KR20040076869A - 진단적 및 치료적 용도를 위한 정제된 ｃ형 간염 바이러스외피 단백질 - Google Patents

진단적 및 치료적 용도를 위한 정제된 ｃ형 간염 바이러스외피 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은, E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 외피 단백질의 정제 방법에 있어서, 재조합 발현 단백질의 단리를 위해 형질전환된 숙주 세포를 용해할 때, 디술피드 절단 또는 환원 단계가 디술피드 결합 절단제와 함께 수행되는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 단리된 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이들 조성물의 진단학적 또는 치료학적 적용에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HCV 치료의 임상적 효험성 및/또는 임상적 결과의 예후 및 모니터링을 위한, HCV E1 단백질 및 펩티드의 용도에 관한 것이다.

Description

진단적 및 치료적 용도를 위한 정제된 Ｃ형 간염 바이러스 외피 단백질{PURIFIED HEPATITIS C VIRUS ENVELOPE PROTEINS FOR DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USE}
본 발명에 기재된 방법에 따라 세포 용해물로부터 정제된 E2 단백질은 대략 95% 의 환자 혈청과 반응한다. 이런 반응성은 CHO 세포로부터 분비되는 E2 에 의해 수득되는 반응성 (Spaete 등, 1992) 과 유사하다. 그러나, E2 의 세포내에서 발현되는 형태는 높은 만노오스 탄수화물 모티프(motif) 를 함유하고 있기 때문에 본래 바이러스 외피 단백질과 더욱 밀접하게 유사할 수 있는 반면, CHO 세포로부터 분비되는 E2 단백질은 갈락토오스 및 시알산 당 부분에 의해 더욱 변형된다. E2 의 아미노말단 절반이 배큘로바이러스계에서 발현되는 경우, 환자 군 유래의 혈청 중 단지 약 13 내지 21% 만이 검출될 수 있다 (Inoue 등, 1992). E.coli 로부터 E2 를 발현시킨 후, HCV 혈청의 반응성은 훨씬 낮고, 14 (Yokosuka 등, 1992) 내지 17% (Mita 등, 1992) 범위이다. Kohara 등 (1992) 및 Hsu 등 (1993) 의 결과와 명백하게 반대로, 본 발명의 백시니아(vaccinia)-발현 재조합 E1 단백질을 사용하면 약 75% 의 HCV 혈청 (및 95% 의 만성 환자) 이 항-E1 양성이다. Kohara 등은 백시니아-바이러스 발현 E1 단백질을 사용하였고, 7 내지 23% 로 항-E1 항체를 검출한 반면, Hsu 등은 배큘로바이러스-발현 E1 을 사용하여 단지 14/50(28%) 만을 검출하였다.
이러한 결과는, 인간 환자 혈청과 외피 단백질의 높은 반응성을 이루기 위해서는 우수한 발현계뿐만 아니라 우수한 정제 프로토콜이 또한 요구됨을 나타낸다. 이는, 본 발명의 적절한 발현계 및/또는 단백질의 천연 폴딩(folding)의 보존을 보장하는 정제 프로토콜, 및 오염 단백질의 제거를 보장하고 형태를 보존하여 HCV 외피 단백질의 반응성을 보장하는 본 발명의 정제 프로토콜을 사용하여 수득된다. 진단 스크리닝 검사를 위해 요구되는 정제 HCV 외피 단백질의 양은 해마다 수 그램 범위내이다. 백신의 목적으로, 더욱 높은 양의 외피 단백질이 필요할 수 있다.따라서, 각종 효모 균주로부터 발현되는 경우, 최적의 발현 구축물을 선택하기 위해 백시니아 바이러스 계가 사용될 수 있고, 한정된 상승 규모를 위해서, 높은 만노오스 탄수화물을 함유하는 단일 또는 특이적 올리고머성 외피 단백질의 대규모 발현 및 정제가 사용될 수 있다. 예를 들어, B형 간염의 경우, 포유류 세포 유래의 HBsAG 의 제조는 효모 유래 B형 감염 백신과 비교하여 훨씬 더 고비용이다.
HCV 감염에 있어서 괴사-염증 및 섬유증의 임상적 중요성
HCV 감염 후 간 질환의 천연 병력은 환자마다 상당히 다양하다. 약 20% 의 급성적으로 감염된 사람은 저절로 감염을 소산(消散)시킬 수 있는 반면, 80% 의 감염된 사람은 만성 감염으로 진행한다. 만성 감염은, 간 조직편의 병력학적 분석에 의해 진달될 수 있거나 대용물 마커, 예컨대 혈청에서의 간 효소 ALT 의 존재를 사용하여 진단될 수 있는, 간의 진행성 염증 및/또는 괴사 (=괴사-염증) 을 초래한다. 이 만성 감염은 간경변의 발전 및 최종적으로 간암을 초래할 수 있는 섬유증의 발전 위험을 증가시킨다. 수많은 데이터는, 진행중인 괴사-염증은 섬유증 및 간경변으로의 진전을 유도함을 제안한다. 20% 이하의 HCV 만성 보균자는 약 20년에 걸쳐 간경변으로 발전될 있고, 간경변을 갖는 사람 중 해마다 1 내지 4% 가 간암으로 발전될 수 있는 것으로 추정된다 (Lauer 및 Walker 2001, Shiffman 1999). 간경변 및 간암 모두는 치료 선택사항이 간이식으로만 한정되는 말기 간 질환이다. 결론적으로, HCV 에 대한 치료의 가장 중요한 목적은, 간 괴사-염증의 감소 및/또는 섬유증 진전의 감소에 의해서 말기 간질환의 발전 위험을 감소시키는 것이다.
간손상의 문헌조사 및/또는 진단을 위해서, 각종 스코어링 시스템이 간 조직편의 병력학적 해석을 위해서 개발되었다. 이러한 스코어링 시스템은 병력학 활성 지수 (HAI) 와 같은 단일 스코어로 염증, 괴사 및 섬유증을 조합할 수 있다. 다른 스코어링 시스템은 괴사-염증에 대한 스코어 (= 등급화)와 섬유증/간경변에 대한 스코어 (단계화) 를 구별한다. 이러한 시스템은, Ishak 또는 Metavir 스코어링 시스템에 의해 제안된 시스템을 포함한다. 이러한 스코어링 시스템의 리뷰는 Lefkowitch (1997) 에 공표되었다.
인터페론을 이용한 치료, 리바비린(ribavirin) 과 조합한 인터페론을 이용한 더욱 최근의 치료, 리바비린의 존재 또는 부재하에 PEG화 인터페론을 이용한 가장 최근의 치료는 HCV 의 천연 병력을 변화시키고, 특히 지지된 바이러스 반응을 갖는 환자에게서 간 섬유증의 추가 진전을 중지시키는 것이 보여졌다 (Schvarcz 등 1999, Shiffman 1999, Reichard 등 1999, Poynard 등 2002). 지속된 바이러스학적 반응 및 지속된 생화학적 반응을 갖는 사람에게서 간암생성에 대한 위험의 감소가 또한 보고되었다 (Takimoto 등 2002).
인터페론 기초 치료에 대한 지속된 바이러스학적 반응이 없는 환자를 위해서, 인터페론 치료의 유지는 병력학적 진전을 예방하는데 도움이 될 수 있지만, 이는 단지 환자의 일부에서만이다 (Alric 등 2001).
따라서, 인터페론 기초 치료에 반응하지 않는 사람 또는 각종 이유로 이러한 치료로부터 배제된 사람 (이는 임상에 관련된 사람의 70% 까지 해당할 수 있다, Falck-Ytter 등, 2002) 은, 말기 간 질환을 피하기 위해서, 간 괴사-염증 감소 및/또는 섬유증 진전의 감소를 위한 치료적 선택사항이 없다.
본 발명은 재조합 단백질 발현, 재조합 단백질의 정제, 합성 펩티드, HCV 감염의 진단, HCV 감염에 대한 예방적 처방의 일반적인 분야, 및 만성 간염을 갖는 개체 치료의 임상 효능의 예후/모니터링, 또는 자연 질병의 예후/모니터링에 관한 것이다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 C형 간염 바이러스 외피 단백질의 정제 방법, 진단, 예방 또는 치료에 있어서의 본 발명에 기재된 방법에 따라 정제된 HCV 외피 단백질의 용도, 질환의 모니터링을 위한 검사, 및/또는 질환의 진단, 및/또는 질환의 치료에 있어서의 단일 또는 특이적 올리고머성 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 외피 단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 E1 및/또는 E2 외피 단백질의 에피토프, 및 이에 대한 모노클로날 항체뿐만 아니라, 진단, 예방 또는 치료에 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다.
도 1: 플라스미드 pgpt ATA 18 의 제한효소 맵.
도 2: 플라스미드 pgs ATA 18 의 제한효소 맵.
도 3: 플라스미드 pMS 66 의 제한효소 맵.
도 4: 플라스미드 pv HCV-11A 의 제한효소 맵.
도 5: IFN 치료에 대한 비-반응자에서 항-E1 수준.
도 6: IFN 치료에 대한 반응자에서 항-E1 수준.
도 7: IFN 치료에 대한 완전 반응을 갖는 환자에서 항-E1 수준.
도 8: IFN 치료에 대한 불완전 반응자에서 항-E1 수준.
도 9: IFN 치료에 대한 비-반응자에서 항-E2 수준.
도 10: IFN 치료에 대한 반응자에서 항-E2 수준.
도 11: IFN 치료에 대한 불완전 반응자에서 항-E2 수준.
도 12: IFN 치료에 대한 완전 반응자에서 항-E2 수준.
도 13: 펩티드와 경쟁된 인간 항-E1 반응성.
도 14: 항-E1 모노클로날 항체와 펩티드의 반응성의 경쟁.
도 15: INF 치료에 대한 비-반응자에서 항-E1 (에피토프 1) 수준.
도 16: INF 치료에 대한 반응자에서 항-E1 (에피토프 1) 수준.
도 17: INF 치료에 대한 비-반응자에서 항-E1 (에피토프 2) 수준.
도 18: INF 치료에 대한 반응자에서 항-E1 (에피토프 2) 수준.
도 19: 항-E2 모노클로날 항체와 펩티드의 반응성의 경쟁.
도 20: 펩티드와 경쟁된 인간 항-E2 반응성.
도 21: 본 발명의 핵산 서열. 본 발명에 따른 E1 또는 E2 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열 목록에 나타낸 각각의 E1 또는 E2 단백질의 아미노산 서열로 번역될 수 있다 (서열번호 3 내지 13, 21 내지 31, 35 및 41 내지 49 는 잔기 1 로부터 시닥하여 리딩 프레임에서 반역되고, 서열번호 37-39 는 잔기 2 로부터 시작하여 리딩 프레임에서 번역된다).
도 22: vvHCV39 (타입 1b), vvHCV40 (타입 1b), wwHCV62 (타입 3a) 및 wwHCV63 (타입 5a) 으로 감염된 세포 용해물의 4 가지의 상이한 E1 정제물의 렌틸 렉틴 크로마토그래피 용출물 분획으로부터 수득된 ELISA 결과.
도 23: 도 22 에 나타낸 값에 기초하여 4 가지의 상이한 E1 구축물의 렌틸 렉틴 크로마토그래피로부터 수득된 용출 프로필.
도 24; vvHCV39 (타입 1b), vvHCV40 (타입 1b), wwHCV62 (타입 3a) 및 wwHCV63 (타입 5a) 으로 감염된 세포 용해물의 4 가지의 상이한 E1 정제물의 겔투과 크로마토그래피 후에 수득되는 분획으로부터 수득된 ELISA 결과.
도 25: 타입 1b (1), 타입 3a (2) 및 타입 5a (3) (각각 vvHCV39, wwHCV62 및 wwHCV63 으로 감염된 RK13 세포 유래이고; 렌틸 렉틴 상에서 정제되고, 실시예 5.2 - 5.3 에서와 같이 정제됨) 및 표준 (4) 의 E1 단백질의 정제물로부터 수득된 프로필. '1', '2' 및 '3' 으로 표시한 피크는 순수한 E1 단백질 피크를 나타낸다 (도 24 참조, 분획 26 내지 30 에서 주로 E1 반응성임).
도 26: E1 vvHCV40 (타입 1b) 의 원료 용해물 (레인 1), 도 25 에서 나타낸 분획 10 내지 17 을 나타내는 vvHCV40 의 겔투과물의 집합 1 (레인 2), 도 25 에서 나타낸 분획 18 내지 25 를 나타내는 vvHCV40 의 겔투과물의 집합 2 (레인 3), 및 E1 집합 분획 26 내지 30) (레인 4) 의, 실시예 4 에 기재된 SDS-PAGE 의 은 염색.
도 27: E1 구축물 39 (타입 1b) 및 62 (타입 3a) 의 겔투과물의 분획의 스트렙타비딘-알칼린 포스파타아제 블랏. 상기 단백질은 NEM-바이오틴으로 표지화되었다. 레인 1: 개시 겔투과 구축물 39, 레인 2: 분획 26 구축물 39, 레인 3: 분획 27 구출물 39, 레인 4: 분획 28 구축물 39, 레인 5: 분획 29 구축물 39, 레인 6: 분획 30 구축물 39, 레인 7: 분획 31 구축물 39, 레인 8: 분자량 마커, 레인 9: 개시 겔투과 구축물 62, 레인 10: 분획 26 구축물 62, 레인 11: 분획 27 구출물 62, 레인 12: 분획 28 구축물 62, 레인 13: 분획 29 구축물 62, 레인 14: 분획 30 구축물 62, 레인 15: 분획 31 구축물 62.
도 28: 도 26 과 동일한 조건하에서 수행된 vvHCV-39 (E1s, 타입 1b) 및 vvHCV-62 (E1s, 타입 3a) 의 겔투과 분획의 SDS-PAGE 겔의 은 염색. 레인 1: 개시 겔투과 구축물 39, 레인 2: 분획 26 구축물 39, 레인 3: 분획 27 구출물 39, 레인 4: 분획 28 구축물 39, 레인 5: 분획 29 구축물 39, 레인 6: 분획 30 구축물 39, 레인 7: 분획 31 구축물 39, 레인 8: 분자량 마커, 레인 9: 개시 겔투과 구축물 62, 레인 10: 분획 26 구축물 62, 레인 11: 분획 27 구출물 62, 레인 12: 분획 28 구축물 62, 레인 13: 분획 29 구축물 62, 레인 14: 분획 30 구축물 62, 레인 15: 분획 31 구축물 62.
도 29: 정제 절차의 완전한 개관을 제공한 항-E1 마우스 모노클로날 항체 5E1A10 을 이용한 웨스턴 블랏 분석. 레인 1: 미정제 용해물, 레인 2: 렌틸 크로마토그래피의 통과 유동물, 레인 3: 렌틸 크로마토그래피 후의 Empigen BB 에 의한 세척, 레인 4: 렌틸 크로마토그래피의 용출물, 레인 5: 렌티 용출물의 농축 동안의 통과 유동물, 레인 6: 크기 배제 크로마토그래피 (겔투과) 후 E1 의 집합.
도 30: vvHCV44 에 감염된 RK13 세포 유래의 E2 단백질의 렌틸 렉틴 크로마토그래피의 OD280프로필 (연속선). 점선은 (실시예 6 에서와 같이) ELISA 에 의해 검출된 E2 반응성을 나타낸다.
도 31A: vvHCV44 에 감염된 RK13 세포 유래의 렌틸-렉틴 겔투과 크로마토그래피 E2 단백질 집합의 OD280프로필 (연속선) (상기 E2 집합은 겔투과 컬럼 (비환원 조건) 상에 즉시 적용된다). 점선은 (실시예 6 에서와 같이) ELISA 에 의해 검출된 E2 반응성을 나타낸다.
도 31B: vvHCV44 에 감염된 RK13 세포 유래의 렌틸-렉틴 겔투과 크로마토그래피 E2 단백질 집합의 OD280프로필 (연속선) (상기 E2 집합은 실시예 5.3 (환원 조건) 에 따라 환원되고 블록킹된다). 점선은 (실시예 6 에서와 같이) ELISA 에 의해 검출된 E2 반응성을 나타낸다.
도 32: 도 31B 에서 보여진 환원 조건 하에 결투과한 후, vvHCV44 로부터 발현된 E2 단백질의 Ni2+-IMAC 크로마토그래피 및 ELISA 반응성.
도 33: 도 32 에 나타낸 Ni2+-IMAC 크로마토그래피의 200 mM 이미다졸 용출 단계 (레인 2) 및 30 mM 이미다졸 세척 (레인 1) 에 의해 회수된 0.5 ㎍ 의 정제된 E2 단백질의 SDS-PAGE 의 은 염색.
도 34: 도 33 에 나타낸 200 mM 이미다졸에 의해 회수된 정제된 E2 단백질의 탈염 단계 (이미다졸 제거를 의도함) 의 OD 프로필.
도 35A: LIA 스캔 방법에 의해서 결정된, 치료 동안 및 치료후 6 내지 12 개월에 걸쳐 수행된, NR 및 LTR 에 있어서 상이한 HCV 항원 (코어 1, 코어 2, E2HCVR, NS3) 에 대한 항체 수준. 평균 값은, 개방 사각형을 갖는 곡선에서 의해서 나타낸다.
도 35B: LIA 스캔 방법에 의해서 결정된, 치료 동안 및 치료후 6 내지 12 개월에 걸쳐 수행된, NR 및 LTR 에 있어서 상이한 HCV 항원 (NS4, NS5, E1 및 E2) 에 대한 항체 수준. 평균 값은, 개방 사각형을 갖는 곡선에서 의해서 나타낸다.
도 36: LTR 및 NR 군에서 평균 E1 항체 (E1Ab) 및 E2 항체 (E2Ab) 수준.
도 37: 타입 1b 및 타입 3a 에 대한 비-반응자 (NR) 및 장기 반응성 (LTR) 에 있어서의 평균 E1 항체 (E1Ab) 수준.
도 38: 항-E2 모노클로날 항체의 상대적 맵 위치.
도 39: HCV E1 외피 단백질의 부분적 디글리코실화. vvHCV10A 감염 RK13 세포의 용해물은 제조사의 지침에 따라 여러 농도의 글리코시다아제와 함께 배양되었다. 오른쪽 패널: 글리코펩티다아제 F (PNGase F). 왼쪽 패널: 엔도글리코시다아제 H (Endo H).
도 40: HCV E2 외피 단백질의 부분적 디글리코실화. vvHCV64 감염 (E2) 및 vvHCV41 감염 (E2s) RK13 세포의 용해물은 제조사의 지침에 따라 여러 농도의 글리코펩티다아제 F (PNGase F) 와 함께 배양되었다.
도 41: HCV E1 당단백질의 실험관내 돌연변이형성. 돌연변이된 서열의 맵 및 새로운 제현효소 부위의 생성.
도 42A: HCV E1 당단백질의 실험관내 돌연변이형성 (파트 1). PCR 증폭의제 1 단계.
도 42B: HCV E1 당단백질의 실험관내 돌연변이형성 (파트 2). 중첩 확장 및 네스티드 PCR.
도 43: HCV E1 당단백질의 실험관내 돌연변이 형성. 증폭의 제 1 단계 동안에 합성된 PCR 돌연변이 분획 (GLY-# 및 OVR-#) 의 맵.
도 44A: HeLa (왼쪽) 및 RK13 (오른쪽) 세포에서 발현된 E1 당단백질 돌연변이체의 웨스턴 블랏에 의한 분석. 레인 1: 야성형 타입 VV (백시니아 바이러스), 레인 2: 본래 E1 단백질 (vvHCV-10A), 레인 3: E1 돌연변이체 Gly-1 (vvHCV-81), 레인 4: E1 돌연변이체 Gly-2 (vvHCV-82), 레인 5: E1 돌연변이체 Gly-3 (vvHCV-83), 레인 6: E1 돌연변이체 Gly-4 (vvHCV-84), 레인 7: E1 돌연변이체 Gly-5 (vvHCV-85), 레인 8: E1 돌연변이체 Gly-6 (vvHCV-86).
도 44B: PCR 증폭/제한효소에 의한 E1 글리코실화 돌연변이체 백시니아 바이러스의 분석. 레인 1: E1 (vvHCV-10A)BspE I, 레인 2: E1.GLY-1 (vvHCV-81)BspE I, 레인 4: E1 (vvHCV-10A)Sac I, 레인 5: E1.GLY-2 (vvHCV-82)Sac I, 레인 7: E1 (vvHCV-10A)Sac I, 레인 8: E1.GLY-3 (vvHCV-83)Sac I, 레인 10: E1 (vvHCV-10A)Stu I, 레인 11: E1.GLY-4 (vvHCV-84)Stu I, 레인 13: E1 (vvHCV-10A)Sma I, 레인 14: E1.GLY-5 (vvHCV-85)Sma I, 레인 16: E1 (vvHCV-10A)Stu I, 레인 17: E1.GLY-6 (vvHCV-86)Stu I, 레인 3 - 6 - 9 - 12 - 15: 저분자량 마커, pBluescript SK+,Msp I.
도 45: S. 세레비시아에에서 발현된 재조합 E2 의 SDS 폴리아크릴아미드 겔전기영동. 접종물을 루신 선별 배지에서 72 시간 동안 성장시키고, 완전 배지 중에서 1/15 로 희석시켰다. 28℃ 에서 10 일간 배양 후, 배지 샘플을 채취하였다. speedvac 에 의해 농축된 200 ㎕ 의 배양 상청액의 등가물을 겔에 로딩하였다. 두 개의 독립적인 형질전환체가 분석되었다.
도 46: 글리코실화 결핍 S. 세레비시아에 돌연변이체에서 발현된 재조합 E2 의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동. 접종물을 루신 선별 배지에서 72 시간 동안 성장시키고, 완전 배지 중에서 1/15 로 희석시켰다. 28℃ 에서 10 일간 배양 후, 배지 샘플을 채취하였다. 이온교환 크로마토그래피에 의해 농축된 350 ㎕ 의 배양 상청액의 등가물을 겔에 로딩하였다.
도 47: 침팬지의 프로필 및 면역화 스케쥴.
도 48: 3 회 면역화 후의 세포 반응.
도 49: 반복된 E1 면역화시 세포 반응의 전개.
도 50: NS3 면역화시의 세포 반응.
도 51: 28 주 경과한 자극 지수. 자극 지수 (SI; 세포 면역 반응) 는, 면역화 전 (0 주), 3번째 변역화 후 2 주 (8 주), 부스터 면역화 전 (26 주) 및 부스터 면역 후 2 주 (28 주) 의 개체로부터 채취된 PBMC (105세포) 를, 3 ㎍ 의 재조합 E1s 또는 2 ㎍ 의 파상풍(tetanos) 독소의 존재 또는 부재하에 배양하고, 배양 5 일 후 18 시간의 펄스 동안 상기 세포에 혼입된 적정 티미딘의 양을 결정하는 것에 의해 수득되었다. 자극 지수는, 외피 항원과 함께 배양된 세포 중에 혼입된 티미딘 대 항원과 함께 배양된 것의 비율이다. 0 주 및 8 주의 샘플은 1차 검사 (A) 에서 결정된 반면, 26 주 및 28 주의 샘플은 2차 검사 (B) 에서 수득되었고, 이때 0 주의 샘플은 다시 분석되었다. 결과는 모든 20 명 (A, 실험) 또는 19 명 (B, 실험) 지원자의 기하 평균 자극 지수로서 표현하였다.
도 52: PBMC 의 시토카인 생성. 부스터 면역화 전 (26 주) 및 부스터 면역 후 2 주 (28 주) 의 개체로부터 채취된 PBMC (105세포) 를, 3 ㎍ 의 재조합 E1s (E1) 또는 2 ㎍ 의 파상풍(tetanos) 독소의 존재하에 또는 항원 없이 (B1) 배양하였다. 시토카인을 24 시간 후 (인터루킨-5) 또는 120 시간 후 (인터페론-감마) 에 채취된 상청액에서 ELISA 에 의해 측정하였다. 자극 지수는, 외피 항원과 함께 배양된 세포의 상청액 중에서 측정된 시토카인 대 항원 없이 배양된 것의 비율이다. 결과를 모든 19 명의 지원자에서 분비된 pg 시토카인/㎖ 의 기하 평균으로서 표현하였다. 검출 한계 이하의 시토카인 양을 갖는 샘플은 검출 한계의 값을 지정하였다. 유사하게, 선형 범위의 검사로부터 극도로 높은 농도의 시토카인을 갖는 샘플은 검사의 선형 범위 한계의 값을 지정하였다.
도 53: 티미딘 혼입 결과. 자극 지수 (세포 면역 반응) 는, 펩티드의 존재 또는 부재하에 PBMC (3 ×105세포) 를 배양하고, 5-6 일간 배양 후 펄스 동안 상기 세포 중에 혼입된 적정 티미딘의 양을 결정하는 것에 의해 수득되었다. 자극 지수는, 펩티드와 함께 배양된 세포에 혼입된 티미딘 대 펩티드 없이 배양된 것의 비율이다. 결과는 백신화된 사람 (상부 패널) 또는 백신화되지 않은 사람 또는 대조군(하부 패널) 에 대한 개체 값으로 표현하였다.
도 54: 개체 환자 (각각 점으로 나타냄) 에 있어서, X-축 상에 ATL-수준의 % 변화 (기준선으로부터 절대적 변화), Y-축 상에 혈청 항-E1 항체 수준의 변화 (mU/㎖), 및 Z-축 상에 Ishak 섬유증 스코어의 변화를 나타내는 3차원 그래프.
도 55: 개체 환자 (각각 점으로 나타냄) 에 있어서, X-축 상에 ATL-수준의 % 변화 (기준선으로부터 절대적 변화), Y-축 상에 혈청 항-E1 항체 수준의 변화 (mU/㎖), 및 Z-축 상에 Metavir 섬유증 스코어의 변화를 나타내는 3차원 그래프.
도 56: 각각의 개체 환자 (점 또는 "★" 로 나타냄) 에 있어서, Ishak 섬유증 스코어 (X-축) 및 ALT 값 (Y-축) 을 나타낸다. 패널 A (상부) 에서는, 기준선 (백신화 전) 상태를 나타낸 반면, 패널 B (하부) 는 간 조직편의 채취 시점에서의 상태를 나타낸다. 혈청 항-E1 항체 수준의 가장 높은 증가를 갖는 7 명의 환자는 "★" 로 나타낸다.
도 57: Ishak 섬유증 스코어 (Y-축)에 대한 각각의 개체 환자 (점 또는 "★" 로 나타냄) 의 연령 (X-축)이 영향을 나타낸다. 패널 A (상부) 에서는, 기준선 (백신화 전) 상태를 나타낸 반면, 패널 B (하부) 는 간 조직편의 채취 시점에서의 상태를 나타낸다. 혈청 항-E1 항체 수준의 가장 높은 증가를 갖는 7 명의 환자는 "★" 로 나타낸다.
표 1: 실시예 1 에 나타낸 E1 단백질의 상이한 형태를 구축하기 위하여, 증폭용으로 사용되는 개별적인 클론 및 프라이머의 특성.
표 2: 항-E1 시험의 개요.
표 3: 경쟁 연구를 위한 합성 펩티드.
표 4: 시간 경과에 따른 외피 항체 수준의 변화.
표 5: LTR 및 NR 사이의 차이.
표 6: 뮤린 E2 모노클로날 항체 사이의 경쟁 실험.
표 7: E1 글리코실화 돌연변이체의 구축을 위한 프라이머.
표 8: ELISA 에 의한 E1 글리코실화 돌연변이체의 분석.
표 9: 아쥬반트화 E1 Balb/c 마우스의 프로필.
표 10: 체액성 반응: 상이한 E1-항체 수준을 위해 요구되는 면역화 횟수.
표 11: 침팬지 항체 역가.
표 12: 인간 항체 역가.
표 13: 인간 항체 역가 (8-28 주)
표 14: 4번째 면역화 후 4 주째 및 5번째 면역화 후 2주째의 개체로부터 채취되고 3 ㎍ 의 E1s 의 존재 또는 부재하에 배양된 PBMC 의 자극 지수 (SI). 3 초과의 자극 지수는 양성 신호로서 고려한다.
표 15: 말초문정맥(periportal) 간염, 컨플루언트 괴사, 병소 염증, 문정맥 염증 및 전체 총 염증 등급화를 위한, 괴사-염증 강도의 Ishak 등급화. 스코어는 기준선으로부터의 변화 (편균 및 95% 신뢰구간), 및 평균 기준선-값 대 말단-값의 변화로서 나타내어진다.
표 16: 소정의 기준선 Metavir 스코어 (상부 열에서 나타냄; 기준선 0 내지 4) 대 치료제 E1s 백신화의 2차 과정의 말기에서의 Metavir 스코어 (왼쪽 열에 나타냄; EOT 0 내지 4)의 변화의 빈도 (환자수로 나타냄) 의 개관. 예를 들어, "*" 로 표시된 "5" (즉, "5*") 는, 5 명의 환자가 1 의 기준선 Metavir 스코어 및 2차 과정 치료의 말기에서 0 의 Metavir 스코어 (EOT = 치료 말기) 를 가짐을 의미한다.
표 17: 치료제 E1s 백신화에 의해 유도된 혈청 항-E1 항체 수준 및 전체 Ishak 스코어의 변화 사이의 상호관련성. 표에 개요된 가능한 기준에 해당하는 환자수를 나타낸다.
본 발명의 목적
본 발명의 목적은 재조합 발현 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질의 새로운 정제 방법을 제공하는 것이고, 이때 상기 재조합 단백질은 응집체 대신에 오염원이 없는 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 단백질로서 진단 및 백신을 위해 직접적으로 사용가능하다.
본 발명의 다른 목적은, HCV 의 E1 및/또는 E2 도메인 유래의 형태적 에피토프를 포함하는 정제된 (단일 또는 특이적 올리고머성) 재조합 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 당단백질을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은, E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질의 재조합 발현을 위한 신규한 재조합 벡터 구출물뿐만 아니라, 상기 벡터 구축물로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 재조합 HCV E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질의 제조 및 정제 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명의 재조합 HCV E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질의 진단학적 및 면역학적 용도를 제공하는 것이고, 또한 임의의 본 발명의 HCV E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질을 포함하는 진단학적 용도를 위한 키트, 백신 또는 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, HCV 감염으로 고생하는 환자의 치료 (예를 들어, 인터페론을 사용) 를 위한 반응의 모니터링/예후를 위한, E1, E2 및/또는 E1/E2 단백질의 신규한 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은, HCV 스크리닝 및 확증적(conformatory) 항체 시험에 있어서의 본 발명의 E1, E2 및/또는 E1/E2 단백질의 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은, HCV 감염의 진단 및 항체 상승을 위해 사용될 수 있는 E1 및/또는 E2 펩티드를 제공하는 것이다. 상기 펩티드는 또한 인간 모노클로날 항체를 단리하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은, 펩티드내에 포함된 E1 및/또는 E2 에피토프 또는 재조합 단백질내에 포함된 형태적 에피트포와 특이적으로 반응하는, 모노클로날 항체, 더욱 특히 인간 모노클로날 항체 또는 인간화된 마우스 모노클로날 항체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은, HCV 항원 검출 또는 만성 HCV 감염의 치료를 위한 항-E1 또는 항-E2 모노클로날 항체의 가능한 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은, HCV 감염으로 고생하는 환자의 치료 (예를 들어, 인터페론을 사용) 에 대한 반응의 모니터링/예후 또는 질환 결과의 모노터링/예후를 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 모든 목적은 하기에 기재된 구현예에 의해 충족되는 것으로 여겨진다.
정의
하기의 정의는 본 발명에서 사용되는 여러 용어 및 표현을 예시하기 위해 제공된다.
용어 'C형 감염 외피 단백질' 은 E1 또는 E2 영역의 하나 이상의 HCV 에피토프를 정의하는 아미노산 서열 (및/또는 아미노산 유사체) 을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 유사체 (예를 들어, 미모토프(mimotope) 에 관한 것이다. 이 단어의 폭넓은 의미에서 상기 단일 외피 단백질은 재조합 발현 외피 단백질의 모노머성 또는 단일-올리고머성 모두일 수 있다. 전형적으로, 에피토프를 정의하는 서열은, (동일한, 또는 에피토프를 파괴하지 않는 본래 아미노산 잔기의 유사체로의 치환을 통한) HCV 의 E1 또는 E2 영역의 아미노산 서열에 해당한다. 일반적으로, 에피토프-정의 서열은 3 이상의 아미노산 길이, 더욱 전형적으로는 5 이상의 아미노산 길이, 더욱 전형적으로는 8 이상의 아미노산 길이, 더욱 더 전형적으로는 10 이상의 아미노산 길이를 가질 것이다. 형태적 에피토프에 관하여, 이들 에피토프는 항원의 3차원적 형상 (예를 들어, 폴딩)에 의해서 형성되는 것으로 여겨지기 때문에, 에피토프-정의 서열의 길이에 폭넓은 변형이 수행될 수 있다. 따라서, 에피토프를 정의하는 아미노산은 상대적으로 적은 수일 수 있지만, 폴딩을 통한 정확한 에피토프 형성을 초래하는 분자의 길이를 따라 폭넓게 분산될 수 있다. 에피토프를 정의하는 잔기 사이의 항원 부분은 에피토프의 형태적 구조에 중요하지 않을 수 있다. 예를 들어, 이들 삽입 서열의 결실 또는 치환은 에피토프에 영향을 미치지 않을 수 있고, 에피토프 형태에 중요한 제공된 서열 (예를 들어, 디술피드 결합에 포함된 시스테인, 글리코실화 부위 등) 은 유지된다. 형태적 에피토프는 또한 단일올리고머 또는 이종올리고머의 서브유닛의 2 이상의 필수 영역에 의해서 또한 형성될 수 있다.
본 발명의 HCV 항원은 HCV 의 E1 및/또는 E2 (외피) 도메인으로부터의 형태적 에피토프를 포함한다. 바이러스 외피 단백질에 해당하는 것으로 여겨지는 E1 도메인은, 현재 HCV 폴리프로테인의 아미노산 192-383 에 걸쳐 있는 것으로 추정된다 (Hijikata 등, 1991). 포유동물계에서의 발현시 (글리코실화됨), 이는 SDS-PAGE 에 의해 결정된 35 kDa 의 대략적 분자량을 갖는 것으로 여겨진다. NS1 으로 종래에 불려진 E2 단백질은, HCV 폴리프로테인의 아미노산 384-809 또는 384-746 에 걸쳐있으며 (Grakoui 등, 1993), 또한 외피 단백질인 것으로 여겨진다. 백시니아 계에서 발현시 (글리코실화됨), 약 72 kDa 의 명백한 겔 분자량을 갖는 것으로 여겨진다. 이러한 단백질 말단점은 대체로 정확하게 이해된다 (예를 들어, E2 의 카르복시 말단은 730-820 아미노산 영역내 어딘가에 놓여 있을 수 있고, 예를 들어 아미노산 730, 735, 740. 742, 744, 745, 바람직하게는 746, 747, 748, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 809, 810, 820 에서 종결될 수 있다). E2 단백질은 또한 E1, P7 (aa 747-809), NS2 (aa 810-1026), NS4A (aa 1658-1711) 또는 NS4B (aa 1712-1972) 와 함께 발현될 수 있다. 이들 다른 HCV 단백질과 함께 발현되는 것은 정확한 단백질 폴딩을 수득하기 위해 중요하다.
또한, 본 발명의 실시예 부분에서 사용된 단리물은 본 발명의 범위의 한정을 의도하지는 않고, HCV 의 타입 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 임의의 다른 신규한 유전자형 유래의 임의의 HCV 단리물이 본 발명의 실시를 위한 E1 및/또는 E2 서열의 적절한 공급원인 것으로 이해된다.
본 발명에서 사용되는 E1 및 E2 항원은 전장 바이러스 단백질, 이의 실질적인 전장 형태 또는 이의 기능적 절편 (예를 들어, 에피토프의 형성 또는 유지에 필수적인 서열이 결여되지 않은 절편) 일 수 있다. 또한, 본 발명의 HCV 항원은 또한 목적하는 형태적 에피토프의 형성을 블록킹 또는 방해하지 않는 다른 서열을 포함할 수 있다. 형태적 에피토프의 존재 또는 부재는, 항체 (형태적 에피토프에 대한 폴리클로날 혈청 또는 모노클로날) 를 이용하여 목적하는 항원을 스크리닝하고 그의 반응성과 단지 선형 에피토프 (존재하는 경우) 를 유지하는 항원의 변성된 형태의 반응성을 비교하는 것을 통해 용이하게 결정될 수 있다. 폴리클로날 항체를 사용하는 이러한 스크리닝에 있어서, 우선 폴리클로날 혈청과 변성된 항원을 흡착시키고 목적하는 항원에 대한 항체가 유지되는지를 확인하는 것이 이로울 수 있다.
본 발명의 HCV 항원은 목적하는 에피토프를 제공하는 임의의 재조합 방법에 의해서 제조될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 또는 곤충 세포에서 재조합 세포내 발현은, 글리코실화 E1 및/또는 E2 항원을 천연 HCV 항원에 대한 경우인 본래 형태로 제공하기 위한 바람직한 방법이다. 효모 세포 및 돌연변이 효모 균주 (예컨대, mnn 9 돌연변이체 (Kniskern 등, 1994) 또는 바나듐산염 내성 선별에 의해서 유도된 글리코실화 돌연변이체 (Ballou 등, 1991) 는, 분비된 고-만노오스-유형 당의 제조에 이상적으로 적합한 반면; 포유동물 세포로부터 분비된 단백질은 특정 진단 또는 백신 적용에 바람직하지 않을 수 있는 갈락토오스 또는 시알산을 포함하는 변형을 함유할 수 있다. 그러나, 단백질에 대해 공지된 바와 같이, 다른 재조합 숙주 (예컨대, E.Coli) 에서 단백질을 발현시키고 회수 후 단백질을 본래화시키는 (renature) 것이, 특정 적용을 위해서 또한 가능하고 충분할 수 있다.
용어 '융합 폴리펩티드' 는 HCV 항원(들) 이 천연에 존재하지 않는 아미노산의 단일 연속 사슬의 일부인 폴리펩티드를 의미한다. HCV 항원은 펩티드 결합에 의해서 서로 직접적으로 연결되거나 아미노산 삽입에 의해서 분리될 수 있다. 융합 폴리펩티드는 또한 HCV 외생적 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
용어 '고체상' 은, 개별적인 HCV 항원 또는 HCV 항원으로 구성된 융합 폴리펩티드가 공유적으로 또는 비공유적으로 (예컨대, 소수성 흡착) 결합된 고체 바디를 의도한다.
용어 '생물학적 샘플' 은, 개체에 의해 생성된 항체, 더욱 특히 HCV 에 대한 항체를 통상적으로 포함하는 포유동물 개체 (예컨대, 유인원, 인간) 의 유동액 또는 조직을 의도한다. 유동액 또는 조직은 또한 HCV 항원을 함유할 수 있다. 상기 성분은 당업계에 공지되어 있고, 한정되지는 않지만, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 척수액, 림프액, 호흡 분비액, 장 또는 비뇨생식기관, 눈물, 타액, 젖, 백혈구세포 및 골수를 포함한다. 체성분은 생물학적 액체를 포함한다. 용어 '생물학적 액체' 는 유기체로부터 수득되는 유동액에 관한 것이다. 일부 생물학적 유동액은 다른 사물의 공급원, 예컨대 응고 인자 (예컨대, 인자 VIII; C), 혈청 알부민, 성장 인자 등의 공급원으로서 사용된다. 이러한 경우, 생물학적 유동액의 공급원은 HCV 와 같은 바이러스에 의한 오염원이 없는 것이 중요하다.
용어 '면역학적으로 반응성인' 은, 당해 항원이 HCV 감염된 개체로부터 체성분내에 존재하는 항-HCV 항체와 특이적으로 반응함을 의미한다.
용어 '면역 복합체' 는, 항체가 항원상의 에피토프와 결합할 때에 형성되는조합을 의도한다.
본원에서 사용된 'E1' 은 HCV 폴리프로테인의 처음 400 개 아미노산내에서 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이고, 종종 E, ENV 또는 S 단백질로 언급된다. 이의 천연 형태에서, 이는 막과의 강한 회합으로 발견되는 35 kDa 당단백질이다. 가장 천연적인 HCV 계통에서, E1 단백질은 C (코어) 단백질 후의 바이러스 폴리프로테인에서 코딩된다. E1 단백질은 전장 폴리프로테인의 대략 아미노산 (aa) 192 에서 약 383 으로 확장된다.
본원에서 사용된 용어 'E1' 은 또한 천연 E1 과 면역학적으로 교차반응성인 유사체 및 절단된 형태를 포함하고, 유전자형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 임의의 다른 새로이 동정된 HCV 형태 또는 아형의 E1 단백질을 포함한다.
본원에서 사용된 'E2' 는 HCV 폴리프로테인의 처음 900 개 아미노산내에서 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이고, 종종 NS1 단백질로 언급된다. 이의 천연 형태에서, 이는 막과의 강한 회합으로 발견되는 72 kDa 당단백질이다. 가장 천연적인 HCV 계통에서, E2 단백질은 E1 단백질 후의 바이러스 폴리프로테인에서 코딩된다. E2 단백질은 전장 폴리프로테인의 대략 아미노산 위치 384 에서 아미노산 위치 746 로 확장되고, E2 의 또다른 형태는 아미노산 위치 809 로 확장된다. 본원에서 사용된 용어 'E2' 는 또한 천연 E2 와 면역학적으로 교차반응성인 유사체 및 절단된 형태를 포함한다. 예를 들어, 코돈 383 및 384 사이의 복수 코돈의 삽입뿐만 아니라, 아미노산 384-387 의 결실은 Kato 등 (1992) 에 의해서 보고되었다.
