KR20040088804A - 신경보호 작용을 갖는 한약조성물 및 이를 함유한 약학적제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경보호작용을 갖는 황금, 황련, 치자, 울금 및 우황의 조성물 및 이를 함유하는 뇌졸증 치료 및 예방을 위한 약학적 제제에 관한 것이다.

본 발명의 황금, 황련, 치자, 울금 및 우황의 조성물, 및 이를 함유하는 약학적 제제는 다양한 원인에 의해 신경 세포가 고사하는 것을 저해하는 효과가 탁월할 뿐 아니라 독성이 없으므로 신경세포의 고사에 의해 발생되는 뇌졸증의 예방 및 치료목적으로 사용될 경우 매우 효과적이다.

Description

신경보호 작용을 갖는 한약조성물 및 이를 함유한 약학적 제제{COMPOSITION OF BEZOAR BOVIS, COPTIDIS RHIZOMA, CURCUMAE LONGAE RADIX, SCUTELLARIAE RADIX AND GARDENIAE FRUCTUS HAVING NEUROPROTECTIVE EFFECTS AND PHARMACEUTICAL PREPARATION CONTAINING THE SAME}

본 발명은 황금, 황련, 치자, 울금 및 우황의 조성물, 및 이를 함유하는 뇌졸증 치료 및 예방을 위한 약학적 제제에 관한 것이다.

중풍(中風)의 상용 처방으로는 안궁우황환(安宮牛黃丸), 황련해독탕(黃連解毒湯) (Xu J et al. J Ethnopharmacol 2000;73(3):405-13.), 조등산, 대승기탕(大承氣湯), 곽향정기산(藿香正氣散), 성향정기산(星香正氣散), 우황청심원(牛黃淸心元) (문상관. 서울: 경희대학교 박사학위논문; 2000.7) 등이 임상에서 주로 활용되고 있다. 특히 우황청심원(牛黃淸心元)은 태평혜민화제국방(太平惠民和劑局方)에 최초로 기록되었으며, 국내에서 중풍구급약 또는 치료제로 가장 널리 사용되고 있으나, 구성약물이 28종으로 약효의 실험적 근거를 밝히기 어렵고, 웅황(雄黃), 주사(朱砂) 등 중금속 약물은 만성 독성이 우려되므로 주의가 필요하며, CITES (the Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora) 협약 (환경부 국제협력관실. 행정간행물등록번호 38000-67042-97-200005. 서울: 환경부; 2000.)으로 사향(麝香), 서각(犀角)등 동물약은 사용할 수 없는 문제점을 가지고 있다.

이에 반해 본 발명의 한약조성물은 베르베린(berberine), 팔마틴(palmatine), 바이칼린(baicalin), 오고노시드(wogonoside), 바이칼레인(baicalein), 오고닌(wogonin), 게니포시드(geniposide), 커큐민(curcumin), 크로신(crocin), 비릴루빈(bilirubin), 콥티신(coptisine), 에피베르베린(epiberberine),자트로리진(jatrorrhizine),베르베라스틴(berberastine), 데메톡시 큐커민(demethoxy cucurmin), 비스데메톡시 커큐민(bisdemethoxy curcumin) 등의 유효 성분을 높은 함량으로 지닌 5가지의 한약재, 즉, 황금, 황련, 치자, 울금 및 우황으로 구성되어 있다. 이러한 신규 구성의 본 한약조성물은 생쥐의 뇌 신경보호 활성에 탁월한 효능을 나타내고 있다. 뇌 신경 보호 활성과 관련하여 현재까지 연구되어온 약물 즉, LY231617이 25~30%, 엘-네임(L-NAME)이 23%, 3-브로모-7-니트로인다졸이 20%, MK-801(2㎎/㎏,i.p.)이 24%, 엘리프로딜(eliprodil; 20㎎/㎏, i.p.)이 25%, NBQX (30 ㎎/㎏, i.p.)이 42%, 7-NI이 17.5%, GYKI52466이 11%, 그리고 LY300168이 23%의 신경세포 고사 저해 효과를 갖는 것으로 알려져 있는데(O'Neill MJ 등,Eur J Pharmacol1996; 310), 이는 본 발명에 따른 한약조성물의 측정 결과인 81.2%(100mg/kg) 보다 낮다. 한약재의 경우 대황(大黃)이 16.8% (1,000㎎/㎏) 및 16.3%(500㎎/㎏), 천마(天麻)가 17.8%(1,200㎎/㎏) 및 15.6%(600㎎/㎏), 후박(厚朴)이 13.7%(1,000㎎/㎏), 대승기탕(大承氣湯)이 18.4% (1,000㎎/㎏) 및 16.6 %(500㎎/㎏)의 신경세포 고사 저해 효과를 나타낸다고 알려져있으나(本草學會誌 Kor. J. Herbology vol.14, No.1, 1999), 이 또한 본 발명의 한약조성물 보다는 낮은 수준이다.

