호가 유선암종 및 종양주변 간질세포의 작은 부분 (<5％)에 존재하였다. 양성 세포의 조직학적 양상은 인접한 음성 세포와 두드러지게 구분되지 않았다. 매우 국소적으로 양성 신호가 괴사 조직에 인접한 신세포 암종의 종양 및(또는) 간질세포에서 확인되었다. 폐 선암종에서는 신호가 발견되지 않았다.
(2)PRO207 ( DNA 30879-1152) ( Apo 2L 동족체 ):
낮은 수준의 발현이 연골육종 및 다른 연조직 육종에서 발견되었다. 다른 모든 조직은 음성이었다.
태반, 탯줄, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위장, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 체벽, 골반 및 하지를 포함한 인간 태아 조직 (E12-E16주)을 조사하였다.
신장 (정상 및 말기), 부신, 심근, 비장, 림프절, 췌장, 폐, 피부, 눈 (망막 포함), 방광 및 간 (정상, 경변 및 급성 부전)을 포함한 인간 성인 조직을 조사하였다.
침팬지 조직으로 타액선, 위장, 갑상선, 부갑상선, 혀, 흉선, 난소 및 림프절, 붉은털 원숭이 조직으로 대뇌 피질, 해마, 소뇌 및 음경을 포함한 비인간 영장류 조직을 조사하였다.
(3)PRO226 ( DNA 33460-1166)( EGF 동족체 ):
특정 신호가 태아 눈에서 발생중인 외안근에 매우 인접한 소성 결합 조직 세포에서 발견되었다. 또한, 중간 정도의 발현이 연조직 육종에서 발견되었다.
(4)PRO232 ( DNA 34435-1140) ( 간상 세포 항원 동족체 ):
인간 및 태아 조직에서의 발현 형태
강한 발현이 전립선 상피세포 및 방광 상피세포에서 발현되었으며, 이보다 낮은 수준의 발현이 기관지 상피세포에서 발현되었다. 낮은 수준의 발현이 뼈, 혈액, 연공육종, 성인 심장 및 태아 간을 포함한 많은 부위에서 발견되었다. 다른 모든 조직은 음성이었다.
신우 요관의 요로상피 및 붉은 털원숭이 음경의 요도에서의 발현
전립선 상피, 방광의 요로 상피의 표층, 신우의 요로상피 내층, 및 요관의 요로상피 (2회 실험중 1회)에서 발현이 관찰되었다. 붉은털 원숭이의 요도는 음성이었다. 요도에서 실제로 발현되지 않은 것인지 또는 붉은털 원숭이 조직과 프로브가 교차반응하지 못한 결과인지 확실하지 않았다. 전립선 및 방광에서의 발견은 동위원소 검출법을 이용한 앞서 기재된 실험 결과와 유사하였다. 이 항원의 mRNA 발현은 전립선 상피에 특이적이지 않았다. 항원은 요로상피 유래 조직의 유용한 마커로 작용할 수 있다. 또한, 요도 상피의 유사분열 후에 표층 세포에서의 발현은 기저 상피에서 특이적으로 발현될 것으로 예상되지만, 특이적 간상세포 마커를 나타내지 않을 것을 시사한다.
전립선 및 방광암에서의 PSCA
다양한 단계의 전립선암 및 방광암의 6개 샘플, 정상 신우, 요관, 방광, 전립선 (정낭 포함) 및 음경요관, 및 LNCaP 및 PC3 전립선 암 세포주의 펠릿의 각 1 샘플을 분석하였다. 각 샘플을 PSCA의 센스 및 항-센스 프로브, 및 베타-액틴만의 항-센스 프로브 (mRNA의 완전한 상태 대조군)와 혼성화하였다.
신우, 요관, 및 방광, 및 음경 요관의 중층원주상피의 정상 이행 상피는 모두 PSCA에 대해 양성이었다. 이들 중 방광 및 신우의 표충 (우산) 세포에서 가장 강하게 양성을 나타내었다. 정상의 전립선 선세포 상피에서는 PSCA에 일정하지 않게 양성을 나타내었다. 동일한 조직편 내에서 음성 선에 매우 인접한 선에서 중간 내지 강한 양성을 나타내었다. 모든 양성 상피세포 (방광 및 전립선)는 이행 또는 전립선 상피에서 더 강하게 발현하였다. 정낭 상피 및 다른 모든 조직 (신경, 혈관, 섬유상 간질, 신실질)은 PSCA을 발현하지 않았다.
전립선 종양 세포는 통상 PSCA-음성이다. LNCaP 및 PC3 세포 및 6개 조직 샘플 중 3개의 샘플에서 검출만한 발현이 확인되지 않았다. 중간 내지 약하게 양성인 세포는 6개의 전립선 종양 샘플에서만 발견되었다. PSCA-음성 전립선 종양 샘플은 베타-액틴 발현을 나타내었으며, 이는 mRNA가 적절하게 보존되었음과 일치한다.
유두 이행 암종 세포 (6개의 샘플 중 5개 샘플)는 PSCA에 대해 중간 또는 강하게 양성이었다. 6개 종양 중 하나 (거의 분화되지 않은 침습적인 TCC 경우)는 국소적으로만 양성 세포를 나타내었다.
또다른 방광암 및 암 표본에서 PSCA 및 PSA 발현
전립선암의 13 샘플 (모두 중간 내지 거의 분화되지 않은 선암종), 종양이 없은 전립선 1 샘플, 및 다양한 단계의 방광 이행성 세포 암종 (8개는 매우 분화되었으며,3개는 중간정도로 분화되었으며, 두개는 거의 분화되지 않음)을 PSCA의 센스 및 항-센스 프로브, 및 베타-액틴만의 항-센스 프로브 (mRNA의 완전한 상태 대조군)와 혼성화시켰다. 또다른 대조군으로, 14개의 전립선 케이스 (case)를 앞선 연구의 전립선 CA의 6개 절편과 같이 PSA의 항-센스 프로브와 혼성화시켰다.
전립선암의 1 케이스 (#127)는 PSCA의 균일하게 높은 발현을 나타내었다. 전립선 CA의 2 케이스 (#399, #403)는 단지 국소적으로만 높은 수준의 PSCA 발현을 나타내었으며, 한 케이스 (#124)는 국소적으로 중간정도의 발현을 나타내었으며, 이들 모두는 선 (gland)에 따라 큰 가변성을 나타내었다. 상기 3 케이스의 대부분의 영역 및 나머지 9 경우의 모든 영역은 PSCA를 균일하게 약하게 발현하거나 발현하지 않았다. 낮은 PSCA 신호는 mRNA 분해에 의한 것이 아니었다. PSCA에 음성인 모든 케이스의 전립선 CA는 PSA 및(또는) 베타-액틴에 양성이었다.
모두 11개의 매우 또는 중간 정도로 분화된 방광의 이행성 암종은 PSCA를 균일하게 중간 정도로 또는 강하게 양성을 나타내었다. 거의 분화되지 않은 두개의 종양은 음성이거나 단지 약하게 양성을 나타내었다.
이러한 결과는 앞서 기재된 연구를 뒷받침한다. 이들 두가지 연구에서, 19개 전립선 CA 케이스를 조사하였다. 19개 중 하나는 높은 발현을 나타내었다. 19개 중 6개는 소수의 종양 세포에서 국소적으로 높은 발현을 나타내었다. 19개중 12개는 음성 또는 단지 약하게 양성을 나타내었다. 한편, 두 연구는 19개의 방광 TCC 케이스를 포함하였으며, 이들의 대부분은 균일하게 중간 정도 내지 강하게 PSCA-양성을 나타내었다. 매우 또는 중간 정도로 분화된 16개의 TCC 케이스 모두는 양성이었다. 거의 분화되지 않은 3 케이스는 단지 약하게 양성을 나타내었다.
(5)PRO243 ( DNA 35917-1207) ( 코르딘 동족체 ):
대퇴골두 및 관골절구 (엉덩이 관절) 사이에 형성하는 발생하는 윤활 관절의 절단선에서 약하게 발현되었다. 이러한 발현 형태가 그밖의 관절 형성 부위에서 관찰된다면, 이는 선조체 증후군 (Cornelia de Lange syndrome)에서 관찰되는 안면 및 사지 이상을 설명할 수 있을 것이다.
인간 태아의 안면, 머리, 사지 및 마우스 배아의 또다른 절편도 조사하였다. 모든 마우스 조직에서 발현되지 않았다. 항-센스 프로브만을 이용하여 발현을 관찰하였다.
발생하는 사지 및 골막내 중간엽의 안면골에 인접한 부위에서 발현이 관찰되었다. 발현은 매우 특이적이며 흔히 혈관형성이 진행되는 영역에 인접하였다. 선조체 증후군에서 발견되는 골격 이상에서 발견과 일치하여 분포한다. 또한, 발생하는 태아 뇌의 측두엽 및 후두엽에서 발현되었으나 그밖에는 발현되지 않았다. 또한, 발생하는 내이의 신경절에서 발현되었다.
(6)PRO342 ( DNA 38649)(IL-1 수용체 동족체 ):
이 DNA는 많은 조직 및 많은 세포형에서 발현되었다. 태아의 망막 내측, 후근절, 소장 상피세포, 흉선 수질 및 비장에서 발현되었다. 성인의 신세뇨관, 간세포 (hepatocyte) 및 방광의 상피세포에서 발현되었다. 또한, 침윤 염증성 세포 및 골육종에서도 발현되었다. 침팬지의 위장 상피, 타액선 및 흉선에서 발현되었다. 조사된 다른 조직에서는 특이적인 발현이 입증되지 않았다.
간, 신장, 부신, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위장, 비장, 생식선, 척수 및 체벽을 포함한 태아 조직 (E12-E16 주)을 조사하였다. 간, 신장, 위장, 방광, 전립선, 폐, 신세포 암종, 골육종, 간염 및 간경화를 포함한 성인 인간 조직을 조사하였다. 갑상선, 신경, 혀, 흉선, 부신성 위점막 및 타액선을 포함한 침팬지 조직을 조사하였다. 붉은털 원숭이 뇌를 포함한 붉은털 원숭이 조직을 조사하였다.
또한, 8개의 폐 편평상피 및 8개의 폐 선암종을 조사하였다. 발현 수준은 가변적이었으나, 모든 종양에서 발현이 관찰되었다. 신호 강도를 기초로 하여 종양을 고발현체 및 저발현체로 분류하였다. 종양 중 3개 (2개의 선암종: 96-20125 및 96-3686, 및 1개의 편평세포암: 95-6727)을 고발현체로 분류하였다. 또한,정상의 양성 기관지 상피 및 림프양 침윤에서도 중간 정도의 발현이 관찰되었으며, 이는 이 수용체가 대부분의 표본에서 널리 발현된다는 앞선 관찰과 일치한다.
실시예 28: PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 혼성화 프로브로서의 용도
하기 방법은 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는PRO4980 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 혼성화 프로브로서의 용도를 기재한다.
본원에서 개시된 전장 또는 성숙 "PRO197", "PRO207", "PRO226", "PRO232", "PRO243", "PRO256", "PRO269", "PRO274", "PRO304", "PRO339", "PRO1558", "PRO779", "PRO1185", "PRO1245", "PRO1759", "PRO5775", "PRO7133", "PRO7168", "PRO5725", "PRO202", "PRO206", "PRO264", "PRO313", "PRO342", "PRO542", "PRO773", "PRO861", "PRO1216", "PRO1686", "PRO1800", "PRO3562", "PRO9850", "PRO539", "PRO4316" 또는 "PRO4980" 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함하는 DNA 및(또는) 그의 단편은 인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 상동성 DNA (예를 들어, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 천연 변이체를 코딩하는 DNA)을 스크리닝하기 위한 프로브로서 사용할 수 있다.
