KR20040088531A

KR20040088531A - 2차 대사 동종체 분포 조절

Info

Publication number: KR20040088531A
Application number: KR10-2004-7013195A
Authority: KR
Inventors: 리카리피터제이; 줄리엔브라이언; 프리크만스콧; 쓰루타히로코
Original assignee: 코산 바이오사이언시즈, 인코포레이티드
Priority date: 2002-02-25
Filing date: 2003-02-25
Publication date: 2004-10-16
Also published as: US20040014183A1; JP4280810B2; NZ535515A; CN1639319B; ES2295574T3; EP1485462B1; AU2003223190A8; EP1485462A2; AU2003223190A1; ATE380861T1; EP1485462A4; JP2005518210A; DE60318020T2; CN1639319A; WO2003072730A3; DE60318020D1; WO2003072730A2; US7220560B2

Abstract

본 발명은 폴리케티드 동종체 분포를 조절하면서, 각종 산소 분압 조건하에 폴리케티드 신타제(PKS) 유전자군을 이종적으로 발현시키도록 조작된 점액세균 균주에 대한 일반화된 산소-제한 배양 방법을 제공한다.

Description

2차 대사 동종체 분포 조절{Secondary metabolite congener distribution modulation}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2002년 2월 25일자로 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제60/359,821호를 우선권으로 주장하고 있다. 본 특허 출원은 우선권을 주장하며 각각 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 출원 일련 번호 제09/724,878호(1998. 11. 20일자 출원) 및 미국 특허 제6,303,342 B1호에 관한 것이다.

폴리케티드는 일련의 축합 및 수반하는 개질을 통해 2-탄소 단위로부터 합성되는 다양한 화합물의 큰 계열을 나타낸다. 폴리케티드는 진균류 및 균사상 세균,특히, 방선균을 포함하는 많은 종류의 유기체에서 발생한다. 매우 다양한 폴리케티드 구조가 있으며, 폴리케티드의 부류는 다양한 활성을 갖는 다수의 화합물을 포함한다. 에리트로마이신, FK-506, FK-520, 메갈로미신, 나르보마이신, 올레안도마이신, 피크로마이신, 라파마이신, 스피노신 및 틸로신이 이러한 화합물의 예이다. 전통적 화학 방법론에 의한 폴리케티드 화합물의 제조상에 주어진 난점 및 야생형 세포내에서 폴리케티드의 전형적인 낮은 생산은 폴리케티드 화합물을 제조하기 위한 개선된 또는 대안적 방법을 발견하는 데 상당한 관심을 가져 오게 했다. 각각이 본원에 참조로서 인용되어 있는, PCT 공개번호 WO 제93/13663호; WO 제95/08548호; WO 제96/40968호; 제97/02358호 및 제98/27203호; 미극 특허 번호 제4,874,748호; 제5,063,155호; 제5,098,837호; 제5,149,639호; 제5,672,491호; 제5,712,146호 및 제5,962,290호 및 문헌[Fu et al., 1994, Biochemistry 33:9321-9326; McDaniel et al., 1993, Science 262: 1546-1550; 및 Rohr, 1995, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34(8): 881-888]을 참조한다.

폴리케티드는 폴리케티드 신타제(PKS) 효소에 의해 자연적으로 합성된다. 다중 대형 단백질의 복합체인 이들 효소는 지방산의 생합성에서 2-탄소 단위의 축합을 촉매하는 신타제와 유사하다. PKS 효소는 일반적으로 3개 이상의 개방형 판독 프레임(ORFs)로 이루어진 PKS 유전자에 의해 암호화된다. 조성 및 합성 방법이 상이한, PKS 효소의 2개의 주 유형이 공지되어 있다. PKS 효소의 이들 2개의 주된 유형은 일반적으로 제I형 또는 "모듈성" 및 제II형 "반복성" PKS 효소로 지칭된다. 진균 세포에서 주로 발견되는 제3형의 PKS는 제I형 및 제II형 효소 둘 다의 특징을가지며 "진균" PKS 효소로 지칭된다.

모듈성 PKS들은 에리트로마이신, 메갈로미신, 메티마이신, 나르보마이신, 올레안도마이신, 피크로마이신 및 틸로신을 포함하는 다수의 12-, 14- 및 16-원 매크로라이드계 항생제의 제조를 담당한다. 모듈성 PKS의 각 ORF는 케토신타제 활성의 1개 또는 2개 이상의 "모듈"을 포함할 수 있으며, 각 모듈은 2개 이상 (부하 모듈인 경우) 및 보다 전형적으로는 3개(가장 단순한 확장자 모듈에 대한) 이상의 효소 활성 또는 "도메인"으로 이루어진다. 이들 대형 다기능성 효소(>300,000kDa)는 아실 티오에스테르 사이의 탈카복실성 축합 후 β-탄소 공정 활성을 변화시키는 주기를 포함하는 다단계 경로를 통해 폴리케티드 마크로락톤의 생합성을 촉매한다(본원에 참조로서 인용된, 문헌[O'Hagan, D. The polyketide metabolites; E. Horwood: New York, 1991]을 참조한다).

지난 5년 동안, 모듈성 PKS 기능 및 특이성에 대한 연구가 6-데옥시에리트로놀리드 B(6-dEB) 신타제(DEBS) 유전자로 개발된 플라스미드-계 스트렙토마이세스 코엘리칼라(Streptomyces coelicolor) 발현 시스템에 의해 현저히 촉진되어 왔다(각각 본원에 참조로서 인용된 문헌[Kao et al., 1994, Science, 265:509-512, McDaniel et al., 1993, Science 262:1546-1557] 및 미국 특허 제5,672,491호 및 제5,712,146호를 참조한다). DEBS에 대한 본 플라스미드-계 유전자 시스템의 이점은 이것이 자연적 DEBS 숙주 유기체, 사카로폴리스포라 에리트라에(Saccharopolyspora erythraea)의 조작을 위한 지루하고 제한된 기법을 극복하여 재조합 PKSs의 작제를 보다 용이하게 하며, "순수한" 숙주 배경을 제공함으로써PKS 분석의 복잡성을 감소시킨다는 것이다. 본 시스템은 또한 스트렙토마이세스 내의 제1 조합 모듈성 폴리케티드 라이브러리(library)의 작제를 촉진시킨다(각각이 본원에 참조로서 인용된, PCT 공개번호 WO 제98/49315호 및 제00/024907호를 참조한다).

