JP2005518210A

JP2005518210A - 二次代謝物同属種分布の調節

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Publication number: JP2005518210A
Application number: JP2003571418A
Authority: JP
Inventors: ピータージェイリカリ; ブライアンジュリーン; スコットフライクマン; ヒロコツルタ
Original assignee: コーザンバイオサイエンシスインコーポレイテッド
Priority date: 2002-02-25
Filing date: 2003-02-25
Publication date: 2005-06-23
Anticipated expiration: 2023-02-25
Also published as: CN1639319A; JP4280810B2; US20040014183A1; AU2003223190A8; DE60318020D1; KR20040088531A; ES2295574T3; EP1485462A4; EP1485462A2; NZ535515A; US7220560B2; WO2003072730A3; AU2003223190A1; EP1485462B1; CN1639319B; WO2003072730A2; ATE380861T1; DE60318020T2

Abstract

本発明は、異種的にポリケチドシンターゼ（PKS）遺伝子クラスターを発現するように操作した粘液細菌株の、該ポリケチド同属種分布を調節する種々の酸素圧条件下での一般化酸素制限培養法を提供する。

Description

（関連出願に対するクロスレファレンス）
本出願は、2002年2月25日提出の米国特許出願番号60/359,821に対する優先権を主張する。本特許出願は、1998年11月20日提出の米国特許出願番号09/724,878に対する優先権を主張し、かつこの出願に関連し、また米国特許第6,303,342 B1に関連する。これら文献はそれぞれ参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。

（発明の分野）
本発明は、組換えDNA技術によってポリケチドを産生させるための組換え方法と材料、及び酸素圧を調節することでポリケチド同属種分布を調節する方法を提供する。本発明は、農業、動物管理、化学、医薬品化学、医学、分子生物学、薬理学、及び獣医学の分野に関する。

（発明の背景）
ポリケチド(Polyketides)は、一連の縮合とその後の修飾によって2-炭素単位から合成される多様な化合物の大ファミリーを表す。ポリケチドは、真菌及び菌糸細菌、特に放線菌を含む多くのタイプの生物内に存在する。多種多様なポリケチド構造があり、ポリケチドの分類は多様な活性を有する多数の化合物を包含する。エリスロマイシン、FK-506、FK-520、メガロマイシン、ナルボマイシン、オレアンドマイシン、ピクロマイシン、ラパマイシン、スピノシン(spinocyn)、及びチロシンは、このような化合物の例である。伝統的な化学的方法論でポリケチド化合物を生成することの困難性及び野生型細胞内でのポリケチドの典型的に低い生産量を考えると、ポリケチド化合物を生成する改良された或いは代替手段を見いだすことに相当の関心がある。PCT公開番号WO93/13663；WO95/08548；WO96/40968；97/02358；及び98/27203；米国特許第4,874,748；5,063,155；5,098,837；5,149,639；5,672,491；5,712,146；及び5,962,290；及びFuら, 1994, Biochemistry 33:9321-9326；McDanielら, 1993, Science 262:1546-1550；及びRohr, 1995, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34(8):881-888（それぞれ参照によって本明細書に取り込まれる）を参照せよ。

ポリケチドは、ポリケチドシンターゼ(PKS)酵素によって天然に合成される。これら酵素は、多数の大きいタンパク質の複合体であり、脂肪酸の生合成における2-炭素単位の縮合を触媒するシンターゼと同様である。PKS酵素は、通常３個以上の開いた読み枠(ORFs)から成るPKS遺伝子によってコードされる。２つの主要タイプのPKS酵素が知られており；これらはその組成と合成の態様が異なる。これら２つの主要タイプのPKS酵素は、通常、Ｉ型又は“モジュール型”及びII型又は“反復型”PKS酵素と呼ばれる。最初真菌細胞内で発見された第３タイプのPKSはＩ型とII型の両酵素の特徴を有し、“真菌”PKS酵素と呼ばれる。

モジュール型PKSsは、エリスロマイシン、メガロマイシン、メチマイシン、ナルボマイシン、オレアンドマイシン、ピクロマイシン、及びチロシンを含む多数の12-、14-、及び16-員マクロライド抗生物質の製造に寄与する。モジュール型PKSの各ORFは、ケトシンターゼ活性の１、２、又はそれ以上の“モジュール”（各モジュールは少なくとも２個（ローディングモジュールの場合）、さらに典型的には３個（最も単純なエクステンダーモジュール）又はそれ以上の酵素活性から成る）或いは“ドメイン”を含み得る。これら大きい多機能酵素（＞300,000kDa）は、アシルチオエステル間の脱炭酸的縮合後β炭素プロセシング活性を変えるサイクルを含む多段階経路によるポリケチドマクロラクトンの生合成を触媒する（参照によって本明細書に取り込まれるO'Hagan, D. The Polyketide metabolites；E. Horwood: New York, 1991参照）。

過去５年間の間に、モジュール型PKSの機能と特異性の研究は、6-デオキシエリスロノライドB(6-dEB)シンターゼ(DEBS)遺伝子によって発達した、プラスミドを基礎としたストレプトマイセス-コエリカラー(coelicolor)発現系によってかなり容易になった（Kaoら, 1994, Science 265:509-512, McDanielら, 1993, Science 262:1546-1557、米国特許第5,672,491号及び第5,712,146号（それぞれ参照によって本明細書に取り込まれる）参照）。このプラスミドを基礎としたDEBSの遺伝子系に対する利点は、それが天然のDEBS宿主生物、Saccharopolyspola erythraeaを操作するための冗漫かつ制限された方法を克服し、組換えPKSsのより容易な構築を可能にし、かつ“クリーンな”宿主バックグラウンドを与えることによるPKS分析の複雑さを減少させることである。この系は、ストレプトマイセス内の第１組合せモジュール型ポリケチドライブラリーの構築を効率よくもした（PCT公開番号WO98/49315及び00/024907(それぞれ参照によって本明細書に取り込まれる)参照）。