이들 라이브러리 DNA를 포함하는 필터의 혼성화 및 세척을 하기 고도의 엄격 조건 하에 수행하였다. 방사선 표지된 PRO197-, PRO207-, PRO226-, PRO232-, PRO243-, PRO256-, PRO269-, PRO274-, PRO304-, PRO339-, PRO1558-, PRO779-, PRO1185-, PRO1245-, PRO1759-, PRO5775-, PRO7133-, PRO7168-, PRO5725-, PRO202-, PRO206-, PRO264-, PRO313-, PRO342-, PRO542-, PRO773-, PRO861-,PRO1216-, PRO1686-, PRO1800-, PRO3562-, PRO9850-, PRO539-, PRO4316- 또는 PRO4980-유도 프로브를 50% 포름아미드, 5×SSC, 0.1% SDS, 0.1% 피로인산나트륨, 50 mM 인산나트륨, pH 6.8, 2×덴하르트(Denhardt's) 용액 및 10% 덱스트란 술페이트 용액 중에서 42℃로 20시간 동안 혼성화시켰다. 필터를 0.1×SSC 및 0.1% SDS의 수용액 중에서 42℃로 세척하였다.
이어서, 전장의 천연 서열 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 or PRO4980을 코딩하는 DNA와 원하는 서열 동일성을 갖는 DNA를 당업계에 공지된 표준 방법으로 찾아내었다.
실시예 29: 이. 콜라이 ( E. coli .)에서 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 발현
본 실시예는 대장균(E. coli) 내의 재조합 발현에 의해 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216,PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 비글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 예시한다.
처음에 목적하는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위를 포함해야만 한다. 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예에는 앰피실린 및 테트라싸이클린 내성 유전자를 포함하는 pBR322 (이. 콜라이에서 유래; Bolivar et al., Gene 2:95(1977) 참조)가 있다. 벡터를 제한 효소로 절단하고 탈인산화시켰다. 이어서, PCR 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션하였다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리-His 리더 (처음 6개의 STII 코돈, 폴리-His 서열 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함), PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 코딩 영역, 람다 전사 종결부 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다.
이어서, 라이게이션 혼합물을 상기 문헌 (Sambrook et al.)에 기재된 방법을 이용하여 선택된 이. 콜라이 균주를 형질전환시키는데 사용하였다. LB 평판 배지에서 성장할 수 있는 형질전환체를 동정하고 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선별하였다. 플라스미드 DNA를 단리하여, 제한 분석법 및 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다.
선별된 클론을 항생제가 포함된 LB 브로쓰와 같은 액체 배양 배지에서 밤새 배양하였다. 이 배양액을 더 큰 규모의 배양액 접종에 사용하였다. 이어서, 세포를 원하는 광학 밀도까지 배양한 후, 발현 프로모터를 작동시켰다.
수시간 이상 동안 세포를 더 배양한 후에 원심분리로 세포를 수획하였다. 원심분리로 얻어진 세포 펠릿을 당업계에 공지된 여러가지 시약을 이용하여 용해시키고, 단백질이 강하게 결합하는 조건 하에서 금속 킬레이팅 컬럼을 이용하여 용해된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 단백질을 정제할 수 있었다.
PRO197, PRO207, PRO1185, PRO5725, PRO202, 및 PRO3562는 하기 방법을 이용하여 이. 콜라이에서 폴리-His 태그가 부착된 형태로 성공적으로 발현되었다. 먼저, 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 PRO197, PRO207, PRO1185, PRO5725, PRO202 및 PRO3562를 코딩하는 DNA를 증폭하였다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위와 효율적이고 신뢰할 만한 번역 개시, 금속 킬레이트 컬럼에서 빠른 정제 및 엔테로키나아제를 사용한 단백질 분해 제거를 제공하는 다른 유용한 서열을 포함하였다. 이어서, PCR 증폭된, 폴리-His 태그가 부착된 서열을 발현 벡터에 라이게이션시킨 후, 균주 52 (W3110fuhA(tonA)lon galErpoHts(htpRts) clpP(lacIq)) 기재의 이.콜라이 숙주를 형질전환시키는데 사용하였다. 우선 형질전환체를 50 ㎎/㎖의 카르베니실린 (carbenicillin)을 포함하는 LB 배지에서 600 nm에서 O.D.가 3 내지 5에 도달할 때까지 30℃에서 진탕 배양하였다. 이어서, 배양액을 CRAP 배지 (물 500 ㎖ 중에 3.57 g (NH4)2SO4, 0.71 g 시트르산나트륨·2H2O, 1.07 g KCl, 5.36 g 디프코(Difco) 효모 추출물, 5.36 g 쉐필드 히카아제 (Sheffield hycase) SF, 및 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55% (w/v) 글루코스 및 7 mM MgSO4를 혼합하여 제조)에 50 내지 100배로 희석하고, 약 20 내지 30시간 동안 30℃에서 진탕 배양하였다. 샘플을 취하여 SDS-PAGE 분석법으로 발현을 확인하고 대량 배양액을 원심분리하여 세포를 펠릿으로 만들었다. 세포 펠릿을 정제 및 리폴딩시킬 때까지 냉동보관하였다.
0.5 내지 1L의 이. 콜라이 페이스트 발효액 (6 내지 10 g 펠릿)을 10배 부피 (w/v)의 7 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 8 완충액에 재현탁시켰다. 고체 아황산나트륨 및 사티온산나트륨을 각각 최종 농도 0.1 M과 0.02 M이 되도록 가하고 용액을 4℃에서 밤새 교반하였다. 이 단계에서 아황산염화에 의해 모든 시스테인 잔기가 차단된 변성 단백질이 생성되었다. 이 용액을 베크만 (Beckman) 한외 원심분리기에서 40,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 상층액을 3 내지 5 배 부피의 금속 킬레이트 컬럼 완충액 (6 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 7.4)으로 희석하고 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 투명하게하였다. 투명한 추출물을 금속 킬레이트 컬럼 완충액으로 평형화된 키아젠 (Qiagen) Ni-NTA 금속 킬레이트 컬럼 5 ㎖에 로딩하였다. 50mM 이미다졸 (Calbiochem, Utrol grade)을 함유하는 추가의 완충액 (pH 7.4)으로 컬럼을 세척하였다. 250 mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 단백질을 용출시키고, 목적하는 단백질을 포함하는 분획을 모아 4℃에 보관하였다. 아미노산 서열을 기준으로 계산된 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서의 흡광도로 단백질 농도를 측정하였다.
20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA로 이루어진, 새로이 제조한 리폴딩 완충액에 샘플을 천천히 희석하여 단백질을 리폴딩시켰다. 리폴딩 부피는 최종 단백질 농도가 50 내지 100 ㎍/㎖가 되도록 정하였다. 리폴딩 용액을 4℃에서 12 내지 36시간 가량 서서히 교반하였다. 최종농도가 0.4% (약 pH 3)가 되도록 TFA를 가하여 리폴딩 반응을 정지시켰다. 추가로 단백질을 정제하기 전에, 용액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하고 아세토니트릴을 최종 농도 2 내지 10%가 되도록 가하였다. 10 내지 80%의 아세토니트릴 농도 구배로 용출시키고 0.1% TFA의 이동 완충액을 이용하는 포로스 (Poros) R1/H 역상 컬럼 크로마토그래피하여 리폴딩된 단백질을 분석하였다. A280흡광도가 나타나는 분획의 분취액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하여 균질하게 리폴딩된 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 통상, 적절하게 리폴딩된 단백질은 역상 수지와의 상호작용으로부터 보호되는 소수성의 내부 부분과 가장 밀착되기 때문에, 대부분의 단백질에서 적절하게 리폴딩된 단백질 형태는 아세토니트릴의 가장 낮은 농도에서 용출된다. 응집된 단백질은 대개 높은 아세토니트릴 농도에서 용출된다. 역상 단계는 목적하는 형태의 단백질로부터 잘못 폴딩된 형태의 단백질을 분리할 뿐 아니라, 샘플로부터 내독소를 제거한다.
바람직하게 폴딩된 PRO197, PRO207, PRO1185, PRO5725, PRO202 및 PRO3562 단백질을 포함하는 분획을 회수하고, 용액에 부드러운 질소 기류를 사용하여 아세토니트릴을 제거하였다. 투석법이나 제제화 완충액으로 평형화되고 멸균 여과된 G25 슈퍼파인 (Superfine, Pharmacia) 수지를 이용한 겔 여과법으로 0.14 M 염화나트륨 및 4% 만니톨이 함유된 20 mM Hepes, pH 6.8로 단백질을 제제화하였다.
실시예 30: 포유동물 세포에서 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 발현
본 실시예는 포유동물 세포에서 재조합 발현에 의해 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 가능한 글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 예시한다.
pRK5 벡터 (1989년 3월 15일 공개된 EP 제307,247호 참조)를 발현 벡터로 사용하였다. 임의로, 상기 문헌 (Sambrook et al.)에 기재된 라이게이션 방법을 이용하여 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 DNA를 선택된 제한 효소로 pRK5에 라이게이션시켜, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드 DNA를 삽입하였다. 생성된 벡터를 pRK5-PRO197, pRK5-PRO207, pRK5-PRO226, pRK5-PRO232, pRK5-PRO243, pRK5-PRO256, pRK5-PRO269, pRK5-PRO274, pRK5-PRO304, pRK5-PRO339, pRK5-PRO1558, pRK5-PRO779, pRK5-PRO1185, pRK5-PRO1245, pRK5-PRO1759, pRK5-PRO5775, pRK5-PRO7133, pRK5-PRO7168, pRK5-PRO5725, pRK5-PRO202, pRK5-PRO206, pRK5-PRO264, pRK5-PRO313, pRK5-PRO342, pRK5-PRO542, pRK5-PRO773, pRK5-PRO861, pRK5-PRO1216, pRK5-PRO1686, pRK5-PRO1800, pRK5-PRO3562, pRK5-PRO9850, pRK5-PRO539, pRK5-PRO4316 또는 pRK5-PRO4980으로 명명하였다.
한 실시양태에서, 숙주 세포로서 293 세포를 선택할 수 있다. 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)를 우태 혈청 (fetal calf serum) 및 임의로 영양소 및(또는) 항생제가 포함된 DMEM와 같은 배지에서 조직 배양 플레이트에 융합될 (confluent)때까지 배양하였다. pRK5-PRO197, pRK5-PRO207, pRK5-PRO226, pRK5-PRO232, pRK5-PRO243, pRK5-PRO256, pRK5-PRO269, pRK5-PRO274, pRK5-PRO304, pRK5-PRO339, pRK5-PRO1558, pRK5-PRO779, pRK5-PRO1185, pRK5-PRO1245, pRK5-PRO1759, pRK5-PRO5775, pRK5-PRO7133, pRK5-PRO7168, pRK5-PRO5725, pRK5-PRO202, pRK5-PRO206, pRK5-PRO264, pRK5-PRO313, pRK5-PRO342, pRK5-PRO542, pRK5-PRO773, pRK5-PRO861, pRK5-PRO1216, pRK5-PRO1686, pRK5-PRO1800, pRK5-PRO3562, pRK5-PRO9850, pRK5-PRO539, pRK5-PRO4316 또는 pRK5-PRO4980 DNA 약 10 ㎍을 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA [Thimmappaya et al., Cell, 31: 543(1982)] 약 1 ㎍과 혼합하여, 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl2의 500 ㎕에 용해시켰다. 이 혼합물에 50 mM HEPES(pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO4를 500 ㎕ 적가하고, 25℃에서 10분간 침전물을 형성시켰다. 침전물을 현탁시키고 293 세포에 가하여 37℃에서 4시간 가량을 정치시켰다. 배지를 흡입 제거하고 PBS 중의 20% 글리세롤 2 ㎖를 30초 동안 가하였다. 이어서, 293세포를 무혈청 배지로 세척하고 새로운 배지를 가하여 5일간 세포를 배양하였다.