한약을 연구 개발하는 과정에서 우선적으로 고려해야 할 사항은 시료로 사용되는 한약재의 표준화인데, 단미와 복합처방의 활성성분을 정량, 정성분석하여 약효발현물질의 균일화와 안정성을 확보하고 그 약리기전을 밝히는 것이 바람직한 연구모델로 제시되고 있다 (WHO/TRM. Regulatory Situation of Herbal Medicines, in 1998; Geneva: WHO; 1998.). 또한 한약을 연구개발의 소재로 사용하기 위해서는 한약재의 GAP (good agricultural practices)와 한약제제의 GMP (good manufactural practices) 그리고 임상에 있어서의 GCP (good clinical practices)를 이루는 일이 선행 과제이다. 1998년 WHO 에서는 28종 한약의 품질, 유효성, 안전성에 대한 기준을 제시하였는데, 특히 GAP, GMP의 기준이 되는 품질에 관해서는식물의 기원, 현미경 관찰, 확인시험, 미생물한도시험, 잔류농약, 잔류방사성물질, 회분함량, 중금속 등과 함께 HPLC 등에 의한 성분함량을 기재토록 하고 있다 (WHO. WHO monographs on selected medicinal plants. Vol.1. Geneva: WHO; 1998. ).

이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 한약조성물의 효능의 안정성을 확보하기 위하여 대한 약전 기준의 표준화된 한약재를 선발 하였다. 먼저 우황의 비릴루빈, 황금의 바이칼린, 황련의 베르베린, 치자의 게니포시드, 울금의 커큐민을 HPLC에 의해 지표성분을 정량정성 분석하고 대한 약전 기준에 도달한 약재를 선별하여 한약조성물을 제조하였다. 표준화된 한약조성물을 뇌질환 치료 및 예방제로 사용하기 위하여 흰쥐의 4-혈관폐색(4-Vessel Occlusion) 실험을 통해 탁월한 신경세포보호효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 우황, 황금, 황련, 치자 및 울금의 조성물, 및 이를 함유하는 뇌졸중 예방 및 치료효과를 갖는 약학적 제제를 제공하는 것이다.

도 1a 우황의 지표성분인 표준품 비릴루빈의 HPLC 크로마토그램

도 1b 한약조성물 중 우황 시료 중 비릴루빈의 HPLC 크로마토그램

도 2a 황련의 지표성분인 표준품 베르베린의 HPLC 크로마토그램

도 2b 한약조성물 중 황련 시료 중 베르베린의 HPLC 크로마토그램

도 3a 황금의 지표성분인 표준품 바이칼린의 HPLC 크로마토그램

도 3b 한약조성물 중 황금 시료 중 바이칼린의 HPLC 크로마토그램

도 4a 울금의 지표성분인 표준품 커큐민의 HPLC 크로마토그램

도 4b 한약조성물 중 울금 시료 중 커큐민의 HPLC 크로마토그램

도 5a 치자의 지표성분인 표준품 게니포시드의 HPLC 크로마토그램

도 5b 한약조성물 중 치자 시료 중 게니포시드의 HPLC 크로마토그램

도 6은 허혈유발 및 재관류 후 본 발명에 따른 한약조성물을 투여하였을 때의 체온의 변화를 나타낸 그래프

도 7a 및 도 7b는 전뇌허혈을 유발시키지 않은 대조군(sham) 쥐의 등쪽 해마(dorsal hippocampus)의 뇌 관상(coronal) 절편을 크레실 바이올렛(Cresylviolet)으로 염색한 다음 현미경으로 촬영한 사진이다.