PKS들의 유전자 조작에 의한 단량체 선별 및 β-탄소 공정 정도와 같은 폴리케티드 생합성의 측면을 제어하는 능력은 신규한 항생제의 조합 공학에 큰 관심을 자극하였다(각각 본원에 참조로서 인용된 문헌[Hutchinson, 1998, Curr. Opin, Microbiol. 1:319-329; Carreras and Santi, 1998, Curr. Opin. Biotech. 9:403-411]; 및 미국 특허 제5,712,146호 및 제5,672,491호를 참조한다). 이러한 관심은 PKS 효소를 암호화하는 유전자의 재조합 DNA 기법에 의한 클로닝, 분석 및 조작을 양산하였다. 양산된 기법은 자연적으로 또는 숙주내에서 발생하는 것보다 높은 수준에서 본 PKS에 의해 합성되는 폴리케티드를 제조하거나 폴리케티드를 제조하지 않는 공지된 PKS 유전자군을 조작하게 하는 것이다. 본 기법은 또한 구조적으로 연관되어 있지만, 공지된 PKS 유전자군으로부터 제조된 폴리케티드와 구별되는 분자를 제조하게 하는 것이다.

이러한 효소를 정상적으로 발현하지 않는 숙주 세포내에서 제I형 및 제II형 PKS 효소에 의해 생산된 폴리케티드를 발현시키는 데 상당한 관심이 있어 왔다. 예를 들면, 이종 이.콜라이(E.coli), 효모 및 식물 세포에서 진균 폴리케티드 6-메틸살리실산(6-MSA)의 생산이 보고되어 왔다. 각각 본원에 참조로서 인용된 문헌[Kealey et al., Jan. 1998, Production of a polyketide natural product innonpolyketide-producing prokaryotic and eukaryotic host, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:505-9, 미국 특허 제6,033,883호 및 PCT 특허 출원 제98/27203호 및 제99/02669호를 참조한다. 이종 아실 담체 단백질 신타제(ACPS)의 공동-발현을 필요로 하거나 이에 의해 현저히 증가된 6-MSA의 이종 생산 및 이.콜라이에 있어 배지 공급은 6-MSA 생합성에 사용되는 말로닐 CoA 기질의 수준을 증가시키는 데 유용하였다. 또한, 본원에 참조로서 인용된 PCT 특허 출원 제97/13845호를 참조한다.

기타 폴리케티드의 생합성은 말로닐 CoA와는 별개로 또는 이에 더하여 기질을 필요로 한다. 이러한 기질은 예를 들면, 프로피오닐 CoA, 2-메틸말로닐 CoA, 2-하이드록시말로닐 CoA 및 2-에틸말로닐 CoA를 포함한다. 폴리케티드 생산 숙주로서 사용할 수 있는 무수한 숙주 세포 중, 많은 것이 이러한 기질을 자연적으로 생산하지 못한다. 출발 물질 및 확장자 분자의 조작 외에, 각종 숙주 세포에서 테일러링(tailoring) 효소를 조작하여 다양한 폴리케티드를 제조한다. 추가로, 숙주는 폴리케티드 동종체 생산에서 중요한 역할을 수행한다.

세균은 편성호기성세균(산소가 성장에 필수적이다), 통성혐기성세균(산소는 필수적이지는 않지만, 빠르게 성장하게 한다), 내기성 혐기성세균(산소가 성장에 영향을 주지 않는다), 편성혐기성세균(산소가 성장을 방해한다) 또는 미호기성세균(저농도의 산소가 성장에 필요하다)으로 분류된다. 호기성세균에서 산소-의존성 세포내 공정은 옥시다제 및 옥시게나제 효소에 의해 매개된다. 대부분의 점액세균 및 방선균이 편성호기성세균의 예이다. 미호기성(저산소) 조건하에서의 호기성 세균의 성장은, 배양물의 성장 반응 및 1차 및 2차 대사산물의 생산이 과량의 산소화의 조건하에서 전형적으로 관측되는 것과 흔히 상이하기 때문에, 흥미를 끈다(문헌[참조: Winkelheusen et al., 1996; Schneider et al. 1999; Jensen et al., 2001; Liefke et al., 1990; Kaiser et al., 1994; Dick et al., 1994]). 저자 및 출원년도에 의해 인용된 참조문헌은 아래에 충분히 언급하였으며 각각은 본원에 참조로서 전문이 인용되어 있다.

악티노미세탈레스(Actinomycetales) 및 믹소코칼스(Myxococcales)의 구성원에 의해 제조된 많은 2차 대사산물은 유효하고 다양한 생물학적 활성을 나타낸다. 폴리케티드는 폴리케티드 신타제(PKS)로 지칭되는 대형 다기능성 효소에 의해 생산된 후, 흔히 수반하는 효소 경로를 통해 변형되는, 이들 자연적 생성물의 부류이다(Carreras et al., 2000). 이들 테일러링 경로 효소의 작용은 당화, 수산화반응, 메틸화, 에폭시화 또는 분자의 중심 구조에 대한 다수의 기타 변화를 포함할 수 있다.

이들 테일러링 경로를 따르는 중간체 화합물은 흔히 최종 화합물과 상이한 생물학적 효능을 갖는다. 이의 예는 항균 화합물 에리트로마이신 B, C 및 D이며, 이들은 산소-의존성 EryK 하이드록실라제를 포함하는 효소 경로를 통해 보다 유효한 에리트로마이신 A 동종체로 가공될 수 있다(도 1 참조). 에리트로마이신 B 및 이의 13-치환된 유사체는 모틸리드(motilide)로 지칭되는 위장운동촉진제의 반합성 생산을 위한 전구체로서 유용하다. 그러나, 에리트로마이신 B는 EryK 효소에 대한 매우 불량한 기질이며, 본질적으로 이러한 경로의 분로상 최종 생성물이다(Lambalot et al., 1995). 이어서 에리트로마이신 D의 궁극적 운명은 EryG 메틸라제 및 산소 의존성 EryK 하이드록실라제 사이의 경쟁적 반응에 따른다. 에리트로마이신 A 또는 B 동종체가 이들 배양의 주된 최종 생성물인지를 결정하는 데 있어 6-데옥시에리트로놀리드 B(6-dEB) 유사체의 에스. 에리트라에(S. erythraea)에 의한 생전환 중 용존 산소 농도가 결정적인 것으로 이미 밝혀져 있다(Carreras et al., 1990).