형질감염 약 24시간 후에 배지를 제거하고 배지(만으로) 또는 200 μCi/㎖35S-시스테인 및 200 μCi/㎖35S-메티오닌을 포함하는 배지로 교체하였다. 12시간 배양 후, 조건화된 배지를 수집하고 회전 필터에서 농축시켜 15% SDS 겔에 로딩하였다. 처리된 겔을 건조시키고 일정 기간동안 필름에 노출시켜 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558,PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 존재를 확인하였다. 형질감염된 세포를 포함하는 배양액을 (무혈청 배지에서) 추가로 배양시키고, 배지를 선택된 생물분석법으로 시험하였다.
별법으로, 문헌[Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575(1981)]에 기재된 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 DNA를 293 세포에 일시적으로 도입시킬 수 있었다. 293 세포를 회전 플라스크에서 최대 밀도가 되도록 배양하고 pRK5-PRO197, pRK5-PRO207, pRK5-PRO226, pRK5-PRO232, pRK5-PRO243, pRK5-PRO256, pRK5-PRO269, pRK5-PRO274, pRK5-PRO304, pRK5-PRO339, pRK5-PRO1558, pRK5-PRO779, pRK5-PRO1185, pRK5-PRO1245, pRK5-PRO1759, pRK5-PRO5775, pRK5-PRO7133, pRK5-PRO7168, pRK5-PRO5725, pRK5-PRO202, pRK5-PRO206, pRK5-PRO264, pRK5-PRO313, pRK5-PRO342, pRK5-PRO542, pRK5-PRO773, pRK5-PRO861, pRK5-PRO1216, pRK5-PRO1686, pRK5-PRO1800, pRK5-PRO3562, pRK5-PRO9850, pRK5-PRO539, pRK5-PRO4316 또는 pRK5-PRO4980 DNA 700 ㎍을 가하였다. 세포를 우선 원심분리하여 회전 플라스크로부터 농축하고 PBS로 세척하였다.DNA-덱스트란 침전물을 세포 펠릿 상에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 20% 글리세롤로 90초간 처리하고 조직 배양 배지로 세척한 후, 조직 배양 배지, 5 ㎍/㎖ 소의 인슐린 및 0.1 ㎍/㎖ 소의 트랜스페린을 포함하는 회전 플라스크에 다시 넣었다. 약 4일 후에 조건화된 배지를 원심분리하고 여과시켜 세포와 파쇄물을 제거하였다. 발현된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 포함하는 샘플을 농축시키고, 투석 및(또는) 컬럼 크로마토그래피와 같은 임의의 선택된 방법으로 정제하였다.
다른 실시양태으로, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 CHO 세포에 발현시킬 수 있다. pRK5-PRO197, pRK5-PRO207, pRK5-PRO226, pRK5-PRO232, pRK5-PRO243, pRK5-PRO256, pRK5-PRO269, pRK5-PRO274, pRK5-PRO304, pRK5-PRO339, pRK5-PRO1558, pRK5-PRO779, pRK5-PRO1185, pRK5-PRO1245, pRK5-PRO1759, pRK5-PRO5775, pRK5-PRO7133, pRK5-PRO7168, pRK5-PRO5725, pRK5-PRO202, pRK5-PRO206, pRK5-PRO264, pRK5-PRO313, pRK5-PRO342, pRK5-PRO542, pRK5-PRO773, pRK5-PRO861, pRK5-PRO1216, pRK5-PRO1686, pRK5-PRO1800, pRK5-PRO3562, pRK5-PRO9850, pRK5-PRO539, pRK5-PRO4316 또는 pRK5-PRO4980 벡터를 공지된 시약, 예를 들어 CaPO4또는 DEAE 덱스트란을 이용하여 CHO 세포에 형질감염시킬 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 세포를 배양하고 배지를 배양 배지(만으로) 또는35S-메티오닌과 같은 방사선 표지를 포함하는 배지로 교체하였다. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 존재를 확인한 후, 배양 배지를 무혈청 배지로 교체하였다. 바람직하게는 6일 가량 배양물을 배양한 후에 조건화된 배지를 회수하였다. 발현된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 포함하는 배지를 농축시켜 임의의 선택된 방법으로 정제하였다.
또한, 에피토프 태그가 부착된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850,PRO539, PRO4316 또는 PRO4980은 CHO 숙주세포에서 발현될 수 있다. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980은 pRK5 벡터로부터 서브클로닝될 수 있다. 서브클론의 삽입체는 PCR을 통해 폴리-His 태그와 같은 선택된 에피토프 태그가 부착된 형태로 번역 프레임에 맞게 배큘로바이러스 발현 벡터에 융합될 수 있다. 폴리-His 태그가 부착된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 삽입체는 안정한 클론의 선별을 위한 DHFR과 같은 선별 마커를 포함하는 SV40 유도 벡터로 서브클로닝될 수 있다. 최종적으로, CHO 세포는 (상기에서와 같이) SV40 유도 벡터로 형질감염될 수 있다. 발현을 확인하기 위해서 상기와 같은 방법으로 표지시킬 수 있다. 이어서, 폴리-His 태그가 부착되어 발현된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 포함하는배양 배지를 농축시켜 Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피와 같이 임의의 선택된 방법으로 정제할 수 있다. 또한, CHO 및(또는) COS 세포에서도 일시적 발현 과정에 의해 발현시킬 수 있다.
PRO197, PRO226, PRO256, PRO202, PRO264, PRO542, PRO773 및 PRO861을 안정한 발현 과정에 의해 CHO 세포에서 발현시킨 반면, PRO256, PRO264 및 PRO861을 일시적 발현 과정에 의해 CHO 세포에서 발현시켰다. 하기 실험 방법을 이용하여 CHO 세포 내에서 안정하게 발현시켰다. 단백질은 각 단백질의 가용성 형태의 코딩 서열이 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 구조체 (이뮤노어드헤신)로서 발현되고(거나) 폴리-His 태그가 부착된 형태로 발현되었다.
PCR 증폭에 이어 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, Johnn Wiley 및 Sons(1997)]에 기재된 표준 방법을 이용하여 각 DNA를 CHO 발현 벡터에 서브클로닝하였다. CHO 발현 벡터는 목적하는 DNA의 5' 및 3'에 적합한 제한 부위를 갖도록 제조되어 cDNA가 편리하게 셔틀링될 수 있게 된다. CHO 세포에서의 발현에 사용되는 벡터는 문헌 [Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9 1774-1779(1996)]에 기재된 바와 같으며, 목적하는 cDNA와 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 발현시키기 위해 SV40 초기 프로모터/인핸서를 사용하였다. DHFR 발현으로 형질감염 후에 플라스미드의 안정하게 유지되는 세포를 선별할 수 있다.
시판되는 형질감염 시약인 슈퍼펙트(상표명) (Superfect, Qiagen), 도스퍼(상표명)(Dosper) 또는 퓨진(상표명) (Fugene, Boehringer Mannheim)을 사용하여, 목적하는 플라스미드 DNA 12 ㎍을 약 1000만개의 CHO 세포에 도입하였다. 상기 문헌 (Lucas et al.)에 기재된 방법에 따라 세포를 배양하였다. 추후에 세포를 배양 및 생산하기 위해 약 3 ×107세포를 하기 기재된 방법에 따라 앰플에 동결시켰다.
플라스미드 DNA를 포함하는 앰플을 수조에 넣어 녹인 후 볼텍싱하여 혼합하였다. 배지 10 ㎖를 포함하는 원심분리 튜브에 피펫으로 내용물을 넣고 1000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 흡입 제거하고 세포를 10 ㎖ 선택 배지(0.2 ㎛ 투석 여과된 5% 우태 혈청을 포함하는, 0.2 ㎛ 여과지를 통해 여과된 PS20)에 재현탁시켰다. 선택 배지 90 ㎖를 포함하는 100 ㎖ 회전 플라스크에 세포를 분주하였다. 1 내지 2일 후, 선택 배지 150 ㎖로 채워진 250 ㎖ 회전 플라스크로 세포를 옮겨 37℃에서 배양하였다. 2 내지 3일 후에 250 ㎖, 500 ㎖ 및 2000 ㎖ 회전 플라스크에 ㎖당 3 ×105개의 세포를 접종하였다. 세포 배양액을 원심 분리하여 신선한 배지로 교환하고 생산 배지에 재현탁하였다. 임의의 적합한 CHO 배지를 사용할 수 있으나, 미국 특허 제5,122,469호 (1992년 6월 16일)에 기재된 생산 배지를 실제로 사용하였다. 3 L 생산 회전 플라스크에 1.2 ×106세포/㎖가 되도록 접종하였다. 제0일에 세포 수와 pH를 측정하였다. 제1일에 회전 플라스크에서 샘플을 취해 여과된 공기의 살포를 개시하였다. 제2일에 회전 플라스크에서 샘플을 취해 온도를 33℃로 바꾸고 500 g/L-글루코스 30 ㎖ 및 10% 소포제 0.6 ㎖(예를 들어,35% 폴리디메틸 실록산 유상액, Dow Corning 365 의약 등급 유상액)을 가하였다. 전체 생산기 동안, 필요에 따라 pH를 약 7.2가 유지되도록 조절하였다. 10일 후 또는 생존률이 70% 미만으로 떨어질 즈음 세포 배양액을 원심분리로 회수하고 0.22 ㎛ 필터에 여과시켰다. 여과액을 4℃에 보관하거나 정제용 컬럼에 즉시 로딩하였다.
폴리-His 태그가 부착된 구조물의 경우, Ni2+-NTA 컬럼 (Qiagen)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 가하였다. 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes, pH 7.4 완충액으로 평형화된 Ni2+-NTA 컬럼 6 ㎖에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 조건화된 배지를 주입하였다. 로딩 후에 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25 슈퍼파인 (Pharmacia) 컬럼을 통해 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액 (pH 6.8)중으로 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.
조건화된 배지로부터 이뮤노어드헤신 (Fc 포함) 구조물을 하기와 같이 정제하였다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액 (pH 6.8)으로 평형화된 단백질 A 컬럼 (Pharmacia) 5 ㎖에 주입하였다. 로딩 후, 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액 (pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다.이어서, 고도로 정제된 단백질을 폴리-His 태그가 부착된 단백질의 경우에 대해 상기 기재된 바와 같이 저장 완충액 (pH6.8) 중으로 염을 제거하였다. SDS-PAGE와 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 단백질의 균일함을 확인하였다.
실시예 32: 효모에서 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 발현
다음 방법은 효모에서 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 재조합 발현을 기재하고 있다.
우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 세포내 생산 또는 분비를 위한 효모 발현 벡터를 제조하였다. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274,PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 코딩하는 DNA 및 프로모터를 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드의 세포내 발현을 위해 선택된 플라스미드의 적합한 제한 효소 부위에 삽입하였다. 분비의 경우에는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 발현을 위해, ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 신호 펩티드 및 다른 포유동물의 신호 펩티드 (예를 들어, 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 신호/리더 서열)를 코딩하는 DNA, 및 링커 서열 (필요한 경우)과 함께 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256,PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 코딩하는 DNA를 선택된 플라스미드에 클로닝할 수 있다.
