KR20040094081A

KR20040094081A - 아세틸콜린에스테라제 저해용 약쑥 추출물 및 이의 정제방법

Info

Publication number: KR20040094081A
Application number: KR1020030028020A
Authority: KR
Inventors: 신동훈; 조홍연; 홍범식; 허호진; 김미정; 최수정; 김혜경
Original assignee: 학교법인고려중앙학원
Priority date: 2003-05-01
Filing date: 2003-05-01
Publication date: 2004-11-09

Abstract

본 발명은 약쑥 메탄올 추출물로부터 분리한 퇴행성 치매와 밀접한 관련이 있는 뇌 세포에 함유된 아세틸콜린에스테라제 저해능 및 뇌신경세포 보호능을 갖는 저분자성 플라보노이드류와 그의 정제방법에 관한 것이다. 본 발명의 아세틸콜린에스테라제 저해성 플라보노이드류는 구성분자가 갖는 극성도에 따른 유기용매 분획, 연속적인 실리카겔 크로미토그라피, TLC (thin layer chromatography) 등 일련의 정제공정을 수행함으로써 약쑥 메탄올 추출물로부터 순수 분리한다. 이렇게 제조된 AChE 저해활성 물질은 저분자의 플라본 성분으로서 아세틸콜린에스테라제 저해능 뿐만 아니라in vitro뇌 신경세포 보호 효과도 가지고 있어 퇴행성 치매 환자나 고령화로 인한 기억력 감퇴현상의 개선제로서 기능성 식품이나 약품소재에 유용하게 사용될 수 있다. 아울러 본 발명은 국내에서 충분히 재배 가능한 약쑥을 농가 부수입원으로 재배할 수 있다는 측면에서 유용하다.

Description

아세틸콜린에스테라제 저해용 약쑥 추출물 및 이의 정제방법 {Medicine wormwood extracts for protecting acetylcholinesterase and their extracting process}

본 발명은 약쑥으로부터 분리한 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase) (AChE) 저해 기능을 갖는 저분자성 플라보노이드류 및 그의 정제 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 건조된 약쑥 분말의 메탄올 추출액으로부터 뇌 신경세포에 포함된 AChE를 저해시키는기능을 갖는 저분자 활성체의 정제에 관한 것이다.

알츠하이머 치매병 치료에 있어서 지금까지 완치할 수 있는 방법이나 제약은 알려져 있지 않다. 퇴행성 치매에 걸렸다고 진단되었을 때 유일한 방법은 병이 더 이상 진행되지 않고 정신 기능을 담당하고 있는 뇌세포에 혈액 순환을 원활하게 하고 기억력을 향상시킬 수 있는 약물 또는 영양소를 공급하여 자신이 누구인지 자신의 힘으로 최소한의 생활을 영위할 수 있게 하는 것이 최선의 치료 방법이다. 혈액순환계와 기억력향상제 (Cholinergic system계 약품)가 현재 미국 FDA에서 허가된 2가지 약품(Cognex 와 Aricept)이 있다. 미국 노스켈로나이나 의과대학에서 조사한 바로는 약 50%의 치매병 환자들이 한가지 이상의 치료방법을 쓰고 있는데 이들 방법은 환자들에게 비타민을 제공(84%)하거나 환자들에게 건강식품을 제공(22%)하거나 환자들에게 한약재를 제공(11%)하거나 환자들에게 "현명해지는 알약"을 제공(9%)한다.