본원에서 사용된 'E1/E2' 는 하나 이상의 E1 성분 및 하나 이상의 E2 성분을 포함하는 외피 단백질의 올리고머성 형태에 관한 것이다.
용어 '특이적 올리고머성' E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 외피 단백질은 응집체가 아닌 재조합 발현 E1 및/또는 E2 외피 단백질의 모든 가능한 올리고머성 형태에 관한 것이다. E1 및/또는 E2 특이적 올리고머성 외피 단백질은 또한 단일-올리고머성 E1 또는 E2 외피 단백질로서 언급한다 (하기 참조).
용어 '단일 또는 특이적 올리고머성' E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 외피 단백질은 단일 모노머성 E1 또는 E2 단백질 (이 단어의 엄격한 의미에서 단일), 및 특이적 올리고머성 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 재조합 발현 단백질에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이러한 단일 또는 특이적 올리고머성 외피 단백질은 하기 식 (E1)x(E2)y[식중, x 는 0 내지 100 사이의 수일 수 있고, y 는 0 내지 100 사이의 수일 수 있으며, 단 x 및 y 모두가 0 은 아니다] 로 더 정의될 수 있다. x=1 및 y=0 인 경우, 상기 외피 단백질은 모노머성 E1 을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 '단일-올리고머' 는, 하나 초과의 E1 또는 E2 모노머를 함유하는 E1 및/또는 E2 의 복합체에 관한 것이고, 예컨대 E1/E2 이량체, E1/E1/E1 삼량체 또는 E1/E1/E1/E1 사량체 및 E2/E2 이량체, E2/E2/E2 삼량체 또는 E2/E2/E2/E2 사량체, E1 오량체 및 육량체, E2 오량체 및 육량체 또는 E1 또는 E2 의 임의의 고차 단일-올리고머가 본 발명의 범위내에서 모두 '단일-올리고머'이다. 올리고머는, 예를 들어 WO94/25601 하에 공개된 국제출원 및 유럽출원 제94870166.9 호 (둘 다 본 출원인에 의한 것임) 에 기재된, C형 바이러스의 상이한 형태 또는 아형의 E1 또는 E2 의 하나, 둘 또는 여러 다른 단량체를 포함할 수 있다. 이러한 혼합 올리고머는 본 발명의 범위내에서 여전히 단일-올리고머이고, HCV 의 더욱 통상적인 진단, 예방 또는 치료를 가능하게 할 수 있다.
본원에서 단백질에 대해 사용되는 용어 '정제된' 은, 목적하는 단백질을 조성물 중 총 단백질 성분의 35% 이상으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 목적하는 단백질은, 바람직하게는 총 단백질 성분 중 40% 이상, 더욱 바람직하게는 약 50% 이상, 더욱 바람직하게는 약 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 70% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 80% 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상이다. 상기 조성물은, 본원에서 사용된 백분율 순도의 결정에 영향을 미치지 않는다면, 탄수화물, 염, 지질, 용매 등과 같은 다른 화합물을 함유할 수 있다. '단리된' HCV 단백질은 35% 이상의 순도를 갖는 HCV 단백질 조성물을 의도한다.
용어 '본질적으로 정제된 단백질' 은 실험관내 진단 방법을 위해, 그리고 치료제 화합물로서 사용될 수 있도록 정제된 단백질을 의미한다. 이러한 단백질은 실질적으로 세포 단백질, 벡터 유래 단백질 또는 다른 HCV 바이러스 성분이 없다. 통상적으로, 이러한 단백질은 균질하게 정제된다 (80% 이상의 순도, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 97%, 더욱 바람직하게는 98%, 더욱 바람직하게는 99%, 더욱 더 바람직하게는 99.5%, 가장 바람직하게는 오염 단백질이 SDS-PAGE 및 은 염색과 같은 통상적인 방법에 의해서 검출가능하지 않아야만한다).
본 발명의 문맥내에서 사용되는 용어 '재조합 발현' 은, 본 발명의 단백질이 하기에서 검토된 원핵생물, 또는 저차 또는 고차 진핵생물에서 재조합 발현 방법에 의해서 제조되는 점에 관한 것이다.
용어 '저차 진핵생물' 은 효모, 곰팡이 등과 같은 숙주 세포에 관한 것이다. 저차 진핵생물은 일반적으로 단일세포이다 (그러나, 그럴 필요는 없음). 바람직한 저차 진핵생물은, 효소, 특히 사카로마이세스, 시키조사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 피치아 (예컨대, 피치아 파스토리스), 한센눌라 (예컨대, 한센눌라 폴리모르파), 야로위아, 스콰니오마이세스, 스키조사카로마이세스, 자이고사카로마이세스 등 내의 종이다. 사카로마이세스 세레비시아에, S. 칼스베르젠시스 및 K. 락티스가 가장 통상적으로 사용되는 효모 숙주이고, 통상적인 곰팡이 숙주이다.
용어 '원핵생물' 은 E.Coli, 락토바실러스, 락토코쿠스, 살모넬라, 스트렙토코쿠스, 바실러스 서브틸리스 또는 스트렙토마이세스와 같은 숙주에 관한 것이다. 또한, 이들 숙주는 본 발명의 범위내에서 고려된다.
용어 '고차 진핵생물' 은 고차 동물, 예컨대 포유류, 파충류, 곤충 등으로부터 유래된 숙주세포에 관한 것이다. 현재 바람직한 고차 진핵생물 숙주 세포는, 차이나 햄스터 (예컨대, CHO), 원숭이 (예컨대, COS 및 베로 세포), 베이비 햄스터 신장 (BHK), 돼지 신장 (PK15), 토끼 신장 13 세포 (PK13), 인간 조골육종 세포주 143 B, 인간 세포주 HeLa 및 인간 간세포주, 예컨대 Hep G2, 및 곤충 세포주 (예컨대, 스포돕테라 프루지페르다) 로부터 유래된다. 숙주 세포는 현탁액 또는 플라스크 배양액, 조직 배양액, 기관 배양액 등으로 제공될 수 있다. 다르게는, 숙주 세포는 또한 트랜스지닉 동물일 수 있다.
용어 '폴리펩티드' 는 아미노산의 중합체에 관한 것이고, 산물의 특정한 길이가 언급되지는 않고; 따라서, 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 폴리펩티드의 정의내에 포함된다. 이 용어는 또한 폴리펩티드의 후-발현 변형, 예컨대 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등이 언급되거나 배제되지 않는다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체 (예컨대 비천연 아미노산, PNA 등을 포함) 를 함유하는 폴리펩티드, 치환된 연결을 갖는 폴리펩티드, 및 당업계에 공지된 기타 변형체 (천연 발생 및 비천연 발생 모두) 가 상기 정의 내에 포함된다.
용어 '재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산' 은, 이의 기원 또는 조작법에 따라 (1) 자연적으로 관련되어 있는 폴리펩티드의 전부 또는 일부와 관련되어 있지 않거나 (2) 자연적으로 연결된 것과 다른 폴리뉴클레오타이드에 연결되거나 (3) 자연에서 존재하지 않는, 게놈, cDNA, 반합성 또는 합성 기원의 폴리펩티드 또는 핵산을 의도한다.
용어 '재조합 숙주 세포', '숙주 세포', '세포', '세포주', '세포 배양물' 및 단일세포 존재물로서 배양된 기타 미생물 또는 고차 진핵동물 세포주를 지칭하는 용어는, 재조합 벡터 또는 기타 수송 폴리뉴클레오타이드에 대한 수용자로서 사용될 수 있거나 사용되어 왔던 세포에 관한 것이고, 형질감염된 본래 세포의 자손을 포함한다. 단일 모체 세포의 자손은, 자연, 우발 또는 의도적 돌연변이로 인해, 본래의 모체와 형태 또는 게놈 또는 총 DNA 컴플리먼트에 있어서 반드시 완전히 동일하지 않을 수도 있다.
용어 '레플리콘(replicon)' 은, 세포 내에서 폴리뉴클레오타이드 복제의 자체적 유닛으로서 행동하는, 즉 자체 제어하에 복제될 수 있는 임의의 유전적 요소, 예컨대 플라스미드, 크로모좀, 바이러스, 코스미드 등이다.
용어 '벡터' 는 목적하는 오픈 리딩 프레임의 복제 및/또는 발현을 제공하는 서열을 더 포함하는 레플리콘이다.
용어 '조절 서열' 은 라이게이션된 코딩 서열의 발현을 수행하기 위해 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다. 이러한 조절 서열의 본질은 숙주 유기체에 따라 상이하다: 원핵생물에서는, 이러한 조절 서열이 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 부위 및 종결자를 포함한다; 진핵생물에서는, 이러한 조절 서열은 프로모터, 종결자를 포함하고, 일부 예에서는, 인핸서 (enhancer) 를 포함한다. 용어 '조절 서열' 은, 최소한, 발현을 위해 존재가 필요한 모든 성분을 포함하는 것으로 의도되고, 또한 존재가 이로운 추가적인 성분, 예를 들어 분비를 조절하는 리더(leader) 서열을 포함할 수 있다.
용어 '프로모터' 는, mRNA 생성이 인접한 구조 유전자에 대한 정상적인 전사 개시 부위에서 개시되도록 하는 방식으로 DNA 주형에 RNA 폴리머라아제가 결합되도록 하는 보존 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열이다.
표현 '작동가능하게 연결된' 은, 상기 기재된 성분이 목적되는 방식으로 기능하도록 하는 관계내에 존재하는 병치(竝置)에 관한 것이다. 코딩 서열에 '작동가능하게 연결된' 조절 서열은, 코딩 서열의 발현이 조절 서열에 적합한 조건 하에서 성취되는 방식으로 라이게이션된다.
'오픈 리딩 프레인' (ORF) 는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 영역이고, 종결 코돈을 포함하지 않고; 이 영역은 코딩 서열 또는 전체 코딩 서열의 부분을 나타낼 수 있다.
'코딩 서열' 은, 적절한 조절 서열의 조절하에 위치될 경우, mRNA 로 전사되고/거나 폴리펩티드로 번역되는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5'-말단의 번역 개시 코돈 및 3'-말단의 번역 종결 코돈에 의해서 결정된다. 코딩 서열은, 한정되지는 않지만, mRNA, DNA (cDNA 포함) 및 재조합 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 '에피토프' 또는 '항원 결정기' 는 면역반응성인 아미노산 서열을 의미한다. 일반적으로, 에피토프는 3 내지 4 이상의 아미노산, 더욱 통상적으로는 5 또는 6 이상의 아미노산 서열로 이루어지고, 종종 에피토프는 약 7 내지 8, 심지어는 약 10 의 아미노산으로 이루어진다. 본원에서 사용된 바와 같이, 지칭된 폴리펩티드의 에피토프는 지칭된 폴리펩티드내의 에피토프로서 동일한 아미노산 서열을 갖는 에피토프 및 이의 면역원성 동등물을 나타낸다. 상기 동등물은 또한, 예를 들어 유전자형 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 4k, 4l, 5a, 5b, 6a, 6b, 6c, 7a, 7b, 7c, 8a, 8b, 9a, 9b, 10a 에서 속하는 균주 또는 현재 공지된 서열의, 또는 임의의 다른 새로이 정의된 HCV (아)형의 균주, 아형(= 유전자형) 또는 유형(군)-특이적 변이체를 포함한다. 에피토프를 구성하는아미노산이 선형 서열의 부분일 필요는 없지만, 임의의 수의 아미노산에 의해 점재될 수 있기 때문에, 형태적 에피토프를 형성할 수 있다는 것이 이해된다.
용어 '면역원성' 은, 아쥬반트의 존재 또는 부재하에, 단독으로 또는 담체와 연결될 경우, 채액성 및/또는 세포성 반응을 유도하는 물질의 능력에 관한 것이다. '중화' 는 감염성 작용제 전염력을 부분적 또는 전체적으로 블록킹하는 면역 반응에 관한 것이다. '백신' 은 HCV 에 대한 보호를 부분적으로 또는 완전하게 유도할 수 있는 면역원성 조성물이다. 백신은 또한 개체의 치료에 유용할 수 있고, 이 경우 치료적 백신이라 불려진다.
용어 '치료제' 는 HCV 감염을 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
용어 '유효량' 은 투여된 개체에서 면역원성 반응을 유도하거나, 다르게는 목적하는 계 (면역검사)에서 검출가능하게 면역반응하기에 충분한 에피토프 함유 폴리펩티드의 양에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 유효량은 상기 정의한 치료를 수행하기에 충분하다. 정확한 양은 필연적으로 적용에 따라 다양할 것이다. 백신 적용을 위해서 또는 폴리클로날 항혈청/항체의 생성을 위해서, 예를 들어 상기 유효량은 종, 개체의 연령 및 일반적인 조건, 치료할 병상의 혹독성, 선택된 특정 폴리펩티드 및 이의 투여 방식 등에 따라 다양할 수 있다. 상기 유효량은, 상대적으로 큰 중요하지 않은 범위내에서 찾아질 것으로 여겨진다. 적절한 유효량은 통상적인 실험만을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. HCV 질환의 예방을 위한 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단열 또는 특이적 올리고머성 외피 단백질의 바람직한 범위는 0.01 내지 100 ㎍/분량, 바람직하게는 0.1 내지 50 ㎍/분량이다. 각종분량이, 충분한 면역 반응 및 뒤이은 HCV 질환에 대한 보호를 성취하기 위해서 개체마다 요구될 수 있다.
발명의 상세한 설명
더욱 구체적으로, 본 발명은 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 외피 단백질의 단리 또는 정제 방법에 있어서, 재조합 발현 단백질의 단리를 위해서 형질전환된 숙주 세포를 용해할 때, 디술피드 결합 절단 또는 환원 단계를 디술피드 결합 절단제와 함께 수행하는 것을 특징으로 하는 방법을 고려한다.
본 발명의 이러한 '단일 또는 특이적 올리고머성' 외피 단백질의 본질은, 단백질을 오염시키지 않는다는 것과 오염원이 연결된 디술피드 결합이 없다는 것이다.
본 발명에 따른 단백질은 저차 또는 고차 진핵생물 세포 또는 원핵생물에서 재조합적으로 발현된다. 본 발명의 재조합 단백질은 바람직하게는 글리코실화되고, 고-만노오스-유형, 하이브리드 또는 복합체 글리코실화를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 상기 단백질은 실시예 부분에서 상세히 검토된 포유동물 세포주로부터, 또는 실시예 부분에서 또한 검토된 돌연변이 효모 균주와 같은 효모에서 발현된다.
본 발명에 따른 단백질은 세포 성분, 예컨대 ER 또는 골지체 내에서 분비되거나 발현될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 본 발명의 단백질은 고-만노오스-유형 글리코실화를 갖고, 포유동물 세포의 ER 또는 골지체에서 유지되거나, 효모 세포에서 유지되거나 그로부터 분비되며, 바람직하게는 mnn9 돌연변이체 (Kniskern 등, 1994)와 같은 효모 돌연변이체로부터 또는 바나듐산염 내성에 의해서 분비되는 돌연변이체 (Ballou 등, 1991) 로부터 분비된다.
HCV 외피 단백질의 발현시, 본 발명자들은, 분자내 또는 분자간 디술피드 브릿지 내에 포함되어 있지 않은 시스테인의 유리 티올기의 일부가 숙주 또는 발현계 (예컨대, 백시니아) 유래 단백질 또는 기타 HCV 외피 단백질 (외피 또는 올리고머성)의 시스테인과 반응하여, 특이적 분자간 브릿지를 형성함을 보여주었다. 이는, 오염 단백질과 함께 HCV 외피 단백질의 '응집체' 의 형성을 초래한다. 또한, WO 92/08734 에서는, '응집체' 가 정제 후 수득됨을 보여주었지만, 단백질 상호작용이 포함된다는 것을 기재하지 않았다. 특허출원 WO 92/08734 에서는, 백시니아 바이러스 계에 의해 발현된 재조합 E1/E2 단백질이 응집체로서 부분적으로 정제되고, 단지 97% 의 순도를 갖는 것으로 확인되어, 정제된 응집체가 진단학적, 예방학적 또는 치료학적 목적에 유용하지 않게 한다.
따라서, 본 발명의 주요 목적은, 오염 단백질로부터 단일 또는 올리고머성 HCV 외피 단백질의 분리, 및 진단학적, 예방학적 및 치료학적 목적을 위한 정제된 단백질 (95% 초과의 순도) 의 사용에 있다. 이런 목적을 위해서, 본 발명자들은, 응집된 단백질 복합체 ('응집체') 가 디술피드 브릿지 및 비공유 단백질-단백질 상호작용에 기초하여 형성된다는 증거를 제공할 수 있었다. 따라서, 본 발명은 특정 조건하에서 디술피드 결합을 선별적으로 절단하기 위한 수단 및 진단학적, 예방학적 및 치료학적 적용을 상당히 방해하는 오염 단백질로부터 절단된 단백질을 분리하기 위한 수단을 제공한다. 유리 티올기는 디술피드 브릿지의 재형성을 방지하기 위해서 (가역적으로 또는 비가역적으로) 블록킹될 수 있고, 기타 외피 단백질을 산화시키거나 그와 올리고머화시키기 위해서 남겨질 수 있다 (단일-올리고머의 정의 참조). 상기 단백질 올리고머는 오염 단백질의 수준이 검출가능하지 않기 때문에, WO 92/08734 및 WO 94/01778 에 기재된 '응집체' 와 본질적으로 다른 것으로 이해된다.
상기 디술피드 결합 절단은 또한 하기에 의해서 성취될 수 있다.
(1) 시스테인 산에 의한 과포름산 산화 (이 경우, 시스테인 잔기는 시스테인산으로 변형된다 (Moore 등, 1963)).
(2) 예를 들어, Cu2+와 같은 적절한 산화제와 함께 술파이트 (SO2- 3) 에 의한 술파이트분해 (R-S-S-R →2-R-SO- 3) (이 경우, 시스테인은 S-술포-시스테인으로 변형된다 (Bailey 및 Cole, 1959).
(3) 디티오트레이톨 (DDT), β-메르캅토-에탄올, 시스테인, 글루타티온 레드, ε-메르캅토-에탄올 또는 티오글리콜산과 같은 메르캅탄에 의한 환원. 상기 반응은 수환경 중에서 수행되고 시스테인이 미변형으로 남기 때문에, 이중 DTT 및 β-메르캅토-에탄올이 통상적으로 사용되고 (Cleland, 1964), 본 발명의 바람직한 방법이다.
(4) 포스핀 (예컨대, Bu3P) 에 의한 환원 (Ruegg 및 Rudinger, 1977).
따라서, 모든 상기 화합물은 본 발명에 따른 디술피드 결합의 절단을 위한 제제 또는 수단으로서 간주된다.
본 발명의 상기 디술피드 결합 절단 (또는 환원) 단계는, 바람직하게는, 부분적인 디술피드 결합 절단 (환원) 단계이다 (부분적인 절단 또는 환원 조건하에서 수행됨).
본 발명에 따른 바람직한 디술피드 절단 또는 환원제는 디티오트레이톨 (DTT) 이다. 부분적인 환원은 상기 환원제의 저농도의 상기 환원제, 즉 예를 들어 약 0.1 내지 약 50 mM, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 20 mM, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 10 mM, 바람직하게는 1 mM 초과, 2 mM 초과 또는 5 mM 초과, 더욱 바람직하게는 약 1.5 mM, 약 2.0 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM 또는 약 7.5 mM 의 농도 범위로 DTT 를 사용함으로써 수득된다.
또한, 상기 디술피드 결합 절단 단계는, 발현 단백질을 해리시킬 수 있는 적절한 세척제 (디술피드 결합을 절단하기 위한 수단의 한 예로서 또는 절단제와 조합하여), 예컨대 데실PEG, EMPIGEN-BB, NP-40, 나트륨 콜레이트, Triton X-100 의 존재하에 수행될 수 있다.
상기 환원 또는 절단 단계 (바람직하게는, 부분 환원 또는 절단 단계) 는, 바람직하게는 세척제의 존재하에 (그와 함께) 수행된다. 본 발명에 따른 바람직한 세척제는 Empgen-BB 이다. 사용되는 세척제의 양은, 바람직하게는 1 내지 10%, 바람직하게는 3% 초과, 더욱 바람직하게는 약 3.5% 의 세척제, 예컨대 Empigen-BB 이다.
디술피드 결합 절단을 수득하기 위한 특히 바람직한 방법은, 상술한 통상적인 디술피드 결합 절단제 및 (또한 상술한) 세척제의 조합을 사용한다. 실시예 부분에서 고려된 바와 같이, 저농도의 DTT (1.5 내지 7.5 mM) 및 약 3.5% 의 Empigen-BB 의 특정한 조합은 재조합 발현 E1 및 E2 단백질의 정제를 위한 환원제 및 세척제의 특히 바람직한 조합인 것으로 증명된다. 겔투과 크로마토그래피 수행시, 상기 부분 환원은, 가능한 이량체성 E1 단백질의 제조 및 면역검사에 사용시 가(假)반응성을 유발하는 오염 단백질로부터 상기 E1 단백질의 분리를 초래하는 것으로 보여진다.
그러나, 조합이 본 발명에서 예시된 바람직한 조합과 동일한 디술피드 브릿지 절단의 목적을 성취할 수 있다면, 당업계에 공지된 임의의 환원제와 당업계에 공지된 임의의 세척제 또는 시스테인을 더욱 접근가능하게 하는 다른 수단의 임의의 다른 조합이 또한 본 발명의 범위내에 존재함이 이해된다.
디술피드 결합의 환원과는 별개로, 본 발명에 따른 디술피드 결합 절단 수단은 또한, 하기 유형의 반응이 발생하도록 하는 당업계에 공지된 임의의 디술피드 브릿지 교환반응 (유기성 또는 단백질성인 경쟁 작용제, 예를 들어 Creighton, 1998 참조) 을 포함할 수 있다.
R1S-SR2 + R3SH →R1S-SR3 + R2SH
* R1, R2: 단백질 응집체의 화합물
* R3SH: 경쟁 작용제 (유기성, 단백질성)
용어 '디술피드 브릿지 교환제' 는 디술피드 결합 개선제 및 디술피드 결합블록킹제를 포함하는 것으로 해석된다.
본 발명은 또한, 예컨대 하기의 목록으로부터 선택된 당업계에 공지된 임의의 SH 기 블록킹 시약 또는 결합 시약의 사용을 더 포함하는, 상기 기재된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 외피 단백질의 정제 또는 단리 방법에 관한 것이다.
- 글루타티온
- 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산) 또는 비스-(3-카르복시-4-니트로페닐)-디술피드 (DTNB 또는 Ellman 시약) (Elmann, 1959)
- N-에틸말레이미드 (NEM; Benesch 등, 1956)
- 단백질에 색상을 제공하는, N-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로페닐) 말레이미드 또는 Tuppy 말레이미드
- P-클로로메르쿠리베조에이트 (Grassetti 등, 1969)
- 4-비닐피리딘 (Friedman 및 Krull, 1969) 는 산 가수분해에 의한 반응 후에 방출될 수 있다.
- 아크릴로니트릴은 산 가수분해 후에 방출될 수 있다 (Weil 및 Seibles, 1961)
- NEM-비오틴 (예컨대, Sigma B1267 로부터 수득됨)
- 2,2'-디티오피리딘 (Grassetti 및 Murray, 1967)
- 4,4'-디티오피리딘 (Grassetti 및 Murray, 1967)
- 6,6'-디티오디니코틴산 (DTDNA; Brown 및 Cunnigham, 1970)
- 2,2'-디티오비스-(5'-니트로피리딘) (DTNP; USP 3597160) 또는 다른 디티오비스 (헤테로사이클 유도체) 화합물 (Grassetti 및 Murray, 1969)
인용된 문헌의 조사는, 술피드릴기에 대한 상이한 시약이 종종 동일한 단백질 또는 효소 분자의 다양한 수의 티올기와 반응함을 보여준다. 티올기의 반응에 있어서 이런 다양성은 상기 기들의 입체 환경, 예컨대 분자의 모양 및 원자의 주변기 및 이들의 전하, 및 시약 분자 또는 이온의 크기, 모양 및 전하에 기인한 것으로 결론내려질 수 있다. 빈번히, 불충분한 농도의 변성제, 예컨대 나트륨 도데실술페이트, 우레아 또는 구아니딘 히드로클로라이드의 존재는 티올기에 대한 모든 시약에 대한 동일한 접근이 가능하다록 하는 단백질 분자의 충분한 비폴딩(unfolding) 을 제공할 것이다. 변성제의 농도를 변화시킴으로써, 비폴딩도를 제어할 수 있고, 이런 방식으로 상이한 정도의 반응성을 갖는 티올기가 발혀질 수 있다. 예전에 보고된 대부분의 작업은 p-클로로메르쿠리벤조에이트, N-에틸말레이미드 및 DTNB 를 사용하여 수행되었지만, 더욱 최근에 발혀진 다른 시약도 동일하게 유용할 수 있는 것 같다. 이들의 다양한 구조로 인해, 실제로는, 티올기의 입체 방해에 있어서의 변화에 상이하게 반응할 수 있는 것 같다.
다르게는, 유리 SH 기가 산화되는 것을 방지하여, E1 및 E2 (외피) 단백질의 재조합 발현 및 정제시 큰 분자간 응집체의 형성을 방지하기 위한 낮은 pH (바람직하게는 pH 6 미만) 과 같은 조건은 또한 본 발명의 범위내이다.
본 발명에 따른 바람직한 SH 기 블록킹제는 N-에틸말레이미드 (NEM) 이다. 상기 SH 기 블록킹제는, 재조합 숙주 세포의 용해 동안에 및 상술한 부분 환원 과정 후에 또는 디술피드 브릿지 절단을 위한 임의의 다른 과정 후에 투여될 수 있다. 상기 SH 기 블록킹제는 또한, 검출가능한 표지 및/또는 상기 재조합 단백질의 고체 기질로의 부동화를 돕는 임의의 기를 제공할 수 있는 임의의 기로 변형될 수 있다 (예컨대 비오틴화 NEM).
시스테인 브릿지를 절단하고 유리 시스테인을 블록킹하기 위한 방법은 또한 Darbre (1987), Means 및 Feeney (1971) 및 Wong (1993) 에 기재되어 있다.
상기 정의된 본 발명에 따른 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질의 정제 방법은, 하기 단계를 포함하는 것을 또한 특징으로 한다.
- 바람직하게는 SH 기 블록킹제, 예컨대 N-에틸말레이미드 (NEM), 및 가능하게는 적당한 세척제, 바람직하게는 Empigen-BB 의 존재하에, E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 발현 숙주 세포를 용해하는 단계;
- 항-E1 및/또는 항-E2 특이적 모노클로날 항체를 사용하여, 친화 정제에 의해, 예컨대 렌틸-렉틴 크로마토크래피와 같은 렉틴-크로마토그래피 또는 면역친화 크로마토그래피에 의해서, 상기 HCV 외피 단백질을 회수하는 단계, 이어서
- 바람직하게는 또한 SH 기 블록킹제, 예컨대 NEM 또는 바이오틴-NEM 의 존재하에, 디술피드 결합 절단제, 예컨대 DTT 에 의한 디술피드 결합의 환원 또는 절단 단계, 및
- 예컨대 겔투과 (크기 배제 크로마토그래피 또는 분자체) 에 의해, 가능하게는 또한 부가적인 Ni2+-IMAC 크로마토그래피 후 탈염 단계에 의해, 환원된 HCV E1및/또는 E2 및/또는 E1/E2 외피 단백질을 회수하는 단계.
상술한 회수 단계는 또한 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
바람직한 렉틴-크로마토그래피 계에는, 실시예 부분에서 예시된, 갈란투스 니발리스 아그루티닌(GNA)-크로마토그래피, 또는 렌스 쿨리나리스 아글루티닌 (LCA) (렌틸) 렉틴 크로마토그래피가 포함된다. 다른 유용한 렉틴에는, 고-만노오스 유형 당을 인식하는 것들, 예컨대 나르시수스 슈도나르시수스 아글루티닌 (NPA), 피섬 사티붐 아글루티닌 (PSA) 또는 알륨 우르시늄 아글루티닌 (AUA) 가 포함된다.
바람직하게는, 상기 방법은 상술한 바와 같은 세포내에서 생성된 단일 또는 특이적 올리고머성 HCV 외피 단백질을 정제하기 위해 사용가능하다.
분비된 E1 또는 E2 또는 E1/E2 올리고머의 경우, 렉틴 결합 복합체 당, 예컨대 리시누스 콤무니스 아글루티닌 1 (RCA 1) 이 바람직한 렉틴이다.
더욱 구체적으로는, 본 발명은 상술한 방법에 의해 단리되거나 정제됨을 특징으로 하는 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 로 이루어진 군으로부터 선택된, 본질적으로 정제된 재조합 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 외피 단백질을 고려한다.
더욱 구체적으로는, 본 발명은 재조합 포유동물 세포, 예컨대 백시니아로부터 발현딘 재조합 외피 단백질의 정제 또는 단리에 관한 것이다.
본 발명은 또한 재조합 효모 세포로부터 발현된 재조합 외피 단백질의 정제 또는 단리에 관한 것이다.
본 발명은, 동질적으로는, 재조합 박테리아 (원핵생물) 세포로부터 발현된 재조합 외피 단백질의 정제 또는 단리에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 벡터 서열, 본 발명의 단일 또는 특이적 올리고머성 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 의 발현을 가능하게 하는 적절한 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스 또는 합성 프로모터 서열 뒤의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 고려한다.
구체적으로는, 본 발명은 벡터 서열, 본 발명의 단일 E1 또는 E1 의 발현을 가능하게 하는 적절한 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스 또는 합성 프로모터 서열 뒤의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 고려한다.
구체적으로는, 본 발명은 벡터 서열, 본 발명의 단일 E1 또는 E2 의 발현을 가능하게 하는 적절한 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스 또는 합성 프로모터 서열 뒤의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 고려한다.
벡터내로 삽입된 목적하는 E1 및/또는 E2 서열을 코딩하는 HCV cDNA 의 분획은, 시그널 서열에 부착될 수 있다. 상기 시그널 서열은 비-HCV 유래의 것, 예컨대 포유동물 세포에서의 발현을 위한 IgG 또는 조직 플라스미노겐 활성화제 (tpa) 리더 서열, 또는 효모 세포내에서의 발현을 위한 α-메이팅 인자 서열일 수 있고, 특별히 한정되지는 않지만, 본 발명에 따른 바람직한 구축물은 E1 및 E2 단백질의 각각의 개시점 전에 HCV 게놈에서 나타나는 시그널 서열을 포함한다. 벡터내로 삽입된 목적하는 E1 및/또는 E2 서열을 코딩하는 HCV cDNA 의 분획은 또한, 예를 들어 실시예 부분에서 예사된 소수성 도메인(들) 또는 E2 초가변(hypervariable) 영역 I 의 결실을 포함할 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 재조합 벡터는, HCV 단일 E1 단백질의 발현을 위해서, HCV 폴리프로테인의 아미노산 위치 1 내지 192 의 영역에서 시작하고, 위치 250 내지 341 내의 영역에서 끝나는, 더욱 바람직하게는 위치 290 내지 341 내의 영역에서 끝나는 폴리프로테인을 코딩하는 HCV cDNA 분획을 갖는 핵산을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 재조합 벡터는, HCV 단일 E1 단백질의 발현을 위해서, 위치 117 내지 192 내의 영역에서 시작하고, 위치 263 내지 326 내의 영역의 임의의 위치에서 끝나는 HCV cDNA 분획을 갖는 재조합 핵산을 포함한다. 또한, 우선 소성 도메인이 결실된 형태 (위치 264 내지 293 ±8 아미노산), 또는 5'-말단 ATG 코돈 및 3'-말단 종결 코돈이 부가된 형태, 또는 인자 Xa 절단 부위 및/또는 3 내지 10 개, 바람직하게는 6 개의 히스티딘 코돈이 부가된 형태는 본 발명의 범위내이다.
더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 재조합 벡터는, HCV 단일 E2 단백질의 발현을 위해서, HCV 폴리프로테인의 아미노산 위치 290 내지 406 내의 영역에서 시작하고, 위치 600 내지 820 내의 영역에서 끝나는 폴리프로테인, 더욱 바람직하게는 위치 322 내지 406 내의 영역에서 시작하고, 더욱 더 바람직하게는 위치 347 내지 406 내의 영역에서 시작하고, 훨씬 더 바람지하게는 위치 364 내지 406 내의 영역에서 시작하는 폴리프로테인을 코딩하는 HCV cDNA 분획을 갖는 핵산을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 재조합 벡터는, HCV 단일 E2 단백질의 발현을 위해서, 위치 290 내지 406 내의 영역에서 시작하고, 위치 623, 650, 661, 673, 710,715, 720, 746 또는 809 중 임의의 위치에서 끝나는 폴리프로테인을 코딩하는 HCV cDNA 분획을 갖는 재조합 핵산을 포함한다. 또한, 5'-말단 ATG 코돈 및 3'-말단 종결 코돈이 부가된 형태, 또는 인자 Xa 절단 부위 및/또는 3 내지 10 개, 바람직하게는 6 개의 히스티딘 코돈이 부가된 형태는 본 발명의 범위내이다.
다양한 벡터가 본 발명의 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 외피 단백질을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 저차 진핵생물, 예컨대 효모 및 글리코실화 돌연변이 균주는 전형적으로 플라스미드로 형질전환되거나, 재조합 바이러스에 의해 형질전환된다. 상기 벡터는 독립적으로 숙주 내에서 복제될 수 있고, 숙주 세포 게놈으로 통합될 수 있다.
고차 진핵생물은 벡터로 형질전환될 수 있거나, 재조합 벡터, 예컨대 재조합 백시니아 바이러스에 감염될 수 있다. 백시니아 바이러스로 외래 DNA 를 삽입하기 위한 기술 및 벡터는, 당업계에 자명하게 공지되어 있다 (예컨대, 상동성 재조합). 폭넓게 다양한 바이러스 프로모터 서열, 가능하게는 종결자 서열 및 폴리(A)-부가 서열, 가능하게는 인핸서 서열, 및 가능학는 증폭 서열, 포유동물 발현을 위해 요구되는 모든 것은 당업계에서 이용가능하다. 백시니아는 숙주 세포 단백질의 발현을 중지시키기 때문에, 특히 바람직하다. 백시니아는 또한 간 재조합 백시니아 바이러스에 면역된 세포 또는 개체에서 HCV 의 E1 및 E2 단백질의 발현을 가능하게 하기 때문에, 훨썬 더 바람직하다. 인간 백신화를 위해서, 아비폭스(avipox) 및 안카라 (Ankara) 변형 바이러스 (AMV) 가 특히 유용한 벡터이다.
헬퍼-독립적 바이러스 발현 벡터인 배큘로바이러스 오토그라파 칼리포르니카핵 폴리헤드로시스(polyhedrosis) 바이러스 (AcNPY) 유래의 곤충 발현 전송 벡터가 또한 공지되어 있다. 상기 계 유래의 발현 벡터는, 통상적으로, 이질성 유전자의 발현을 유도하는 강력한 바이러스 폴리헤드린 유전자 프로모터를 사용한다. 배큘로바이러스의 목적하는 부위로 이질성 DNA 를 도입하기 위한 상이한 벡터 및 방법은, 배큘로바이러스 발현을 위해 당업자에게 이용가능하다. 또한, 곤충 세포에 의해 인식되는 후번역 변형을 위한 상이한 시그널이 당업계에 공지되어 있다.
또한, 정제된 재조합 단일 또는 특이적 올리고머성 HCV E1 또는 E2 또는 E1/E2 단백질의 제조 방법에 있어서, 응집체 형성에 관련된 시스테인 잔기를 응집체 형성을 방지하는 다른 잔기로 핵산 수준에서 대체하는 방법은 본 발명의 범위내이다. 상기 돌연변이 E1 및/또는 E2 단백질 코딩 핵산을 담지한 재조합 벡터에 의해 발현되는 재조합 단백질도 또한 본 발명의 범위내이다.
본 발명은 또한, 하나 이상의 글리코실화 부위가 제거되어 결과적으로 글리코실화 돌연변이라고 지칭되는 것을 특징으로 하는 재조합 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질에 관한 것이다. 실시예 부분에서 설명한 바와 같이, 상이한 글리코실화 돌연변이는 당해 환자에 따른 HCV 질환의 진단 (스크리닝, 확인, 예후 등) 및 예방이 목적될 수 있다. GLY4 가 결여된 E2 단백질 글리코실화 돌연변이는, 예를 들어 진단에 있어서 특정 혈청의 반응성을 개선시키는 것으로 확인되었다. 이러한 글리코실화 돌연변이는, 바람직하게는 본 발명에 개시된 방법에 따라 정제된다. 또한, 상기 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 글리코실화 돌연변이를 코딩하는 핵산 삽입부를 담지한 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포도 또한본 발명에서 고려된다.
본 발명은 또한, 본 발명의 일부를 또한 형성할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명은, 더욱 구체적으로는, 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 49 로 나타내어지는 재조합 핵산 또는 이의 일부에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 정의된 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에 있어서, 상기 벡터가 상기 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 서열에 조작가능하게 연결되고 상기 HCV E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질의 발현을 조절할 수 있는 조절 서열 외에, 상기 정의된 HCV E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 고려한다.
진핵생물 숙주는, 상기 부분에서 기술된 저차 및 고차 진핵생물을 포함한다. 저차 진핵생물은, 당업계에 공지된 효모 세포를 포함한다. 고차 진핵생물은, 주로, 당업계에 공지된 포유동물 세포주를 포함하고, Hela 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, PK15, PK13 및 수많은 다른 세포주를 포함하여 ATCC 로부터 입수가능한 수많은 부동화 세포주를 포함한다.
본 발명은, 구체적으로는, 상기 정의한 재조합 벡터를 포함하는 상기 정의한 숙주세포에 의해 발현되는 재조합 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질에 관한 것이다. 이러한 재조합 단백질은, 구체적으로는, 본 발명의 방법에 따라 정제된다.
상기 정의한 HCV 외피 단백질을 단리 또는 정제하기 위한 바람직한 방법은, 적어도 하기 단계를 포함하는 것을 또한 특징으로 한다:
- 본 발명에 따른 재조합 벡터, 또는 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 외피 단백질을 발현하는 공지된 재조합 벡터로 형질전환된 상기 정의한 숙주 세포를 적절한 배양배지 중에서 성장시키는 단계;
- 상기 정의한 상기 벡터 서열의 발현을 적절한 조건하에 유도하는 단계;
- 바람직하게는 SH 기 블록킹제, 예컨대 N-에틸말레이미드 (NEM), 및 가능하게는 적절한 세척제, 예컨대 Empigen-BB 의 존재하에, 상기 혈질전환된 숙주 세포를 용해하는 단계;
- 친화 정제에 의해서, 항-E1 및/또는 항-E2 특이적 모노클로날 항체를 사용하여, 예컨대 렉틴-크로마토그래피 또는 면역친화 크로마토그래피에 의해서 상기 HCV 외피 단백질을 회수하는 단계 (상기 렉틴은 바람직하게는 렌틸-렉틴 또는 GNA 임); 이어서,
- 디술피드 결합 절단 수단, 예컨대 DTT 와 함께 전 단계의 용해물을 배양한 후, 바람직하게는 SH 기 블록킹제, 예컨대 NEM 또는 바이오틴-NEM 과 함께 배양하는 단계, 및
- 예컨대 겔투과에 의해서, 가능하게는 뒤이은 Ni2+-IMAC 크로마토그래피 후 탈염 단계에 의해서 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질을 단리하는 단계.
상기 과정의 결과로서, E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질은, 실시예 부분에서 예시된 바와 같이 겔투과 컬럼 또는 IMAC 컬럼의 공극 체적에서 벡터-유래 성분 및/또는 세포 성분을 포함하는 커다란 응집체로부터 상이하게 용출되는 형태로 제조될 수 있다. 또한, 디술피드 브릿지 절단 단계는, 이롭게는, 숙주 및/또는 바현계 유래 단백질의 존재로 인한 가반응성을 제거한다. 세포 용해 동안 NEM 및 적절한 세척제의 존재는, HCV 외피 단백질 및 오염원 사이의 응집을 사전에 부분적으로 또는 심지어는 완전히 방지한다.
Ni2+-IMAC 크로마토그래피 후 탈염 단계는, Janknecht 등, 1991 및 Hochuli 등, 1988 에 기재된 바와 같이, (His)6를 갖는 구축물에 대해서 바람직하게 사용된다.
본 발명은 또한, 본 발명의 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 외피 단백질을 사용하여, 마우스 또는 랫트와 같은 소형 동물에서 모노클로날 항체를 제조하는 방법, 및 항-HCV 항체를 인식하는 B-세포를 스크리닝하고 단리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 표 3 에 나열되어 있고 다르게는 본원에 기재된 하기 E1 펩티드 중 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다:
코어/E1 V1 영역의 아미노산 181 내지 200 에 놓여있는 E1-31 (서열번호 56),
E1 영역의 아미노산 193 내지 212 에 놓여있는 E1-33 (서열번호 57),
E1 V2 영역의 아미노산 205 내지 224 에 놓여있는 E1-35 (서열번호 58) (에피토프 B),
E1 V2 영역의 아미노산 208 내지 227 에 놓여있는 E1-35A (서열번호 59) (에피토프 B),
E1 영역 (V1, C1 및 V2 영역 (에피토프 B 포함)) 의 아미노산 192 내지 228 에 놓여있는 1bE1 (서열번호 53),
E1 영역의 아미노산 301 내지 320 에 놓여있는 E1-51 (서열번호 66),
E1 C4 영역의 아미노산 313 내지 332 에 놓여있는 E1-53 (서열번호 67) (에피토프 A),
E1 영역의 아미노산 325 내지 344 에 놓여있는 E1-55 (서열번호 68).