이어서, 효모 세포, 예를 들어 효모 균주 AB110을 상기 기재된 발현 플라스미드로 형질전환시키고 선택된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질전환된 효모 상층액을 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 분석할 수 있다.
계속해서, 원심분리에 의해 발효 배지로부터 효모 세포를 회수하고 선택된 카트리지 필터를 이용하여 배지를 농축시켜 재조합 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 단리하고 정제할 수 있다. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 함유하는 농축액을 선택된 컬럼 크로마토그래피 수지를 이용하여 추가로 정제할 수 있다.
실시예 33: 배큘로바이러스 감염된 곤충 세포에서 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 발현
다음 방법은 배큘로바이러스로 감염된 곤충 세포 내에서의 재조합 발현에 대하여 기재하고 있다.
PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 코딩하는 서열을 배큘로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 상류에 융합시켰다. 이러한 에피토프 태그에는 폴리-His 태그 및 면역글로블린 태그 (예, IgG의 Fc 영역)가 포함된다. 시판되는 플라스미드, 예를 들어 pVL1393 (Novagen)에서 유도된 플라스미드를 포함한 다양한 플라스미드를 사용할 수 있다. 요컨데, PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 코딩하는 서열이나 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256,PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 코딩하는 서열의 원하는 부분 (예를 들어, 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 세포외 단백질의 경우에 성숙 단백질 코딩하는 서열)을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서, 생성물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다.
리포펙틴 (lipofectin) (GIBCO-BRL로부터 구입)을 이용하여, 상기 플라스미드 및 배큘로골드 (상표명) (BaculoGold™) 바이러스 DNA (Phamingen)를 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda, "Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)에 동시 형질감염시켜 재조합 배큘로바이러스를 생성하였다. 28℃에서 4 내지 5일 배양 후에, 방출된 바이러스를 회수하여 이후의 증폭에 사용하였다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌 [O'Reilley et al., Baculovirus Expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 따라 수행하였다.
이어서, 폴리-His 태그가 부착되어 발현된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562,PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980은 예를 들어 Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피로 하기와 같이 정제할 수 있다. 문헌 [Rupert et al., Nature, 362: 175-179(1993)]에 따라 재조합 바이러스로 감염시킨 Sf9 세포로부터 추출물을 제조한다. 요컨데, Sf9 세포를 세척하여 초음파 처리 완충액 (25 ㎖ Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고 빙상에서 20초간 2회 초음파 처리하였다. 초음파 처리물을 원심분리로 투명하게하고, 상층액을 로딩 완충액 (50 mM 인산, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8)에 50배 희석하여 0.45 ㎛ 필터로 여과시켰다. Ni2+-NTA 아가로스 컬럼 (Qiagen으로부터 구입)을 5 ㎖ 충진 부피로 제조하여 물 25 ㎖로 세척하고 로딩 완충액 25 ㎖로 평형화시켰다. 여과된 세포 추출물을 분당 0.5 ㎖로 컬럼에 로딩하였다. 로딩 완충액으로 A280기준선까지 컬럼을 세척하고, 이 시점에서 분획을 회수하기 시작하였다. 다음으로, 2차 세척 완충액 (50 mM 인산; 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)으로 컬럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시켰다. A280이 기준선에 다시 도달하면, 컬럼을 2차 세척 완충액 중의 0 내지 500 mM 이미다졸 구배로 전개시켰다. 1 ㎖ 분획을 회수하여 SDS-PAGE 및 은 염색하거나 알카리 포스파타제에 결합된 Ni2+-NTA (Qiagen)로 웨스턴 블롯팅하여 분석하였다. 용출된 His10-태그가 부착된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775,PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 포함하는 분획을 모아 로딩 완충액에 대해 투석하였다.
별법으로, IgG 태그가 부착된 (또는 Fc 태그가 부착된) PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있다.
발현은 실제로 0.5 내지 2 L 규모로 수행되기는 했지만, 더 큰 제조 규모(예를 들어, 8 L)로 용이하게 규모를 스케일 업할 수 있다. 이들 단백질은, 단백질의 세포외 영역이 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 구조체 (이뮤노어드헤신)로서 발현되고(거나) 폴리-His 태그가 부착된 형태로 발현되었다.
PCR 증폭 후에, 각각의 코딩 서열을 배큘로바이러스 발현 벡터 (IgG 융합 단백질의 경우 pb.PH.IgG, 폴리-His 태그가 부착된 단백질의 경우 pb.PH.His.c)에 서브클로닝한 후, 리포펙틴 (Gibco BRL)을 이용하여 이 벡터 및 배큘로골드(상표명) (BaculoGlod) 배큘로바이러스 DNA (Pharmingen)를 105 스포도프테라 프루기페르다 ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)에 동시 형질감염시켰다. pb.PH.IgG 및 pb.PH.His.c는 시판되는 pVL1393 배큘로바이러스 발현 벡터 (Pharmingen)를 His 또는 Fc 태그 서열을 포함하는 변형된 폴리링커 영역을 갖도록 변형시킨 벡터이다. 10% FBS가 포함된 Hink's TNM-FH 배지(Hyclone)에서 세포를 배양하였다. 세포를 28℃에서 5일 동안 배양하였다. 상층액을 회수하여, 감염 다중도 (multiplicity of infection; MOI)가 약 10이 되도록 10% FBS가 포함된 Hink's TNM-FH 배지에서 Sf9 세포를 감염시킴으로써 수행되는 1차 바이러스 증폭에 이를 사용하였다. 세포를 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 상층액을 회수하고, 히스티딘 태그가 부착된 단백질의 경우 Ni2+-NTA 비드 (QIAGEN) 또는 IgG 태그가 부착된 단백질의 경우 단백질-A 세파로스 CL-4B 비드 (Pharmacia) 25 ㎖에 상층액 1 ㎖을 배치 결합시킨 후에 SDS-PAGE 분석하여 쿠마시 블루 염색에 의해 알려진 농도의 단백질 표준과 비교함으로써 배큘로바이러스 발현 벡터 내 구조물의 발현을 확인하였다.
1차 바이러스 증폭 상층액을 사용하여, ESF-921 배지 (Expression Systems LLC)에서 배양된 회전 플라스크 중의 Sf9 세포 배양액 (500 ㎖)을 MOI 약 0.1로 감염시켰다. 세포를 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 상층액을 회수하여 여과하였다. 필요한 경우, 회전 플라스크 배양액의 발현이 확인될 때까지 배치 결합 및 SDS-PAGE 분석을 반복하였다.
형질감염된 세포로부터의 조건화된 배지 (0.5 내지 3 L)를 원심분리에 의해 회수하여 세포를 제거한 후, 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-His 태그가 부착된 구조물의 경우, Ni2+-NTA 컬럼 (Qiagen)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 가하였다. 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes, pH 7.4 완충액으로 평형화된 Ni-NTA 컬럼 6 ㎖에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 조건화된 배지를 주입하였다. 로딩 후에 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25 슈퍼파인 (Pharmacia) 컬럼을 통해 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액 (pH 6.8)중으로 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.
조건화된 배지로부터 이뮤노어드헤신 (Fc 포함) 구조물을 하기와 같이 정제하였다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액 (pH 6.8)으로 평형화된 단백질 A 컬럼 (Pharmacia) 5 ㎖에 주입하였다. 로딩 후, 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액 (pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 폴리-His 태그가 부착된 단백질의 경우에 대해 상기 기재된 바와 같이 저장 완충액 중으로 염을 제거하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔 (PAG) 전기영동과 에드만 분해법에 의해 N-말단 아미노산 서열 분석으로 단백질의 균일함을 확인하였다.
상기 기재된 방법에 의해 PRO256, PRO269, PRO1245, PRO264 및 PRO542를 배큘로바이러스 감염된 Sf9 곤충세포에서 발현시켰다.
별법으로, high 5 세포에 혼입시키는 변형된 배큘로바이러스 방법을 이용할 수 있다. 이 방법에서는 원하는 서열을 코딩하는 DNA를 Pfu (Stratagene)와 같은적합한 시스템으로 증폭시키거나, 배큘로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 (5') 상류에 융합시켰다. 이러한 에피토프 태그에는 폴리-His 태그 및 면역글로불린 태그 (예를 들어, IgG의 Fc 영역)가 포함된다. pIE1-1 (Novagen)과 같이 시판되는 플라스미드에서 유도된 플라스미드를 포함한 다양한 플라스미드를 사용할 수 있다. pIE1-1 및 pIE1-2 벡터는 안정하게 형질전환된 곤충 세포에서 배큘로바이러스 ie1 프로모터로부터 재조합 단백질이 구성적으로 발현되도록 설계한 것이다. 이 플라스미드는 단지 다중 클로닝 부위의 방향만 상이하고, 감염되지 않은 곤충 세포에서 ie1-매개 유전자 발현에 중요한 것으로 알려진 모든 프로모터 서열 및 hr5 인핸서를 포함하고 있다. pIE1-1 및 pIE1-2는 번역 개시 부위를 포함하기 때문에 융합 단백질의 제조에 사용할 수 있다. 요컨데, 원하는 서열 또는 원하는 서열의 부분 (예를 들어, 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열)을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서, 생성물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 예를 들어, pIE1-1의 유도체는 원하는 서열의 (3') 하류에 인간 IgG의 Fc 영역 (pb.PH.IgG) 또는 8개의 히스티딘 (pb.PH.His) 태그를 포함할 수 있다.
high 5 세포를 CO2, 페니실린 및 스트렙토마이신이 없는 27℃의 조건하에서 50%의 융합도 (confluency)로 배양하였다. 각각의 150 mm 플레이트에 대해, 서열을 포함하는 pIE 기재의 벡터 30㎍을 Ex-Cell 배지(배지: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu, JHR Biosciences #14401-78P, 주의: 이 배지는 빛에 민감함) 1 ㎖와 혼합하고, 별도의 튜브에 CellFECTIN (Gibco BRL #10362-010) 100 ㎕를 Ex-Cell 배지 1 ㎖와 혼합 (볼텍싱으로 혼합)하였다. 상기 두 용액을 혼합하여 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. Ex-Cell 배지 8 ㎖를 DNA/CellFECTIN의 혼합물 2 ㎖에 가하고, 이를 Ex-Cell 배지로 1회 세척된 high 5 세포에 가하였다. 이어서, 플레이트를 어두운 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. DNA/CellFECTIN의 혼합물을 흡입 제거하고, 세포를 Ex-Cell 배지로 1회 세척하여 과량의 CellFECTIN을 제거한 후, 새로운 Ex-Cell 배지 30 ㎖를 가하고 세포를 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 상층액을 회수하고, 히스티딘 태그가 부착된 단백질의 경우 Ni2+-NTA 비드 (QIAGEN) 또는 IgG 태그가 부착된 단백질의 경우 단백질-A 세파로스 CL-4B 비드 (Pharmacia) 25 ㎖에 상층액 1 ㎖을 배치 결합시킨 후에 SDS-PAGE 분석하여 쿠마시 블루 염색에 의해 알려진 농도의 단백질 표준과 비교함으로써 배큘로바이러스 발현 벡터 내 서열의 발현을 측정하였다.
형질감염된 세포로부터의 조건화된 배지 (0.5 내지 3 L)를 원심분리에 의해 회수하여 세포를 제거한 후, 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-His 태그가 부착된 구조물의 경우, Ni2+-NTA 컬럼 (Qiagen)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 가하였다. 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes, pH 7.4 완충액으로 평형화된 Ni2+-NTA 컬럼 6 ㎖에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 조건화된 배지를 주입하였다. 로딩 후에컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25 슈퍼파인 (Pharmacia) 컬럼을 통해 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액 중으로 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.