도 7c 및 도 7d는 10분간 전뇌허혈을 유발시킨 7일 후에 생리 식염수를 투여한 대조군 쥐의 등쪽 해마(dorsal hippocampus)의 뇌관상(coronal) 절편을 크레실 바이올렛 (Cresyl violet)으로 염색한 다음 현미경으로 촬영한 사진이다.

도 7e 및 도 7f는 10분간 전뇌허혈을 유발시킨 다음 7일 후에 본 발명의 한약조성물을 투여한 처치군 쥐의 등쪽 해마(dorsal hippocampus)의 뇌 관상(coronal) 절편을 크레실 바이올렛 (Cresyl violet)으로 염색한 다음 현미경으로 촬영한 사진이다.

도 8은 정상 대조군과 10분간 전뇌허혈을 유발 시킨 다음 7일 후에 생리 식염수를 투여한 대조군, 본 발명의 한약조성물을 투여한 처치군 쥐의 뇌 해마 CA1 영역 세포수를 측정한 결과를 나타낸 그래프 이다.

본 발명에 따른 한약조성물은 우황, 황금, 황련, 치자 및 울금을 분말로 하여 봉밀과 섞어 환으로 한 후 복용하는 것으로 전체 재료가 사용되나 제제의 특성에 따라 물, 저급알콜 또는 이들의 혼합용매로 추출, 농축 및 동결건조하여 얻을수 있는데 문헌적 근거에 따라 물 추출물이 바람직하다.

상기 한약조성물 제조 시 추출 과정은 초음파 추출법, 여과법, 환류추출 및/또는 감압 농축법이 사용될 수 있으며, 이 밖에도 통상적으로 사용되는 추출법이 사용될 수 있다. 농축 및 동결과정 역시 통상적으로 알려진 방법이 다양하게 사용될 수 있다.

본 발명의 한약조성물의 표준화와 약효의 안정성을 확보하기 위하여 HPLC를 이용하여 대한약전에 제시되어있는 지표성분으로 정성·정량분석을 실시하였다. 실험에 사용한 황금은 전남 여수산을, 치자는 전남 순천산을 산지로부터 직접 구입하여 사용하였으며, 울금과 황련은 중국산을 경동시장에서 구입하였고, 우황은 브라질산을 구입하여 경희대학교 동서의학대학원 김호철 교수로부터 동정받아 실험에 사용하였다. 구성 한약재들의 학명은 대한약전을 중심으로 중국, 일본, 북한 약전을 각각 참조하였다

우황의 비릴루빈, 황금의 바이칼린, 황련의 베르베린의 대한약전 7개정(한국약학대학협의회 약전분과회. 서울: 문성사; 2001.)을 내용을 중심으로 하였고 치자의 게니포시드(Oshima T et al. J Chromatogr 1988;455:410-4.)와 울금의 커큐민(Jayaprakasha GK et al. J Agric Food Chem 2002;50(13):3668-72.)은 문헌치를 참고하여 정성, 정량분석 하였다