본 발명은 또한 표 3 에 나열된 하기 E2 펩티드 중 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다:
E2 영역의 아미노산 위치 397 내지 416 에 놓여있는 Env 67 또는 E2-67 (서열번호 72) (모노클로날 항체 2F10H 에 의해 인식되는 에피토프 A, 도 19 참조),
E2 영역의 아미노산 위치 409 내지 428 에 놓여있는 Env 69 또는 E2-69 (서열번호 73) (에피토프 A),
E2 영역의 아미노산 위치 583 내지 602 에 놓여있는 Env 23 또는 E2-23 (서열번호 86) (에피토프 E),
E2 영역의 아미노산 위치 595 내지 614 에 놓여있는 Env 25 또는 E2-25 (서열번호 87) (에피토프 E),
E2 영역의 아미노산 위치 607 내지 626 에 놓여있는 Env 27 또는 E2-27 (서열번호 88) (에피토프 E),
E2 영역의 아미노산 위치 547 내지 566 에 놓여있는 Env 17B 또는 E2-17B (서열번호 83) (에피토프 D),
E2 영역의 아미노산 위치 523 내지 542 에 놓여있는 Env 13B 또는 E2-13B (서열번호 82) (모노클로날 항체 16A6E7 에 의해 인식되는 에피토프 C, 도 19 참조),
본 발명은 또한 하기의 E2 형태적 에피토프 중 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다:
모노클로날 항체 15C8C1, 12D11F1 및 8G10D1H9 에 의해서 인식되는 에피토프 F,
모노클로날 항체 9G3E6 에 의해 인식되는 에피토프 G,
모노클로날 항체 10D3C4 및 4H6B2 에 의해 인식되는 에피토프 H (또는 C), 또는
모노클로날 항체 17F2C2 에 의해 인식되는 에피토프 I.
본 발명은 또한 펩티드 또는 단백질 조성물에 의한 면역시에 상승하는 E1 또는 E2 특이적 항체에 관한 것으로, 상기 항체는 상기 정의한 폴리펩티드 또는 펩티드 중 임의의 것과 특이적으로 반응하고, 상기 항체는 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
본 발명은 또한 플라스미드 또는 파지 중 가변 사슬 라이브러리로부터, 또는 인간 B-세포 집단으로부터 당업계에 공지된 방법에 의해서 스크리닝되는 E1 또는 E2 특이적 항체에 관한 것으로, 상기 항체는 상기 정의한 폴리펩티드 또는 펩티드중 임의의 것과 특이적으로 반응하고, 상기 항체는 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 E1 또는 E2 특이적 모노클로날 항체는, 한편으로는 상기한 바와 같이 본 발명에 따른 HCV 폴리펩티드 또는 펩티드에 대해 면역된 동물, 특히 마우스 또는 랫트의 비장 세포로부터 통상적인 방법에 따라 형성되기 쉬운 임의의 하이브리도마에 의해, 다른 한편으로는 골수종 세포주의 세포의 하이브리도마에 의해 생성될 수 있고, 상기 동물의 면역을 위해 초기에 사용되는 폴리펩티드를 인식하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마의 능력에 의해서 선별된다.
본 발명에 관련된 항체는, 효소적, 형광적 또는 방사성적 형태의 적절한 표지에 의해서 표지화될 수 있다.
본 발명의 상기 바람직한 구현예에 따른 모노클로날 항체는, H 및 L 사슬을 코딩하는 cDNA 또는 게놈 클론 유래의 H 및 L 사슬을 코딩하는 마우스 및/또는 인간 게놈 DNA 서열의 부분으로부터 벗어난, 재조합 DNA 기술에 의해서 제조된 마우스 모노클로날 항체의 인간화 형태일 수 있다.
다르게는, 본 발명의 상기 바람직한 구현예에 다른 모노클로날 항체는, 인간 모노클로날 항체일 수 있다. 본 발명의 본 구현예에 따른 상기 항체는 또한, HCV 에 감염된 또는 HCV 에 대한 백신화된 환자의 인간 말초 혈액 림프구로부터 유도될 수 있다. 상기 인간 모노클로날 항체는, 예를 들어 심각히 조합된 면역결핍 (SCID) 마우스 (최신 리뷰에 대해서, Duchosal 등, 1992 참조) 의 인간 말초 혈액 림프구 (PBL) 재생에 의해서 제조될 수 있다.
본 발명은 또한, 반복(repertoire) 클로닝 방법 (Persson 등, 1991) 에 의한 재조합 항체의 선별을 위한, 본 발명의 단백질 또는 펩티드의 용도에 관한 것이다.
특정 유전자 형으로부터 유래된 펩티드 또는 단일 또는 특이적 올리고머성 외피 단백질에 대한 항체는, 의약로서 사용될 수 있고, 더욱 구체적으로는 HCV 유전자형의 검출을 위한 면역검사로의 통합을 위해 (HCV E1 또는 E2 항원의 존재를 검출하기 위해), HCV 질환의 예후/모니터링을 위해, 또는 치료제로서 사용될 수 있다.
다르게는, 본 발명은 또한, 생물학적 샘플에서 E1 또는 E2 항원의 존재를 검출하기 위한 면역검사 키트의 제조를 위한, HCV 질환의 예후/모니터링을 위한 키트의 제조를 위한, 또는 HCV 약물의 제조를 위한, 상기 구체화된 임의의 E1 또는 E2 특이적 모노클로날 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 적어도 하기 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에 존재하는 HCV 항원의 실험관내 진단 또는 검출을 위한 방법에 관한 것이다:
(i) 바람직하게는 면역 복합체를 형성시킬 수 있는 적절한 조건하에서, 부동화 형태로, 상기 생물학적 샘플을 상기 정의한 임의의 E1 및/또는 E2 특이적 모노클로날 항체와 접촉시키는 단계;
(ii) 결합되지 않은 성분을 제거하는 단계,
(iii) 분석될 샘플 중에 존재하는 항체에 특이적으로 결합하는 이질성 항체와 함께 형성된 면역 복합체를 배양하는 단계로서, 상기 이질성 항체가 적절한 조건 하에서 검출가능한 표지에 공액된 것인 단계,
(iv) 상기 면역 복합체의 존재를 가시적으로 또는 기계적으로 (예컨대, 밀도측정계, 형광측정계, 비색계에 의해서) 검출하는 단계.
본 발명은 또한, 하기를 포함하는, 생물학적 샘플내에 존재하는 HCV 항원의 실험관내 진단을 위한 키트에 관한 것이다.
- 고체 기질 상에 바람직하게는 부동화된, 상기 정의한 하나 이상의 모노클로날 항체;
- 완충제 또는 상기 항체 및 생물학적 샘플내에 존재하는 HCV 항원 사이의 결합 반응을 가능하게 하는 완충제를 제공하기 위한 성분,
- 상기 결합 반응에서 형성된 면역 복합체를 검출하기 위한 수단,
- 가능하게는, 관찰된 결합 패턴으로부터 샘플 중에 존재하는 HCV 항원을 추론하기 위한 자동화 스캐닝 및 해석 장치를 또한 포함함.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 따라 정제된 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 재조합 HCV 단백질을 포함하는 조성물, 또는 의약으로서 사용하기 위한 상기 구체화된 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은, 더욱 구체적으로는, 면역 반응을 생성하기 위해서, 가능하게는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트(들) 을 수반하는 조성물의 충분한 양을 투여하는 것을 포함하는 HCV 에 대해 포유동물, 바람직하게는 인간의 면역화를 위한 백신으로서 사용하기 위한, 상기 구체화된 외피 펩티드 중 하나 이상을 포함하는 조성물 또는 상기 정의된 재조합 외피 단백질 조성물에 관한 것이다.
더욱 구체적으로는, 본 발명은, 상기 정의한 백신의 제조를 위한, 상기 본원에 기재된 임의의 조성물의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 단백질 또는 상기한 바와 같은 E1 및/또는 E2 영역으로부터 유래된 펩티드를 포함하는, HCV 에 대해 포유동물, 바람직하게는 인간의 면역화를 위한 백신에 관한 것이다.
면역원성 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 조성물은 면역원적 양의 상기 정의된 재조합 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단일 또는 특이적 올리고머성 단백질, 또는 상기 정의한 E1 또는 E2 펩티드를 포함하며, 통상적으로 약학적으로 허용가능한 담체와 조합되며, 추가적으로 아쥬반트를 더 포함한다.
본 발명의 단일 또는 특이적 올리고머성 외피 단백질인 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 은, E1 또는 E2 에 대한 항체의 형성이 다른 외피 단백질에 대한 것 보다 더욱 바람직하고 E2 단백질은 HCV 유형들 사이에 교차반응성이며 E1 단백질은 종-특이적이기 때문에, 특히 유용한 백신 항원을 제공할 것으로 예상된다. 각종 유전자형으로부터 유래된 타입 1 E2 단백질 및 E1 단백질을 포함하는 칵테일은, 특히 이로울 수 있다. 몰 과량의 E1 대 E2 또는 E2 대 E1 을 함유하는 칵테일은 또한 특히 유용할 수 있다. 면역원성 조성물은 항체의 생성을 유도하기 위해, 또는 항체의 공급원을 제공하기 위해, 또는 동물에서 보호 면역성을 유도하기 위해 동물에 투여될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는, 그 자체로는 조성물을 투여받은 개체에 해로운 항체의 제조를 유도하지 않는 임의의 담체를 포함한다. 적절한 담체는, 전형적으로는 크고 서서히 대사되는 거대 분자, 예컨대 단백질, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 중합체, 및 불활성화 바이러스 입자이다. 상기 담체는 당업자에게 자명하게 공지되어 있다.
조성물의 효율성을 강화시키기 위한 바람직한 아쥬반트는, 특별히 한정되지는 않지만, 하기를 포함한다: 알루미늄 히드록시드(알룸), 박테리아로부터 추출된 3 가지의 성분으로서 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP) (USP 4,606,918 에서 발견됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE) 및 RIBI, 모노포스포릴 지질 A, 트레할로오스 디미콜레이트, 및 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼 중의 세포벽 골격 (MPL+TDM+CWS). 3 가지 성분 MPL, TDM 또는 CWS 중 임의의 것이 도한 단독으로 또는 2 대 2 의 조합으로 사용될 수 있다. 부가적으로, Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) 또는 SAF-1 (Syntex) 와 같은 아쥬반트가 사용될 수 있다. 또한, 완전 플로인트 아쥬반트 (CFA) 및 불완전 프로인트 아쥬반트 (IFA) 가 비인간 적용 및 연구 목적으로 사용될 수 있다.
면역원성 조성물은, 전형적으로는, 약학적으로 허용가능한 운반제, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤, 에탄올 등을 포함할 것이다. 부가적으로, 보조 물질, 예컨대 습윤화제 또는 유화제, pH 완충 물질, 보존제 등이 상기 운반제로서 포함될 수 있다.
전형적으로는, 면역원성 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서의 주사제로서 제조되고; 주사전에 액체 운반제 중 또는 현탁액 중 용액에 적합한 고체 형태가또한 제조될 수 있다. 상기 제제는 또한 강화된 아쥬반트 효과를 위해서 유화되거나 캡슐화될 수 있다. E1 및 E2 단백질은 또한 면역 자극 복합체내로 사포닌과 함께 혼입될 수 있다 (예컨대 Quil A (ISCOMS)).
백신으로서 사용되는 면역원성 조성물은, 본 발명의 외피 단백질의 '충분한 양' 또는 '면역학적 유효량', 및 필요에 따라 임의의 다른 상기 언급한 성분을 포함한다. '면역학적 유효량' 은 단일 분량으로 또는 시리즈의 부분으로서 개체에 상기 양의 투여가 상기 정의한 바와 같이 치료에 효과적인 것을 의미한다. 상기 양은 치료할 개체의 건강 및 육체 상태, 치료할 개체의 분류적 그룹 (예커내, 비인간 영장류, 영장류 등), 항체를 합성하는 환자의 면역계의 능력, 요구되는 보호 정도, 백산의 제형화, 의학적 상화에 대한 치료 의사의 평가, 감염 HCV 의 균주 및 기타 관련 인자에 따라 다양하다. 상기 양은 통상적인 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 폭넓은 범위에 속할 것으로 예상된다. 통상적으로, 상기 양은 0.01 내지 1000 ㎍/분량, 더욱 구체적으로 0.1 내지 100 ㎍/분량으로 다양할 것이다.
단일 또는 특이적 올리고머성 외피 단백질은 또한, B형 간염 표면 항원 (유럽특허출원 제 174,444 호 참조) 와 동일한 방식으로, 동질성 (예컨대, 코어, NS2, NS3, NS4 또는 NS5 영역 유래의 T 세포 에피토프 또는 B 세포 에피토프) 또는 이질성 (비-HCV) 헵텐을 나타내기 위한 백신 담체로서 제공할 수 있다. 이런 용도에 있어서, 외피 단백질은 헵텐 또는 응집체에 공액된 항원에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 면역원성 담체를 제공한다. 상기 항원은 통상적인 화학적 방법에 의해서 공액될 수 있거나, 단백질의 소수성 영역에 해당하는 위치에서 E1 및/또는 E2를 코딩하는 유전자로 클로닝될 수 있다. 상기 소수성 영역은, V1 영역 (아미노산 위치 191 내지 202 를 포함), V2 영역 (아미노산 위치 213 내지 223 을 포함), V3 영역 (아미노산 위치 230 내지 242 를 포함), V4 영역 (아미노산 위치 230 내지 242 를 포함), V5 영역 (아미노산 위치 294 내지 303 을 포함) 및 V6 영역 (아미노산 위치 329 내지 336 을 포함) 을 포함한다. 헵텐 삽입을 위한 또다른 유용한 위치는 소수성 영역 (대략적으로 아미노산 위치 264 내지 293 을 포함) 이다. 상기 영역은 결실된 E1 단백질과 항혈청의 반응성에 영향을 주지 않고 결실될 수 있는 것으로 보여진다. 따라서, 헵텐은 결실 부위에서 삽입될 수 있다.
면역원성 조성물은 통상적으로 비경구적으로, 전형적으로는 주사에 의해서, 예컨대 경피 또는 근육내로 투여된다. 다른 투여 방법에 적합한 추가적인 제형은, 경구 제형 및 좌약을 포함한다. 투약 처방은 단일 분량 스케쥴 또는 복수 분량 스케쥴일 수 있다. 상기 백신은 다른 면역조절제와 병용하여 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, 생물학적 샘플 중에 존재하는 HCV 항체의 실험관내 검출을 위한, 상술한 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 생물학적 샘플 중에 존재하는 HCV 항체의 검출용 면역검사 키트의 제조를 위한, 상술한 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 적어도 하기 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 중에 존재하는 HCV 항체의 실험관내 진단을 위한 방법에 관한 것이다:
(i) 바람직하게는 면역 복합체의 형성을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 부동화된 형태로, 상기 생물학적 샘플을 상기 정의된 임의의 외피 펩티드 또는 단백질과 접촉시키는 단계에 있어서, 상기 펩티드 또는 단백질이 스트렙타비딘 또는 아비딘 복합체에 의해서 고체 기질에 공유 결합되는 바이오틴화 펩티드 또는 단백질일 수 있는 단계;
(ii) 결합되지 않은 성분을 제거하는 단계;
(iii) 이질성 항체에 의해 형성된 면역 복합체를 배양하는 단계에 있어서, 상기 이질성 항체가 적절한 조건하에서 검출가능한 표지에 공액된 단계;
(iv) 상기 면역 복합체의 존재를 가시적으로 또는 기계적으로 (예컨대, 밀도측정계, 형광측정계, 비색계에 의해서) 검출하는 단계.
다르게는, 본 발명은 또한, 상기 기재된 재조합적으로 생성되는 정제된 단일 또는 특이적 올리고머성 단백질 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질이 생물학적 샘플 중에 존재하는 HCV 항체에 대해 경쟁하기 위해서 E1 및/또는 E2 펩티드와의 경쟁에 사용되는, 경쟁 면역검사 포멧에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 하기를 포함하는, 생물학적 샘플 중의 HCV 항체의 존재를 결정하기 위한 키트에 관한 것이다:
- 고체 기질 상에, 더욱 바람직하게는 동일한 ELISA 플레이트의 상이한 마이크로웰 상에, 훨씬 더욱 바람직하게는 하나 및 동일한 막 스트립(strip) 상에 바람직하게는 부동화된, 가능하게는 HCV 또는 HCV 의 다른 유형 유래의 다른 폴리펩티드 또는 펩티드와 조합된, 상기 정의한 하나 이상의 펩티드 또는 단백질 조성물;
- 완충제 또는 상기 폴리펩티드 또는 펩티드와 생물학적 샘플내에 존재하는 HCV 에 대한 항체 사이의 결합 반응을 가능하게 하는 완충제를 제조하기 위해 필요한 성분,
- 상기 결합 반응에서 형성된 면역 복합체를 검출하기 위한 수단,
- 가능하게는, 관찰된 결합 패턴으로부터 샘플 중에 존재하는 HCV 유전자형을 추론하기 위한 자동화 스캐닝 및 해석 장치를 또한 포함함.
본 발명에 따른 면역검사 방법은, HCV 에 감염된 개체 유래의 혈청 중의 항체에 의해서 인식되는 선형 (펩티드의 경우) 및 형태적 에피토프 (단일 또는 특이적 올리고머성 단백질) 를 유지하는, E1 및/또는 E2 도메인 유래의 단일 또는 특이적 올리고머성 항원을 이용한다. 예를 들어 단일 또는 특이적 올리고머성 항원, 이량체 항원, 및 단일 또는 특이적 올리고머성 항원의 조합을 사용하는 것은 본 발명의 범위내이다. 본 발명의 HCV E1 및 E2 항원은 실제적으로 항체를 검출하기 위한 공지된 항원을 사용하는 임의의 검사 포멧에서 사용될 수 있다. 물론, HCV 형태적 에피토프를 변성시키는 포멧은 피하거나 수정되어야만 한다. 상기 검사의 모든 통상적인 특징은, 항원이 성분 중에 존재하는 임의의 항체에 결합될 수 있도록 하는 조건 하에서 HCV 항체를 포함할 것으로 의심되는 체성분과 항원을 접촉시키는 것이다. 이러한 조건은, 전형적으로는, 과량의 항원을 사용하는 생리학적 온도, pH 및 등장성 강도일 것이다. 표본과 함께 항원을 배양하는 것은, 항원을 포함하는 면역 복합체의 검출이 뒤따른다.
면역검사의 고안은 상당히 다양하게 수행되고, 수많은 포멧이 당업계에 공지되어 있다. 프로토콜은, 예를 들어 고체 지지체 또는 면역침전을 사용할 수 있다. 대부분의 검사는 표지화 항체 또는 폴리펩티드를 포함하고; 상기 표지는 예를 들어효소적, 형광적, 화학발광적, 방사능적 또는 염료 분자일 수 있다. 면역 복합체로부터 시그널을 증폭시키는 검사도 또한 공지되어 있고; 이의 예에는 바이오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘을 이용하는 검사, 및 효소-표지화 및 매개 면역검사, 예컨대 ELISA 검사가 있다.
제한 없이, 면역 검사는, 표준 또는 경쟁 유형의 이질성 또는 동질성 포멧일 수 있다. 이질성 포멧에 있어서, 폴리펩티드는 전형적으로는 배양후 폴리펩티드 유래의 샘플의 분리를 용이하게 하는 고체 매트릭스 또는 지지체에 결합된다. 사용될 수 있는 고체 지지체의 예에는, 니트로셀룰로오스 (예컨대, 막 또는 마이크로역가 웰 형태로), 폴리비닐 클로라이드 (예컨대, 시트 또는 마이크로역가 웰 내), 폴리스티렌 락텍스 (예컨대, 비드 또는 마이크로역가 플레이트 중), 폴리비닐리딘 플루오라이드 (ImmunolonTM으로서 공지됨), 디아조화 페이퍼, 나이론막, 활성화 비드, 및 프로테인 A 비드가 있다. 예를 들어, Dynatech ImmunolonTM1 또는 ImmunolonTM2 마이크로역가 플레이트, 또는 0.25 인치 폴리스티렌 비드 (Precision Plastic Ball) 이 이질성 포멧에 사용될 수 있다. 항원성 폴리펩티드를 함유하는 고체 지지체는, 전형적으로는, 시험 샘플로부터 분리된 후, 및 결합된 항체의 검출 전에 세척된다. 표준 및 경쟁 포멧 모두 당업계에 공지되어 있다.
동질성 포멧에서, 시험 샘플은 용액 중 항원의 조합물과 함께 배양된다. 이는, 예를 들어, 형성되는 임의의 항원-항체 복합체를 침전시키는 조건 하에 존재할 수 있다. 이 검사를 위한 표준 및 경쟁 포멧이 모두 당업계에 공지되어 있다.
표준 포멧에서, 항체-항원 복합체 중의 HCV 항체의 양은 직접적으로 모니터링된다. 이는, 항-HCV 항체 상에서 에피토프를 인식하는 표지화된 항-이종성 (예컨대 항-인간) 항체가 복합체 형성으로 인해 결합할 수 있는지를 결정하는 것에 의해 성취될 수 있다. 경쟁 포멧에서, 샘플 중의 HCV 항체의 양은 복합체 중의 표지화된 항체 (또는 다른 경쟁 리간드) 의 공지된 양의 결합에 대한 경쟁적 효과를 모니터링함으로써 유추된다.
항-HCV 항체 (또는 경쟁 검사의 경우에는, 경쟁 항체의 양) 를 포함하는 형성된 복합체는 포멧에 따라 임의의 수의 공지된 기술을 사용하여 검출된다. 예를 들어, 복합체 중의 비(非)표지화 HCV 항체는 표지와 복합체화된 항-이종성 Ig 의 공액체 (예컨대, 효소 표지)를 사용하여 검출될 수 있다.
면역침전 또는 아글루틴화 검사 포멧에서, HCV 항원 및 항체 사이의 반응은 용액 또는 현탁액으로부터 침전하는 네트워크를 형성하고, 침전물의 가시화 층 또는 필름을 형성한다. 항-HCV 항체가 시험 표본 중에 존재하지 않는다면, 가시화 침전물이 형성되지 않는다.
현재, 3 가지 특이적 유형의 입자 글루틴화 (PA) 검사가 존재한다. 이들 검사는 지지체에 피복하는 경우 다양한 항원에 대한 항체의 검출을 위해 사용된다. 상기 검사의 하나의 유형은, RBC 에 항원 (또는 항체)를 수동적으로 흡착시키는 것에 의해 감작되는 적혈구 (RBC) 를 사용하는 헤마글루틴화 검사이다. 체성분 중에 존재하는 특이적 항원 항체의 첨가는, 존재한다면, 정제된 항원으로 피복된 RBC 가 아글루틴화되도록 한다.
헤마글루틴화 검사에서 잠재적인 비특이적 반응을 제거하기 위해서, 두 가지의 인고적인 담체가 PA 중에서 RBC 대신에 사용될 수 있다. 이들 중 가장 통상적인 것은, 라텍스 입자이다. 그러나, 겔화 입자가 또한 사용될 수 있다. 이들 담체중 하나를 사용하는 검사는 정제된 항원으로 피복된 입자의 수동적 아글루틴화에 기초한다.
형태적 에피토프를 포함하는 본 발명의 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 항원은, 전형적으로는, 이들 면역 검사에서의 사용을 위한 키트의 형태로 포장될 것이다. 상기 키트는, 일반적으로는, 개별적인 용기 중에 천연 HCV 항원, 조절 항체 제형 (양성 및/또는 음성), 상기 검사 포멧이 그를 요구하는 경우 표지화된 항체, 및 표지가 시그널을 직접적으로 생성하지 않는 경우 시그널 생성 시약 (예컨대, 효소 기질) 을 포함할 것이다. 천연 HCV 항원은 고체 매트릭스에 사전에 결합되거나, 그를 매트릭스에 결합시키기 위한 시약과 함께 분리될 수 있다. 상기 검사를 수행하기 위한 지침서 (예컨대, 서면, 테입, CD-ROM 등) 가 통상적으로 상기 키트에 포함될 것이다.
천연 HCV 항원을 사용하는 면역검사는, 잠재적으로 감염성인 HCV 가 결여된 공급물의 제조를 위한 혈액의 스크리닝에 유용하다. 혈액 공급물의 제조를 위한 방법은 하기 단계를 포함한다: 개체 공여 혈액 유래의 체성분, 바람직하게는 혈액 또는 혈액 성분을 본 발명의 HCV E1 및/또는 E2 단백질과 반응시켜 HCV 항체 및 존재하는 경우 HCV 항원 사이의 면역학적 반응을 수행하는 단계; 항-HCV 항체 - HCV 항원 복합체가 반응 결과로서 형성되었는지를 검출하는 단계. 혈액 공급에 기여하는 혈액은, 천연 HCV 항원인 E1 또는 E2 에 대한 항체가 존재하지 않는 공여자 유래의 것이다.
HCV 항원에 대해 양성 반응성인 경우, 가(假)양성의 가능성을 감소시키기 위해 면역검사를 반복하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 혈액 제품 (예컨대, 수혈, 혈장, 인자 VIII, 면역글로블린 등) 의 제조를 위한 대규모 혈액 스크리닝에 있어서, '스크리닝' 시험은, 전형적으로는, 특이성의 손실로 감작성을 증가시키기 위해 (오염된 혈액이 통과되지 않도록 하기 위해) 포멧화되고; 즉, 가양성률이 증가한다. 따라서, '반복적으로 반응성인', 즉 공여된 샘플 상에서 2회 이상의 면역 검사에서 양성인 공여자의 것을 더 실험하는 것을 단지 연기하는 것이 전형적이다. 그러나, HCV-양성의 확인을 위하여, '확인' 시험은, 전형적으로는, 감작성의 손실로 특이성을 증가시키기 위해 (가양성 샘플이 확인되지 않도록 하기 위해) 포멧화 된다. 따라서, E1 및 E2 에 대한 본 발명에 기재된 정제 방법은, 단일 또는 특이적 올리고머성 외파 단백질을 HCV 진단 검사에 포함시키는 것이 매우 유리할 것이다.
선택된 고체상은 중합체성 또는 유리 비드, 니트로셀룰로오스, 마이크로입자, 반응 트레이의 마이크로웰, 시험 튜브 및 자기(magnetic) 비드를 포함할 수 있다. 시그널 생성 화합물은 효소, 발광 화합물, 크로모겐(chromogen), 방사성 원소 및 화학발광 화합물을 포함할 수 있다. 효소의 예에는, 알칼리성 포스파타아제, 서양고추냉이 퍼옥시다아제 및 베타-갈락토시다아제가 포함된다. 인핸서 화합물의 예에는, 바이오틴, 항-바이오틴 및 아비딘이 포함된다. 인핸서 화합물 결합 구성원의 예에는, 바이오틴, 항-바이오틴 및 아비딘이 포함된다. 류마티스 인자-유사 물질의 효과를 블록킹하기 위해서, 시험 샘플은 류마티스 인자-유사 물질의 효과를 블록킹하기에 충분한 조건을 수행한다. 상기 조건들은, 시험 샘플을 다량의 항-인간 IgG 와 접촉시켜, 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 실질적으로 류마티스 인자-유사 물질이 없는 반응 혼합물 산물을 형성하는데 충분한 시간 및 조건하에서 배양하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는, HCV 감염으로 고생하는 환자의 치료 (예를 들어 인터페론 이용) 에 대한 반응의 예후 또는 HCV 질환의 실험관내 모니터링을 위한, E1 단백질 또는 이의 일부, 더욱 구체적으로는 상기 정의된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 E1 단백질이 용도를 고려한다:
- E1 단백질 또는 이의 적절한 일부를 갖는 C형 간염 감염을 갖는 환자 유래의 생물학적 샘플을, 면역학적 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건하에서 배양하는 단계,
- 결합되지 않은 성분을 제거하는 단계,
- 상기 샘플 중에 존재하는 항-E1 역가를 계산하는 단계 (예를 들어, (인터페론) 치료 과정의 개시 및/또는 도중에),
- 치료 개시 및/또는 치료 과정의 도중에 상기 샘플에서 발견된 항-E1 역가의 양에 기초하여, HCV 질환의 본래 진행을 모니터링하거나, 상기 환자의 치료에 대한 반응을 예후하는 단계.
초기 항-E1 역가의 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 배, 또는 바람직하게는 20 배 초과의 감소를 나타내는 환자는, HCV 치료, 더욱 구체적으로는 인터페론 치료에 대한 장기 지속적인 반응자인 것으로 결론내려질 수 있다. 항-E1 검사가 IFN 치료, 또는 일반적인 C형 간염 질환의 치료에 대한 장기 반응을 예후함에 있어 유용할 수 있다는 것은, 실시예 부분에서 예시되어 있다.
더욱 구체적으로는, 표 3 에 나타낸 하기의 E1 펩티드는 HCV 질환의 실험관내 모니터링 또는 HCV 감염으로 고생하는 환자의 인터페론 치료에 대한 반응의 예후를 위해 유용하다는 것이 발견되었다:
코어/E1 V1 영역의 아미노산 181 내지 200 에 놓여있는 E1-31 (서열번호 56),
E1 영역의 아미노산 193 내지 212 에 놓여있는 E1-33 (서열번호 57),
E1 V2 영역의 아미노산 205 내지 224 에 놓여있는 E1-35 (서열번호 58) (에피토프 B),
E1 V2 영역의 아미노산 208 내지 227 에 놓여있는 E1-35A (서열번호 59) (에피토프 B),
E1 영역 (V1, C1 및 V2 영역 (에피토프 B 포함))의 아미노산 192 내지 228 에 놓여있는 1bE1 (서열번호 53),
E1 영역의 아미노산 301 내지 320 에 놓여있는 E1-51 (서열번호 66),
E1 C4 영역의 아미노산 313 내지 332 에 놓여있는 E1-53 (서열번호 67) (에피토프 A),
E1 영역의 아미노산 325 내지 344 에 놓여있는 E1-55 (서열번호 68).
상기 언급한 펩티드의 소형 절편이 또한 본 발명의 범위내에 속한다는 것이 해될 것이다. 상기 소형 절편은 화학적 합성에 의해서 용이하게 제조될 수 있고, 상기 및 실시예 부분에서 언급한 검사에 사용되는 이들의 능력에 대해 시험될 수 있다.
본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는, HCV 질환의 모니터링 또는 HCV 감염으로 고생하는 환자의 치료 (예컨대, 인터페론 치료) 에 대한 반응의 예후를 위한 키트에 관한 것이다:
- 하나 이상의 E1 단백질 또는 E1 펩티드, 상기 정의된 E1 단백질 또는 E1 펩티드;
- 완충제 또는 이들 단백질 또는 펩티드와 생물학적 샘플 중에 존재하는 항-E1 항체 사이의 결합 반응을 가능하게 하는 완충제를 제조하기 위해 요구되는 성분,
- 상기 결합 반응에서 형성된 면역 복합체를 검출하기 위한 수단,
- 가능하게는, 관찰된 결합 패턴으로부터 샘플 중에 존재하는 HCV 항원을 추론하기 위한 자동화 스캐닝 및 해석 장치를 또한 포함함.
또한, 항-E2 수준은 다른 HCV 항원에 대한 항체와 비교하여 또한 감소되기 때문에, 본 발명에 따른 E2 단백질 및 펩티드가 E1 단백질 또는 펩티드에 대해 상기 나타낸 HCV 치료의 모니터링/예후를 위한 특정 정도로 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 그러나, HCV 질환의 모니터링/예후를 위한 시험에 사용하기에 또한 적합할 수 있는 E2 영역에서 특정 에피토프를 결정하는 것이 가능할 수 있음이이해될 것이다.
본 발명은 또한, 생물학적 샘플 중에 존재하는 HCV 의 하나 이상의 혈청학적 유형을 검출하기 위한, 더욱 구체적으로는 적어도 하기 단계를 포함하는 하나의 포멧으로 조합하여 검출되는 상이한 유형의 HCV 의 항체를 검출하기 위한 혈청형분석 에 관한 것이다:
(i) 하나 이상의 혈청학적 유형의 HCV 항체의 존재에 대하여 분석될 생물학적 샘플과, 하나 이상의 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질 조성물 또는 상술한 하나 이상의 E1 또는 E2 펩티드 조성물을, 바람직하게는 부동화 형태로 면역 복합체의 형성을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 접촉시키는 단계;
(ii) 결합되지 않은 성분을 제거하는 단계,
(iii) 이질성 항체와 함께 형성된 면역 복합체를 배양하는 단계로서, 상기 이질성 항체가 적절한 조건 하에서 검출가능한 표지에 공액된 것인 단계,
(iv) 상기 면역 복합체의 존재를 가시적으로 또는 기계적으로 (예컨대, 밀도측정계, 형광측정계, 비색계에 의해서) 검출하는 단계 및 관찰된 결합 패턴으로부터 하나 이상의 HCV 혈청학적 유형의 존재를 추론하는 단계.
상기 방법에 사용되는 단백질 또는 펩티드의 조성은 재조합 발현 유형-특이적 외피 단백질 또는 유형-특이적 펩티드임이 이해될 것이다.
본 발명은 또한, 하기를 포함하는, 생물학적 시료 중에 존재하는 하나 이상의 혈청학적 유형의 HCV 를 혈청형분석하기 위한, 더욱 구체적으로는 상기 HCV 의 혈청학적 유형에 대한 항체를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다:
- 하나 이상의 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질, 또는 상기 정의된 E1 또는 E2 펩티드;
- 완충제 또는 이들 단백질 또는 펩티드와 생물학적 샘플 중에 존재하는 항-E1 항체 사이의 결합 반응을 가능하게 하는 완충제를 제조하기 위해 요구되는 성분,
- 상기 결합 반응에서 형성된 면역 복합체를 검출하기 위한 수단,
- 가능하게는, 관찰된 결합 패턴으로부터 하나 이상의 혈청학적 유형의 존재를 검출하기 위한 자동화 스캐닝 및 해석 장치를 또한 포함함.
본 발명은 또한, 상기 정의된 방법에 따라 HCV 의 유전자형의 존재를 결정하기 위해, 고체 기질 상에서의 부동화 및 역상 하이브리드형성 검사로의 혼입을 위한, 바람직하게는 막 스트립과 같은 고체 지지체 상으로의 평행선으로서의 부동화를 위한, 상기 정의된 펩티드 또는 단백질 조성물의 용도에 관한 것이다. 다른 HCV 폴리프로테인 영역 유래의 다른 유형-특이적 항원과 조합하는 것은, 또한 본 발명의 범위 내에 놓인다.
본 발명은, 상기 단백질과 디술피드 결합 절단제 또는 환원제를 접촉시키는 것을 포함하는 재조합 방법에 의해서 제조된 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질로부터 선택된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 외피 단백질을 정제하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 접촉 방법은, 부분적인 절단 또는 환원 조건하에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 디술피드 결합 절단제는, 바람직하게는 0.1 내지 50 mM, 바람직하게는 0.1 내지 20 mM, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 10 mM 의농도 범위의 디티오트레이톨 (DTT)이다. 다르게는, 디술피드 결합 절단제는, 바람직하게는 1 내지 10%, 더욱 바람직하게는 3.5% 의 농도의 세척제, 예컨대 Empigen-BB (즉, 주요 성분으로서 N-도세실-N,N-디메틸글리신을 함유하는 혼합물임) 일 수 있다. 세척제, 디술피드 결합 절단제 및/또는 환원제의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 하나의 구현예에 의하면, 디술피드 결합 개량은 SH 기 블록킹제, 예컨대 N-에틸말레이미드 (NEM) 또는 이의 유도체에 의해 방지될 수 있다. 바람직한 구현예에 의하면, 디술피드 결합 개량은 낮은 pH 조건의 사용에 의해 블록킹될 수 있다.
본 발명은 또한, 하기 단계를 더 포함하는 본원에 기재된 방법을 제공한다: 재조합 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 발현 숙주세포를, 임의로는 SH 블록킹제, 예컨대 N-에틸말레이미드 (NEM) 의 존재하에 용해하는 단계; 항-E1 및/또는 항-E2 특이적 모노클로날 항체를 사용하는 친화 정제에 의해, 예컨대 렌틸-렉틴 크로마토크래피와 같은 렉틴-크로마토그래피 또는 면역친화에 의해서, 상기 HCV 외피 단백질을 회수하는 단계; 디술피드 결합 절단제, 예컨대 DTT, 바람직하게는 또한 SH 블록킹제, 예컨대 NEM 또는 바이오틴-NEM 의 존재하에, 디술피드 결합을 환원 또는 절단하는 단계; 및, 결투과에 의해, 및 임의로 부가적으로는 후속적인 Ni2+-IMAC 클로마토그래피 및 탈염 단계에 의해서, 환원된 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 외피 단백질을 회수하는 단계.
본 발명은, 바람직하게는 본원에 기재된 방법으로부터 딘리된, 실질적으로 단리 및/또는 정제된, 및/또는 단리/또는 정제된, E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 로부터 선택된 재조합 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 외피 단백질을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 재조합 HCV 외피 단백질은 재조합 포유동물 세포, 예컨대 백시니아, 재조합 효모 세포에서 발현되었다.
본 발명은, 작동가능한 조합으로, 벡터서열, 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스 프로모터 서열, 및 단일 또는 특이적 올리고머성 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질의 발현을 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 하나의 구현예에 의하면, 벡터의 뉴클레오타이드 서열은, 아미노산 위치 1 내지 192 의 영역에서 시작하고 아미노산 위치 250 내지 400 사이의 영역에서 끝나는, 더욱 구체적으로는 위치 250 내지 341 사이의 영역에서 끝나는, 훨씬 더 바람직하게는 위치 290 내지 341 사이의 영역에서 끝나는 단일 HCV E1 단백질을 코딩한다. 또다른 구현예에 의하면, 벡터의 뉴클레오타이드 서열은, 아미노산 위치 117 내지 192 의 영역에서 시작하고 아미노산 위치 263 내지 400 사이의 영역에서 끝나는, 더욱 구체적으로는 위치 250 내지 326 사이의 영역에서 끝나는 단일 HCV E1 단백질을 코딩한다. 또다른 구현예에 의하면, 벡터의 뉴클레오타이드 서열은 벡터의 뉴클레오타이드 서열은, 아미노산 위치 264 내지 293 ±8 아미노산 사이의 제 1 의 소수성 도메인의 결실을 갖는 단일 HCV E1 단백질을 코딩한다. 다른 구현예에 의하면, 벡터의 뉴클레오타이드 서열은, 아미노산 위치 290 내지 406 의 영역에서 시작하고 아미노산 위치 600 내지 820 사이의 영역에서 끝나는, 더욱 구체적으로는 위치 322 내지 406 사이의 영역에서 시작하고, 훨씬 더 바람직하게는위치 347 내지 406 사이의 영역에서 시작하고, 가장 바람직하게는 위치 364 내지 406 사이의 영역에서 시작하고; 바람직하게는 아미노산 위치 623, 650, 661, 673, 710, 715, 720, 746 또는 809 중 임의의 것으로 끝나는 단일 HCV E2 단백질을 코딩한다. 하나의 구현예에 의하면, 본 발명의 벡터는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 5'-말단 ATG 코돈 및 3'-말단 종결 코돈을 함유한다. 또한, 하나의 구현예에 의하면, 벡터는 인자 Xa 절단 부위 및/또는 3 내지 10 개, 바람직하게는 6 개의 코딩 영역의 3'-말단에 연결된 히스티딘 코돈을 더 포함한다. 본 발명의 벡터는 임의로는 E1 또는 E2 단백질 내에 존재하는 하나 이상의 글리코실화 부위가 핵산 수준에서 제거된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명은, 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 49 중 임의의 것 또는 이의 일부를 포함하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 벡터는 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 49 중 임의의 것 또는 이의 일부를 포함하는 핵산을 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 조성물은 본원에 기재된 발현 산물이거나 그를 발현하는 재조합 HCV 외피 단백질을 더 포함한다.
본 발명은, 본원에 기재된 하나 이상의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하며, 이때 상기 벡터는, 숙주 세포에 조작가능하게 연결되고 HCV E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질의 발현을 조절할 수 있는 조절 서열 외에, 본원에 기재된 HCV E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.또한, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포에 의해서 발현되는 재조합 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 를 제공한다.
본 발명은 또한, 하기의 단계를 포함하는, 본원에 기재된 방법을 제공한다: 본원에 기재된 재조합 벡터로 형질전환된 본원에 기재된 숙주세포를 적당한 배양배지 중에서 성장시키는 단계; 적절한 조건 하에서, 본원에 기재된 바와 같이, 벡터의 벡터 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도하는 단계; 형질전환된 숙주세포를, 바람직하게는 SH 기 블록킹제, 예컨대 N-에틸말레이미드 (NEM) 의 존재하에 용해하는 단계; 항-E1 및/또는 항-E2 특이적 모노클로날 항체를 사용하여, 친화 정제에 의해, 예컨대 렌틸-렉틴 크로마토크래피와 같은 렉틴-크로마토그래피 또는 면역친화 크로마토그래피에 의해서, 상기 HCV 외피 단백질을 회수하는 단계 (상기 렉틴은 바람직하게는 렌틸-렉틴이다); 디술피드 결합 절단제, 예컨대 DTT 와 함께, 바람직하게는 또한 SH 블록킹제, 예컨대 NEM 또는 바이오틴-NEM 의 존재하에, 상기 전 단계의 용출액을 배양하는 단계; 및, 결투과에 의해, 및 가능하게는 또한 부가적인 Ni2+-IMAC 클로마토그래피 및 탈염 단계에 의해서, HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질을 단리하는 단계.