PKSsの遺伝子操作によるモノマー選択及びβ-炭素プロセシングの程度のようなポリケチド生合成の局面を制御する能力は、新規抗生物質の組合せ工学で多くの関心を刺激してきた（Hutchinson, 1998, Curr. Opin. Microbial. 1:319-329；Carreras及びSanti, 1998, Curr. Opin. Biotech. 9:403-411；米国特許第5,712,146号及び第5,672,491号(それぞれ参照によって本明細書に取り込まれる)参照）。この関心がPKS酵素をコードする遺伝子の組換えDNA技術によるクローニング、分析、及び操作をもたらした。その結果の技術により、既知のPKS遺伝子クラスターを操作して天然に存在するより高レベルで、或いはそうでなければポリケチドを産生しない宿主内で当該PKSによって合成されるポリケチドを生成することができる。この技術により、構造的に関連するが、既知のPKS遺伝子クラスターから産生されるポリケチドとは異なる分子を生成することもできる。

Ｉ型及びII型PKS酵素によって、普通はこのような酵素を発現しない宿主細胞内で産生されるポリケチドを発現することに多大な関心があった。例えば、異種の大腸菌、酵母菌、及び植物細胞内での真菌ポリケチド6-メチルサリチル酸(6-MSA)の産生が報告されている。Kealeyら, Jan. 1998, 非ポリケチド産生性原核生物及び真核生物宿主内でのポリケチド天然産物の産生, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:505-9、米国特許第6,033,883号、及びPCT特許公開番号98/27203及び99/02669（それぞれ参照によって本明細書に取り込まれる）を参照せよ。6-MSAの異種産生は異種のアシルキャリヤータンパク質シンターゼ(ACPS)の共発現を必要とし、或いはそれによってかなり増加し、しかも大腸菌では、6-MSA生合成で利用されるマロニルCoA基質のレベルの増加に培地補充が役立った。PCT特許公開番号97/13845（参照によって本明細書に取り込まれる）も参照せよ。

他のポリケチドの生合成は、マロニルCoA以外の基質或いはマロニルCoAに加えて基質を必要とする。このような基質としては、例えば、プロピオニルCoA、2-メチルマロニルCoA、2-ヒドロキシマロニルCoA、及び2-エチルマロニルCoAが挙げられる。ポリケチド産生性宿主として利用可能な無数の宿主細胞の多くはこのような基質を天然には産生しない。さらに、出発基質及びエクステンダー分子の操作には、多様なポリケチド産物を獲得するための種々の宿主内で酵素を仕立てる(tailor)という操作がある。さらに、宿主はポリケチド同属種産生で重大な役割を果たす。

細菌は偏性好気性菌（生育に酸素が必要）、通性嫌気性菌（酸素を必要としないが、より早い生育をもたらす）、耐気性嫌気性菌（酸素は生育に効果を及ぼさない）、偏性嫌気性菌（酸素が生育を妨げる）、又は微好気性菌（生育に低濃度の酸素が必要）として分類される。好気性細菌における酸素依存性の細胞内プロセスは、オキシダーゼ及びオキシゲナーゼ酵素によって媒介される。ほとんどの粘液細菌(myxobacteria)及び放線菌は偏性好気性菌の例である。微好気性（低酸素）条件下での好気性細菌の生育は、クラスターの生育挙動と一次及び二次代謝物の生産が過剰酸素化の条件下で典型的に観察されるのとしばしば異なるので興味深い（Winkelheusenら, 1996；Schneiderら, 1999；Jensenら, 2001；Liefkeら, 1990；Kaiserら, 1994；Dickら, 1994）。出版物の著者と年数で引用される参考文献は完全引用が後述され、それぞれその全体が参照によって本明細書に取り込まれる。

放線菌目及び粘液細菌目のメンバーによって産生される多くの二次代謝物は、強力かつ様々な生物活性を示す。ポリケチドは、ポリケチドシンターゼ(PKS)と呼ばれる大きい多機能酵素によって生産され、しばしばその後に起こる酵素経路によって修飾されるこれら天然産物の１分類である（Carrerasら, 2000）。これら仕立て(tailoring)経路酵素の作用としては、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、エポキシド化、又は該分子のコア構造に対する多数の変化が挙げられる。

これら仕立て経路に沿った中間化合物は、しばしば最終化合物とは異なる生物力価を有する。この例は、抗菌化合物エリスロマイシンＢ、Ｃ、及びＤであり、酸素依存性EryKヒドロキシラーゼを含む酵素経路によってより強力なエリスロマイシンＡ同属種に加工され得る（図１参照）。エリスロマイシンＢ及びその13-置換類似体は、モチライド(motilides)と呼ばれるプロキネチック(prokinetic)胃腸薬の半合成的生産の前駆体として有用である。しかし、エリスロマイシンＢはEryK酵素に対して非常に不十分な基質であり、かつ本質的にこの経路の分路最終産物である（Lambalotら, 1995）。従って、エリスロマイシンＤ分子の究極的な運命はEryGメチラーゼと酸素依存性EryKヒドロキシラーゼとの間の競合反応に依存する。以前に、6-デオキシエリスロノライドＢ(6-dEB)類似体のS. erythraea生転換時の溶解酸素濃度が、エリスロマイシンＡ又はＢ同属種がこれら培養の優先的な最終産物であるかの決定に重要であることが示された（Carrerasら, 1990）。