에포틸론(도 2)은 최근에 유효한 항암 화합물 팍리탁셀에 대한 강력한 화학요법 대체물질로서 관심을 불러일으켰다(Bollag et al., 1995, Gerth et al., 1996). 팍리탁셀(탁솔^R) 및 에포틸론 둘 다 동일한 작용 메카니즘을 통해 미세관을 안정화시키지만, 에포틸론은 팍리탁셀-내성 암에 효과적이며 보다 수용성이다(Kowalski et al., 1997, Su et al., 1997). 39개 이상의 상이한 에포틸론 변형체 및 관련 화합물이 야생형 생산 유기체, 소란기움 셀룰로섬의 발효 브로스(broth)에서 동정되었다(Hardt et al., 2001). 에포틸론 D가 4개의 주 에포틸론 동종체 A, B, C 또는 D의 최고 치료 지수를 갖는다고 보고되지만(Chou et al., 1998, Chou et al., 2001), 에스. 셀룰로섬에 의해서는 매우 낮은 양으로 생산된다(Gerth et al., 2000). 에포틸론 PKS의 아실 트랜스퍼라제 4(AT4) 도메인은 말로닐-CoA 또는 메틸말로닐-CoA 확장자 단위를 통합할 수 있으며, 이러한 선택성은 에포틸론 A 및 B 사이, 또는 에포틸론 C 및 D 사이의 최종 비율에 영향을 준다(Gerth et al., 2000). 에포틸론 D 동종체는 EpoK 모노옥시게나제에 의해 촉매되는, 에포틸론 B으로의 에폭시화(도 3)를 위한 직접적인 전구체이다(Julien et al., 2000, Gerth, et al.,2001).

에리트로마이신 B 및 에포틸론 D는 중간체가 때로 목적하는 생성물인 2차 대사산물 테일러링 경로의 중간체의 예로서 제시된다. 따라서, 모노옥시게나제 효소 반응이 경로 중간체를 최종 생성물로 처리하기 위해 필요한, 자연 생성물의 많은 다른 예가 있다. 예는 컴팩틴의 콜레스테롤-저하제, 프라바스타틴으로의 생전환(Serizawa et al., 1991, Watanabe et al., 1995); 식물 호르몬, 지베렐린의 생산(Tudzynski et al, 1998); 진균 미코톡신, 스테리그마토시스틴의 생산(Keller et al., 2000); 및 독소루비신, 항암제의 생산(Lomovskaya et al., 1999, Walczak et al., 1999)를 포함한다.

이들 산소-의존성 효소의 활성은 유전적 방법에 의해 제거될 수 있지만, 이러한 공법은 각종 이유로 수행하기 어렵거나 불가능하다고 증명될 수 있다. 모노옥시게나제 효소의 직접적 유전자 비활성화는 이의 서열에 대한 지식 및 접근 및 숙주 유기체의 DNA를 조작하는 능력을 필요로 한다. 본 발명은 테일러링 효소의 어떠한 유전자 조작의 필요없이, 주 생성물로서 이들 중간체를 생산하기 위한 대안적 방법을 제공한다.

이종 숙주 세포내에 가치 있고 유용한 폴리케티드의 대량 생산 잠재력이 있다면, 동종체의 변형된 분포로 폴리케티드를 생산할 수 있는 숙주 세포가 필요하다. 본 발명은 재조합 숙주 세포, 발현 벡터 및 다양한 숙주 세포 내에서 폴리케티드를 생산하기 위한 방법을 제공함으로써 이러한 필요를 충족시키도록 돕는다.

다음의 참조는 본 발명에 대한 배경 지식을 제공하며 본원에 이들의 전문이참조로서 인용되어 있다.

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발명의 요약

한 양태에서, 본 발명은 폴리케티드 신타제(PKS) 유전자 또는 테일러링 효소의 유전자 조작없이 이종 숙주 세포내의 폴리케티드 동종체 분포를 조절하는 방법을 제공한다.

한 양태에서, 본 발명은 숙주 세포의 배양 중 산소 분압을 제어함으로써 폴리케티드 동종체의 특정 분포를 생산하도록 조작될 수 있는 대사적으로 조작한 이종 숙주 세포를 제공한다.

한 양태에서, 본 발명은 조절된 산소 분압 조건 하에 배양될 시 동종체의 생산을 이동시키는, 재조합 폴리케티드 생산 숙주 세포를 제공한다. 한 양태에서, 재조합 숙주 세포는 에포틸론 A 및 B를 생산하고 고갈된 산소 조건하에 배양할 시, 에포틸론 C 및 D로 생산을 이동시키는 소란기움 셀룰로섬 숙주 세포이다.

한 양태에서, 이종 숙주 세포에 의해 생산된 폴리케티드는 에포틸론이고, 본 에포틸론 동종체 분포는 배양 중 산소 분압을 조절함으로써 에포틸론 D를 생산하도록 조절된다.

한 양태에서, 산소 분압에 의해 조절된 에포틸론 동종체 분포는 과량의 산소분압하에 에포틸론 C 동종체에 대한 에포틸론 D동종체의 고비율을 초래한다. 다른 양태에서, 에포틸론 D 동종체에 대한 에포틸론 C의 비율은 고갈된 산소 조건하에 증가한다. 한 양태에서, 에포틸론 동종체는 이종 믹소코쿠스 크산투스(Myxococcusxanthus) 균주 K111-32.35에 의해 생산된다. 한 양태에서, 균주 K111-32.35에서 에포틸론 A 및 B는 과량의 산소 분압 하에 생산되며, 에포틸론 C 및 D는 고갈된 산소 분압하에 생산된다.

한 양태에서, 본 발명은 유전자 조작 없이 에포틸론 폴리케티드 신타제(PKS)군의 모듈 4의 산소 분압을 조절함으로써 에포틸론의 아실트랜스퍼라제(AT) 도메인의 특이성을 변화시키는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 균주 K111-32.35의 AT 특이성은 C-12에서 메틸 그룹을 갖는 동종체로의 이동을 초래하면서, 메틸말로닐-CoA로 이동한다(에포틸론 B 또는 D).

한 양태에서, 본 발명은 활성 EpoK 모노옥시게나제를 갖는 대사적으로 조작된 이종 숙주 세포에 의해 생산된 신규한 폴리케티드를 제공한다.

한 양태에서, 이종 숙주 세포의 배양 중 산소분압을 조절함으로써 생산된 신규한 폴리케티드는 에포틸론 506이다.

본 발명은 재조합 DNA 기법에 의한 폴리케티드 생산을 위한 재조합 방법 및 물질, 및 산소분압을 조절함으로써 폴리케티드 동종체 분포를 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명은 농업, 축산업, 화학, 의약화학, 의학, 분자생물학, 약리학 및 수의 공학의 분야에 관한 것이다.

도 1은 산소-의존성 EryK 하이드록실라제를 포함하는 효소 경로를 통해 보다 유효한 에리트로마이신 A 동종체로 가공될 수 있는, 에리트로마이신 B, C 및 D를 나타낸다.

도 2는 각종 에포틸론의 화학 구조를 나타낸다. (a) 에포틸론 A(R₁=H; R₂=S); 에포틸론 B(R₁=CH₃; R₂=S); 에포틸론 G₁(R₁=H; R₂=O); 에포틸론 G₂(R₁=CH₃; R₂=O). (b) 에포틸론 C(R₁=H; R₂=S); 에포틸론 D(R₁=CH₃; R₂=S); 에포틸론 H₁(R₁=H; R₂=O); 에포틸론 H₂(R₁=CH₃; R₂=O). (c) 10,11-다이데하이드로-에포틸론 A(R₁=H); 10,11-다이데하이드로-에포틸론 B(R₁=CH₃). (d) 10,11-다이데하이드로-에포틸론C(R₁=H); 10,11-다이데하이드로-에포틸론 D(R₁=CH₃).