본 발명은, 하기 E1 및/또는 E2 펩티드 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다:
코어/E1 V1 영역의 아미노산 181 내지 200 에 놓여있는 E1-31 (서열번호 56),
E1 영역의 아미노산 193 내지 212 에 놓여있는 E1-33 (서열번호 57),
E1 V2 영역의 아미노산 205 내지 224 에 놓여있는 E1-35 (서열번호 58) (에피토프 B),
E1 V2 영역의 아미노산 208 내지 227 에 놓여있는 E1-35A (서열번호 59) (에피토프 B),
E1 영역 (V1, C1 및 V2 영역 (에피토프 B 포함)) 의 아미노산 192 내지 228 에 놓여있는 1bE1 (서열번호 53),
E1 영역의 아미노산 301 내지 320 에 놓여있는 E1-51 (서열번호 66),
E1 C4 영역의 아미노산 313 내지 332 에 놓여있는 E1-53 (서열번호 67) (에피토프 A),
E1 영역의 아미노산 325 내지 344 에 놓여있는 E1-55 (서열번호 68).
E2 영역의 아미노산 위치 397 내지 416 에 놓여있는 Env 67 또는 E2-67 (서열번호 72) (에피토프 A),
E2 영역의 아미노산 위치 409 내지 428 에 놓여있는 Env 69 또는 E2-69 (서열번호 73) (에피토프 A),
E2 영역의 아미노산 위치 583 내지 602 에 놓여있는 Env 23 또는 E2-23 (서열번호 86) (에피토프 E),
E2 영역의 아미노산 위치 595 내지 614 에 놓여있는 Env 25 또는 E2-25 (서열번호 87) (에피토프 E),
E2 영역의 아미노산 위치 607 내지 626 에 놓여있는 Env 27 또는 E2-27 (서열번호 88) (에피토프 E),
E2 영역의 아미노산 위치 547 내지 566 에 놓여있는 Env 17B 또는 E2-17B (서열번호 83) (에피토프 D),
E2 영역의 아미노산 위치 523 내지 542 에 놓여있는 Env 13B 또는 E2-13B (서열번호 82) (에피토프 C),
본 발명은 하기 E2 형태적 에피토프 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다:
모노클로날 항체 15C8C1, 12D11F1 및 8G10D1H9 에 의해서 인식되는 에피토프 F,
모노클로날 항체 9G3E6 에 의해 인식되는 에피토프 G,
모노클로날 항체 10D3C4 및 4H6B2 에 의해 인식되는 에피토프 H (또는 C), 또는
모노클로날 항체 17F2C2 에 의해 인식되는 에피토프 I.
본 발명은 본원에 기재된 조성물에 의한 면역시에 상승되는 E1 및/또는 E2 특이적 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 HCV E1 또는 E2 항원의 존재를 검출하기 위한 면역 검사 키트로의 혼입을 위한, 질환의 예후/모니터링을 위한, 또는 HCV 치료를 위한 약물로서 사용될 수 있다. 본 발명은, HCV E1 또는 E2 항원의 존재를 검출하기 위한 면역 검사 키트의 제조를 위한, HCV 질환의 예후/모니터링을 위한 키트의 제조를 위한, 또는 HCV 약물의 제조를 위한, 본원에 기재된 E1 및/또는 E2 특이적 모노클로날 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은, 하기 단계를 포함하는, 생물학적 샘플내에 존재하는 HCV 항원의 실험관내 진단을 위한 방법을 제공한다:
(i) 바람직하게는 면역 복합체를 형성시킬 수 있는 적절한 조건하에서, 부동화 형태로, 상기 생물학적 샘플을 본원에 기재된 E1 및/또는 E2 특이적 모노클로날 항체와 접촉시키는 단계;
(ii) 결합되지 않은 성분을 제거하는 단계,
(iii) 이질성 항체와 함께 형성된 면역 복합체를 배양하는 단계로서, 상기 이질성 항체가 적절한 조건 하에서 검출가능한 표지에 공액된 것인 단계,
(iv) 상기 면역 복합체의 존재를 가시적으로 또는 기계적으로 검출하는 단계.
본 발명은, 적어도 하기를 포함하는, 생물학적 샘플 중에 존재하는 HCV 항원의 존재를 결정하기 위한 키트를 제공한다: 고체 기질 상에 바람직하게는 부동화된 형태의, 본원 기재된 하나 이상의 E1 및/또는 E2 특이적 모노클로날 항체; 완충제 또는 상기 항체 및 생물학적 샘플내에 존재하는 HCV 항원 사이의 결합 반응을 가능하게 하는 완충제를 제공하기 위한 성분, 및 임의로는 상기 결합 반응에서 형성된 면역 복합체를 검출하기 위한 수단.
본 발명의 조성물은 의약의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명은, 면역 반응을 생성하기 위해, 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 수반한 상기 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물, 바람직하게는 인간을 HCV 에 대해 면역시키기 위한 백신으로서 사용하기 위한 본원에기재된 조성물을 제공한다.
본 발명은, 면역 반응을 생성하기 위해, 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 수반한 상기 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물, 바람직하게는 인간을 HCV 에 대해 면역시키기 위한 백신의 제조를 위한, 본원에 기재된 조성물의 사용방법을 제공한다.
본 발명은, 임의로는 또한 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 수반한 본원에 기재된 조성물을 포함하는 E1 및/또는 E2 를 함유하는 조성물의 유효량을 포함하는, 포유동물, 바람직하게는 인간을 HCV 에 대해 면역시키기 위한 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은, 생물학적 샘플 내에 존재하는 HCV 항체의 실험관내 검출을 위한 형태로 제공될 수 있다. 본 발명은 또한, 생물학적 샘플 중에 존재하는 HCV 항체의 검출을 위한 면역검사 키트의 제조 방법, 및 생물학적 샘플 내에 존재하는 HCV 항체를 진단하기 위한 본 발명의 조성물을 사용하여 생물학적 샘플 중에 존재하는 HCV 항체의 검출 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 방법은 적어도 하기 단계를 포함한다:
(i) 바람직하게는 생물학적 샘플 중에 존재하는 HCV 항체와 면역 복합체를 형성시킬 수 있는 적절한 조건하에서, 부동화 형태로, 상기 생물학적 샘플을 본원에 기재된 조성물과 접촉시키는 단계;
(ii) 결합되지 않은 성분을 제거하는 단계,
(iii) 이질성 항체와 함께 형성된 면역 복합체를 배양하는 단계로서, 상기이질성 항체가 적절한 조건 하에서 검출가능한 표지에 공액된 것인 단계,
(iv) 상기 면역 복합체의 존재를 가시적으로 또는 기계적으로 검출하는 단계.
본 발명은, 하기를 포함하는, 생물학적 샘플 중에 존재하는 HCV 항체의 존재를 결정하기 위한 키트를 제공한다: 고체 기질 상에 바람직하게는 부동화된 형태의, 본원 기재된 하나 이상의 펩티드 또는 단백질 조성물; 완충제 또는 상기 단백질 또는 펩티드와 생물학적 샘플내에 존재하는 HCV 에 대한 항체 사이의 결합 반응을 가능하게 하는 완충제를 제조하기 위한 성분; 및 임의로는 상기 결합 반응에서 형성된 면역 복합체를 검출하기 위한 수단.
본 발명은, HCV 질환의 실험관내 모니터링 방법 또는 HCV 감염으로 고생하는 환자의 치료, 바람직하게는 인터페론 치료에 대한 반응의 진단 방법으로서, 하기를 포함하는 방법을 제공한다: 면역학적 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 E1 단백질 또는 이의 적합한 부분과 함께, HCV 감염을 갖는 환자 유래의 생물학적 샘플을 배양하는 단계; 결합되지 않은 성분을 제거하는 단계; 치료 개시 및 동안에 샘플에 존재하는 항-E1 역가를 계산하는 단계; HCV 질환의 본래 과정을 모니터링하거나, 치료의 개시 및/또는 동안에 샘플 중에 존재하는 항-E1 역가의 양에 기초하여 환자의 치료에 대한 반응을 모니터링하는 단계.
본 발명은 HCV 질환의 모니터링, 또는 HCV 감염으로 고생하는 환자의 치료, 구체적으로는 인터페론 치료에 대한 반응의 예후를 위한 키트로서, 하기를 포함하는 키트를 제공한다: 하나 이상의 E1 단백질 또는 E1 펩티드, 더욱 구체적으로는본원에 기재된 E1 단백질 또는 E1 펩티드; 완충제 또는 상기 단백질 또는 펩티드와 생물학적 샘플내에 존재하는 항-E1 항체 사이의 결합 반응을 가능하게 하는 완충제를 제조하기 위한 성분; 및 임의로는 상기 결합 반응에서 형성된 면역 복합체를 검출하기 위한 수단; 또한 임의로는, 치료 진행 동안 항-E1 역가의 감소를 추론하기 위한 자동화 스캐닝 및 해석 장치.
본 발명은, 하기를 포함하는, 생물학적 샘플 중에 존재하는 HCV 의 하나 이상의 혈청학적 유형을 검출하기 위한, 더욱 구체적으로는 하나의 검사 포멧에 결합되어 검출되는 HCV 의 상이한 유형의 HCV 의 항체를 검출하기 위한 혈청형분석을 제공한다: (i) 하나 이상의 혈청학적 유형의 HCV 항체의 존재에 대하여 분석될 생물학적 샘플과, 본원에 기재된 하나 이상의 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질 조성물 또는 상술한 하나 이상의 E1 또는 E2 펩티드 조성물을, 바람직하게는 부동화 형태로 면역 복합체의 형성을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 접촉시키는 단계; (ii) 결합되지 않은 성분을 제거하는 단계; (iii) 이질성 항체와 함께 형성된 면역 복합체를 배양하는 단계로서, 상기 이질성 항체가 적절한 조건 하에서 검출가능한 표지에 공액된 것인 단계; 임의로는, (iv) 상기 면역 복합체의 존재를 가시적으로 또는 기계적으로 (예컨대, 밀도측정계, 형광측정계, 비색계에 의해서) 검출하는 단계 및 관찰된 결합 패턴으로부터 하나 이상의 HCV 혈청학적 유형의 존재를 추론하는 단계.
본 발명은, 하기를 포함하는, 생물학적 샘플 중에 존재하는 하나 이상의 혈청학적 유형의 HCV를 혈청형분석하기 위한, 더욱 구체적으로는 상기 혈청학적 유형의 HCV 에 대한 항체를 검출하기 위한 키트를 제공한다: 상기 기재된 하나 이상의 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 단백질, 또는 상기 기재된 E1 또는 E2 펩티드; 완충제 또는 이들 단백질 또는 펩티드와 생물학적 샘플 중에 존재하는 항-E1 항체 사이의 결합 반응을 가능하게 하는 완충제를 제조하기 위해 요구되는 성분; 임의로는, 상기 결합 반응에서 형성된 면역 복합체를 검출하기 위한 수단; 또한, 임의로는, 관찰된 결합 패턴으로부터 하나 이상의 혈청학적 유형의 존재를 검출하기 위한 자동화 스캐닝 및 해석 장치.
본 발명은, 본원에 기재된 방법에 따른 HCV 의 유전자형의 존재를 결정하기 위해, 고체 기질 상에서의 부동화 및 역상 하이브리드형성 검사로의 혼입을 위한, 바람직하게는 막 스트립과 같은 고체 지지체 상으로의 평행선으로서의 부동화를 위한, 본원에 기재된 펩티드 또는 단백질 조성물을 제공한다.
본 발명은, 하기의 치료학적 유효량을 함유하거나 포함하는, 치료적 백신 조성물, 예컨대 치료적 HCV 백신 조성물을 제공한다: E1 단백질, E2 단백질, 상기 E1 및 E2 단백질의 일부, 정제된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 E1 또는 E2 단백질 또는 이의 일부로부터 형성된 E1/E2 단백질 복합체로부터 선택된 하나 이상의 정제된 재조합 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 외피 단백질; 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 함유하는 조성물. 본 발명의 또다른 치료적 백신 조성물, 예컨대 치료적 HCV 백신 조성물은, 상이한 HCV 유전자형 또는 아형으로부터 유래된 E1 단백질, 상이한 HCV 유전자형 또는 아형으로부터 유래된 E2 단백질, 상기 E1 및 E2 단백질의 부분, 및 상이한 HCV 유전자형 또는 아형으로부터유래된 정제된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 E1 또는 E2 단백질 또는 이의 일부로부터 형성된 E1/E2 단백질 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 정제된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 외피 단백질; 및 임의로는, 약학적으로 허용가능한 아쥬반트의 조합의 치료학적 유효량을 포함할 수 있다.
본 발명의 백신의 HCV 외피 단백질, 또는 더욱 구체적으로 HCV 백신은, 재조합 포유동물 세포에 의해서, 재조합 효모 세포에 의해서, 또는 재조합 바이러스에 의해 또는 그를 통해 임의로 제조된다. 본 발명은, 하기 E1 및 E2 펩티드 중 하나 이상을 포함하는 조성물의 유효량을 함유하거나 포함하는, 치료적 백신 조성물, 예컨대 치료적 HCV 백신 조성물을 제공한다:
코어/E1 V1 영역의 아미노산 181 내지 200 에 놓여있는 E1-31 (서열번호 56),
E1 영역의 아미노산 193 내지 212 에 놓여있는 E1-33 (서열번호 57),
E1 V2 영역의 아미노산 205 내지 224 에 놓여있는 E1-35 (서열번호 58) (에피토프 B),
E1 V2 영역의 아미노산 208 내지 227 에 놓여있는 E1-35A (서열번호 59) (에피토프 B),
E1 영역 (V1, C1 및 V2 영역 (에피토프 B 포함)) 의 아미노산 192 내지 228 에 놓여있는 1bE1 (서열번호 53),
E1 영역의 아미노산 301 내지 320 에 놓여있는 E1-51 (서열번호 66),
E1 C4 영역의 아미노산 313 내지 332 에 놓여있는 E1-53 (서열번호 67) (에피토프 A),
E1 영역의 아미노산 325 내지 344 에 놓여있는 E1-55 (서열번호 68),
E2 영역의 아미노산 위치 397 내지 416 에 놓여있는 Env 67 또는 E2-67 (서열번호 72) (에피토프 A),
E2 영역의 아미노산 위치 409 내지 428 에 놓여있는 Env 69 또는 E2-69 (서열번호 73) (에피토프 A),
E2 영역의 아미노산 위치 583 내지 602 에 놓여있는 Env 23 또는 E2-23 (서열번호 86) (에피토프 E),
E2 영역의 아미노산 위치 595 내지 614 에 놓여있는 Env 25 또는 E2-25 (서열번호 87) (에피토프 E),
E2 영역의 아미노산 위치 607 내지 626 에 놓여있는 Env 27 또는 E2-27 (서열번호 88) (에피토프 E),
E2 영역의 아미노산 위치 547 내지 566 에 놓여있는 Env 17B 또는 E2-17B (서열번호 83) (에피토프 D),
E2 영역의 아미노산 위치 523 내지 542 에 놓여있는 Env 13B 또는 E2-13B (서열번호 82) (에피토프 C),
E1 영역의 위치 192 내지 211 에 놓여있는 IGP 1626 (서열번호 112),
E1 영역의 위치 204 내지 223 에 놓여있는 IGP 1627 (서열번호 113),
E1 영역의 위치 216 내지 235 에 놓여있는 IGP 1628 (서열번호 114),
E1 영역의 위치 228 내지 247 에 놓여있는 IGP 1629 (서열번호 115),
E1 영역의 위치 240 내지 259 에 놓여있는 IGP 1630 (서열번호 116),
E1 영역의 위치 252 내지 271 에 놓여있는 IGP 1631 (서열번호 117),
E1 영역의 위치 264 내지 283 에 놓여있는 IGP 1632 (서열번호 118),
E1 영역의 위치 276 내지 295 에 놓여있는 IGP 1633 (서열번호 119),
E1 영역의 위치 288 내지 307 에 놓여있는 IGP 1634 (서열번호 120),
E1 영역의 위치 300 내지 319 에 놓여있는 IGP 1635 (서열번호 121), 및
E1 영역의 위치 312 내지 331 에 놓여있는 IGP 1636 (서열번호 122).
이때, 상기 펩티드는 재조합 또는 합성 기원일 수 있고, 임의로는 치료적으로 허용가능한 아쥬반트와 결합된다.
상기 기재된 임의의 치료적 백신 조성물은 또한 치료적 HCV 백신 조성물로서 또는 치료제 조성물 또는 치료제 HCV 조성물로서, 또는 조성물 또는 HCV 조성물로서 고려되거나 간주될 수 있다.
본 발명은, 본원에 기재된 조성물, 예컨대 상기 기재된 백신 또는 치료제 조성물, 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트의 유효량을 투여하는 것으로 포함하는, HCV 에 감염딘 포유동물, 예컨대 인간의 치료방법을 제공하는 것이다. 하나의 구현예에 의하면, 본 발명의 조성물은, 본 발명의 조성물의 투여 바로 전 또는 후에 또는 투여와 함께, 항바이러스 치료와 조합하거나 동시에 병용하여 투여된다. 본 발명의 임의의 조성물, 예컨대 치료적 HCV 백신 조성물은 HCV 에 만성 감염된 포유동물 ("만성 HCV-감염된 포유동물") 의 치료를 위해 사용될 수 있음이 명백하다.
본 발명은, E1 단백질 및 E2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 정제된 재조합 HCV 재조합 외피 단백질 및 임의로는 아쥬반트를 함유하거나 포함하는 조성물, 예컨대 치료제 HCV 조성물 또는 HCV 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에 의하면, 조성물은 하기의 E1 및 E2 펩티드 중 하나 이상을 포함한다:
코어/E1 V1 영역의 아미노산 181 내지 200 에 놓여있는 E1-31 (서열번호 56),
E1 영역의 아미노산 193 내지 212 에 놓여있는 E1-33 (서열번호 57),
E1 V2 영역의 아미노산 205 내지 224 에 놓여있는 E1-35 (서열번호 58) (에피토프 B),
E1 V2 영역의 아미노산 208 내지 227 에 놓여있는 E1-35A (서열번호 59) (에피토프 B),
E1 영역 (V1, C1 및 V2 영역 (에피토프 B 포함)) 의 아미노산 192 내지 228 에 놓여있는 1bE1 (서열번호 53),
E1 영역의 아미노산 301 내지 320 에 놓여있는 E1-51 (서열번호 66),
E1 C4 영역의 아미노산 313 내지 332 에 놓여있는 E1-53 (서열번호 67) (에피토프 A),
E1 영역의 아미노산 325 내지 344 에 놓여있는 E1-55 (서열번호 68),
E2 영역의 아미노산 위치 397 내지 416 에 놓여있는 Env 67 또는 E2-67 (서열번호 72) (에피토프 A),
E2 영역의 아미노산 위치 409 내지 428 에 놓여있는 Env 69 또는 E2-69 (서열번호 73) (에피토프 A),
E2 영역의 아미노산 위치 583 내지 602 에 놓여있는 Env 23 또는 E2-23 (서열번호 86) (에피토프 E),
E2 영역의 아미노산 위치 595 내지 614 에 놓여있는 Env 25 또는 E2-25 (서열번호 87) (에피토프 E),
E2 영역의 아미노산 위치 607 내지 626 에 놓여있는 Env 27 또는 E2-27 (서열번호 88) (에피토프 E),
E2 영역의 아미노산 위치 547 내지 566 에 놓여있는 Env 17B 또는 E2-17B (서열번호 83) (에피토프 D),
E2 영역의 아미노산 위치 523 내지 542 에 놓여있는 Env 13B 또는 E2-13B (서열번호 82) (에피토프 C),
E1 영역의 위치 192 내지 211 에 놓여있는 IGP 1626 (서열번호 112),
E1 영역의 위치 204 내지 223 에 놓여있는 IGP 1627 (서열번호 113),
E1 영역의 위치 216 내지 235 에 놓여있는 IGP 1628 (서열번호 114),
E1 영역의 위치 228 내지 247 에 놓여있는 IGP 1629 (서열번호 115),
E1 영역의 위치 240 내지 259 에 놓여있는 IGP 1630 (서열번호 116),
E1 영역의 위치 252 내지 271 에 놓여있는 IGP 1631 (서열번호 117),
E1 영역의 위치 264 내지 283 에 놓여있는 IGP 1632 (서열번호 118),
E1 영역의 위치 276 내지 295 에 놓여있는 IGP 1633 (서열번호 119),
E1 영역의 위치 288 내지 307 에 놓여있는 IGP 1634 (서열번호 120),
E1 영역의 위치 300 내지 319 에 놓여있는 IGP 1635 (서열번호 121), 및
E1 영역의 위치 312 내지 331 에 놓여있는 IGP 1636 (서열번호 122).
이때, 상기 펩티드는 재조합 또는 합성 기원일 수 있고, 임의로는 치료적으로 허용가능한 아쥬반트와 결합된다.
본 발명의 또다른 조성물, 예컨대 치료제 HCV 조성물 또는 HCV 조성물은, 상이한 HCV 유전자형 또는 아형으로부터 유래된 E1 단백질, 상이한 HCV 유전자형 또는 아형으로부터 유래된 E2 단백질, 상기 E1 및 E2 단백질의 부분, 및 상이한 HCV 유전자형 또는 아형으로부터 유래된 정제된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 E1 또는 E2 단백질 또는 이의 일부로부터 형성된 E1/E2 단백질 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 정제된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 외피 단백질; 및 임의로는, 약학적으로 허용가능한 아쥬반트의 조합의 치료학적 유효량을 포함할 수 있다.
본 발명은, HCV-특이적 항체를 유도하기 위한, 또는 T-세포 활성을 자극하기 위한, 또는 시토카인 분비 또는 시토카인 제조를 자극하기 위한, 치료제 조성물 또는 치료적 백신 조성물 또는 조성물을 제공한다. 본 발명은, HCV-특이적 항체를 유도하기 위한, 또는 T-세포 활성을 자극하기 위한, 또는 시토카인 분비 또는 시토카인 제조를 자극하기 위한, 치료제 HCV 조성물 또는 치료적 HCV 백신 조성물 또는 HCV 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물, 예컨대 치료적 HCV 백신 조성물 또는 치료제 HCV 조성물은 또한, 상기 E1, E2 또는 E1/E2 단백질 복합체가 유래되는 HCV 유전자형과상이한 HCV 유전자형 또는 HCV 유전자형에 감염된 HCV 보균자에 있어서 치료학적으로 효과적이다.
재조합 HCV 외피 단백질은 재조합 포유동물 세포에 의해서 생성될 수 있고, 재조합 HCV 외피 단백질은 재조합 효모 세포에 의해서 생성되거나, 재조합 바이러스에 의해 또는 그를 통해 생성된다. 본 발명은 본원에 기재된 조성물, 예컨대 치료적 HCV 백신 조성물 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 HCV 에 감염된 포유동물, 예컨대 인간의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 임의의 조성물이 만성 HCV 감염 포유동물의 치료에 사용될 수 있음이 명백할 것이다. 본 발명은, HCV-특이적 항체를 유도하기 위한, T-세포 활성을 자극하기 위한, 또는 시토카인 분비 또는 시토카인 제조를 위한 치료제 조성물을 제공하며, 상기 조성물은, E1 단백질 및 E2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 정제된 재조합 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 외피 단백질 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 포함한다.
특히, 본 발명에 따른 임의의 조성물 (백신 조성물 및 치료제 조성물 포함) 은, 상기 재조합 HCV 외피 단백질의 시스테인이 블록킹된 재조합 HCV 외피 단백질을 포함할 수 있거나, E1 또는 E2 펩티드의 시스테인이 블록킹된 E1 및/또는 E2 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에 의하면, 본 발명에 따른 조성물 (백신 조성물 및 치료제 조성물 포함) 은, 상기 조성물에 바이러스-유사 입자 (VLP) 로서 첨가되는재조합 HCV 외피 단백질을 포함할 수 있다.
다른 구현예에 의하면, 본 발명의 조성물, 예컨대 치료적 HCV 백신 조성물은 재조합 HCV E1 외피 단백질로서 E1s 단백질을 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 상기 E1s 단백질은 서열번호 123 에 의해 정의된다.
본 발명의 또다른 양태는, E1 단백질 및/또는 E2 단백질, 및 상기 E1 및 E2 단백질의 일부로부터 선택된 하나 이상의 HCV 재조합 외피 단백질의 발현을 가능하게 하는 재조합 바이러스 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 포함하는, 면역원성 조성물, 특히 HCV 면역원성 조성물에 관한 것이다.
또다른 양태에 의하면, 본 발명은, E1 단백질 및/또는 E2 단백질, 및 상기 E1 및 E2 단백질의 일부로부터 선택된 하나 이상의 HCV 재조합 외피 단백질의 발현을 가능하게 하는 재조합 바이러스 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 포함하는, 백신 조성물, 예컨대 HCV 백신 조성물을 고려한다.
하나의 구현예에 의하면, 상기 재조합 바이러스 조성물은 상기 E1 단백질 및/또는 E2 단백질 또는 이의 상기 일부가 유래되는 HCV 유전자형 또는 아형과는 상이한 HCV 유전자형 또는 아형에 대항해 효과적일 수 있다.
또다른 구현예에 의하면, 상기 재조합 바이러스 조성물은, HCV-특이적 항체를 유도하기 위해, 또는 T-세포 활성을 자극하기 위해, 또는 시토카인 또는 시토카인 생성을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
재조합 바이러스 조성물에 대한 또다른 구현예에 의하면, 상기 재조합 바이러스는 백시니아 바이러스, 재조합 아비폭스 바이러스 또는 재조합 안카라 변형 바이러스이다.
본 발명의 또다른 양태는, 상기한 재조합 백신 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, HCV 에 감염된 포유동물의 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 임의의 상기 양태에 있어서 상기 포유동물은 특히 인간일 수 있다.
본 발명의 하나의 다른 양태는, 포유동물 또는 인간에게 치료적 백신을 투여하는 것을 포함하는, 만성 HCV 감염 포유동물 또는 인간에서 간 질환의 완화 방법에 관한 것이다.
또다른 양태에 의하면, 치료적 백신을 포유동물 또는 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 만성 HCV 감염 포유동물 또는 인간에서 간 섬유증 진행의 완화 방법이 포함된다.
다른 양태는, 치료적 백신을 포유동물 또는 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 만성 HCV 감염 포유동물 또는 인간에서 간 지방증의 완화 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 양태는, 포유동물 또는 인간에게 치료적 백신을 투여하는 것을 포함하는, 만성 HCV 감염 포유동물 또는 인간에서 전체 Ishak 스코어 또는 Ishak 활성 스코어에 따른 2 이상의 포인트로 간 질환을 완화시키는 방법을 구현한다.
또다른 양태는, 포유동물 또는 인간에게 치료적 백신을 투여하는 것을 포함하는, 만성 HCV 감염 포유동물 또는 인간에서 Ishak 섬유증 스코어에 따른 1 이상의 포인트로 간 질환 또는 간 섬유증을 완화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는, 포유동물 또는 인간에게 치료적 백신을 투여하는 것을 포함하는, 만성 HCV 감염 포유동물 또는 인간에서 혈청 ALT 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 양태는, 포유동물 또는 인간에게 치료적 백신을 투여하는 것을 포함하는, 만성 HCV 감염 포유동물 또는 인간의 간에서 항-E1 및/또는 항-E2 면역반응성을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물, 예컨대 치료적 HCV 백신 조성물의 임의의 복수 분량을 포유동물 또는 인간에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 복수 분량이 구체화된 시간 간격으로 분리되어 상기 포유동물 또는 인간에게 투여되는, 만성 HCV-감염 포유동물 또는 인간의 치료 방법 또한 본 발명에 포함된다. 따라서, 만성 HCV 감염 보균자의 치료를 위한 상기의 복수 투여는, 예를 들어 4주 미만의 시간 간격에 의해 분리될 수 있다. 따라서, 상기 시간 간격은 1 또는 1.5 또는 2 또는 2.5 또는 3 또는 3.5 또는 4 주일 수 있거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28 일일 수 있다. 특히, 만성 HCV 포유동물 또는 인간의 상기 치료 방법은, 본 발명의 조성물, 예컨대 치료적 HCV 백신 조성물을 포유동물 또는 인간에게 복수 투여하는 것을 포함하고, 상기 투여는 3 주의 시간 간격으로 분리된다. 다른 구현예에 의하면, 상기 복수 투여는 5 회 이상의 투여 후 12 주 이상 동안 투여하지 않는 1차 시리즈 후, 3 회 투여 이상의 2차 투여로 이루어진다. 특히, 투여 시리즈는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 이상의 투여를 포함할 수 있다. 투여하지 않는 기간은적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 주 또는 그 이상일 수 있다.
또한, 본 발명의 임의의 조성물, 예컨대 HCV 백신 조성물은 상기 기재된 각종 방법에서 목적하는 임의의 효과를 수득하기 위해 사용될 수 있다. 상술한 방법에서 적용되는 상기 치료적 백신은, 본 발명의 임의의 조성물, 예컨대 치료적 HCV 백신 조성물일 수 있다.
상기 개요된 임의의 방법에서 사용을 위한 또는 상기 개요된 각종 방법에서 목적하는 임의의 효과를 수득하기 위해 사용되는 조성물, HCV 조성물, 백신, HCV 백신, 치료적 백신 또는 치료적 HCV 백신의 제조를 위한, 상기 상세한 설명을 통해 개요된 HCV E1/E2 단백질 또는 이의 일부 또는 E1/E2 펩티드의 사용은, 본 발명에 의해 또한 고려된다.
임의의 상기 방법에 있어서, 상기 치료적 백신은, 하나 이상의 HCV 항원, 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트, 예컨대 알룸을 포함한다. 이에 대한 하나의 구현예에 의하면, 상기 HCV 항원은 E1 또는 E2 항원, 또는 E1 또는 E2 항원의 면역원성 부분이다. E1s 항원인 것으로서 HCV 항원을 언급하면, E1s 항원은 서열번호 123 에 의해 정의된다.
용어 "간 질환" 은, 본 명세서에서, 염증, 섬유증, 간경변, 괴사, 괴사-염증 및 간세포암을 포함하는 C형 간염 바이러스에 의한 감염에 의해 유발되는 임의의 비정상적 간 병상을 의미한다.
"지방증" 은 전신 질환, 독성 또는 약물-유도 간 상처, 및 C형 간염 감염,윌슨 질환 및 갈락토스혈증을 포함하는 각종 특이적 간 질환의 폭넓은 의미에서 간 관련 지표인 간세포에 있어서의 지방 축적의 조직학적 특성을 의미한다.
"간 질환의 완화" 는 간 질환 상태의 임의의 안정화 또는 완화를 의미한다. 간질환은, 예를 들어 Knodell 스코어링계 또는 Ishak 에 의한 수정된 Knedell 스코어링계에 의해서 결정될 수 있다. 상기 스코어의 2 포인트 감소는 각종 연구에서 치료학적으로 유용한 효과로서 수용된다 (예를 들어, Shiffman 1999 의 표 2 에 나타낸 1996 년 이후에 공개된 연구 참조).
"간 섬유증 진행의 완화" 는 간 섬유증의 정상적으로 예상되는 진행의 임의의 감속, 정지 또는 역행을 의미한다. 간 섬유증 진행은 예를 들어 Metavir 스코어링계에 의해서 결정될 수 있다. 상기 계에 따른 간 섬유증의 정상적으로 예상되는 진행은 해마다 약 0.133 의 비치료 만성 HCV 환자의 Metavir 스코어의 증가인 것으로 공개되었다 (Poynard 등, 1997). 섬유증은, 말초동모양혈관 (perisinusoidal) 섬유증을 포함하는 Metavir 또는 Ishak 계에 의해 스코어링된 섬유증의 임의의 형태를 포함하는 것으로 고려된다.
용어 "HCV 항원" 은 하나 이상의 T 세포 에피토프 또는 B 세포 에피토프를 포함하는 임의의 HCV 단백질 또는 이의 절편을 의미한다.
본 발명의 다른 구현예는, 하기를 포함하는, 만성 HCV 감염 포유동물 또는 인간에서 간 질환의 변화의 예측 방법을 제공한다:
(i) E1 항원을 포함하는 HCV 백신 조성물에 의한 치료적 백신화 전에 혈청 항-E1 항체 수준의 수준 결정 단계;
(ii) E1 항원을 포함하는 HCV 백신 조성물에 의한 치료적 백신화 후에 혈청 항-E1 항체 수준의 수준 결정 단계;
(iii) (i) 및 (ii) 에서 결정된 혈청 항-E1 항체 수준의 수준 차이를 추론하고, 이로부터 간 질환의 변화를 예측하는 단계.
(ii) 에서 측정된 값 - (i) 에서 측정된 값으로서 계산된, 혈청 항-E1 항체 수준의 유의적으로 높고 긍정적인 수준 차이는, 긍정적인 예상, 즉 간 질환도가 감소할 것이라는 예상으로 균형이 기울어질 것이라는 것이 당업자에게 명백하다. 또한, 지속된 유의적으로 높은 긍정적인 차이는 감소된 간 질환의 예상의 긍정적인 특성에 추가할 수 있다. 그러나, 상기 차이가 유의적이지 않게 높거나, 0 이거나, 부정적이거나, 한 시점에서만 유의적으로 높고 긍정적이지만 지속적이지 않다면, 이는 부정적인 예상, 즉 간 질환도가 변화되지 않거나 증가할 것이라는 예상으로 균형이 기울어질 것이다. 항-E1 항체의 지속적으로 높은 혈청 수준은, 예컨대 3 주의 짧은 시간 간격을 갖는 투여로 이루어진 초기 감작 시리즈 후, 투여가 없는 기간 후의 새로운 시리즈의 면역의 투여에 의한, 또는 예컨대 6 주의 큰 시간 간격을 갖는 면역을 반복하는 것에 의한 추가적인 면역을 통해 성취될 수 있을 것이다.
실시예 1: C형 간염 바이러스 E1 단백질의 클로닝 및 발현
1. 백시니아 바이러스 재조합 벡터의 구축
pgptATA18 백시니아 재조합 플라스미드는, 백시니아 바이러스 I3 중기 프로모터의 제어하에 E.coli 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 유전자를 함유하는 부가적인 삽입부를 갖는 pATA18 (Stunnenberg 등, 1988) 의 변형된 형태이다. 플라스미드 pgsATA18 은 3 개의 리딩 프레임 중에 종결 코돈을 포함하는 서열번호 1/94 를 갖는 올리고뉴클레오타이드 연결자를 Pst I 및 HindIII-절단 pATA18 벡터에 삽입하는 것에 의해 구축되었다. 이는 여분의 PacI 제한효소 부위를 생성하였다 (도 2). 본래의 HindIII 부위는 저장되지 않는다.
서열번호 1/94 를 갖는 올리고뉴클레오타이드 연결자:
재조합 단백질에 융합된 가공 히스티딘 신장부의 Ni2+킬레이트화에 의해서 신속하고 효율적인 정제를 용이하게 하기 위하여, 부가적인 카르복시 말단 히스티딘 태그를 갖는 분비 단백질을 발현하도록 백시니아 재조합 벡터 pMS66 를 고안하였다. 블런트 말단 (Sam I, Stu I 및 Pml I/Bbr PI) 를 생성하는 3 개의 제한효소에 대한 독특한 부위를 포함하는, 서열번호 2/95 를 갖는 올리고뉴클레오타이드 연결자는, 임의의 cDNA 의 카르복시 말단 종결부가 프로테아제 인자 Xa 절단 부위를 코딩하는 서열 뒤에 6 개의 히스티딘 및 2 개의 종결 코돈을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프레임에 삽입되도록 합성되었다 (새로운 PacI 제한효소 부위가 또한 3' 말단 하류에 생성되었다). 서열번호 2/95 를 갖는 상기 올리고뉴클레오타이드는 pgptATA18 의 Xma I 및 Pst I 부위 사이에 도입되었다 (도 3).
서열번호 2/95 를 갖는 올리고뉴클레오타이드 연결자:
E.coli MC1061 (lambda) 내에 포함된 플라스미드 pgptATA-18 는, 부다페스트 조약 하에 BCCM/LMBP (Belgian Coordinated Collection of microorganism/Laboratorium voor Moleculaire Biologie - Plasmidencollectie, Universiteit Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent, Belgium) 에 기탁하였고, 접근번호 LMBP4486 을 갖는다. 상기 기탁은 2002 년 1월 9일자로 수행되었다.
실시예 2. HCV 재조합 플라스미드의 구축
2.1. E1 단백질의 상이한 형태를 코딩하는 구축물
폴리머라아제 연쇄반응 (PCR) 산물은, RNA 제조 후, 상기 기재된 바와 같은 역전사 및 PCR 에 의해서 혈청 샘플로부터 유도되었다 (Stuyver 등, 1993b). 표 1 은 증폭을 위해 사용되는 개별적인 콜론 및 프라이머의 특성을 나타낸다. PCR 절편은 SmaI 절단 pSP72 (Promega) 플라스미드로 클로닝되었다. 하기의 클론이 백시니아 재조합 벡터로의 삽입에 대해 선별되었다: HCCl9A (서열번호 3), HCCl10A (서열번호 5), HCCl11A (서열번호 7), HCCl12A (서열번호 9), HCCl13A (서열번호 11) 및 HCCl17A (서열번호 13), 도 21 에 나타냄. E1 코딩 영역을 포함하는 cDNA 절편은 각각의 pPS72 플라스미드로부터 EcoRI 및 HindIII 제한효소에 의해 절단되었고, 11K 백시아니 바이러스 후기 프로모터의 하류에, EcoRI/HindIII 절단 pgptATA-18 백시니아 재조합 벡터 (실시예 1 에 기재됨) 에 삽입되었다. 각각의 플라스미드를 pvHCV-9A, pvHCV-10A, pvHCV-11A, pvHCV-12A, pvHCV-13A 및 pvHCV-14A 로 지칭하였고, 이중 pvHCV-11A 를 도 4 에 나타낸다.
2.2. 소수성 영역 E1 결실 돌연변이체
코돈 Asp264 내지 Val287 (뉴클레오타이드 790 내지 861, 소수성 도메인 I 코딩 영역) 의 결실을 포함하는 클론 HCCl37 이 하기와 같이 생성되었다: HCPr52 (서열번호 16)/HCPr107 (서열번호 19) 및 HCPr108 (서열번호 20)/HCPr54 (서열번호18) 의 프라이머 세트를 이용하여, 2 개의 PCR 절편을 클론 HCCl10A 로부터 생성하였다. 상기 프라이머를 도 21 에 나타낸다. 2 개의 PCR 절편을 전기영동 후 아가로오스 겔로부터 정제하고, 1 ng 의 각각의 절편을 HCPr52 (서열번호 16) 및 HCPr54 (서열번호 18) 에 의한 PCR 용 주형으로서 함께 사용하였다. 생성된 절편을 Sma I 절단 pSP72 벡터로 클로닝하고, 상기 결실을 포함하는 클론은 24 개의 코돈 (72 개의 염기쌍) 의 결실로 인해 용이하게 동정되었다. 클론 HCCl37 (서열번호 15) 를 포함하는 플라스미드 pSP72HCCl37 이 선별되었다. 소수성 도메인 I 이 결여된 전장 E1 cDNA 를 포함하는 재조합 백시니아 플라스미드는 결실 부위의 HCV 서열 (벡터 pSP72-HCCl37 로부터 XmaI 및 BamHI 에 의해 절단된 절편) 을 백시니아 플라스미드 pvHCV-10A 의 XmaI - BamHI 부위에 삽입하는 것에 의해 구축되었다. 생성된 플라스미드를 pvHCV-37 로 명명하였다. 서열분석 확인 후, 내부 결실을 포함하는 아미노-말단 영역이 상기 벡터로부터 단리되었고 (EcoRI 및 BstEII 에 의한 절단), EcoRI 및 Bst EII 절단 pvHCV-11A 플라스미드로 재삽입되었다. 이 구축물은, 결실된 소수성 도메인 모두를 갖는 E1 단백질을 발현할 것으로 예상되고, pvHCV-38 로 명명하였다. 클론 HCCl38 의 E1 코딩 영역은 서열번호 23 으로 나타낸다.
E1 카르복시말단의 소수성 영역 (이론적으로는, 아미노산 337-340 부위로 확장됨) 은 구축물 pvHCV-38 에 완전하게 포함되지 않기 때문에, 소수성 영역 도메인 I 이 결여된 더욱 큰 E1 영역이 EcoRI 및 BamHI 절단에 의해 pvHCV-37 로부터 단리되었고, EcoRI/BamHI 절단 pgsATA-18 벡터로 클로닝되었다. 생성된 플라스미드는pvHCV-39 로 명명되었고, 크로 HCCl39 (서열번호 25) 를 포함하였다. 동일한 절편이 BamHI 에 의해 (이의 스티키 말단은 Klenow DNA 폴리머라아제 I (Boehringer) 에 의해 채워짐), 그리고 이어서 EcoRI 에 의해 (5' 점착성 말단) pvHCV37 벡터로부터 절단되었다. 이 서열을 EcoRI 및 Bbr PI 절단 벡터 pMS-66 에 삽입되었다. 이는 카르복시 말단 종결부에 6 개의 히스티딘 꼬리를 포함하는 플라스미드 pvHCV-40 중의 클론 HCCl40 (서열번호 27) 을 생성하였다.
2.3. 다른 유전자형의 E1
클론 HCCl62 (서열번호 29) 는 만성 C형 간염을 갖는 타입-3a 감염 환자로부터 유도되었고 (혈청 BR36, 클론 BR36-9-13, WO 94/25601 중의 서열번호 19, 및 또한 Stuyver 등, 1993a 참조), HCCl63 (서열번호 31) 은 수혈 후 간염을 갖는 타입-5a 감염된 어린이로부터 유도되었다 (혈청 BE95, 클론 PC-4-1, WO94/25601 중의 서열번호 45).