본 연구에서는 그동안 천연물의 분리 분석에 널리 사용되어온 HPLC-PDA 방법을 이용하여 한약조성물 지표물질의 정성 정량 분석을 시도하였다. 먼저 한약조성물 구성단미재의 지표물질 함량을 HPLC로 분석하여 대한약전 기준에 도달하는 표준 한약재 여부를 검토하였다. 그 결과 우황의 비릴루빈은 17.5%, 황련의 베르베린은 4.25%, 황금의 바이칼린은 10%로 모두 대한약전의 기준치에 도달하는 것을 확인할 수 있었고, 치자에는 게니포시드가 7.4%, 울금에는 커큐민이 0.8% 함유되어 있어서 성분함량이 우수한 품질을 선택하였음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 한약조성물은 뇌허혈 등의 원인에 의해 신경 세포가 고사하는 것을 저해하는 작용이 탁월하기 때문에 신경세포 고사에 의해 발생되는 뇌질환 치료 및 예방제로 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명자들은 상기 기준치에 도달한 단미재를 사용하여 한약조성물을 제조하고 신경세포 보호 활성을 확인하기 위하여 중풍 치료 효과 관찰을 목적으로 1979년 펄시넬리 (Pulsinelli)가 개발한 4-혈관폐색(4-Vessel Occlusion)모델을 사용하였다. 상기 모델은 뇌허혈로 인한 신경세포 고사의 대표적인 동물 모델로서 랫트의 뇌에 혈액을 공급하는 혈관들을 일시적으로 차단한 후 재관류하게 되면 주로 뇌해마부분의 신경세포가 손상을 입게 되는 원리를 사용한 것으로써, 차단후 약 5~7일 이후에 세포 손상이 일어나고 세포 손상의 양상이 세포자연사(apoptosis)와 비슷하여 이를 지연성 세포괴사라고 한다. 상기 모델에서 신경세포 괴사 방지효과를 나타내는 약물들은 사람의 중풍 모델과 유사한 국소허혈의 동물 모델에는 모두 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 임상 효과도 상당히 확보할 수 있기 때문에 중풍 실험을 위한 바람직한 동물 모델로 여겨지고 있다. 상기 모델 중에서도 최근 전뇌허혈(前腦虛血, forebrain ischemia)모델이 각광을 받고있는데, 이는 랫트에게 4-혈관폐색(4-vessel occlusion)을 유발시키는 방법으로써 후뇌의 혈류가 영향을 받지 않아 호흡과 체순환에 영향을 미치지 않는 장점을 가져서 널리 사용되고 있다.

본 발명에서는 먼저, 뇌허혈시 체온 저하는 뇌 해마(hippocampus) 내의 신경 세포 손상을 방지함으로써 신경방어 효과를 나타낸다(Busto 등.,J Cereb Blood Flow Metab1987; 7: 720-738)는 사실에 착안하여 랫트에 뇌허혈을 유발한 후 본 발명의 한약조성물을 투여하여 체온 변화를 관찰하였다. 한약조성물의 투여량에 따라 정상 대조군 대비 약 1.8 2.5 의 체온이 하강되었음을 확인하였다(도 6 참조).

랫트에 유도한 뇌허혈로 인하여 가장 손상 받기 쉬운 부분은 뇌 해마(hippocampus)의 CA1 추체 신경세포(pyramidal neuron)이며, 상기 세포들은 재관류후 72시간이 지나면 죽기 시작한다(Pulsinelli WA 등,Ann Neurol 1982;11: 491-498). 따라서, 본 발명의 한약조성물이 랫트 뇌 해마(hippocampus)의 CA1 부위에서 지연성 신경원세포 고사(delayed neuronal death)를 저해하는지를 확인하기 위하여 랫트의 뇌허혈을 유발하고 한약조성물을 경구 투여한 다음 신경세포의 손상이 거의 완전히 일어난 시점인 재관류 1주일후에 해마 조직 절편을 제조하여 광학 현미경하에서 관찰하였다(도 7a 내지 7f 참조).

어떤 외부자극이나 내부자극에 의해 고사(apoptosis)가 유도된 세포의 경우 우선 세포가 수축하여 분화된 세포의 고유한 모양을 잃어버리고 이 수축에 의하여 주변 세포들과의 연결이 파괴되어 세포 간의 상호작용이 중단된다. 그리고 수축이 어느 정도 진행되면 세포막이 수포 모양을 형성하면서 괴사체(apoptotic body)를 형성하게 된다. 상기 괴사체는 뇌허혈 유도후 한약조성물을 투여하지 않은 군의 해마 조직 절편에서는 높은 빈도로 발견된 반면, 한약조성물을 투여한 군에서는 발견되지 않았는데, 한약조성물 투여군의 경우 많은 수의 세포들이 세포고사 (apoptosis)로부터 방어되어 정상적인 추체(pyramidale) 형태를 이루었으며 주변 세포들과의 연결(junction)을 계속 유지하고 있음을 확인하였다.