エポチロン(epothilones)(図２)は、最近、強力な抗癌化合物パクリタキセルに対して可能性のある化学療法用後継薬としての関心を生み出した（Bollagら,1995, Gerthら,1996）。パクリタキセル(Taxol(登録商標))とエポチロンは両方とも同一機構の作用によって微小管を安定化するが、エポチロンはパクリタキセル抵抗性腫瘍に有効であり、より水溶性である（Kowalskiら, 1997, Suら, 1997）。少なくとも39種のエポチロン変種と関連化合物が、野生型産生性生物、Sorangium cellulosumの発酵ブロス内で同定された(Hardtら,2001)。エポチロンＤは、４つの主要エポチロン同属種Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤの最高治療指標を有すると報告されているが（Chouら, 1998, Chouら, 2001）、S. cellulosumによって非常に低量で産生される（Gerthら, 2000）。エポチロンPKSのアシルトランスフェラーゼ４(AT4)ドメインは、マロニル-CoA又はメチルマロニル-CoAエクステンダー単位を取り込むことができ、この選択性がエポチロンＡとＢの間、又はエポチロンＣとＤの間の最終的な比率に影響する（Gerthら, 2000）。エポチロンＤ同属種は、EpoKモノオキシゲナーゼによって触媒されるエポチロンＢへのエポキシド化（図３）の直接的な前駆体である（Julienら, 2000, Gerthら, 2001）。

エリスロマイシンＢとエポチロンＤは、二次代謝物仕立て経路の中間体の例として提供され、該中間体は、時には所望産物である。さらに、最終産物への経路中間体のプロセシングにモノオキシゲナーゼ酵素反応が必要な天然産物の多くの他の例がある。例としては、コレステロール低減薬、プラバスタチンへのコンパクションという生転換が挙げられる（Serizawaら, 1991, Watanabeら, 1995；植物ホルモン、ジベレリンの生産（Tudzynskiら, 1998）；真菌マイコトキシン、ステリグマトシスチン(sterigmatocystin)の生産（Kellerら, 2000）；及びドキソルビシン、抗癌薬の生産（Lomovskayaら,1999, Walczakら, 1999））。

これら酸素依存性酵素の活性は遺伝的手段によって除去できるが、この操作は種々の理由のため達成が困難又は不可能であることがわかる。モノオキシゲナーゼ酵素の直接的な遺伝子不活性化は、その配列の知識と配列へのアクセスのみならず、宿主生物のDNAを操作する能力をも必要とする。本発明は、仕立て酵素のいかなる遺伝子操作をも必要とせずに、主要産物としてこれら中間体を生じさせる代替方法を提供する。

異種宿主細胞内で大量の有益かつ有用なポリケチドを作る可能性を考慮すると、同属種の変化した分布内でポリケチドを作ることができる宿主細胞が必要である。本発明は、組換え宿主細胞、発現ベクター、及び多様な宿主細胞内でポリケチドを作る方法を提供することで当該必要を満たすのに役立つ。
以下の参考文献は、本発明に関する背景情報を提供し、参照によってその全体が本明細書に含まれるものとする。

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発明の概要
一実施形態では、本発明は、ポリケチドシンターゼ(PKS)遺伝子又は仕立て酵素の遺伝子操作なしで、異種宿主細胞内のポリケチド同属種分布を調節する方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、宿主細胞の培養中酸素圧を制御することによって特定分布のポリケチド同属種を産生するように操作できる、代謝的に操作された異種宿主細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、調節した酸素圧条件下で培養した場合、同属種の生産量を変化させる組換えポリケチド産生性宿主細胞を提供する。一実施形態では、組換え宿主細胞はエポチロンＡ及びＢを産生するSorangium cellulosum宿主細胞であり、欠乏酸素条件下で培養すると、生産物をエポチロンＣ及びＤに変える。

一実施形態では、異種宿主細胞によって産生されるポリケチドがエポチロンであり、かつ培養中酸素圧を調節することによって、該エポチロン同属種分布が調節されてエポチロンＤを産生する。
一実施形態では、エポチロン同属種分布が酸素圧で調節された結果、過剰酸素圧下では、エポチロンＣ同属種に対してより高率のエポチロンＤ同属種となる。別の実施形態では、欠乏酸素条件下でエポチロンＣのエポチロンＤ同属種に対する比率が増す。一実施形態では、エポチロン同属種が異種Myxococcus xanthus株K111-32.25によって産生される。一実施形態では、株K111-32.25内過剰酸素圧下ではエポチロンＡ及びＢが産生され、かつ欠乏酸素圧下ではエポチロンＣ及びＤが産生される。

一実施形態では、本発明は、遺伝子操作なしで、エポチロンポリケチドシンターゼ(PKS)クラスターのモジュール４の酸素圧を調節することによって、エポチロンのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメインの特異性を変える方法を提供する。一実施形態では、株K111-32.25のAT特異性がメチルマロニル-CoAに変わり、結果としてＣ-12にメチル基を有する同属種（エポチロンＢ又はＤ）への変化となる。
一実施形態では、本発明は、活性なEpoKモノオキシゲナーゼを有する代謝的に操作した異種宿主細胞によって産生される新規なポリケチドを提供する。
一実施形態では、異種宿主細胞の培養中酸素圧を調節することによって産生される新規なポリケチドがエポチロン506である。