2.4. E2 구축물
HCV E2 PCR 절편 22 는, Stuyver 등, 1993b 에 기재된 바와 같이 RNA 제조, 역전사 및 PCR 을 이용하여 프라이머 HCPr109 (서열번호 33) 및 HCPr72 (서열번호 34) 에 의해 혈청 BE11 (유전자형 1b) 로부터 수득하였고, 이 절편으로 SmaI 절단 pSP72 벡터로 클로닝하였다. 클론 HCCl22A (서열번호 35) 를 NcoI/AlwNI 로 또는 BamHI/AlwNI 에 의해 절단하고, 이 절편의 스티키 말단을 (Klenow DNA 폴리머라아제 (Boehringer) 에 의해 NcoI 및 BamHI 부위를, T4 DNA 폴리머라아제 (Boehringer) 에 의해 AlwNI 를) 블런트화하였다. 이어서, BamHI/AlwNI cDNA 절편을 EcoRI 및 HindIII 절단에 의해 선형화된 백시니아 pgsATA-18 벡터로 삽입하고, 이중 점착성 말단을 Klenow DNA 폴리머라아제 (Boehringer) 로 채웠다. 생성된 플라스미드를 pvHCV-41 로 명명하였고, 시그널 서열로서 공급될 수 있는 E1 단백질의 37 개의 아미노산 (Met347 내지 Gly383) 을 포함하는 아미노산 Met347 내지 Gln673 의 E2 영역을 코딩하였다. 동일한 HCV cDNA 를 EcoRI 및 Bbr PI 절단 벡터 pMS66 에 삽입한 후, Klenow DNA 폴리머라아제에 의해 블런트 말단화하였다. 생성된 플라스미드를 pvHCV-42 로 명명하였고, 또한 아미노산 347 내지 683 을 코딩하였다. NcoI/AlwNI 절편을 동일한 방식으로 pgsATA-18 (pvHCV-43) 또는 pMS-66 백시니아 벡터 (pvHCV-44) 의 동일한 부위로 삽입하였다. pvHCV-43 및 pvHCV-44 는 HCV 폴리프로테인의 아미노산 364 내지 673 을 코딩하였고, 이중 아미노산 364 내지 383 은 E2 에 대한 시그널 서열을 코딩하는 E1 단백질의 천연 카르복시말단 영역으로부터 유도되었고, 아미노산 384 내지 673 은 성숙 E2 단백질이었다.
2.5. 재조합 HCV-백시니아 바이러스의 생성
토끼 신장 RK13 세포 (ATCC CCL 37), 인간 골암종(osteosarcoma) 143B 티미딘 키아나아제 결핍 (TK-) (ATCC CRL 8303), HeLa (ATCC CCL 2) 및 Hep G2 (ATCC HB 8065) 세포주를, American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md, USA) 로부터 분주받았다. 세포를, 10% 우태아혈청, 및 143B 또는 RK13 세포에 대해서는 얼스 염 (Earle's salt)을, Hep G2 에 대해서는 글루코오스 (4 g/ℓ)를 보충한 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) 중에서 성장시켰다. 백시니아 바이러스 WR 균주(Western Reserve, ATTC VR 119) 는 통상적으로 종래에 기재된 바와 같이 143 또는 RK13 세포 중에서 증식되었다 (Panicali & Paoletti, 1982; Piccini 등, 1987; Mackett 등, 1982, 1984 및 1986). 143B 세포의 컨플루언트 단층은 0.1 의 감염 복수성 (m.o.i.) (= 0.1 의 세포당 플라크 형성 유닛 (PFU))으로 야생형 백시니아 바이러스를 감염시켰다. 2 시간 후, 백시니아 재조합 플라스미드를 상동성 재조합 (Graham & van der Eb, 1973; Mackett 등, 1985) 이 가능하도록 500 ng 의 플라스미드 DNA 를 포함하는 칼슘 포스페이트 공침전물의 형태로 감염됨 세포에 형질감염시켰다. E.coli 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (gpt) 단백질을 발현하는 재조합 벡터를 선별 배지 (25 ㎍/㎖ 의 마이코페놀산 (MPA), 250 ㎍/㎖ 의 크산틴 및 15 ㎍/㎖ 의 하이포크산틴을 포함하는 EMEM; Falkner 및 Moss, 1988; Janknecht 등, 1991) 중에서 배양된 토끼 신장 RK13 세포 상에서 선별하였다. 단일 재조합 바이러스를, 선별 배지 중 0.9% 아가로오스 오버레이 하에서 RK13 세포의 갓 제조한 단층 상에서 정제하였다. 티미딘 키나아제 결핍 (TK-) 재조합 바이러스를 선별한 후, 25 ㎍/㎖ 의 5-브로모-2'-데옥시우리딘의 존재하에 인간 143B 세포 (TK-) 의 갓 제조한 단층 상에서 플라크를 정제하였다. 정제된 재조합 HCV-백시니아 바이러스의 저장액을, 0.05 m.o.i. (Mackett 등, 1988) 으로 인간 143B 또는 토끼 RK13 세포를 감염시키는 것에 의해 제조하였다. 재조합 백시니아 바이러스 중 HCV cDNA 의 삽입은, MPA 선별 후, 개별적인 HCV 절편 (표 1 참조) 을 클로닝하기 위해 사용되는 프라이머를 이용한 PCR 에 의해서 세포 용해물의 분액 (50 ㎕)상에서 확인하였다. 재조합 백시니아-HCV 바이러스는 백시니아 재조합 플라스미드 수에 따라 명명되었고, 예를 들어 재조합 백시니아 바이러스 vvHCV-10A 는 pvHCV-10A 플라스미드를 갖는 야생형 WR 균주의 재조합으로부터 유도되었다.
실시예 3: 재조합 백시니아 바이러스에 의한 세포의 감염
RK13 세포의 컨플루언트 단층을 3 m.o.i. 으로 실시예 2 에 기재된 재조합 HCV-백시니아 바이러스에 의해 감염시켰다. 감염을 위해, 세포 단층을 인산-완충된 식염수(PBS) (pH 7.4) 로 2회 세척하고, 재조합 백시니아 바이러스 저장액을 MEM 배지 중에 희석하였다. 200 ㎕ 의 바이러스 용액을 106세포마다 m.o.i. 가 3 이 되도록 첨가하고, 24℃ 에서 45 분 동안 배양하였다. 바이러스 용액을 흡인하고, 2 ㎖ 의 완전 성장 배지 (실시예 2 참조) 를 106세포 마다 첨가하였다. HCV 단백질의 발현이 발생되는 동안 세포를 37℃ 에서 24 시간 동안 배양하였다.
실시예 4: 웨스턴 블랏팅에 의한 재조합 단백질의 분석
감염된 세포를 PBS 로 2회 세척하고, 용해 완충액 (50 mM 트리스ㆍHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 5 mM MgCl2, 1 ㎍/㎖ 의 아프로티닌 (Sigma, Bornem, Belgium)) 으로 직접적으로 용해하거나, 50 mM 트리스ㆍHCl (pH 7.5)/10 mM EDTA/150 mM NaCl 중에서 5 분간 배양하여 플라스크로부터 탈착시키고, 원심 분리 (1000 g 에서 5 분)하여 수집하였다. 이어서, 세포 펠렛을 106세포마다 200 ㎕ 의 용해 완충액 (50 mM 트리스ㆍHCl (pH 8.0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2아프로티닌, 1% 트리톤 X-100) 중에 재현탁하였다.
세포 용해물을 Eppendorf 원심분리로 14,000 rpm 에서 5 분 동안 투명하게 하여 불용성 잔해물을 제거하였다. 20 ㎕ 의 단백질을 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 에 의해서 분리하였다. 이어서, 단백질을, 4℃ 로 냉각된 Hoefer HSI 이동 설비를 이용하여, 2 시간 동안 100 V 의 정전압에서, 겔로부터 니트로셀룰로오스 시트 (Amersham) 으로 이동 완충액 (25 mM 트리스ㆍHCl (pH 8.0), 192 mM 글리신, 20% (v/v) 메탄올) 중에서 전기-이동시켰다. 니트로셀룰로오스 필터를 Blotto (PBS 중 5% (w/v) 지방 없는 즉석 유분; Johnson 등, 1981) 로 블록킹하고, Blotto/0.1% Tween 20 중에 희석된 1차 항체와 함께 배양하였다. 통상적으로, 인간 대조군 혈청 또는 HCV 에 감염된 환자의 혈청을 200 배 희석하고, 200 배 희석된 야생형 백시니아 바이러스-감염 세포 용해물과 함께 상온에서 1 시간 동안 예비배양하여, 비-특이적 결합 반응을 감소시켰다. Blotto/0.1% Tween 20 으로 세척한 후, 니트로셀룰로오스 필터를 Blotto/0.1% Tween 20 중에 희석된 알칼린 포스파타아제 기질 용액과 함께 배양하였다. PBS 중 0.1% Tween 20 으로 세척한 후, 필터를 알칼린 포스파타아제 기질 용액 (100 mM 트리스ㆍHCl (pH 9.5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.38 ㎍/㎖ 니트로블루 테트라졸륨, 0.165 ㎍/㎖ 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트) 와 함께 배양하였다. 전기 이동을 제외한 모든 단계는 상온에서 수행되었다.
실시예 5: 재조합 E1 또는 E2 단백질의 정제
5.1. 용해
감염된 RK13 세포 (E1 또는 E2 구축물을 담지함) 를 포스페이트-완충액 식염수 (PBS) 로 2회 세척하고, 10 mM EDTA 를 함유하는 PBS 중에서 배양하는 것에 의해 배양 수용자로부터 탈착시켜다. 탈착된 세포를 PBS 로 2 회 세척하고, 105세포마다 2 mM 바이오틴화 N-에틸말레이미드 (바이오틴-NEM) (sigma) 를 포함하는 1 ㎖ 의 용해 완충액 (50 mM 트리스ㆍHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 5 mM MgCl2, 1 ㎍/㎖ 의 아프로티닌 (Sigma, Bornem, Belgium))을 4℃ 에서 첨가하였다. 이 용해물을 타입 B 다운서(douncer) 로 균질화시키고, 상온에서 0.5 시간 동안 방치시켰다. 또다른 5 부피의 10 mM N-에틸말레이미드 (NEM, Aldrich, Bornem, Belgium) 을 포함하는 용해 완충액을 1차 용해물에 첨가하고, 이 혼합물을 상온에서 15 분 동안 방치시켰다. 불용성 세포 잔해물을 Beckman JA-14 로터 중에서 14,000 rpm (30100 g 의 rmax) 로 원심분리에 의해 4℃ 에서 1 시간 동안 용액으로부터 투명하게 하였다.
5.2. 렉틴 크로마토그래피
투명화된 세포 용해물을, 1 ㎖/분의 속도로 세포 완충액의 5 컬럼 부피로 평형화시킨 10 cm 렌틸-렉틴 세파로오스 4B 컬럼 (Pharmacia) 에 의해 0.8 상에 1 ㎖/분의 속도로 로딩하였다. 렌틸-렉틴 컬럼을 5 내지 10 컬럼 부피의 완충액 1 (0.1 M 칼륨 포스페이트 (pH 7.3), 500 mM KCl, 5% 글리세롤, 1 mM 6-NH2-헥산산, 1mM MgCl2, 및 1% 데실PEG (KWANT, Bedum, The Netherlands) 로 세척하였다. 일부 실험에 있어서, 컬럼은, 이어서 1% 데실PEG 대신에 0.5% Empigen-BB (Calbiochem, San Diego, CA, USA) 를 포함하는 10 컬럼 부피의 완충액 1 로 세척하였다. 결합된 물질을, 용출 완충액 (10 mM 칼륨 포스페이트 (pH 7.3), 5% 글리세롤, 1 mM 헥산산, 1 mM MgCl2, 0.5% Empigen-BB 및 0.5 M α-메틸-만노피라노시드) 를 적용하는 것에 의해 용출시켰다. 용출된 물질을 분획화하고, 실시예 6 에 기재된 ELISA 에 의해서 E1 또는 E2 단백질의 존재에 대하여 스크리닝하였다. 도 22 는 vvHCV39 (타입 1b), vvHCV40 (타입 1b), vvHCV62 (타입 3a) 및 vvHCV63 (타입 5a) 에 감염된 세포 용해물의 4 가지의 상이한 E1 정제물의 렌틸 렉틴 용출물 분획으로부터 수득된 ELISA 결과를 나타낸다. 도 23 은 도 22 에 나타낸 값으로부터 수득된 프로필을 나타낸다. 이러한 결과는, 렉틴 친화 컬럼이 상이한 유형의 HCV 의 외피 단백질에 대해 사용될 수 있음을 보여준다.
5.3. 농축 및 부분 환원
E1- 또는 E2-양성 분획을 모으고, Beckman JA-20 로터 중에서 5,000 rpm 으로 3 시간 동안 4℃ 에서 원심분리하는 것에 의해 Centricon 30 kDa (Amicon) 상에서 농축시켰다. 일부 실험에서, E1- 또는 E2-양성 분획을 모으고, 질소 증발에 의해서 농축시켰다. 3.108세포의 등가물을 약 200 ㎕ 로 농축시켰다. 부분적 환원을 위하여, 30% Empigen-BB (Calbiochem, San Diego, CA, USA) 를 상기 200 ㎕ 용액에 최종 농도 3.5% 로 첨가한 후, H2O 중 1 M DTT 를 최종 농도 1.5 내지 7.5 mM로 첨가하고, 37℃ 에서 30 분 동안 배양하였다. 이어서, NEM (디메틸술폭시드 중 1 M) 을 최종 농도 50 mM 로 첨가하고, 추가적인 30 분 동안 37℃ 에서 반응하도록 방치하여, 유리 술피드릴 기를 블록킹하였다.
5.4. 겔투과 크로마토그래피
Superdex-200 HR 10/20 컬럼 (Pharmacia) 를 3 컬럼 부피의 PBS/3% Empigen-BB 로 평형화시켰다. 환원된 조성물을 500 ㎕ 샘플 루프의 Smart System (Pharmacia) 중에 주입하고, PBS/3% Empigen-BB 완충액을 겔투과를 위해 첨가하였다. 250 ㎕ 의 분획을 V0로부터 Vt로 수집하였다. 상기 분획을 실시예 6 에 기재된 바와 같이 E1 또는 E2 단백질의 존재에 대해 스크리닝하였다.
도 24 는 vvHCV39 (타입 1b), vvHCV40 (타입 1b), vvHCV62 (타입 3a) 및 vvHCV63 (타입 5a) 에 감염된 세포 용해물의 4 가지 상이한 E1 정제물의 겔투과 크로마토그래피 후 수득된 분획으로부터 얻어진 ELISA 결과를 나타낸다. 도 25 는 타입 1b, 3a 및 5a (각각 vvHCV39), vvHCV62 및 vvHCV63 에 감염된 RK13 세포로부터 유래되고; 렌틸 렉틴 상에서 정제되고, 상기 실시예에서와 같이 환원됨) 의 E1 단백질의 정제물로부터 수득된 프로필을 나타낸다. '1', '2' 및 '3' 으로 나타낸 피크는, 순수한 E1 단백질 피크 (주로 분획 26 내지 30 에서 E1 반응성임) 를 나타낸다. 상기 피크는 이량체성 E1 단백질에 해당하는 약 70 kDa 의 매우 유사한 분자량을 나타낸다. 세 가지 프로필의 다른 피크는, 실시예 5.3 에 개요된 환원 단계로 인해, 그리고 적절한 세척제의 존재하에 후속적인 환원 단계로 인해, 단지 E1으로부터만 분리될 수 있는 백시니아 바이러스 및/또는 세포 단백질을 나타낸다. 도 26 에서 나타낸 바와 같이, 집합 1 (분획 10 내지 17 을 나타냄) 및 집합 2 (분획 18 내지 25 를 나타냄) 는 E1 집합 (분획 26 내지 30) 에 존재하지 않는 오염 단백질을 포함한다. E1 피크 분획은, SDS/PAGE 상에서 전개되었고, 실시예 4 에서와 같이 블랏팅되었다. NEM-바이오틴으로 표지화된 단백질은 도 27 에 나타낸 스트렙타비딘-알칼린 포스파타아제에 의해서 검출되었다. 이중, 겔투과 크로마토그래피 전에 존재하는 29 kDa 및 45 kDa 오염 단백질 (레인 1) 은 분획 26 내지 30 에서는 매우 극히 낮은 수준으로만 존재하였다. 약 65 kDa 의 밴드는, 단량체성 E1 형태로 전체적으로 교란될 수 없는 E1 이량체성 형태를 나타낸다. 유사한 결과가, 6 개 대신에 단지 5 개의 탄수화물의 존재로 인해 SDS/PAGE 상에서 더욱 빠른 이동성을 나타내는 타입 3a E1 단백질 (레인 10 내지 15) 에 대해서도 수득되었다. 도 28 은 도 26 에서와 동일한 조건으로 전개된 SDS/PAGE 겔의 은 염색을 나타낸다. 정제 절차의 완전한 개관은 도 29 에 나타낸다.
정제된 E1 단백질의 존재는, 실시예 4 에 기재된 웨스턴 블랏팅에 의해서 또한 확인되었다. 이량체성 E1 단백질은 응집되지 않고 오염원이 없는 것으로 보여졌다. 상기 계획에 따라 vvHCV-40 감염 세포로부터 정제된 아형 1b E1 단백질은, 477 Perkin-Elmer 서열분석기 상에서 자동적으로 서열분석되었고, 1차 잔기로서 티로신을 함유하는 것으로 보여졌다. 이는, E1 단백질이 이의 시그널 서열로부터 정확한 위치 (A191 및 Y192 사이) 에서 시그널 펩티드에 의해 절단되었음을 확인시켰다. 이는, 성숙 E1 단백질의 아미노말단이 아미노산 위치 192 에서 시작한다는Hijikata 등 (1991) 의 발견을 확인시킨다.
5.5. E2 단백질의 정제
E2 단백질 (아미노산 384 내지 673) 은 실시예 5.1 내지 5.4 에서 나타낸 바와 같이 vvHCV44 에 감염된 RK13 세포로부터 정제되었다. 도 30 은 렌틸 렉틴 크로마토그래피의 OD280프로필 (지속선) 을 나타낸다. 점선은 ELISA (실시예 6 참조) 에 의해 검출된 E2 반응성을 나타낸다. 도 31 은 렌틸-렉틴 E2 집합 (도 30 참조) 의 겔투과 크로마토그래피로부터 수득된 동일한 프로필을 나타내고, 이중 일부는 컬럼에 즉시 적용되었다. E2 집합의 모든 부분은 분리 겔투과 컬럼 상에서 전개되었다. 환원이 수행되지 않은 경우, E2 는 오염 단백질을 갖는 공유적으로 연결된 응집체를 형성함을 보여질 수 있었다. 환원 및 블록킹 후, 주요한 오염 단백질은 V0분획으로 격리되었다. 오염 단백질이 후속적인 단계에서 제거될 수 있었기 때문에, E2 단백질과 함께 동시 정제된 다른 오염 단백질은 더 이상 E2 단백질에 공유적으로 연결되지 않았다. 도 32 는 E2 단백질 정제를 위해 수행될 수 있는 부가적인 Ni2+-IMAC 정제 단계를 나타낸다. 상기 친화 정제 단계는 vvHCV44 로부터 발현된 E2 단백질에 부가된 6 개의 히스티딘 잔기를 사용한다. 오염 단백질을 컬럼을 통과할 수 있거나, 30 mM 이미다졸 세척에 의해 제거될 수 있다. 도 33 은 0.5 ㎍ 의 정제된 E2 단백질 및 30 mM 이미다졸 세척의 은 염색 SDS/PAGE 를 나타낸다. 순수한 E2 단백질은, 200 mM 이미다졸 용출 단계에 의해 용이하게 회수될 수 있었다. 도 34 는 이미다졸을 제거하고 목적하는 완충액, 예컨대 PBS, 카보네이트 완충액, 식염수로 교환할 수 있는 것을 의도하는 부가적인 탈염 단계를 나타낸다.
E1 의 제조를 위한 vvHCV11A (또는 vvHCV40), 또는 E2 단백질의 제조를 위한 vvHCV41, vvHCV42, vvHCV43 또는 vvHCV44 에 감염된 약 50,000 ㎠ 의 RK13 세포로부터 출발하면, 실시예 5.1 내지 5.5 에 기재된 절차는 약 1.3 ㎎ 의 E1 단백질 및 0.6 ㎎ 의 E2 단백질의 정제를 가능하게 한다.
또한, 분비된 E2 단백질 (약 30-40%, 60-70% 가 세포내 형태인 것으로 구성됨) 은 (예상과 반대로) 응집체 형서엥 의해 특정됨이 주목되어야만 한다. 따라서, 동일한 문제가 분비된 E2 단백질을 정제함에 있어서도 제기된다. 분비된 E2 는 상기 설명한 바와 같이 정제될 수 있다.
실시예 6: 항-E1 또는 항-E2 항체의 검출 또는 E1 또는 E2 단백질의 검출을 위한 ELISA
Maxisorb 마이크로웰 플레이트 (Nunc, Roskilde, Denmark) 를, 4℃ 에서 16 시간 동안 또는 37℃ 에서 1 시간 동안, 웰 당, PBS 중 스트렙타비딘 (Boehringer, Mannheim) 의 5 ㎍/㎖ 용액의 1 부피 (예컨대 50 ㎕ 또는 100 ㎕ 또는 200 ㎕) 로 피복하였다. 다르게는, 상기 웰을, 4℃ 에서 16 시간 동안 또는 37℃ 에서 1 시간 동안, 50 mM 나트륨 카보네이트 완충액 (pH 9.6) 중 갈란투스 니발리스 아글루티닌 (GNA) 5 ㎍/㎖ 의 1 부피로 피복하였다. GNA 로 피복하는 경우에, 플레이트를 400 ㎕ 의 Innotest HCV Ab III 키트 (Innogenetics, Belgium) 의 세척 용액으로 2 회 세척하였다. 결합되지 않은 피복 표면은 1.5 내지 2 부피의 블록킹 용액 (PBS 중0.1% 카세인 및 0.1% NaN3) 으로, 37℃ 에서 1 시간 동안 또는 4℃ 에서 16 시간 동안 블록킹하였다. 블록킹 용액은 흡인하였다. 정제된 E1 또는 E2 를 100 내지 1000 ng/㎖ (A = 280 nm 에서 측정된 농도) 로 희석하거나, E1 또는 E2 에 대해 스크리닝될 컬럼 분획, 또는 비정제된 세포 용해물 (실시예 5.1) 중의 E1 또는 E2 를 블록킹 용액 중에서 20 배 희석하고, 1 부피의 E1 또는 E2 용액을 각 웰에 첨가하고, 스트렙타비딘- 또는 GNA-피복 플레이트 상에서 37℃ 에서 1 시간 동안 배양하였다. 마이크로웰을 1 부피의 Innotest HCV Ab III 키트 (Innogenetics, Belgium) 의 세척 용액 400 ㎕ 로 5 회 세척하였다. 결합된 항체를, 1 부피의 Innotest HCV Ab III 키트 (Innogenetics, Belgium) 의 공액 희석제로 1/80,000 희석된 염소 항-인간 또는 항-마우스 IgG, 퍼옥시다아제 공액된 2차 항체 (DAKO, Glostrup, Denmark) 와 함께 37℃ 에서 1 시간 동안 각각의 웰을 배양하는 것에 의해 검출되었고, 색상 발현은, Innotest HCV Ab III 키트 (Innogenetics, Belgium) 의 세척 용액 400 ㎕ 로 플레이트를 3 회 세척한 후, 24℃ 에서 30 분 동안 Innotest HCV Ab III 키트 (Innogenetics, Belgium) 의 기질 용액의 1 부피로 100 배 희석된 Innotest HCV Ab III 키트 (Innogenetics, Belgium) 의 기질을 첨가하는 것에 의해서 얻어졌다.
실시예 7: 상이한 임상적 프로필을 갖는 환자 군의 추적
7.1. 항-E1 및 항-E2 항체의 모니터링
현재 C형 간염 바이러스 (HCV) 진단적 분석은 HCV 항체의 존재의 스크리닝및 확인을 위해 개발되었다. 이러한 검사는 치료의 모니터링을 위해 또는 질환의 결말의 예후를 위해 유용한 정보를 제공할 것 같지는 않다. 그러나, B형 간염의 경우에서와 같이, 항-외피 항체의 검출 및 정량은 임상 설정에 있어서 더욱 유용한 것으로 증명될 수 있다. C형 간염 질환의 결과에 대한 예후적 마커로서 항-E1 항체 역가 및 항-E2 항체 역가의 사용 가능성을 조사하기 위해서, 장기 지속 방응을 갖는 일련의 IFN-α치료 환자 (치료 후 1년 이상의 기간 동안 혈액에서 정상적인 트랜스아미나아제 수준 및 음성 HCV-RNA 시험 (5' 비코딩 영역에서의 PCR) 결과를 갖는 환자로서 정의됨) 를, 반응을 나타내지 않거나 치료 말기에 재발되는 생화학적 반응을 나타내는 환자와 비교하였다.
8 명의 장기 지속된 반응을 갖는 IFN-α치료 환자의 군 (LTR, 1 내지 3.5 년 지속, 3 명의 타입 3a 및 5 명의 타입 1b) 을, 치료에 대한 불완전 반응을 나타내는 9 명의 환자 (NR, 1 내지 4 년 지속, 6 명이 타입 1b 및 3 명의 타입 3a) 와 비교하였다. 타입 1b (vvHCV-39, 실시예 2.5. 참조) 및 3a E1 (vvHCV-62, 실시예 2.5. 참조) 단백질은, 백시니아 바이러스계로부터 발현되었고 (실시예 3 및 4 참조), 균일하게 정제하였다 (실시예 5). 타입 1b C형 간염 바이러스에 감염된 환자로부터 유래된 샘플은 정제된 타입 1b E1 단백질과의 반응성에 대해 검사한 반면, 타입 3a 감염 샘플은 실시예 6 에 기재된 ELISA 로 항-타입 3a E1 항체의 반응성에 대해서 시험하였다. 상이한 환자를 감염시킨 C형 간염 바이러스의 유전자형은 Inno-LiPA 유전자형 검사 (Innogenetics, Belgium) 에 의해서 결정되었다. 도 5 는 인터페론 치료 과정 동안 및 치료후 추적 기간 동안에 따라오는 항-E1 시그널대 노이즈 비율을 나타낸다. LTR 경우는 항-E1 수준의 일정한 빠른 감소를 나타낸 반면 (3 가지 경우에 완전한 음성임), NR 경우의 항-E1 수준은 대략적으로 일정하게 남겨졌다. 수득된 항-E1 데이터의 일부를 평균 S/N 비율 ±SD (평균 항-E1 역가) 로서 표 2 에 나타낸다. 항-E1 역가는 도 5, 6, 7 및 8 에 나타낸 시그널 대 노이즈의 비율로부터 유추될 수 있었다.
치료 말기에 이미, 현저한 차이가 2 개의 군 사이에 관찰될 수 있었다. 항-E1 항체 역가는 LTR 에서 6.9 배 감소하였지만, NR 에서는 단지 1.5 배 감소하였다. 추적 말기에, 항-E1 역가는 지속 반응을 갖는 환자에서 22.5 의 인자가 감소되었고, NR 에서는 심지어 약간 증가하였다. 따라서, 이러한 데이터에 기초하면, IFN-α치료의 모니터링 동안의 항-E1 항체 수준의 감소는 치료에 대한 장기의 지속된 반응과 상호관련이 있다. 항-E1 검사는 IFN 치료, 또는 일반적인 C형 간염 질환의 치료에 대한 장기 반응의 예후에 매우 유용할 수 있다.
이런 발견은 예측되지 못하였다. 반대로, 본 발명자들은 항-E1 항체 수준이 장기 반응을 갖는 환자에서 IFN 치료 과정 동안에 증가할 것으로 예측하였다. B형 간염의 경우에서와 같이, 상기 바이러스는 항-HBsAg 항체에 대한 혈청전환의 결과로서 명백하다. 또한, 수많은 다른 바이러스 감염에 있어서, 상기 바이러스는 항-외피 항체가 증가되는 경우 제거된다. 그러나, 본 발명의 실험에서, 항-E1 항체는 치료에 대한 장기 반응을 갖는 환자에서 명백히 감소된 반면, 비-반응 환자에서는 대략적으로 동일한 수준으로 항체-수준이 유지되었다. 이러한 실험 결과가 예측되지 못하였을지라도, 이런 자명하지 않은 발견은 매우 중요할 수 있고, HCV 감염의임상 진단을 위해 유용할 수 있다. 도 9, 10, 11 및 12 에서 보는 바와 같이, 항-E2 수준은 연구된 동일 환자에서 매우 상이한 양상을 갖고, 역가에 있어서 자명하지 않은 감소가 항-E1 항체에 대해서 관찰되었다. 도 35 는 선도적인 연구의 완전한 개관을 제공한다.
표 2 로부터 유추될 수 있는 바와 같이, 장기 반응자에서 치료 개시시에, 항-E1 역가는 치료에 대한 불완전 반응자와 비교하여 평균 2 배 이상이었다. 따라서, 치료 개시시에 항-E1 항체의 역가를 측정하거나, 감염 과정 동안에 환자를 모니터링하고 항-E1 역가를 측정하는 것은, C형 간염의 임상적인 진단을 위한 유용한 마커가 될 수 있다. 또한, 더욱 정의된 영역의 E1 또는 E2 단백질의 사용은, 실시예 7.3 에서 보는 바와 같이 바람직하게 될 수 있다.
7.2. 더 큰 환자 집단에서의 E1 및 E2 항체의 분석
선도적인 연구로, 본 발명자들은, 감염이 완전하게 명백한 경우, HCV 외피 단백질에 대한 항체는 더욱 예전에 연구된 HCV 항원에 대한 항체 보다 더욱 신속하게 변화시킨다는 (E1 항체는 가장 격렬하게 변화됨) 결론에 이루렀다. 따라서, 본 발명자들은 타입 1b 및 3a 에 감염된 LTR 을 더 포함하였고, 두 군에 각각 14 명의 환자를 더 포함하도록 매칭된 일련의 NR 을 갖는 집단을 더 보충하였다. 일부 부분적인 반응자 (PR) 및 재발을 갖는 반응자 (RR) 이 또한 분석되었다.
도 36 은, LTR 및 NR 군에서 평균 E1 항체 (E1Ab) 및 E2 항체 (E2Ab) 수준을 나타내고, 표 4 및 5 는 통계학적 분석을 나타낸다. 상기 더 큰 집단에서, IFN-α치료전의 더욱 높은 E1 항체 수준은 LTR 과 관련되어 있었다 (P < 0.03). 타입1b-감염된 환자와 비교하여 훨씬 더 높은 E1 항체 수준이 타입 3a 감염된 환자에서 관찰되었기 때문에 (도 37), 유전자형이 고려되었다 (표 4). 타입 1b-감염된 군내에서, LTR 은 또한 치료 개시시에 NR 보다 더 높은 E1 항체 수준을 가졌고 [P < 0.05]; 타입 3a 감염된 NR 의 제한된 수는 통계학적 분석이 가능하지 않았다.
1.5 년의 추적 기간 동안 LTR 에서 모니터링된 항체 수준 중, 단지 E1 항체만이 치료 개시시에 측정된 수준과 비교하여 명백히 빨랐다 [P = 0.0058, 치료 말기; P = 0.0047 및 P = 0.0051, 각각 치료 후 6 및 12 개월째]. 이런 명백성은 타입 1- 또는 타입 3-감염된 LTR 내에서 유의적인 것으로 남겨진다 (평균 P 값 < 0.05). 이런 데이터는, E1Ab 수준이 초기 상의 해석에 있어서 빠르게 감소하는 초기의 발견을 확인시켜 주었다. 이런 특성은 바이러스 유전자형에 독립적인 것 같다. NR, PR 또는 RR 에 있어서, 측정된 임의의 항체의 변화가 추적 기간에 걸쳐 관찰되지 않았다. 치료 동안 ALT 수준의 정상화 및 HCV-RNA 음성을 갖는 치료에 대해 바람직하게 반응하는 환자에 있어서, 지속된 반응자 (LTR) 및 재발을 갖는 반응자 사이의 현저한 차이가 존재하였다. LTR 과 반대로, RR 은 E1 항체 수준의 임의의 감소를 나타내지 않았고, 이는 HCV-RNA 의 검출을 위한 PCR 또는 다른 전통적인 기술에 의해서, 또는 상승된 ATL 수준에 의해서도 보여질 수 없는, 보이지 않는 HCV 감염의 존재를 나타낸다. 치료 동안 RR 군에 여전히 존재하는 바이러스 RNA 의 미세한 양은 항-E1 B 세포를 자극할 수 있는 것 같다. 따라서, 항-E1 모니터링은 NR 로부터 LTR 을 구별할 수 있을뿐만 아니라, RR 로부터도 구별할 수 있다.
7.3. E1 단백질의 정의된 영역의 항체의 모니터링
HCV 항원을 동정하기 위한 분자생물학적 방법이 바이러스 진단의 발전에 있어서 전례없는 진전을 초래하였을지라도, λgt11 라이브러리의 면역 스크리닝 방법은 코어 및 비구조 영역을 통해 분산되어 있는 선형 에피토프를 우세하게 생산하고, 외피 영역의 분석은 포유동물 세포에서 E1/E2 영역의 클로닝 및 발현이 진행되어야만 한다. 이런 접근법은 외피 영역에 대한 에피토프가 게놈 서열의 해독되기 오래 전에 이미 맵핑된 수많은 다른 바이러스 감염과는 정반대이다. 이러한 에피토프 및 대응하는 항체는 종종 백신 개발에 유용한 중화 활성을 갖고/거나, 임상적 또는 예후적 중요성을 갖는 진단학적 검사의 개발을 가능하게 한다 (예를 들어, B형 간염 표면 항원에 대한 항체).
C형 간염 질환의 임상적 진단 및 예후를 가능하게 하는 HCV 백신 또는 시험이 오늘날 이용가능하지 않기 때문에, 면역 감시에 노출된 바이러스 외피 영역의 특징화는 HCV 진단 및 예방에 있어서 새로운 방향에 현저하게 기여할 수 있다.
8 개의 아미노산이 서로 중첩된 각종 20-mer 펩티드 (표 3) 는, HC-J1 서열 (Okamoto 등, 1990) 에 기초하여 종래에 기술된 방법 (EP-A-0 489 968) 에 따라 합성되었다. 펩티드 env35 (또한, E1-35 로서 언급됨) 를 제외한 이들 펩티드 중 어떤 것도, 약 200 개의 HCV 경우의 혈청들에서 항체를 검출할 수 없었다. 단지 2 개의 혈청만이 env35 펩티드와 약간 반응하였다. 그러나, 실시예 6 에 기재된 항-E1 ELISA 에 의해서는, 하기와 같은 추가적인 에피토프를 발견하는 것이 가능하였다. 실시예 6 에 기재된 항-E1 ELISA 는, 50 ㎍/㎖ 의 E1 펩티드와 1/20 희석된 샘플 희석제 중의 인간 혈청을 혼합하는 것에 변형시켰다. 도 13 은, 단독 또는E1 펩티드 혼합물의 존재하에, 재조합 E1 (vvHCV-40 으로부터 발현됨) 단백질에 대한 인간 혈청의 반응성의 결과를 나타낸다. Line Immunoassay 포멧 중 스트립 상에 피복된 E1 펩티드에 의해서 단지 2% 의 혈청만이 검출될 수 있는 반면, 재조합 E1 단백질 상에서 시험된 경우, 절반 이상의 혈청이 동일한 펩티드에 의해 결쟁될 수 있는 항-E1 항체를 포함하였다. 이어서, 정제된 E1 단백질에 의한 주사 후 Balb/C 로부터 수득된 뮤린 모노클로날 항체의 일부는 단일 펩티드와 E1 에 대한 반응성에 대해 경쟁하였다 (도 14). 명백하게, env53 의 첨가가 실질적으로 E1 과의 혈청의 반응성에 대해 결정할 수 있었고 env31 영역에 대한 항체가 또한 검출되었기 때문에, env53 의 영역은 우세한 에피토프를 포함하였다. env53 및 env31 펩티드는 고체상에 직접적으로 피복되는 경우 임의의 반응성을 나타내지 않기 때문에, 이런 발견은 놀라운 것이다.
따라서, 본 출원인에 의해 종래에 언급된 기술 (WO 93/18054) 를 사용하여 펩티드가 합성된다. 하기의 펩티드가 합성되었고:
펩티드 env35A-바이오틴
NH2-SNSSEAADMIMHTPGCV-GK바이오틴 (서열번호 51)
이는 E1 영역 중 HCV 폴리프로테인의 아미노산 208 내지 227 에 놓여있음;
펩티드 바이오틴-env53 ('에피토프 A')
바이오틴-GG-ITGHRMAWDMMMNWSPTTAL-COOH (서열번호 52)
이는 E1 영역 펩티드 1bE1 중 HCV 폴리프로테인의 아미노산 313 내지 332 에놓여있음;
펩티드 1bE1 ('에피토프 B')
NH2-YEVRNVSGIYHVTNDCSNSSIVYEAADMIMHTPGCGK-바이오틴 (서열번호 53)
이는 E1 영역 중 HCV 폴리프로테인의 아미노산 192 내지 228 에 놓여있음;
유전자형 1a 및 1b 의 동일한 서열 영역으로부터 각각 유도되고 IXth international virology metting in Glasgow, 1993 에서 언급된, 펩티드 E1a-BB (바이오틴-GG-TPTVATRDGKLPATQLRRHIDLL, 서열번호 54) 및 E1b-BB (바이오틴-GG-TPTLAARDASVPTTTIRRHVDLL, 서열번호 55) ('에피토프 C')의 반응성과 비교하였다. HCV 혈청의 패널의 반응성은 에피토프 A, B 및 C 에 대하여 검사되었고, 에피토프 B 는 또한 env35A 와 비교하였다 (47 개의 HCV-양성 혈청 중, 8 개는 에피토프 B 에 대해 양성이고, 어떤 것도 env35A 와 반응하지 않았다). 에피토프 A, B 및 C 에 대한 반응성은, 실시예 6 에 기재된 바와 같이, 스트렙타비딘-피복된 플레이트에 결합된 바이오틴화 펩티드 (50 ㎍/㎖) 에 대해 직접적으로 검사하였다. 명백하게는, 에피토프 A 및 B 는 가장 반응성인 반면, 에피토프 C 및 env35A-바이오틴은 훨씬 덜 반응성이었다. 완전한 E1 단백질 (실시예 7.1.) 에 대한 반응성을 모니터링된 동일한 일련의 환자는 에피토프 A, B 및 C 에 대해 검사되었다. 에피토프 C 에 대해서는 거의 반응성이 보여지지 않은 반면, 도 15, 16, 17 및 18 에서 보는 바와 같이, 에피토프 A 및 B 는 주요한 혈청과 반응하였다. 그러나, 가장 활성인 에피토프 (에피토프 A) 에 대한 항체는 질환의 환화를 예상하지 못하는 것으로 보여진 반면, 항-1bE1 항체 (에피토프 B) 는 IFN 치료 개시시에 장기 반응자에서 대부분 배타적으로 존재하였다. 따라서, 항-1bE1 (에피토프 B) 항체 및 항-env53 (에피토프 A) 항체는 C형 간염 질환의 예후를 위한 유용한 마커인 것으로 보여질 수 있었다. env53 에피토프는 이롭게는 가교반응성 항체 (주요한 유전자형 사이에서 가교반응하는 항체) 의 검출을 위해 사용될 수 있고, env53 영역에 대한 항체는 혈청 또는 간 조직에서 보편적인 E1 항원 검출을 위해 매우 유용할 수 있다. env53 영역을 인식하는 모노클로날 항체는 랜덤 에피토프 라이브러리와 반응하였다. 모노클로날 항체 5E1A10 에 의한 면역스크리닝시 반응하는 4 개의 클론에는, 서열 -GWD- 가 존재하였다. env53 영역에 있어서의 모든 HCV 변이체 내에 존재하는 보편적인 HCV 서열과의 유사성으로 인해, 서열 AWD 는 env53 가교반응성 뮤린 에피토프이 필수적인 서열을 포함하는 것으로 여겨진다. 명백하게는, env31 은 또한 아미노산 말단 서열 -YQVRNSTGL- (서열번호 93) 중에 에피토프를 포함할 수 있는 가변영역을 포함하고, 진단에 유용할 수 있다. 표 3 에 나타낸 Env31 또는 E1-31 은 펩티드 1bE1 의 일부이다. 펩티드 E1-33 및 E1-51 은 또한 일부 확장하여 뮤린 항체와 반응하였고, 펩티드 E1-33 (가변여역 6 (V6) 포함; 아미노산 위치 329-336 에 놓여있음) 도 또한 일부 환자 혈청과 반응하였다.
명백하게는, 항-E2 항체는 특히 치료에 대한 장기 반응을 갖는 환자에서 항-E1 항체와는 상이한 패턴이 뒤따랐다. 따라서, 단일 항-E1 또는 항-E2 단백질을 이용하는 것만큼, 재조합 E1/E2 단백질을 사용하는 검사를 이용하여 항-외피 항체의 감소가 효율적으로 측정될 수 없다는 것이 명백하다. 명백하게는, 항-E2 반응은, 두 종류의 항체를 동시에 측정하는 검사에서 항-E1 반응을 둔하게 할 것이다. 따라서, 단일 E1 및 E2 단백질에 대한 항-외피 항체를 검사하는 능력이 유용한 것으로 보여졌다.