조건화된 배지로부터 이뮤노어드헤신 (Fc 포함) 구조물을 하기와 같이 정제하였다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액 (pH 6.8)으로 평형화된 단백질 A 컬럼 (Pharmacia) 5 ㎖에 주입하였다. 로딩 후, 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액(pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 폴리-His 태그가 부착된 단백질의 경우에 대해 상기 기재된 바와 같이 저장 완충액 중으로 염을 제거하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔, 에드만 분해법에 의해 N-말단 아미노산 서열 분석, 및 원하거나 필요한 경우 기타 분석 방법으로 단백질의 균일함을 확인하였다.
high 5 세포를 포함하는 상기 변형된 배큘로바이러스 방법에 의해 PR226, PRO232, PRO243, PRO269, PRO779, PRO202, PRO542 및 PRO861을 성공적으로 발현하였다.
실시예 34: PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980에 결합하는 항체의 제조
본 실시예는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 제조하는 방법을 예시한다.
모노클로날 항체를 제조하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 상기의 문헌 (Goding)에 기재되어 있다. 이용할 수 있는 면역원에는 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 포함하는 본 발명의 정제된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 융합 단백질, 및 세포 표면에 재조합 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216,PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 발현하는 세포가 포함된다. 당업자는 불필요한 실험없이도 면역원을 선택할 수 있다.
마우스, 예를 들어 Balb/c를 프로인트 완전 면역보강제에 유화된 PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 면역원 1 내지 100 ㎍을 피하 또는 복강내 주사하여 면역화시켰다. 별법으로, 면역원을 MPL-TDM 면역보강제 (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)에 유화시켜 동물의 뒷발바닥에 주사하여 면역화시켰다. 이어서, 면역화된 마우스를 10 내지 12일 후에 선택된 면역보강제 내에 유화된 추가의 면역원으로 부스팅하였다. 그 이후, 수주 동안 마우스를 추가 면역 주사로 부스팅할 수 있다. 역회전 출혈법 (retro-orbital bleeding)으로 마우스에서 혈청 샘플을 주기적으로 채취하여, ELISA 분석법을 시험하여 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980을 검출하였다.
적합한 항체 역가가 검출되면, 항체에 대해 "양성"인 동물에게 PRO197,PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980을 최종 정맥주사하였다. 3 내지 4일 후에 마우스를 희생시켜 비장 세포를 회수하였다. 이어서, 비장 세포를 선택된 쥐의 골수종 세포주, 예를 들어 ATCC CRL 1597로부터 입수가능한 P3X63AgU.1과 융합시켰다(35% 폴리에틸렌 글리콜 이용). 융합체는 비-융합세포, 골수종 하이브리드 및 비장세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT (하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 포함하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅할 수 있는 하이브리도마 세포를 생성하였다.
PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980에 대한 반응성에 대해 하이브리도마 세포를 ELISA로 스크리닝할 수 있다. PRO197, PRO207, PRO226, PRO232, PRO243, PRO256, PRO269, PRO274, PRO304, PRO339, PRO1558, PRO779, PRO1185, PRO1245, PRO1759, PRO5775, PRO7133, PRO7168, PRO5725, PRO202, PRO206, PRO264, PRO313, PRO342, PRO542, PRO773, PRO861, PRO1216, PRO1686, PRO1800, PRO3562, PRO9850, PRO539, PRO4316 또는 PRO4980 폴리펩티드에 대한 목적하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
양성 하이브리도마 세포는 순계의 Balb/c 마우스를 복강내 주사하여 항-PRO197, 항-PRO207, 항-PRO226, 항-PRO232, 항-PRO243, 항-PRO256, 항-PRO269, 항-PRO274, 항-PRO304, 항-PRO339, 항-PRO1558, 항-PRO779, 항-PRO1185, 항-PRO1245, 항-PRO1759, 항-PRO5775, 항-PRO7133, 항-PRO7168, 항-PRO5725, 항-PRO202, 항-PRO206, 항-PRO264, 항-PRO313, 항-PRO342, 항-PRO542, 항-PRO773, 항-PRO861, 항-PRO1216, 항-PRO1686, 항-PRO1800, 항-PRO3562, 항-PRO9850, 항-PRO539, 항-PRO4316 또는 항-PRO4980 모노클로날 항체를 포함하는 복수를 생산할 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 조직 배양 플라스크 또는 롤러 병에서 배양할 수 있다. 복수 내에서 생성된 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전에 이은 겔 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있다. 별법으로, 항체의 단백질 A 또는 단백질 G 결합을 기초로 하는 친화 크로마토그래피를 이용할 수도 있다.
물질의 기탁:
다음 물질들은 미국 버지니아주 20110-2209 매나서스 유니버시티 불러버드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되었다.
물질 ATCC 기탁번호 기탁일
DNA22780-1078 209284 1997년 9월 18일
DNA30879-1152 209358 1997년 10월 10일
DNA33460-1166 209376 1997년 10월 16일
DNA34435-1140 209250 1997년 9월 16일
DNA35917-1207 209508 1997년 12월 3일
DNA35880-1160 209379 1997년 10월 16일
DNA38260-1180 209397 1997년 10월 17일
DNA39987-1184 209786 1998년 4월 21일
DNA39520-1217 209482 1997년 11월 21일
DNA43466-1225 209490 1997년 11월 21일
DNA71282-1668 203312 1998년 10월 6일
DNA58801-1052 55820 1996년 9월 5일
DNA62881-1515 203096 1998년 8월 4일
DNA64884-1527 203155 1998년 8월 25일
DNA76531-1701 203465 1998년 11월 17일
DNA96869-2673 PTA-255 1999년 6월 22일
DNA128451-2739 PTA-618 1999년 8월 31일
DNA102846-2742 PTA-545 1999년 8월 17일
DNA92265-2669 PTA-256 1999년 6월 22일
DNA35672-2508 203538 1999년 12월 15일
DNA47465-1561 203661 1999년 2월 9일
DNA94713-2561 203835 1999년 3월 9일
DNA97003-2649 PTA-43 1999년 5월 11일
기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및그의 규칙 (부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시 (이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙 (37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.
본 출원의 양수인은 적합한 조건하에서 배양시 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 이를 통지하면 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
앞서 기술한 명세서는 당업계의 숙련인이 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 기탁된 실시양태가 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 본 발명은 기탁된 구조물의 범위에 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의 구조물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업자에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.
본 발명은 인간을 비롯한 포유동물에서 신생물성 세포의 성장 및 증식의 진단 및 치료용 조성물, 및 진단 및 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종양 세포의 게놈에서 증폭된 유전자의 동정을 기초로 한다. 이러한 유전자 증폭은 동일한 조직 유형의 정상 세포에 비해 유전자 생성물이 과다 발현된 것과 관련되어 있으며, 종양발생의 원인이 되는 것으로 생각된다. 따라서, 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 특정 암의 진단 및(또는) 치료 (예방을 비롯하여)에 유용한 표적으로 생각되며, 종양 치료의 예후를 예측할 수 있는 것으로 생각된다. 본 발명은 신규 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본원에서는 그러한 핵산 서열을 포함하는 벡터와 숙주세포, 본 발명의 폴리펩티드를 이종 폴리펩티드 서열과 융합된 상태로 포함하는 키메라 폴리펩티드 분자, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체, 및 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.
<110> Genentech, Inc., et al. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF TUMOR <130> P2931R1_PCT <140> PCT/US00/03565 <141> 2000-02-11 <150> US 60/130,232 <151> 1999-04-21 <150> US 60/131,445 <151> 1999-04-28 <150> US 60/134,287 <151> 1999-05-14 <150> US 60/141,037 <151> 1999-06-23 <150> US 60/145,698 <151> 1999-07-26 <150> US 60/162,506 <151> 1999-10-29 <150> PCT/US99/28313 <151> 1999-11-30 <150> PCT/US99/28551 <151> 1999-12-02 <150> PCT/US99/28565 <151> 1999-12-02 <150> PCT/US99/30095 <151> 1999-12-16 <150> PCT/US99/31243 <151> 1999-12-30 <150> PCT/US99/31274 <151> 1999-12-30 <150> PCT/US00/00219 <151> 2000-01-05 <150> PCT/US00/00277 <151> 2000-01-06 <150> PCT/US00/00376 <151> 2000-01-06 <160> 258 <210> 1 <211> 1869 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gccgagctga gcggatcctc acatgactgt gatccgattc tttccagcgg 50 cttctgcaac caagcgggtc ttacccccgg tcctccgcgt ctccagtcct 100 cgcacctgga accccaacgt ccccgagagt ccccgaatcc ccgctcccag 150 gctacctaag aggatgagcg gtgctccgac ggccggggca 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tccgtgcacc tgggtggcga 1050 ggacacggcc tatagcctgc agctcactgc acccgtggcc ggccagctgg 1100 gcgccaccac cgtcccaccc agcggcctct ccgtaccctt ctccacttgg 1150 gaccaggatc acgacctccg cagggacaag aactgcgcca agagcctctc 1200 tggaggctgg tggtttggca cctgcagcca ttccaacctc aacggccagt 1250 acttccgctc catcccacag cagcggcaga agcttaagaa gggaatcttc 1300 tggaagacct ggcggggccg ctactacccg ctgcaggcca ccaccatgtt 1350 gatccagccc atggcagcag aggcagcctc ctagcgtcct ggctgggcct 1400 ggtcccaggc ccacgaaaga cggtgactct tggctctgcc cgaggatgtg 1450 gccgttccct gcctgggcag gggctccaag gaggggccat ctggaaactt 1500 gtggacagag aagaagacca cgactggaga agcccccttt ctgagtgcag 1550 gggggctgca tgcgttgcct cctgagatcg aggctgcagg atatgctcag 1600 actctagagg cgtggaccaa ggggcatgga gcttcactcc ttgctggcca 1650 gggagttggg gactcagagg gaccacttgg ggccagccag actggcctca 1700 atggcggact cagtcacatt gactgacggg gaccagggct tgtgtgggtc 1750 gagagcgccc tcatggtgct ggtgctgttg tgtgtaggtc ccctggggac 1800 acaagcaggc gccaatggta tctgggcgga gctcacagag ttcttggaat 1850 aaaagcaacc tcagaacac 1869 <210> 2 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Val Ile Arg Phe Phe Pro Ala Ala Ser Ala Thr Lys Arg 1 5 10 15 Val Leu Pro Pro Val Leu Arg Val Ser Ser Pro Arg Thr Trp Asn 20 25 30 Pro Asn Val Pro Glu Ser Pro Arg Ile Pro Ala Pro Arg Leu Pro 35 40 45 Lys Arg Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu 50 55 60 Cys Ala Ala Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val 65 70 75 Gln Ser Lys Ser Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val 80 85 90 Leu Ala His Gly Leu Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His 95 100 105 Ala Glu Arg Thr Arg Ser Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu 110 115 120 Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp 125 130 135 Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg Val Asp Pro Glu Val Leu His 140 145 150 Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln Asn Ser Arg Ile Gln Gln 155 160 165 Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg His Leu Glu Lys Gln 170 175 180 His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe Gly Leu Leu Asp 185 190 195 His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala Arg Arg Lys 200 205 210 Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His Asn Val 215 220 225 Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe Gln 230 235 240 Val Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly 245 250 255 Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly 260 265 270 Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn 275 280 285 Arg Pro Trp Glu Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His Gly 290 295 300 Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp 305 310 315 Arg Asn Ser Arg Leu Ala Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn 320 325 330 Ala Glu Leu Leu Gln Phe Ser Val His Leu Gly Gly Glu Asp Thr 335 340 345 Ala Tyr Ser Leu Gln Leu Thr Ala Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly 350 355 360 Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser Gly Leu Ser Val Pro Phe Ser Thr 365 370 375 Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg Arg Asp Lys Asn Cys Ala Lys 380 385 390 Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn 395 400 405 Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro Gln Gln Arg Gln Lys 410 415 420 Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg Gly Arg Tyr Tyr 425 430 435 Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met Ala Ala Glu 440 445 450 Ala Ala Ser <210> 3 <211> 1353 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cgatccctcg ggtcccggga tgggggggcg gtgaggcagg cacagccccc 50 cgcccccatg gccgcccgtc ggagccagag gcggaggggg cgccgggggg 100 agccgggcac cgccctgctg gtcccgctcg cgctgggcct gggcctggcg 150 ctggcctgcc