다음으로 본 발명에서는 상기 한약조성물의 신경세포 고사 저해 효과가 체온 하강과 관련되어 있는지를 확인하기 위하여 뇌허혈 유도 및 한약조성물 투여 후 인위적으로 정상 체온을 유지시키면서 그 효과를 관찰하였다. 상기 조건으로 실험한 랫트의 해마 조직 절편을 관찰한 결과, 한약조성물을 투여하지 않은 경우보다 약 71.0~88.7% 증가된 세포 생존율을 나타냄을 확인함으로써 정상 체온에서도 신경세포 고사 저해 효과가 나타남을 확인하였다(도 8 참조).

본 발명의 한약조성물을 유효 활성성분으로 함유하는 뇌질환 치료 및 예방을 위한 약학적 제제는 실제 임상투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 통상 사용하는 담체, 즉 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며,이러한 고형제제는 상기 한약조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 한약조성물의 유효 용량은 환자의 성별, 나이, 체중, 및 질환의 정도 등에 따라 차이가 있을 수 있으나, 일반적으로 10~5000 mg/㎏을 하루에 1~3회로 나누어 투여할 수 있으며, 100~250 mg/㎏이 바람직하다.

본 발명에 따른 한약조성물의 급성독성시험을 수행하기 위하여, ICR계 마우스(28±6)와 Sprague Dawley(250±2) 랫트를 각각 15마리씩 5군으로 나누어 본 발명의 한약조성물을 각각 20, 100 및 500mg/kg의 용량으로 경구투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과 5군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다. 이상의 결과에서 본 발명의 한약조성물은 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.

결과적으로 본 발명의 한약조성물은 뛰어난 신경세포 고사 저해 활성을 나타내는 것으로 확인되었으므로, 임상에서 뇌졸중 환자를 위한 치료제 및/또는 예방제로 사용할 수 있다.

이하, 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보지만, 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

한약조성물의 제조

한약조성물의 구성 약재로서, 실험에 사용한 황금은 전남 여수산을, 치자는 전남 순천산을 산지로부터 직접 구입하여 사용하였으며, 울금과 황련은 중국산을 경동시장에서 구입하였고, 우황은 브라질산을 구입하여 경희대학교 동서의학대학원 김호철 교수로부터 동정받아 실험에 사용하였다.

약효시험용 탕제의 조제는 마쇄하여 분말로 한 황련 50g 울금 15g 황금 30g 치자 30g을 1.5ℓ 3차 증류수에 넣어 50℃에서 1 시간 초음파 처리 한 것을 3000 rpm에서 5분간 침전시킨 후 상층액을 여과하고 여액을 동결건조하여 18.72g의 엑기스를 얻었다. 이 엑기스에 2.5g의 우황을 섞어 -20℃ 에 보관하면서 시험에 사용하였다.

실시예 2

약제학적 제제의 제조

(제조예 1)

실시예 1의 한약조성물 100 ㎎

소디움 메타비설파이트 3.0 ㎎

메틸파라벤 0.8 ㎎

프로필파라벤 0.1 ㎎

주사용 멸균증류수 적량

통상의 방법으로 상기의 성분을 혼합하여 최종 부피가 2 ㎖이 되도록 제조한 후 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

(제조예 2)

실시예 1의 한약조성물 200 ㎎

유당 100 ㎎

전분 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 적량

통상의정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다.

(제조예 3)

실시예 1의 한약조성물 100 ㎎

유당 50 ㎎

전분 50 ㎎

탈크 2 ㎎

스테아린산마그네슘 적량

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

(제조예 4)

실시예 1의 한약조성물 1000 ㎎

설탕 20 g

이성화당 20 g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 100 ㎖

통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

시험예 1

랫트 뇌허혈 유발

랫트에서 가장 적합한 허혈유발 시간을 결정하기 위하여 먼저, 5주령, 170 g 내외의 위스터계(Wistar) 수컷 랫트(SLC, Japan) 8마리를 1주일간 실험 환경에 적응시켰다. 랫트를 질소와 산소의 혼합가스(질소 70%, 산소 30%)에 포함된 5% 이소플루레인(isoflurane)으로 마취시킨 다음 정위고정장치 (stereotaxic apparatus)에 수평면으로 머리를 기준으로 하여 꼬리를 아래로 30°경사지게 고정시켰다. 코와 입 주위는 플라스틱 원추흡입기(cone)로 마취기 (Ohameda V.M.C./Boc Health Care, Cyprane, UK)에 연결시키고 마취는 1.5 % 이소플루레인으로 계속 유지시켰다.