7.4. 항-E2 항체의 맵핑
24 개의 항-E2 Mab 중, 단지 3 개만이 펩티드에 의한 재조합 E2 에 대한 반응성을 경쟁할 수 있었고, 이중 2 개는 HVRI (펩티드 E2-67 및 E2-69, 에피토프 A 로 지칭됨)과 반응하였고, 이중 하나는 펩티드 E2-13B 에 의해 경쟁되는 에피토프 (에피토프 C)를 인식하였다. 대부분의 뮤린 항체는 형태적 항-E2 에피토프를 인식하였다 (도 19). HCVRI (에피토프 A) 에 대한, 및 보다 작은 정도의 HVRII (에피토프 B) 및 제 3 의 선형 에피토프 영역 (펩티드 E2-23, E2-25 또는 E2-27 에 의해 경쟁됨, 에피토프 E 로 지칭함) 및 제 4 의 선형 에피토프 영역 (펩티드 E2-17B 에 의해 경쟁되고, 에피토프 D) 에 대한 인간 반응은 또한 빈번히 관찰되었지만, 대부분의 혈청은 형태적 에피토프와 반응하였다 (도 20). 이러한 형태적 에피토프는 하기와 같이 상대적 위치에 따라 그룹화될 수 있었다: 형태적 에피토프를 인식하는 하이브리도마 15C8C1, 12D11F1, 9G3E6, 8G10D1H9, 10D3C4, 4H6B2, 17F2C2, 5H6A7, 15B7A2 의 상청액중 IgG 항체는 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의해서 정제되었고, 1 ㎎/㎖ 의 생성된 IgG 는 바이오틴의 존재하에 보레이트 완충액 중에서 바이오틴화되었다. 바이오틴화된 항체는 겔투과 크로마토그래피에 의해서 유리 바이오틴으로부터 분리되었다. 집합된 바이오틴화 항체 분획은 100 대 10,000 배로 희석하였다. 고체상에 결합된 E2 단백질은 100 배 양의 비-바이오틴화된 경쟁 항체의존재하에 바이오틴화 IgG 에 의해서 검출된 후, 알칼린 포스파타아제 표지화된 스트렙타비딘에 의해서 검출되었다.
경쟁 백분율은 표 6 에 나타낸다. 이들 결과에 기초하여, 4 개의 형태적 항-E2 에피토프 영역 (에피토프 F, G, H 및 I) 이 서술될 수 있었다 (도 38). 다르게는, 이들 Mab 는 본 연구에서 사용되지 않은 펩티드에 의해서 나타내어지지 않은 돌연변이체 선형 에피토프를 인식할 수 있다. Mab 4H6B2 및 10D3C4 는 16A6E7 의 반응성과 경쟁하였지만, 16A6E7 과는 달리, 이들은 펩티드 E2-13B 를 인식하지 못하였다. 이들 Mab 는 동일한 선형 에피토프 (에피토프 C) 의 변이체를 인식할 수 있거나, 입체 방해된 형태적 에피토프를 인식하거나, E2-13B 영역 (에피토프 H) 에 16A6E7 이 결합한 후 형태를 변화시킬 수 있다.
실시예 8: E1 글리코실화 돌연변이체
8.1. 도입
표유동물 세포로부터 발현되는, vvHCV10A 에 의해 코딩되는 E1 단백질, 및 vvHCV41 내지 44에 의해 코딩되는 E2 단백질은, 6 및 11 개의 탄수화물 부분을 각각 포함한다. 이는 vvHCV10A-감염 또는 vvHCV44-감염 RK13 세포의 용해물을 감소된 농도의 글리코시다아제 (제조사 지침에 따른 PNGase F 또는 엔도글리코시다아제 H (Boehringer Mannhein Biochemica)) 와 함께 배양하는 것에 보여질 수 있고, 예컨대 용해물 (E1 포함) 중의 단백질은 부분 디글리코실화된다 (각각, 도 39 및 40).
일부 글리코실화 부위가 없는 돌연변이체는 개선된 면역학적 반응성을 갖는외피 단백질의 선별을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어 HIV 의 경우, 특정 선별된 당-부가 모티프가 결여된 gp120 단백질은, 특히 진단 또는 백신 목적으로 유용한 것으로 확인되었다. A/홍콩/3/68 (H3N2) 인플루엔자 바이러스의 탈출 돌연변이체의 헤마토글루티닌 단백질 중 새로운 올리고사카라이드 측쇄의 부가는 중화 모노클로날 항체와의 반응성을 억제한다 (Skehel 등, 1984). 신규한 글루코실화 부부위가 부위-특이적 돌연변이형성에 의해 인플루엔자 헤마토글루티닌 단백질로 도입되는 경우, 현저한 항원성 변화가 관찰되고, 이는 탄수화물이 항원성의 변형자로서 기능함을 제안한다 (Gallagher 등, 1988). 또다른 분석에 의하면, Freind 뮤린 백혈병 바이러스의 표면 단백질 gp70 의 8 개의 탄수화물 부가 모티프는 결실되었다. 7 개의 돌연변이가 바이러스 감염성에 영향을 미치지 않을지라도, 아미노산 말단에 대한 제 4 의 글리코실화 시그널의 돌연변이는 비-감염성 표현형을 초래하였다 (Kayman 등, 1991). 또한, N-연결 탄수화물 사슬의 부가가 폴딩 중간체의 안정화에 중요하여, 그에 따른 효율적인 폴딩, 소포체 중에서의 불량폴딩 및 분해의 방지, 올리고머화, 생물학적 활성 및 당단백질의 이송에 중요하다는 것이 당업계에 공지되어 있다 (Rose 등, 1988; Dom 등, 1993; Helenius, 1994 에 의한 리뷰 참조).
HCV 유전자형이 상이한 외피 단백질 서열의 배열 후, 일부는 특정 형태 (아형) 에서 존재하지 않기 때문에, HCV 아형 1bE1 단백질에 대한 6 개의 모든 글리코실화 부위가 적절한 폴딩 및 반응성을 위해서 요구되지 않는다는 것이 추론될 수 있다. 타입 1b, 6a, 7, 8 및 9 에 존재하는 제 4 의 탄수화물 모티프 (Asn251 상에서) 는 오늘날 공지된 모든 다른 유형에서는 부재이다. 상기 당-부가 모티프는 돌연변이되어, 개선된 반응성을 갖는 타입 1bE1 단백질을 생성할 수 있다. 또한, 타입 2b 서열은 V5 영역 (Asn299 상에서) 에서 여분의 글리코실화 부위를 나타낸다. 유전자형 2c 에 속하는 단리물 S83 은, 심지어는 V1 영역 (Asn 상에서) 에서 제 1 의 탄수화물 모티프가 결여된 반면, 모든 다른 단리물 상에서는 존재한다 (Stuyver 등, 1994). 그러나, 심지어 완전히 보존된 당-부가 모티프 중에서, 탄수화물의 존재는 폴딩을 위해 요구되지 않을 수 있지만, 면역 감시의 탈출에 있어 역할을 할 수 있다. 따라서, 적절한 폴딩 (및 반응성) 에 요구되지 않는 탄수화물 부가 모티프의 동정은 자명하지 않고, 각각의 돌연변이체는 반응성에 대해 분석되고 시험되어야만 한다. 글리코실화 모티프 (NXS 또는 NXT 서열)의 돌연변이형성은 N, S 또는 T 에 대한 코돈의 돌연변이화에 의해서, 이들 코돈이 N 의 경우 N 과 상이한 아미노산을, 및/또는 S 및 T 의 경우 S 또는 T 와 상이한 아미노산을 코딩하도록 하는 방식으로 성취될 수 있다. 다르게는, NPS 또는 NPT 는 탄수화물로 종종 변형되지 않는 것을 공지되어 있기 때문에, X 위치는 P 로 돌연변이될 수 있다. 어떠한 탄수화물-부가 모티프가 폴팅 및/또는 반응성을 위해 요구되는지의 여부를 확립하기 위해, 상기 돌연변이의 조합이 만들어질 수 있다.
8.2. E1 단백질의 돌연변이 형성
모든 돌연변이는 클론 HCCl10A (서열번호 5) 의 E1 서열 상에서 수행되었다. 백시니아 11K 후기 프로모터의 상류에 위치된 GPT 서열을 표적하는 센스 프라이머 'GPT' (표 7 참조), 및 목적하는 염기 변화를 포함하는 안티센스 프라이머 (GLY#로 지칭, 여기에서 # 는 글리코실화 부위의 수를 나타냄, 도 41 참조) 를 사용하여, 1차 PCR 을 수행함으로써 돌연변이형성을 얻었다. 6 개의 GLY# 프라이머 (각각 소정이 글리코실화 부위에 대해 특이적임) 가 하기와 같이 지칭되었다:
- N-글리코실화된 Asn (AAC 또는 AAT) 를 코딩하는 코돈을 Gln 코돈 (CAA 또는 CAG) 로 변형. 글루타민은 아스파라긴과 매우 유사하기 때문에 선택된다 (두 아미노산 모두 중성이고, 비극성 잔기를 포함하고, 글루타민은 더 긴 측쇄를 가짐 (하나 이상의 -CH2- 기).
- 새로운 독특한 또는 희귀한 (예를 들어, E1Gly5 에 대한 제 2 의 SmaI 부위) 제한효소 부위를 생성하기 위하여, 글리코실화 부위의 하류의 코돈 하나 또는 몇 개에서 침묵 돌연변이의 도입. 아미노산 서열의 변형이 없다면, 상기 돌연변이는 본래의 E1 서열 (pvHCV-10A) 로부터 또는 서로로부터 변이된 서열을 구별하는 방법을 제공할 것이다 (도 41). 이런 부가적인 제한 효소는 또한 새로운 하이브리드 (이중, 삼중 등) 글리코실화 돌연변이체의 구축을 위해 유용할 수 있다.
- 18 개의 뉴클레오타이드가 5' 의 제 1 의 매치되지 않은 뉴클레오타이드를 확장하고, 12 내지 16 개의 뉴클레오타이드가 3' 말단을 확장한다. 표 7 은 N-연결된 글리코실화 부위의 서열이 중첩된 6 개의 GLY# 프라이머의 서열을 나타낸다.
부위-직접 돌연변이형성을 위해서, '미스프라이밍(mispriming) 또는 '중첩 확장' (Horton, 1993) 이 사용되었다. 상기 개념은 도 42 및 43 에 예시된다. 우선, 두 개의 분리된 절편을 각각의 변이된 부위에 대한 표적 유전자로부터 증폭하였다. 5' 말단으로부터 수득된 PCR 산물 (산물 GLY#) 을 5' 센스 GPT 프라이머 (표 7 참조) 및 각각의 3' 안티센스 GLY# 프라이머에 의해서 증폭하였다. 2차 절편 (OVR# 산물) 을 3' 안티센스 TKR프라이머 및 각각의 5' 센스 프라이머 에 의해서 증폭하여다 (OVR# 프라이머, 표 7 참조, 도 43).
OVR# 프라이머는 GLY# 프라이머 서열의 일부를 표적한다. 따라서, 두 군의 PCR 산물은 동일한 서열의 중첩 영역을 공유한다. 이들 중간체 산물이 혼합되고 (GLY-1 과 OVR-1, GLY-2 와 OVR-2 등), 고온에서 용융되고, 다시 어닐링되는 경우, 두 가닥이 서로에 대한 프라이머로서 작용하는 방식으로, 산물 GLY# 의 상부 센스 가닥은 산물 OVR# 의 안티센스 가닥에 (그리고, 그 반대로) 어닐링될 수 있다 (도 42B 참조). 2 회의 PCR 사이클 동안 Taq 폴리머라아제에 의한 어닐링된 중첩부의 확장은 전장 돌연변이체 분자 E1Gly# 을 생성하였고, 이는 글리코실화 부위 번화 # 을 파괴하는 돌연변이를 담지한다. 클로닝을 위한 충분한 양의 E1GLY# 산물은, 두 개의 내부 네스티스 프라이머의 통상적인 세트에 의한 3차 PCR 에 의해서 생성되었다. 이들 2 가지의 새로운 프라이머는, 백시니아 11K 프로모터의 3' 말단 (센스 GPT-2 프라이머) 및 백시니아 티미딘 키나아제 좌위의 5' 말단 (안티센스 TKR-2 프라이머, 표 7 참조) 이 각각 중첩되어 있다. 모든 PCR 조건은 Stuyver 등 (1993) 에 기재된 바와 같이 수행되었다.
이들 PCR 산물의 각각은 EcoRI/BamHI 절단에 의해 본래의 E1 서열을 포함하는 EcoRI/BamHI 절단 백시니아 벡터 (pvHCV-10A) 로 클로닝되었다.
선별된 클론은 EcoRI/BamHI 절단에 의한 삽입부의 길이에 대해, 및 각각의 새로운 제한효소 부위의 존재에 대해 분석하였다. 돌연변이된 부위가 중첩된 서열은 이중가닥 서열분석에 의해서 확인되었다.
8.3. E1 글리코실화 돌연변이체의 분석
실시예 8.2 에 기재된 바와 같이 돌연변이체 E1 서열을 함유하는 6 개의 플라스미드로부터 출발하여, 재조합 백시니아 바이러스가 실시예 2.5 에 기재된 야생형 백시니아 바이러스와의 재조합에 의해서 생성되었다. 간단하게는, 서브컨플루언트 RK13 세포의 175 ㎠ 플라스크를 돌연 변이체 E1 서열을 담지한 6 개의 재조합 백시니아 바이러스, 및 vvHCV-10A (돌연변이되지 않은 E1 서열 담지) 및 야생형 백시니아 바이러스에 감염시켰다. 세포를 감염 24 시간 후에 용해시키고, 실시예 4 에 기재된 바와 같이 웨스턴 블랏 상에서 분석하였다 (도 44A 참조). 모든 돌연변이체는 본래의 E1 단백질 보다 SDS 상에서 더욱 빠른 이동성을 나타내었고 (약 2 내지 3 kDa 의 더 낮은 분자량에 해당); 이는 하나의 탄수화물 부분이 부가되지 않았음을 확인시켜 주었다. 재조합 바이러스는 또한 PCR 및 제한효소 분석에 의해 분석하여, 상이한 돌연변이체의 동일성을 확인하였다. 도 44B 는 (도 41 에 나타낸) 모든 돌연변이체가 예측된 부가적인 제현효소 부위를 함유하였음을 보여준다. 세포 용해물의 또다른 부분은 ELISA 에 의한 상이한 돌연변이체의 반응성을 시험하기 위해 사용되었다. 상기 용해물은 20 배 희석되었고, 실시예 6 에 기재된 렉틴 GNA 로 피복된 마이크로웰 플레이트에 첨가하였다. 포획된 (돌연변이체) E1 당단백질은 방치하여, 실시예 6 에서 기재된 바와 같이, 24 개의 HCV-감염된 환자의 20배 희석된 혈청과 반응시켰다. 6 개의 돌연변이체 및 E1 에 대한 시그널 대 노이즈 (S/N) 값 (GLY# 의 OD/wt 의 OD) 을 표 8 에 나타낸다. 이 표는 또한, GLY# 및 E1 단백질의 S/N 갓 사이의 비율을 나타낸다. 환자 혈청과의 반응성 비교를 위한 상이한 돌연변이체의 세포 용해물의 사용에 대한 접근법은 반응성 수준 보다는 상이한 발현 수주의 결과인 관찰이 생성될 수 있음이 이해되어야만 한다. 이러한 차이성은, 실시예 5 에 기재된 바와 같은 상이한 돌연변이체의 정제에 의해, 및 동일한 양의 모든 상이한 E1 단백질을 시험하는 것에 의해 극복될 수 있다. 그러나, 표 5 에 나타낸 결과는, 첫번째 (GLY1), 세번째 (GLY3) 및 6번째 (GLY6) 글리코실화 모티프의 제거가 일부 혈청의 반응성을 감소시키는 반면, 2 번째 및 5 번째 부위의 제거는 그렇지 않다는 것을 이미 나타낸다. GLY4 의 제거는, 특정 혈청의 반응성을 향상시키는 것 같다. 이러한 데이터는, 상이한 환자가 본 발명의 글리코실화 돌연변이체에 상이하게 반응한다는 것을 나타낸다. 따라서, 상기 돌연변이체 E1 은 HCV 질환의 진단 (스크리닝, 확인, 예후 등) 및 예방에 유용할 수 있다.
실시예 9: 글리코실화-결핍 효모에서 HCV E2 단백질의 발현
클론 HCCl41 에 해당하는 E2 서열은, 효모 발현 벡터 및 E2 단백질을 분비하는 상기 구축물로 형질전환된 S. 세레비시아에 세포에서 성장배지로 삽입된, α-메이팅 인자 프리/프로 시그널 서열을 제공한다. 대부분의 글리코실화 부위는 S. 세레비시아에 균주에서 상기 구축물의 발현시 고-만노오스 유형의 글리코실화에 의해 변형되는 것으로 관찰되었다 (도 45). 이는 매우 높은 수준의 이질성 및 반응성의 보호를 초래하였고, 이는 백신 또는 진단 목적으로 바람직하지 않다. 이런 문제를해결하기 위해, 변형된 글리코실화 경로를 갖는 S. 세레비시아에 돌연변이체는 바나듐산염-내성 클론의 선별에 의해 생성되었다. 상기 클론은 당단백질 인버타아제의 분자량 및 이질성 분석에 의해서 변형된 글리코실화 경로에 대해 분석하였다. 이는, 상이한 글리코실화 결핍 S. 세레비시아에 돌연변이체의 동정을 가능하게 하였다. 이어서, E2 단백질은 일부 선별된 돌연변이체에서 발현되었고, 방치하여, 실시예 4 에 기재된 웨스턴 블랏 상에서 실시예 7 에 기재된 모노클로날 항체와 반응시켰다 (도 46).
실시예 10. 일반적인 유용성
본 결과는, 우수한 발현계뿐만 아니라 우수한 정제 프로토콜이 HCV 외피 단백질과 인간 환자 혈청의 높은 반응성을 이루기 위해 요구된다는 것을 보여준다. 이는, 적절한 HCV 외피 단백질 발현계 및/또는 단백질의 천연 폴딩의 보존을 보장하는 본 발명의 정제 프로토콜 및 오염 단백질의 제거를 보장하고 형태를 보존하여 HCV 외피 단백질의 반응성을 보존하는 본 발명의 정제 프로토콜을 사용하여 수득될 수 있다. 진단학적 스크리닝 검사에 필요한 정제된 HCV 외피 단백질의 양은 해마다 그램의 범위내이다. 백신 목적으로, 훨씬 더 높은 양의 외피 단백질이 요구될 수 있다. 따라서, 백신 바이러스계가 가장 우수한 발현 구축물을 위해, 그리고 제한된 대규모화를 위해 사용될 수 있고, 각종 효모 균주로부터 발현되는 경우, 고-만노오스 탄수화물을 함유하는 단일 또는 특이적 올리고머성 외피 단백질의 대규모 발현 및 정제가 성취될 수 있다. 예를 들어 B형 간염의 경우, 포유동물 세포로부터 HBsAg 를 제조하는 것은 효모-유래 B형 간염 백신과 비교하여 훨씬 더 고비용이었다.
본 발명에 개시된 정제 방법은, 일반적으로 '바이러스 외피 단백질' 에 대해 또한 사용될 수 있다. 예에는, 플라비바이러스로부터 유래된 것, 새로이 발견된 GB-A, GB-B 및 GB-C형 간염 바이러스, 페스트바이러스 (예컨대, 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV), 돼지 콜레라 바이러스 (HCV), 경계 질환(Border disease) 바이러스 (BDV))뿐만 아니라, 덜 관련된 바이러스, 예컨대 B형 간염 바이러스 (주로, HBsAg 의 정제를 위해) 가 있다.
본 발명의 외피 단백질 정제 방법은, 상세한 설명 부분에 기재된 바와 같은 저차 또는 고차 진핵생물 세포에서 또는 원핵생물에서 세포내 및 세포외 발현 단백질에 사용될 수 있다.
실시예 11. 예방적 및 치료적 사용의 증명
HCV 에 만성 감염된 침팬지에서의 간 질환은 E1 에 의한 면역화에 의해서 완화될 수 있다. 그러나, 현저한 면역 반응을 위해서는 복수 면역이 요구되었다. 당업자는, 바이러스 자체 또는 숙주에 의해서 통제되는 면역 변형과 함께 바이러스 영속성이 생성됨을 인정할 것이다. 상기 면역 조절이 HCV 에서 존재하는지를 분석하기 위하여, 나이브 및 만성 감염된 침팬지에서 E1 및 NS3 에 대한 면역 반응이 비교되었다. 만성 감염된 동물에서 낮은 반응이 나타나기 때문에, 상기 군의 동물은 하기를 포함하는 더욱 엄격한 면역화 스케쥴을 위해 선택되었다: 알룸과 비교하여 세포 반응 (표 9) 을 유도하는 더 큰 잠재성을 갖는 마우스에서 증명된 아쥬반트의 사용 (상기 아쥬반트는 나이브 동물을 위해 사용되었다); 및 나이브 동물에대한 6 회와 비교하여 12 회 면역화로 이루어진 만성 감염된 동물에 대한 면역화 스케쥴 (도 47).
면역된 동물의 수가 통계학적 분석을 가능하게 하지 않을지라도, 하기의 명백한 경향이 체액성 반응에서 검출될 수 있었다 (표 10): 12회 면역 후, 혈청형전환을 위한 면역화의 수는 나이브 동물에서 더 낮고; 면역 반응의 크기는 나이브 동물에서 실질적으로 더 크고, 2/3 의 감염 동물은 10 내부 유닛의 수준에 도달하지 못함.
3 회 면역 후, 세포 반응의 분석은, 하기를 포함하는 훨씬 더 큰 차이성을 나타낸다 (도 48a-d): E1-특이적 T-세포 증식은 만성 감염된 동물에서 대부분 없는 반면, 명백한 자극이 나이브 설정에서는 나타나고; 알룸-아쥬반트 함유 백신에 대해 예상된 바와 같이, 나이브 동물에서는 명백한 Th2 (IL-2) 반응이 나타남.
이는, 적어도 E1 면역화가 나이브 동물에서 예방적 효과를 제공함을 확인시켜 주고, E2 및/또는, E1 및 E2 단백질 및/또는 펩티드의 조합이 나이브 동물에서 유용한 치료적 및/또는 예방적 이점을 제공할 수 있음을 제안한다.
HCV E1 항원에 대한 세포성 및 체액성 반응 모두를 유도하는 '손상' 은 하기 결과에 의해 보여진 바와 같이, 복수 면역화에 의해 단지 부분적으로 극복될 수 있다: 각각의 주사 후 항체 역가의 증가가 기록되었지만, 나이브 동물에서의 수준은 2/3 동물에 도달하지 못하였고; T-세포 증식 반응은 극도로 낮았다 (도 49). 그러나, ELISPOT 결과는 IL-2 의 소량 증가 (보여지지 않음), IFN-g 의 미변화 (보여지지 않음) 및 IL-4 의 증가 (도 49) 를 나타내고, 이는 Th2 유형 반응이 더욱 용이하게 유도됨을 나타낸다. IL-4 는 나이브 동물에서 3회 면역 후 도달되는 수준과 비교하여 낮은 수준으로 남겨짐이 주목되었다.
훨씬 더 강력한 아쥬반트 (RIBI) 를 만성 침팬지에서 사용한 경우에, 매우 유사한 관찰이 만들어졌다. 나이브 동물에서 알룸 제형과 비교하여, 하기가 주목되었다: 유도된 항체 역가는 두 군 모두에서 상당하고 (보여지지 않음); 시토카인 분비 및 T-세포 증식 모두 나이브 동물에서의 반응과 비교하여 만성 동물에서 대부분 없다 (도 49a-b).
만성 보균자에서 HCV 에 대한 면역 반응이 낮거나 감염의 제거를 가능하게 하는데 불충분하다는 일부 징후가 현재 존재한다. 상기 결과는, HCV 만성 보균자의 면역계가 손상될 수 있고, 이들은 나이브 상황에서만큼 효과적으로 HCV 항원에 대해 반응하지 못한다는 가설을 지지한다.
Wiedmann 등에 의한 연구 (Hepatology 2000; 31: 230-234) 에서, HBV 용 백신은 HCV 만성 보균자에서 덜 효과적이고, 이는 상기 면역 손상이 HCV 항원에 제한되지 않는다는 것을 나타낸다. De Maria 등 (Hepatology 2000; 32; 444-445) 는 이러한 데이터를 확인시켜 주었고, HCV 환자에 대한 수정된 백신 분량 요법을 제안하였다. 본원에 나타낸 데이터는, 면역 횟수의 증가가 체액성 반응을 실제로 증가시킬 수 있지만, 세포 (특히, Th1) 반응은 심지어 강력한 아쥬반트가 사용되는 경우에도 유도되기 어렵다는 것을 제안한다. 면역계가 더욱 반응하기 쉬울 때, 항바이러스 치료 시점에서 면역화를 수행하는 것이 이로울 수 있다.
표 1: 재조합 백시니아 플라스미드 및 바이러스
nt: 뉴클레오타이드; aa: 아미노산; Kl: Klenow DNA Pol 필링(filling); T4: T4 DNA Pol 필링
위치: HCV 폴리프로테인 서열 중 아미노산 위치
표 1 (계속): 재조합 백시니아 플라스미드 및 바이러스
nt: 뉴클레오타이드; aa: 아미노산; Kl: Klenow DNA Pol 필링(filling); T4: T4 DNA Pol 필링
위치: HCV 폴리프로테인 서열 중 아미노산 위치
표 2: 항-E1 시험의 요약
S/N ±SD (평균 항-E1 역가)
LTR: 1 년 이상 동안 장기 지속 반응
NR: 비-반응, 퇴행을 갖는 반응, 또는 부분 반응
표 3: 경쟁 연구를 위한 합성 펩티드
표 3 (계속): 경쟁 연구를 위한 합성 펩티드
표 4: 시간 경과에 따른 외피 항체 수준의 변화 (경쟁 연구, 28 명의 환자)
*데이터는 치료 개시시에 수득된 값과 비교되었다
** P 값 < 0.05
표 5: LTR 및 NR 사이의 차이성 (완전한 연구)
* P 값 < 0.05
표 6: 뮤린 E2 모노클로날 항체 사이의 경쟁 연구
바이오틴화된 항-E2 Mab 의 항-E2 반응성의 감소 (%)
표 7. 프라이머
밑줄친 뉴클레오타이드는 부가적인 제한효소 부위를 나타낸다.
굵은 뉴클레오타이드는 본래의 HCCl10A 서열에 대한 돌연변이를 나타낸다.
표 8. ELISA 에 의한 E1 글리코실화의 분석
표 8 (계속). ELISA 에 의한 E1 글리실화 돌연변이체의 분석
표 9. Balb/c 마우스에서 아쥬반트화된 E1 의 프로필
알룸 T-세포 아쥬반트 RBI
항체 역가 (평균 ±SD, n = 6) 96000 ±101000 62000 ±60000 176000 ±149000
항체 이소타입 IgG1 IgG1/2b IgG1/2a
비장에서의 T-세포 증식1(n = 3) 11750 (2/3) 48300 (3/3) 26000 (3/3)
림프 노드에서 T-세포 증식2 특정 자극 없음 4000 8000
시토카인 프로필 (비장) Il-4 INF-g/Il-4 IFN-g/Il-4
13회 s.c./i.m. 면역화 후, 3 마리의 무작위 선택된 마우스를 개별적으로 분석하였고, 그 결과를 E1 자극 (1 ㎍/㎖) 4 일 후에 수득되는 특정 cpm 의 평균으로서 표현하고, 괄호안의 숫자는 상기한 배경하에 특정 자극을 갖는 마우스의 숫자에 관한 것이다.2하나의 단일 풋패스(footpath) 내부 자극 (n = 2) 후, 상기 결과를 E1 자극 (1 ㎍/㎖) 5 일 후에 수득되는 특정 cpm 의 평균으로서 표현한다.
표 10. 체액성 반응: 상이한 E-1 항체 수준에 요구되는 면역화 횟수
동물 상태 혈청형전환1 > 1 U/㎖2 > 10 U/㎖
Marcel 만성 3 4 5
Peggy 만성 3 5 > 12
Femma 만성 4 5 > 12
Yoran 나이브 3 4 5
Marti 나이브 2 3 5
1면역화 전에 E1-항체가 존재하지 않는다면, 컷오프 수준 보다 높은 ELISA 시그널로서 정의되고, 다른 경우서는 3 개의 개별 시점의 면역전 역가 보다 높은 역가의 관찰이 혈청전환점으로서 고려된다.2단위는 하기와 같이 정의된다: 인터페론 치료전에 유전자형 1b 에 감염된 인간 만성 보균자에서 E1 항체의 수준은 환자의 50% 에 대해서는 < 0.1 U/㎖ 이상이고, 25% 의 환자에 대해서는 0.1 내지 1 U/㎖ 이고, 나머지 25% 의 환자에서는 > 1 U/㎖ 임 (n = 58).
실시예 12: HCV 아형 1b에 만성 감염된 침팬지의 면역화
이미 13년(면역화되기 5015일 전) 동안 HCV 아형 1b주에 감염되었던 침팬지(Phil)은, WO 99/97285의 실시예 1-3에서 설명된 바와 같이 준비된 유전자형 1b의 다른 주 유래의 E1(aa192-326)(아미노산 서열에서 95.1%의 동일성을 가진다)로 백신화되었다(참고문헌으로 본 발명에 전 내용이 삽입된 WO 99/67285의 표 2를 또한 참고). 침팬지는 제조자의 프로토콜(Ribi Inc. Hamilton, MT)에 의하여 RIBI R-730(MPLA+TDM+CWS)와 혼합된 PBS/0.05% CHAPS 중 50㎍ E1으로 총 6번의 근육내 면역화를 받았다. 6번의 면역화는 3주의 간격을 두고 3번의 주사를 2회, 그리고 두기간 사이에 6주의 지연기를 두고 실시되었다. 면역화에 앞서 초기 150일, 면역기 동안, 면역화 후 1년까지(하기 및 WO 99/67285를 참고), 침팬지는 계속적으로 HCV 유도성 질병의 활성에 대하여 각종 파라미터 표지에 의하여 관찰되었다. 파라미터는 혈액 화학, ALT, AST, 감마GT, 혈액 화학, 혈청 중 바이러스 비중, 간 내의 바이러스 비중 및 간의 조직학을 포함한다. 부가적으로, 면역화에 대한 면역 반응이 체액 수준 및 세포 수준 모두에서 관찰되었다. 이 기간동안 동물들은 행동, 임상적 증상, 체중, 체온 및 국소적 반응(발적, 부종, 경화)에서의 변화와 같은, 면역화에 대한 부작용에 대하여 관찰되었다. 이들 작용들은 관찰되지 않았다.
명백하게도, ALT(및 특히 감마GT, 데이터 미첨부) 수준은 E1에 대한 항체 수준이 그들 최대 수준에 이르자마자 감소하였다(WO 99/6285의 도 8을 참고). ALT는 항체 수준이 감소하자마자 보다 빠르게 회복하였지만, 감마GT는 항-E1이 감지될 수 있는한 더 낮은 수준을 유지한다.
간에서의 E2 항원는 항-E1이 감지될 수 있는 기간 동안은 거의 감지할 수 없는 수준으로 감소하였고, E2 항원은 이들 항체의 소멸 직후에 회복하였다. Core 및 E2 항원가 함께 간에서 감지되지 않음과 동시에 간에서의 염증이 현저하게 감소하였다(WO 99/67285의 표 3을 참고). 이것은 백신이 아마도 이들의 주요 표적 기관인 간으로부터 나온 바이러스 항원을 적어도 부분적으로나마 제거함으로써 간 손상의 감소를 유도한다는 주요 증거이다. Amplicor HCV Monitor(Roche, Basel, Switzerland),로 측정한 바이러스 증상(viraemia)의 수준은 전체 연구 기간동안 혈청 중에서 거의 변하지 않고 유지되었다.
체액성 반응의 더 구체적인 연구는 최대 종점의 적가가 14.5×103(6번째 면역화 후)에 이르며, 이 적가가 면역화 1년 후 탐지할 수 없는 수준으로 떨어진다는 것을 보여준다(WO 99/67285의 도 8을 참고). WO 99/67285의 도 9는 펩티드로 모방할 수 있는, B 세포에 의하여 인식되는 주요 에피토프(WO 99/67285의 표 4에서 내용을 알 수 있는 펩티드 V1V2 및 V2V3)가 E2이 N-말단 부위에 위치하는 것을 보여준다. 재조합 E1에 대한 반응성이 더 고도로 더 길게 지속되므로, 이 특성에서도 추론되듯이, 이들 펩티드를 인식하는 항체는 E1에 대한 총 항체군의 단지 일부이다. 이 에피토프는 전체 E1 분자 상에, 또는 심지어 입자 유사 구조 상에 존재한다. E1에 대한 이러한 면역 반응은 적어도 인간 만성 HCV 보유자 및, 자연적 경로로 감염되어 항-E1 항체를 갖고 있는 침팬지에서 통상 관찰되는 경우와 비교하여,독특하다. 이들 환자들에서, 항 E1은 부분적으로 불연속적인 에피토프에 작용하나, 많은 부분은 C4 에피토프에 대하여 작용하며(환자의 혈청에서 ±50%), 적은 부분이 V1V2에 작용하고(유전형에 따라 2-70% 범위), V2V3에 대한 반응성은 단지 예외적으로만 기록된다.(Maertens etal., 1997).
이 세포 반응성의 연구는 이들 T 세포의 자극 지수가 1에서 2.5로 올라갈 때, 또한 면역 시스템의 이 구획이 특이적 방식으로 백신에 의하여 자극되며, 다음 기간 동안 다소 계속 상승한다는 것을 보여준다((WO 99/67285의 도 10). 이들 T 세포 반응성은 인터페론 치료의 장기 반응자에서만 보여진다( PCT/EP 94/03555에서 Leroux-Roels et al; Leroux-Roels et al (1996)을 참고)
실시예 13: 다른 아형의 만성 HCV 보유자에 대한 면역화
HCV 유전자형 1a로 10년(면역화 전 3809일) 동안 이미 감염되었던 침팬지(Ton)를, 상술한 실시예에서 설명한 바와 같이 준비한 유전자형 1b 유래의 E1(아미노산 수준에서 단지 79.3% 동일성(WO 99/67285의 표 2 참고)을 갖는다)으로 백신화하였다.
침팬지는 제조자의 프로토콜에 의하여 RIBI R-730와 혼합된 PBS/0.05% CHAPS 중 50㎍ E1으로 총 6번의 근육내 면역화를 받았다(Ribi Inc. Hamilton, MT). 6번의 면역화는 3주의 간격을 두고 3번의 주사를 2회, 그리고 두 기간 사이에 4주의 지연기를 두고 실시되었다. 면역화에 앞서 250일, 면역기 동안, 면역화 후 9개월동안(하기의 내용 및WO 67285 참고)침팬지는 계속적으로 HCV 유도성 질병의 활성에 대하여 각종 파라미터 표지에 의하여 관찰되었다. 파라미터는 혈액 화학, ALT, AST, 감마GT, 혈청 중 바이러스 비중, 간 내의 바이러스 비중 및 간의 조직학을 포함한다. 게다가 면역화에 대한 면역 반응이 체액 수준 및 세포 수준 양쪽에서 관찰되었다. 이 기간동안 동물들은 행동, 임상적 증상, 체중, 체온 및 국소적 반응(발적, 부종, 경화)에서의 변화와 같은, 면역화에 대한 부작용에 대하여 관찰되었다. 이들 작용들은 관찰되지 않았다.
명백하게도, ALT(및 특히 감마GT, 데이터 미첨부) 수준은 E1에 대한 항체 수준이 그들 최대 수준에 이르자마자 감소하였다(WO 99/6285의 도 11을 참고). ALT 및 감마GT는 항체 수준이 감소하기 시작하자마자 회복하였지만, ALT 및 감마GT는 다음 전체 기간동안 낮은 수준으로 유지되었다. ALT 수준은 백신화 전의 기간(85±11 U/1)에 비하여 백신화 후(62±6U/1)에 현저히 감소하였다. 조직 손상의 표지가 혈청에서 적게 회복되었기 때문에, 이들 발견들은 백신화가 간 질환의 개선을 유도한다는 첫번째 표시이다.
E2 항원 수준은 항-E1이 역가 1.0×103이상으로 유지하는 동안에는 탐지되지 않았지만, E1 항체 수준이 낮은 때에는 다시 탐지할 수 있었다. HCV 항원의 소멸과 함께, 간의 염증이 약한 만성 활동 간염에서 만성 지속 간염의 최소형으로 현저히 감소하였다. 이것은 백신이 아마 적어도 부분적으로는 이들의 주요 표적기관인 간에서 바이러스를 제거함으로서 간 손상의 감소를 유도한다는 또다른 주요 증거이다.
Amplicor HCV Monitor(Roche, Basel, Switzerland),로 측정한 바이러스 증상의 수준은 전체 연구 기간동안 혈청 중에서 거의 변하지 않고 유지되었다. 체액성 반응의 더 구체적인 연구는 최대 종점의 적가가 30×103(6번째 면역화 후)에 이르고, 이 적가가 면역화 9개월 후 0.5×103으로 떨어진다는 것을 보여준다.(WO 99/67285의 도 11을 참고) WO 99/67285의 도 12는 펩티드로 모방할 수 있고 B 세포에 의하여 인식되는 주요 에피토프(WO 99/67285의 표 4에서 내용을 알 수 있는 펩티드 V1V2 및 V2V3)가 N-말단 부위에 위치하는 것을 보여준다. 재조합 E1에 대한 반응성이 더 고도로 더 길게 지속되므로, 이 특성에서도 추론되듯이, 이들 펩티드를 인식하는 항체는 E1에 대한 총 항체군의 단지 일부이다. 잔여 부분은 대부분 불연속 에피토프 등의 펩티드에 의하여 모방할 수 없는 에피토프에 대하여 작용된다. 아마도 이들 에피토프는 단지 전체 E1 분자 상에, 또는 심지어 임자 유사 구조 상에 존재한다. E1에 대한 이러한 면역 반응은 독특하며, 적어도 탐지할 수 있는 항-E1을 갖는 인간 만성 HCV 보유자에서 통상 관찰되는 경우와 비교된다. 이들 환자들에서, 항-E1은 부분적으로 불연속적이나, 많은 부분은 인간 C4 에피토프에 대하여 작용하며(환자의 혈청에서 ±50%), 적은 부분이 V1V2에 작용하고(유전자형에 따라 2 내지 70%까지의 범위), V2V3에 대한 반응성은 단지 예외적으로만 기록된다(Maertens etal., 1997). 이 침팬지들이 1a 분리물로 감염될 때, 항체 반응 또한 E1-1a 항원에 대하여 이러한 교차 반응을 평가하였다. WO 99/67285의 도 13에서 볼 수 있듯이, 그들이 단지 총 항체 군의 일부를 형성하기는 하지만, 이러한 교차 반응 항체가 정말 생성된다. 간에서의 바이러스 항원의 재출현과 혈청에서의 탐지할 만한 항-1a E1 항체의 소멸 간에는 현저한 상관관계가 있다.
T 세포 반응성의 연구는 면역 시스템의 이들 부분이 이들 T 세포의 자극 지수가 0.5에서 5로 올라가고, 추후의 기간 동안 다소 계속 상승하여 유지되는 것과 같은 특이적 방식으로 백신에 의하여 자극된다는 것을 보여준다(WO 99/67285의 도 14).
실시예 14: HCV 만성 보유자의 E1에 의한 재부스팅
실시예 12 및 13에서 관찰되듯이 E1 항체 적가가 안정되지 못하고 시간 경과에 따라 1b 감염 침팬지에 대하여 탐지할 수 없는 수준까지 감소할 때, 이 항체 반응이 추가적인 부스팅에 의하여 다시 증가할 수 있다면 그것은 연구되었다. 두 침팬지 모두 3주 간의 간격을 둔 3번의 연속적인 근육내 면역화(RIBI 보조제와 혼합된 50㎍ E1)로 다시 면역하였다. WO 99/67285의 도 8 및 11로부터 판단할 수 있듯이, 항-E1 반응은 다시 바이러스 항원이 탐지 한계의 아래쪽까지 감소하기만 하면 다시 부스팅 될 수 있었다. 혈청 중 바이러스 비중은 Ton에서이기는 하지만 일정하게 유지된다(WO 99/67285의 도 11). 바이러스 증상의 수준이 ml 당 105게놈 해당량 이하라면 추후의 기간 동안 첫번째 시기에 측정되었다.
이미 첫번째 면역화의 경우에 그랬듯이, 서브타입 1b HVC 주(Phil)에 감염된 침팬지는 서브타입 1a HCV 주에 감염된 침팬지보다 낮은 항-E1 역가로 반응한다(첫번째 라운드에서의 최대 역가가 Ton에 대하여 14.5×103대 30×103, 추가적 부스팅 후 Phil에 대하여 1.2×103대 Ton에 대하여 40×103). 양쪽 동물에 대한 유리한 효과가 유사하기는 하지만, 이 실험으로부터 다른 아형 또는 유전형 유래의 E1 단백질로 면역화된 만성 보유자의 면역화가, 숙주에 존재하고 감염 서브타입 또는 유전형에 의하여 유도되는 이미 존재하는 특이적 면역 억제를 회피하면서도 더 높은 역가에 도달할 정도로 특히 유리하다는 결론이 난다. 다른 방법으로, 동일한 셋팅(1b 백신 + 1b 감염)에서 관찰되는 낮은 역가는 바이러스에 대하여 다량의 항체가 결합한다는 것을 나타낸다. 따라서 유도 항체는 중화능을 가질 수 있다.
실시예 15: 침팬지에서 E1-백신화의 예방 효율의 입증
HCV E1 단백질(아미노산 192-326)은 재조합 우두 바이러스 HCV11B를 사용하여 Vero 세포에서 발현되었다. 이 우두 바이러스는 특히 vvHCV11A(참고 문헌에 의하여 본 발명에 전 내용이 삽입된 미국 특허 제 6,150,134호에서 설명)와 동일하지만, RK13에서 Vero 세포로 전해졌다. 이 단백질은 본질적으로 시스테인에 대한 알킬화제로서 요오드아세트아미드를 사용하여, PCT/E99/04342(WO 99/67285)의 실시예 9에서 설명한 바와 같이 분리되었다(렌틸 크로마토그래피, 환원-알킬화 및 크기 배제 크로마토그래피). 분리 후, PCT/E99/04342의 실시예 1에서 설명한 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피에 의하여 3% empigen-BB가 3% 베타인으로 교환되었고, 이 과정은 입자로서 E1을 회복할수 있게 한다. 최종적으로, 물질들은 0.5% 베타인 및 500㎍/㎖ 농도의 E1을 포함하는 PBS로 염이 제거되었다. 이 E1은 50㎍/㎖ 농도의 E1 및 0.13%의 Alhydogel의 농도로 백반-보강 E1을 얻기 위하여, 동일 부피의 Alhydrogel 1.3%(Superofos, Denmark)와 혼합되고, 최종적으로 8배 부피의 0.9% NaCl로 추가로 희석되었다.