tcggcctcct gctggccgtg gtcagtttgg ggagccgggc 200 atcgctgtcc gcccaggagc ctgcccagga ggagctggtg gcagaggagg 250 accaggaccc gtcggaactg aatccccaga cagaagaaag ccaggatcct 300 gcgcctttcc tgaaccgact agttcggcct cgcagaagtg cacctaaagg 350 ccggaaaaca cgggctcgaa gagcgatcgc agcccattat gaagttcatc 400 cacgacctgg acaggacgga gcgcaggcag gtgtggacgg gacagtgagt 450 ggctgggagg aagccagaat caacagctcc agccctctgc gctacaaccg 500 ccagatcggg gagtttatag tcacccgggc tgggctctac tacctgtact 550 gtcaggtgca ctttgatgag gggaaggctg tctacctgaa gctggacttg 600 ctggtggatg gtgtgctggc cctgcgctgc ctggaggaat tctcagccac 650 tgcggcgagt tccctcgggc cccagctccg cctctgccag gtgtctgggc 700 tgttggccct gcggccaggg tcctccctgc ggatccgcac cctcccctgg 750 gcccatctca aggctgcccc cttcctcacc tacttcggac tcttccaggt 800 tcactgaggg gccctggtct ccccgcagtc gtcccaggct gccggctccc 850 ctcgacagct ctctgggcac ccggtcccct ctgccccacc ctcagccgct 900 ctttgctcca gacctgcccc tccctctaga ggctgcctgg gcctgttcac 950 gtgttttcca tcccacataa atacagtatt cccactctta tcttacaact 1000 cccccaccgc ccactctcca cctcactagc tccccaatcc ctgacccttt 1050 gaggccccca gtgatctcga ctcccccctg gccacagacc cccaggtcat 1100 tgtgttcact gtactctgtg ggcaaggatg ggtccagaag accccacttc 1150 aggcactaag aggggctgga cctggcggca ggaagccaaa gagactgggc 1200 ctaggccagg agttcccaaa tgtgaggggc gagaaacaag acaagctcct 1250 cccttgagaa ttccctgtgg atttttaaaa cagatattat ttttattatt 1300 attgtgacaa aatgttgata aatggatatt aaatagaata agtcataaaa 1350 aaa 1353 <210> 4 <211> 249 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Ala Arg Arg Ser Gln Arg Arg Arg Gly Arg Arg Gly Glu 1 5 10 15 Pro Gly Thr Ala Leu Leu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly Leu 20 25 30 Ala Leu Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Gly 35 40 45 Ser Arg Ala Ser Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ala Gln Glu Glu Leu 50 55 60 Val Ala Glu Glu Asp Gln Asp Pro Ser Glu Leu Asn Pro Gln Thr 65 70 75 Glu Glu Ser Gln Asp Pro Ala Pro Phe Leu Asn Arg Leu Val Arg 80 85 90 Pro Arg Arg Ser Ala Pro Lys Gly Arg Lys Thr Arg Ala Arg Arg 95 100 105 Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp 110 115 120 Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu 125 130 135 Ala Arg Ile Asn Ser Ser Ser Pro Leu Arg Tyr Asn Arg Gln Ile 140 145 150 Gly Glu Phe Ile Val Thr Arg Ala Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys 155 160 165 Gln Val His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr Leu Lys Leu Asp 170 175 180 Leu Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu Glu Glu Phe 185 190 195 Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro Gln Leu Arg Leu Cys 200 205 210 Gln Val Ser Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Arg 215 220 225 Ile Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu 230 235 240 Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val His 245 <210> 5 <211> 1875 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cccaagccag ccgagccgcc agagccgcgg gccgcggggg tgtcgcgggc 50 ccaaccccag gatgctcccc tgcgcctcct gcctacccgg gtctctactg 100 ctctgggcgc tgctactgtt gctcttggga tcagcttctc ctcaggattc 150 tgaagagccc gacagctaca cggaatgcac agatggctat gagtgggacc 200 cagacagcca gcactgccgg gatgtcaacg agtgtctgac catccctgag 250 gcctgcaagg gggaaatgaa gtgcatcaac cactacgggg gctacttgtg 300 cctgccccgc tccgctgccg tcatcaacga cctacatggc gagggacccc 350 cgccaccagt gcctcccgct caacacccca acccctgccc accaggctat 400 gagcccgacg atcaggacag ctgtgtggat gtggacgagt gtgcccaggc 450 cctgcacgac tgtcgcccca gccaggactg ccataacttg cctggctcct 500 atcagtgcac ctgccctgat ggttaccgca agatcgggcc cgagtgtgtg 550 gacatagacg agtgccgcta ccgctactgc cagcaccgct gcgtgaacct 600 gcctggctcc ttccgctgcc agtgcgagcc gggcttccag ctggggccta 650 acaaccgctc ctgtgttgat gtgaacgagt gtgacatggg ggccccatgc 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gatggtggca cagcagcatc 550 ggctgcgaca gatccaggag agactccaca cagcggcgct cccagcctga 600 atctgcctgg atggaactga ggaccaatca tgctgcaagg aacacttcca 650 cgccccgtga ggcccctgtg cagggaggag ctgcctgttc actgggatca 700 gccagggcgc cgggccccac ttctgagcac agagcagaga cagacgcagg 750 cggggacaaa ggcagaggat gtagccccat tggggagggg tggaggaagg 800 acatgtaccc tttcatgcct acacacccct cattaaagca gagtcgtggc 850 atttcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 893 <210> 26 <211> 198 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Pro Val Pro Ala Leu Cys Leu Leu Trp Ala Leu Ala Met Val 1 5 10 15 Thr Arg Pro Ala Ser Ala Ala Pro Met Gly Gly Pro Glu Leu Ala 20 25 30 Gln His Glu Glu Leu Thr Leu Leu Phe His Gly Thr Leu Gln Leu 35 40 45 Gly Gln Ala Leu Asn Gly Val Tyr Arg Thr Thr Glu Gly Arg Leu 50 55 60 Thr Lys Ala Arg Asn Ser Leu Gly Leu Tyr Gly Arg Thr Ile Glu 65 70 75 Leu Leu Gly Gln Glu Val Ser Arg Gly Arg Asp Ala Ala Gln Glu 80 85 90 Leu Arg Ala Ser Leu Leu Glu Thr Gln Met Glu Glu Asp Ile Leu 95 100 105 Gln Leu Gln Ala Glu Ala 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tctgtcctga tttctacaac tggagttttt 1450 ttatacaatg ttctttgtct caaaataaag caatgtgttt tttcgg 1496 <210> 40 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Met Glu Phe Leu Trp Ala Pro Leu Leu Gly Leu Cys Cys Ser Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Asp Arg His Thr Val Phe Trp Asn Ser Ser Asn Pro 20 25 30 Lys Phe Arg Asn Glu Asp Tyr Thr Ile His Val Gln Leu Asn Asp 35 40 45 Tyr Val Asp Ile Ile Cys Pro His Tyr Glu Asp His Ser Ala Asp 50 55 60 Ala Ala Met Glu Gln Tyr Ile Leu Tyr Leu Val Glu His Glu Glu 65 70 75 Tyr Gln Leu Cys Gln Pro Gln Ser Lys Asp Gln Val Arg Trp Gln 80 85 90 Cys Asn Arg Pro Ser Ala Lys His Gly Pro Glu Lys Leu Ser Glu 95 100 105 Lys Phe Gln Arg Phe Thr Pro Phe Thr Leu Gly Lys Glu Phe Lys 110 115 120 Glu Gly His Ser Tyr Tyr Tyr Ile Ser Lys Pro Ile His Gln His 125 130 135 Glu Asp Arg Cys Leu Arg Leu Lys Val Thr Val Ser Gly Lys Ile 140 145 150 Thr His Ser Pro Gln Ala His Asp Asn Pro Gln Glu Lys Arg Leu 155 160 165 Ala Ala Asp Asp Pro Glu Val Arg Val Leu His Ser Ile Gly His 170 175 180 Ser 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gcagccagtg attgggatca gccagcgggt gcggatgaac 600 tccaaggaga aaaaggacct gggaactctg ggctacgtgc tgggcattac 650 catgatggtg atcatcattg ccatcggagc tggcatcatc ttgggctact 700 cctacaagag ggggaaggat ttgaaagaac agcatgatca gaaagtatgt 750 gagagggaga tgcagcgaat cactctgccc ttgtctgcct tcaccaaccc 800 cacctgtgag attgtggatg agaagactgt cgtggtccac accagccaga 850 ctccagttga ccctcaggag ggcaccaccc cccttatggg ccaggccggg 900 actcctgggg cctgagcccc cccagtgggc aggagcccat gcagacactg 950 gtgcaggaca gcccaccctc ctacagctag gaggaactac cactttgtgt 1000 tctggttaaa accctaccac tccc 1024 <210> 44 <211> 263 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Met Leu Leu Ala Trp Val Gln Ala Phe Leu Val Ser Asn Met Leu 1 5 10 15 Leu Ala Glu Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Cys Phe Trp Asp Asn Gly 20 25 30 His Leu Tyr Arg Glu Asp Gln Thr Ser Pro Ala Pro Gly Leu Arg 35 40 45 Cys Leu Asn Trp Leu Asp Ala Gln Ser Gly Leu Ala Ser Ala Pro 50 55 60 Val Ser Gly Ala Gly Asn His Ser Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Glu 65 70 75 Asp Pro Arg Gly Pro Trp Cys Tyr Val Ser Gly 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tccacaaaag agaaaaacgt caagccaaac 950 acaaacagcg gaaacgcctt aagtccagct gtaagagaca ccctttgtac 1000 gtggacttca gtgacgtggg gtggaatgac tggattgtgg ctcccccggg 1050 gtatcacgcc ttttactgcc acggagaatg cccttttcct ctggctgatc 1100 atctgaactc cactaatcat gccattgttc agacgttggt caactctgtt 1150 aactctaaga ttcctaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgctat 1200 ctcgatgctg taccttgacg agaatgaaaa ggttgtatta aagaactatc 1250 aggacatggt tgtggagggt tgtgggtgtc gctagtacag caaaattaaa 1300 tacataaata tatatatata tatatattct agaaaaaaga aaaaaacaaa 1350 caaacaaaaa aaccccaccc cagttgacac tttaatattt cccaatgaag 1400 actttattta tggaatggaa tggaaaaaaa aacagctatt ttgaaaatat 1450 atttatatct acgaaaagaa gttgggaaaa caaatatttt aatcagagaa 1500 ttattcctta aagatttaaa atgtatttag ttgtacattt tatatgggtt 1550 caaccccagc acatgaagta taatggtcag atttattttg tatttattta 1600 ctattataac cactttttag gaaaaaaata gctaatttgt atttatatgt 1650 aatcaaaaga agtatcgggt ttgtacataa ttttccaaaa attgtagttg 1700 ttttcagttg tgtgtattta agatgaaaag tctacatgga aggttactct 1750 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tggagcctgg gcttcagaaa gtcactgttg 1500 cactctgtga cggagagagc agctatagcg gggagnnnnn nnnnnnnnnn 1550 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1600 tttagcgacc tacattgctc aagcaaatta agttctgatt agcaaagaag 1650 aaagaccaat agatattggg tgggcaacta gcaggtaatt ccatactcta 1700 aaattgtcct caggggaatg gtagccattc aatacatcac ttcttttttc 1750 tttcttagaa aggaaaaaag tgtctccgca ccaagaagtc actcaaagcc 1800 atccacctgc agttcaagaa ctgcaccagc ctgcacacct acaagcccag 1850 gttctgtggg gtctgcagtg atggccgctg ctgcactccc cacaatacca 1900 aaaccatcca ggcagagttt cagtgctccc cagggcaaat agtcaagaag 1950 ccagtgatgg tcattgggac ctgcacctgt cacaccaact gtcctaagaa 2000 caatgaggcc ttcctccagg agctggagct gaagactacc agagggaaaa 2050 tgtaacctgt cactcaagaa gcacacctac agagcacctg tagctgctgc 2100 gccacccacc atcaaaggaa tataagaaaa gtaatgaaga atcacgattt 2150 catccttgaa tcctatgtat tttcctaatg tgatcatatg aggacctttc 2200 atatctgtct tttatttaac aaaaaatgta attaactgta aacttggaat 2250 caaggtaagc tcaggatatg gcttaggaat gacttacttt cctgtggttt 2300 tattacaaat gcaaatttct ataaatttaa gaaaacaagt atataattta 2350 ctttgtagac tgtttcacat tgcactcatc atattttgtt gtgcactagt 2400 gcaattccaa gaaaatatca ctgtaatgag tcagtgaagt ctagaatcat 2450 acttaacatt tcattgtaca agtattacaa ccatatattg aggttcattg 2500 ggaagattct ctattggctc cctttttggg taaaccagct ctgaacttcc 2550 aagctccaaa tccaaggaaa catgcagctc ttcaacatga catccagaga 2600 tgactattac ttttctgttt agttttacac taggaacgtg ttgtatctac 2650 agtaatgaaa tgtttactaa gtggactggt gtcataactt ctccattaga 2700 cacatgactc cttccaatag aaagaaacta aacagaaaac tcccaataca 2750 aagatgactg gtccctcata gccctcagac atttatatat tggaagctgc 2800 tgaggccccc aagtttttta attaagcaga aacagcatat tagcagggat 2850 tctctcatct aactgatgag taaactgagg cccaaagcac ttgcttacat 2900 ccctctgata gctgtttcaa atgtgcattt tgtggaattt tgagaaaaat 2950 agagcaaaat caacatgact ggtggtgaga gaccacacat tttatgagag 3000 tttggaatta ttgtagacat gcccaaaact tatccttggg cataattatg 3050 aaaactcatg atcctcgag 3069 <210> 56 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> unsure <222> 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ggtcctggtg 750 ggcctggaga tttggaatag tcaggacagg ttccacgtca gccccgaccc 800 cagtgtcaca ctggagaacc tcctgacctg gcaggcacgg caacggacac 