도 3은 에포틸론 D 동종체가 EpoK 모노옥시게나제에 의해 촉매된 에포틸론 B로의 에폭시화를 위한 직접적 전구체임을 나타낸다.

도 4는 (a) 과량 또는 (b) 고갈된 산소조건 하의 균주 K111-32.25(EpoK⁺)의 배양을 나타내며, 고갈된 산소조건은 과량의 산소의 존재하에 동일한 균주의 배양 중 수득된 것보다 60% 높은 세포 밀도를 양산한다.

도 5는 (a) EpoK 효소의 최대 활성 및 1차 최종 생성물로서의 에포틸론 A 및 B의 생산을 초래하는 과량의 산소 조건하에서 배양된 균주 K111-40.1((EpoK⁺)의 발효로부터의 수지 추출물의 HPLC 크로마토그래프; (b) 고갈된 산소 조건이 1차 최종 생성물로서 에포틸론 C 및 D의 생성을 초래하면서, 본 효소의 활성을 제한하고; (c) 고갈된 산소조건 하의 이들 배양의 결과는 EpoK 효소의 활성이 유전자 조작을 통해 제거된, 과량의 산소조건 하의 다른 균주(K111-40.1)을 사용하여 수득한 바와 유사함을 나타낸다.

도 6은 과량의 산소 조건하에 (b) Epo506으로 전환되는 (a) 10,11-다이데하이드로-에포틸론 B의 비닐위치 파이네(Payne) 재배열을 나타낸다.

도 7은 10,11-다이데하이드로-에포틸론 D 및 Epo506 사이의 동종체 비율의 이동을 초래하는 고갈된 및 과량의 산소처리 둘 다의 조건하에서의 균주 K165-79.7의 배양을 나타낸다.

도 8은 소란기움 셀룰로섬 균주 Soce K111-150.17의 배양 중 산소분압의 조절이 에포틸론 생산물 분포를 이동시킴을 나타낸다. (a) 50% 용존 산소(DO) 하의 세포 성장; 및 (b) 및 (c) 저 산소분압.

도 9는 3개의 상이한 용존 산소 조건에 대한 시간 경과에 따른 역가를 나타낸다.

도 10은 t=112시간에서 50% 용존 산소 조건으로부터의 epoA 및 epoB 동종체 분포를 나타내는 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.

도 11은 112시간에서 0% 용존 산소 조건으로부터의 에포틸론 A, B, C 및 D 피크의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.

본 발명은 테일러링 효소의 임의의 유전자 조작 필요 없이, 주 생성물로서 폴리케티드 중간체를 생산하는 대안적 방법을 제공한다. 본 발명의 본 방법은 부다페스트 조약 하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션{American Type Culture Collection(ATCC)}에 기탁되고 수탁 번호를 양도받은 숙주 세포를 사용한다. 믹소코쿠스 크산투스 균주 K111-32.25는 수탁 번호 PTA-1700 하에 2000년 5월 1일자로 기탁되었으며 믹소코쿠스 크산투스 균주 K111-40.1은 수탁 번호 PTA-2712하에 2001년 1월 18일자로 기탁되었다. 소란기움 셀룰로섬 균주 K111-150.17은 _________하에 __________일자로 기탁되었다.

유가(fed batch) 배양 방법은 이종 엠. 크산투스(M. xanthus)계에서 에포틸론 D의 생산을 위해 이미 기술되었다. 이들 유가 배양 중, 용존 산소분압은 동종체 생산의 이동을 이루기 위해 과량의 산소, 약 50% 용존 산소 포화 내지 고갈된 산소 또는 0% 용존 산소 측정치로 변형되거나 조절될 수 있다. 유가 배양 중, 용존 산소분압은 교반율의 자동화 제어를 통해 50%의 공기 포화에서 유지된다. 교반율의 상위 범위가 본 용존 산소분압의 유지에 불충분한 값에서 제한되는 경우, 이의 증가된 세포 밀도에 의한 배양물의 대사 요구의 지속적인 증가는 궁극적으로 산소의 배양 브로스를 고갈시킬 수 있다. 이어서 본 배양은 배양 브로스 내의 산소 용해율이 세포에 의한 이의 소비율과 동등한 대사 상태가 된다. 잔여 산소 활성을 나타내지 않는, 용존 산소 프로브로부터 0의 판독을 초래하는 본 대사 상태가 배양 브로스에서 검출된다. 이어서 여전히 배양물의 생존가능성을 유지시키는 데 충분한 산소를 제공하는 동안, 처리 경로의 산소-의존성 테일러링 효소의 활성을 최소화하기 위해 본 배양 상태를 사용할 수 있다.

K111-32.25(ATCC 수탁 번호 PTA-1700, 2000년 5월 1일) 에포틸론 B 생산 균주(EpoK⁺)의 배양물은 교반률의 제어에 의해 전체 에포틸론 생산 단계 동안 과량(50% 포화) 및 고갈된(0%) 용존 산소분압에서 유지시켰다(도 4 a, b). 과량의 산소 조건은 EpoK 효소의 최대 활성 및 1차 최종 생성물로서 에포틸론 A 및 B의 생산을 초래한다(도 5a). 고갈된 산소 조건은 1차 최종 생성물로서 에포틸론 C 및 D의 생산을 초래하면서, 본 효소 활성을 제한한다(도 5b). 고갈된 산소조건 하의 이들 배양의 결과는 과량의 산소조건 하에, EpoK 효소의 활성이 유전자 조작을 통해 제거된 다른 균주(K111-40.1, ATCC 수탁 번호 PTA-2712, 2001년 1월 18일)를 사용하여 수득된 것과 유사하다(도 5c).

용존 산소분압의 조절은 에포틸론 A 및 B(또는 C 및 D) 동종체 사이의 비율과 에포틸론의 최대 총 역가에 영향을 준다(실시예 2, 표 1을 참조). 그러나, 이들 최대 역가가 수득되는 시간은 표 1에 기술된 3개의 배양 조건 모두 약 12일에 이들의 최대 총 에포틸론 역가를 수득한 바와 같이, 균주 유형 또는 생반응기내의 산소화 농도에 따르지 않는다. 에포틸론 PKS의 아실 트랜스퍼라제 4(AT4) 도메인은 말로닐 CoA 또는 메틸말로닐-CoA 확장자 단위를 통합시킬 수 있으며, 본 선택성은 이들 에포틸론 동종체(17) 사이의 최종 비율에 영향을 준다. 산소 농도는 말로닐- 및 메틸말로닐-CoA 사이의 세포내 풀(pool) 분포에 간접적으로 영향을 줄 수 있다. 과량의 산소조건을 사용한 균주 K111-40.1(EpoK^-) 및 K111-32.25(EpoK⁺)의 배양은 C-12(에포틸론 B 또는 D)에서 메틸 그룹을 갖는 동종체로의 현저한 이동을 초래하며, 이는 본 세포가 이러한 조건하에서 메틸말로닐-CoA의 생산 및/또는 통합을 선호함을 나타낸다(표 1).

