KR20040094041A

KR20040094041A - 마조람으로부터 우르솔릭산을 추출하는 방법 및 그 용도

Info

Publication number: KR20040094041A
Application number: KR1020030027969A
Authority: KR
Inventors: 신동훈; 허호진; 김미정; 최수정; 김은기; 김병용; 함영태; 김혜경
Original assignee: 학교법인고려중앙학원
Priority date: 2003-05-01
Filing date: 2003-05-01
Publication date: 2004-11-09

Abstract

본 발명은 마조람으로부터 추출한 우르솔릭산(ursolic acid)을 유효성분으로 함유하는 아세틸콜린에스터라아제(AChE) 저해용 조성물에 관한 것이다.

마조람을 에탄올로 추출한 뒤 감압증류하고, 에탄올 추출물에 클로로포름을 가하여 물층과 클로로포름층으로 용매 분획하고, 클로로포름층에 대하여 전개용매인 클로로포름과 메탄올의 비율을 94:6으로 하여 1차 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하고, 회수분획 전체에 대하여 전개용매인 클로로포름과 메탄올의 비율을 98:2로 하여 2차 오픈 실리카겔 크로마토그래피를 실시하고, 2번째 회수분획에 대하여 전개용매인 클로로포름과 메탄올의 비율을 95:5로 하여 TLC를 실시함으로써 최종적으로 아세틸콜린에스터라아제(AChE) 저해활성물질인 우르솔릭산을 수득할 수 있다.

이러한 방법으로 제조된 저분자성 테르페노이드류인 우르솔릭산은, AChE 저해활성능 및 기억, 학습증진 효과를 가지고 있어 노인성 치매 환자나 고령화로 인한 기억력 감퇴현상의 개선제로서 기능성 식품이나 약품에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

마조람으로부터 우르솔릭산을 추출하는 방법 및 그 용도 {A method for extracting ursolic acid from marjoram and the use thereof}

알츠하이머성 치매의 발병기전은 명확히 알려져 있지 않으나, 중추신경계의 아세틸콜린 기능의 감소가 가장 공통적으로 나타나므로, 그 치료를 위해서는 아세틸콜린 전구체를 투여하거나 아세틸콜린의 분해를 저해하는 약물을 투여하여 뇌의 아세틸콜린 농도를 높여주는 치료방법이 사용되어 왔다.

알츠하이머 치매병 치료에 있어서 지금까지 완치할 수 있는 방법이나 제약은 알려져 있지 않다. 많은 연구결과들이 보여주듯이 퇴행성 치매에 걸렸다고 진단되었을 때 유일한 방법은 병이 더 이상 진행되지 않고 정신 기능을 담당하고 있는 뇌세포에 혈액 순환을 원활하게 하고 기억력을 향상시킬 수 있는 약물 또는 영양소를 공급하여 자신이 누구인지 자신의 힘으로 최소한의 생활을 영위할 수 있게 하는 것이 지금으로선 최선의 치료 방법이다. 혈액순환계와 기억력향상제 (Cholinergicsystem계 약품)가 현재 미국 FDA에서 허가된 Cognex 와 Aricept 두 제품이 있다. 미국 노스켈로나이나 의과대학에서 조사한 바로는 약 50%의 치매병 환자들이 한가지 이상의 치료방법을 쓰고 있는데 이들 방법들은 다음과 같다. 84% 환자들에게 비타민을 제공한다 혹은 22% 환자들에게 건강식품을 제공한다 혹은 11% 환자들에게 한약재를 제공한다 혹은 9% 환자들에게 "현명해지는 알약"을 제공한다.