꼬리를 수술대에 고정하고 경추를 신전시킨 상태로 실험하였다. 먼저 인후(咽喉)부위를 수술하기 위하여 총경동맥에 실리콘 튜브로 고리를 만들어 허혈을 유발하고 재관류할 수 있도록 장치하였다. 그리고 허혈 유발시 미세혈관의 순환을 봉쇄하기 위하여 실로 뒤쪽으로는 기관(氣管, trachea), 식도(esophagus), 외부 경정맥(external jugular vein), 총경동맥(common carotid arteries) 들이 위치되고 앞쪽으로는 경부(cervical), 척추주위(paravertebral) 근육들이 지나가도록 꿰뚫은 다음 수술용 클립으로 상처를 봉합하였다.

그 다음 랫트를 돌려서 목 정중선 절개를 하여 후두골 하단의 1번 경추부를 수술확대경을 이용하여 근육이 다치지 않게 수술하고 1 ㎜ 이하의 미세한 전기소작침을 1번 경추의 우상공(alar foramina)을 통하여 밑으로 척추동맥이 통과하고 있는 터널로 집어넣어, 간헐적인 전류를 통전시켜 척추동맥을 소작하였다. 수술 현미경을 이용하여 뼈 속으로 지나가는 터널에 존재하는 척추동맥이 완전히 소작되어서 폐쇄되었다는 것을 확인한 다음 수술용 클립으로 봉합하였다. 봉합후 24시간이 지난 다음 수술용 클립을 제거한 다음 총경동맥을 동맥류(動脈瘤,aneurysm) 클립으로 각각 5분, 10분, 20분 및 30분 동안 조여서 허혈을 유발하였다. 만약 1분 이내에 대광반사(對光反射)가 소실되지 않으면 경부봉합을 단단하게 하였고 이 때 대광반사가 소실되지 않은 랫트들은 완전한 양측 평행적인 CA1 신경손상이 유발되지 않았기 때문에 제외시켰고, 경련을 일으키는 랫트들도 제외시켰다. 허혈 유발 후 각각 5분, 10분, 20분 및 30분 후 최종적으로 선택된 4마리의 랫트의 총경동맥에서 동맥류 (aneurysm) 클립을 떼어 내어 허혈을 중지시키고 재관류시켰다.

허혈 유발 1주일 후에 랫트를 클로랄 하이드레이트(35.0 ㎎/㎏, i.p.)로 마취시켜 개흉한 다음, 심장 우심이를 절개하여 좌심실에 바늘을 주입한 후 헤파린 처리한 5% 질산 나트륨 생리식염수를 각각 10분, 심장에 관류시키고, 4.0 % 포르말린 고정액으로 관류시켰다. 그 후 랫트의 뇌부분을 떼어내어 2시간 동안 0.1 M 인산 완충된 포르말린 고정액에 후고정 시킨 다음, 30 % 수크로오즈 용액에 담가 4 에서 하룻밤 동안 방치하였다. 고정된 뇌에서 정수리점(Bregma) -2.5 ㎜와 -4.0 ㎜사이의 등쪽 해마(dorsal hippocampus) 부위에 있는 관상조각(coronal block)을 절개하고 -70 에서 동결한 후 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여 30 ㎛ 간격으로 절단하여 해마를 포함하는 조직 절편을 제조하였다.

상기의 방법으로 제조된 절편을 크레실 바이올렛에 염색하여 고정시킨 다음 등쪽 해마(dorsal hippocampal) CA1 중 지연성 신경원세포 사망(delayed neuronal death)에 의해 가장 손상받기 쉬운 부분인(Crain BJ 등.,Neuroscience1988; 27: 387-402) 중간대(middle zone) 1,000㎛ 부분내에 존재하는 손상된 신경 세포수를 관찰하였다. 세포수의 관찰은 고배율(×250)에서 정상적인 형태를 보이는 추체세포(pyramidal cell)의 수를 3인의 관찰자가 한 개의 뇌조직에서 3개의 다른 조직 절편의 좌우양측 2개, 총 6부위에서 관찰한 값을 평균하였다.