発明の詳細な説明
本発明は、仕立て酵素のいかなる遺伝子操作をも必要とせずに、主要産物としてポリケチド中間体を産生させる代替方法を提供する。本発明の方法は、ブダペスト条約下、American Type Culture Collection(ATCC)によって寄託され、かつ寄託指定番号が割り当てられている宿主細胞を利用する。Myxococcus xanthus株K111-32.25は、寄託指定PTA-1700で2000年5月1日に寄託され、Myxococcus xanthus株K111-40.1は、寄託番号PTA-2712で2001年1月18日に寄託された。Sorangium cellulosum株K111-150.17は、寄託指定で
に寄託された。

流加培養法は、異種M. xantus系内のエポチロンＤの産生について既述されている。これら流加培養中に、溶解酸素圧を過剰酸素、約50％の溶解酸素飽和から欠乏酸素又は実測０％の溶解酸素まで調節して、同属種産生の変化を達成することができる。流加培養中、撹拌速度の自動制御によって溶解酸素圧を50％の空気飽和で維持する。撹拌速度の上方範囲がこの溶解酸素圧の維持に不十分な値で制限されると、その上昇する細胞密度による培養の代謝要求の連続した増加が、最終的に培養ブロスの酸素を消耗し得る。培養は代謝状態であり、培養ブロス中への酸素の溶解速度が細胞による酸素の消費速度に等しい。この代謝状態の結果、溶解酸素プローブからの読みがゼロとなり、培養ブロス内で残存酸素活性が検出されないことを示す。この培養状態を利用して、プロセシング経路の酸素依存性仕立て酵素の活性を最小化し、それでもなお十分な酸素を供給して培養生存能力を維持することができる。

K111-32.25(ATCC寄託指定PTA-1700，2000年5月1日)エポチロンＢ産生性株(EpoK⁺)の培養は、全体的なエポチロン産生期の間、撹拌速度を制御することによって過剰(飽和の50％)及び欠乏(０％)溶解酸素圧で維持した（図４ａ,ｂ）。過剰酸素条件の結果、EpoK酵素の最大活性、及び主要最終産物としてエポチロンＡとＢの産生となる（図５ａ）。欠乏酸素条件は、この酵素の活性を制限し、その結果主要最終産物としてエポチロンＣとＤの産生となる（図５ｂ）。欠乏酸素化下でのこれら培養の結果は、EpoK酵素の活性が遺伝子操作によって除去されている別の株(K111-40.1，ATCC寄託指定PTA-2712，2001年1月18日)によって過剰酸素化下で得られる結果と同様である（図５ｃ）。

溶解酸素圧の調節は、エポチロンの最大総力価に加え、エポチロンＡ及びＢ（又はＣ及びＤ）同属種間の比に影響する（実施例２、表１参照）。しかし、これら最大力価が得られる時は、表１に示される３種すべての培養条件が12日あたりで最大総エポチロン力価を獲得したように、株のタイプ又はバイオリアクター内の酸素化レベルに依存しなかった。エポチロンPKSのアシルトランスフェラーゼ４(AT4)ドメインは、マロニル-CoA又はメチルマロニル-CoAエクステンダー単位を取り込むことができ、この選択性がこれらエポチロン同属種間(17)の最終比に影響する。酸素濃度は、マロニル-及びメチルマロニル-CoA間の細胞内プール分布に間接的に影響し得る。過剰酸素化での株K111-40.1(EpoK^-)及びK111-32.25(EpoK⁺)の培養の結果、Ｃ-12にメチル基を有する同属種（エポチロンＢ又はＤ）への明白な変化をもたらし、この条件下では細胞がメチルマロニル-CoAの産生及び／又は取り込みを助けることを示している。

欠乏酸素化でのEpoK⁺株の培養は、過剰酸素の存在下で同一株の培養時に得られる細胞密度より60％高い細胞密度をもたらした（図４ａ,ｂ）。過剰酸素培養の指数増殖期は７日に終わり、その後、細胞密度は比較的安定したままだった（図４ａ）。この指数期中の比増殖速度(μ)は0.7ｄ^-1だった。しかし、欠乏酸素培養内の溶解酸素圧が、撹拌カスケード応答の制限のため４日にゼロに達したとき、この培養はその指数増殖期から低速の増殖(μ＝0.15ｄ^-1)に変化し、12日まで続いた（図４ｂ）。増殖挙動の同様のパターン及び最大細胞密度の増加は、欠乏酸素化でのEpoK^-株によってのみならず、他の遺伝的に操作した、新規エポチロンを産生するM. xanthusでも観察された。
欠乏酸素培養内の酸素密度の増加は、(ｉ)細胞が、酸素制限によって強いられる遅い増殖時に、異なる速度又は異なる選択パターンで栄養素を利用し、それによって臨界的な栄養素の消耗を延期し得る、(ii)培養が、酸素制限時に過剰酸素化下で排出されるのとは異なるタイプ又はレベルの強力な増殖-阻害代謝物を産生する、又は(iii)酸素の制限が、細菌の増殖及び呼吸プロセスに関与する遺伝子の発現及び酵素の活性を高め或いは抑制することに起因し得る。

細菌培養の培養中の溶解酸素濃度の制御は、培養の細胞密度のみならず二次代謝物の力価とその同属種分布に劇的な効果をもたらす。この酸素制限培養戦略を用いて、主要産物として酸素依存性仕立て経路の中間体を生じさせることができる。しかし、モノオキシゲナーゼ活性が完全に除去されるわけではなく、単に過剰酸素条件下で典型的に見られる最大速度のフラクションに減じられるだけである。それでもやはりこれら中間体が低速で処理されるのを防ぐため、何らかの方法でそれらを安定化する必要がある。この一例は、エリスロマイシンＤ基質に対するEryKヒドロキシラーゼとEryGメチラーゼとの間の競合反応である（図１）。EryKの活性が減少すれば、EryGはエリスロマイシンＤの、EryKヒドロキシラーゼに対して不十分な基質であるエリスロマイシンＢへの転換を触媒することができる。これは、酵素経路中間体、エリスロマイシンＢの蓄積をもたらす。この経路は、別の酸素依存性仕立て酵素、すなわち制限された酸素条件下で6-デオキシエリスロノライドＢ(6-dEB)をエリスロノライドＢに処理できる状態のままであるEryFをも含む（図１）。