850 ggcggcacct gcatgacaac gtacagctca tcacgggtgt cgacttcacc 900 gggactactg tggggtttgc cagggtgtcc gccatgtgct cccacagctc 950 aggggctgtg aaccaggacc acagcaagaa ccccgtgggc gtggcctgca 1000 ccatggccca tgagatgggc cacaacctgg gcatggacca tgatgagaac 1050 gtccagggct gccgctgcca ggaacgcttc gaggccggcc gctgcatcat 1100 ggcaggcagc attggctcca gtttccccag gatgttcagt gactgcagcc 1150 aggcctacct ggagagcttt ttggagcggc cgcagtcggt gtgcctcgcc 1200 aacgcccctg acctcagcca cctggtgggc ggccccgtgt gtgggaacct 1250 gtttgtggag cgtggggagc agtgcgactg cggccccccc gaggactgcc 1300 ggaaccgctg ctgcaactct accacctgcc agctggctga gggggcccag 1350 tgtgcgcacg gtacctgctg ccaggagtgc aaggtgaagc cggctggtga 1400 gctgtgccgt cccaagaagg acatgtgtga cctcgaggag ttctgtgacg 1450 gccggcaccc tgagtgcccg gaagacgcct tccaggagaa cggcacgccc 1500 tgctccgggg gctactgcta caacggggcc tgtcccacac tggcccagca 1550 gtgccaggcc ttctgggggc caggtgggca ggctgccgag gagtcctgct 1600 tctcctatga catcctacca ggctgcaagg ccagccggta cagggctgac 1650 atgtgtggcg ttctgcagtg caagggtggg cagcagcccc tggggcgtgc 1700 catctgcatc gtggatgtgt gccacgcgct caccacagag gatggcactg 1750 cgtatgaacc agtgcccgag ggcacccggt gtggaccaga gaaggtttgc 1800 tggaaaggac gttgccagga cttacacgtt tacagatcca gcaactgctc 1850 tgcccagtgc cacaaccatg gggtgtgcaa ccacaagcag gagtgccact 1900 gccacgcggg ctgggccccg ccccactgcg cgaagctgct gactgaggtg 1950 cacgcagcgt ccgggagcct ccccgtcctc gtggtggtgg ttctggtgct 2000 cctggcagtt gtgctggtca ccctggcagg catcatcgtc taccgcaaag 2050 cccggagccg catcctgagc aggaacgtgg ctcccaagac cacaatgggg 2100 cgctccaacc ccctgttcca ccaggctgcc agccgcgtgc cggccaaggg 2150 cggggctcca gccccatcca ggggccccca agagctggtc cccaccaccc 2200 acccgggcca gcccgcccga cacccggcct cctcggtggc tctgaagagg 2250 ccgccccctg ctcctccggt cactgtgtcc agcccaccct tcccagttcc 2300 tgtctacacc cggcaggcac caaagcaggt catcaagcca acgttcgcac 2350 ccccagtgcc cccagtcaaa cccggggctg gtgcggccaa ccctggtcca 2400 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ggcgcacagc acgcagcgca tcaccccgaa tggctc 36 <210> 85 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 85 gtgctgccca tccgttctga gaagga 26 <210> 86 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 86 gcagggtgct caaacaggac ac 22 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 87 tgtccaccaa gcagacagaa g 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 88 actggatggc gcctttccat g 21 <210> 89 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 89 ctgacagtga ctagctcaga ccacccagag gacacggcca acgtcacagt 50 <210> 90 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 90 gggctctttc ccacgctggt actatgaccc cacggagcag atctg 45 <210> 91 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 91 tggaaggaga tgcgatgcca cctg 24 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 92 tgaccagtgg ggaaggacag 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 93 acagagcaga gggtgccttg 20 <210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 94 tcagggacaa gtggtgtctc tccc 24 <210> 95 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 95 tcagggaagg agtgtgcagt tctg 24 <210> 96 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 96 acagctcccg atctcagtta cttgcatcgc ggacgaaatc ggcgctcgct 50 <210> 97 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 97 ctgatccggt tcttggtgcc cctg 24 <210> 98 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 98 gctctgtcac tcacgctc 18 <210> 99 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 99 tcatctcttc cctctccc 18 <210> 100 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 100 ccttccgcca cggagttc 18 <210> 101 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 101 ggcaaagtcc actccgatga tgtc 24 <210> 102 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 102 gcctgctgtg gtcacaggtc tccg 24 <210> 103 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 103 tcggggagca ggccttgaac cggggcattg ctgctgtcaa ggagg 45 <210> 104 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 104 gcggaagggc agaatgggac tccaag 26 <210> 105 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 105 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cagatcctct tctgagatga gtttctgttc ctcctccaat 50 gaaaggc 57 <210> 120 <211> 244 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 120 cgcgtacgta agctcggaat tcggctcgag ggaacaatgg ctaccgagag 50 tactccctca gagatcatag aactggtgaa gaaccaagtt atgagggatc 100 agaaaccagc ctttcattgg aggaggaaca ggagaaaagt ataaaaaaaa 150 aaaaaaaggg cggccgccga ctagtgagct cgtcgacccg ggaattaatt 200 ccggaccggt acctgcaggc gtaccagctt tccctatagt agtg 244 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 121 gcataatgga tgtcactgag g 21 <210> 122 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 122 agaacaatcc tgctgaaagc tag 23 <210> 123 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 123 gaaacgagga ggcggctcag tggtgatcgt gtcttccata gcagcc 46 <210> 124 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. 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Oligonucleotide Probe. <400> 131 cacgctcaac gagtcttcat g 21 <210> 132 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 132 gtggccctcg cagtgcaggc cttctacgtc caatacaagt g 41 <210> 133 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 133 gccatctgga aacttgtgga c 21 <210> 134 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 134 agaagaccac gactggagaa gccccc 26 <210> 135 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 135 agcccccctg cactcag 17 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 136 gacctgcccc tccctctaga 20 <210> 137 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 137 ctgcctgggc ctgttcacgt gtt 23 <210> 138 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 138 ggaatactgt atttatgtgg gatgga 26 <210> 139 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 139 gcaataaagg gagaaagaaa gtcct 25 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 140 tgacccgccc acctcagcca 20 <210> 141 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 141 gcctgaggct tcctgcagt 19 <210> 142 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 142 gccaggcctc acattcgt 18 <210> 143 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 143 ctccctgaat ggcagcctga gca 23 <210> 144 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 144 aggtgtttat taagggccta cgct 24 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 145 ccagtgcctt 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tcagggtcta catcagcctc ctgc 24 <210> 168 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 168 aaggccaagg tgagtccat 19 <210> 169 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 169 ccctatcgct ccagccaa 18 <210> 170 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 170 cgaagaagca cgaacgaatg tcgaga 26 <210> 171 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 171 ccgagaagtt gagaaatgtc ttca 24 <210> 172 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 172 acagatccag gagagactcc aca 23 <210> 173 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 173 agcggcgctc ccagcctgaa t 21 <210> 174 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 174 catgattggt cctcagttcc atc 23 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 175 atagagggct cccagaagtg 20 <210> 176 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 176 cagggccttc agggccttca c 21 <210> 177 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 177 gctcagccaa acactgtca 19 <210> 178 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 178 ggggccctga cagtgtt 17 <210> 179 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 179 ctgagccgag actggagcat ctacac 26 <210> 180 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 180 gtgggcagcg tcttgtc 17 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 181 cctactgagg agccctatgc 20 <210> 182 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 182 cctgagctgt aaccccactc cagg 24 <210> 183 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 183 agagtctgtc ccagctatct tgt 23 <210> 184 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 184 ggggaaccat tccaacatc 19 <210> 185 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 185 ccattcagca gggtgaacca cag 23 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 186 tctccgtgac catgaacttg 20 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 187 ttagggaatt tggtgctcaa 20 <210> 188 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 188 ttgctctccc ttgctcttcc cc 22 <210> 189 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 189 tcctgcagta ggtattttca gttt 24 <210> 190 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 190 gagccggtgg tctcaaac 18 <210> 191 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 191 ccgggggtcc tagtcccctt c 21 <210> 192 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 192 tttactgctg cgctccaa 18 <210> 193 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 193 cagctgcagt gtgggaat 18 <210> 194 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 194 cactacagca agaagctcgc cagg 24 <210> 195 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 195 cgcacagagt gtgcaagtta t 21 <210> 196 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 196 cggaaggagg ccaacca 17 <210> 197 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 197 cgacagtgcc atccccacct tca 23 <210> 198 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 198 ttctttctcc atccctccga 20 <210> 199 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 199 gcatggcccc aacggt 16 <210> 200 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 200 cacgactcag tatccatgct cttgaccttg t 31 <210> 201 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 201 tggctgtaaa tacgcgtgtt ct 22 <210> 202 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 202 cctgtgagat tgtggatgag aaga 24 <210> 203 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 203 ccacaccagc cagactccag ttgacc 26 <210> 204 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 204 gggtggtgcc ctcctga 17 <210> 205 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 205 ccattgttca gacgttggtc a 21 <210> 206 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 206 ctctgttaac tctaagattc ctaaggcatg ctgtgtc 37 <210> 207 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 207 atcgagatag cactgagttc tgtcg 25 <210> 208 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 208 ctcggctcgc gaaactaca 19 <210> 209 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 209 tgcccgcaca gacttctact gcctg 25 <210> 210 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 210 ggagctacat atcatccttg gaca 24 <210> 211 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 211 gagataaacg acgggaagct ctac 24 <210> 212 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 212 acgcctacgt ctcctacagc gactgc 26 <210> 213 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 213 gctgcggctt taggatgaag t 21 <210> 214 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 214 ccttggcctc catttctgtc 20 <210> 215 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 215 tgctgctcag gcccatgcta tgagt 25 <210> 216 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 216 gggtgtagtc cagaacagct agaga 25 <210> 217 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 217 cccattccca gcttcttg 18 <210> 218 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 218 ctcagagcca aggctcccca ga 22 <210> 219 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 219 tcaaggactg aaccatgcta ga 22 <210> 220 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 220 accatgtact acgtgccagc tcta 24 <210> 221 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 221 attctgactt cctctgattt tggcatgtgg 30 <210> 222 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 222 ggcttgaact ctccttatag gagtgt 26 <210> 223 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 223 ctaactgccc agctccaaga a 21 <210> 224 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 224 tcacagcact ctccaggcac ctcaa 25 <210> 225 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 225 tctgggccac agatccactt 20 <210> 226 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 226 gctcagccct agaccctgac tt 22 <210> 227 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 227 caggctcagc tgctgttcta acctcagtaa tg 32 <210> 228 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 228 cgtggacagc aggagcct 18 <210> 229 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 229 actcgggatt cctgctgtt 19 <210> 230 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 230 ggcctgtcct gtgttctca 19 <210> 231 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 231 aggcctttac ccaaggccac aac 23 <210> 232 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 232 gacccacgcg ctacgaa 17 <210> 233 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 233 cggtctcctt catggacgtc aacag 25 <210> 234 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 234 ggtccacggt tctccaggt 19 <210> 235 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 235 atgattggta ggaaatgagg taaagtact 29 <210> 236 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 236 ccatctttct ctggcacatt gaggaactg 29 <210> 237 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 237 tgatctagaa cttaaacttt ggaaaacaac 30 <210> 238 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 238 tcccaccact tacttccatg aa 22 <210> 239 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 239 attgtcctga gattcgagca aga 23 <210> 240 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 240 ctgtggtacc caattgccgc cttgt 25 <210> 241 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 241 ggtcacctgt gggacctt 18 <210> 242 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 242 tgcacctgac agacaaagc 19 <210> 243 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 243 tccctcactc ccctccctcc tagt 24 <210> 244 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 244 aagcctttgg gtcacactct 20 <210> 245 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 245 tggtccactg tctcgttca 19 <210> 246 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 246 cggagcttcc tgtccctttt tctg 24 <210> 247 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 247 gaattctaat acgactcact atagggccgc caccgccgtg ctactga 47 <210> 248 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 248 ctatgaaatt aaccctcact aaagggatgc aggcggctga cattgtga 48 <210> 249 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 249 ggattctaat acgactcact atagggctcc tgcgcctttc ctgaacc 47 <210> 250 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 250 ctatgaaatt aaccctcact aaagggagac ccatccttgc ccacagag 48 <210> 251 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 251 ggattctaat acgactcact atagggccag cactgccggg atgtcaac 48 <210> 252 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 252 ctatgaaatt aaccctcact aaagggagtt tgggcctcgg agcagtg 47 <210> 253 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 253 ggatcctaat acgactcact atagggcacc cacgcgtccg gctgctt 47 <210> 254 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 254 ctatgaaatt aaccctcact aaagggacgg gggacaccac ggaccaga 48 <210> 255 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 255 ggattctaat acgactcact atagggcaag gagccgggac ccaggaga 48 <210> 256 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 256 ctatgaaatt aaccctcact aaagggaggg ggcccttggt gctgagt 47 <210> 257 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 257 ggattctaat acgactcact atagggcggg gccttcacct gctccatc 48 <210> 258 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Probe. <400> 258 ctatgaaatt aaccctcact aaagggagct gcgtctgggg gtctcctt 48

Claims (43)

  1. 서열번호 38의 PRO5725 폴리펩티드에 결합하는 단리된 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포의 사멸을 유도하는 모노클로날 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포가 동일한 조직 유형의 정상 세포에 비해 상기 폴리펩티드를 과다발현시키는 암세포인 모노클로날 항체.
  5. 제1항에 있어서, 비-인간 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 인간 프레임워크 영역 (FR)을 포함하는 모노클로날 항체.
  6. 제1항에 있어서, 검출이 가능하도록 표지된 모노클로날 항체.
  7. 제1항에 있어서, Fab, Fab', F(ab')2및 Fv 또는 단일쇄 Fv 항체인 모노클로날 항체.
  8. 50％ 포름아미드, 5×SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산 나트륨, 5×덴하르트 (Denhardt) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/㎖), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 술페이트를 42℃에서 사용하고, 42℃에서 0.2×SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 그리고 55℃에서 50％ 포름아미드로 세척하며, 55℃에서 EDTA가 함유된 0.1×SSC를 이용한 고도로 엄격한 세척을 수행하는 조건 하에서, 서열번호 38의 PRO5725 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열과 혼성화하는, 동일한 조직 유형의 정상 세포에 비해 종양 세포의 게놈에서 증폭되는 것을 특징으로 하는 단리된 핵산 분자 또는 그의 상보체.
  9. 서열번호 38의 PRO5725 폴리펩티드를 함유할 것으로 의심되는 인간을 제외한 포유동물로부터 얻은 샘플을 항-PRO5725 항체에 노출시켜 샘플에서 상기 항체와 상기 폴리펩티드의 결합 여부를 결정하는 것을 포함하는, 상기 샘플에서 상기 폴리펩티드의 존재를 결정하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 샘플이 서열번호 38의 PRO5725 폴리펩티드를 함유할 것으로 의심되는 세포를 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포가 암세포인 방법.
  12. (a) 인간을 제외한 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플, 및 (b) 동일한 세포 유형의 공지된 정상 조직 세포인 대조용 샘플에서 서열번호 38의 PRO5725 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하며, 이 때 대조용 샘플에 비해 시험 샘플에서 발현 수준이 더 높으면 시험 조직 세포를 얻은 포유동물에 종양이 존재함을 나타내는 것인, 인간을 제외한 포유동물의 종양 진단 방법.
  13. (a) PRO5725 폴리펩티드(서열번호 38)에 대한 항-PRO5725 항체를 인간을 제외한 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플과 접촉시키는 단계, 및 (b) 시험 샘플에서 상기 항체와 서열번호 38의 PRO5725 폴리펩티드의 결합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 이 때 결합체의 형성이 상기 포유동물에 종양이 존재함을 나타내는 것인, 인간을 제외한 포유동물의 종양 진단 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항체가 검출가능하게 표지된 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 조직 세포의 상기 시험 샘플이 신생물성 세포 성장 또는 증식이 의심되는 개체로부터 얻은 것인 방법.
  16. 적합한 포장 내에 PRO5725 폴리펩티드(서열번호 38)에 대한 항-PRO5725 항체, 및 담체를 포함하는 암 진단용 키트.
  17. 제16항에 있어서, 서열번호 38의 PRO5725 폴리펩티드를 함유할 것으로 의심되는 샘플에서 상기 폴리펩티드의 존재를 검출하는데 상기 항체를 사용하기 위한 지침서를 더 포함하는 키트.
  18. 후보 화합물을 서열번호 38의 PRO5725 폴리펩티드와 이들 두 성분이 상호작용하기에 충분한 시간 및 조건하에서 접촉시켜 상기 폴리펩티드의 생물학적 또는 면역학적 활성의 억제 여부를 결정하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드의 생물학적 또는 면역학적 활성을 억제하는 화합물을 동정하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 후보 화합물이 PRO5725 폴리펩티드(서열번호 38)에 대한 항-PRO5725 항체인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 후보 화합물 또는 상기 서열번호 38의 PRO5725 폴리펩티드가 고상 지지체상에 고정된 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 고정되지 않은 성분이 검출가능하게 표지된 것인 방법.
  22. (a) 서열번호 38의 PRO5725 폴리펩티드의 존재하에 상기 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응을 유도하기에 적합한 조건에서 스크리닝할 후보 화합물과 세포를 접촉시키는 단계, 및
    (b) 상기 세포 반응의 유도를 측정하여 시험 화합물이 효과적인 길항제인지 결정하기 위한 단계를 포함하며,
    이 때 상기 세포 반응이 유도되지 않으면 상기 화합물이 효과적인 길항제임을 나타내는 것인, 상기 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물의 동정 방법.
  23. 서열번호 38의 PRO5725 폴리펩티드를 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시켜 상기 폴리펩티드의 발현이 억제되는지 측정하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물의 동정 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 후보 화합물이 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
  25. 도 38 (서열번호 38)에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산.
  26. 도 37 (서열번호 37)에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 핵산.
  27. 도 37 (서열번호 37)에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전장 코딩 서열을 갖는 단리된 핵산.
  28. ATCC 기탁번호 PTA-256로 기탁된 DNA (서열번호 37)의 전장 코딩 서열을 갖는 단리된 핵산.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 벡터.
  31. 제29항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  32. 제31항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포인 숙주세포.
  33. 제31항에 있어서, 상기 세포가 이. 콜라이 (E. coli)인 숙주세포.
  34. 제31항에 있어서, 상기 세포가 효모 세포인 숙주세포.
  35. 제31항에 있어서, 상기 세포가 배큘로바이러스-감염된 곤충 세포인 숙주세포.
  36. 서열번호 38의 PRO5725 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 제31항의 숙주세포를 배양하고, 세포 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 상기 폴리펩티드의 제조 방법.
  37. 도 38 (서열번호 38)에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드.
  38. ATCC 기탁번호 PTA-256로 기탁된 DNA (서열번호 37)의 전장 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드.
  39. 에피토프 태그 서열 또는 면역글로불린의 Fc 영역의 아미노산 서열과 융합된, 제37항 또는 제38항의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자.
  40. 제37항 또는 제38항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
  41. 제40항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체, 인간화 항체 또는 단일쇄 항체인 항체.
  42. (a) 신호 펩티드가 결합되어 있지 않은, 도 38 (서열번호 38)에 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열,
    (b) 신호 펩티드가 결합되어 있는, 도 38 (서열번호 38)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는
    (c) 신호 펩티드가 결합되어 있지 않은, 도 38 (서열번호 38)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
    을 갖는 단리된 핵산.
  43. (a) 신호 펩티드가 결합되어 있지 않은, 도 38 (서열번호 38)에 나타낸 폴리펩티드,
    (b) 신호 펩티드가 결합되어 있는, 도 38 (서열번호 38)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는
    (c) 신호 펩티드가 결합되어 있지 않은, 도 38 (서열번호 38)에 나타낸 폴리펩티드의 세포외 도메인
    의 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드.
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