그 밖에도 비스테로이드계 항염증 약품(NSAIDS)을 복용하는 경우와 호르몬제인 에스트로젠, 혈액순환제인 은행잎 추출물 등을 사용하는 경우가 있다. 이들 중 약 3분의 1정도가 효과가 있다고 보고하고 있다. 현재 판매되고 있는 콜린에스터라아제 억제제(기억력 향상제의 일종)로 FDA에서 허가된 약품은 Cognex 와 Aricept 두 종류인데 Cognex의 경우 치매병이 초기 및 중간 단계의 환자들에게 효과가 있는 것으로 알려져 있으나 그 부작용이 너무 심해 떨림증, 현기증, 구토증, 간독성 등은 우려할 만한 부작용으로 알려져 있다. 효능과 부작용에서 개선된 새로운 제품으로 1996년에 Aricept 제품이 시판되었으며 이 제품은 Cognex 보다 훨씬 선택성이 우수하여 부작용이 적어졌으나 이 제품 역시 현기증, 구토증, 설사 등의 부작용이 있다고 보고되고 있다. 이 계통의 새로운 제약들이 개발, 최종 단계에 들어 있는 것으로 베이어 제약에서 Metrifonate라는 제품과 Sandon에서 END-713, Forest사의 physostigmine SR, Astra Arcus사의 NXX-066, Janssen사의 galanthamine 등이 있다. 그밖에 뇌신경전달물질인 아세틸콜린 양을 증가시키는 제약으로 개발중인 약품으로는 Eli Lilly사의 Xanomeline, Parke-Davis사 제품인 milameline, Smithkline Beecham 사의 SB-202026, Suow Brand producto사의 AF-102B와 Abbott사의 ABT-418등이 개발되고 있는 실정이다.

현재 우리나라에서 개발한 치매관련 치료제로는 천연물 및 일부 한약재가 치료에 쓰이고 있다. 그리고 은행잎 추출물의 경우, 유럽에서는 뇌일혈 환자의 회복 및 치매병 치료에 효과가 있다고 여러 연구 기관에서 보고하고 있고 또 현재 사용 중에 있다. 그러나 복합적인 처방에 의한 치료제 개발은 현재까지 알려져 있지 않았다.

최근에 세계적으로 식물체를 이용한 각종 토닉류(tonics), 식물체를 이용한 약품(botanical medicine), 보조식이(dietary supplement) 등이 이미 큰 시장을 형성하고 있으며 녹차를 이용한 각종 식품들이 개발되고 있다. 이들에 대한 소비자의 수요가 증가하는 현상은 이들의 효과가 의약품과 같이 신속하게 나타나지는 않지만 꾸준한 섭취를 통하여 치매와 같은 퇴행성 만성질환 등 고령화병의 예방에 효험이 있다는 인식을 갖기 때문이다.

우리 국민들은 전통적으로 차, 채소류를 비롯한 각종 식용 천연물류를 즐겨 섭취해 왔을 뿐만 아니라 이들의 약리, 생리활성에 대한 많은 구전과 보고들이 있어 왔다. 따라서 이들 천연 생물자원에 함유된 유효 성분에 관한 연구는 향후에도 활발히 진행될 것이며, 특히 이 분야 연구는 타 생물소재에 비하여 비교적 미개척 분야로 특이한 구조와 기능을 가진 신규화합물이 발견될 가능성이 높다. 생리, 약리활성을 함유한 천연 식물소재로부터의 추출물의 산업적 응용은 정제정도에 따라 의약품으로부터 기능성 식품에까지 다양한 형태를 취할 수 있기 때문에 산업화가 용이한 장점을 가지고 있기도 하다.

이상에서 언급한 바와 같이 AChE 저해 기능을 갖는 저분자성 테르페노이드류는 뇌 신경성 신호전달기능 향상 및 치매 예방제로 기능성 식품 및 보조요법제의 소재로 사용될 수 있다.

본 발명자들은 식품소재로 사용되는 식용의 천연 식물소재의 기능성 식품으로의 이용가능성을 연구하던 중 향신료의 일종인 마조람의 에탄올 추출물에서 높은 AChE 저해 기능을 확인하고 그 추출물로부터 활성본체인 우르솔릭산을 정제함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 마조람으로부터 추출한 우르솔릭산을 유효성분으로 함유하는 아세틸콜린에스터라아제(AChE) 저해용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 마조람으로부터 우르솔릭산을 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 기술적 과제는, 마조람을 에탄올로 추출한 뒤 감압증류하고, 에탄올 추출물에 클로로포름을 가하여 물층과 클로로포름층으로 용매 분획하고, 클로로포름층에 대하여 전개용매를 클로로포름과 메탄올로 하여 1차, 2차 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 TLC를 실시하고, 아세틸콜린에스터라아제 (AChE) 저해활성물질인 우르솔릭산을 수득함으로써 달성하였다.

도 1은 1차 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의한 각 분획의 AChE 저해활성을 나타낸 그래프이다.

도 2는 2차 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의한 각 분획의 AChE 저해활성을 나타낸 그래프이다.