시험예 2

한약조성물 투여에 따른 뇌허혈 랫트의 체온 변화

허혈 유발시 한약조성물 투여에 따른 랫트의 체온 변화를 관찰하고자 하였다.

상기 시험예 1과 동일한 방법으로 10분간 랫트의 뇌허혈을 유발 및 재관류시킨 다음 의식 소실 기간이 20±5분인 랫트들만을 선택하였다. 허혈 유발후 0분과 90분 후에 한약조성물 투여 용량에 따른 변화를 알아보기 위하여 실시예 1에서 제조한 한약조성물을 0.89 % 생리식염수에 용해한 다음 랫트 체중 당 2.0 ㎖ 씩, 각각 100 ㎎/㎏의 양을 경구 투여하였다. 대조군으로는 0.89 % 생리식염수만을 투여한 랫트를 사용하였다.

체온은 허혈유발 후 6시간까지 30분 간격으로 모니터링 하였고, 체온은 직장 속으로 소식자(消息子, probe)를 최소한 6㎝ 들어가게 삽입하여 측정하였다(Miyazawa T 등,J. Cereb. Blood Flow Metat.1992; 12:817-822).

그 결과 본 발명의 한약조성물을 투여한 군에서는 체온이 강하하지 않았음을 관찰하였다(도 6 참조).

시험예 3

한약조성물의 신경세포 보호능 관찰

해마(hippocampus)의 CA1 부위에서 지연성 신경세포 고사(delayed neuronaldeath)을 관찰하기 위하여 상기 시험예 1과 동일한 방법으로 랫트에서 10분간 뇌허혈을 유발한 다음 90분 후 상기 실시예 1에서 제조한 한약조성물을 0.89 % 생리식염수에 용해한 다음 랫트 체중 당 2.0 ㎖ 씩, 각각 20, 100, 500 ㎎/㎏의 양을 경구투여하였다. 다음으로 1주일 후에 랫트를 사망시켜 상기 시험예 2와 동일한 방법으로 해마 조직 절편을 제조하고, 제조된 조직을 광학 현미경하에서 관찰하였다(도 7a 내지 f 참조).

정상 대조군으로는 뇌허혈을 유발하지않은 랫트의 뇌 해마 조직을, 무첨가 대조군으로는 상기 과정에서 본 발명의 한약조성물 대신 생리 식염수를 주사 투여한 랫트의 뇌 해마 조직을 사용하였다. 그 결과 정상 대조군(sham operated)에서는 해마(hippocampal) 신경세포들이 정상적으로 관찰되었으며(도 7a 및 도 7b 참조), 무첨가 대조군 신경세포의 경우 정상 신경세포와는 다르게 조직이 이완되면서 세포들이 주변 세포로부터 유리되는 현상을 관찰할 수 있었으며, 세포체(cell body) 역시 본래의 추체상(pyramidal) 형태를 잃고 응축되어 단일 세포의 형태로 되어있음을 확인할 수 있었다. 또한, 핵 염색질이 농축되고 핵막이 붕괴되는 현상이 관찰됨으로써 세포고사(apoptosis)가 이루어 졌음을 확인할 수 있었다(도 7c 및 도 7d 참조).

본 발명의 한약조성물을 투여한 군의 신경세포는 정상 세포와 유사한형태를 나타내었으며, 잘 뻗어나가는 핵주위질 (perikaryon)과 중앙에 위치하는 둥근 핵으로 인하여 쉽게 구별되었으며 비교적 건강한 상태로 주위의 호중구(neutrophil)와는 명확하게 구별되었다. 또한, 대다수의 세포들이 세포고사(apoptosis)로부터 방어되어 정상적인 추체(pyramidale) 형태를 이루었으며 주변세포들과의 연결(junction)을 계속하여 유지하고 있음을 확인하였다(도 7e 및 도 7f 참조).

시험예 4

한약조성물의 신경세포손상 방어효과

한약조성물의 신경방어 효과가 체온 하강과 관련되어 있는지 확인하기 위하여 본 발명의 한약조성물을 투여한 후 인위적으로 정상 체온을 유지시키면서 그 효과를 관찰하였다.