고갈된 산소조건을 사용한 EpoK⁺의 배양은 과량의 산소 하에 동일한 균주의 배양 중 수득된 것 보다 60% 높은 세포 밀도를 산출한다(도 4 a, b). 과량의 산소 배양의 급격한 성장 단계는 7일째에 멈추며, 그 후 세포 밀도는 상대적으로 일정하게 유지된다(도 4a). 이러한 급격한 단계 중 특정 성장률(μ)은 0.7d^-1이었다. 그러나, 교반 캐스케이드(cascade) 반응의 한계 때문에, 고갈된 산소 배양 중 용존 산소분압이 4일째에 0 에 도달할 시, 본 배양은 이의 급격한 성장 단계로부터 저속의 성장(μ=0.15d^-1)으로 이동하고, 이는 12일까지 계속된다(도 4b). 성장 거동에 있어서의 유사한 양식 및 최대 세포 밀도의 증가 또한 고갈된 산소조건을 사용한 EpoK^-균주 및 신규한 에포틸론을 생산하는 유전적으로 조작한 다른 엠. 크산투스 균주를 사용하여 관측하였다.

고갈된 산소 배양 중 세포 밀도의 증가는 (i) 산소 제한에 의한 느린 성장 중 세포가 상이한 속도 또는 상이한 선택 양식으로 영양분을 사용할 수 있고, 이에 따라 중요한 영양분의 고갈을 연기할 수 있으며, (ii) 본 배양이 과량의 산소하에 방출된 것 보다 산소 제한 중 상이한 유형 또는 농도의 유효한 성장-억제 대사산물을 생산하거나, (iii) 산소의 제한이 세균 성장 및 호흡 과정에 관련되는 효소의 활성 및 유전자의 발현을 증강 또는 억제시키는 것이 원인이 될 수 있다.

세균 배양물의 배양 중 용존 산소 농도의 제어는 배양물의 세포 밀도와 제2 대사산물 역가 및 이들의 동종체 분포에 극적인 영향을 줄 수 있다. 이러한 산소-제한 배양 방법은 1차 생성물로서 산소-의존성 테일러링 경로의 중간체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 모노옥시게나제 활성은 완전하게 제거되지 않으며, 단지 과량의 산소 조건하에 전형적으로 보이는 최대 속도의 부분으로 감소된다. 이들 중간체가 저속에서 여전히 처리되는 것을 예방하기 위해, 특정한 방법으로 이들을 안정화시키는 것이 필요할 수 있다. 이의 예는 에리트로마이신 D 기질에 대한 EryK 하이드록실라제 및 EryG 메틸라제 사이의 경쟁적 반응이다(도 1). EryK의 활성이 감소되는 경우, EryG는 에리트로마이신 D의 EryK 하이드록실라제의 불량한기질인, 에리트로마이신 B로의 전환을 촉매할 수 있다. 이는 효소 경로 중간체, 에리트로마이신 B가 축적되게 한다. 이러한 경로는 또한 다른 산소-의존성 테일러링 효소, EryF를 포함하는데(도 1), 당해 효소 또한 여전히 제한된 산소 조건하에 6-데옥시에리트로놀리드 B(6-dEB)가 에리트로놀리드 B로 가고오딜 수 있게 한다.

본 중간체 축적의 다른 예는 활성 EpoK 효소를 사용한 이종 엠. 크산투스계의 배양 중 에포틸론 D의 생산이다. 산소-고갈된 EpoK 효소의 활성 감소는 에포틸론 D 중간체의 이의 에포틸론 B 동종체로의 촉매화를 느리게 하는 데 명백히 충분하고 에포틸론 D가 세포 밖으로 확산되게 하며 생반응기에서 XAD-16 수지에 결합되거나 이에 의해 안정화된다. EpoK 활성이 유지되는 에스. 셀룰로섬의 비생산 균주의 교반 플라스크 배양물로의 에포틸론 C 및 D의 첨가는 이들 화합물이 세포 내로 되돌아 확산되게 하며 수지가 존재하지 않을 경우 에포틸론 A 및 B로 변환되게 한다. 쥴리엔(Julien) 및 동료들은 이것이 또한 에포틸론 PKS는 비작용적이지만, EpoK는 활성이 있는 믹소코쿠스 크산투스 균주를 사용하는 경우임을 밝혀내었다.

신규한 에포틸론은 에포틸론 폴리케티드 신타제 서열이 조작된 균주에 의해 생산된다(Julien et al., 2000, Tang et al., 2000). 생산 배지에 아세테이트 및 프로피오네이트와 같은 특정 전구체를 첨가함과 함께, 용존 산소분압을 조절하여 활성 EpoK 효소를 갖는 단일 엠. 크산투스 균주로부터 1차 생성물로서 4개의 주요 에포틸론 동종체 A, B, C 또는 D 각각을 생산한다(도 2)(Frykman et al., 2002).

생산 배지 내의 세린 농도의 증가는 에포틸론 비-리보솜 펩티드 신테타제(NRPS)에 의해 시스테인 대신 이의 에포틸론 내로의 상대적 통합을 증가시킨다(Frykman et al., 2002). 용존 산소 농도의 조절과 함께, K-111-32.25의 생산 배지에 세린을 공급하면 주 생성물로서 옥사졸 에포틸론 G₂또는 H₂(도 2) 중 하나가 생산된다. 용존 산소분압을 제어하며, 생산 배지에 세린 아세테이트 및/또는 프로피오네이트를 첨가하면 단일 엠. 크산투스 균주로부터 1차 생성물로서 임의의 8개의 티아졸 및 옥사졸 주 화합물(에포틸론 A, B, C, D, G1, G2, H1 및 H2)이 축적된다. 이러한 접근은 또한, 10,11-다이데하이드로에포틸론 D 및 Epo506의 옥사졸 상대물을 생산하거나 이의 동종체를 조절할 수 있게 한다.