도 3은 최종 분리된 활성물질 우르솔릭산의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 최종 분리된 활성물질 우르솔릭산의 항산화 실험(DCF-DA Test) 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 최종 분리된 활성물질 우르솔릭산의 세포독성 실험(MTT Test) 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은, (a) 마조람을 에탄올로 추출한 뒤 감압증류하는 단계; (b) 에탄올 추출물 분말에 클로로포름을 가하여 물층과 클로로포름층으로 용매 분획하는 단계; (c) 상기 클로로포름층에 대하여 전개용매인 클로로포름과 메탄올의 비율을 94:6으로 하여 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하고 분획을 회수하는 단계; (d) 상기 회수 분획 전체에 대하여 전개용매인 클로로포름과 메탄올의 비율을 98:2로 하여 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하고 2번째 분획을 회수하는 단계; 및 (e) 상기 2번째 회수 분획에 대하여 전개용매인 클로로포름과 메탄올의 비율을 95:5로 하여 TLC를 실시하고 각 밴드의 AChE 저해활성을 측정하여 가장 높은 저해활성을 나타낸 분획을 회수함으로써 우르솔릭산을 수득하는 단계로 구성된다.

본 발명자들은 수십 종의 천연 식용자원을 대상으로 뇌 신경세포에 포함되어 있는 AChE 저해능을 갖는 천연신소재를 탐색하던 중 마조람 에탄올 추출물로부터 높은 저해활성능을 발견하였다. 이에 전술한 에탄올 추출물에 포함된 활성 본체를 분리하고자 용매 분획(solvent fractionation)과 오픈 컬럼 크로마토그래피(open column chromatography), 얇은 막 크로마토그래피(thin layer chromatography) 등을 실시한 결과 분자량 456.7를 갖는 저분자성 테르페노이드(terpenoid)류인 우르솔릭산(ursolic acid)을 HPLC를 통하여 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 뇌 신경세포 함유 AChE 저해능을 갖는 마조람 에탄올 추출물의 확인

마조람의 에탄올 추출물이 뇌 신경세포 함유 AChE 저해능을 갖는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 Ellman의 방법(Ellman, G. L., Courtney, K. D., Andres, V. Jr. and Featherstone, R. M. (1961) A new and rapid colormetric determination of acetylcholinesterase activity.Biochem. Pharmacol.7, 88-95.)을 사용하여 AChE 저해능을 측정하였다.

(5,5-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid)) (DTNB) 는 모두 시그마사(Sigma Chemical Co.)에서 구입하여 사용하였고, 완충용액으로는 소듐 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer) pH 8.0을 사용하였다. 기질 용액(Substrate solution)은 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 8.0)에 500 M 아세틸치오콜린

(acetylthiocholine)과 1 mM (5,5-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid)) (DTNB)를 넣어서 만든다. 반응에 사용한 기기는 Bio-Rad micro plate reader model 550 이다. 버퍼 50 ㎕, 시료 10 ㎕, 아세틸콜린에스터라아제 효소 10 ㎕, 기질 용액 70 ㎕ 순으로 96-웰 플레이트에 넣고 37℃ 인큐베이터에서 20분간 반응시킨다. 그 후 405 nm에서 측정하였다.

저해 활성도(%)=(1-(시료 실험군-시료 대조군)/(효소 반응군-효소 대조군)) x 100

상기와 같이 측정한 마조람 에탄올 추출액의 AChE 저해능은 1.0 ㎎/㎖의 농도에서 50.7 %의 높은 활성을 나타내었으며 이는 낮은 정제도에서도 높은 저해활성을 갖는 것으로 기능성 소재로서의 사용 가능성을 제시한다.

실시예 2: 마조람 에탄올 추출물로부터 AChE 저해성 테르페노이드류의 정제

클로로포름층에 있는 AChE 저해활성 물질을 다음의 방법에 따라 두 단계의 연속적인 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리, 정제하였다.