この中間体蓄積の別の例は、活性EpoK酵素を有する異種M. xanthus系の培養時のエポチロンＤの産生である。酸素依存性EpoK酵素活性の低減は、エポチロンＤ中間体のそのエポチロンＢ同属種への触媒作用を遅くするのに明らかに十分であり、かつエポチロンＤを細胞から拡散させ、バイオリアクター内でXAD-16樹脂に結合かつ安定化させる。エポチロンＣとＤを添加して、EpoK活性を保持するS. cellulosum非産生性株のフラスコ培養を振り動かすと、樹脂が存在しない場合は、これら化合物が細胞中に戻って拡散し、エポチロンＡとＢに変換してしまうことが分かった。Julien及び共同研究者らは、エポチロンPKSは非機能性であるが、EpoKが活性であるMyxococcus xanthus株でもこの状況であることを示した。
エポチロンポリケチドシンターゼ配列を操作した株によって新規なエポチロンが創造される（Julienら, 2000, Tangら, 2000）。アセテートやプロピオネートのような特有の前駆体の産生培地への添加と組み合わせた溶解酸素圧の調節は、活性なEpoK酵素を有する単一のM. xantus株から主要産物として４つの主要エポチロン同属種Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤ（図２）のそれぞれの産生を可能にする（Frykmanら, 2002）。

産生培地内のセリン濃度を高めると、エポチロン非リボソームペプチドシンターゼ(NRPS)によるシステインに代わるエポチロンへのセリンの相対的な取り込みが増える（Frykmanら, 2002）。溶解酸素濃度の調節と共に、株K111-32.25の産生培地へのセリンの補充の結果、主要産物としてオキサゾールエポチロンＧ₂又はＨ₂のどちらかの産生となる（図２）。溶解酸素圧の調節に加え、セリン、アセテート、及び／又はプロピオネートの産生培地への補充は、単一のM. xantus株から主要産物として、これら８種のチアゾールとオキサゾール主要化合物（エポチロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ₁、Ｇ₂、Ｈ₁、及びＨ₂）のいずれの蓄積をも可能にする。このアプローチは、同様に10,11-ジデヒドロ-エポチロンＤとEpo506のオキサゾール同等物の産生と同属種調節をも可能にするはずだ。

野生型エポチロンPKSは、エポチロンＡ〜Ｄに加え、ほぼ35種のさらなるエポチロン変種を産生することが分かった（Hardtら, 2001）。同様に、エポチロンPKSの異種発現及び操作した変種は、予想した産物に加え、多数の新規化合物をもたらすことが分かった。これら産物の濃度は、培養条件によって高め或いは抑制することができる。新規化合物を生成する能力及びそのPKS配列内に単一の遺伝子変化を有する株の培養条件の操作によるそれら新規化合物の分布を調節する能力は、適切な生理学的調節と組み合わせた場合、手段PKS操作が、強力な生理活性を有する新規な天然産物の迅速な生成にいかに強力であるかを実証する。
上述した本発明の詳細な説明、以下の実施例は、本発明を説明する目的のために与えられ、本発明又はクレイムの範囲の制限であると解釈すべきでない。

実施例１
調節した酸素圧条件下での宿主細胞の培養
細菌株。エポチロンポリケチドシンターゼをSorangium cellulosum SMP44からクローン化し、Myxococcus xanthus株DZ1中に導入した（Julienら, 印刷中）。M. xantusエポチロンＢ産生株（K111-32.25）は機能性EpoKエポキシダーゼ（EpoK⁺）を有するが、この酵素はエポチロンＤ産生性株（K111-40.1）内では遺伝的に不活性化（EpoK^-）されている。エポチロンPKSのエノイルレダクターゼ（ER5）ドメインの活性をK111-32.25及びK111-40.1の両株内の点突然変異の導入によって除去し、それぞれ株K165-79.7及びK165-76.2を生成した。株K165-79.7及びK165-76.2を操作してそれぞれ10,11-ジデヒドロ-エポチロンＢ及びＤを生成した（図２）。

バイオリアクター種菌膨張。特定しない限り、すべての培地成分はSigma（St. Louis, MO）から得た。すべてのM. xantus培養は、３mLのCYE-MOM培地（10g/LのCasitone、カゼインの膵臓消化物（Difco, Detroit, MI）、５g/Lの酵母抽出液（Difco）、１g/LのMgSO₄・7H₂O（EM Science, Gibbstown, NJ）、及び２mL/Lのオレイン酸メチル（Emerest 2301, Cognis Corporation, Cincinnati, OH））を含有する無菌の25mLガラス管内で１mLの凍結細胞バンクバイアルを２日間28℃及び175rpmで生き返らせることによって開始した。この管の全体的な含量を１日間250mLのバッフルド(baffled)三角フラスコ内50mLのCYE-MOM中で膨張させてから、このフラスコを用いて１日間2.8Lのバッフルドフェルンバッハフラスコ内で500mLのCYE-MOMを接種した。