야생형 에포틸론 PKS는 에포틸론 A-D 외에 거의 35개의 추가의 에포틸론 변형체를 생산한다고 밝혀져왔다(Hardt et al., 2001). 유사하게, 에포틸론 PKS 및 조작한 변형체의 이종 발현이 기대한 생성물 외에 다수의 신규한 화합물을 양산한다고 밝혀져 왔다. 이들 생성물의 농축은 배양 조건에 의해 증강 또는 억제될 수 있다. 이의 PKS 서열 내의 단일한 유전적 변화를 갖는 균주의 배양 조건의 조작을 통한 신규한 화합물의 생성 및 이들 분포의 조절 능력은 장비 PKS 공학이 적합한 생리학적 조율과 배합되었을 때, 얼마나 강력하게 유효한 생물학적 활성을 갖는 신규한 자연 생성물을 빠르게 산출할 수 있는가를 입증한다.

위에 제공한 본 발명의 상세한 기술, 다음의 실시예는 본 발명을 예시할 목적으로 제공되었으며 본 발명 또는 청구항의 범위에 제한을 두는 것으로 해석되지 않아야 한다.

조절된 산소분압 조건 하의 숙주 세포의 배양

세균성 균주. 에포틸론 폴리케티드 신타제를 소란기움 셀룰로섬 SMP44로부터 클로닝하였고, 믹소코쿠스 크산투스 균주 DZ1로 도입하였다(Julien et al., 발행). 엠. 크산투스 에포틸론 B 생산자(K111-32.25)는 작용적 EpoK 에폭시다제(EpoK⁺)를 가지며, 반면 본 효소는 에포틸론 D 생산 균주(K111-40.1) 내에서는 유전적으로 비활성화(EpoK^-)되어 있다. 에포틸론 PKS의 에놀 리덕타제(ER5)도메인의 활성을 K111-32.25 및 K111-40.1 균주 둘 다에 점돌연변이를 도입함으로써 제거하여 균주 K165-79.7 및 K165-76.2 각각을 생산하였다. 균주 K165-79.7 및 K165-76.2를 처리하여 10,11-다이데하이드로-에포틸론 B 및 D, 각각을 생산하였다(도 2).

생반응기 접종량 팽창. 달리 제시되지 않는 한, 모든 배지 성분은 시그마{Sigma(St. Louis, MO)}로부터 입수되었다. 모든 엠. 크산투스 배양은 28℃ 및 175rpm에서 2일 동안 CYE-MOM 배지(카이스톤 10g/L, 카세인의 최장 소화물(Difco, Detroit, MI), 효모추출물 5g/L(Difco), MgSO₄·7H₂O 1g/L(EM Science, Gibbstown, NJ) 및 메틸 올레이트 2㎖/L(Emerest 2301, Cognis Corporation, Cincinnati, OH)) 3㎖를 함유하는 멸균된 25㎖들이 유리 튜브에 동결 세포 뱅크 바이알(vial) 1㎖을 환원시킴으로써 시작하였다. 본 튜브의 전체 성분을 250㎖ 배플장착된 삼각 플라스크에서 CYE-MOM 50㎖에 1일 동안 팽창시키고, 이어서 본 플라스크를 1일 동안 배양한 2.8L 배플장착된 페른바흐(Fernbach) 플라스크에서 CYE-MOM 500㎖를 접종하는데 사용하였다.

유가 생반응기 배양. XAD-16 소수성 수지(Rohm and Haas, Philadelphia, PA) 100그람 및 MgSO₄·7H₂O 10g을 탈이온화된 물 4.5L에 배합하고, 5L들이 생반응기에서 멸균시켰다(90분, 121℃)(B. Braun, Allentown, PA). 본 수지를 생산 배지에 통합시켜 에포틸론을 결합시키고 이들을 분해로부터 안정화시켰다. 카세인 소화물 및 메틸 올레이트 250g/ℓ용액의 2개의 분리된 공급 루프를 생반응기에 연결하고, 이들 2개의 충분한 양의 영양분을 생반응기에 첨가하여 초기 카세인 소화물 및 메틸 올레이트 농도가 각각, 5g/ℓ 및 2㎖/ℓ가 되게 한다. 최종적으로, 0.22㎛ 필터-여과된 흔적 원소 용액(1%(v/v) 농축된 H₂SO₄, FeCl₃·6H₂O 14.6g/ℓ, ZnCl₃2.0g/ℓ, MnCl₂·4H₂O 1.0g/ℓ, CuCl₂·2H₂O 0.43g/ℓ, H₃BO₃0.31g/ℓ, CaCl₂·6H₂O 0.24g/ℓ및 Na₂MO₄·2H₂O 0.24g/ℓ) 25㎖을 멸균적으로 첨가한다. 이어서 본 생반응기를 CYE-MOM 시드(seed) 배양물로 접종하고(5% v/v), 접종 48시간 후 카세인 소화물(2g/ℓ/일) 및 메틸 올레이트(3㎖/ℓ/일) 공급을 시작하였다. 생반응기 내에서 기류를 0.4vvm{분당 용기 용적당 기류 용적(airflow volume per vessel volume per minute)}에서 일정하게 유지하였다.

생반응기에 용해된 산소분압을 제자리 폴라로그래피 산소 센서를 사용하여 모니터링하였다. 100% 질소를 사용하여 생산 배지를 평형화시킴으로써 0% 용존 산소분압에서, 그리고 공기를 사용하여 생산 배지를 평형화시킴으로써 100% 용존 산소분압에서 본 프로브를 측정하였다. 배양 중 추가로 생반응기 역압(backpressure)을 사용하지 않고, 초기 교반률을 400rpm으로 셋팅하였다. 산소의 포화 농도는 28℃에서 약 7.7mg/ℓ이다(Pirt, S.J., 1975). 과량의 산소 배양 중 교반 캐스케이드(고갈된 산소 배양 중 최대 450rpm으로 제한되는 교반률을 가짐)에 의해 용존 산소분압을 최소 공기 포화(3.9mg/ℓO₂) 50%로 유지하였다. 2.5N H₂SO₄및 2.5N KOH를 자동적으로 첨가하여 pH 세트 포인트를 7.4로 유지하였다. 생반응기를 12 내지 14일 동안 매일 표본 추출한 후, 수지를 수거하였다.

세포 밀도 및 에포틸론 역가의 정량. 배양 샘플 50㎖을 원뿔형 튜브내의 생반응기로부터 매일 제거하고, 본 브로스를 수지로부터 옮겼다. 본 브로스의 1㎖ 분취액을 5분 동안 12000g에서 1.5㎖ 에펜도르프 튜브내에서 원심분리하고, 상층액을 피펫으로 제거하였다. 세포 펠렛을 탈이온화된 물을 사용하여 총 용적 1㎖로 재현탁시켰고, 본 세포 현탁액의 흡광도를 600nm에서 분광광도계로 측정하였다(Genesys 20, Thermo Spectronic, Rochester, NY). 믹소코쿠스 크산투스 배양물은 정확한 흡광도(OD) 측정을 촉진시키는, 분산된 단일세포성 막대형으로 성장하였다. 1.0 흡광도 단위의 OD 측정은 약 0.3g/ℓ의 무수 세포중량과 상관되며, 본 상관 선형은 0 내지 40 OD 단위의 범위 내에 있다.