용매 분획한 후의 클로로포름층을 가지고 첫 번째 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(first open silica-gel column chromatography)를 실시하였다. 19 개의 소분획으로 나누었으며 각각의 저해 활성을 측정하였다. 소분획 중에서 (CHCl₃:MeOH = 94:6)의 분획이 AChE의 활성을 약 77±4.6%로 유의성 있게 저해 시킴을 알 수 있었다. (도 1 참조)

저해활성을 갖는 해당 분획을 다시 두 번째 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(open silica-gel column chromatography)에 적용하였고, CHCl₃:MeOH=98:2 조건의 두 번째 분획에서 약 80.1%의 저해활성을 갖는 성분을 얻었다. (도 2 참조)

가장 높은 AChE 저해활성(80.1%)을 보인 클로로포름과 메탄올의 비율이 98:2의 2 번째 분획을 가지고 단일 물질을 분리해내기 위하여 클로로포름과 메탄올의 비율을 95:5으로 혼합한 용매로 TLC에 전개시켰다. 각각의 밴드를 긁어 메탄올로 우려내어 상온에서 증발건조시킨 다음 AChE 저해활성을 측정하였다.

가장 높은 활성을 나타낸 부분의 활성물질을 확인하기 위하여 HPLC assay를 실시하였다. μ-bondapak TM C₁₈column(19x300 mm)을 이용하여 0.5 ml/min의 속도로 메탄올을 0~100%의 기울기 용출(gradient elution)을 통하여 200~800nm에서 스캐닝(scanning)을 하였고 주입량(injection volume)은 10 ㎕로 하였다.

실시예 3.: 마조람에서 분리한 AChE 저해성 테르페노이드류의 특성

마조람에서 분리한 뇌 신경세포의 AChE 저해성 활성체의 분자량을 분석한 결과 정제된 테르페노이드류는 분자량이 456 m/z 정도의 저분자성 우르솔릭산(ursolic acid, 3-Hydroxyurs-12-en-28-oic acid)로 확인되었다. AChE 저해능을 갖는 우르솔릭산은 PC12 cell을 대상으로in vitro세포독성 실험 (MTT test)를 실시하였고 이들 시험에서 세포보호 효과를 보였다.(도 5 참조)

이러한 결과들로부터 마조람에서 정제한 AChE 저해성 terpenoids인 ursolic acid는 그 분자량이 456 m/z 정도의 저분자성 물질로 뇌 신경세포에 함유된 AChE를 저해시켜 acetylcholine의 양을 증가시킴과 동시에 산화적 손상으로부터 뇌 신경세포 보호효과를 갖는 것으로 사료된다. 이는 기능성 식품 또는 소재로의 이용 시 매우 유용할 뿐만 아니라 노인성 또는 퇴행성 치매환자나 노령화로 인한 기억력 감퇴환자의 식이로도 유용할 것으로 예상된다.

마조람을 에탄올로 추출한 뒤 감압증류하고, 에탄올 추출물에 클로로포름을 가하여 물층과 클로로포름층으로 용매 분획하고, 클로로포름층에 대하여 전개용매인 클로로포름과 메탄올의 비율을 94:6으로 하여 1차 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하고, 회수분획 전체에 대하여 전개용매인 클로로포름과 메탄올의 비율을 98:2로 하여 2차 오픈 실리카겔 크로마토그래피를 실시하고, 2번째 회수분획에 대하여 전개용매인 클로로포름과 메탄올의 비율을 95:5로 하여 TLC를 실시함으로써 수득한 아세틸콜린에스터라아제(AChE) 저해활성물질 우르솔릭산은 노인성 치매나 기억력 감퇴 등의 예방 및 치료에 효과가 있으므로 이는 약품 또는 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

마조람으로부터 추출한 우르솔릭산(ursolic acid)을 유효성분으로 함유하는 아세틸콜린에스터라아제(AChE) 저해용 조성물.
다음의 단계를 포함하는 아세틸콜린에스터라아제 저해용 우르솔릭산의 추출방법 :

(a) 마조람을 에탄올로 추출한 뒤 감압증류하는 단계;

(b) 에탄올 추출물 분말에 클로로포름을 가하여 물층과 클로로포름층으로 용매 분획하는 단계;

(c) 상기 클로로포름층에 대하여 전개용매인 클로로포름과 메탄올의 비율을 94:6으로 하여 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하고 분획을 회수하는 단계;

(d) 상기 회수 분획 전체에 대하여 전개용매인 클로로포름과 메탄올의 비율을 98:2로 하여 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하고 2번째 분획을 회수하는 단계; 및

(e) 상기 2번째 회수 분획에 대하여 전개용매인 클로로포름과 메탄올의 비율을 95:5로 하여 TLC를 실시하고 각 밴드의 AChE 저해활성을 측정하여 가장 높은 저해활성을 나타낸 분획을 회수함으로써 우르솔릭산을 수득하는 단계.