流加バイオリアクター培養。100ｇのXAD-16疎水性樹脂（Rohm and Haas, Philadelphia, PA）と10ｇのMgSO₄・7H₂Oを4.5Lの脱イオン水中で混ぜ合わせ、かつ５Lのバイオリアクター（B. Braum, Allentown, PA）内で滅菌した（90分、121℃）。この樹脂を産生培地内に組み入れてエポチロンを結合い、それらを分解から安定化した。カゼイン消化物とオレイン酸メチルの250g/L溶液の２つの別々の供給ループをバイオリアクターに連結し、十分な量のこれら２つの栄養素をバイオリアクターに添加してカゼイン消化物及びオレイン酸メチルの初期濃度をそれぞれ５g/L及び2mL/Lに導いた。最後に、25mLの0.22μmフィルター滅菌微量成分溶液（１％(v/v)濃縮H₂SO₄、14.6g/LのFeCl₃・6H₂O、2.0g/LのZnCl₃、1.0g/LのMnCl₂・4H₂O、0.43g/LのCuCl₂・2H₂O、0.31g/LのH₃BO₃、0.24g/LのCaCl₂・6H₂O、及び0.24g/LのNa₂MO₄・2H₂O）を無菌的に添加した。バイオリアクターをCYE-MOM種培養で接種し（５％v/v）、接種後48時間でカゼイン消化物（２g/L/日）とオレイン酸メチル（３mL/L/日）の供給を開始した。バイオリアクター内の空気流は0.4vvm（空気流体積/容器容積/分）で一定に保持した。

インサイツポーラログラフ酸素センサーを用いてバイオリアクター内の溶解酸素圧を監視した。このプローブを、100％窒素で産生培地を平衡化することで０％溶解酸素圧に目盛定めし、産生培地を空気で平衡化することで100％溶解酸素圧に目盛定めした。初期撹拌速度を400rpmに設定し、培養中は追加のバイオリアクター背圧を使用しなかった。酸素の飽和濃度は、28℃で約7.7mg/Lである（Pirt, S.J., 1975）。溶解酸素圧は、過剰酸素培養では撹拌カスケードによって最小で空気飽和の50％に維持し、欠乏酸素培養では撹拌速度を最大450rpmに制限した。pHの設定点7.4は、2.5ＮのH₂SO₄と2.5ＮのKOHを自動添加して維持した。12〜14日間毎日バイオリアクターから試料摂取後、樹脂を収集した。

細胞密度とエポチロン力価の定量。50mLの培養試料を毎日バイオリアクターから円錐管に移し、ブロスを樹脂からデカントした。ブロスの１mL分量を1.5mLのエッペンドルフ管内12000ｇで５分間遠心分離機にかけ、上清をピペットで除去した。細胞ペレットを脱イオン水で再懸濁させて全量１mLにし、この細胞懸濁液の吸光度を600nmで分光光度的に測定した（Genesys 20, Thermo Spectronic, Rochester, NY）。Myxococcus xanthus培養は、別個の単細胞ロッドとして成長し、正確な光学密度（OD）測定を容易にした。1.0吸光度単位のOD測定値は、約0.3g/Lの乾燥細胞質量と相関的関係をもち、この相関直線は０〜40OD単位の範囲内である。

XAD-16樹脂を１回45mLの脱イオン水で洗浄し、再びそれをデカントした。樹脂を25mLの試薬グレードメタノール中で30分間抽出し、エポチロン力価をHPLC又はLC/MSで定量化した。HPLC分析は、UV検出器を備えたHewlett Packard 1090HPLC（Palo Alto, CA）を用いて250nmで行った。50μL分量のメタノール抽出溶液を２つの4.6×10mmガードカラム（MetaChem Inertsil C18 ODS 3,5μm, Ansys, Lake Forest, CA）とクロマトグラフ分離用の同材料のより長いカラム（4.6×150mm）で注入した。本方法は、12分の運転中ずっと70％のアセトニトリルと30％の水で単一溶媒組成で行った。LC/MS分析は同一試料についてAPCI源と前述したのと同一のガード及びクロマトグラフカラムを用いてPE Sciex API100LC（Perkin-Elmer, Shelton, CT）中に注入して行った。このクロマトグラフ法は、10分間に渡って35％から100％に直線的に増加するアセトニトリル/水の勾配だった。

実施例２
新規エポチロンの産生
エポチロンPKSを遺伝子的に変えて、腫瘍細胞系に対して高められた水溶性及び／又は効力を示す可能性のある新規なエポチロンを産生する本発明の株を創造した。遺伝子操作した操作Myxococcus xanthus産生株（株K165-79.7, EpoK⁺）に本発明の酸素化制御法を適用して新規エポチロン、10,11-ジデヒドロ-エポチロンＢを生じさせた（図２）。その一対の片方（K165-76.2K^-）を過剰酸素化条件下で培養した場合、10,11-ジデヒドロ-エポチロンＣ及びＤが単独の産物であることが分かった。株K165-79.7内で活性なEpoK酵素は、過剰酸素の存在下でこの10,11-ジデヒドロ-エポチロンＤ中間体の10,11-ジデヒドロ-エポチロンＢへのエポキシド化（図６ａ）を触媒すると予想された。しかし、この化合物は検出されず、代わりに、新規異性体（Epo506）がこれら培養の主要産物だった（図６ｂ）。高分解能質量分析法と、一及び二次元NMRを利用してこのテトラヒドロフラン産物の構造を確立した（実施例１参照）。

この観察結果は、図６に概要が示されるように、これら過剰酸素条件下で生成された10,11-ジデヒドロ-エポチロンＢが、次にビニル性ペイン(Payne)転位によってEpo506に変換されるプロセスの産物である。この反応は、相対的に安定なアリル性カルボカチオン中間体を与えるエポキシドの開環のため有利である。株K165-79.7の欠乏及び過剰の両酸素化条件下での培養の結果、10,11-ジデヒドロ-エポチロンＤとEpo506との間の同属種比の変化となり（図７）、これら２種の溶解酸素レベル下で親株、K111-32.25の培養によって得られるエポキシド化及び非エポキシド化エポチロン化合物間の同属種変化と同様だった（表１）。