그 밖에도 비스테로이드계 항염증 약품 (NSAIDS)을 복용하는 경우와 호르몬제인 에스트로젠, 혈액순환제인 은행잎 추출물 등을 사용하는 경우가 있다. 이들 중 약 3분의 1정도가 효과가 있다고 보고하고 있다. 현재 판매되고 있는 콜린에스터레이즈 억제제 (기억력 향상제의 일종)로 FDA에서 허가된 약품은 2종류(Cognex 와 Aricept)인데 코그넥스(Cognex)의 경우 치매병이 초기 및 중간 단계의 환자들에게 효과가 있는 것으로 알려져 있으나 그 부작용이 너무 심해 떨림증, 현기증, 구토증, 간독성 등은 우려할 만한 부작용으로 알려져 있다. 효능과 부작용에서 개선된 새로운 제품으로 1996년에 아리세트(Aricept) 제품이 시판되었으며 이 제품은코그넥스 보다 훨씬 선택성이 우수하여 부작용이 적어졌으나 이 제품 역시 현기증, 구토증, 설사 등의 부작용이 있다고 보고되고 있다. 이 계통의 새로운 제약들이 개발, 최종 단계에 들어 있는 것으로 베이어 제약의 약품(Metrifonate)과 산돈(Sandon)사의 END-713, 포레스트(Forest)사의 약품(physostigmine SR), 아스트라아르쿠스(Astra Arcus)사의 약품(NXX-066), 얀센(Janssen)사의 약품(galanthamine) 등이 있다. 그밖에 뇌신경전달물질인 아세틸콜린 양을 증가시키는 제약으로 개발중인 약품으로는 엘리릴리(Eli Lilly)사의 약품(Xanomeline), 파트-데이비스(Parke-Davis)사 약품(milameline), 스미스클라인비참(Smithkline Beecham)사의 약품(SB-202026), Suow Brand producto사의 AF-102B와 Abbott사의 ABT-418등이 개발되고 있는 실정이다.

현재 우리나라에서 개발한 치매관련 치료제로는 천연물 및 일부 한약재가 치료에 쓰이고 있다. 그리고 은행잎 추출물의 경우, 유럽에서는 뇌일혈 환자의 회복 및 치매병 치료에 효과가 있다고 여러 연구 기관에서 보고하고 있고 또 현재 사용 중에 있다. 그러나 복합적인 처방에 의한 치료제 개발은 현재까지 알려져 있지 않았다.

최근에 세계적으로 식물체를 이용한 각종 토닉류(tonics), 추출물(botanical medicine, dietary supplement) 등이 이미 큰 시장을 형성하고 있으며 녹차를 비롯한 각종 식품들이 개발되고 있다. 이들에 대한 소비자의 수요가 증가하는 현상은 이들의 효과가 의약품과 같이 신속하게 나타나지는 않지만 꾸준한 섭취를 통하여 치매와 같은 퇴행성 만성질환 등 고령화병의 예방에 효험이 있다는 인식을 갖기 때문이다.

우리 국민들은 전통적으로 차, 채소류를 비롯한 각종 식용 천연물류를 즐겨 섭취해 왔을 뿐만 아니라 이들의 약리, 생리활성에 대한 많은 구전과 보고들이 있어 왔다. 따라서 이들 천연 생물자원에 함유된 유효 성분에 관한 연구는 향후에도 활발히 진행될 것이며, 특히 이 분야 연구는 타 생물소재에 비하여 비교적 미개척 분야로 특이한 구조와 기능을 가진 신규화합물이 발견될 가능성이 높다. 생리, 약리활성을 함유한 천연 식물소재로부터의 추출물의 산업적 응용은 정제정도에 따라 의약품으로부터 기능성 식품에까지 다양한 형태를 취할 수 있기 때문에 산업화가 용이한 장점을 가지고 있기도 하다. 이상에서 언급한 바와 같이 AChE 저해 기능을 갖는 저분자성 플라보노이드류는 뇌신경성 신호전달기능 향상 및 치매 예방제로 기능성 식품 및 보조요법제의 소재로 사용될 수 있다.

본 발명은 식품소재로 사용되는 식·약용류 식물소재의 기능성 식품으로의 이용가능성을 연구하던 중 약쑥의 메탄올 추출물에서 높은 AChE 저해 기능을 확인하고 메탄올 추출물로부터 활성본체를 정제한 것이다. 본 발명의 목적은 약쑥 메탄올 추출물을 뇌 신경세포에 존재하는 AChE 저해제로써의 용도로 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 약쑥 메탄올 추출물로부터 정제된 AChE 플라보노이드를 산화적 손상으로부터 뇌신경 손상을 보호해 줄 수 있는 뇌신경세포 보호제로서 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 약쑥 메탄올 추출물로부터 정제된 AChE 저해성 플라보노이드를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 약쑥 메탄올 추출물로부터 전술된 AChE 저해제로서의 플라보노이드의 정제법을 제공하는 것이다.

도 1은 최종활성물의 HPLC를 나타낸 것이다.

도 2는 최종활성물에의한 산화독성억제실험(DCF-DA Test)을 나타낸 것이다.

도 3은 최종활성물의 세포독성실험(MTT Test)를 나타낸 것이다.

도 4는 첫 번째 실리카겔 크로마토그라피에 의한 저해활성성분 분획도이다.