먼저 실험을 위하여 랫트를 각 그룹으로 나누어 실험하였는데, 제1군은 정상대조군(sham group)으로 수술 과정과 생리 식염수 투약은 같게 하였지만 뇌허혈(brain ischemia)은 일으키지 않았으며, 제2군은 무첨가 대조군으로 시험예 1과 동일한 방법으로 랫트의 뇌허혈을 유발시킨 후 0분 및 90분 경과 후에 생리식염수 2.0 ㎖/㎏ 만을 복강내 주사하였다. 제3, 4, 5군은 실시예 1에서 제조한 한약조성물을 0.89%의 생리식염수에 녹인 후 각각 2.0 ㎖/㎏의 부피와 20, 100, 500 ㎎/㎏의 용량을 뇌허혈 유발후 0분 및 90분에 경구 투여하였다.

체온하강이 나타나는 경우에는 체온 하강을 방치한 경우와 부분적으로 체온저하를 방지하면서 저체온으로 인한 신경세포의 방어효과를 차단한 경우를 분리하면서 실험하였다. 체온 저하를 위해서는 뇌온도를 반영하는 직장 온도를 이용한 자동 온도 조절 전열기를 37 로 고정시키는 방법을 사용하여 12시간 지속하였으며, 체온은 직장 속으로 소식자(消息子, probe)를 최소한 6 ㎝ 들어가게 삽입함으로써측정하였다(Miyazawa T 등,J.Cereb. Blood Flow Metat.1992; 12:817-822).

다음으로, 상기 랫트의 해마 조직 절편을 상기 시험예 1에서의 방법과 동일한 방법으로 제조하고, 절편의 가로, 세로 각각 1 ㎜ 면적내에서 정상형 CA1 추체신경원 세포수의 평균값을 구함으로써 신경 보호 능력을 측정하였다. 측정값은 평균±표준편차이며, 각 군에 대한 자료값은 대조군과 각 시료군을 비교하여 스튜던트 t-검정법으로 분석하였고, 결과는 하기 표 4에 나타내었다(도 8 참조).

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 체온을 37℃ 로 조정한 정상 대조군(sham)의 경우 가로×세로 1㎟ 당 세포수 평균은 308±6.6인 반면, 무첨가 대조군에서는 27±6.1로 나타나 신경세포 고사가 많이 일어났음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 한약조성물 100㎎/㎏을 투여한 실험군에서는 세포수 평균이 각각 255.3±8.8 세포수/㎜로 무첨가 대조군에 비하여 각각 81.2% 정도의 신경 세포가살아있음을 확인함으로써 매우 우수한 신경세포 보호 효과를 나타냄을 확인하였다.

상기 결과로부터, 본 발명의 한약조성물 및 이를 함유한 약학적 제제는 뇌허혈 등의 원인에 의해 신경세포가 고사하는 것을 저해하는 작용이 탁월할 뿐만아니라 독성이 없으므로 신경세포의 고사에 의해 발생되는 뇌질환의 예방 및 치료의 목적으로 사용될 경우 매우 효과적이다.

Claims (4)

1. 황련, 황금, 치자, 울금 및 우황을 포함하는 신경보호작용을 나타내는 한약조성물.
2. 유효 활성성분으로서 제 1 항에서 청구된 한약조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 뇌졸증의 예방 및 치료용 약학적 제제.
3. 황련 10 내지 50 중량%, 황금 10 내지 50 중량%, 치자 10 내지 50 중량% 및 울금 10 내지 50 중량%를 함께 저급알콜, 물 혹은 이의 혼합물로 추출하고, 이어 농축시킨 후 동결건조시켜 수득한 엑기스와 우황 0.1 내지 10 중량%를 혼합함을 특징으로 하여, 황련, 황금, 치자, 울금 및 우황의 한약조성물을 제조하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 적어도 5 중량%의 결합형 비릴루빈을 함유하는 우황, 적어도 3 중량%의 바이칼린을 함유하는 황금, 적어도 1 중량%의 베르베린을 함유하는 황련, 적어도 1 중량%의 게니포시드를 함유하는 치자 및 적어도 0.1 중량%의 커큐민을 함유하는 울금을 사용하는 방법.