Epo506の高分解能質量スペクトルは、正イオン形態のターボ-イオンスプレイ源を有して構成されたMariner TOF分光器（Applied Biosystems, Foster City, CA）で得た。Epo506の1-D及び2-D NMRスペクトルは、QNP z-軸勾配プローブヘッドを備えたDRX 400分光器（Bruker, Billerica, MA）によって300Ｋで記録した。化学シフトは、¹Ｈ及び¹³Ｃスペクトルでそれぞれδ7.26及び77.0を表した。
Epo506の分子式は、m/z 506.25887の[Ｍ+Ｈ]⁺ピークのHREIMS測定によってＣ₂₇Ｈ₃₉ＮＯ₆であると決定し（Ｃ₂₇Ｈ₃₉ＮＯ₆で計算すると506.25709）、10,11-ジデヒドロ-エポチロンＤについて１つの酸素原子の取り込みを示している。¹³Ｃスペクトルは、Epo506が10,11-ジデヒドロ-エポチロンＤより少ない１つの二重結合を有することを示し、Epo506が付加環を含むことを示唆している。HSQC、HMBC、COSY、及びTOCSYデータは、炭素結合性の疑いの余地のない割当てを与えた。炭素３、７、10及び13における化学シフトは、これら４つの炭素すべてが酸素原子に結合していることを示した。これら酸素化炭素の２つは分子式を考慮して環状エーテルの一部であると想定された。炭素３と13のヒドロキシルプロトンは1-D及び2-Dスペクトルの両方で見られ、それらの隣接原子に対するHMBC及びCOSY相関関係はそれらの割当てを確証した。従って、環状エーテルは、炭素７及び10を含んでいなければならず、テトラヒドロフラン構造を示している。質量スペクトルの有意なNa+及びＫ+付加物も、LC/MSによって506.3で観察されるイオンが実は該分子のイオンであり、仮想の親ジオールのイオン化によって生成されたフラグメントでないことを確証した。

表１．K111-40.1株内のエポチロン同属種変化

実施例３
Sorangium cellulosum株Soce90 K111-150.17内で調節されたエポチロン同属種の産生
異種宿主細胞の培養中の溶解酸素の調節は、ポリケチド同属種分布を変化させることが分かった。この実施例では、酸素欠乏条件下で培養した場合、エポチロン産生性株を酸素圧にさらした結果、エポチロン同属種分布の変化となった。Sorangium cellulosum株Soce90 K111-150.17（ATCC寄託指定）は、Soce90親株からUV突然変異によって誘導されたリファマイシン-抵抗性突然変異体である（B. Julien, 未発表結果）。この実施例で用いる培養方法論及び分析法は、上記実施例１で述べたとおりに行った。

Sorangium cellulosum株Soce90 K111-150.17は、活性なepoK遺伝子を有するエポチロンＡ及びＢ産生株である。図８(ａ)は、３種の溶解酸素（DO）条件の600nmにおける光学密度（OD）で測定した経時的な細胞増殖と、lpm（リットル/分）で測定した空気流を示す。図８(ｂ)は、エポチロン産物分布に及ぼす溶解酸素の調節の効果を示す。Sorangium cellulosum株Soce90 K111-150.17、エポチロンＡ及びＢ産生株は、０％の欠乏溶解酸素条件ではエポチロンＣ及びＤを産生する。表２は、種々の酸素圧条件下でK111-150.17株によって産生されたエポチロンの観察された力価を示す。観察されたエポチロンＤの産生量は、株K111-150.17に対して50％の過剰溶解酸素におけるより０％の欠乏溶解酸素下で数倍高い。

表２．株K111-150.17内での欠乏酸素下におけるエポチロン同属種比の変化

図９は、３種の溶解酸素管理内で株K111-150.17によるエポチロンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの産生量の時間経過を示し、低酸素圧管理下ではエポチロンＤ産生量が高いことが分かる。50％の溶解酸素圧と０％の酸素圧下で行った発酵から得られるHPLCクロマトグラムは、50％の酸素圧ではとんど排他的にエポチロンＡとＢが産生され、かつ低酸素圧下では、より多量のエポチロンＣとＤが産生されることを示す。
前記実施例は本発明の説明のためであり、かつ本技術の当業者は、前記実施例が特許請求の範囲で発明者らが請求するとおりの本発明の非限定的な実施形態であると解釈するものである。