XAD-16 수지를 탈이온화된 물 45㎖로 1회 세척하고, 다시 이를 옮겼다. 본 수지를 30분 동안 시약-등급 메탄올 25㎖로 추출하고, 본 에포틸론 역가를 HPLC 또는 LC/MS에 의해 정량하였다. HPLC 분석은 250nm에서 UV 검출을 갖는 휴렛 팩카드(Hewlett Packard) 1090 HPLC(Palo Alto, CA)를 사용하여 수행하였다. 메탄올-추출 용액 50㎕ 분취액을 2개의 4.6 ×10mm 보호 칼럼(MetaChem Inertsil C18 ODS 3, 5㎛, Ansys, Lake Forest, CA) 및 크로마토그래피 분리용 동일한 물질의 장칼럼(4.6 ×150mm)을 통하여 주입하였다. 본 방법은 70% 아세토니트릴 및 30% 물을 사용하여 12분에 걸쳐 전개시키는 등용매였다. LC/MS 분석을 APCI원 및 상기한 바와 같은 동일한 보호 및 크로마토그래프 칼럼을 사용하여, PE Sciex API100LC(Perkin-Elmer, Shelton, CT)내로 주입함으로써 동일한 샘플상에서 수행하였다. 크로마토그래프 방법은 10분의 기간에 걸쳐 35%에서 100%까지 선형적으로 증가하는 아세토니트릴/물 구배였다.

실시예 2

신규한 에포틸론의 제조

증가된 수용성 및/또는 종양 세포주에 대한 효능을 효율적으로 나타낼 수 있는 신규한 에포틸론을 생산하는 본 발명의 균주를 제조하기 위해 에포틸론 PKS를 유전적으로 변형시켰다. 본 발명의 산소화 제어 방법을 신규한 에포틸론, 10,11-다이데하이드로-에포틸론 B(도 2)를 제조하기 위해 유전적으로 조작한 조작된 믹소코쿠스 크산투스 생산 균주(균주 K165-79.7, EpoK⁺)에 적용시켰다. 이의 상대물, 균주 K165-76.2(EpoK^-)를 과량의 산소화 조건 하에 배양시키는 경우, 10,11-다이데하이드로-에포틸론 C 및 D(도 2)가 단독 생성물임이 밝혀졌다. 균주 K165-79.7 내의 활성 EpoK 효소가 과량의 산소의 존재하에 본 10,11-다이데하이드로-에포틸론 D중간체의 10,11-디아디하이드로-에포틸론 B로의 에폭시화(도 6a)를 촉매한다고 기대되었다. 그러나, 본 화합물은 검출되지 않았으며; 대신, 신규한 이성체(Epo506)이 이들 배양의 1차 생성물이었다(도 6b). 고분해능 질량 분광측정 및 1차원 및 2차원 NMR을 사용하여 본 테트라하이드로푸란 생성물의 구조를 수립하였다(실시예 1 참조).

본 관측 결과는 과량의 산소 조건하에 형성된 10,11-다이데하이드로-에포틸론 B가 이어서, 도 6에 요약된 바와 같이, 비닐위치 파이네 재배열을 통해 Epo506으로 전환되는 방법의 생성물일 수 있다. 본 반응은 에폭시드 개방이 상대적으로 안정한 알릴성 탄소양이온 중간체를 산출하기 때문에 선호된다. 고갈된 및 과량의 산소화 조건하의 균주 K165-79.7의 배양은 10,11-다이데하이드로-에포틸론 D 및 Epo506사이의 동종체 비율의 이동을 초래하며(도 7), 이는 이들 2개의 용존 산소 농도하에 모균주, K111-32.25의 배양에 의해 수득된, 에폭시화 및 비에폭시화 에포틸론 화합물 사이의 동종체 이동과 유사하였다(표 1).

양이온 모드 중 터보-이온스프레이원으로 배열한 마리너(Mariner) TOF 분광기(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 Epo506의 고분해능 질량 스펙트럼을 수득하였다. QNP z-축 구배 프로브헤드(probehead)로 갖춘 DRX 400 분광기(Bruker, Billerica, MA)를 사용하여 300K에서 Epo506의 1-D 및 2-D NMR 스펙트럼을 기록하였다. 화학적 이동은¹H 및¹³C에 대해 각각, δ7.26 및 77.0으로 나타났다.

Epo506의 분자식은 10,11-다이데하이드로-에포틸론 D에 관하여 1개의 산소 원자의 통합을 나타내는, m/z 506.25887(C₂₇H₄₀NO₆S 506.25709에 대해 계산됨)에서 [M+H]⁺피크의 HREIMS 측정에 의해 C₂₇H₃₉NO₆으로 결정되었다.¹³C 스펙트럼은 Epo506이 10,11-다이데하이드로-에포틸론 D보다 1개 적은 이중 결합을 포함함을 나타내었고, 이는 Epo506이 추가의 환을 함유함을 암시하는 것이다. HSQC, HMBC, COSY 및 TOCSY 데이타는 탄소 연결성을 명백하게 지시하였다. 탄소 3, 7, 10 및 13에서의 화학적 이동은 이들 탄소 4개 모두가 산소 원자에 결합되었음을 나타내었다. 이들 산소화된 탄소 2개는 분자식을 차지하는 사이클릭 에테르의 일부라고 간주되었다. 탄소 3 및 13에서의 하이드록실 양자는 1-D 및 2-D 스펙트럼 둘 다에서 보여지며, 이웃 원자에 대한 이들 HMBC 및 COSY 상관은 이들의 지시를 확증하였다. 따라서, 사이클릭 에테르는 테트라하이드로푸란 구조를 나타내는, 탄소 7 및 10을 포함해야 한다. 질량 스펙트럼에서 중요한 Na⁺및 K⁺부가물 또한 LC/MS에 의해 506.3에서 관측된 이온이 정확하게 분자 이온이며, 가설의 모 디올의 이온화에 따라 생산된 단편이 아님을 확증하였다.

K111-40.1 균주내에서 에포틸론 동종체 이동.