도 5는 2 번째 실리카겔 크로마토그라피에의한 저해활성성분분획도이다.

본 발명은 약쑥으로부터 추출한 4',5-디하이드록시-3',6,7-트리메톡시플라본을 유효성분으로 함유하는 뇌신경세포에 함유된 아세틸콜린에스터라아제 저해용 추출물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 약쑥을 메탄올로 추출한 약쑥 추출물에 극성이 다른 유기용매를 이용하여 분획하고 그 분리물을 수득하는 공정; 상기 분리물을 2단계의 오픈 실리카겔 컬럼(open silica gel column)을 통해서 저해 활성물을 수득하는 공정; 상기 활성물을 TLC (thin layer chromatography)를 통해서 컬럼 활성물을 분획하여 수득하는 공정; 및 상기 활성분획분을 역상 컬럼을 이용한 HPLC (high pressure liquid chromatography)를 사용하여 분리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌신경세포에 함유된 아세틸콜린에스터라아제 저해용 4',5-디하이드록시-3',6,7-트리메톡시플라본을 정제하는 방법이다.

본 발명자는 수십 종의 국내산 식·약용류를 대상으로 뇌 신경세포에 포함되어 있는 AChE 저해능을 갖는 천연신소재를 탐색하던 중 약쑥을 메탄올로 추출한 추출물로부터 높은 저해활성을 발견하였다. 이에 전술한 메탄올 추출물에 포함된 활성 저분자를 분리하고자 분리방법(solvent fractionation, open column chromatography, thin layer chromatography)을 실시한 결과 분자량 344를 갖는 저분자성 플라본류를 HPLC를 통하여 확인하였다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 뇌신경세포에 함유된 AChE 저해능을 갖는 약쑥 메탄올추출물

약쑥 메탄올 추출물이 뇌신경세포에 함유된 AChE 저해능을 갖는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 엘만방법(참조: Ellman, G. L., Courtney, K. D., Andres, V. Jr. and Featherstone, R. M. (1961) A new and rapid colormetric determination of acetylcholinesterase activity.Biochem. Pharmacol.7, 88-95.)을 사용하여 AChE 저해능을 측정하였다.

DTNB(5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoicacid))는 모두 시그마사(Sigma Chemical Co.)에서 구입하여 사용하였고, 완충용액으로는 버퍼(sodium phosphate buffer) (pH 8.0)를 사용하였다. 용액(Substrate solution)은 50 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0)에 500 M acetylthiocholine과 1 mM (5,5-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid)) (DTNB)를 넣어서 만든다. 반응에 사용한 기기는 Bio-Rad micro plate reader model 550 이다. Buffer 50 ㎕, 시료 10 ㎕, Acetylcholinesterase enzyme 10 ㎕, Substrate solution 70 ㎕ 순으로 96-well plate에 넣고 37℃ incubator에서 20 분간 반응시킨다. 그 후 405 nm에서 측정하였다.

저해 활성도(%)

= (1-(시료 실험군-시료 대조군)/(효소 반응군-효소 대조군)) 100

상기와 같이 측정한 약쑥 메탄올 추출액의 AChE 저해능은 1.0 ㎎/㎖의 농도에서 48 %의 높은 활성을 나타내었으며 이는 낮은 정제도에서도 높은 저해활성을 갖는 것으로 보조요법제로의 사용 가능성을 제시한다.

실시예 2: 약쑥 메탄올 추출물로부터 AChE 저해성 플라보노이드류의 정제

클로로포름층에 있는 성분(AChE inhibitory component)을 다음의 방법에 따라 두 단계의 연속적인 컬럼(open silica-gel column) 크로마토그래피를 이용하여 분리, 정제하였다.

크로마토그라피(Open silica-gel column chromatography)를 위하여 분리(Solvent partitioning)한 후의 클로로포름 층을 가지고 분리(first open silica-gel column chromatography)를 시행하였다. 24 개의 소분획으로 나누었으며 각각의 저해 활성을 측정하였다. 소분획 중에서 (CHCl₃:MeOH = 99:1, 98:2)의 분획이 AChE의 활성을 약 60 ±8.2%로 유의성 있게 저해 시킴을 알 수 있었다 (도 4). 또한 저해활성을 갖는 해당 획분은 다시 두 번째 크로마토그라피(open silica-gel column chromatography)에 적용되었고 CHCl₃: MeOH의 98:2 조건에서 약 76%의 저해활성을 갖는 획분을 얻었다(도 5).