酸素依存性EryKヒドロキシラーゼを含む酵素経路によって、より強力なエリスロマイシンＡ同属種に加工され得るエリスロマイシンＢ、Ｃ、及びＤを示す。種々のエポチロンの化学構造を示し、(ａ)エポチロンＡ(Ｒ₁＝Ｈ；Ｒ₂＝Ｓ)；エポチロンＢ(Ｒ₁＝ＣＨ₃；Ｒ₂＝Ｓ)；エポチロンＧ₁(Ｒ₁＝Ｈ；Ｒ₂＝Ｏ)；エポチロンＧ₂(Ｒ₁＝ＣＨ₃；Ｒ₂＝Ｏ)、(ｂ)エポチロンＣ(Ｒ₁＝Ｈ；Ｒ₂＝Ｓ)；エポチロンＤ(Ｒ₁＝ＣＨ₃；Ｒ₂＝Ｓ)；エポチロンＨ₁(Ｒ₁＝Ｈ；Ｒ₂＝Ｏ)；エポチロンＨ₂(Ｒ₁＝ＣＨ₃；Ｒ₂＝Ｏ)、(ｃ)10,11-ジデヒドロ-エポチロンＡ(Ｒ₁＝Ｈ)；10,11-ジデヒドロ-エポチロンＢ(Ｒ₁＝ＣＨ₃)；(ｄ)10,11-ジデヒドロ-エポチロンＣ(Ｒ₁＝Ｈ)；10,11-ジデヒドロ-エポチロンＤ(Ｒ₁＝ＣＨ₃)を示す。 EpoKモノオキシゲナーゼによって触媒されるエポチロンＢへのエポキシド化のための直接的な前駆体であるエポチロンＤ同属種を示す。 (ａ)過剰又(ｂ)欠乏酸素化の下における株K111-32.25(EpoK⁺)の培養を示し、欠乏酸素化の結果、過剰酸素存在下の同一株の培養中に得られる細胞密度より60％高い細胞密度が得られる。株K111-40.1(EpoK+)の発酵から得られる樹脂抽出物のHPLCクロマトグラフを示し、(ａ)過剰酸素条件下で培養した結果、EpoK酵素の最大活性、かつ主要最終産物としてエポチロンＡとＢの産生となり；(ｂ)欠乏酸素条件はこの酵素の活性を制限し、結果として主要最終産物としてエポチロンＣとＤの産生となり；(ｃ)欠乏酸素化下のこれら培養の結果は、EpoK酵素の活性が遺伝子操作によって除去されている別の株(K111-40.1)で過剰酸素化下で得られる結果と同様である。過剰酸素条件下、(ａ)10,11-ジデヒドロ-エポチロンＢが(ｂ)Epo506に転換するというビニル性ペイン(Payne)転位を示す。欠乏及び過剰の両酸素化条件下における株K165-79.7の培養を示し、その結果10,11-ジデヒドロ-エポチロンＤ及びEpo506間の同属種比の変化となる。 Sorangium cellulosum株Soce K111-150.17の培養中の酸素圧の調節がエポチロン産物分布を変化させることを示し、(ａ)50％の溶解酸素(DO)、(ｂ)及び(ｃ)低酸素圧下の細胞増殖を示す。３種の溶解酸素条件について力価の時間経過を示す。ｔ＝112時間における50％溶解酸素条件から得られたepoＡ及びepoＢ同属種分布を示すHPLCクロマトグラムを示す。 112時間における０％溶解酸素条件から得られたエポチロンＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤのピークのHPLCクロマトグラムを示す。

Claims

制御された酸素圧条件下で培養された組換え粘液細菌宿主細胞であって、前記宿主細胞は発現制御配列の制御下のポリケチドシンターゼ（PKS）遺伝子を含み、前記ポリケチド産生をもたらす条件下で前記宿主細胞を培養した場合は前記PKS遺伝子の発現はポリケチドの産生となり、前記宿主細胞は、活性な酸素感受性チトクロームP-450モノオキシゲナーゼ仕立て酵素をコードする遺伝子をも含むことを特徴とする粘液細菌宿主細胞。
前記ポリケチドがエポチロンである、請求項１の粘液細菌宿主細胞。
前記宿主細胞がSorangium cellulosum株K111-150.17であり、かつ前記酸素感受性チトクロームP-450モノオキシゲナーゼがEpoKエポキシダーゼである、請求項２の粘液細菌宿主細胞。
宿主細胞内でエポチロンポリケチドシンターゼ（PKS）のマロニル-CoAからメチルマロニル-CoAにアシルトランスフェラーゼ（AT）ドメインエクステンダー単位特異性を変える方法であって、エポチロンの産生をもたらす条件下、増殖培地内で前記宿主細胞を培養する工程と、酸素圧を過剰溶解酸素に調節する工程を含む方法。
粘液細菌宿主細胞内のポリケチド同属種分布産生比を調節する方法であって、ポリケチドの産生をもたらす条件下、増殖培地内で前記宿主細胞を培養する工程と、前記宿主細胞の培養中酸素圧を調節して、前記ポリケチド同属種の産生の種類を変化させる工程を含む方法。
さらに前記増殖培地をセリンで補充する工程を含む、請求項５の方法。
さらに前記増殖培地をアセテートで補充する工程を含む、請求項５の方法。
さらに前記増殖培地をプロピオネートで補充する工程を含む、請求項５の方法。
前記ポリケチドがエポチロンである、請求項５の方法。
前記酸素圧を低酸素圧に調節し、かつ産生される前記ポリケチド同属種がエポチロンＤである、請求項９の方法。
前記宿主細胞が、活性なEpoK⁺モノオキシゲナーゼを有するMyxococcus xanthusである、請求項５の方法。
前記宿主細胞がSorangium cellulosum株Soce90 K111-150.17である、請求項５の方法。
前記宿主細胞がMyxococcus xanthus株K111.32.25である、請求項５の方法。
産生される前記エポチロンＤ同属種が低酸素圧下で得られる、請求項１０の方法。
前記エポチロンＤ同属種が、過剰酸素圧条件下より４倍まで高濃度で存在する、請求項１０の方法。
欠乏酸素培養下、エポチロン同属種産生の比率が、エポチロンＡ及びＢからエポチロンＣ及びＤ同属種分布に変化する、請求項５の方法。
過剰酸素条件下、エポチロンＤ対Ｃの同属種産生比が少なくとも３対１である、請求項５の方法。
前記粘液細菌宿主細胞がEpoK^-である、請求項１７の方法。
前記粘液細菌宿主細胞がMyxococcus xanthus株K111-40.1である、請求項１７の方法。
前記酸素圧が50％溶解酸素未満である、請求項１９の方法。