HCV E2deltaHVRI (아미노산 412-715) 가 발현되었고, PCT/E99/04342 의 실시예 8 에 기재된 pvHCV-101 로부터 재조합되고 야생형 백시니아 바이러스인 재조합 백시니아 바이러스 HCV101 을 사용하여 본질적으로는 E1 에 대해 기재된 바와 같이 Vero 로부터 정제되었다. 또한, E2deltaHVRI 는 Empigen 에서 베타인으로 교환한 후 입자로 행동하였다 (동역학적 광산란에 의해 측정됨).
HCV-RNA 및 HCV-항체에 대해 음성인 것으로 시험된 5 마리의 침팬지가 선택되었다. 동물 (Huub) 중 하나는 면역되지 않았고, 2 마리 동물 (Marti 및 Yoran) 은 알룸으로 아쥬반트된 50 ㎍ E1 으로 6회 면역시킨 반면, 나머지 2 마리 동물은 아룸으로 아쥬반트된 50 ㎍ E2deltaHVRI 으로 6회 면역시켰다 (Joost 및 Karlien). 모든 면역물은 3 주 간격으로 근육내 투여하였다. 체액성 및 세포성 면역 반응은면역시키는 항원에 대항하여 각각의 동물에서 평가되었고, 각각의 동물에서 두 유형의 반응이 표 11 에서 보는 바와 같이 검축되었다.
모든 침팬지는 감작 후 7 일째에 HCV-RNA 양성이 되었고 (Monitor HCV, Roche, Basel, Switzerland 에 의해 측정됨), 1차 ALT 및 감마GT 피크가 35일 및 63일 사이에 측정되었다. 이는 모든 침팬지들이 급성 간염을 전개했음을 증명한다. 현저하게는, E1 면역된 동물 모두는 이들의 감염을 해결한 반면, E1 면역된 동물은 98일 (Yoran) 및 133일 (Marti) 째에 HCV-RNA 를 유실하였으며 (Monitor HCV, Roche, Basel, Switzerland 에 의해 측정됨), 매달 시험하면서 273일까지 여전히 음성으로 남겨졌다. 모든 다른 동물은 273 일의 전체 추적 기간 동안 여전히 RNA 양성인 것으로 정치하였고, ALT 및 감마GT 값은 E1 면역된 침팬지에 대해서 정상으로 회복되지 않았지만 점차 증가하였다.
표 11:6차 면역화 후 2 주째에 ELISA 에 의해 항체 역가가 결정되었다. 샘플의 일련의 희석물이 집단내 표준 (1000 mU/㎖ 의 E1 또는 항-E2deltaHVRI 항체를 갖는 것으로 정의된 상기 집단내 표준은 높은 항-외피 역가에 기초하여 선택된 HCV 만성 보균자 유래의 3 가지의 혈청 혼합물이다) 과 비교하였다. 세포 면역 반응을 반영하는 자극 지수는 3차 면역화 후 2주째에 동물로부터 채취된 PBMC 를 외피 항원의 존재 또는 부재하에 배양하고 배양 5 일 후 18 시간의 펄스 동안 상기 세포내에 혼입된 적정 티미딘의 양을 결정하는 것에 의해서 수득되었다. 자극 지수는 외피 항원과 함께 배양된 세포에 혼입된 티미딘 대 항원 없이 배양된 것의 비율이다. > 3 의 자극 지수는 양성 시그널로 고려된다.
챔팬지 항-E1 반응 항-E1deltaHCVRI 반응
항체 역가 자극 지수 항체 역가 자극 지수
Yoran 14110 10.9
Marti 5630 14.2
Joost 3210 8.5
Karlien 1770 11.2
마지막의 6회 면역화 후 3주째에, 대조군을 포함하는 모든 동물을 100 CID (챔팬지 감염 분량) 의 유전자형 1b 접종물 (J4.91, Dr. J. Bukh, NIH, Bethesda, Maryland 에 의해 친절히 공급됨) 에 감작시켰다. 백신 단백질 및 J4.91 단리물 (이의 서열 정보는 접근번호 BAA01583 하에 이용가능하다) 사이의 아미노산 서열 상이성은 E1s 에 대해서는 7% (135 아미노산 중 9 개) 이고, E2deltaHVRI 에 대해서는 11% 이고; 결과적으로, 상기 감작은 이질성인 것으로 고려되었고, 실제 생존 감작을 반영한다.
결과적으로, E1 면역화는 만성 감염으로의 전개를 방지함으로써 HCV 감염의 천연 병력학을 변화시키는 것으로 보여졌고, 이는 HCV 에 관련된 주요 건강 문제이다.
실시예 16: 침팬지에서의 감염 제거를 가능하게 하는 유사한 E1 반응은 사람에게서 유도될 수 있다
인간에서 E1 면역화의 예방적 효과를 수득하기 위하여, 침팬지와 비교하여 유사한 면역 반응인 인간에서 유도될 수 있는 것이 요구된다. 따라서, 본 발명자들은 항-E1 반응 (체액성 또는 세포성) 이 검출되지 않은 20 명의 남성 인간 지원자를 0.13% 알히드로겔 상에서 제형화된 3회 분량의 20 ㎍ e1s 0.5 ㎖ 로 백신화시켰다. 모든 면역화물은 3 주간 간격으로 근육내로 제공하였다. 도 12 에서 증명된 바와 같이, 20 명의 지원자 중 17 명이 실제로 상당한 E1 에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응을 일으켰고, 이는 심각한 부작용이 없었다. 3회 El 면역화 후 컷-오프 수준 초과이었기 때문에, 단지 1 명의 지원자 (대상체 021) 만이 비-반응자로서 간주되여야만 했다. 체액성 반응이 챔팬지 수준과 비교하여 낮다는 관찰은, 50 ㎍ 으로 6 회 투여가 아닌 20 ㎍ 에 의한 3회 면역화가 투여되었다는 사실에 관한 것이다.
표 12:3차 면역화 후 2 주째에 ELISA 에 의해 항체 역가가 결정되었다. 샘플의 일련의 희석물이 집단내 표준 (1000 mU/㎖ 의 E1 또는 항-E2deltaHVRI 항체를 갖는 것으로 정의된 상기 집단내 표준은 높은 항-외피 역가에 기초하여 선택된 HCV 만성 보균자 유래의 3 가지의 혈청 혼합물이다) 과 비교하였다. 자극 지수 (세포 면역 반응) 는 3차 면역화 후 2주째에 개체로부터 채취된 PBMC 를 1 ㎍ 의 E1s 의 존재 또는 부재하에 배양하고 배양 5 일 후 18 시간의 펄스 동안 상기 세포내에 혼입된 적정 티미딘의 양을 결정하는 것에 의해서 수득되었다. 자극 지수는 외피 항원과 함께 배양된 세포에 혼입된 티미딘 대 항원 없이 배양된 것의 비율이다. > 3 의 자극 지수는 양성 시그널로 고려된다.
피검체 번호 항체 역가 자극 지수 피검체 번호 항체 역가 자극 지수
002 1370 30.9 014 49 4.6
003 717 13.2 015 228 3.8
004 800 9.1 016 324 4.1
007 680 3.8 017 < 20* 6.2
008 1026 3.9 018 < 20 6.7
009 325 4.6 019 624 3.1
010 898 7.7 020 84 5.5
011 284 4.1 021 < 20 2.1
012 181 3.6 022 226 2.7
013 < 20 3.5 023 163 7.6
* 이 개체는 면역전 샘플 및 3회 면역 후 샘플 사이에서 ELISA 시그널의 상당한 증가가 보였기 때문에 면역 화후 항-E1 양성인 것으로 고려되지만, 역가는 매우 낮고, 정확한 결정이 가능하지 않다.
실시예 17: 백신화된 건강한 지원자에서 E1 반응의 부스팅(boosting)
실시예 16 의 20 명의 인간 지원자 중 19 명이, 26 주째(즉, 3차 면역화 후 20 주째)에, 0.5 ㎖ 의 0.13% 알히드로겔 (Alhydrogel) 상에서 제형화된 20 ㎍ 의 Els 에 의해 1회 이상 부스팅되었다. 다시 항체 역가 및 세포 면역 반응이 상기 추가적인 면역화 후 2 주째에 결정되었다. 모든 개체에 있어서, 항체 역가는 20 주 간격 동안 감소하였지만, 상기 추가적인 면역화에 의해서 8주째에 관찰된 것과 동일하거나 그 보다 높은 수준으로 쉽게 부스팅될 수 있었다. 평균적으로, 항체 역가는 8 주째의 역가와 비교하여 상기 부스팅 후에는 2 배 높았으며, 26 주째 역가와 비교하여 7 배 높았다 (표 13).
20 주 간격 후, 대부분의 개체에 대해서 T-세포 반응이 현저하게 여전히 높았다. 사전 면역화의 결과로서 대부분의 개체에서 존재하는 파상풍 반응에 대한 정상화를 고려하면, 자극 지수의 기하 평균의 변화는 없다. 추가적인 부스팅 후, 파상풍 반응에 대한 정상화를 고려하면, 변화가 없다는 것이 주목된다 (도 51). 이는, 강력한 T-헬프 반응이 3회 E1 면역화 후에 유도된다는 것을 확인시켜 주고, 이들 면역화는 추가적인 부스팅 없이 적어도 6 개월 동안 요구되는 매우 우수한 T-헬프 기억을 이미 유도했다는 것을 나타낸다.
표 13: 3차 면역화 후 2주째 (= 8주째) 및 20주째 (= 26 주째), 및 마지막으로 또한 부스팅 후 2주째 (= 28 주째)에 항체 역가를 결정하였다. 샘플의 일련의 희석물은 집단내 표준과 비교하였다 (1000 mU/㎖ 의 E1 항체를 갖는 것으로 정의된 상기 집단내 표준은 높은 항-외피 역가에 기초하여 선택된 HCV 만성 보균자 유래의3 가지의 혈청 혼합물이다). 정확한 비교를 위하여, 8주째 역가의 결정은 26주째 및 28주째 샘플에서와 동일한 검사내에서 반복되었고, 이는 실시예 16 의 표 12 와의 차이성을 설명한다.
도 51 에 대한 주석: 자극 지수 (세포 면역 반응) 는 면역화 전 (0 주째), 3차 면역화 후 2주째 (8 주째), 부스터 면역화 전 (26 주째) 및 부스터 면역화 후 2 주째 (28 주째) 에 개체로부터 채취된 PBMC (105세포) 를 3 ㎍ 의 재조합 E1s 또는 2 ㎍ 의 파상풍 독소의 존재 또는 부재하에 배양하고, 배양 5 일 후 18 시간의 펄스 동안에 상기 세포에 혼입된 적정 티미딘의 양을 결정하는 것에 의해 수득되었다. 자극 지수는 외피 항원과 함께 배양된 세포에 호닙된 티미딘 대 항원 없이 배양된 것의 비율이다. 0 주째 및 8 주째의 샘플은 1차 검사 (A) 에서 결정된 반면, 26 주째 및 28 주째의 샘플은 2차 검사 (B) 에서 결정되었으며, 이때 0 주째의 샘플이 다시 검사되었다. 결과는 모든 20 (A, 실험) 또는 19 (B, 실험) 의 자극 지수의 기하 평균으로서 표현하였다.
또한, Th1 시토카인 인터페론-감마 및 Th2 시토카인 인터루킨-5 가 26 주째 및 28 주째에 채취된 샘플의 PBMC 배양물의 상청액 중에서 측정하였고, E1 에 의해 다시 자극하였다. 도 52 로부터 판단할 수 있는 바와 같이, E1 자극된 PBMC 에 의해 분비된 우세한 시토카인은 인터페론-감마이었다. 알룸은 Th2 유도자인 것으로 공지되어 있기 때문에, 강력한 Th1 에 치우친 반응이 알룸 아쥬반트화 E1 에 의해 관찰되는 것으로 보여진 것은 매우 놀라운 것이다. 최종 부스터 전에 이미 매우 강력한 반응이 관찰되었기 때문에, 우수한 T-세포 기억이 유도된다는 결과를 한 번 더 확인하였다. 부가적인 실험에서 0 주째에 채취된 샘플을 사용하여, 상기한 지원자의 E1 자극된 세포 배양물과 자극되지 않은 세포 배양물 사이의 차이성이 관찰되지 않았기 때문에, 인터페론-감마 분비는 특이적인 것으로 확인되었다.
도 52 에 대한 주석: 부스터 면역화 전 (26 주째) 및 부스터 면역화 후 2 주째 (28 주째) 의 개체로부터 채취된 PBMC (105세포) 를, 3 ㎍ 의 재조합 E1s (E1) 또는 2 ㎍ 의 파상풍 독소의 존재하에 또는 항원 없이 (B1) 배양하였다. 시토카인을 24 시간 후 (인터루킨-5) 또는 120 시간 후 (인터페론-감마) 에 채취된 상청액에서 ELISA 에 의해 측정하였다. 자극 지수는, 외피 항원과 함께 배양된 세포의 상청액 중에서 측정된 시토카인 대 항원 없이 배양된 것의 비율이다. 결과를 모든 19 명의 지원자에서 분비된 pg 시토카인/㎖ 의 기하 평균으로서 표현하였다. 검출 한계 이하의 시토카인 양을 갖는 샘플은 검출 한계의 값을 지정하였다. 유사하게, 선형 범위의 검사로부터 극도로 높은 농도의 시토카인을 갖는 샘플은 검사의 선형 범위 한계의 값을 지정하였다.
실시예 18: 백신화된 건강한 지원자에서 E1 에 대한 세포 반응의 미세 맵핑
E1 특이적 반응을 맵핑하기 위해서, 표준 Fmoc 화학을 사용하여, 8 개의 아미노산 중첩을 갖고 E1s 의 온전한 서열을 포함하는 일련의 20-mer 펩티드를 합성하였다. 모든 펩티드는, 유리 아미노-말단을 갖는 IGP 1626 을 제외하고는, C-말단 아미드화 및 N-말단 아세틸화되었다.
E1s 로 백신화되지 않은 14 명의 상이한 건강한 공여자 또는 E1s 로 백신화된 10 명의 공여자로부터의 PMBC 를 25 ㎍/㎖ (백신화되지 않은 사람) 또는 10 ㎍/㎖ (백신화된 사람, 3차 또는 부스터 주사 후 채취된 샘플) 의 각각의 펩티드의 개별적인 존재하에 배양하였다. 도 53 으로부터 판단할 수 있는 바와 같이, 펩티드 IGP 1627, 1629, 1630, 1631, 1633, 1635 및 1635 모두는 백신화되지 않은 사람과 비교하여 백신화된 사람에게서 상당히 높은 반응을 유도하였다. 컷-오프로서 3 의 자극 지수를 사용하여, 펩티드 IGP 1627, 1629, 1631 및 1635 는 가장 빈도있게 인식되었다 (즉, 적어도 검사된 백신화된 사람의 절반에 의해 인식됨).
상기 실험은, 이러한 반응이 포유동물 세포 배양물로부터 유래된 동일한 E1s 에 의해서 뿐만 아니라 합성 펩티드에 의해서도 기억될 수 있기 때문에, 포유동물 세포 배양물로부터 유래된 E1s 에 의해 유도된 T-세포 반응이 E1 에 대해 특이적이라는 것을 증명한다. 또한, 상기 실험은, E1 중 가장 면역원성인 T-세포 도메인은 아미노산 위치 204-223, 228-271, 276-295, 300-331 사이에, 더욱 특히 바람직하게는 아미노산 204-223, 228-247, 252-271 및 300-319 사이에 위치된다는 것을 설명한다.
도 53 에 대한 주석: 자극 지수 (세포 면역 반응) 는, 펩티드의 존재 또는 부재하에 PBMC (3 ×105세포) 를 배양하고, 5-6 일간 배양 후 펄스 동안 상기 세포 중에 혼입된 적정 티미딘의 양을 결정하는 것에 의해 수득되었다. 자극 지수는, 펩티드와 함께 배양된 세포에 혼입된 티미딘 대 펩티드 없이 배양된 것의 비율이다. 결과는 백신화된 사람 (상부 패널) 또는 백신화되지 않은 사람 또는 대조군 (하부 패널) 에 대한 개체 값으로 표현하였다.
본 발명은 또한, 하기의 펩티드, 단백질 조성물, 및 그를 포함하는 키트, 상기 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 그를 포함하는 단백질, 및 그들의 제조방법, 및 다른 E1 및 본 발명의 관련 펩티드에 대해 본원에 일반적으로 기재된 용도를 제공한다.
E1 영역의 위치 192 내지 211 에 놓여있는 IGP 1626 (서열번호 112),
E1 영역의 위치 204 내지 223 에 놓여있는 IGP 1627 (서열번호 113),
E1 영역의 위치 216 내지 235 에 놓여있는 IGP 1628 (서열번호 114),
E1 영역의 위치 228 내지 247 에 놓여있는 IGP 1629 (서열번호 115),
E1 영역의 위치 240 내지 259 에 놓여있는 IGP 1630 (서열번호 116),
E1 영역의 위치 252 내지 271 에 놓여있는 IGP 1631 (서열번호 117),
E1 영역의 위치 264 내지 283 에 놓여있는 IGP 1632 (서열번호 118),
E1 영역의 위치 276 내지 295 에 놓여있는 IGP 1633 (서열번호 119),
E1 영역의 위치 288 내지 307 에 놓여있는 IGP 1634 (서열번호 120),
E1 영역의 위치 300 내지 319 에 놓여있는 IGP 1635 (서열번호 121),
E1 영역의 위치 312 내지 331 에 놓여있는 IGP 1636 (서열번호 122).
실시예 19: 사람에게 E1-백신화의 치료적 이용의 예시
HCV E1s 단백질 (아미노산 192-326 (서열번호 123: YEVRNVSGMYHVTNDCSNSSIVYEAADMIMHTPGCVPCVRENNSSRCWVALTPTLAARNASVPTTTIRRHVDLLVGAAAFCSAMYVGDLCGSVFLVSQLFTISPRRHETVQDCNCSIYPGHITGHRMAWDMMMNW)) 은 재조합 백시니아 바이러스 HCV11B 를 사용하여 Vero 세포에서 발현되었다. 상기 백시니아 바이러스는 본질적으로는 vvHCV11A (예를 들어 PCT/EP95/03031 및 USP 6,510,134 에 기재됨; 이들 각각의 전체 내용은 참고로 본원에 통합된다) 과 동일하지만, RK13 으로부터 Vero 세포로 교대되었다. 상기 단백질은, 시스테인에 대한 알킬화제로서 요오도아세트아미드를 사용하여, PCT/E99/04342 (이의 각각이 전체 내용은 참고로 본원에 통합된다) 의 실시예 9 에 기재된 바와 같이, 본질적으로는 정제하였다 (렌틸 크로마토그래피, 환원-알킬 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해). 정제 후, PCT/E99/04342 의 실시예 1 에 기재된 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피에 의해 3% Empigen-BB (N-도데실-N,N-디메틸글리신) 을 3% 베타인으로 교환하였고, 이 과정은 입자로서 E1s 가 회수될 수 있도록 한다. 마지막으로, 상기 물질을 0.5% 베타인 및 400 ㎍/㎖ 의 E1s 농도를 포함하는 PBS 로 탈염시켰다. 상기 E1 은 동일 부피의 알히드로겔 1.3% (Superfos, Denmark) 와 혼합하였고, 마지막으로 8 부피의 0.9% NaCl 에 더 희석하여, 40 ㎍/㎖ 의 농도의 알룸 아쥬반트된 E1 및 0.13% 알히드로겔을 수득하였다.
인간에서 E1 면역화의 치료적 효과를 보여주기 위하여, 만성 감염된 환자에서 면역 반응이 유도되었다. 상기 면역 반응은 정량적 및 정성적으로 상기 환자에 존재하는 E1 에 대한 기준선 반응과는 상이하였다.
26 명의 만성적으로 유전자형 1 에 감염된 HCV 환자를 5회 분량의 0.13% 알히드로겔 상에서 제형화된 20 ㎍ 의 E1s 0.5 ㎖ 로 백신화시켰다. 모든 면역화는 근육내로 수행되었다. 면역화는 0, 4, 8, 12 및 24 주째에 수행되었다. 또한, 9명의 환자에 동일한 수의 알룸만으로 이루어진 위약 주사를 투여하였다. 하기 표 14 로부터 명백한 바와 같이, T-세포 반응은 정상적으로는 만성 HCV 보균자에서는 없다 (단지 4% (26 명 중 1 명)가 검출가능한 T-세포 반응을 갖는다). 면역시, 이는 4회 면역화 후에 이미 약 70% 로 증가하였다 (26 명 중 18 명). 이런 관찰은, 상기 면역 반응이 T-세포 비-반응성으로부터 명백한 반응성으로 정성적으로 변화되었다는 것을 증명한다. 또한, 5차 면역 3 달 후에도 여전히 면역 반응이 동일하거나 다소 증가된 수준이기 때문에, 상기 면역 반응은 커다란 간격을 갖는 부스팅에 의해서 지속될 수 있다. 위약 군에서는 현저한 변화가 관찰되지 않았다.
표 14: 자극 지수 (SI; 세포 면역 반응) 는 4차 면역 후 4 주째 (W16) 및 5차 면역 후 2 주째 (W26) 에 개체로부터 채취된 PMBS 를, 3 ㎍ 의 E1s 의 존재 또는 부재하에 배양하고, 배양 5 일후 18 시간의 펄스 동안에 상기 세포에 혼입된 적정 티미딘의 양을 결정하는 것에 의해 수득되었다. 자극 지수는 외피 항원과 함께 배양된 세포 중에 혼입된 티미딘 대 항원 없이 배양된 것의 비율이다. > 3 의 자극 지수는 양성 스그널로서 고려된다.
T-세포 반응
WO W16 W26
SI > 3 1/26 18/26 17/25
평균 SI 1.5 13.7 19.3
또한, 항체 역가는 1차 면역화 전 (이는 면역화 전 상이한 시점에서 채취된 3 가지의 샘플 상에서 각각의 환자에 대해 수행되었다) 및 5차 면역화 후 (이는 2 가지의 샘플 (W26 및 W28) 상에서 각각의 환자에 대해 수행됨) 에 ELISA 에 의해 결정되었다. 샘플의 일련의 희석물이 집단내 표준과 비교되었다 (상기 언급한 바와 같이, 1000 mU/㎖ 의 E1 항체를 갖는 것으로 정의된 상기 집단내 표준은, 높은 항-외피 역가에 기초하여 선택된 HCV 만성 보균자 유래의 3 가지 샘플의 혼합물이다). 이런 분석으로부터, 평균적으로 역가느 331 에서 715 mU/㎖ 로 배가되었다는 것을 결론내렸다. 이런 결과는, 면역 반응의 체액성 분지가 적어도 정량적으로 변경되었다는 것을 나타낸다.
알룸 상에서 제형화된 E1 백신은 E1 에 대한 정성적 및 정량적 면역 반응을 모두 변화시킨다. 이러한 E1 에 기초한 백신 및/또는 본원에 기재된 임의의 백신은, 한정되지는 않지만 인터페론과 같은 항바이러스 치료와 병용하여, 다르게는 리바비리딘 과 병용하여 투여되는 경우 (즉, 본 발명이 조성물 전, 후 또는 그와 함께), 부가적으로 유용할 수 있다.
하기 및 상기 및 이후에 나타난 교과서, 참고서, 특허, 간행물 등은 참고로 그 전체가 본원에 통합된다.
실시예 20: 만성 감염된 환자에서 치료적 E1-백신화의 효과
본 연구의 1차 과정으로, 실시예 19 에 기재된 바와 같이, 26 명의 환자에 5회 분량의 20 ㎍ 의 E1s 를 투여하였다. 2차 과정으로, 상기 26 명의 환자 중 25 명에 6 회 근육내 분량의 0.13% 알히드로겔 상에서 제형화된 20 ㎍ 의 E1s 0.5 ㎖ 를 더 투여하였다 (실시예 19 에서와 같이). 상기 2차 시리즈의 면역화는 3 주 간격으로 투여되었고, 1차 주사는 50 주째에 제공하였다. 2차 과정의 마지막 주사 후 4 주째에, 치료적 E1s 백신화의 완전한 두 과정을 완료한 25 명의 환자 중 24 명에서 간 조직편 검사를 수행하였다. 간 조직편 검사는 또한 치료적 백신 치료의개시 전에 (즉, 과정 1 백신화 계획 전에) 모든 환자에서 수행되었다. 치료전 및 치료후 생체조직편 검사 사이에 경과된 평균 시간은 17 개월이었다. 치료적 백신화 전 및 후에 수득된 상기 간 조직학 슬라이드를, Ishak 및 Metavir 스코어링계 (Knodell 등의 스코어링계의 변형인 Ishak 등 1995; Bedossa 및 Poynard 1996) 에 따라 섬유증 및 염증에 대해, 및 국제특허출원 WO99/50301 에 기재된 바와 같이 IGH222 뮤린 항-E2 HVRI 모노클로날 항체를 사용하는 항-E2 면역염색에 대해, 두 명의 숙련된 병리학자에 의해 맹목적 방식으로 중점적으로 스코어링하였다. 말초동모양혈관 섬유증은 시리우스 레드 (Sirius Red) 에 의한 콜라겐의 염색에 기초하여 평가하였다 (간 조직학 슬라이드 상에서).
Ishak 스코어는 염증의 등급화에 대해서는 0 내지 18 범위이고, 섬유증/간경변에 대해서는 0 내지 6 의 범위이다. Ishak 염증 및 섬유증 스코어의 합은 폭넓게 사용되어 온 조직학적 활성 지수 (HAI; Knodell 등 1981) 와 밀접하게 된다. 치료적 E1s 백신화의 두 과정을 수행한 24 명의 환자에서 Ishak 섬유증 스코어에 있어서의 변화는 -0.04 (-0.60 내지 + 0.68 의 95% 신뢰 구간) 이고, 기준선-값에서 말단-값으로의 변화는 2.54 (기준선) 에서 2.50 (말단) 이다.
상이하게 평가된 괴사-염증 강도 (Ishak 스코어링)의 개관은 표 15 에 제공된다.
치료된 환자에 대한 HAI 스코어의 Ishak 등가는, -0.17 의 기준선 값으로부터의 절대적 평균 변화 (-1.36 내지 1.03 의 95% 신뢰 구간) 을 나타내었고, 기준선-값에서 말단-값으로의 변화는 8.88 (기준선) 에서 8.71 (말단) 이었다. 또한,24 명의 환자 중 9 명 (38%) 은 Ishak 염증- 및 Ishak 섬유증-스코어의 합에 대해 2 포인트 이상 개선한 반면, 24 명의 환자 중 10 명은 안정하게 남겨졌고 (변화 없음 또는 +1 또는 -1 변화), 5 명의 환자는 악화된 조건으로 전개되었다 (2 포인트 이상 악화).
Metavir 스코어는 염증 등급화에 대해서는 0 내지 3 의 범위이고, 섬유증/간경변의 단계화에 대해서는 0 내지 4 이다. 치료되지 않은 환자에서 Metavir 스코어의 전체 진전율은 해마다 0.133 인 것으로 추정된다 (Poynard 등 1997).
본 연구의 환자에 대해서는, 기준선 스코어의 선형 확장에 기초한 17 개월의 기간 및 추정된 감염 기간에 걸친 평균 진전은 (이는 치료적 E1s 백신화의 두 과정을 수행한 24 명의 환자 중 19 명에 대해서 기록된다) 0.20 이었다. 이는, 17 개월의 기간에 대해서 0.19 인 공개된 전체 진전율과 매우 상관관계가 있다.
그러나, 치료된 환자에 대해 관찰된 Metavir 스코어에 있어서의 변화는 0.00 이고 (-0.43 내지 + 0.43 의 95% 신뢰구간), 평균 기준선-스코어 및 말단-스코어는 1.67 이다. 2차 과정 치료의 기준선 및 말단의 Metavir 스코어의 개관은 표 16 에 나타낸다. 치료전 및 치료후 슬라이드의 비(非)맹목 비교는, 10 명의 환자에서 시리우스 레드 염색에 기초한 말초동모양혈관 섬유증이 감소되었음을 밝혀냈다.
항-E2 면역염색 스코어는 0 내지 4 의 범위이다 (0 = 검출가능하지 않은 E2 항원, 1 = 검출가능한 E2 항원을 갖는 우발적 세포, 2 = E2 항원 양성 세포의 클러스터, 그러나 25% 미만의 세포가 양성임, 3 = E2 항원 양성 세포의 클러스터이고 25 내지 50% 이 세포가 양성임, 4 = E2 항원 양성 세포의 클러스터이고 50% 초과의세포가 양성임). 치료된 환자에 대한 항-E2 면역염색 스코어는, -0.75 의 기준선으로부터의 절대적 평균을 나타내었고 (-1.64 내지 0.14 의 95% 신뢰 구간), 기준선-값에서 말단-값으로의 변화는 2.54 (기준선) 에서 1.79 (말단) 이었다. 맹목 스코어링을 사용하는 간에서의 항-E2 면역반응성에 대해 보여진 감소는, 환자마다 짝지워진 슬라이드의 비맹목적 비교에 의해 확인되었다. 11 명의 환자는 HCV E2 면역염색에 있어서 음성화 또는 현저한 감소를 나타낸 반면, 단지 3 명의 환자만이 치료후 강력한 면역염색을 가졌다. 이들 11 명의 환자 중, 3 명은 또한 지방증이 감소를 나타내었다.
혈청 HCV RNA 수준은 Amplicor HCV Monitor 키트 (Roche, Basel, Switzerland) 를 사용하여 결정하였다. 혈청 HCV RNA 수준은 1 명의 환자를 제외하고는 변화되지 않거나 기준선으로부터 1 로그(log) 초과로 변화하지 않았다. 이는, 유전자형 1a 에 감염되고 기준선의 flu-유사 증상을 갖는 37세 치료-나이브 여성 환자에 관계되었다. HCV-RNA 는 8주째로부터 (E1 에 의한 2회 감염 후) 3 로그 감소하여, 16 및 20 주째에 3000 IU/㎖ 미만의 수준에 도달하였고, 그와 동시에, ALT 도 8 주째에 400 U/㎖ 이 단일 피크값으로부터 16, 20 및 24 주째의 정상적인 ALT 값으로 감소하였다. 이 기간 후, ALT 및 HCV-RNA 모두 다시 증가하였고, 증상이 다시 나타났다. 나타난 바이러스 부하 증가 동안에 존재하는 바이러스의 서열은 기준선 서열과 비교하였다. 탈출 돌연변이체 바이러스이 존재에 대한 증가는 발견되지 않았다.
치료된 환자에서 혈청 ALT (알라닌 아미노트랜스퍼라아제 활성) 수준은, 기준선 수준과 비교하여 평균 22% 감소하였다 (-15% 내지 -30% 의 95% 신뢰 구간). ALT 수준의 기준선으로부터의 % 변화 및 섬유증 스코어에서의 기준선으로부터의 절대적 변화 사이의 양성적 상호관련성은 주목되었다: Ishak 스코어에 대해서는 p = 0.0007 및 Metavir 스코어에 대해서는 p = 0.002 의 Spearman 랭크가 혈청 ALT 수준에서의 기준선을보퉈의 변화 및 기준선 Ishak 및 Metavir 섬유증 스코어 각각으로부터의 절대적 변화 사이의 상호관련성으로서 수득되었다.
본 연구의 다른 결과는 조직학적 소코어 (섬유증 및 전체) 및 혈청 ALT 수준에 있어서의 개선을 위한 치료에 대한 면역 반응 (혈청 항-E1s 항체 수준에 있어서의 증가의 면에서) 의 예상되는 특징이다.
항체 역가가 ELISA 에 의해서 결정되었다. 혈청 샘플의 일련의 희석물을 집단내 표준 (1000 mU/㎖ 의 E1s 항체를 갖는 것으로 정의된 상기 집단내 표준은 높은 항-외피 역가에 기초하여 선택된 HCV 만성 보균자 유래의 3 가지의 혈청 혼합물이다) 과 비교하였다. 이 검사에 대한 검출 한계는 5 mU/㎖ 이다.
p = 0.007 의 Spearman rank 는 혈청 항-E1 항체 수준에서의 기준선으로부터의 변화와 총 Ishak (염증 + 섬유증) 스코어에서의 기준선으로부터의 절대적 변화 사이의 상호관련성으로서 수득되었다. p = 0.06 및 p = 0.009 의 Pearson p-값은 혈청 항-E1 항체 수준에서의 기준선으로부터의 변화와 Ishak 섬유증 스코어에서의 기준선으로부터의 절대적 (p = 0.06) 및 상대적 (p = 0.009) 변화 각각 사이의 상호관련성으로서 수득되었다. p = 0.01 의 Pearson p-값은 혈청 항-E1 항체 수준에서의 기준선으로부터의 변화와 ALT 값에서의 기준선으로부터의 상대적 변화 사이의상호관련성으로서 수득되었다.
이러한 관계는 기준선 간 조직학 스코어, ALT, 혈청 HCV-RNA 바이러스 부하, 연령 및 성별, 및 IFN 노출에 대한 보정 후에도 유지되어, 따라서 치료적 E1s 백신화 치료에 의해 유도되는 실제 양성 효과의 가능성에 부가된다.
치료적 백신 후보물질에 반응하여 혈청 항체 수준의 가장 높은 증가를 갖는 7 명의 환자 (즉, 700 mU/㎖ 이상의 항-E1 항체 수준의 증가를 갖는 환자) 는, Metavir 간 섬유증 스코어 상에서 평균 -0.9 포인트의 현저한 감소 (-0.2 내지 -1.5 의 95% 신뢰 구간) 를 가졌다. 상기 아군에서, 혈청 ALT 는 평균 37% 감소하였다 (-25 내지 -49% 의 95% 신뢰 구간). 표 17 은 면역 반응 (치료에 의해 유도된 항-E1 항체 수준의 면에서) 및 Ishak 스코어에서의 전체 변화 (기준선에 대해 상대적임) 사이의 상호관련성의 개관을 제공한다. 도 54 는 Ishak 섬유증 스코어에서의 변화, ALT-수준에서의 변화 및 항-E1s 항체 수준에서의 변화 사이의 상호관련성을 나타낸다. 도 55 는 Metavir 섬유증 스코어에서의 변화, ALT-수준에서의 변화 및 항-E1s 항체 수준에서의 변화 사이의 상호관련성을 나타낸다. 도 56 은, 1차 치료 과정의 개시시 (패널 A) 및 2차 치료 과정의 말기시 (패널 B) 모두에서 Ishak 섬유증 대 ALT 수준을 나타낸다. 도 57 은 1차 치료 과정의 개시시 (패널 A) 및 2차 치료 과정의 말기시 (패널 B) 모두에서 환자의 연령 대 Ishak 섬유증 스코어를 나타낸다. 도 56 및 57 은 또한, 치료적 백신화 치료에 의해 유도된 항-E1s 항체 수준에 있어서의 가장 높은 증가를 갖는 7 명의 환자를 나타낸다.
2차 치료 과정의 말기시에 혈청 항-E1s 항체 수준 및 T 세포 증식 지수 값사이의 양성적 상호관련성이 관찰되었다 (p = 0.009 의 Pearson p-값).
결론적으로, E1s 백신화에 대한 항체 수준의 증가로, 간 섬유증 (Metavir 및 Ishak 스코어), 염증 및 섬유증 스코어 (Ishak) 의 합, 및 ALT 수준에 있어서의 개선이, 심지어 임의의 다른 기준선 예후적 변화에 대한 보정 후에도, 상당히 예측되었다. 백신화 후 항-E1 항체에 있어서의 증가는 또한 E1 에 대한 T 세포 증식 지수의 증가와 상당히 상호관련성이 있었다.
본 연구는 간경변으로의 질환 진전을 멈추게 하는 잠재성을 갖는 E1 에 기초한 치료적 백신화 전략에 대해 명백히 지지한다.
표 15.말초문정맥 간염, 컨플루언트 괴사, 병소 염증, 문정맥 염증 및 전체 총 염증 등급화에 대한 괴사-염증 강도의 Ishak 등급화. 스코어는 기준선으로부터의 변화 (평균 및 95% 신뢰 구간), 및 평균 기준선-값에서 말단-값으로의 변화로서 나타낸다.
하기에 대한 스코어 기준선으로부터의 스코어의 변화평균 (95% 신뢰 구간) 기준선으로부터 말단으로의 스코어의 변화(평균)
말초문정맥 간염 -0.21 (-0.62 내지 0.20) 1.42 에서 1.21
컨플루언트 괴사 0.38 (-0.17 내지 0.92) 0.00 에서 0.38
병소 염증 -0.17 (-0.59 내지 0.26) 2.63 에서 2.46
문정맥 염증 -0.13 (-0.51 내지 0.26) 2.29 에서 2.17
총 염증 등급화 -0.13 (-1.18 내지 0.93) 6.33 에서 6.21
표 16.소정의 기준선 Metavir 스코어 (상부 열에 나타냄; 기준선 0 내지 4) 대 치료적 E1s 백신화의 2차 과정의 말기에서의 소정의 Metavir 스코어 (왼쪽 열에 나타냄; EOT 0 내지 4)의 변화의 빈도 (환자수로 나타냄) 의 개관. 예를 들어, "*" 로 표시된 "5" (즉, "5*") 는, 5 명의 환자가 1 의 기준선 Metavir 스코어 및 2차 과정 치료의 말기에서 0 의 Metavir 스코어 (EOT = 치료 말기) 를 가짐을 의미한다.
기준선 0 기준선 1 기준선 2 기준선 3 기준선 4 총
EOT 0 0 5* 1 0 0 6
EOT 1 1 3 2 0 0 6
EOT 2 0 5 1 0 0 6
EOT 3 0 0 0 1 1 2
EOT 4 0 0 1 2 1 4
총 1 13 5 3 1 24
표 17.치료제 E1s 백신화에 의해 유도된 혈청 항-E1 항체 수준 및 전체 Ishak 스코어의 변화 사이의 상호관련성. 표에 개요된 가능한 기준에 해당하는 환자수를 나타낸다.
Ishak 스코어의 전체 변화 (기준선으로부터의 변화) < -1 -1, 0 또는 +1 > +1
높은 항-E1s 항체 반응 5 2 0
낮은 항-E1s 항체 반응 4 8 5
실시예 21: 치료적 E1-백신화 요법의 효과
본 연구의 1차 과정으로, 실시예 19 에 기재된 바와 같이, 26 명의 환자에 5회 분량의 20 ㎍ E1s 를 투여하였고 ("E1s 환자"), 9 명의 환자에 동일한 수의 알룸만으로 이루어진 위약을 투여하였다 ("위약 환자"). 2차 과정으로, 1차 과정 동안 E1s 를 투여한 상기 26 명의 환자 중 25 명 및 위약을 투여한 9 명의 환자 중 9 명을 모두, 6회 근육내 분량의 0.13% 알히드로겔 상에서 제형화된 20 ㎍ E1s 0.5 ㎖ 로 더 면역시켜, 두 군의 환자를 초래하였다: "E1s/E1s 환자" 및 "위약/E1s 환자". 상기 2차 시리즈, 즉 과정 2 의 면역화는 (1차 시리즈, 즉 과정 2 동안의4 주 간격과 비교하여) 3 주 간격으로 투여하였고, 1차 주사를 50 주째에 제공하였다. 4회 E1s 주입 후 항-E1 항체에 대한 중간값은 4 주 간격에 대해서는 195 mU/㎖ 이었고 (E1s 환자로부터 유추됨), 3 주 간격에 대해서는 274 mU/㎖ 이었으며 (위약/E1s 환자로부터 유추됨), 따라서 이는 3-주 간격 요법이 짧은 기간 내에서 더욱 강력한 체액성 면역 반응을 유도함을 나타낸다.
위약/E1s 환자에서, E1s-특이적 T 세포 증식은 기준선의 0/9 의 환자에서 3 주 간격을 갖는 6회 주사후 69 주째에 9/9 환자로 증가하였다.
건강한 남성 지원자 (실시예 16 및 17 참조) 에서 E1s 에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응이 환자 군에서의 것과 비교할 경우, 항-E1 항체 수준 및 T 세포 반응의 다소 느린 증가가 관찰된다. 건강한 지원자에서 보여진 부스터 효과는 환자에서는 거의 없었고 (4차 면역 후 12 주째에 부스터로서 E1s/E1s 환자에 투여된 5 차 면역화 후 165 mU/㎖ 의 중간 역가), 이는 환자에서 E1s 에 대한 면역학적 기억의 다소 손상된 구축을 제안한다. 3 주 간격으로 반복된 근육내 주사는 상기 손상을 극복하는 것 같고 (위약/E1s 환자에서 3 주 간격으로 6회 연속 면역화시킨 후 530 mU/㎖ 의 중간 역가), 이는 3 주 간격을 갖고/거나 1차 시리즈의 면역화에서 4회 분량 초과로 투영하는 E1s 백신화 용법의 또다른 이점을 나타낸다.
참조 문헌
본원에 인용된 모든 참조문헌은 참고로 그 전체가 본원에 통합된다.