크로마토그라피(Thin layer chromatography)를 위하여 가장 높은 효과(AChE inhibitory effect) (76%)를 보인 클로로포름과 메탄올의 비율이 98:02의 1번째 fraction을 가지고 단일 물질을 분리 해내기 위하여 클로로포름 과 메탄올 의 비율을 96:04으로 혼합한 용매로 전개 시켰다. 각각의 밴드를 긁어 메탄올로 우려내어 25℃에서 evaporation을 실시한 다음 활성(AChE inhibitory activity)을 측정하였다.

가장 높은 활성을 나타낸 부분의 활성성분을 분리 해내기 위하여 HPLC 분석을 실시하였다. 컬럼(μ-bondapak TM C₁₈column) (3.9 ±150 mm)을 이용하여 0.5 ml/min의 속도로 메탄올을 0~100%의 gradient elution을 통하여 200에서 800nm에서 scanning을 하였고 injection volume은 20 ㎕로 하였다.

실시예 3.: 약쑥에서 분리한 AChE 저해성 플라보노이드류의 특성

약쑥에서 분리한 뇌 신경세포의 AChE 저해성 플라본의 분자량을 분석한 결과 정제된 플라버노이드류는 분자량이 344 m/z 정도의 저분자성 플라보노이드류 (4',5-dihydroxy-3',6,7-trimethoxyflavone)로 확인되었다. AChE 저해능을 갖는 4',5-디하이드록시-3',6,7-트리메톡시플라본은 PC12 cell을 대상으로in vitro세포독성 test (MTT test)를 실시하였고 이들 시험에서 세포보호 효과를 보였다.

이러한 결과들로부터 약쑥에서 정제한 AChE 저해성 플라본인 4',5-디하이드록시-3',6,7-트리메톡시플라본은 그 분자량이 344 m/z 정도의 저분자성 물질로뇌 신경세포에 함유된 AChE를 저해시켜 아세틴콜린(acetylcholine)의 양을 증가시킴과 동시에 산화적 손상으로부터 뇌 신경세포 보호효과를 갖는 것으로 사료된다. 이는 기능성 식품 또는 소재로의 이용 시 매우 유용할 뿐만 아니라 노인성 또는 퇴행성 치매환자나 노령화로인한 기억력 감퇴환자의 식이로도 유용할 것으로 예상된다.

이상에서 상세히 설명하고 입증한 것과 같이 본 발명은 약쑥 메탄올 추출물로부터 분리한 뇌 신경세포 함유 AChE 저해성 플라보노이드류 및 그의 정제방법을 제공한다. 본 발명의 AChE 저해성 플라보노이드류는 유기용매 분획화, silica gel column 크로마토그래피, TLC (thin layer chromatography)를 통한 일련의 공정으로 약쑥 메탄올추출물에서 순수 분리한다. 이렇게 분리한 AChE 저해성 천연 활성물질은 저분자의 플라보노이드류로in vitro실험에서와 같이 신경세포 보호 효과를 갖고 있으므로 퇴행성 치매 또는 기억력 감퇴 등에 효율적인 소재로 이용할 수 있고 기능성 식품으로의 이용도 유용하다. 한편 약쑥의 재배가 국내에서 비교적 보편적으로 가능 할 뿐 아니라 농가의 부 수입원 개발이라는 측면에서 제약산업 및 기능성식품산업상 매우 유용한 발명이다.

Claims

약쑥으로부터 추출한 4',5-디하이드록시-3',6,7-트리메톡시플라본을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌신경세포에 함유된 아세틸콜린에스터라아제 저해용 추출물.
약쑥을 메탄올로 추출한 약쑥 추출물에 극성이 다른 유기용매를 이용하여 분획하고 그 분리물을 수득하는 공정; 상기 분리물을 2단계의 오픈 실리카겔 컬럼(open silica gel column)을 통해서 저해 활성물을 수득하는 공정; 상기 활성물을 TLC (thin layer chromatography)를 통해서 컬럼 활성물을 분획하여 수득하는 공정; 및 상기 활성분획분을 역상 컬럼을 이용한 HPLC (high pressure liquid chromatography)를 사용하여 분리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌신경세포에 함유된 아세틸콜린에스터라아제 저해용 4',5-디하이드록시-3',6,7-트리메톡시플라본의 정제방법.