배양 조건(균주, 산소 농도)	피크 에포틸론 B 역가(mg/ℓ)	피크 에포틸론 D 역가(mg/ℓ)	총(A-D)에포틸론 역가(mg/ℓ)	에포틸론B:A동종체 비율	에포틸론D:C동종체 비율
K111-32.25(EpoK⁺)과량의 산소	48	3	60	5.8:1	3.6:1
K111-32.25(EpoK⁺)고갈된 산소	3	19	34	2.5:1	1.7:1
K111-40.1(EpoK^-)과량의 산소	0	30	36	-	5.2:1

실시예 3

소란기움 셀룰로섬 균주 Soce90 K111-150.17내에서의 조절된 에포틸론 동종체의 생산

이종 숙주 세포의 배양 중 고갈된 산소의 조절은 폴리케티드 동종체 분포를 이동시키는 것으로 밝혀졌다. 본 실시예에서, 에포틸론 생산 균주를 산소 고갈 상태하에서 배양시킬 경우, 에포틸론 동종체 분포의 변화를 초래하는 산소 분압에 적용시켰다. 소란기움 셀룰로섬 균주 Soce90 K111-150.17(ATCC 수탁 번호 _______)는 UV 돌연변이를 통해 Soce90 모균주로부터 유래된 리파마이신-내성 돌연변이체이다(B. Julien, 공개되지 않은 결과). 본 실시예에 사용된 배양 방법론 및 분석적 방법을 위의 실시예 1에 기술한 바와 같이 수행하였다.

소란기움 셀룰로섬 균주 Soce90 K111-150.17은 활성 epoK 유전자를 갖는 에포틸론 A 및 B 생산자이다. 도 8(a)는 3개의 상이한 용존 산소(DO) 조건 및 lpm(분당 리터)에서 측정된 기류에서 600nm에서 흡광도(OD)에 의해 측정된 시간에 따른 세포 성장을 예시한다. 도 8(b)는 에포틸론 생산 분포에 대한 용존 산소 조절의 효과를 나타낸다. 소란기움 셀룰로섬 균주 Soce90 K111-150.17, 에포틸론 A 및 B생산자는 0% 고갈된 용존 산소 조건에서 에포틸론 C 및 D를 생산한다. 표 2는 각종 산소분압 조건하에서 K111-150.17 균주에 의해 생산된 에포틸론 역가 관측치를 나타낸다. 에포틸론 D의 관측된 생산은 균주 K111-150.17에 대해 50% 과량의 용존 산소에서보다 0% 고갈된 용존 산소하에서 몇배 더 높다.

균주 K111-150.17에서 에포틸론 동종체 비율은 고갈된 산소 하에 이동한다.

DO 농도	LPM	v/v/m	EpoA(mg/ℓ)	EpoB(mg/ℓ)	EpoC(mg/ℓ)	EpoD/mg/ℓ
50%	1	0.2	13.3	6.54	0	0.08
0%	0.4	0.2	3.87	2.06	0.66	0.35
0%	0.3	0.15	3.04	1.71	0.4	0.32

도 9는 저산소 분압 지배하에 보다 높은 에포틸론 D 생산을 나타내는 3개의 상이한 용존 산소 지배에서 균주 K111-150.17에 의한 에포틸론 A, B, C 및 D 생산의 시간 경과를 나타낸다. 50% 용존 산소분압 및 0% 산소 분압하에 수행된 발효로부터의 HPLC 크로마토그램은 50% 산소분압에서의 거의 독점적인 에포틸론 A 및 B의 생산 및 저산소분압하에서 생산되는 보다 많은양의 에포틸론 C 및 D를 나타낸다.

앞의 실시예는 본 발명의 예시를 위한 것이며 다음의 청구항에서 본 발명자에 의해 주장되는 바와 같이 본 발명의 양태를 제한하지 않음이 당해 분야의 숙련가에 의해 이해될 수 있을 것이다.

Claims

숙주 세포가 폴리케티드 생산을 초래하는 조건하에 배양될 경우, 발현되어 폴리케티드의 생산을 초래하는, 발현 제어 서열의 제어하의 폴리케티드 신타제(PKS) 유전자를 포함하고, 또한 활성 산소-감작화 시토크롬 P-450 모노옥시게나제 테일러링(tailoring) 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는, 제어된 산소분압 조건하에 배양된 재조합 점액세균 숙주 세포.
제1항에 있어서, 폴리케티드가 에포틸론인 점액세균 숙주 세포.
제2항에 있어서, 숙주 세포가 소란기움 셀룰로섬(Sorangium cellulosum) 균주 K111-150.17이고, 산소 감작화 시토크롬 P-450 모노옥시게나제가 EpoK 에폭시다제인 점액세균 숙주 세포.
에포틸론의 생산을 초래하는 조건 하에 성장 배지 내에서 숙주 세포를 배양하고 과량의 용존 산소로 산소 분압을 조절하는 단계를 포함하여, 숙주 세포 내의 에포틸론 폴리케티드 신타제(PKS)에서 말로닐-CoA로부터 메틸말로닐-CoA로 아실트랜스퍼라제(AT) 도메인 확장자 단위 특이성을 변형시키는 방법.
폴리케티드의 생산을 초래하는 조건 하에 성장 배지 내에서 숙주 세포를 배양하고 숙주 세포의 배양 중 산소 분압을 조절하여 폴리케티드 동종체의 종의 생산의 이동을 초래하는 단계를 포함하여, 점액세균 숙주 세포내에서 폴리케티드 동종체 분포 생산 비율을 조절하는 방법.
제5항에 있어서, 성장 배지에 세린을 보충하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 성장 배지에 아세테이트를 보충하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 성장 배지에 프로피오네이트를 보충하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 폴리케티드가 에포틸론인 방법.
제9항에 있어서, 산소 분압이 저산소 분압으로 조절되고 생산된 폴리케티드 동종체가 에포틸론 D인 방법.
제5항에 있어서, 숙주 세포가 활성 EpoK⁺모노옥시게나제를 갖는 믹소코쿠스크산투스(Myxococcus xanthus)인 방법.
제5항에 있어서, 숙주 세포가 소란기움 셀룰로섬(Sorangium cellulosum) 균주 Soce90 K111-150.17인 방법.
제5항에 있어서, 숙주 세포가 믹소코쿠스 크산투스 균주 K111.32.25인 방법.
제10항에 있어서, 생산된 에포틸론 D 동종체가 저산소 분압하에 수득되는 방법.
제10항에 있어서, 에포틸론 D 동종체가 과량의 산소 분압 조건하에서보다 최대 4배 높은 농도로 존재하는 방법.
제5항에 있어서, 에포틸론 동종체 생산 비율이 고갈된 산소 배양하에서 에포틸론 A 및 B로부터 에포틸론 C 및 D 동종체 분포로 이동하는 방법.
제5항에 있어서, 에포틸론 D 대 에포틸론 C 동종체 생산 비율이 과량의 산소 조건하에 3 대 1 이상인 방법.
제17항에 있어서, 점액세균 숙주 세포가 EpoK^-인 방법.
제17항에 있어서, 점액세균 숙주 세포가 믹소코쿠스 크산투스 균주 K111-40.1인 방법.
제19항에 있어서, 산소 분압이 50% 용존 산소 이하인 방법.