<110> Innogenetics N.V. <120> Purified hepatitis C virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use. <140> PCT/EP02/14480 <160> 123 <170> PatentIn 3.1 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 1 ggcatgcaag cttaattaat t 21 <210> 2 <211> 68 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 2 ccggggaggc ctgcacgtga tcgagggcag acaccatcac caccatcact aatagttaat 60 taactgca 68 <210> 3 <211> 642 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <220> <221> CDS <222> (1)..(639) <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(636) <400> 3 atg ccc ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg gct tta ctg tcc tgt 48 Met Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys 1 5 10 15 ctg acc att cca gct tcc gct tat gag gtg cgc aac gtg tcc ggg atg 96 Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Met 20 25 30 tac cat gtc acg aac gac tgc tcc aac tca agc att gtg tat gag gca 144 Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala 35 40 45 gcg gac atg atc atg cac acc ccc ggg tgc gtg ccc tgc gtt 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cca caa gct gtc 528 Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val 165 170 175 gtg gac atg gtg gcg ggg gcc cat tgg gga gtc ctg gcg ggc ctc gcc 576 Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala 180 185 190 tac tat tcc atg gtg ggg aac tgg gct aag gtt ttg att gtg atg cta 624 Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu 195 200 205 ctc ttt gct ctc taa t ag 642 Leu Phe Ala Leu *** 210 <210> 4 <211> 213 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 4 Met Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys 1 5 10 15 Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Met 20 25 30 Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala 35 40 45 Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu 50 55 60 Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala 65 70 75 80 Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu 85 90 95 Leu Val Gly Ala Ala Ala Leu Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu 100 105 110 Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Ile Ser Pro Arg 115 120 125 Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His 130 135 140 Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro 145 150 155 160 Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val 165 170 175 Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala 180 185 190 Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu 195 200 205 Leu Phe Ala Leu *** 210 <210> 5 <211> 795 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <220> <221> CDS <222> (1)..(792) <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(789) <400> 5 atg ttg ggt aag gtc atc gat acc ctt aca tgc ggc ttc gcc gac ctc 48 Met Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu 1 5 10 15 gtg ggg tac att ccg ctc gtc ggc gcc ccc cta ggg ggc gct gcc agg 96 Val Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg 20 25 30 gcc ctg gcg cat ggc gtc cgg gtt ctg gag gac ggc gtg aac tat gca 144 Ala Leu Ala His 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*** 260 <210> 6 <211> 264 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 6 Met Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu 1 5 10 15 Val Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg 20 25 30 Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala 35 40 45 Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu 50 55 60 Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val 65 70 75 80 Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val 85 90 95 Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys 100 105 110 Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr 115 120 125 Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His 130 135 140 Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val 145 150 155 160 Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Ile 165 170 175 Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr 180 185 190 Pro Gly His Ile Thr Gly His 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Leu 50 55 60 ctg tcc tgt ctg acc att cca gct tcc gct tat gag gtg cgc aac gtg 240 Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val 65 70 75 80 tcc ggg atg tac cat gtc acg aac gac tgc tcc aac tca agc att gtg 288 Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val 85 90 95 tat gag gca gcg gac atg atc atg cac acc ccc ggg tgc gtg ccc tgc 336 Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys 100 105 110 gtt cgg gag aac aac tct tcc cgc tgc tgg gta gcg ctc acc ccc acg 384 Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr 115 120 125 ctc gca gct agg aac gcc agc gtc ccc act acg aca ata cga cgc cac 432 Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His 130 135 140 gtc gat ttg ctc gtt ggg gcg gct gct ttc tgt tcc gct atg tac gtg 480 Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val 145 150 155 160 ggg gat ctc tgc gga tct gtc ttc ctc gtc tcc cag ctg ttc acc atc 528 Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu 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Hepatitis C virus <400> 10 Met Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys 1 5 10 15 Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Val 20 25 30 Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala 35 40 45 Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu 50 55 60 Gly Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala 65 70 75 80 Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu 85 90 95 Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu 100 105 110 Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg 115 120 125 Arg His Gln Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His 130 135 140 Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser *** 145 150 155 160 <210> 11 <211> 480 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <220> <221> CDS <222> (1)..(477) <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(474) <400> 11 atg tcc ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg gcc ctg ctg tcc tgt 48 Met Ser Gly Cys Ser 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tac cat gtc acg aac gac tgc tcc aac tca agc att gtg 288 Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val 85 90 95 tat gag gca gcg gac atg atc atg cac acc ccc ggg tgc gtg ccc tgc 336 Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys 100 105 110 gtt cgg gag aac aac tct tcc cgc tgc tgg gta gcg ctc acc ccc acg 384 Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr 115 120 125 ctc gcg gct agg aac gcc agc atc ccc act aca aca ata cga cgc cac 432 Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Ile Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His 130 135 140 gtc gat ttg ctc gtt ggg gcg gct gct ttc tgt tcc gct atg tac gtg 480 Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val 145 150 155 160 ggg gat ctc tgc gga tct gtc ttc ctc gtc tcc cag ctg ttc acc atc 528 Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Ile 165 170 175 tcg cct cgc cgg cat gag acg gtg cag gac tgc aat tgc tca atc tat 576 Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr 180 185 190 ccc 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<220> <221> mat_peptide <222> (1)..(717) <400> 21 atg ttg ggt aag gtc atc gat acc ctt aca tgc ggc ttc gcc gac ctc 48 Met Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu 1 5 10 15 gtg ggg tac att ccg ctc gtc ggc gcc ccc cta ggg ggc gct gcc agg 96 Val Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg 20 25 30 gcc ctg gcg cat ggc gtc cgg gtt ctg gag gac ggc gtg aac tat gca 144 Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala 35 40 45 aca ggg aat ttg ccc ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg gct ttg 192 Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu 50 55 60 ctg tcc tgt ctg acc gtt cca gct tcc gct tat gaa gtg cgc aac gtg 240 Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val 65 70 75 80 tcc ggg atg tac cat gtc acg aac gac tgc tcc aac tca agc att gtg 288 Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val 85 90 95 tat gag gca gcg gac atg atc atg cac acc ccc ggg tgc gtg ccc tgc 336 Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met 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Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val 210 215 220 ggg aac tgg gct aag gtt ttg att gtg atg cta ctc ttt gct ccc taa 720 Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Pro *** 225 230 235 240 tag 723 <210> 22 <211> 240 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 22 Met Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu 1 5 10 15 Val Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg 20 25 30 Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala 35 40 45 Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu 50 55 60 Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val 65 70 75 80 Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val 85 90 95 Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys 100 105 110 Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr 115 120 125 Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His 130 135 140 Val Asp Ser Gln Leu Phe Thr Ile Ser Pro Arg Arg His Glu 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tcc att tac agt 576 Pro Arg Gln His Ala Thr Val Gln Asn Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Ser 180 185 190 ggc cat gtt acc ggc cac cgg atg gca tgg gat atg atg atg aac tgg 624 Gly His Val Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp 195 200 205 taa tag 630 *** <210> 32 <211> 209 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 32 Met Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met 1 5 10 15 Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Gly Pro Ile Gly Gly Val Ala Arg Ala 20 25 30 Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr 35 40 45 Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Ile Leu Ala Leu Leu 50 55 60 Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Val Pro Tyr Arg Asn Ala Ser 65 70 75 80 Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro Asn Ser Ser Ile Val Tyr 85 90 95 Glu Ala Asp Asn Leu Ile Leu His Ala Pro Gly Cys Val Pro Cys Val 100 105 110 Met Thr Gly Asn Val Ser Arg Cys Trp Val Gln Ile Thr Pro Thr Leu 115 120 125 Ser Ala Pro Ser Leu Gly Ala Val Thr Ala Pro Leu Arg Arg Ala Val 130 135 140 Asp Tyr Leu Ala Gly Gly Ala Ala Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly 145 150 155 160 Asp Ala Cys Gly Ala Leu Phe Leu Val Gly Gln Met Phe Thr Tyr Arg 165 170 175 Pro Arg Gln His Ala Thr Val Gln Asn Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Ser 180 185 190 Gly His Val Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp 195 200 205 *** <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 33 tgggatatga tgatgaactg gtc 23 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 34 ctattatggt ggtaagccac agagcaggag 30 <210> 35 <211> 1476 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <220> <221> CDS <222> (1)..(1473) <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(1470) <400> 35 tgg gat atg atg atg aac tgg tcg cct aca acg gcc ctg gtg gta tcg 48 Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser 1 5 10 15 cag ctg ctc cgg atc cca caa gct gtc gtg gac atg gtg gcg ggg gcc 96 Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala 20 25 30 cat tgg gga gtc ctg gcg ggc ctc gcc tac tat tcc atg gtg ggg aac 144 His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn 35 40 45 tgg gct aag gtt ttg gtt gtg atg cta ctc ttt gcc ggc gtc gac ggg 192 Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly 50 55 60 cat acc cgc gtg tca gga ggg gca gca gcc tcc gat acc agg ggc ctt 240 His Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp Thr Arg Gly Leu 65 70 75 80 gtg tcc ctc ttt agc ccc ggg tcg gct cag aaa atc cag ctc gta aac 288 Val Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn 85 90 95 acc aac ggc agt tgg cac atc aac agg act gcc ctg aac tgc aac gac 336 Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp 100 105 110 tcc ctc caa aca ggg ttc ttt gcc gca cta ttc tac aaa cac aaa ttc 384 Ser Leu Gln Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe 115 120 125 aac tcg tct gga tgc cca gag cgc ttg gcc agc tgt cgc tcc atc gac 432 Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp 130 135 140 aag ttc gct cag ggg tgg ggt ccc ctc act tac act gag cct aac agc 480 Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Ser 145 150 155 160 tcg gac cag agg ccc tac tgc tgg cac tac gcg cct cga ccg tgt ggt 528 Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly 165 170 175 att gta ccc gcg tct cag gtg tgc ggt cca gtg tat tgc ttc acc ccg 576 Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro 180 185 190 agc cct gtt gtg gtg ggg acg acc gat cgg ttt ggt gtc ccc acg tat 624 Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr 195 200 205 aac tgg ggg gcg aac gac tcg gat gtg ctg att ctc aac aac acg cgg 672 Asn Trp Gly Ala Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile Leu Asn Asn Thr Arg 210 215 220 ccg ccg cga ggc aac tgg ttc ggc tgt aca tgg atg aat ggc act ggg 720 Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly 225 230 235 240 ttc acc aag acg tgt ggg ggc ccc ccg tgc aac atc ggg ggg gcc ggc 768 Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Ala Gly 245 250 255 aac aac acc ttg acc tgc ccc act gac tgt ttt cgg aag cac ccc gag 816 Asn Asn 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Ser Leu Phe 50 55 60 Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser 65 70 75 80 Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr 85 90 95 Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe Asn Ser Ser Gly 100 105 110 Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp Lys Phe Ala Gln 115 120 125 Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Ser Ser Asp Gln Arg 130 135 140 Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala 145 150 155 160 Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val 165 170 175 Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Ala 180 185 190 Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly 195 200 205 Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr 210 215 220 Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu 225 230 235 240 Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala 245 250 255 Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met Val His 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Gly Leu Val Ser 50 55 60 ctc ttt agc ccc ggg tcg gct cag aaa atc cag ctc gta aac acc aac 235 Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn 65 70 75 ggc agt tgg cac atc aac agg act gcc ctg aac tgc aac gac tcc ctc 283 Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu 80 85 90 caa aca ggg ttc ttt gcc gca cta ttc tac aaa cac aaa ttc aac tcg 331 Gln Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe Asn Ser 95 100 105 110 tct gga tgc cca gag cgc ttg gcc agc tgt cgc tcc atc gac aag ttc 379 Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp Lys Phe 115 120 125 gct cag ggg tgg ggt ccc ctc act tac act gag cct aac agc tcg gac 427 Ala Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Ser Ser Asp 130 135 140 cag agg ccc tac tgc tgg cac tac gcg cct cga ccg tgt ggt att gta 475 Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val 145 150 155 ccc gcg tct cag gtg tgc ggt cca gtg tat tgc ttc acc ccg agc cct 523 Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys 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Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala 290 295 300 Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg 305 310 315 320 Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gly Asp Arg Gly Gln 325 330 335 Thr Pro Ser Pro Pro Ser Leu 340 <210> 41 <211> 945 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <220> <221> CDS <222> (1)..(942) <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(939) <400> 41 atg gtg ggg aac tgg gct aag gtt ttg gtt gtg atg cta ctc ttt gcc 48 Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala 1 5 10 15 ggc gtc gac ggg cat acc cgc gtg tca gga ggg gca gca gcc tcc gat 96 Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp 20 25 30 acc agg ggc ctt gtg tcc ctc ttt agc ccc ggg tcg gct cag aaa atc 144 Thr Arg Gly Leu Val Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile 35 40 45 cag ctc gta aac acc aac ggc agt tgg cac atc aac agg act gcc ctg 192 Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu 50 55 60 aac tgc aac gac tcc ctc caa aca ggg ttc ttt gcc gca cta ttc tac 240 Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr 65 70 75 80 aaa cac aaa ttc aac tcg tct gga tgc cca gag cgc ttg gcc agc tgt 288 Lys His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys 85 90 95 cgc tcc atc gac aag ttc gct cag ggg tgg ggt ccc ctc act tac act 336 Arg Ser Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr 100 105 110 gag cct aac agc tcg gac cag agg ccc tac tgc tgg cac tac gcg cct 384 Glu Pro Asn Ser Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro 115 120 125 cga ccg tgt ggt att gta ccc gcg tct cag gtg tgc ggt cca gtg tat 432 Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr 130 135 140 tgc ttc acc ccg agc cct gtt gtg gtg ggg acg acc gat cgg ttt ggt 480 Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly 145 150 155 160 gtc ccc acg tat aac tgg ggg gcg aac gac tcg gat gtg ctg att ctc 528 Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Ala Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile Leu 165 170 175 aac aac acg cgg ccg ccg cga ggc aac tgg ttc ggc tgt aca tgg atg 576 Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met 180 185 190 aat ggc act ggg ttc acc aag acg tgt ggg ggc ccc ccg tgc aac atc 624 Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile 195 200 205 ggg ggg gcc ggc aac aac acc ttg acc tgc ccc act gac tgt ttt cgg 672 Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg 210 215 220 aag cac ccc gag gcc acc tac gcc aga tgc ggt tct ggg ccc tgg ctg 720 Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu 225 230 235 240 aca cct agg tgt atg gtt cat tac cca tat agg ctc tgg cac tac ccc 768 Thr Pro Arg Cys Met Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro 245 250 255 tgc act gtc aac ttc acc atc ttc aag gtt agg atg tac gtg ggg ggc 816 Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly 260 265 270 gtg gag cac agg ttc gaa gcc gca tgc aat tgg act cga gga gag cgt 864 Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg 275 280 285 tgt gac ttg gag gac agg gat aga tca gag ctt agc ccg ctg ctg ctg 912 Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu 290 295 300 tct aca aca gag tgg cag agc tta att aat tag 945 Ser Thr Thr Glu Trp Gln Ser Leu Ile Asn 305 310 <210> 42 <211> 314 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 42 Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp 20 25 30 Thr Arg Gly Leu Val Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile 35 40 45 Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu 50 55 60 Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr 65 70 75 80 Lys His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys 85 90 95 Arg Ser Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr 100 105 110 Glu Pro Asn Ser Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro 115 120 125 Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr 130 135 140 Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp 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Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu 225 230 235 240 aca cct agg tgt atg gtt cat tac cca tat agg ctc tgg cac tac ccc 768 Thr Pro Arg Cys Met Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro 245 250 255 tgc act gtc aac ttc acc atc ttc aag gtt agg atg tac gtg ggg ggc 816 Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly 260 265 270 gtg gag cac agg ttc gaa gcc gca tgc aat tgg act cga gga gag cgt 864 Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg 275 280 285 tgt gac ttg gag gac agg gat aga tca gag ctt agc ccg ctg ctg ctg 912 Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu 290 295 300 tct aca aca ggt gat cga ggg cag aca cca tca cca cca tca cta ta 960 Ser Thr Thr Gly Asp Arg Gly Gln Thr Pro Ser Pro Pro Ser Leu 305 310 315 g 961 <210> 44 <211> 319 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 44 Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp 20 25 30 Thr Arg Gly Leu 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ctc cgg atc cca 672 Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro 210 215 220 caa gct gtc gtg gac atg gtg gcg ggg gcc cat tgg gga gtc ctg gcg 720 Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala 225 230 235 240 ggc ctc gcc tac tat tcc atg gtg ggg aac tgg gct aag gtt ttg gtt 768 Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val 245 250 255 gtg atg cta ctc ttt gcc ggc gtc gac ggg cat acc cgc gtg tca gga 816 Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val Ser Gly 260 265 270 ggg gca gca gcc tcc gat acc agg ggc ctt gtg tcc ctc ttt agc ccc 864 Gly Ala Ala Ala Ser Asp Thr Arg Gly Leu Val Ser Leu Phe Ser Pro 275 280 285 ggg tcg gct cag aaa atc cag ctc gta aac acc aac ggc agt tgg cac 912 Gly Ser Ala Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His 290 295 300 atc aac agg act gcc ctg aac tgc aac gac tcc ctc caa aca ggg ttc 960 Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe 305 310 315 320 ttt gcc gca cta ttc tac aaa cac 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aca tgg atg aat ggc act ggg ttc acc aag acg tgt ggg 1344 Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly 435 440 445 ggc ccc ccg tgc aac atc ggg ggg gcc ggc aac aac acc ttg acc tgc 1392 Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu Thr Cys 450 455 460 ccc act gac tgt ttt cgg aag cac ccc gag gcc acc tac gcc aga tgc 1440 Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala Arg Cys 465 470 475 480 ggt tct ggg ccc tgg ctg aca cct agg tgt atg gtt cat tac cca tat 1488 Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met Val His Tyr Pro Tyr 485 490 495 agg ctc tgg cac tac ccc tgc act gtc aac ttc acc atc ttc aag gtt 1536 Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val 500 505 510 agg atg tac gtg ggg ggc gtg gag cac agg ttc gaa gcc gca tgc aat 1584 Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala Cys Asn 515 520 525 tgg act cga gga gag cgt tgt gac ttg gag gac agg gat aga tca gag 1632 Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu 530 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acc acc ctg ccg gcc cta tcc acc ggc 2064 Gln Ile Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly 675 680 685 ctg atc cac ctc cat cag aac atc gtg gac gtg caa tac ctg tac ggt 2112 Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly 690 695 700 gta ggg tcg gcg gtt gtc tcc ctt gtc atc aaa tgg gag tat gtc ctg 2160 Val Gly Ser Ala Val Val Ser Leu Val Ile Lys Trp Glu Tyr Val Leu 705 710 715 720 ttg ctc ttc ctt ctc ctg gca gac gcg cgc atc tgc gcc tgc tta tgg 2208 Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Ile Cys Ala Cys Leu Trp 725 730 735 atg atg ctg ctg ata gct caa gct gag gcc gcc tta gag aac ctg gtg 2256 Met Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu Val 740 745 750 gtc ctc aat gcg gcg gcc gtg gcc ggg gcg cat ggc act ctt tcc ttc 2304 Val Leu Asn Ala Ala Ala Val Ala Gly Ala His Gly Thr Leu Ser Phe 755 760 765 ctt gtg ttc ttc tgt gct gcc tgg tac atc aag ggc agg ctg gtc cct 2352 Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Arg Leu Val Pro 770 775 780 ggt gcg 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Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr 180 185 190 Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser 195 200 205 Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro 210 215 220 Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val 225 230 235 240 Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr 245 250 255 Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys 260 265 270 Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser 275 280 285 Gln Leu Phe Thr Ile Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys 290 295 300 Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp 305 310 315 320 Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln 325 330 335 Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His 340 345 350 Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp 355 360 365 Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly His 370 375 380 Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp Thr Arg Gly Leu Val 385 390 395 400 Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr 405 410 415 Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser 420 425 430 Leu Gln Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe Asn 435 440 445 Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp Lys 450 455 460 Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Ser Ser 465 470 475 480 Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile 485 490 495 Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser 500 505 510 Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr Asn 515 520 525 Trp Gly Ala Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile Leu Asn Asn Thr Arg Pro 530 535 540 Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly Phe 545 550 555 560 Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Ala Gly Asn 565 570 575 Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala 580 585 590 Thr Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met 595 600 605 Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe 610 615 620 Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Phe 625 630 635 640 Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp 645 650 655 Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp 660 665 670 Gln Ile Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly 675 680 685 Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly 690 695 700 Val Gly Ser Ala Val Val Ser Leu Val Ile Lys Trp Glu Tyr Val Leu 705 710 715 720 Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Ile Cys Ala Cys Leu Trp 725 730 735 Met Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu Val 740 745 750 Val Leu Asn Ala Ala Ala Val Ala Gly Ala His Gly Thr Leu Ser Phe 755 760 765 Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Arg Leu Val Pro 770 775 780 Gly Ala Ala Tyr Ala Phe Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu 785 790 795 800 Leu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Tyr Ala *** 805 810 <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(17) <400> 51 Ser Asn Ser Ser Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys 1 5 10 15 Val <210> 52 <211> 22 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(22) <400> 52 Gly Gly Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp 1 5 10 15 Ser Pro Thr Thr Ala Leu 20 <210> 53 <211> 37 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(37) <400> 53 Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp Cys 1 5 10 15 Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr 20 25 30 Pro Gly Cys Gly Lys 35 <210> 54 <211> 25 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(25) <400> 54 Gly Gly Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Ala Thr 1 5 10 15 Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu 20 25 <210> 55 <211> 25 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(25) <400> 55 Gly Gly Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asp Ala Ser Val Pro Thr Thr 1 5 10 15 Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu 20 25 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 56 Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Val Arg Asn 1 5 10 15 Ser Thr Gly Leu 20 <210> 57 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 57 Gln Val Arg Asn Ser Thr Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro 1 5 10 15 Asn Ser Ser Ile 20 <210> 58 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 58 Asn Asp Cys Pro Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala His Asp Ala Ile 1 5 10 15 Leu His Thr Pro 20 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 59 Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr 1 5 10 15 Pro Gly Cys Val 20 <210> 60 <211> 19 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 60 His Asp Ala Ile Leu His Thr Pro Gly Val Pro Cys Val Arg Glu Gly 1 5 10 15 Asn Val Ser <210> 61 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 61 Cys Val Arg Glu Gly Asn Val Ser Arg Cys Trp Val Ala Met Thr Pro 1 5 10 15 Thr Val Ala Thr 20 <210> 62 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 62 Ala Met Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Ala Thr 1 5 10 15 Gln Leu Arg Arg 20 <210> 63 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 63 Leu Pro Ala Thr Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser 1 5 10 15 Ala Thr Leu Cys 20 <210> 64 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 64 Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu 1 5 10 15 Cys Gly Ser Val 20 <210> 65 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 65 Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Gly Cys 1 5 10 15 Asn Cys Ser Ile 20 <210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 66 Thr Gln Gly Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His 1 5 10 15 Arg Met Ala Trp 20 <210> 67 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 67 Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro 1 5 10 15 Thr Ala Ala Leu 20 <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 68 Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Met Ala Gln Leu Leu Arg Ile 1 5 10 15 Pro Gln Ala Ile 20 <210> 69 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 69 Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Leu Asp Met Ile Ala Gly Ala His 1 5 10 15 Trp Gly Val Leu 20 <210> 70 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 70 Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met 1 5 10 15 Val Gly Asn Met 20 <210> 71 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 71 Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr Ile Val Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gln Ala 20 <210> 72 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 72 Ser Gly Leu Val Ser Leu Phe Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln 1 5 10 15 Leu Ile Asn Thr 20 <210> 73 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 73 Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Gln Trp His Ile Asn Ser 1 5 10 15 Thr Ala Leu Asn 20 <210> 74 <211> 21 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 74 Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu Asn Thr Gly Trp Trp Leu Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ile Tyr Gln His Lys 20 <210> 75 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 75 Ala Gly Leu Ile Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu 1 5 10 15 Arg Leu Ala Ser 20 <210> 76 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 76 Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Pro Leu Thr Asp Phe Asp 1 5 10 15 Gln Gly Trp Gly 20 <210> 77 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 77 Thr Asp Phe Asp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser 1 5 10 15 Gly Pro Asp Gln 20 <210> 78 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 78 Ala Asn Gly Ser Gly Pro Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Lys Pro Cys 20 <210> 79 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 79 Trp His Tyr Pro Pro Lys Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Lys Ser Val 1 5 10 15 Cys Gly Pro Val 20 <210> 80 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 80 Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val 1 5 10 15 Val Val Gly Thr 20 <210> 81 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 81 Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr 1 5 10 15 Tyr Ser Trp Gly 20 <210> 82 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 82 Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Glu Asn Asp Thr Asp Val Phe Val 1 5 10 15 Leu Asn Asn Thr 20 <210> 83 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 83 Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys 1 5 10 15 Val Cys Gly Ala 20 <210> 84 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 84 Gly Phe Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Val Cys Ile Gly Gly Ala 1 5 10 15 Gly Asn Asn Thr 20 <210> 85 <211> 19 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 85 Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu His Cys Pro Thr Asp Cys Arg 1 5 10 15 Lys His Pro <210> 86 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 86 Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Asp Ala Thr Tyr Ser Arg Cys Gly 1 5 10 15 Ser Gly Pro Trp 20 <210> 87 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 87 Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Leu Val Asp 1 5 10 15 Tyr Pro Tyr Arg 20 <210> 88 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 88 Cys Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile 1 5 10 15 Asn Tyr Thr Ile 20 <210> 89 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 89 Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly 1 5 10 15 Gly Val Glu His 20 <210> 90 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 90 Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu Ala Ala Cys Asn Trp 1 5 10 15 Thr Pro Gly Glu 20 <210> 91 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 91 Ala Cys Asn Trp Thr Pro Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp 1 5 10 15 Arg Ser Glu Leu 20 <210> 92 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 92 Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Thr Thr Thr 1 5 10 15 Gln Trp Gln Val 20 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 93 Tyr Gln Val Arg Asn Ser Thr Gly Leu 1 5 <210> 94 <211> 29 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 94 agctaattaa ttaagcttgc atgcctgca 29 <210> 95 <211> 60 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 95 gttaattaac tattagtgat ggtggtgatg gtgtctgccc tcgatcacgt gcaggcctcc 60 60 <210> 96 <211> 19 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 96 gtttaaccac tgcatgatg 19 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 97 gtcccatcga gtgcggctac 20 <210> 98 <211> 45 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 98 cgtgacatgg tacattccgg acacttggcg cacttcataa gcgga 45 <210> 99 <211> 42 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 99 tgcctcatac acaatggagc tctgggacga gtcgttcgtg ac 42 <210> 100 <211> 42 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 100 tacccagcag cgggagctct gttgctcccg aacgcagggc ac 42 <210> 101 <211> 42 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 101 tgtcgtggtg gggacggagg cctgcctagc tgcgagcgtg gg 42 <210> 102 <211> 48 <212> DNA <400> 102 cgttatgtgg cccgggtaga ttgagcactg gcagtcctgc accgtctc 48 <210> 103 <211> 42 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 103 cagggccgtt ctaggcctcc actgcatcat catatcccaa gc 42 <210> 104 <211> 26 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 104 ccggaatgta ccatgtcacg aacgac 26 <210> 105 <211> 24 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 105 gctccattgt gtatgaggca gcgg 24 <210> 106 <211> 23 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 106 gagctcccgc tgctgggtag cgc 23 <210> 107 <211> 25 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 107 cctccgtccc caccacgaca atacg 25 <210> 108 <211> 27 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 108 ctacccgggc cacataacgg gtcaccg 27 <210> 109 <211> 24 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 109 ggaggcctac aacggccctg gtgg 24 <210> 110 <211> 22 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 110 ttctatcgat taaatagaat tc 22 <210> 111 <211> 23 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 111 gccatacgct cacagccgat ccc 23 <210> 112 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 112 Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp Cys 1 5 10 15 Ser Asn Ser Ser 20 <210> 113 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 113 Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met 1 5 10 15 Ile Met His Thr 20 <210> 114 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 114 Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg 1 5 10 15 Glu Asn Asn Ser 20 <210> 115 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 115 Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr 1 5 10 15 Pro Thr Leu Ala 20 <210> 116 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 116 Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr 1 5 10 15 Thr Thr Ile Arg 20 <210> 117 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 117 Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly 1 5 10 15 Ala Ala Ala Phe 20 <210> 118 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 118 Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp 1 5 10 15 Leu Cys Gly Ser 20 <210> 119 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 119 Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe 1 5 10 15 Thr Ile Ser Pro 20 <210> 120 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 120 Ser Gln Leu Phe Thr Ile Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp 1 5 10 15 Cys Asn Cys Ser 20 <210> 121 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 121 Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly 1 5 10 15 His Arg Met Ala 20 <210> 122 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 122 His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser 1 5 10 15 Pro Thr Thr Ala 20 <210> 123 <211> 135 <212> PRT <213> hepatitis C virus <400> 123 Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys 1 5 10 15 Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr 20 25 30 Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp 35 40 45 Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr 50 55 60 Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe 65 70 75 80 Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val 85 90 95 Ser Gln Leu Phe Thr Ile Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp 100 105 110 Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala 115 120 125 Trp Asp Met Met Met Asn Trp 130 135

Claims (30)

  1. 만성 HCV-감염된 동물에서 간 질환의 완화를 위한 치료적 HCV 백신 조성물.
  2. 만성 HCV-감염된 동물에서 간 섬유증 진전의 완화를 위한 치료적 HCV 백신 조성물.
  3. 만성 HCV-감염된 동물에서 간 섬유증의 완화를 위한 치료적 HCV 백신 조성물.
  4. 만성 HCV-감염된 동물에서 전체 Ishak 스코어에 따른 2 이상의 포인트로 간 질환을 감소시키기 위한 치료적 HCV 백신 조성물.
  5. 만성 HCV-감염된 동물에서 Ishak 섬유증 스코어에 따른 1 이상의 포인트로 간 질환을 감소시키기 위한 치료적 HCV 백신 조성물.
  6. 만성 HCV-감염된 동물에서 혈청 ALT 수준의 완화를 위한 치료적 HCV 백신 조성물.
  7. 만성 HCV-감염된 동물에서 지방증 (steatosis) 의 완화를 위한 치료적 HCV백신 조성물.
  8. 만성 HCV-감염된 동물의 간에서 항-E2 면역반응성의 완화를 위한 치료적 HCV 백신 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, HCV 항원 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 포함하는 치료적 HCV 백신 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 HCV 항원이 E1 또는 E2 항원, 또는 E1 또는 E2 항원의 면역원성 부분인 치료적 HCV 백신 조성물.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 아쥬반트가 알룸 (alum) 인 치료적 HCV 백신 조성물.
  12. 하기를 포함하는, 만성 HCV-감염된 동물에서 간 질환의 변화를 예측하는 방법:
    (i) E1 항원을 포함하는 HCV 백신 조성물에 의한 치료적 백신화 전에 혈청 항-E1 항체 수준의 수준 결정 단계;
    (ii) E1 항원을 포함하는 HCV 백신 조성물에 의한 치료적 백신화 후에 혈청 항-E1 항체 수준의 수준 결정 단계;
    (iii) (i) 및 (ii) 에서 결정된 혈청 항-E1 항체 수준의 수준 차이를 추론하고, 이로부터 간 질환의 변화를 예측하는 단계.
  13. E1 단백질, E2 단백질, 상기 E1 및 E2 단백질의 일부, 및 정제된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 E1 또는 E2 단백질 또는 이의 일부로부터 형성된 E1/E2 단백질 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 정제된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 외피 단백질의 치료적 유효량; 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 포함하는, 치료적 HCV 백신 조성물.
  14. 상이한 HCV 유전자형 또는 아형으로부터 유래된 E1 단백질, 상이한 HCV 유전자형 또는 아형으로부터 유래된 E2 단백질, 상기 E1 및 E2 단백질의 일부, 및 상이한 HCV 유전자형 또는 아형으로부터 유래되고 정제된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 E1 또는 E2 단백질 또는 이의 일부로부터 형성된 E1/E2 단백질 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 정제된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 외피 단백질의 조합의 치료적 유효량; 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 포함하는, 치료적 HCV 백신 조성물.
  15. 하기의 E1 및 E2 펩티드 중 하나 이상의 치료적 유효량 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 포함하는 치료적 HCV 백신 조성물:
    코어/E1 V1 영역의 아미노산 181 내지 200 에 놓여있는 E1-31 (서열번호56),
    E1 영역의 아미노산 193 내지 212 에 놓여있는 E1-33 (서열번호 57),
    E1 V2 영역의 아미노산 205 내지 224 에 놓여있는 E1-35 (서열번호 58),
    E1 V2 영역의 아미노산 208 내지 227 에 놓여있는 E1-35A (서열번호 59),
    E1 영역의 아미노산 192 내지 228 에 놓여있는 1bE1 (서열번호 53),
    E1 영역의 아미노산 301 내지 320 에 놓여있는 E1-51 (서열번호 66),
    E1 C4 영역의 아미노산 313 내지 332 에 놓여있는 E1-53 (서열번호 67),
    E1 영역의 아미노산 325 내지 344 에 놓여있는 E1-55 (서열번호 68),
    E2 영역의 아미노산 위치 397 내지 416 에 놓여있는 Env 67 또는 E2-67 (서열번호 72),
    E2 영역의 아미노산 위치 409 내지 428 에 놓여있는 Env 69 또는 E2-69 (서열번호 73),
    E2 영역의 아미노산 위치 583 내지 602 에 놓여있는 Env 23 또는 E2-23 (서열번호 86),
    E2 영역의 아미노산 위치 595 내지 614 에 놓여있는 Env 25 또는 E2-25 (서열번호 87),
    E2 영역의 아미노산 위치 607 내지 626 에 놓여있는 Env 27 또는 E2-27 (서열번호 88),
    E2 영역의 아미노산 위치 547 내지 566 에 놓여있는 Env 17B 또는 E2-17B (서열번호 83),
    E2 영역의 아미노산 위치 523 내지 542 에 놓여있는 Env 13B 또는 E2-13B (서열번호 82),
    E1 영역의 위치 192 내지 211 에 놓여있는 IGP 1626 (서열번호 112),
    E1 영역의 위치 204 내지 223 에 놓여있는 IGP 1627 (서열번호 113),
    E1 영역의 위치 216 내지 235 에 놓여있는 IGP 1628 (서열번호 114),
    E1 영역의 위치 228 내지 247 에 놓여있는 IGP 1629 (서열번호 115),
    E1 영역의 위치 240 내지 259 에 놓여있는 IGP 1630 (서열번호 116),
    E1 영역의 위치 252 내지 271 에 놓여있는 IGP 1631 (서열번호 117),
    E1 영역의 위치 264 내지 283 에 놓여있는 IGP 1632 (서열번호 118),
    E1 영역의 위치 276 내지 295 에 놓여있는 IGP 1633 (서열번호 119),
    E1 영역의 위치 288 내지 307 에 놓여있는 IGP 1634 (서열번호 120),
    E1 영역의 위치 300 내지 319 에 놓여있는 IGP 1635 (서열번호 121), 및
    E1 영역의 위치 312 내지 331 에 놓여있는 IGP 1636 (서열번호 122).
  16. E1 단백질, E2 단백질, 상기 E1 및 E2 단백질의 일부, 및 정제된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 E1 또는 E2 단백질 또는 이의 일부로부터 형성된 E1/E2 단백질 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 정제된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 외피 단백질의 치료적 유효량; 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 포함하는, 치료적 HCV 조성물.
  17. 상이한 HCV 유전자형 또는 아형으로부터 유래된 E1 단백질, 상이한 HCV 유전자형 또는 아형으로부터 유래된 E2 단백질, 상기 E1 및 E2 단백질의 일부, 및 상이한 HCV 유전자형 또는 아형으로부터 유래되고 정제된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 E1 또는 E2 단백질 또는 이의 일부로부터 형성된 E1/E2 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 둘 이상의 정제된 HCV 단일 또는 특이적 올리고머성 재조합 외피 단백질의 조합의 치료적 유효량; 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 포함하는, 치료적 HCV 조성물.
  18. 하기의 E1 및 E2 펩티드 중 하나 이상의 치료적 유효량 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 포함하는 치료적 HCV 조성물:
    코어/E1 V1 영역의 아미노산 181 내지 200 에 놓여있는 E1-31 (서열번호 56),
    E1 영역의 아미노산 193 내지 212 에 놓여있는 E1-33 (서열번호 57),
    E1 V2 영역의 아미노산 205 내지 224 에 놓여있는 E1-35 (서열번호 58),
    E1 V2 영역의 아미노산 208 내지 227 에 놓여있는 E1-35A (서열번호 59),
    E1 영역 (V1, C1 및 V2 영역) 의 아미노산 192 내지 228 에 놓여있는 1bE1 (서열번호 53),
    E1 영역의 아미노산 301 내지 320 에 놓여있는 E1-51 (서열번호 66),
    E1 C4 영역의 아미노산 313 내지 332 에 놓여있는 E1-53 (서열번호 67),
    E1 영역의 아미노산 325 내지 344 에 놓여있는 E1-55 (서열번호 68),
    E2 영역의 아미노산 위치 397 내지 416 에 놓여있는 Env 67 또는 E2-67 (서열번호 72),
    E2 영역의 아미노산 위치 409 내지 428 에 놓여있는 Env 69 또는 E2-69 (서열번호 73),
    E2 영역의 아미노산 위치 583 내지 602 에 놓여있는 Env 23 또는 E2-23 (서열번호 86),
    E2 영역의 아미노산 위치 595 내지 614 에 놓여있는 Env 25 또는 E2-25 (서열번호 87),
    E2 영역의 아미노산 위치 607 내지 626 에 놓여있는 Env 27 또는 E2-27 (서열번호 88),
    E2 영역의 아미노산 위치 547 내지 566 에 놓여있는 Env 17B 또는 E2-17B (서열번호 83),
    E2 영역의 아미노산 위치 523 내지 542 에 놓여있는 Env 13B 또는 E2-13B (서열번호 82),
    E1 영역의 위치 192 내지 211 에 놓여있는 IGP 1626 (서열번호 112),
    E1 영역의 위치 204 내지 223 에 놓여있는 IGP 1627 (서열번호 113),
    E1 영역의 위치 216 내지 235 에 놓여있는 IGP 1628 (서열번호 114),
    E1 영역의 위치 228 내지 247 에 놓여있는 IGP 1629 (서열번호 115),
    E1 영역의 위치 240 내지 259 에 놓여있는 IGP 1630 (서열번호 116),
    E1 영역의 위치 252 내지 271 에 놓여있는 IGP 1631 (서열번호 117),
    E1 영역의 위치 264 내지 283 에 놓여있는 IGP 1632 (서열번호 118),
    E1 영역의 위치 276 내지 295 에 놓여있는 IGP 1633 (서열번호 119),
    E1 영역의 위치 288 내지 307 에 놓여있는 IGP 1634 (서열번호 120),
    E1 영역의 위치 300 내지 319 에 놓여있는 IGP 1635 (서열번호 121), 및
    E1 영역의 위치 312 내지 331 에 놓여있는 IGP 1636 (서열번호 122).
  19. HCV-특이적 항체의 유도, T-세포 활성의 자극 및 시토카인 분비의 자극 중 하나 이상을 위한 제 13 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 치료적 HCV 조성물.
  20. 상기 HCV 유전자형과 상이한 HCV 유전자형, 또는 상기 E1, E2 또는 E1/E2 단백질 복합체가 유래되는 HCV 유전자형으로 감염된 HCV 보균자에서 치료적으로 유효한, 제 13 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 치료적 HCV 조성물.
  21. 하기 E1 및 E2 펩티드 중 하나 이상 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 포함하는 조성물:
    E1 영역의 위치 192 내지 211 에 놓여있는 IGP 1626 (서열번호 112),
    E1 영역의 위치 204 내지 223 에 놓여있는 IGP 1627 (서열번호 113),
    E1 영역의 위치 216 내지 235 에 놓여있는 IGP 1628 (서열번호 114),
    E1 영역의 위치 228 내지 247 에 놓여있는 IGP 1629 (서열번호 115),
    E1 영역의 위치 240 내지 259 에 놓여있는 IGP 1630 (서열번호 116),
    E1 영역의 위치 252 내지 271 에 놓여있는 IGP 1631 (서열번호 117),
    E1 영역의 위치 264 내지 283 에 놓여있는 IGP 1632 (서열번호 118),
    E1 영역의 위치 276 내지 295 에 놓여있는 IGP 1633 (서열번호 119),
    E1 영역의 위치 288 내지 307 에 놓여있는 IGP 1634 (서열번호 120),
    E1 영역의 위치 300 내지 319 에 놓여있는 IGP 1635 (서열번호 121), 및
    E1 영역의 위치 312 내지 331 에 놓여있는 IGP 1636 (서열번호 122).
  22. 제 10 항 및 제 13 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E1 또는 E2 항원의, 상기 재조합 HCV 외피 단백질의 또는 상기 E1 및 E2 펩티드의 시스테인이 블록킹되는 조성물.
  23. 제 10 항, 제 13 항, 제 14 항, 제 16 항, 제 17 항, 제 19 항, 제 20 항 및 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E1 또는 E2 항원 또는 상기 재조합 HCV 외피 단백질이 바이러스-유사 입자로서 첨가되는 조성물.
  24. 제 10 항, 제 13 항, 제 14 항, 제 16 항, 제 17 항, 제 19 항, 제 20 항 및 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E1 항원 또는 상기 재조합 HCV E1 외피 단백질이 E1s 단백질인 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 E1 항원 또는 상기 E1s 단백질이 서열번호 23 에 의해 정의되는 조성물.
  26. 제 1 항 내지 제 10 항, 제 13 항, 제 14 항, 제 16 항, 제 17 항, 제 19 항, 제 20 항 및 제 22 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCV 항원 또는 상기 재조합 HCV 외피 단백질이 재조합 포유동물 세포에 의해서, 재조합 효모 세포에 의해서 또는 재조합 바이러스에 의해서 생성되는 조성물.
  27. 제 15 항 및 제 18 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 재조합 펩티드 또는 합성 펩티드인 조성물.
  28. 제 1 항 내지 제 11 항 및 제 13 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, HCV 감염된 포유동물의 치료를 위한 조성물.
  29. 제 1 항 내지 제 11 항 및 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 조성물.
  30. 제 12 항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
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